TY - THES A1 - Sampers, René T1 - Einfluss von Autophagie-modulierenden Wirkstoffen auf die Proliferation von oralen Tumorzelllinien T1 - Influence of autophagy-modulating agents on the proliferation of oral tumor cell lines N2 - Die Autophagie nimmt als ein zentraler Bestandteil des zellulären Metabolismus eine wichtige Rolle für die Proliferationsfähigkeit von Tumorzellen ein. Dabei zeigt sich, dass sich der Einfluss der Autophagie kontextabhängig zwischen und innerhalb einzelner Tumorentitäten unterscheidet und das Tumorzellwachstum sowohl fördern als auch hemmen kann. Durch den Einsatz der Wirkstoffe Chloroquin, Bafilomycin und Rapamycin konnte effektiv die Autophagie in den untersuchten Zelllinien moduliert und durch Proteinanalyse mit Hilfe der SDS-Page validiert werden. Dosisabhängige Reduktionen der Zellzahlen konnten vor allem bei den inhibitorisch wirkenden Substanzen Chloroquin und Bafilomycin erreicht werden, während Rapamycin als Autophagie-induzierender Wirkstoff keine antiproliferativen Effekte erzeugen konnte. Auch FasL und TNFα konnten in den untersuchten Tumorzelllinien nur zu einer mäßigen Zellzahlreduktion führen. Cisplatin hingegen konnte in allen Zelllinien dosisabhängige Zellzahlreduktionen induzieren. Durch die Kombination von Chloroquin mit FasL konnte in den FasL-responsiven Zelllinien eine signifikante Sensitivierung im Sinne einer Proliferationshemmung induziert werden. Ähnliche Effekte ließen sich bei der Kombination von Rapamycin mit FasL beobachten. Auch für die MR konnte ein proliferationshemmender Effekt in den zwei untersuchten Tumorzelllinien FaDu und Detroit562 validiert werden. In der Kombination mit FasL wurde bei einer Zelllinie eine Sensitivierung auf das extrinsische Todessignal nachgewiesen. Die kombinatorische Anwendung der MR mit TNFα und Autophagiemodulatoren zeigte keine signifikanten, proliferationshemmenden Effekte. Auswirkungen ließen sich dagegen in der IL-8 Expression feststellen, wobei die MR allein zu einem signifikanten Anstieg führte und Rapamycin die Expressionsrate in Kombination mit der MR signifikant senkte. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit das Potenzial der Autophagiemodulation vor allem bei responsiven HNSCC-Tumorzellen auf. Auch die MR konnte in vitro vielversprechende Ergebnisse liefern. Die kontextabhängigen Auswirkungen der Autophagie auf das Tumorwachstum bedeuten allerdings auch eine Menge offener Fragen, die es in Zukunft zu klären gilt, bevor die Autophagiemodulation Einzug in die klinische Praxis der Tumortherapie erhalten kann. Ausschlaggebend für die Weiterentwicklung effektiver Therapien wird unter anderem ein verbessertes Verständnis über intrinsische und extrinsische Resistenzmechanismen sein und welche Rolle die Autophagie dabei einnimmt. N2 - Autophagy plays a crucial role in the cellular metabolism and has significant implications for the proliferation ability of tumor cells. The influence of autophagy varies contextually, both between and within different tumor entities, and can either promote or inhibit tumor cell growth. The use of autophagy-modulating agents such as chloroquine, bafilomycin, and rapamycin effectively modulated autophagy in the examined cell lines, which was validated through protein analysis using SDS-PAGE. Dose-dependent reductions in cell numbers were achieved primarily with the inhibitory substances chloroquine and bafilomycin, while rapamycin, as an autophagy-inducing agent, did not produce any anti-proliferative effects. FasL and TNFα also led to only moderate reductions in cell numbers in the investigated tumor cell lines. Cisplatin, on the other hand, induced dose-dependent reductions in cell numbers in all cell lines. When chloroquine was combined with FasL, a significant sensitization resulting in proliferation inhibition was observed in the FasL-responsive cell lines. Similar effects were observed with the combination of rapamycin and FasL. Furthermore, a proliferation-inhibiting effect of MR was validated in the two examined tumor cell lines, FaDu and Detroit562. In combination with FasL, sensitization to the extrinsic death signal was demonstrated in one cell line. However, the combined application of MR with TNFα and autophagy modulators did not show any significant proliferation-inhibiting effects. Nevertheless, effects were observed in IL-8 expression, where MR alone led to a significant increase, and rapamycin significantly reduced the expression rate in combination with MR. Overall, the results of this study demonstrate the potential of autophagy modulation, particularly in responsive HNSCC tumor cells. MR also provided promising in vitro results. However, the context-dependent effects of autophagy on tumor growth raise numerous unresolved questions that need to be addressed before autophagy modulation can be incorporated into the clinical practice of tumor therapy. Improved understanding of intrinsic and extrinsic resistance mechanisms and the role of autophagy will be crucial for the development of effective therapies. KW - Autophagie KW - Bafilomycin KW - Rapamycin KW - Chloroquin KW - Sirolimus KW - Tumor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320662 ER - TY - THES A1 - Stein, Florian T1 - Untersuchungen zur Aufklärung der adversen Effekte von HES auf Zellen (HK-2) des proximalen Nierentubulus T1 - Studies to elucidate the adverse effects of HES on cells (HK-2) of the proximal renal tubule N2 - In der Volumentherapie galt das Kolloid Hydroxyethylstärke (HES) lange Zeit als ideale Infusionslösung und war der in Deutschland am häufigsten eingesetzte Plasmaexpander. In den letzten Jahren mehrten sich jedoch die Hinweise, dass HES insbesondere bei kritisch Kranken zu einer akuten Nierenfunktionsverschlechterung beitragen könnte, welche das klinische Ergebnis wesentlich beeinflusst. Der genaue Pathomechanismus ist bis heute nicht geklärt. Bekannt ist, dass sich HES nach intravenöser Applikation in vielen verschiedenen Geweben ablagert, wobei eine renale Anreicherung bevorzugt in proximalen Tubuluszellen stattfindet. Histopathologisch finden sich große Mengen intrazellulärer Vesikel im Zytoplasma, welche zu einer Zellschwellung führen, die auch als osmotische Nephrose bezeichnet und als prinzipiell reversibel erachtet wird. Der zelluläre Abbau soll dabei im Allgemeinen über das lysosomale System stattfinden. Dieses ist fester Bestandteil der Autophagie, welche ein evolutionär in allen Eukaryonten konservierter stress-induzierter kataboler Prozess ist, der der zellulären Homöostase und energieeffizienten Selbstreinigung dient. Hierbei werden defekte Makromoleküle durch Lysosomen in ihre Grundbestandteile zerlegt und der Zelle als Bausteine wieder zur Verfügung gestellt. In dieser Arbeit wurde in einem ersten Schritt der Einfluss von HES der 3. Generation auf die Viabilität von HK-2-Zellen mit zwei unabhängigen in vitro Assays überprüft. Diese beruhen auf einem Substratumsatz durch zytosolische bzw. mitochondriale Dehydrogenasen. Für beide Assays konnte zu verschiedenen Inkubationszeitpunkten bis 21 Stunden jeweils eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion durch HES festgestellt werden, welche auch nach einer „Regenerationsphase“ noch verringert nachweisbar und somit partiell reversibel war. Im nächsten Schritt wurde die Hypothese überprüft, ob eine medikamentöse Induktion der Autophagie die beobachtete Viabilitätsreduktion abschwächen oder sogar aufheben kann. Hierbei wurde analog zu einer Arbeit von Liu et al. (2014) eine Inkubationszeit von insgesamt acht Stunden gewählt, da nach diesem Zeitraum eine perinukleäre Cluster-Bildung der Lysosomen beobachtet werden konnte, welche für eine erhöhte Autophagierate spricht. Es kamen im Folgenden HES-Lösungen von 0,75% zum Einsatz, da diese aufgrund einer Viabilitätsreduktion um zirka ein Drittel als am besten geeignet betrachtet wurden. Der Autophagieinduktor Everolimus zeigte hierbei in dem auf mitochondrialen Dehydrogenasen basierenden EZ4U-Assay eine fast vollständige Aufhebung der HES-vermittelten Viabilitätsreduktion. Dieser Effekt konnte durch den MAP-Kinase-Kinase-Blocker U0126 aufgehoben werden. Andere Autophagiemodulatoren hingegen bewirkten zumeist nur geringe Änderungen der Zellviabilität. Zuletzt wurde auf Proteinebene untersucht, ob zentrale Moleküle bzw. Komplexe der Autophagie unter HES zum einen im zeitlichen Verlauf und zum anderen unter zusätzlichem Einfluss der Modulatoren eine Expressionsänderung aufwiesen. HES alleine bewirkte im zeitlichen Verlauf weitestgehend keine signifikante Expressionsänderung. Auch im Vergleich zu einer 0%-HES-Kontrolllösung konnten keine relevanten Unterschiede festgestellt werden. Die Koinkubation mit Everolimus führte zu einer erhöhten Expression der Quotienten ppERK/pERK und LC3BII/LC3BI, U0126 konnte dies jeweils weitestgehend wieder aufheben. Perifosin bewirkte ebenso wie 3-Methyladenin eine verringerte Expression von Akt, Chloroquin führte zu keiner signifikanten Expressionsänderung aller bestimmter Proteine. Darüber hinaus verursachten alle Modulatoren keine signifikante Expressionsänderung des zentralen Autophagiekomplexes Beclin1 sowie von LAMP2 und SQSTM1. Insgesamt sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine allgemeine, direkte Beeinflussung von klassischer Autophagie durch HES. Der Autophagieinduktor Everolimus zeigte jedoch einen protektiven Effekt auf die Zellviabilität, welcher vermutlich über einen Autophagie-vermittelten Weg verursacht wird. Unsere Arbeitsgruppe konnte darüber hinaus eine HES-vermittelte Reduktion von ROS beobachten. Das Autophagienetzwerk ist eng mit der zellulären Redox-Homöostase verknüpft. Eine verminderte ROS-Bildung könnte zu einer verminderten Autophagierate und somit auch verringerten Zellviabilität führen, welche durch Everolimus kompensiert wird. Bisher ungeklärt ist auch, auf welchem Weg HES in die Zelle aufgenommen wird. Denkbar wäre, dass größere HES-Moleküle via Endozytose in die Zelle gelangen. Hierbei ist der mTORC1-Komplex ein wichtiger Regulator, der durch Everolimus gehemmt wird und somit über eine verringerte HES-Aufnahme zu einer Viabilitätssteigerung führen könnte. Kleinere HES-Moleküle dagegen könnten über Glukose-Transporter aufgenommen werden, die möglicherweise über AMPK reguliert werden. N2 - In volume therapy, the colloid hydroxyethyl starch (HES) was long considered the ideal infusion solution and was the most commonly used plasma expander in Germany. In recent years, however, there has been increasing evidence that HES may contribute to acute renal function deterioration, particularly in critically ill patients, which significantly affects clinical outcome. The exact pathomechanism has not been elucidated to date. What is known is that HES is deposited in many different tissues after intravenous administration, with renal accumulation occurring preferentially in proximal tubule cells. Histopathologically, large amounts of intracellular vesicles are found in the cytoplasm, leading to cell swelling, also known as osmotic nephrosis, which is considered reversible in principle. Cellular degradation is generally thought to occur via the lysosomal system. This is an integral part of autophagy, which is an evolutionarily conserved stress-induced catabolic process in all eukaryotes that serves cellular homeostasis and energy-efficient self-purification. In this process, defective macromolecules are broken down into their basic components by lysosomes and made available again to the cell as building blocks. In this work, as a first step, the influence of 3rd generation HES on the viability of HK-2 cells was tested using two independent in vitro assays. These are based on substrate turnover by cytosolic and mitochondrial dehydrogenases, respectively. For both assays, a concentration-dependent viability reduction by HES was detected at different incubation times up to 21 hours, which was still detectable in a reduced manner after a "regeneration phase" and thus partially reversible. In the next step, the hypothesis was tested whether a drug induction of autophagy could attenuate or even reverse the observed viability reduction. Here, analogous to a work by Liu et al. (2014), an incubation period of eight hours in total was chosen, since after this period a perinuclear cluster formation of the lysosomes could be observed, which speaks for an increased autophagy rate. In the following, HES solutions of 0.75% were used, as these were considered most suitable due to a viability reduction of about one third. The autophagy inducer everolimus showed an almost complete abolition of the HES-mediated viability reduction in the mitochondrial dehydrogenase-based EZ4U assay. This effect could be abolished by the MAP kinase kinase blocker U0126. In contrast, other autophagy modulators mostly caused only minor changes in cell viability. Finally, we investigated at the protein level whether central molecules or complexes of autophagy showed a change in expression under HES on the one hand in the time course and on the other hand under the additional influence of the modulators. HES alone largely did not cause a significant change in expression over time. Also in comparison to a 0%-HES control solution no relevant differences could be detected. Coincubation with everolimus increased the expression of ppERK/pERK and LC3BII/LC3BI ratios, and U0126 largely reversed this in each case. Perifosine caused decreased expression of Akt, as did 3-methyladenine, and chloroquine caused no significant change in expression of all specific proteins. In addition, all modulators did not cause a significant change in expression of the central autophagy complex Beclin1, as well as LAMP2 and SQSTM1. Overall, the results of this work argue against a general direct effect of HES on classical autophagy. However, the autophagy inducer everolimus showed a protective effect on cell viability, which is presumably caused by an autophagy-mediated pathway. Furthermore, our research group was able to observe a HES-mediated reduction of ROS. The autophagy network is closely linked to cellular redox homeostasis. Decreased ROS formation could lead to decreased autophagy rate and thus decreased cell viability, which is compensated by everolimus. The pathway by which HES is taken up into the cell has also not yet been clarified. It is conceivable that larger HES molecules enter the cell via endocytosis. Here, the mTORC1 complex is an important regulator that is inhibited by everolimus and could thus lead to an increase in viability via reduced HES uptake. Smaller HES molecules, on the other hand, could be taken up via glucose transporters, which are possibly regulated via AMPK. KW - Hydroxyethylstärke KW - Autophagie KW - Everolimus KW - Nierenversagen KW - Autophagie KW - Akutes Nierenversagen KW - Hydroxyethyl starch KW - Autophagy KW - Acute Kidney Injury KW - Everolimus Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-282514 ER - TY - THES A1 - Stetter, Maurice T1 - LC3-associated phagocytosis seals the fate of the second polar body in \(Caenorhabditis\) \(elegans\) T1 - LC3-assoziierte Phagozytose besiegelt das Schicksal des zweiten Polkörpers in \(Caenorhabditis\) \(elegans\) N2 - This work investigates the death and degradation of the second polar body of the nematode C. elegans in order to improve our understanding how pluripotent undifferentiated cells deal with dying cells. With the use of fluorescence microscopy this work demonstrates that both polar bodies loose membrane integrity early. The second polar body has contact to embryonic cells and gets internalized, dependent on the Rac1-ortholog CED-10. The polar body gets degraded via LC3-associated phagocytosis. While lysosome recruitment depends on RAB-7, LC3 does not improve lysosome recruitment but still accelerates polar body degradation. This work establishes the second polar body as a genetic model to study cell death and LC3-associated phagocytosis and has revealed further aspects of phagosome maturation and degradation. N2 - Um besser zu verstehen, wie undifferenzierte pluripotente Zellen mit abgestorbenen Zellen umgehen, wird in dieser Dissertation die Phagozytose und der Abbau des 2. Polkörpers der weiblichen Meiose im Fadenwurm C. elegans untersucht. Mithilfe von fluorenzenzmikroskopischen Aufnahmen wird in dieser Arbeit gezeigt, dass beide Polkörper schon früh ihre Membranintegrität verlieren. Der 2. Polkörper, welcher direkten Kontakt zu embryonischen Zellen hat, wird daraufhin mithilfe des Rac1-Orthologs CED-10 phagozytiert. Es wird gezeigt, dass es sich bei dem Abbauprozess um LC3-assoziierte Phagozytose handelt. Die RAB-7 GTPase ist notwendig für die Rekrutierung von Lysosomen, während LC3 darauf keinen Einfluss hat, aber trotzdem den Abbau des Polkörpers beschleunigt. Mit dieser Arbeit konnte ein genetisches Modell für die Erforschung von Zelltod und der LC3-assoziierten Phagozytose entwickelt werden und weitere Aspekte der Phagosomreifung und des -abbaus aufgedeckt werden. KW - Polkörper KW - Phagozytose KW - Autophagie KW - Zelltod KW - Caenorhabditis elegans KW - LC3-assoziierte Phagozytose KW - phagosome maturation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231981 ER - TY - THES A1 - Börner, Kevin T1 - How CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells T1 - Wie CLEC16A die Funktion von Thymus-Epithelzellen beeinflusst N2 - Genomweite Assoziationsstudien haben CLEC16A als ein Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes und weitere Autoimmunerkrankungen identifiziert. Die genaue Funktion von CLEC16A bleibt jedoch ungeklärt. Studien zeigten, dass sowohl das Drosophila Ortholog ema als auch das murine Clec16a eine Rolle in Autophagie spielen. Autophagie trägt zur Beladung der MHC-Klasse-II Moleküle und somit der Antigenpräsentation bei. Darüber hinaus konnten Studien belegen, dass Autophagie zur Antigenpräsentation während der T-Zell Selektion in Thymus-Epithelzellen benötigt wird. Dies schlägt eine mögliche Funktion von CLEC16A in Thymus-Epithelzellen während der T-Zell Selektion vor. Außerdem berichteten Arbeiten, dass CLEC16A als quantitativer Trait Locus für seine Nachbargene fungiert und dass Clec16a KD in Langerhans Inseln im Pankreas die Insulinsekretion und den Glukosestoffwechsel beeinträchtigt. Dieser Arbeit vorausgehend hatten Schuster et al. eine Clec16a KD NOD Maus generiert, welche vor spontanem autoimmunem Diabetes geschützt war. Für diese Arbeit wurde vermutet, dass CLEC16A als Suszeptibilitätsgen für Typ 1 Diabetes den Prozess der Autophagie in Thymus-Epithelzellen beeinträchtigt und somit Antigenpräsentation und das T-Zell Repertoire beeinflusst. Um auf der Vorarbeit von Schuster et al. aufzubauen und diese zu ergänzen, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss von CLEC16A auf Thymus-Epithelzellen zu untersuchen. Hierfür wurde ein CLEC16A KD in menschlichen Zellen mittels RNA Interferenz erzeugt und Autophagie durch Immunoblotting untersucht. Zusätzlich wurde die Entzündung im Pankreasgewebe von Clec16a KD NOD Mäusen mittels H.E. Färbung beurteilt und bewertet. Thymus-Transplanationen wurden durchgeführt, um zu sehen, ob der Einfluss von Clec16a KD T-Zell intrinsisch ist. Außerdem wurden intraperitoneale Glukosetoleranztests durchgeführt, um den Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD Mäusen zu beurteilen. Schließlich wurden mittels qPCR Expressionslevel der benachbarten Gene, wie zum Beispiel Dexi und Socs1, erhoben, um die Eigenschaften von CLEC16A als quantitativer Trait Locus einzuordnen. Gemeinsam mit den Ergebnissen von Schuster et al. kann diese Arbeit aufzeigen, dass Clec16a KD die Ausprägung von Insulitis im Pankreas reduziert und Clec16a KD NOD Mäuse vor spontanem Autoimmundiabetes schützt. Dieser Schutz vor Erkrankung wird durch beeinträchtigte Autophagie in Thymus-Epithelzellen hervorgerufen, welche die T-Zell Selektion beeinflusst und die Reaktivität von T-Zellen reduziert. Der Einfluss des Clec16a KD ist innerhalb des Thymus wirksam. Der Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD NOD Mäusen bleibt unverändert und kann deshalb als Ursache für den Schutz vor Type 1 Diabetes ausgeschlossen werden. Clec16a und Dexi zeigen ähnliche Expressionslevel auf, dennoch benötigt es weitere detaillierte Studien, um eine Beziehung zwischen den beiden Genen etablieren zu können. Letztlich konnte die Beeinträchtigung von Autophagie in menschlichen CLEC16A KD Zellen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Funktion von CLEC16A evolutionär konserviert ist und ein möglicher Zusammenhang zwischen CLEC16A Polymorphismen und einem erhöhten Risiko für Typ 1 Diabetes im Menschen besteht. N2 - Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes. For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus. In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human. KW - Thymus KW - Toleranz KW - Autoimmunität KW - Diabetes mellitus Typ 1 KW - Epithelzelle KW - CLEC16A KW - T cell selection KW - Antigen presentation KW - Autophagy KW - Autoimmunity KW - T Zell Selektion KW - Antigenpräsentation KW - Autophagie Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200230 ER - TY - THES A1 - Hahlbrock, Theresa T1 - Das onkologische Supportivprodukt Avemar: Untersuchungen zum antiproliferativen und antimetabolischen Effekt an humanen gastrointestinalen Tumorzellen T1 - Studies on the antiproliferative and antimetabolic effect of the dietary supplement Avemar on human gastrointestinal tumor cells N2 - Unter dem Namen Avemar sind fermentierte Weizenkeimlinge als onkologisches Supportivprodukt erhältlich. Der hohe Anteil an 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinonen (DMBQ) in Avemar soll für das \(in\) \(vitro\) und \(in\) \(vivo\) belegte antikanzerogene Potential verantwortlich sein. DMBQ wirken über Semichinonradikale bzw. durch Ausbildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Induktion von oxidativem Stress zytotoxisch. Da Tumorzellen empfindlicher auf oxidativen Stress reagieren als gesunde Zellen, kann dies die selektive zytotoxische Wirkung von Avemar erklären. Die Beteiligung von DMBQ am antiproliferativen Effekt von Avemar und die Wirkung von Avemar auf den Stoffwechsel maligner Zellen sind derzeit nicht eindeutig geklärt. Die antiproliferativen Eigenschaften von Avemar und DMBQ als Reinsubstanz wurden miteinander verglichen. Hierzu wurden DMBQ in einer zu Avemar mit 0,04% Benzochinonen äquimolaren Konzentration von 24 μmol/L eingesetzt. Die Ergebnisse der Arbeit lassen den Schluss zu, dass der starke zytotoxische Effekt von Avemar bei BxPc-3 Zellen auf einen DMBQ-induzierten oxidativen Stress zurückzuführen ist. Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde für BxPc-3 Zellen bei der Inkubation mit DMBQ eine 20-fache bzw. mit Avemar eine 40-fache Zunahme des ROS-Indikators 2',7'-Dichlorofluorescein gemessen. Im Westernblot ließ sich bei BxPc-3 Zellen das Enzym DT-Diaphorase, welches die Zellen vor Benzochinon-induziertem oxidativem Stress schützt, nicht nachweisen. In Zellen der anderen beiden Zelllinien konnte das Enzym nachgewiesen werden. Das mangelnde Schutzsystem gegenüber DMBQ-induziertem oxidativen Stress könnte demzufolge den DMBQ vermittelten zytotoxischen Effekt von Avemar in BxPc-3 Zellen erklären. Zusätzlich zum zytotoxischen Effekt wies Avemar zwei weitere antiproliferative Effekte auf: Zytostase bei 23132/87 Zellen und Wachstumsverzögerung bei HRT-18 Zellen. Beide antiproliferativen Effekte waren auf die Beeinflussung des Zellmetabolismus zurückzuführen. Avemar verringerte den zellulären Glukoseverbrauch von HRT-18 Zellen um 69% und von 23132/87 Zellen um 99%. In 23132/87 Zellen korrelierte der verringerte Glukoseverbrauch mit einer Abnahme von ATP um 70% und einem Zellzyklusarrest in der G\(_2\)/M Phase. Der durch die Inkubation von HRT-18 Zellen mit Avemar ausgelöste verringerte Glukoseverbrauch beeinflusste hingegen weder den ATP-Gehalt noch den Zellzyklus, induzierte aber Autophagie. Dies ließ sich zeigen durch morphologische Veränderungen wie die Bildung von intrazellulären Vakuolen und durch den Nachweis des Autophagiemarkers LC3-II. Die Wertigkeit dieses Phänomens für die zytotoxischen Eigenschaften von Avemar ist in weiteren Untersuchungen zu klären. Die antiproliferativen Eigenschaften von Avemar führen zu Veränderungen im Zellmetabolismus von gastrointestinalen Tumorzellen. Ausschlaggebend dafür, welcher der drei antiproliferativen Effekte von Avemar (zytotoxisch, zytostatisch oder wachstumsverzögernd) dominiert, sind vermutlich zelleigene Schutzsysteme und metabolische Charakteristika der Zellen. Avemar weist ein breites Spektrum antiproliferativer Effekte auf, deren Einfluss auf Zellfunktion und Zellstoffwechsel im Detail noch weiter untersucht werden sollte. N2 - The commercial product Avemar is an oncologic supportive drug that consists of fermented wheat germ extracts. The high content of 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone (DMBQ) in Avemar is thought to be responsible for the anticancer effects, which were observed both \(in\) \(vitro\) and \(in\) \(vivo\) experiments. The cytotoxic effect of DMBQ is caused by semiquinone radicals which induce oxidative stress in cells. Because tumor cells are more sensitive to oxidative stress than benign cells, the presence of semiquinone radicals might explain the selective cytotoxic effect of Avemar. However, the role of DMBQ in the antiproliferative mechanism of Avemar and the effect of Avemar on the metabolism of malignant cells have not yet been clarified. In this work, the antiproliferative features of Avemar were compared to those of DMBQ as a pure substance. DMBQ was investigated in a concentration of 24 μmol/L, which is equimolar to Avemar with a concentration of 0.04% of DMBQ. Both Avemar and DMBQ exhibited an increase of reactive oxygen species in BxPc-3 cells, which resulted in a cytotoxic effect within 24 hours after starting treatment. Compared to untreated cells, intracellular DCF fluorescence as a measure of reactive oxygen species increased by 20 times for DMBQ and 40 times for Avemar in BxPc-3 cells. Western Blot analysis revealed that the enzyme DT-diaphorase, which protects cells against benzoquinone-induced oxidative stress, was not present in BxPc-3 cells. In contrast, the enzyme could be detected in cells of the other two cell lines. The lack of DT-diaphorase in BxPc-3 cells indicates insufficient protection against DMBQ-induced oxidative stress which could consequently result in a DMBQ-mediated cytotoxic effect when exposed to Avemar. Besides the cytotoxic effect, Avemar showed two additional antiproliferative features: cytostasis in 23132/87 cells and growth delay in HRT-18 cells. Both antiproliferative effects of Avemar were caused by the influence of the substance on the cell metabolism. Avemar impaired the cellular consumption of glucose by 69% in HRT-18 cells and by 99% in 23132/87 cells. The impaired consumption of glucose in 23132/87 cells correlated with a decrease of ATP by 70% and an arrest in the G\(_2\)/M phase during the cell cycle of 23132/87. In contrast, when treated with Avemar, the impaired consumption of glucose in HRT-18 cells did not affect the ATP concentration and did not alter the cell cycle. Instead, Avemar leads to autophagy, as indicated by the formation of intracellular vacuoles. The presence of autophagy in HRT-18 cells was confirmed by the detection of the autophagy marker LC3-II. The relevance of this phenomenon for the cytotoxic properties of Avemar is to be clarified in further studies. Three different mechanisms of action of Avemar were identified: cytotoxic, cytostasis, and growth delay. The relevant effect on each cell type is presumably determined by the available protection mechanism and metabolic character of the cells. Avemar shows a broad spectrum of antiproliferative features whose exact influence on the functions and metabolism of the cell remains to be investigated in more detail in future studies. KW - Oxidativer Stress KW - Chinonderivate KW - Alternative Medizin KW - Gastrointestinaler Tumor KW - Weizenkeim KW - 2,6-Dimethoxybenzochinon KW - Avemar KW - Fermentierte Weizenkeimlinge KW - Autophagie KW - 2,6-Dimethoxybenzoquinone KW - fermented wheat germ KW - autophagy Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145787 ER - TY - THES A1 - Schober, Kilian T1 - Der Einfluss von CLEC16A auf Autophagie - ein neuer Mechanismus in der Pathogenese von Typ-1-Diabetes T1 - The influence of CLEC16A on autophagy - a new mechanism in the pathogenesis of type 1 diabetes N2 - Das Gen CLEC16A ist mit der Autoimmunerkrankung Typ-1-Diabetes assoziiert. NOD-Mäuse mit einem Clec16a-KD sind vor der Entwicklung von Diabetes geschützt, der entscheidende Wirkungsort für Clec16a sind dabei TECs. Im Rahmen zentraler Toleranz präsentieren TECs CD4+ Thymozyten Selbstantigene auf MHC II-Komplexen. Autophagie ist ein Zellprozess, der in TECs MHC II-Komplexen Selbstantigene zuführt und so für die Entwicklung zentraler Toleranz essentiell ist. Das Ortholog von CLEC16A, ema, fördert die Bildung von Autophagosomen. So wurde vermutet, dass CLEC16A ein Suszeptibilitätsgen für Typ-1-Diabetes ist, weil es Autophagie in TECs und somit deren MHC II-Beladung verändert. Die vorliegende Arbeit schaltete CLEC16A in einer humanen Zelllinie durch RNAi aus und untersuchte die autophagische Aktivität dieser Zellen. Außerdem untersuchte sie die Autophagie von TECs aus NOD-Clec16a-KD-Mäusen. Die Beurteilung erfolgte morphologisch durch Immunzytochemie bzw. -histochemie und funktionell durch Immunoblots. Es wurde gezeigt, dass der KD von CLEC16A in vitro und in vivo Autophagie funktionell beeinträchtigt. Damit liefert die vorliegende Arbeit zusammen mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe Kissler einen möglichen Erklärungsansatz, warum CLEC16A ein mit Typ-1-Diabetes assoziiertes Gen ist. CLEC16A fördert Autophagie in TECs, was die Selbstantigen-Beladung von MHC II-Komplexen verändert. Selbstreaktive CD4+ Thymozyten führen so zum Verlust zentraler Toleranz und der Entwicklung von Typ-1-Diabetes. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um diese Hypothese zu bekräftigen. N2 - The gene CLEC16A is associated with type 1 diabetes. NOD mice with a Clec16a-KD are protected from diabetes. Specifically, the protection is dependent on a Clec16a-KD in TECs. TECs present self-antigens to CD4+ thymocytes for positive selection and central tolerance. Some TECs show constitutive levels of autophagy and in these cells, autophagy changes the TCR ligandome of self antigens, thereby modulating central tolerance. The orthologous gene of CLEC16A in Drosophila, ema, promotes the formation of autophagosomes. It was therefore hypothesized that CLEC16A is associated with type 1 diabetes, as it changes autophagy in TECs. This doctoral thesis knocked down CLEC16A in a human cell line, using RNA interference, and investigated TECs from NOD-Clec16a-KD mice. Autophagic flux was determined using immunocytochemistry/immunohistochemistry and immunoblot of the autophagic markers p62 and LC3. It was shown that a KD of CLEC16A compromises autophagic activity in vitro and in vivo. Together with further results from the lab of Stephan Kissler, a change in autophagy in TECs through CLEC16A provides a possible reason for the association with type 1 diabetes, but also other autoimmune diseases: CLEC16A enhances autophagy in TECs, which modulates MHC II self-peptide loading. Self reactive CD4+ T cells are thus not eliminated by central tolerance and contribute to the pathogenesis of type 1 diabetes. KW - Thymus KW - Autophagie KW - Diabetes mellitus KW - Typ-1-Diabetes KW - Autophagie KW - Zentrale Toleranz Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138715 ER - TY - THES A1 - Frank, Benjamin T1 - Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen T1 - Analyses of autophagy induction in Leishmania major-infected bone marrow-derived macrophages N2 - Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gezählte Leishmaniose wird durch intrazelluläre Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die länglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandmücke – der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im Säugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen näher untersucht, um demgemäß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zukünftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen könnten. Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellulärem Stress ihre Homöostase erhalten können. Durch diesen Prozess können überflüssige oder beschädigte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben übernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen. Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellulären Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erhöhte autophage Aktivität konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB bestätigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays führten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verknüpfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, nämlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erhöht sind. Durch siRNA-Analysen konnte überdies beobachtet werden, dass beide für die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind. Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte für mögliche zukünftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele für künftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungsärmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt näher. N2 - Leishmaniasis, listed by the WHO to be one of the 17 most important NTDs, is caused by intracellular parasites of the genus Leishmania. The life cycle of the parasites consists of two stages. The oblong and motile promastigotes characterize the stage in the sand fly, the vector of leishmaniasis. However, the stage in the vertebrate host is characterized by round immotile amastigotes. Due to a lack of capable antileishmanial therapies, the interaction between L. m. parasites and their main host cell, the macrophage, was investigated in the present work, huge focus on autophagic processes in infected macrophages. Our goal was to get new insights for the future production of antileishmanial drugs. Autophagy is a catabolic process whereby cells are able to maintain their homeostasis in times of starvation or cellular stress. During to this process, redundant or damaged organelles are recycled in order to sustain cellular viability. Furthermore, autophagy has an essential role in the defense of pathogens invading the cytosol. The newly established total autophagy score showed an autophagy induction in L. m.-infected BMDM. Intracellular amastigotes are digested by autophagy in BMDM. The increased autophagic activity could also be confirmed by western-blot analyses of the autophagy-relevant proteins ATG5, LC3B, and UB. Molecular genetic investigations of L. m.-infected BMDM by Affymetrix microarrays led to a network of autophagy-relevant and infection-specific genes, which was called LISA. Additionally, it showed a strong connection between autophagy-relevant genes and genes of the glycolysis, a second catabolic process. Moreover, we identified and further characterized two additional autophagy-relevant genes, Bnip3 and Ctse, which were not included in LISA. Both genes were significantly overexpressed on protein level in L. m.-infected BMDM. By siRNA analyses we also demonstrated their importance for successful elimination of amastigotes. Therefore, both proteins, BNIP3 and CTSE, could be new potential targets for possible future antileishmanial therapies. In addition, the genes included in LISA might be promising targets for future drugs against leishmaniasis. Due to all these investigations we are one step closer to our goal of a targeted and safe therapy of leishmaniasis. KW - Autophagie KW - Leishmania major KW - Cathepsin E KW - BNIP3 KW - Elektronenmikroskopie KW - Autophagie KW - Leishmania major KW - Cathepsin E KW - BNIP3 KW - Elektronenmikroskopie KW - Microarray KW - siRNA KW - Autophagiescore Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137277 ER - TY - THES A1 - Riedel, Alexander T1 - Untersuchungen zur endogenen MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation nukleärer Antigene T1 - Investigation of the endogenous MHC class II-restricted presentation of nuclear antigens N2 - Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf Major-Histokompatibilitätskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molekülen ist von entscheidender Bedeutung für eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Präsentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verständnis der Abläufe zu leisten, die an der endogenen Präsentation nukleärer Antigene auf MHC-II-Molekülen beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukleär lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Präsentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpräsentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR über einen endogenen Präsentationsweg und nicht über die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molekülen präsentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach möglichen Eintrittspforten für nukleäre Proteine in diesen Abbauweg gesucht. Für die Autophagie-abhängige Präsentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Auflösung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukleärer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verstärkte Antigenpräsentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpräsentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpräsentation mit der MHC-II-Oberflächenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine ähnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abhängiger Antigenpräsentation wurde auch für EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abhängige Präsentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene Präsentation der untersuchten nukleären Antigene auf MHC-II-Molekülen. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabhängig von ihrer subzellulären Lokalisation Zugang zu diesem Präsentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellulären Antigene, die einer CD4+ T-Zellüberwachung unterliegen. N2 - The endogenous presentation of intracellular antigens on major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules plays an important role in adaptive immune responses, but the underlying molecular mechanisms are not well understood. The aim of this study was to gain insight into the endogenous presentation pathways for nuclear antigens on MHC-II molecules. By using antigen-specific CD4+ T cell clones, MHC-II presentation of the nuclear antigens neomycin phosphotransferase II (NucNeoR) and Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) was studied in professional and non-professional antigen presenting cells (APC). Both types of APC presented peptides derived from these nuclear proteins on MHC-II molecules by an endogenous presentation pathway and not by release and reuptake as exogenous protein. Inhibition of autophagy drastically reduced endogenous antigen presentation, indicating that nuclear proteins enter the MHC-II processing and loading compartment through autophagic vesicles. Because autophagocytosis occurs in the cytoplasm, potential entry routes for nuclear proteins into this pathway were investigated. Endogenous presentation of NucNeoR on MHC-II molecules by autophagy did neither involve the CRM1-mediated export of the nuclear protein into the cytoplasm, nor the redistribution of nuclear and cytoplasmic components following the dissolution of the nuclear envelope during mitosis. Conditional antigen expression and cell cycle phase separation of antigen-expressing cells revealed that antigen presentation was maximal in cells in G1/0 and then gradually decreased as cells progressed in the cell cycle. This reduction in antigen presentation correlated with a cell cycle-dependent decrease in antigen transcription/translation, but not with the total amount of antigen present in these cells. By contrast, when antigen expression was turned off, antigen presentation correlated with MHC-II surface expression, which increased from G1/0- to G2/M-phase. A similar correlation between antigen presentation and antigen transcription/translation was also observed for the antigens EBNA3C and the cytosolic variant of neomycin phosphotransferase II (NeoR). These results identify autophagocytosis of newly-synthesized proteins as the molecular mechanism mediating endogenous presentation of nuclear and cytosolic antigens on MHC-II molecules. By coupling protein translation and autophagocytosis, newly-synthesized proteins gain access to the endogenous MHC-II presentation pathway irrespective of their subcellular localisation and thereby broaden the spectrum of intracellular antigens that are presented to CD4+ T cells. KW - Autophagie KW - Antigenpräsentation KW - MHC KW - nukleäre Antigene KW - T-Zellen KW - autophagy KW - antigen presentation KW - MHC KW - nuclear antigen KW - T Lymphocytes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25183 ER -