TY - THES A1 - Mayer, Rafaela T1 - OxPAPC as an endogenous agonist of TRPA1 channels on nociceptors T1 - OxPAPC als endogener Agonist von TRPA1 Kanälen auf Nozizeptoren N2 - Non-steroidal antiinflammatory drugs are most commonly used for inflammatory and postoperative pain. But they lack effectiveness and specificity, leading to severe side effects, like gastric ulcers, asthma and severe bleeding. Oxidized 1-palmitoyl-2-arachinidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (OxPAPC) plays an important role in inflammatory pain. PAPC is a common phosphatidylcholine of membranes, which can be oxidized by reactive oxygen species. In preliminary experiments, our group found that local injection of OxPAPC in rat paws induces hyperalgesia. In this study we examined the effect of OxPAPC on transient receptor potential A1 (TRPA1), an ion channel expressed in C-fiber neurons. Furthermore, we investigated if intracellular cysteine residues of TRPA1 were necessary for agonist-channel-interactions and if a subsequent TRPA1 activation could be prevented by OxPAPC scavengers. To answer these questions, we performed calcium imaging using HEK-293 cells stably expressing hTRPA1, or transiently expressing the triple mutant channel hTRPA1-3C and naïve DRG neurons. Cells were incubated with the ratiometric, fluorescent dye Fura-2/AM and stimulated with OxPAPC. The change of light emission after excitation with 340 and 380 nm wavelengths allowed conclusions regarding changes of intracellular calcium concentrations after TRPA1 activation. In our investigation we proved evidence that OxPAPC activates TRPA1, which caused a flow of calcium ions into the cytoplasm. The TRPA1-specific channel blocker HC-030031 eliminated this agonist-induced response. TRPA1-3C was not completely sensitive to OxPAPC. The peptide D-4F and the monoclonal antibody E06 neutralized OxPAPC-induced TRPA1 activation. In this work, the importance of OxPAPC as a key mediator of inflammatory pain and as a promising target for drug design is highlighted. Our results indicate that TRPA1 activation by OxPAPC involves cysteine-dependent mechanisms, but there are other, cysteine-independent activation mechanisms as well. Potential pharmaceuticals for the treatment of inflammatory pain are D-4F and E06, whose efficiency has recently been confirmed in the animal model by our research group. N2 - Nichtsteroidale Antiphlogistika werden bei Entzündungs- und postoperativen Schmerzen eingesetzt. Ihre mangelnde Effektivität und Spezifität kann jedoch starke Nebenwirkungen wie Magen-Darmulzera, Analgetikaasthma und Blutungen hervorgerufen. Hyperalgesie kann in Entzündungsprozessen lokal durch das oxidierte Phospholipid 1-Palmitoyl-2-Arachinidonoyl-sn-Glycero-3- Phosphocholin (OxPAPC) induziert werden, welches durch Oxidation mit reaktiven Sauerstoffspezies entsteht. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass OxPAPC nach intraplantarer Injektion in Rattenpfoten Hyperalgesie hervorruft. In dieser Arbeit steht die Interaktion zwischen OxPAPC und dem „transient receptor potential A 1“ Kanal (TRPA1), einem Ionenkanal von C-Faser-Neuronen, im Fokus. Es wurde untersucht, ob intrazelluläre Cysteinreste zur Aktivierung durch oxidierte Phospholipide beitragen und ob diese durch einen OxPAPC-spezifischen Antagonismus verhindert werden kann. Zur Klärung der Fragestellung verwendeten wir HEK-293 Zellen, die entweder hTRPA1 stabil oder den an drei Positionen mutierten hTRPA1-C3 transient exprimierten und native DRG Neurone. Die Änderung der intrazellulären Kalziumionenkonzentration nach Kanalmodulation mit OxPAPC wurde mittels ratiometrischer Fura-2/AM-Experimente bestimmt. Wir zeigten, dass OxPAPC zur Aktivierung von TRPA1 führt, welche sich nach Zugabe des spezifischen Antagonisten HC-030031 als reversibel erwies. Sind drei Cysteine des intrazelllulären Aminoterminus von TRPA1 mutiert, wurde ein Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration durch OxPAPC verringert. Das Peptid D-4F und der monoklonale Antikörper E06 neutralisierten die Wirkung von OxPAPC auf den Kanal. Das in Entzündungsprozessen gebildete OxPAPC ist ein endogener Agonist von TRPA1 Kanälen und stellt damit eine potentielle pharmakologische Zielsubstanz für die Entwicklung von Analgetika dar. Naheliegend ist, dass die Aktivierung von TRPA1 durch OxPAPC über Cysteinbindungsstellen erfolgen kann. Jedoch sind weitere, cysteinunabhängige Mechanismen ebenfalls wahrscheinlich. D-4F und E06 sind vielversprechende neuartige Substanzen für die Behandlung von Entzündungsschmerz. Ihre analgetische Wirkung wurde bereits im Tiermodell durch unsere Arbeitsgruppe bestätigt. KW - Schmerzforschung KW - Phospholipide KW - Entzündung KW - Schmerztherapie KW - Ionenkanal KW - TRPA1 channel KW - Oxidized Phospholipids KW - Inflammatory Pain KW - Nociceptor KW - DRG Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175890 ER - TY - THES A1 - Martin, Corinna T1 - Oxidized phospholipids and their role in neuronal excitation of primary sensory neurons T1 - Oxidierte Phospholipide und ihre Funktion in neuronaler Erregbarkeit in primären sensorischen Neuronen N2 - Recently, our research group identified in a study novel proalgesic targets in acute and chronic inflammatory pain: oxidized phospholipids (OxPL). OxPL, endogenous chemical irritants, are generated in inflamed tissue and mediate their pain-inducing function by activating the transient receptor potential channels TRPA1 and TRPV1. Both channels are sensors for chemical stimuli on primary afferent nociceptors and are involved in nociception. Here, with the help of calcium imaging and whole cell patch clamp recording techniques, it was found that OxPL metabolites acutely activate TRPA1 and TRPV1 ion channels to excite DRG neurons. OxPL species act predominantly via TRPA1 ion channels and mediate long- lasting non-selective inward currents. Notably, one pure OxPL compound, PGPC, activated a TRPA1 mutant lacking the binding site for electrophilic agonists, suggesting that OxPL activate TRP ion channels by an indirect mechanical mechanism. Next, it was investigated how OxPL influence the excitability of primary sensory neurons. Acute stimulation and fast calcium imaging revealed that OxPL elicit repetitive, spike-like calcium transients in small- diameter DRG neurons, which were fully blocked by antagonists against TRPA1/V1 and N- type voltage-gated calcium channels. In search of a mechanism that drives repetitive spiking of DRG neurons, it was asked whether NaV1.9, a voltage-gated sodium channel involved in subthreshold excitability and nociception, is needed to trigger OxPL-induced calcium spikes and action potential firing. In electrophysiological recordings, both the combination of local application of OxPL and current injection were required to efficiently increase the action potential (AP) frequency of small-diameter sensory neurons. However, no difference was monitored in the resting membrane potential or OxPL-induced AP firing rate between wt and NaV1.9-deficient small diameter DRG neurons. To see whether NaV1.9 needs inflammatory conditions to be integrated in the OxPL-induced excitation cascade, sensory neurons were pretreated with a mixture of inflammatory mediators before OxPL application. Under inflammatory conditions both the AP and the calcium-spike frequency were drastically enhanced in response to an acute OxPL stimulus. Notably, this potentiation of OxPL stimuli was entirely lost in NaV1.9 deficient sensory neurons. Under inflammatory conditions, the resting membrane potential of NaV1.9-deficient neurons was more negative compared to wt neurons, suggesting that NaV1.9 shows resting activity only under inflammatory conditions. In conclusion, OxPL are endogenous irritants that induce excitability in small-diameter DRG neurons, a cellular model of nociceptors, via TRP activation. This effect is potentiated under inflammatory conditions. Under these conditions, NaV1.9 functions as essential mediator as it eases the initiation of excitability after OxPL stimulation. As mutants in the human NaV1.9 mediate an enhanced or painless perception, this study provides new insight into the mechanism on how NaV1.9 amplifies stimuli of endogenous irritants under inflammatory conditions. N2 - Im Zuge einer Studie über Entzündungsschmerz hat unsere Arbeitsgruppe oxidierte Phospholipide (OxPL) als neue endogene Entzündungsmediatoren entdeckt. Diese werden im entzündeten Gewebe produziert und vermitteln ihre schmerzinduzierende Funktion durch Aktivierung von sogenannten transienten Rezeptorpotentialkanälen TRPA1 und TRPV1. Beide Ionenkanäle werden von afferenten Nozizeptoren exprimiert und sind Sensoren für chemische Reize. In dieser Arbeit wurde mithilfe von Calcium Imaging und elektrophysiologischen Messungen gezeigt, dass oxidierte Phospholipide TRPA1 und TRPV1 aktivieren und eine erhöhte Erregbarkeit in sensorischen Neuronen der Hinterwurzelganglien (DRG Neuronen) auslösen. Hierbei aktivieren oxidierte Phospholipide TRPA1 stärker als TRPV1 und induzieren langanhaltende, nicht-selektive Einwärtsströme. Ein Bestandteil von OxPL, das Oxidationsprodukt PGPC, aktiviert zudem eine Mutante von TRPA1, die nicht die Bindungsstelle für elektrophile Agonisten trägt. Dies lässt vermuten, dass OxPL die TRP Kanäle über einen indirekten, mechanischen Mechanismus aktivieren. Als nächstes wurde der Einfluss von OxPL auf die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen untersucht. Schnelles Calcium Imaging zeigte, dass eine akute Stimulation mit OxPL zu wiederholten spike-ähnlichen Signalen in DRG Neuronen führt. Diese waren nur in Neuronen mit kleinem Durchmessern zu finden und deren Aktivierung konnte sowohl durch Antagonisten gegen TRPA1/V1 als auch mit Inhibitoren spannungsgesteuerter N-Typ Kalziumkänale blockiert werden. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass eine Strominjektion mit gleichzeitiger lokaler Applikation von OxPL zur Erhöhung der Aktionspotentialsrate in kleinen DRG Neuronen führt. Deshalb wurde untersucht, ob der spannungsgesteuerte Natriumkanal NaV1.9 für die durch OxPL induzierten Kalziumspikes und Aktionspotentiale verantwortlich ist, da er an der unterschwelligen Erregbarkeit von Neuronen beteiligt ist. Es konnte jedoch kein Unterschied beim Ruhemembranpotential oder der OxPL induzierten Aktionspotentialsrate zwischen den wt und NaV1.9-defizienten (NaV1.9 KO) Neuronen festgestellt werden. Um zu verstehen, ob NaV1.9 unter inflammatorischen Bedingungen in die OxPL induzierte Erregungskaskade integriert wird, wurden die sensorischen Neurone mit inflammatorischen Mediatoren vorbehandelt und anschließend mit OxPL stimuliert. Dies führte sowohl zu einer stark erhöhten Kalziumspike- als auch Aktionspotentialfrequenz im wt, während die NaV1.9 KO Neurone sich wie unter nicht inflammatorischen Bedingungen verhielten. Unter inflammatorischen Bedingungen konnte zudem eine Erniedrigung des Ruhemembranpotentials im Vergleich zwischen NaV1.9 KO und wt Neuronen beobachtet werden. Das lässt vermuten, dass NaV1.9 seine Ruheaktivität nur unter Entzündungsbedingungen zeigt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass OxPL endogene Agonisten sind, die kleine DRG Neurone, ein zelluläres Model für Nozizeptoren, über TRPA1 und TRPV1 aktivieren. Dieser Effekt wird unter Entzündungsbedingungen verstärkt. Hierbei spielt der unterschwellig aktive Kanal NaV1.9 eine essentielle Vermittlerrolle, indem er die Auslösung von Aktionspotentialen nach einem OxPL Stimulus erleichtert. Da Mutationen im menschlichen Na1.9 Kanal zu einem erhöhten oder sogar fehlendem Schmerzempfinden führen können, gibt diese Studie einen neuen Einblick in den Mechanismus mit dem NaV1.9 Stimuli endogener, reizauslösender Substanzen unter Entzündungsbedingungen amplifiziert. KW - inflammatory pain KW - Entzündungsschmerz KW - NaV1.9. oxidized phospholipids KW - TRPA1 KW - TRPV1 KW - DRG KW - oxidierte Phospholipide KW - Entzündung KW - Schmerz KW - Phospholipide Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160665 ER - TY - THES A1 - Raida, Markus T1 - Kosteneffizienzanalyse der Polytrauma-Patienten im Jahr 2010 T1 - Account analysis of multiple injured patients in 2010 N2 - Mit der Einführung des G-DRG Systems im Jahr 2003 änderte sich die Abrechnung der Behandlungskosten grundlegend. Die fallgenaue Berechnung der tatsächlich entstandenen Kosten wurde durch eine gleiche Vergütung gleicher Entlassdiagnosen ersetzt. Bereits vor Einführung des G-DRG wurde über mögliche negative Folgen insbesondere im Bereich der Schwerverletztenversorgung spekuliert. Besorgniserregende Studien aus anderen Ländern mit DRG-System sahen Traumazentren in der Gefahr einer ökonomiebedingten Schließung. Die ersten Veröffentlichungen nach Einführung des G-DRG bestätigten die zuvor getroffenen Befürchtungen und zeigten eine deutlich defizitäre Vergütung. Fallgenaue Berechnungen gibt es seither nur noch an den Kalkulationshäusern des InEK. Das UKW steht als überregionales Traumazentrum im Focus dieses Missstandes und gewährleistet indes die Versorgung von rund 120 Polytrauma-Patienten pro Jahr. Diese Studie betrachtet retrospektiv die tatsächlich entstandenen Kosten von 43 solcher Patienten aus dem Jahr 2010 mit einem mittleren ISS von 22,7±9,9 Punkten und benutzt dazu eigene Berechnungen. Die berechneten Kostenfaktoren sind OP-Kosten (Personal und Material), Radiologie, Labor, Transfusion, Anästhesie und Intensivstation. Diese beziehen sich auf tatsächlich entstandene Kosten. Infrastruktur und Vorhaltung finden dabei beispielsweise keine Beachtung. Es zeigt sich eine Kostenunterdeckung von 2.616±7.461€ pro Patient. Hauptsächlich wurden die MDCs Prä-MDC (Langzeitbeatmung) und MDC 08 (vom DRG nicht als Polytrauma erkannte Fälle) defizitär vergütet. Die wesentlichen Kostenanteile entfallen auf die Kosten der Intensivstation. Trotz der Nichtbeachtung relevanter Kostenpunkte, wie dem der Vorhaltekosten, konnte bereits eine Unterfinanzierung des Patientenkollektivs nachgewiesen werden. Die tatsächlichen Kosten scheinen in ihrer Gesamtsumme also noch deutlich höher zu liegen. Die bisherigen Anpassungen des Entgeltsystems durch Erhöhung des Basisfallwertes und der Abbildungsgenauigkeit scheinen unzureichend zu sein. Eine Forderung nach fallgenauer Berechnung insbesondere im Bereich klinischer Polytrauma-Patienten, die jedoch in eine andere MDC eingeordnet wurden, scheint gerechtfertigt. Gerade im Hinblick auf eine weitere Zentralisierung der Schwerverletztenversorgung im Zuge des Ausbaus des Traumanetzwerks der DGU und des Schwerstverletzungsartenverfahrens der DGUV. N2 - Account analysis of multiple injured patients in 2010 KW - Kosten-Nutzen-Analyse KW - Polytrauma KW - DRG-System KW - Gesundheitsökonomie KW - Intensivmedizin KW - DRG KW - Schwerverletztenversorgung KW - Schwerverletzte Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106511 ER - TY - THES A1 - Schmalfuss, Andreas T1 - Protonensensitivität des Hitzerezeptors von primär afferenten Neuronen der Küken in vitro T1 - The heat receptors proton-sensitivity in chicken primary afferent neurons in vitro N2 - Aus vorherigen Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der Säugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivität und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen könnten Rückschlüsse auf funktionelle Strukturen des Säugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die übergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivität unterscheiden. Für die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von Küken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgeführt, um eine mögliche Veränderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierfür wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinwärtsströmen untersucht. Zunächst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabhängig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die nächste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierfür wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3% ± 0,5% bei pH 7,4 auf 35,0% ± 4,0% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabhängig ist. Hierfür wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgeführt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einwärtsströme gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einwärtsstroms temperaturabhängig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einwärtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der Küken TRPV1 ähnlich wie der der Säugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entzündlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verstärkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone. N2 - From previous publications of the work group it was already known that the TRPV1 heat receptor of birds differs from the TRPV1 of mammals in regards to the capsaicin sensitivity and the regulation of the expression by NGF. Differences in properties between the two heat receptor subtypes might allow conclusions on functional structures of the mammal TRPV1. In the study it was examined whether both subtypes of heat receptors also differ concerning their sensitivity of proton. For this analyzes, spinal ganglion neurons of chicks were isolated and cultivated. By means of the cobalt-uptake method the percentage of neurons was identified which functionally expresses the heat receptor TRPV1. These experiments were conducted after 1,2 and 3 days in culture conditions to be able to evaluate a possible change over time. Further on it was examined whether the percentage of heat sensitive neurons is influenced by proton. For this, the neurons were stimulated after one day in culture conditions in combination of heat and proton. To study the sensitisation of the heat response through proton within single neurons, the amplitude of heat and proton induced total ionic currents was examined by using the patch-clamp method in the whole-cell configuration. As a start, it was examined by means of the cobalt-uptake method whether the percentage of heat sensitive neurons is influenced by proton over time in culture conditions. At a temperature of 44°C the percentage of heat sensitive neurons increased within the first 3 days in culture conditions independently on the concentration of proton (pH 7,4, pH 6,6 and pH 5,8). The next question was the percentage of proton sensitive neuron at room temperature. For this, the cells were stimulated after one day in cell culture with a medium of pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 or pH 5,8. An increase of 3,3% ± 0,5% at pH 7,4 up to 35,0% ± 4,0% at pH 5,8 could be identified. In the following it was evaluated whether this increase is dependent on temperature. Therefore, experiments at 37°C, 40°C and 44°C after one day in culture conditions were conducted. In comparison at 37°C the percentage of positive neurons was already at 6,2 as high as at room temperature at pH 5,8. With a further increasing temperature, the percentage of positive neurons decreased with increasing pH values. Thus, at 44°C and pH 5,8 only a little further increase could be identified. In the last part of the study, heat and proton induced ionic currents were measured by using the patch-clamp method. Exemplarily it could be demonstrated that the amplitude of heat induced ionic currents is dependent on temperature. Further on it could be demonstrated that the amplitude of the heat induced ionic current significantly increases at a medium of pH 6,6 compared to a pH of 7,4. The results of this study show that the TRPV1 of chicks similarly to the one of mammals can be sensitized by proton in concentrations as they exist in inflamed tissue. This results in a recruiting of additional heat sensitive neurons as well as an intensified response of already heat sensitive neurons. KW - Küken KW - Nervenzelle KW - Zellkultur KW - Sensitivität KW - Proton KW - DRG KW - chick Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24973 ER -