TY  - THES
A1  - Dannhäuser, Sven
T1  - Function of the Drosophila adhesion-GPCR Latrophilin/CIRL in nociception and neuropathy
T1  - Funktionelle Rolle des Drosophila aGPCR Latrophilin/CIRL in Nozizeption und Neuropathie
N2  - Touch sensation is the ability to perceive mechanical cues which is required for essential behaviors. These encompass the avoidance of tissue damage, environmental perception, and social interaction but also proprioception and hearing. Therefore research on receptors that convert mechanical stimuli into electrical signals in sensory neurons remains a topical research focus. However, the underlying molecular mechanisms for mechano-metabotropic signal transduction are largely unknown, despite the vital role of mechanosensation in all corners of physiology.
Being a large family with over 30 mammalian members, adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs) operate in a vast range of physiological processes. Correspondingly, diverse human diseases, such as developmental disorders, defects of the nervous system, allergies and cancer are associated with these receptor family. Several aGPCRs have recently been linked to mechanosensitive functions suggesting, that processing of mechanical stimuli may be a common feature of this receptor family – not only in classical mechanosensory structures.
This project employed Drosophila melanogaster as the candidate to analyze the aGPCR Latrophilin/dCIRL function in mechanical nociception in vivo. To this end, we focused on larval sensory neurons and investigated molecular mechanisms of dCIRL activity using noxious mechanical stimuli in combination with optogenetic tools to manipulate second messenger pathways. In addition, we made use of a neuropathy model to test for an involvement of aGPCR signaling in the malfunctioning peripheral nervous system. To do so, this study investigated and characterized nocifensive behavior in dCirl null mutants (dCirlKO) and employed genetically targeted RNA-interference (RNAi) to cell-specifically manipulate nociceptive function.
The results revealed that dCirl is transcribed in type II class IV peripheral sensory neurons – a cell type that is structurally similar to mammalian nociceptors and detects different nociceptive sensory modalities. Furthermore, dCirlKO larvae showed increased nocifensive behavior which can be rescued in cell specific reexpression experiments. Expression of bPAC (bacterial photoactivatable adenylate cyclase) in these nociceptive neurons enabled us to investigate an intracellular signaling cascade of dCIRL function provoked by light-induced elevation of cAMP. Here, the findings demonstrated that dCIRL operates as a down-regulator of nocifensive behavior by modulating nociceptive neurons. Given the clinical relevance of this results, dCirl function was tested in a chemically induced neuropathy model where it was shown that cell specific overexpression of dCirl rescued nocifensive behavior but not nociceptor morphology.
N2  - Der Tastsinn ist die Fähigkeit, mechanische Reize wahrzunehmen, die für essentielle Verhaltensweisen notwendig sind. Dazu gehören die Vermeidung von Gewebsschädigungen, die Wahrnehmung der Umwelt und soziale Interaktion, aber auch die Propriozeption und das Hören. Daher bleibt die Forschung an Rezeptoren, die mechanische Reize in sensorischen Neuronen in elektrische Signale umwandeln, ein aktueller Forschungsschwerpunk. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen für die mechanometabotrope Signalübertragung sind trotz der wesentlichen Rolle des Tastsinns in allen Bereichen der Physiologie weitgehend unbekannt.
Adhäsions G-Protein gekoppelte Rezeptoren (aGPCRs), eine große Molekülfamilie mit über 30 Vertretern im Menschen, sind an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Demzufolge wird ein Zusammenhang zwischen diesen Rezeptoren und verschiedenen Erkrankungen des Menschen, wie z. B. Entwicklungsstörungen, Defekte des Nervensystems, Allergien und Krebs, angenommen. Mehrere aGPCRs wurden kürzlich mit mechanosensitiven Funktionen in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die Verarbeitung mechanischer Reize ein gemeinsames Merkmal dieser Rezeptorfamilie ist – nicht nur in klassischen mechanosensorischen Strukturen.
In diesem Projekt wurde Drosophila melanogaster verwendet, um die Funktion des aGPCR-Latrophilin/dCIRL in der mechanischen Nozizeption in vivo zu analysieren. Zu diesem Zweck konzentriert sich diese Arbeit auf mechano-sensorische Neurone (Typ II Klasse IV) der Fruchtfliegenlarve, um die molekularen Mechanismen der dCIRL-Aktivität zu untersuchen. Hierzu wurden noxische mechanische Reize in Kombination mit optogenetischen Werkzeugen, zur Manipulation der Second-Messenger-Signalübertragung, herangezogen.
Zusätzlich wurde ein Neuropathie-Modell etabliert, um eine Beteiligung des aGPCRs dCIRL am beeinträchtigten peripheren Nervensystem zu testen. Zu diesem Zweck untersucht und charakterisiert diese Studie das nozizeptive Verhalten in dCirl-Nullmutanten (dCirlKO) und die RNA-Interferenz (RNAi) Methode, um zellspezifische Manipulationen auszuführen.
Die Ergebnisse zeigen, dass dCirl in spezifischen peripheren sensorischen Neuronen (C4da) transkribiert wird - ein Zelltyp, der Nozizeptoren in Säugern strukturell ähnlich ist und verschiedene nozizeptive sensorische Modalitäten vermittelt.
Darüber hinaus zeigen dCirlKO-Larven ein erhöhtes nozizeptives Verhalten, welches mittels zellspezifischer Reexpression gerettet werden kann. Die Expression von bPAC (bakterielle photoaktivierbare Adenylatcyclase) in diesen nozizeptiven Neuronen ermöglichte es, intrazelluläre Signalkaskaden von CIRL zu untersuchen, welche durch lichtinduzierte Erhöhung von cAMP angeregt werden. Dieser Versuch zeigt, dass dCIRL durch die Modulation nozizeptiver Neuronen eine Herabregulation des nozizeptiven Verhaltens bewirkt.
Angesichts der klinischen Relevanz dieses Ergebnisses wurde die dCirl-Funktion in einem chemisch induzierten Neuropathie-Modell getestet. Dabei stellte sich heraus, dass zellspezifische Überexpression von dCirl eine ausgeprägte Hyperalgesie reduziert, morphologische Schädigungen hingegen nicht gerettet werden konnten.
KW  - Drosophila
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Nozizeption
KW  - Neuropathie
KW  - nociception
KW  - neuropathy
KW  - adhesion-GPCR
KW  - aGPCR
KW  - dCIRL
KW  - Latrophilin
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201580
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TY  - THES
A1  - Kunz, Tobias C.
T1  - Expansion Microscopy (ExM) as a tool to study organelles and intracellular pathogens
T1  - Expansionsmikroskopie (ExM) als Tool zur Untersuchung von Organellen und intrazellulären Pathogenen
N2  - The resolution of fluorescence light microscopy was long believed to be limited by the diffraction limit of light of around 200-250 nm described in 1873 by Ernst Abbe. Within the last decade, several approaches, such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated emission depletion STED and (direct) stochastic optical reconstruction microscopy (d)STORM have been established to bypass the diffraction limit. However, such super-resolution techniques enabling a resolution <100 nm require specialized and expensive setups as well as expert knowledge in order to avoid artifacts. They are therefore limited to specialized laboratories. Recently, Boyden and colleagues introduced an alternate approach, termed expansion microscopy (ExM). The latter offers the possibility to perform superresolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded. Since its introduction in 2015, expansion microscopy has developed rapidly offering protocols for 4x, 10x and 20x expansion of proteins and RNA in cells, tissues and human clinical specimens. 
Mitochondria are double membrane-bound organelles and crucial to the cell by performing numerous tasks, from ATP production through oxidative phosphorylation, production of many important metabolites, cell signaling to the regulation of apoptosis. The inner mitochondrial membrane is strongly folded forming so-called cristae. Besides being the location of the oxidative phosphorylation and therefore energy conversion and ATP production, cristae have been of great interest because changes in morphology have been linked to a plethora of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. However, cristae imaging remains challenging as the distance between two individual cristae is often below 100 nm. Within this work, we demonstrate that the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to fluorescent protein GFP (MtCK-GFP) can be used as a cristae marker. Upon fourfold expansion, we illustrate that our novel marker enables visualization of cristae morphology and localization of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. Furthermore, we show the applicability of expansion microscopy for several bacterial pathogens, such as Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae and Staphylococcus aureus. Due to differences in bacterial cell walls, we reveal important aspects for the digestion of pathogens for isotropic expansion. We further show that expansion of the intracellular pathogens C. trachomatis and S. negevensis, enables the differentiation between the two distinct developmental forms, catabolic active reticulate bodies (RB) and infectious elementary bodies (EB), on a conventional confocal microscope. We demonstrate the possibility to precisely locate chlamydial effector proteins, such as CPAF or Cdu1, within and outside the chlamydial inclusion. Moreover, we show that expansion microscopy enables the investigation of bacteria, herein S. aureus, within LAMP1 and LC3-II vesicles. With the introduction of the unnatural α-NH2-ω-N3-C6-ceramide, we further present the first approach for the expansion of lipids that may also be suitable for far inaccessible molecule classes like carbohydrates. The efficient accumulation and high labeling density of our functionalized α-NH2-ω-N3-C6-ceramide in both cells and bacteria enables in combination with tenfold expansion nanoscale resolution (10-20 nm) of the interaction of proteins with the plasma membrane, membrane of organelles and bacteria. Ceramide is the central molecule of the sphingolipid metabolism, an important constituent of cellular membranes and regulates many important cellular processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Many studies report about the importance of sphingolipids during infection of various pathogens. While the transport of ceramide to Chlamydia has been reported earlier, one of the unanswered questions remaining was if ceramide forms parts of the outer or inner bacterial membrane. Expansion of α-NH2-ω-N3-C6-ceramide enabled the visualization of ceramide in the inner and outer membrane of C. trachomatis and their distance was determined to be 27.6 ± 7.7 nm.
N2  - Aufgrund der Beugungseigenschaften des Lichtes wurde bereits 1873 durch Ernst Abbe für die Lichtmikroskopie eine theoretische Auflösungsgrenze von 200-250 nm definiert. Durch die Einführung verschiedener hochauflösender Mikroskopiemethoden, wie beispielsweise SIM-Mikroskopie (structured illumination microscopy), STED-Mikroskopie (stimulated emission depletion) und (d)STORM-Mikroskopie ((direct) stochastic optical reconstruction microscopy), konnte im letzten Jahrzehnt jedoch die Auflösung auf unter 100 nm verbessert werden. Allerdings benötigen solche Hochauflösungstechniken sowohl spezialisierte und kostenintensive Geräte als auch Expertenwissen zur Vermeidung von Artefakten, sodass diese nur in wenigen Laboren angewendet werden können. Ein alternativer Ansatz, die sogenannte Expansionsmikroskopie, wurde kürzlich von der Arbeitsgruppe um Ed Boyden etabliert. Hierbei wird eine Probe mit einem quellfähigen Gel vernetzt, welches daraufhin isotrop expandiert wird, sodass auch an konventionellen konfokalen Mikroskopen Hochauflösung ermöglicht wird. Seit ihrer Einführung im Jahre 2015 hat sich die Expansionsmikroskopie schnell entwickelt und bietet Protokolle für 4-fache, 10-fache oder sogar 20-fache Expansion von Proteinen als auch RNA in Zellen oder sogar komplexen Geweben.
Mitochondrien besitzen zwei Membranen und sind für die Zelle von großer Bedeutung, da sie eine Vielzahl wichtiger Aufgaben übernehmen - von der ATP-Produktion durch die oxidative Phosphorylierung über die Produktion vieler wichtiger Metabolite bis hin zur Regulation zellulärer Signalwege. Die innere Mitochondrienmembran ist stark gefaltet und bildet Einstülpungen, die sogenannten Cristae, in welchen die oxidative Phosphorylierung und somit die Energieumwandlung und ATP-Synthese stattfindet.  Morphologische Veränderungen der Cristae können sowohl beim Altern von Zellen, als auch bei verschiedenen Infektionen beobachtet werden und können darüber hinaus auch im Rahmen diverser Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Diabetes oder neurodegenerativen Erkrankungen auftreten. Die Visualisierung der Cristae durch Fluoreszenzmikroskopie ist herausfordernd, da der Abstand zwischen einzelnen Cristae oftmals unter 100 nm beträgt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Expression der mitochondrialen Kreatinkinase gekoppelt an das Fluoreszenzprotein GFP (MtCK-GFP) als Cristaemarker genutzt werden kann. In Kombination mit vierfacher Expansion ermöglicht unser Marker die Untersuchung morphologischer Veränderungen von Cristae, sowie die Lokalisierung mitochondrialer Proteine relativ zu den Cristae. Darüber hinaus wird im Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit der Expansionsmikroskopie für mehrere bakterielle Pathogene, und zwar Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae und Staphylococcus aureus, gezeigt.  Hierbei verdeutlichen wir wichtige Aspekte für den vollständigen Verdau unterschiedlicher bakterieller Zellwände und somit isotropen Expansion. Die Expansion der intrazellulären Pathogene C. trachomatis und S. negevensis ermöglichte es uns an konventionellen konfokalen Mikroskopen zwischen den zwei verschiedenen Entwicklungsstadien, der katabolisch aktiven Retikulärkörperchen (RBs) und der infektiösen Elementarkörperchen (EBs), zu unterscheiden. Außerdem konnte die Möglichkeit der präzisen Lokalisierung chlamydialer Proteine wie CPAF und Cdu1 innerhalb und außerhalb der chlamydialen Inklusion gezeigt werden und Bakterien, in diesem Fall S. aureus, in LAMP1 und LC3-II Vesikeln visualisiert werden. Mit der Einführung des unnatürlichen α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides, präsentieren wir zudem ein erstes Konzept für die Expansion von Lipiden, welches möglicherweise auch für deutlich unzugänglichere Molekülklassen wie beispielsweise Kohlehydrate geeignet ist. Die effiziente Akkumulierung unseres funktionalisierten α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides in Zellen sowie Bakterien ermöglicht in Kombination mit zehnfacher Expansion die Untersuchung der Interaktion von Proteinen mit der Zellmembran, Membranen von Organellen und Bakterien mit einer räumlichen Auflösung von 10-20 nm. Ceramid ist das zentrale Molekül des Sphingolipidstoffwechsels, ein wichtiger Baustein zellulärer Membrane und reguliert viele essentielle Prozesse wie die Zelldifferenzierung, die Proliferation als auch die Apoptose. Viele Studien berichten von der Bedeutung der Sphingolipide während der Infektion verschiedener Pathogene. So wurde beispielsweise zuvor berichtet, dass Ceramide aktiv zu Chlamydien transportiert und in deren Membranen eingebaut werden. Hierbei verblieb allerdings die Frage, ob Ceramide in der äußeren oder inneren bakteriellen Membran lokalisiert sind. Die Expansion unseres α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides ermöglichte es uns Ceramide in der inneren und äußeren Membran von C. trachomatis zu visualisieren und den Abstand zwischen beiden Membranen auf 27.6 ± 7.7 nm zu bestimmen.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Mitochondrium
KW  - Chlamydia trachomatis
KW  - Ceramide
KW  - Superresolution microscopy
KW  - Expansion microscopy
KW  - Mitochondria
KW  - Intracellular bacteria
KW  - Hochauflösungsmikroskopie
KW  - Expansionsmikroskopie
KW  - Mitochondrien
KW  - Intrazelluläre Bakterien
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223330
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TY  - THES
A1  - Gentzsch, Christian
T1  - Molecular Imaging of Opioid Receptors and Butyrylcholinesterase with Selective, Tailored Probes Using Positron Emission Tomography and Fluorescence Microscopy
T1  - Molekulare Bildgebung von Opioidrezeptoren und Butyrylcholinesterase mit selektiven, maßgeschneiderten Verbindungen durch Positronen-Emissions-Tomographie und Fluoreszenzmikroskopie
N2  - The present thesis concerns the molecular imaging of opioid receptors and human butyrylcholinesterase with the aid of tailored probes, which are suitable for the respective applied imaging techniques. The first part focusses on imaging of opioid receptors with selective probes using total internal reflection- and single molecule fluorescence microscopy. Design and synthesis of the ligands are presented and their pharmacological characterization and application in microscopy experiments are shown. The second part of this thesis focused on the development of 18F-labeled, selective radiotracers for imaging of butyrylcholinesterase via positron emission tomography. The design and synthesis of each a reversible and pseudoirreversible 18F-labeled tracer are presented. After evaluation of the binding properties of each tracer, their initial application in ex vivo autoradiography- and preliminary in vivo microPET studies is described and analyzed.
N2  - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularen Bildgebung von Opioidrezeptoren und der humanen Butyrylcholinesterase mithilfe von maßgeschneiderten Verbindungen, die jeweils optimal geeignet für die angewendeten Bildgebungstechniken sind. Der erste Teil behandelt die Bildgebung von Opioidrezeptoren durch selektive Liganden mittels interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie- und Einzelmolekül-Mikroskopie. Design und Synthese der Liganden werden beschrieben und ihre pharmakologische Charakterisierung und Anwendung in Mikroskopieexperimenten werden gezeigt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von 18F-markierten, selektiven Radiotracern für die Bildgebung der Butyrylcholinesterase mittels Positronen-Emissions-Tomographie. Das Design und die Synthese jeweils eines reversiblen und pseudo-irreversiblen, 18F-markierten Tracers werden beschrieben. Nach der Bewertung der Bindungseigenschaften beider Tracer am Enzym, wird ihre erste Anwendung in ex vivo Autoradiographie- und vorläufigen in vivo microPET Studien beschrieben und ausgewertet.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Positronen-Emissions-Tomografie
KW  - Opiatrezeptor
KW  - Dimerisierung
KW  - Enzyminhibitor
KW  - Fluoreszenzliganden
KW  - Biodistribution
KW  - Autoradiographie
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247529
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TY  - THES
A1  - Eiring, Patrick
T1  - Super-resolution microscopy of plasma membrane receptors
T1  - Hochauflösende Mikroskopie von Plasmamembran Rezeptoren
N2  - Plasma membrane receptors are the most crucial and most commonly studied components of cells, since they not only ensure communication between the extracellular space and cells, but are also responsible for the regulation of cell cycle and cell division. The composition of the surface receptors, the so-called "Receptome", differs and is characteristic for certain cell types. Due to their significance, receptors have been important target structures for diagnostic and therapy in cancer medicine and often show aberrant expression patterns in various cancers compared to healthy cells. However, these aberrations can also be exploited and targeted by different medical approaches, as in the case of personalized immunotherapy. In addition, advances in modern fluorescence microscopy by so-called single molecule techniques allow for unprecedented sensitive visualization and quantification of molecules with an attainable spatial resolution of 10-20 nm, allowing for the detection of both stoichiometric and expression density differences. 
In this work, the single molecule sensitive method dSTORM was applied to quantify the receptor composition of various cell lines as well as in primary samples obtained from patients with hematologic malignancies. The focus of this work lies on artefact free quantification, stoichiometric analyses of oligomerization states and co localization analyses of membrane receptors.
Basic requirements for the quantification of receptors are dyes with good photoswitching properties and labels that specifically mark the target structure without generating background through non-specific binding. To ensure this, antibodies with a predefined DOL (degree of labeling) were used, which are also standard in flow cytometry. First background reduction protocols were established on cell lines prior analyses in primary patient samples. Quantitative analyses showed clear expression differences between the cell lines and the patient cells, but also between individual patients.
An important component of this work is the ability to detect the oligomerization states of receptors, which enables a more accurate quantification of membrane receptor densities compared to standard flow cytometry. It also provides information about the activation of a certain receptor, for example of FLT3, a tyrosine kinase, dimerizing upon activation. For this purpose, different well-known monomers and dimers were compared to distinguish the typical localization statistics of single bound antibodies from two or more antibodies that are in proximity. Further experiments as well as co localization analyses proved that antibodies can bind to closely adjacent epitopes despite their size.
These analytical methods were subsequently applied for quantification and visualization of receptors in two clinically relevant examples. Firstly, various therapeutically relevant receptors such as CD38, BCMA and SLAMF7 for multiple myeloma, a malignant disease of plasma cells, were analyzed and quantified on patient cells. Furthermore, the influence of TP53 and KRAS mutations on receptor expression levels was investigated using the multiple myeloma cell lines OPM2 and AMO1, showing clear differences in certain receptor quantities. 
Secondly, FLT3 which is a therapeutic target receptor for acute myeloid leukemia, was quantified and stoichiometrically analyzed on both cell lines and patient cells. In addition, cells that have developed resistance against midostaurin were compared with cells that still respond to this type I tyrosine-kinase-inhibitor for their FLT3 receptor expression and oligomerization state.
N2  - Plasmamembranrezeptoren sind die wohl wichtigsten und meist untersuchten Komponenten einer Zelle, da sie nicht nur die Kommunikation zwischen dem extrazellulären Bereich und den Zellen gewährleisten, sondern auch für die Regulierung des Zellzyklus und der Zellteilung zuständig sind. Dabei unterscheidet sich die Zusammensetzung der Oberflächenrezeptoren, das sogenannte „Rezeptom“, und ist charakteristisch für bestimme Zelltypen. Aufgrund ihrer Bedeutsamkeit sind Rezeptoren wichtige Zielstrukturen für Diagnose und Therapie in der Krebsmedizin, welche häufig bei verschiedensten Krebserkrankungen im Vergleich zu gesunden Zellen aberrante Expressionsmuster aufweisen. Diese Abweichungen können sich allerdings auch zu Nutze gemacht werden und zum Ziel verschiedener medizinischer Behandlungsmethoden, wie es bei der personalisierten Immuntherapie der Fall ist, werden. Zusätzlich hat der Fortschritt in der modernen Fluoreszenzmikroskopie durch sogenannte Einzelmolekültechniken, es auch erlaubt, eine noch nie dagewesene empfindliche Visualisierung und Quantifizierung von Molekülen mit einer räumlichen Auflösung von 10-20 nm zu erreichen, wodurch sowohl stöchiometrische Unterschiede, als auch Unterschiede in der Expressionsdichte detektiert werden können. 
In dieser Arbeit wurde die einzelmolekülsensitive Methode dSTORM genutzt, um die Rezeptorkomposition von verschiedenen Zelllinien aber auch von primären Patientenzellen mit zugrundeliegenden hämatologischen Erkrankungen zu quantifizieren. Schwerpunkte dieser Arbeit sind dabei die artefaktfreie Quantifizierung, stöchiometrische Analysen von Oligomerisierungszuständen, sowie die Kolokalisationsanalyse von Membranrezeptoren.
Grundvoraussetzung für die Quantifizierung von Rezeptoren sind dabei gut schaltbare Farbstoffe, sowie Label, welche die Zielstruktur spezifisch markieren ohne dabei Hintergrund durch unspezifische Bindung zu generieren. Um dies zu gewährleisten, kamen Antikörper mit einem vordefinierten DOL (degree of labeling; engl. für: Markierungsgrad) zum Einsatz, welche auch in der Durchflusszytometrie standardmäßig eingesetzt werden. Protokolle zur Hintergrundreduktion wurden dabei an Zelllinien etabliert, bevor Primärzellen von Krebspatienten analysiert wurden. Durch quantitative Analysen konnten dabei deutliche Expressionsunterschiede zwischen den Zelllinien und den Patientenzellen, aber auch zwischen den verschiedenen Patienten gezeigt werden.
Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit ist die Fähigkeit, den Oligomerisierungszustand von Rezeptoren zu erkennen, was eine genauere Quantifizierung der Membran-rezeptordichten im Vergleich zur Durchflusszytometrie ermöglicht. Allerdings können diese Oligomerisierungszustände auch Informationen über die Aktivierung eines Rezeptors beinhalten, wie zum Beispiel von FLT3, einer Tyrosinkinase, welche zur Aktivierung dimerisieren muss. Hierfür wurden verschiedene bekannte Monomere und Dimere verglichen, um die typische Lokalisationsstatistik von vereinzelten gebundenen Antikörpern mit der von zwei oder mehr Antikörpern, welche nah beieinanderliegen, zu vergleichen. Durch weitere Etablierungsexperimente sowie Kolokalisationsanalysen konnte außerdem bewiesen werden, dass Antikörper trotz ihrer Größe auch an nah benachbarte Epitope binden können.
Diese Analyseverfahren wurden im weiteren Verlauf zur Quantifizierung und Visualisierung von Rezeptoren an zwei klinisch relevanten Beispielen angewendet. Zum einen wurden verschiedene therapeutisch relevante Rezeptoren wie z.B. CD38, BCMA und SLAMF7 für das Multiple Myelom, einer malignen Erkrankung von Plasmazellen, auf Patientenzellen analysiert und quantifiziert. Zusätzlich wurde der Einfluss von TP53 und KRAS Mutationen auf die Rezeptorexpressionen anhand der Multiplen Myelom Zelllinien OPM2 und AMO1 untersucht, bei denen eindeutige Unterschiede in der Rezeptorexpression detektiert wurden. 
Zum anderen wurde FLT3, welches ein therapeutischer Zielrezeptor für die akute myeloische Leukämie ist, sowohl auf Zelllinien als auch auf Patientenzellen quantifiziert und stöchiometrisch analysiert. Hierbei wurden auch Zellen welche eine Midostaurinresistenz entwickelt haben mit Zellen, welche auf diesen Typ I Tyrosinkinase Inhibitor ansprechen, auf ihre FLT3 Rezeptorexpression und ihren Oligomerisierungszustand verglichen.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Membranrezeptor
KW  - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Super-resolution microscopy
KW  - Membrane receptor
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250048
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zwettler, Fabian Ulrich
T1  - Expansionsmikroskopie kombiniert mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie
T1  - Expansion Microscopy combined with Super-Resolution Fluorescence Microscopy
N2  - Fluorescence microscopy is a form of light microscopy that has developed during the 20th century and is nowadays a standard tool in Molecular and Cell biology for studying the structure and function of biological molecules. High-resolution fluorescence microscopy techniques, such as dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) allow the visualization of cellular structures at the nanometre scale (10−9 m). This has already made it possible to decipher the composition and function of various biopolymers, such as proteins, lipids and nucleic acids, up to the three-dimensional (3D) structure of entire organelles. In practice, however, it has been shown that these imaging methods and their further developments still face great challenges in order to achieve an effective resolution below ∼ 10 nm. This is mainly due to the nature of labelling biomolecules. For the detection of molecular structures, immunostaining is often performed as a standard method. Antibodies to which fluorescent molecules are coupled, recognize and bind specifcally and with high affnity to the molecular section of the target structure, also called epitope or antigen. The fluorescent molecules serve as reporter molecules which are imaged with the use of a fluorescence microscope. However, the size of these labels with a length of about 10-15 nm in the case of immunoglobulin G (IgG) antibodies, cause a detection of the fluorescent molecules shifted to the real position of the studied antigen. In dense regions where epitopes are located close to each other, steric hindrance between antibodies can also occur and leads to an insuffcient label density. Together with the shifted detection of fluorescent molecules, these factors can limit the achievable resolution of a microscopy technique. Expansion microscopy (ExM) is a recently developed technique that achieves a resolution improvement by physical expansion of an investigated object. Therefore, biological samples such as cultured cells, tissue sections, whole organs or isolated organelles are chemically anchored into a swellable polymer. By absorbing water, this so-called superabsorber increases its own volume and pulls the covalently bound biomolecules isotropically apart. Routinely, this method achieves a magnifcation of the sample by about four times its volume. But protocol variants have already been developed that result in higher expansion factors of up to 50-fold. Since the ExM technique includes in the frst instance only the sample treatment for anchoring and magnifcation of the sample, it can be combined with various standard methods of fluorescence microscopy. In theory, the resolution of the used imaging technique improves linearly with the expansion factor of the ExM treated sample. However, an insuffcient label density and the size of the antibodies can here again impair the effective achievable resolution. The combination of ExM with high-resolution fluorescence microscopy methods represents a promising strategy to increase the resolution of light microscopy. In this thesis, I will present several ExM variants I developed which show the combination of ExM with confocal microscopy, SIM (Structured Illumination Microscopy), STED (STimulated Emission Depletion) and dSTORM. I optimized existing ExM protocols and developed different expansion strategies, which allow the combination with the respective imaging technique. Thereby, I gained new structural insights of isolated centrioles from the green algae Chlamydomonas reinhardtii by combining ExM with STED and confocal microscopy. In another project, I combined 3D-SIM imaging with ExM and investigated the molecular structure of the so-called synaptonemal complex. This structure is formed during meiosis in eukaryotic cells and contributes to the exchange of genetic material between homologous chromosomes. Especially in combination with dSTORM, the ExM method showed its high potential to overcome the limitations of modern fluorescence microscopy techniques. In this project, I expanded microtubules in mammalian cells, a polymer of the cytoskeleton as well as isolated centrioles from C. reinhardtii. By labelling after expansion of the samples, I was able to signifcantly reduce the linkage error of the label and achieve an improved label density. In future, these advantages together with the single molecule sensitivity and high resolution obtained by the dSTORM method could pave the way for achieving molecular resolution in fluorescence microscopy
N2  - Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Form der Lichtmikroskopie, die sich im Laufe des 20. Jahrhunderts entwickelt hat und heutzutage standardmäßig in der Molekular-und Zellbiologie zur Erforschung von Aufbau und Funktion biologischer Moleküle eingesetzt wird. Hochauflösende Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, wie die dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Technik, ermöglichen die Visualisierung zellulärer Strukturen im Nanometer-Größenbereich (10−9 m). Dadurch konnte bereits die Zusammensetzung und Funktion unterschiedlicher Biopolymere, wie die von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren, bis hin zum dreidimensionalen (3D) Aufbau ganzer Organellen entschlüsselt werden.
In der Praxis zeigt sich jedoch, dass diese Bildgebungsverfahren und ihre Weiterentwicklungen immer noch vor großen Herausforderungen stehen, bevor eine effektive Auflösung von unter ∼10 nm erreicht werden kann. Die größte Hürde stellt die Art und Weise der Markierung von Biomolekülen dar. Bei dieser wird zum Nachweis molekularer Strukturen häufig die sogenannte Immunfärbung als Standardmethode eingesetzt. Antikörper, welche mit Fluoreszenzmolekülen gekoppelt werden, erkennen und binden hierbei spezifisch und mit hoher Affinität den Molekülabschnitt der Zielstruktur, auch Epitop oder Antigen genannt. Die Fluoreszenzmoleküle dienen als Reportermoleküle, welche mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops abgebildet werden. Die Größe der Antikörper, mit einer Länge von etwa 10-15 nm im Falle von Immunglobulin G (IgG) Antikörpern, bewirkt jedoch eine Detektion der fluoreszierenden Moleküle verschoben zur eigentlichen Lage des untersuchten Antigens. In Regionen mit räumlich dicht nebeneinander liegenden Epitopen kann es zusätzlich zur sterischen Hinderung zwischen den Antikörpern kommen. Dies führt zu einer unzureichenden Markierungsdichte und stellt - zusammen mit der verschobenen Detektion der Fluoreszenzmoleküle - eine Limitierung der zu erreichenden Auflösung dar.
Die Expansionsmikroskopie (ExM) ist ein neu entwickeltes Verfahren, welches eine Auflösungsverbesserung durch die physikalische Expansion eines untersuchten Objekts erreicht. Hierbei werden biologische Proben, wie beispielsweise kultivierte Zellen, Gewebeschnitte, ganze Organe oder isolierte Organellen, chemisch in ein quellbares Polymer verankert. Durch Absorption von Wasser vergrößert dieser sogenannte Superabsorber sein eigenes Volumen und zieht während der räumlichen Expansion die kovalent gebundenen Biomoleküle isotrop auseinander. Standardmäßig wird durch dieses Verfahren eine Vergrößerung der Proben um etwa das vierfache Volumen erreicht, wobei bereits Protokollvarianten entwickelt wurden, die eine bis zu 50-fache Expansion erzielt haben.
Da die ExM-Technik zunächst nur die Probenbehandlung zur Verankerung und Vergrößerung der Probe selbst beinhaltet, kann sie mit unterschiedlichen Standardmethoden der Fluoreszenzmikroskopie kombiniert werden. Dadurch verbessert sich die Auflösung des verwendeten Bildgebungsverfahrens theoretisch linear um den Faktor der Volumenvergrößerung der ExM behandelten Probe. Eine unzureichende Markierungsdichte und die Größe der verwendeten Antikörper können auch hier die effektiv erreichbare Auflösung beeinträchtigen. Die Kombination der ExM mit hochauflösenden Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie stellt eine vielversprechende Strategie zur Erhöhung der bisher erreichbaren Auflösung in der Lichtmikroskopie dar.
In dieser Arbeit werde ich mehrere von mir entwickelte ExM Varianten vorstellen, welche die Kombination von ExM mit konfokaler Mikroskopie, SIM (Structured Illumination Microscopy), STED (STimulated Emission Depletion) und dSTORM zeigen. Um die Verbindung mit dem jeweiligen Bildgebungsverfahren zu ermöglichen, optimierte ich bestehende ExM-Protokolle und entwickelte unterschiedliche Expansionsstrategien. Dadurch konnte ich neue strukturelle Erkenntnisse von isolierten Zentriolen aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii durch die Verbindung von ExM mit STED und konfokaler Mikroskopie gewinnen. In einem weiteren Projekt kombinierte ich 3D-SIM mit ExM und untersuchte den molekularen Aufbau des sogenannten synaptonemalen Komplexes. Diese Struktur bildet sich in eukaryotischen Zellen während der Reifeteilung (Meiose) aus und trägt zum Austausch des genetischen Materials zwischen homologen Chromosomen bei.
Vor allem in Verbindung mit dSTORM zeigte sich das hohe Potential der ExM-Methode, die bisherigen Limitierungen moderner Techniken der Fluoreszenzmikroskopie zu überwinden. In diesem Projekt expandierte ich Mikrotubuli in Säugetierzellen, ein Polymer des Zytoskeletts, sowie isolierte Zentriolen aus C. reinhardtii. Dadurch, dass die Markierung erst nach dem Expandieren der Proben erfolgte, gelang es, den Abstandsfehler der Markierung deutlich zu verringern und eine verbesserte Markierungsdichte zu erreichen. Diese Vorteile könnten in Verbindung mit der Einzelmolekülsensititvität und hohen Auflösung der dSTORM Methode Wegbereiter zur Erreichung einer molekularen Auflösung sein
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Expansionsmikroskopie
KW  - Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie
KW  - Zentriolen
KW  - Synaptonemaler Komplex
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212362
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