TY - THES A1 - Lauber, Paloma T1 - Die Rolle individueller NFAT-Faktoren in Lymphozyten und Keratinozyten T1 - The role of individual NFAT factors in lymphocytes and keratinocytes N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2 in NK-Zellen und die Rolle der Faktoren NFATc1-4 und NFAT5 in Keratinozyten analysiert. Die Familie der Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) Transkriptionsfaktoren besteht aus fünf Mitgliedern, welche entscheidend die Gentranskription bei Immunantworten beeinflussen. Nach Antigenaktivierung wird in Lymphozyten die Expression des Nfatc1-Gens stark induziert. Die Akkumulation der dabei gebildeten kurzen Isoform NFATc1/αA ist für die Zytokinproduktion als Effektorfunktion sowie für die Proliferation und das Überleben aktivierter Zellen verantwortlich. Das kurze NFATc1-Protein unterscheidet sich nicht nur strukturell, sondern auch funktionell von fast allen anderen NFAT-Proteinen. Um neue Erkenntnisse über die Funktion der Isoform NFATc1/αA in Lymphozyten zu gewinnen, wurden KT12 NK-Zellen mit NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2- exprimierenden Vektoren transfiziert, geklont, stimuliert und anschließend auf ihre jeweilige Apoptoserate und die Zytokinsynthese bzw. -expression hin untersucht. Die gewählten KT12-Hybridoma-Zellen erwiesen sich allerdings in ihrer intendierten Funktion als Testzellen für die Über-Expression von NFATc-Proteinen in NK-Zellen als ungeeignet. Fehlregulationen von NFAT-Signalwegen werden mit einer fehlerhaften Entwicklung des Immunsystems, mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und mit Krebs in Verbindung gebracht. Um die Rolle von NFAT-Faktoren in Keratinozyten besser zu verstehen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten mit Differenzierungssignalen bzw. UVB-Licht stimuliert. Änderungen der Transkription von NFAT-Faktoren, Keratinozyten-spezifischen Proteinen und Chemokinen wurden mittels qRT-PCR-Assays detektiert und analysiert. Insgesamt konnte die Beteiligung von NFAT-Faktoren am Differenzierungsprozess und an der UV-Antwort von Keratinozyten gezeigt werden. Es zeigte sich tendenziell eine stärkere Induktion der kurzen NFATc1-Isoform im Vergleich zu langen NFATc1-Isoformen, was die Frage nach einer besonderen Funktion der kurzen NFATc1-Isoform in Keratinozyten aufwirft. Generell ließen sich besonders hohe Expressionslevel des Transkriptionsfaktors NFAT5 - verglichen mit anderen NFAT-Faktoren - messen. Für die Entwicklung von Therapien, welche die Ursachen und Folgen einer dysregulierten Hautbarrierenbildung behandeln, könnten sich weitere Studien zu einzelnen NFAT-Faktoren bzw. NFATc1-Isoformen als zielführend erweisen. N2 - In the present work the role of the transcription factors NFATc1/αA or NFATc1/ßC and NFATc2 in NK cells and the role of the factors NFATc1-4 and NFAT5 in keratinocytes were investigated. The nuclear factor of activated T-cell (NFAT) transcription factor family consists of five members that critically influence gene transcription in immune responses. Following antigen activation, expression of the Nfatc1 gene is strongly induced in lymphocytes. Accumulation of the short NFATc1/αA isoform - formed in this process - is responsible for cytokine production as an effector function and for proliferation along with the survival of activated cells. The short NFATc1 protein differs not only structurally but also functionally from almost all other NFAT proteins. To gain new insights into the function of the NFATc1/αA isoform in lymphocytes, KT12 NK cells were transfected with NFATc1/αA, NFATc1/ßC or NFATc2- expressing vectors. The KT12 cells were cloned, stimulated and subsequently analyzed for their respective apoptosis rates together with cytokine synthesis or expression. However, the selected KT12 hybridoma cells proved to be unsuitable in their function as test cells for the overexpression of NFATc proteins in NK cells. Misregulation of NFAT signaling pathways has been associated with defective development of the immune system and autoimmune diseases and cancer. To better understand the role of NFAT factors in keratinocytes, HaCaT cells and primary human keratinocytes were stimulated with differentiation signals and UVB light, respectively. Changes in transcription of NFAT factors, keratinocyte-specific proteins and chemokines were detected and analyzed by qRT-PCR assays. Overall, the involvement of NFAT factors in the differentiation process and UV response of keratinocytes was demonstrated. The short NFATc1 isoform tended to be more strongly induced compared with long NFATc1 isoforms, raising the question of a special function of the short NFATc1 isoform in keratinocytes. Particularly high expression levels of the transcription factor NFAT5 - compared to other NFAT factors - could be measured. For the development of therapies that treat the causes and consequences of dysregulated skin barrier formation further studies on individual NFAT factors or NFATc1 isoforms will prove useful. KW - Keratinozyt KW - Natürliche Killerzelle KW - Transkriptionsfaktor KW - Chemokin CXCL10 KW - Chemokine KW - NFAT KW - Differenzierung KW - UV-Strahlung KW - Keratine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240119 ER - TY - JOUR A1 - Majumder, Snigdha A1 - Jugovic, Isabelle A1 - Saul, Domenica A1 - Bell, Luisa A1 - Hundhausen, Nadine A1 - Seal, Rishav A1 - Beilhack, Andreas A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Mougiakakos, Dimitrios A1 - Berberich-Siebelt, Friederike T1 - Rapid and Efficient Gene Editing for Direct Transplantation of Naive Murine Cas9\(^+\) T Cells JF - Frontiers in Immunology N2 - Gene editing of primary T cells is a difficult task. However, it is important for research and especially for clinical T-cell transfers. CRISPR/Cas9 is the most powerful gene-editing technique. It has to be applied to cells by either retroviral transduction or electroporation of ribonucleoprotein complexes. Only the latter is possible with resting T cells. Here, we make use of Cas9 transgenic mice and demonstrate nucleofection of pre-stimulated and, importantly, of naive CD3\(^+\) T cells with guideRNA only. This proved to be rapid and efficient with no need of further selection. In the mixture of Cas9\(^+\)CD3\(^+\) T cells, CD4\(^+\) and CD8\(^+\) conventional as well as regulatory T cells were targeted concurrently. IL-7 supported survival and naivety in vitro, but T cells were also transplantable immediately after nucleofection and elicited their function like unprocessed T cells. Accordingly, metabolic reprogramming reached normal levels within days. In a major mismatch model of GvHD, not only ablation of NFATc1 and/or NFATc2, but also of the NFAT-target gene IRF4 in naïve primary murine Cas9\(^+\)CD3\(^+\) T cells by gRNA-only nucleofection ameliorated GvHD. However, pre-activated murine T cells could not achieve long-term protection from GvHD upon single NFATc1 or NFATc2 knockout. This emphasizes the necessity of gene-editing and transferring unstimulated human T cells during allogenic hematopoietic stem cell transplantation. KW - CRISPR/Cas9 KW - gRNA-only KW - GvHD KW - metabolism KW - NFAT KW - naive T-cell gene editing KW - T-cell transfer KW - IRF4 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242896 SN - 1664-3224 VL - 12 ER -