TY - THES A1 - Wolter, Steve T1 - Single-molecule localization algorithms in super-resolution microscopy T1 - Einzelmoleküllokalisierungsalgorithmen in der superauflösenden Mikroskopie N2 - Lokalisationsmikroskopie ist eine Methodenklasse der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, deren Methoden sich durch stochastische zeitliche Isolation der Fluoreszenzemission auszeichnen. Das Blinkverhalten von Fluorophoren wird so verändert, dass gleichzeitige Aktivierung von einander nahen Fluorophoren unwahrscheinlich ist. Bekannte okalisationsmikroskopische Methoden umfassen dSTORM, STORM, PALM, FPALM, oder GSDIM. Lokalisationsmikroskopie ist von hohem biologischem Interesse, weil sie die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops bei minimalem technischem Aufwand um eine Größenordnung verbessert. Der verbundene Rechenaufwand ist allerdings erheblich, da Millionen von Fluoreszenzemissionen einzeln mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden müssen. Der Rechen- und Implementationsaufwand dieser Auswertung hat die Verbreitung der superauflösenden Mikroskopie lange verzögert. Diese Arbeit beschreibt meine algorithmische Grundstruktur für die Auswertung lokalisationsmikroskopischer Daten. Die Echtzeitfähigkeit, d.h. eine Auswertegeschwindigkeit oberhalb der Datenaufnahmegeschwindigkeit an normalen Messaufbauten, meines neuartigen und quelloffenen Programms wird demonstriert. Die Geschwindigkeit wird auf verbrauchermarktgängigen Prozessoren erreicht und dadurch spezialisierte Rechenzentren oder der Einsatz von Grafikkarten vermieden. Die Berechnung wird mit dem allgemein anerkannten Gaussschen Punktantwortmodell und einem Rauschmodell auf Basis der größten Poissonschen Wahrscheinlichkeit durchgeführt. Die algorithmische Grundstruktur wird erweitert, um robuste und optimale Zweifarbenauswertung zu realisieren und damit korrelative Mikroskopie zwischen verschiedenen Proteinen und Strukturen zu ermöglichen. Durch den Einsatz von kubischen Basissplines wird die Auswertung von dreidimensionalen Proben vereinfacht und stabilisiert, um präzisem Abbilden von mikrometerdicken Proben näher zu kommen. Das Grenzverhalten von Lokalisationsalgorithmen bei hohen Emissionsdichten wird untersucht. Abschließend werden Algorithmen für die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf verbreitete Probleme der Biologie aufgezeigt. Zelluläre Bewegung und Motilität werden anhand der in vitro Bewegung von Myosin-Aktin-Filamenten studiert. Lebendzellbildgebung mit hellen und stabilen organischen Fluorophoren wird mittels SNAP-tag-Fusionsproteinen realisiert. Die Analyse des Aufbaus von Proteinklumpen zeigt, wie Lokalisationsmikroskopie neue quantitative Ansätze jenseits reiner Bildgebung bietet. N2 - Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost. However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time. In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data. I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them. I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units. The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model. I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples. I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities. Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems. I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging. KW - super-resolution microscopy KW - fluorescence KW - scientific computing KW - dSTORM KW - localization microscopy KW - PALM KW - 3D microscopy KW - two-color microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Bildauflösung KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109370 ER - TY - THES A1 - Klein, Teresa T1 - Lokalisationsmikroskopie für die Visualisierung zellulärer Strukturen T1 - Localization Microscopy for the visualization of cellular structures N2 - Die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Auflösung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierfür photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz räumlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu können. Aus tausenden Einzelmolekül-Lokalisationen wird ein künstliches, hochaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die hochauflösende Mikroskopie ist grade für die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzelluläre Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu können. Als Marker können sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. Während die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der höheren Photonenausbeute eine präzisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren über sogenannte chemische Tags ermöglicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gefärbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich für die Hochauflösung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Für besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings können unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfläche mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photoschädigung möglichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die Möglichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu können, stellt einen großen Gewinn für die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der ursprünglich farbstoffgekoppelte Antikörper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgeklärt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellulär vorhandene Peptide größere Aggregate formen als die im extrazellulären Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen. N2 - The implementation of fluorescence microscopy enables specific labeling and studying of cellular structures with high contrast. Since light microscopy is limited in its resolution, structural information at the molecular level remains hidden. This barrier, known as diffraction limit, can be circumvented by modern imaging techniques. For this purpose localization microscopy employs photoswitchable fluorophores. The fluorescence of these fluorophores is spatially and temporally separated in order to localize single fluorophores with nanometer precision. From thousands of single-molecule localizations an artificial highresolution image is reconstructed. Super-resolution microscopy is a valuable tool for live-cell observations in order to investigate sub-cellular structures and protein dynamics beyond the diffraction limit under physiological conditions. Both photoactivatable fluorescent proteins and photoswitchable organic fluorophores can be used as labels. Whereas labeling with fluorescent proteins is straightforward to implement, organic fluorophores, however, have the Advantage of a more precise localization due to a higher photon yield. In living cells, labeling of structures with synthetic fluorophores is facilitated by so-called chemical tags. Those are polypeptide sequences that are genetically fused to the target protein and subsequently labeled with dye coupled substrates. In this work, on the basis of the model structure H2B—a histone protein—dyes are identified in combination with chemical tags, that can be successfully used for super-resolution imaging with direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in living cells. The dyes tetramethylrhodamine, 505 and Atto 655 proved to be particularly suitable, whereby the whole spectral range is represented. However, unspecific binding and dye aggregation can pose a problem for the efficient labeling of living cells. It is shown, that coating the glass surface with glycine successfully minimizes unspecific adsorption of fluorophores. Furthermore the impact of the excitation light on living cells is discussed. Methods are presented to keep photodamage at a minimum, e. g., by choosing a dye within the red excitation range. The feasibility to label living cells with photoswitchable organic fluorophores represents a big asset for localization microscopy, which originally employed dye labeled antibodies. This alternative labeling technique is used in a collaboration to study the aggregation behavior of � -Amyloid peptides, which cause Alzheimer’s disease. By means of HeLa cells, different diffraction limited morphologies of aggregates are revealed. It is thereby shown, that intracellular peptides generate larger aggregates than the ones in the extracellular region. In another collaboration the structural organization of two flotillin proteins in the membrane of bacteria is examined by means of the photoactivatable Protein mEos2 and photoactivated localization microscopy (PALM). These proteins form two clusters with different diameters, which could be determined with nanometer precision. It was also asserted that both proteins exist in unequal numbers within the bacterium. KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Zellmarker KW - dSTORM KW - PALM KW - live-cell KW - Hochauflösung KW - Zellmarkierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99260 ER - TY - THES A1 - Heidbreder, Meike T1 - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells T1 - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen N2 - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.   N2 - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären. KW - Fluoreszenzmikrosopie KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Hochauflösendes Verfahren KW - sptPALM KW - dSTORM KW - PALM KW - QDTI KW - TNF-R1 KW - TNF-R2 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191 ER - TY - JOUR A1 - Endesfelder, Ulrike A1 - Malkusch, Sebastian A1 - Flottmann, Benjamin A1 - Mondry, Justine A1 - Liguzinski, Piotr A1 - Verveer, Peter J. A1 - Heilemann, Mike T1 - Chemically Induced Photoswitching of Fluorescent Probes - A General Concept for Super-Resolution Microscopy N2 - We review fluorescent probes that can be photoswitched or photoactivated and are suited for single-molecule localization based super-resolution microscopy. We exploit the underlying photochemical mechanisms that allow photoswitching of many synthetic organic fluorophores in the presence of reducing agents, and study the impact of these on the photoswitching properties of various photoactivatable or photoconvertible fluorescent proteins. We have identified mEos2 as a fluorescent protein that exhibits reversible photoswitching under various imaging buffer conditions and present strategies to characterize reversible photoswitching. Finally, we discuss opportunities to combine fluorescent proteins with organic fluorophores for dual-color photoswitching microscopy. KW - Super-Resolution Microscopy KW - photoswitchable organic fluorophores KW - fluorescent proteins KW - super-resolution KW - PALM KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74896 ER - TY - JOUR A1 - Endesfelder, Ulrike A1 - Malkusch, Sebastian A1 - Flottmann, Benjamin A1 - Mondry, Justine A1 - Liguzinski, Piotr A1 - Verveer, Peter J. A1 - Heilemann, Mike T1 - Chemically Induced Photoswitching of Fluorescent Probes - A General Concept for Super-Resolution Microscopy JF - Molecules N2 - We review fluorescent probes that can be photoswitched or photoactivated and are suited for single-molecule localization based super-resolution microscopy. We exploit the underlying photochemical mechanisms that allow photoswitching of many synthetic organic fluorophores in the presence of reducing agents, and study the impact of these on the photoswitching properties of various photoactivatable or photoconvertible fluorescent proteins. We have identified mEos2 as a fluorescent protein that exhibits reversible photoswitching under various imaging buffer conditions and present strategies to characterize reversible photoswitching. Finally, we discuss opportunities to combine fluorescent proteins with organic fluorophores for dual-color photoswitching microscopy. KW - Photoactivated localization microscopy KW - Fusion proteins KW - Molecules KW - Patterns KW - Switch KW - Limit KW - Time KW - photoswitchable organic fluorophores KW - fluorescent proteins KW - super-resolution KW - PALM KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134080 VL - 16 IS - 4 ER -