TY - THES A1 - Mayer, Stefanie T1 - Differenzierte β-Arrestin2 Rekrutierung am μ-Opioid Rezeptor durch klinisch eingesetzte Opioide T1 - Differential Opioid-induced β-Arrestin2 Recruitment at the μ-Opioid Receptor Using Clinically Relevant Opioids N2 - Opioide gehören zu den potentesten Analgetika für die Behandlung akuter und chronischer Schmerzen, werden jedoch in ihrer Anwendung durch analgetische Toleranz aber auch Nebenwirkungen wie Abhängigkeit, Atemdepression und Obstipation limitiert. Opioid-Analgetika vermitteln dabei nahezu alle klinisch relevanten Wirkungen durch Stimulation des μ-Opioidrezeptors, einem G- Protein-gekoppelten Rezeptor. Die „klassische“ Signaltransduktion durch Aktivierung inhibitorischer Gi/0-Proteine kann durch G-Protein gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) und β-Arrestine negativ reguliert werden. Zusätzlich können durch β-Arrestin-Bindung an den Rezeptor G-Protein-unabhängige Signalwege aktiviert werden. Die genauen Mechanismen wie β-Arrestin- assoziierte Rezeptordesensibilisierung, -internalisierung und G-Protein- unabhängige Signalwege an der physiologischen Antwort und insbesondere an Toleranzentwicklung und Abhängigkeit von Opioid-Analgetika beteiligt sind, können bislang nicht ausreichend erklärt werden. In dieser Arbeit konnte in HEK293-Zellen mit Lebendzell-Konfokalmikroskopie und Luciferase-Komplementierung für 17 Opioide eine differenzierte β-Arrestin2- Rekrutierung zum μ-Opioidrezeptor gezeigt werden. Von den untersuchten Opioiden sind 13 häufig eingesetzte Opioid-Analgetika. Durch die Erstellung detaillierter pharmakologischer Profile ließen sich die Opioide bezüglich ihres β- Arrestin2-Rekrutierungsvermögens in Voll-, Partial und Antagonisten eingruppieren. Bemerkenswert war die fehlende β-Arrestin2-Rekrutierung für Buprenorphin, Tramadol und Tilidin, sodass diese interessante Substanzen für weitere Untersuchungen in physiologischerem Kontext sind. Durch Überexpression von GRK2 konnte die β-Arrestin2-Rekrutierung insbesondere für Partialagonisten gesteigert werden, was die Abhängigkeit der β-Arrestin- Rekrutierung vom GRK-Expressionslevel, das in verschiedenen Assays und Gewebetypen variieren kann, zeigt. Außerdem konnte ein heterogenes Bild der Rezeptorregulierung demonstriert werden, welches indirekt durch Endozytosehemmung unter Verwendung von Dynamin-Inhibitoren erfasst wurde. Die erhobenen Daten dienen als Anknüpfungspunkt für weiteren Arbeiten auf dem Gebiet der μ-Opioidrezeptorregulation. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen ist nötig, um sichere und nebenwirkungsärmere Opioid-Analgetika entwickeln zu können. N2 - Opioids remain among the most effective analgesics for the treatment of acute and chronic pain, but their clinical use is limited by analgesic tolerance and other side effects including dependence, respiratory depression and obstipation. Opioid analgesics exert nearly all their clinically relevant actions through stimulation of µ-opioid receptors, which belong to the family of G Protein-coupled receptors. “Classical” signaling through activation of inhibitory Gi/o Proteins can be negatively regulated via G Protein-coupled receptor kinases and β-Arrestins. Additionally, recruitment of β-Arrestins to the µ-opioid receptor can transduce G Protein independent signals. The detailed mechanisms how β-Arrestin-induced receptor desensitization, internalization and G Protein independent signaling mediate physiological effects including tolerance and dependence remains unclear. In this study using confocal live-cell imaging and split luciferase complementation in HEK293 cells 17 opioids showed differential β-Arrestin2 recruitment to the µ-opioid receptor. Of the opioids under investigation, 13 are frequently administered opioid analgesics. Detailed pharmacologic profiles of these opioids allowed for grouping into full agonists, partial agonist and antagonists in regards to β-Arrestin2 recruitment. Surprisingly, β-Arrestin2 recruitment was not detected for Buprenorphin, Tramadol and Tilidin, making these substances interesting candidates for further investigations in a more physiological setting. Overexpression of GRK2 led to increased β-Arrestin2 recruitment especially for partial agonists. This demonstrates the dependence on GRK expression level for β-Arrestin recruitment, which can vary between assays or cell types. Furthermore different opioids showed a heterogenous receptor regulation, assessed by inhibition of receptor endocytosis using dynamin inhibitors. The collected data serve as basis for further research on µ-receptor regulation. Better understanding of the molecular mechanisms is necessary for the development of safer opioid analgesics with fewer side effects. KW - Opiatrezeptor KW - µ-Opioid Rezeptor KW - Opioide KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Arrestine KW - beta-Arrestin2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240949 ER - TY - THES A1 - Schmid, Benedikt T1 - Molecular Signaling Mechanisms at the µ-Opioid Receptor T1 - Molekulare Signalmechanismen am µ-Opioidrezeptor N2 - To this day, opioids represent the most effective class of drugs for the treatment of severe pain. On a molecular level, all opioids in use today are agonists at the μ-opioid receptor (μ receptor). The μ receptor is a class A G protein-coupled receptor (GPCR). GPCRs are among the biological structures most frequently targeted by pharmaceuticals. They are membrane bound receptors, which confer their signals into the cell primarily by activating a variety of GTPases called G proteins. In the course of the signaling process, the μ receptor will be phosphorylated by GRKs, increasing its affinity for another entity of signaling proteins called β-arrestins (β-arrs). The binding of a β-arr to the activated μ receptor will end the G protein signal and cause the receptor to be internalized into the cell. Past research showed that the μ receptor’s G protein signal puts into effect the desired pain relieving properties of opioid drugs, whereas β-arr recruitment is more often linked to adverse effects like obstipation, tolerance, and respiratory depression. Recent work in academic and industrial research picked up on these findings and looked into the possibility of enhancing G protein signaling while suppressing β-arr recruitment. The conceptual groundwork of such approaches is the phenomenon of biased agonism. It appreciates the fact that different ligands can change the relative contribution of any given pathway to the overall downstream signaling, thus enabling not only receptor-specific but even pathway-specific signaling. This work examined the ability of a variety of common opioid drugs to specifically activate the different signaling pathways and quantify it by means of resonance energy transfer and protein complementation experiments in living cells. Phosphorylation of the activated receptor is a central step in the canonical GPCR signaling process. Therefore, in a second step, expression levels of the phosphorylating GRKs were enhanced in search for possible effects on receptor signaling and ligand bias. In short, detailed pharmacological profiles of 17 opioid ligands were recorded. Comparison with known clinical properties of the compounds showed robust correlation of G protein activation efficacy and analgesic potency. Ligand bias (i.e. significant preference of any path- way over another by a given agonist) was found for a number of opioids in native HEK293 cells overexpressing μ receptor and β-arrs. Furthermore, overexpression of GRK2 was shown to fundamentally change β-arr pharmacodynamics of nearly all opioids. As a consequence, any ligand bias as detected earlier was abolished with GRK2 overexpression, with the exception of buprenorhin. In summary, the following key findings stand out: (1) Common opioid drugs exert biased agonism at the μ receptor to a small extent. (2) Ligand bias is influenced by expression levels of GRK2, which may vary between individuals, target tissues or even over time. (3) One of the opioids, buprenorhin, did not change its signaling properties with the overexpression of GRK2. This might serve as a starting point for the development of new opioids which could lack the ability of β-arr recruitment altogether and thus might help reduce adverse side effects in the treatment of severe pain. N2 - Nach wie vor stellen Opioide die wirkstärkste Gruppe von Medikamenten zu Behandlung starker Schmerzen dar. Auf molekularer Ebene sind alle heute gebräuchlichen Opioide Agonisten am μ-Opioidrezeptor. Der μ-Opioidrezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) der Klasse A. GPCR zählen zu den häufigsten Zielstrukturen von Pharmaka. Sie sind membranständige Rezeptoren, die ihr Signal in erster Linie durch die Aktivierung von G-Proteine genannten GTPasen in die Zelle weiterleiten. Im Laufe des Signalprozesses wird der GPCR von GRK phosphoryliert, wodurch seine Affinität zu einer weiteren Gruppe von Signalproteinen, den sog. β-Arrestinen erhöht wird. Bindet ein β-Arrestin an den Rezeptor, beendet dies das G-Proteinsignal und veranlasst die Internalisierung des Rezeptors ins Zellinnere. Bisherige Forschung zeigte, dass das G-Proteinsignal des μ-Opioidrezeptors die erwünschte Schmerzlinderung vermittelt, wohingegen die Rekrutierung von β-Arrestin oftmals mit unerwünschten Wirkungen wie Obstipation, Toleranzentwicklung und Atemdepression in Verbindung gebracht wird. Neuere akademische und industrielle Forschung griff diese Erkenntnisse auf und erkundete die Möglichkeit, das G-Proteinsignal zu verstärken und zur gleichen Zeit die β-Arrestinrekrutierung zu inhibieren. Die theoretische Grundlage solcher Ansätze liegt im Konzept des biased agonism. Dieses berücksichtigt die Tatsache, dass verschiedene Liganden den Anteil eines bestimmten Signalweges am gesamten vom Rezeptor ausgehenden Signals beeinflussen kann und damit nicht nur rezeptor-, sondern sogar signalwegspezifische Signale möglich sein sollten. Die vorliegende Arbeit untersuchte eine Reihe von gängigen Opioiden auf ihre Fähigkeit hin, die einzelnen Signalwege spezifisch zu aktivieren und quantifizierte dies mit Methoden des Resonanzenergietransfers sowie der Proteinkomplementierung in lebenden Zellen. Die Phosphorylierung des Rezeptors ist ein zentrales Ereignis in der anerkannten Abfolge der Signalprozesse an GPCR. Daher wurde in einem weiteren Schritt die Expression der phosphorylierenden GRK erhöht und nach möglichen Auswirkungen auf die Selektivität der Signalwegaktivierung gesucht. Hierbei wurde detaillierte pharmakologische Profile von 17 Opioiden erstellt. Der Abgleich mit bekannten klinischen Wirkeigenschaften der Substanzen zeigte einen robusten Zusammenhang zwischen der Fähigkeit, G-Proteine zu aktivieren und der analgetischen Wirkstärke. Ligand bias, d.h. die signifikante Bevorzugung eines Signalweges gegenüber einem anderen durch einen Liganden, konnte für eine Reihe von Opioiden in lebenden HEK293-Zellen gezeigt werden, die den μ-Opioidrezeptor sowie β-Arrestine überexprimierten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die zusätzliche Überexpression von GRK2 die pharmakodynamischen Eigenschaften nahezu aller Opioide grundlegend veränderte. In der Folge war jeder zuvor gezeigte ligand bias mit Ausnahme von Buprenorphin aufgehoben. Zusammenfassend stehen die folgenden drei Erkenntnisse im Vordergrund: (1) Gängige Opioide zeigen in einem gewissen Maß Selektivität zwischen den Signalwegen. (2) Ligand bias wird beeinflusst von GRK2-Expressionsleveln, welche zwischen Individuen, verschiedenen Gewebetypen oder auch im zeitlichen Verlauf variieren können. (3) Als einziges der untersuchten Opioide änderte Buprenorphin seine Signaleigenschaften durch die Überexpression von GRK2 nicht. Dies könnte als Anknüpfungspunkt in der Entwicklung neuer Opioide dienen, die keinerlei β-Arrestinrekrutierung bewirken und dadurch helfen könnten, unerwünschte Wirkungen in der Behandlung starker Schmerzen zu verhindern. KW - Opiatrezeptor KW - Opioide KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Pharmakodynamik KW - Arrestine KW - Rezeptorpharmakologie KW - biased agonism KW - signalling Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176850 ER -