TY  - THES
A1  - Popp, Christina
T1  - Evolution of antifungal drug resistance of the human-pathogenic fungus \(Candida\) \(albicans\)
T1  - Evolution der Antimykotikaresistenz im humanpathogenen Pilz \(Candida\) \(albicans\)
N2  - Infections with the opportunistic yeast Candida albicans are frequently treated with the first-line drug fluconazole, which inhibits ergosterol biosynthesis. An alarming problem in clinics is the development of resistances against this azole, especially during long-term treatment of patients. Well-known resistance mechanisms include mutations in the zinc cluster transcription factors (ZnTFs) Mrr1 and Tac1, which cause an overexpression of efflux pump genes, and Upc2, which results in an overexpression of the drug target. C. albicans strains with such gain-of-function mutations (GOF) have an increased drug resistance conferring a selective advantage in the presence of the drug. It was previously shown that this advantage comes with a fitness defect in the absence of the drug. This was observed in different conditions and is presumably caused by a deregulated gene expression. 

One aim of the present study was to examine whether C. albicans can overcome the costs of drug resistance by further evolution. Therefore, the relative fitness of clinical isolates with one or a combination of different resistance mutations in Mrr1, Tac1 and/or Upc2 was analyzed in competition with the matched fluconazole-susceptible partner. Most fluconazole-resistant isolates had a decreased fitness in competition with their susceptible partner in vitro in rich medium. In contrast, three fluconazole-resistant strains with Mrr1 resistance mutations did not show a fitness defect in competition with their susceptible partner. In addition, the fitness of four selected clinical isolate pairs was examined in vivo in mouse models of gastrointestinal colonization (GI) and disseminated infection (IV). In the GI model all four fluconazole-resistant strains were outcompeted by their respective susceptible partner. In contrast, in the IV model only one out of four fluconazole-resistant isolates did show a slight fitness defect in competition with its susceptible partner during infection of the kidneys. It can be stated, that in the present work the in vitro fitness did not reflect the in vivo fitness and that the overall fitness was dependent on the tested conditions. In conclusion, C. albicans cannot easily overcome the costs of drug resistance caused by a deregulated gene expression. 

In addition to GOFs in Mrr1, Tac1 and Upc2, resistance mutations in the drug target Erg11 are a further key fluconazole resistance mechanism of C. albicans. Clinical isolates often harbor several resistance mechanisms, as the fluconazole resistance level is further increased in strains with a combination of different resistance mutations. In this regard, the question arises of how strains with multiple resistance mechanisms evolve. One possibility is that strains acquire mutations successively. In the present study it was examined whether highly drug-resistant C. albicans strains with multiple resistance mechanisms can evolve by parasexual recombination as another possibility. In a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations could combine these advantageous traits by mating. Thereupon selection could act on the mating progeny resulting in even better adapted derivatives.
 
Therefore, strains heterozygous for a resistance mutation and the mating type locus (MTL) were grown in the presence of fluconazole. Derivatives were isolated, which had become homozygous for the resistance mutation and at the same time for the MTL. This loss of heterozygosity was accompanied by increased drug resistance. In general, strains which are homozygous for one of both MTL configurations (MTLa and MTLα) can switch to the opaque phenotype, which is the mating-competent form of the yeast, and mate with cells of the opposite MTL. In the following, MTLa and MTLα homozygous strains in the opaque phenotype were mated in all possible combinations. The resulting mating products with combined genetic material from both parents did not show an increased drug resistance. Selected products of each mating cross were passaged with stepwise increasing concentrations of fluconazole. The isolated progeny showed high levels of drug resistance and loss of wild-type alleles of resistance-associated genes. In conclusion, selective pressure caused by fluconazole exposure selects for resistance mutations and at the same time induces genomic rearrangements, resulting in mating competence. Therefore, in a clonal population, cells with individually acquired resistance mutations can mate with each other and generate mating products with combined genetic backgrounds. Selection can act on these mating products and highly drug-resistant und thus highly adapted derivatives can evolve as a result. 

In summary, the present study contributes to the current understanding of the evolution of antifungal drug resistance by elucidating the effect of resistance mutations on the fitness of the strains in the absence of the drug selection pressure and investigates how highly drug-resistant strains could evolve within a mammalian host.
N2  - Infektionen mit dem opportunistischen Hefepilz Candida albicans werden häufig mit dem First-Line-Medikament Fluconazol behandelt, welches die Ergosterol-Biosynthese hemmt. Ein besorgniserregendes Problem in der Klinik, insbesondere bei der Langzeitbehandlung von Patienten, ist die Entwicklung von Resistenzen gegen dieses Azol. Zu den bekannten Resistenzmechanismen gehören Resistenzmutationen in den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren (ZnTFs) Mrr1 und Tac1, die eine Überexpression von Effluxpumpen-Genen bewirken und Resistenzmutationen in Upc2, die zu einer Überexpression des Wirkstofftargets führen. C. albicans Stämme mit solchen Gain-of-Function-Mutationen (GOF) weisen eine erhöhte Medikamentenresistenz auf, was einen selektiven Vorteil in Gegenwart des Medikaments bedeutet. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser Vorteil mit einem Fitnessdefekt in Abwesenheit des Medikaments einhergeht. Dies wurde in verschiedenen Bedingungen nachgewiesen und wird vermutlich durch eine deregulierte Genexpression verursacht. 

Ein Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, ob C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz durch Evolution kompensieren kann. Daher wurde die relative Fitness von klinischen Isolaten mit einer oder einer Kombination verschiedener Resistenzmutationen in Mrr1, Tac1 und/oder Upc2 im Wettbewerb mit dem zugehörigen Fluconazol-sensitiven Partner analysiert. Die meisten Fluconazol-resistenten Isolate hatten eine verminderte Fitness im Wettbewerb mit ihrem sensitiven Partner in vitro in vollwertigem Medium. Dennoch zeigten drei Fluconazol-resistente Stämme mit Mrr1-Resistenzmutationen keinen Fitnessdefekt im Wettbewerb mit ihrem jeweiligen Partner. Zusätzlich wurde die Fitness von vier ausgewählten klinischen Isolat-Paaren in vivo in Mausmodellen für gastrointestinale Kolonisation (GI) und disseminierte Infektion (IV) untersucht. Im GI-Modell wurden alle vier Fluconazol-resistenten Stämme von ihren sensitiven Partnern überwachsen. Im Gegensatz dazu zeigte im IV-Modell nur einer der vier Fluconazol-resistenten Isolate einen leichten Fitnessdefekt im Wettbewerb mit dem jeweiligen Fluconazol-sensitiven Partner während der Infektion der Nieren. Es kann festgestellt werden, dass in der vorliegenden Arbeit die in vitro-Fitness nicht die in vivo-Fitness widerspiegelt und dass die Gesamtfitness von den getesteten Bedingungen abhängig ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass C. albicans die Kosten der Medikamentenresistenz, die durch eine deregulierte Genexpression verursacht werden, nur schwer überwinden kann. 

Neben GOFs in Mrr1, Tac1 und Upc2 sind Resistenzmutationen im Wirkstofftarget Erg11 ein wichtiger Resistenzmechanismus von C. albicans. Klinische Isolate weißen oft mehrere Resistenzmechanismen auf, da die Kombination verschiedener Resistenzmutationen die Fluconazol-Resistenz potenziert. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, wie sich Stämme mit mehreren Resistenzmechanismen entwickeln. Eine Möglichkeit ist, dass Stämme Mutationen sequenziell erwerben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob als weitere Möglichkeit hochresistente C. albicans Stämme mit multiplen Resistenzmechanismen durch parasexuelle Rekombination evolvieren können. In einer klonalen Population könnten Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen diese vorteilhaften Eigenschaften durch Paarung kombinieren. Daraufhin könnte Selektionsdruck auf die Matingprodukte wirken und so die Entstehung von besser angepassten Derivaten begünstigen. 

Daher wurden Resistenzmutation und Mating Type Locus (MTL) heterozygote Stämme in Gegenwart von Fluconazol kultiviert. So konnten Derivate isoliert werden, die homozygot für die Resistenzmutation und gleichzeitig für den MTL geworden waren. Dieser Verlust der Heterozygotie ging mit einer erhöhten Medikamentenresistenz einher. Generell können Stämme, die homozygot für eine der beiden MTL-Konfigurationen (MTLa und MTLα) sind, in den opaque Phänotyp wechseln, der die paarungskompetente Form der Hefe darstellt, und sich mit Zellen des gegensätzlichen MTL paaren. Im Folgenden wurden MTLa und MTLα homozygote Stämme im opaque Phänotyp in allen möglichen Kombinationen verpaart. Die resultierenden Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Material beider Elternteile wiesen keine erhöhte Medikamentenresistenz auf. Ausgewählte Paarungsprodukte jeder Kreuzung wurden mit stufenweise ansteigenden Konzentrationen von Fluconazol passagiert. Die isolierten Nachkommen zeigten ein hohes Maß an Medikamentenresistenz und den Verlust von Wildtyp-Allelen der resistenzassoziierten Gene. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der selektive Druck, der durch die Fluconazol-Exposition verursacht wird, für Resistenzmutationen selektiert und gleichzeitig genomische Umlagerungen induziert, die eine Paarung ermöglichen. Daher können sich in einer klonalen Population Zellen mit individuell erworbenen Resistenzmutationen miteinander paaren und Matingprodukte mit kombiniertem genetischem Hintergrund generieren. Auf diese Matingprodukte kann die Selektion wirken, woraufhin sich hochresistente und damit stark an ihre Umwelt angepasste Derivate entwickeln können. 

Zusammenfassend trägt die vorliegende Studie zum aktuellen Verständnis der Evolution der Antimykotika-Resistenz bei, indem sie den Effekt von Resistenzmutationen auf die Fitness der Stämme in Abwesenheit des Medikamenten-Selektionsdrucks untersucht und aufklärt, wie sich hochgradig resistente Stämme in einem Säugetierwirt entwickeln könnten.
KW  - Evolution
KW  - Resistenz
KW  - Fitness
KW  - Candida albicans
KW  - Fluconazol
KW  - Resistance
KW  - Fluconazole
KW  - Drug resistance
KW  - Human-pathogenic
KW  - Yeast
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243515
ER  - 
TY  - THES
A1  - da Cruz Güerisoli, Irene Maria
T1  - Investigating the murine meiotic telomere complex TERB1-TERB2-MAJIN: spatial organization and evolutionary history
T1  - Untersuchung des murinen meiotischen Telomer-Komplex TERB1-TERB2-MAJIN: spatiale Organisation und Evolutionsgeschichte
N2  - Einess der faszinierenden Merkmale der meiotischen Prophase I sind die
hochkonservierten kräftigen Bewegungen homologer Chromosomen. Diese
Bewegungen sind entscheidend für den Erfolg von Schlüsselereignissen wie die
Ausrichtung, Paarung und Rekombination der homologen Chromosomen.
Mehrere bisher untersuchte Organismen, darunter Säugetiere, Würmer, Hefen
und Pflanzen, erreichen diese Bewegungen, indem sie die Chromosomenenden
an spezialisierten Stellen in der Kernhülle verankern. Diese Verankerung
erfordert Telomer-Adapterproteine, die bisher in der Spalthefe und der Maus
identifiziert wurden.
Die meiosespezifischen Telomer-Adapterproteine der Maus, TERB1, TERB2 und
MAJIN, sind an der Verankerung des ubiquitären Telomer-Shelterin-protein an
den LINC-Komplex beteiligt, mit einem analogen Mechanismus, wie er die
Spalthefe beschrieben wird. Obgleich die meiose-spezifischen TelomerAdapterproteine eine wesentliche Rolle spielen, ist der genaue Mechanismus
der Verankerung der Telomere an die Kernhülle sowie ihre evolutionäre
Geschichte bisher noch wenig verstanden. Das Hauptziel dieser Arbeit ist daher
die Untersuchung der Organisation des meiosespezifischen TelomerAdapterkomplexes TERB1-TERB2-MAJIN der Maus und dessen
Evolutionsgeschichte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Organisation des TERB1-TERB2-MAJIN
Komplexes mittels hochauflösender Mikroskopie (SIM), an Mausspermatozyten
untersucht, sowie die Lokalisation in Bezug auf TRF1 des Telomer-ShelterinKomplexes und die telomerische DNA analysiert. In den Stadien Zygotän und
Pachytän zeigten die Fluoreszenzsignale eine starke Überlappung der Verteilung
der meiotischen Telomer-Komplex-Proteine, wobei die Organisation von TERB2
an den Chromosomenenden heterogener war als die von TERB1 und MAJIN.
Außerdem konnte die TRF1-Lokalisation an den Enden der Lateralelemente
(LEs) mit einer griffartigen Anordnung um die TERB1- und MAJIN-Signale im
Zygotän- und Pachytän-Stadium gezeigt werden. Interessanterweise erwies
sich die telomerische DNA als lateral verteilt und teilweise überlappend mit der
zentralen Verteilung der meiotischen Telomer-Komplex-Proteine an den Enden
der LEs. Die Kombination dieser Ergebnisse erlaubte die Beschreibung eines alternativen Modells der Verankerung der Telomer an die Kernhülle während
der meiotischen Prophase I.
Der zweite Teil dieser Arbeit analysiert die Evolutionsgeschichte der
Mausproteine von TERB1, TERB2 und MAJIN. Die fehlende Übereinstimmung
zwischen den Meiose-spezifische Telomer-Adapteproteinen der Maus und der
Spalthefe hat die Frage nach dem evolutionsbedingten Ursprung dieses
spezifischen Komplexes aufgeworfen. Um vermeintliche Orthologen der
Mausproteinevon TERB1, TERB2 und MAJIN über Metazoen hinweg zu
identifizieren, wurden computergestützte Verfahren und phylogenetische
Analysen durchgeführt. Darüber hinaus wurden Expressionsstudien
implementiert, um ihre potenzielle Funktion während der Meiose zu testen. Die
Analysen haben ergeben, dass der Meiose-spezifische Telomer-Komplex der
Maus sehr alt ist, da er bereits in den Eumetazoen entstand, was auf einen
einzigen Ursprung hindeutet. Das Fehlen jeglicher Homologen des
meiosespezifischen Telomerkomplexes in Nematoden und die einigen wenigen
in Arthropoden nachgewiesenen Kandidaten, deuten darauf hin, dass die
Telomer-Adapterproteine in diesen Abstammungslinien verloren/ersetzt oder
stark diversifiziert worden sind. Bemerkenswerterweise zeigten
Proteindomänen von TERB1, TERB2 und MAJIN, die an der Bildung des
Komplexes sowie an der Interaktion mit dem Telomer-Shelterin-Protein und den
LINC-Komplexen beteiligt sind, eine hohe Sequenzähnlichkeit über alle Kladen
hinweg. Abschließend lieferte die Genexpression im Nesseltier Hydra vulgaris
den Beweis, dass der TERB1-TERB2-MAJIN-Komplex selektiv in der Keimbahn
exprimiert wird, was auf die Konservierung meiotischer Funktionen über die
gesamte Metazoen-Evolution hinweg hindeutet.
Zusammenfassend bietet diese Arbeit bedeutende neue Erkenntnisse
hinsichtlich des Meiose-spezifischen Telomer-Adapterkomplex, seines
Mechanismus zur Verankerung der Telomer an die Kernhülle und die
Entschlüsselung seines Ursprungs in den Metazoen.
N2  - One of the fascinating features of meiotic prophase I, is the highly conserved
vigorous movements of homologous chromosomes. These movements are
critical for the success of essential events as homologs alignment, synapsis and
recombination. Several organisms studied so far, including mammals, worms,
yeast and plants achieve these movements by anchoring the chromosome ends
to specialized sites in the nuclear envelope (NE). This attachment requires
telomere adaptor proteins which have to date been identified in fission yeast
and mice.
The mouse meiosis-specific telomere adaptor proteins TERB1, TERB2, and
MAJIN are involved in the attachment of ubiquitous shelterin telomere to the
LINC complex, in an analogous mechanism as those described in fission yeast.
Despite the essential role of meiosis-specific telomere adaptor proteins, the
precise mechanism of anchorage of telomeres to the nuclear envelope, as well
as their evolutionary history, are still not well understood. Therefore, the main
aim of this thesis is to investigate the organization of the mouse meiosis-specific
telomere adaptor complex TERB1-TERB2-MAJIN and its evolutionary history.
In the first part of this thesis high-resolution Structured Illumination Microscopy
(SIM), indirect immunofluorescence and Telo-FISH on mouse spermatocytes
were used to determine precisely how the telomere complex proteins are
localized with relation to the shelterin telomeric TRF1 protein and telomeric
DNA. During zygotene and pachytene stages staining patterns revealed
extensively overlapping of meiotic telomere complex proteins distributions in
which TERB2 organization is more heterogeneous than TERB1 and MAJIN at
the chromosome ends. Further, TRF1 localization was shown at the side of
lateral elements (LEs) ends with grasp-like distribution surrounding the TERB1
and MAJIN signals in zygotene and pachytene stages. Interestingly, telomeric
DNA was shown to be laterally distributed and partially overlapping with the
more central distribution displayed by meiotic telomere complex proteins of LEs
ends. The combination of these results allowed to describe an alternative model
of the telomere attachment to the NE during meiotic prophase I. The second part of this thesis, analyses mouse TERB1, TERB2, and MAJIN
evolutionary history. The lack of similarity between mouse and fission yeast
meiotic-specific telomere adaptor proteins has raised the question about the
origin of this specific complex through evolution. To identify mouse TERB1,
TERB2, and MAJIN putative orthologues, computational approaches and
phylogenetic analyses were performed. Besides, to test their potential function
during meiosis, expression studies were conducted. From these analyses, it was
revealed that mouse meiosis-specific telomere complex is ancient, as it
originated as early as eumetazoans pointing to a single origin. The absence of
any homologs in Nematoda and only a few candidates detected in Arthropoda
for meiosis-specific telomere complex, seemed, that these proteins have been
lost/replaced or highly diversified in these lineages. Remarkably, TERB1, TERB2,
and MAJIN protein domains involved in the formation of the complex as well as
those required for the interaction with the telomere shelterin protein and the
LINC complexes revealed high sequence similarity across all clades. Finally,
gene expression in the cnidarian Hydra Vulgaris provided evidence that the
TERB1-TERB2-MAJIN complex is selectively expressed in the germline
suggesting conservation of meiotic functions across metazoan evolution.
In summary, this thesis provides significant insights into the meiosis-specific
telomere complex mechanism to engage telomeres to the nuclear envelope and
the elucidation of its origin in metazoans.
KW  - meiosis
KW  - chromosomes telomere-led movement
KW  - TERB1-TERB2-MAJIN
KW  - SIM
KW  - Evolution
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210562
ER  -