TY - THES A1 - Stingl, Lavinia T1 - Die Bedeutung des Hitzeschockproteins HSP90 für die Strahlenempfindlichkeit von Tumorzellen unterschiedlicher Entitäten T1 - The Role of the heat shock protein HSP90 for the radiation response of tumor cells of different entities N2 - Krebs ist die zweithäufigste Todesursache in Deutschland. Für die Behandlung von Tumorerkrankungen wird unter anderen die Strahlentherapie angewendet. Allerdings ist die Wirkung der Bestrahlung durch die Radiotoxizität auf normalem Gewebe sowie durch die Radioresistenz vieler Tumoren bei klinisch relevanten Dosen limitiert. Ein vielversprechendes Target für die Radiosensibilisierung von Tumorzellen scheint das Hitzeschockprotein HSP90 zu sein, ein wichtiges molekulares Chaperon, das für die Faltung, Aktivierung, Translokation und Degradation der so genannten Klientenproteine zuständig ist. Durch die pharmakologische Blockierung seiner Funktion wird die simultane Degradation multipler HSP90 Klientenproteine eingeleitet, darunter Radioresistenz-assoziierte Proteine wie RAF-1, AKT, EGFR, Survivin, DNA-Reparaturproteine. Verschiedene Studien belegen das Potential der HSP90 Inhibitoren Geldanamycin und seiner Derivaten als Radiosensibilisatoren. Im Gegensatz zu diesen Substanzen sind die neuartigen HSP90 Inhibitoren NVP-AUY922 und NVP-BEP800 wasserlöslich und nicht hepatotoxisch. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 (200 nM, 24 h vor der Bestrahlung) auf die Strahlenempfindlichkeit humaner Tumorzelllinien unterschiedlicher Entitäten, darunter eine Lungenkarzinomzellinie A549, eine Fibrosarkomzelllinie HT1080, sowie zwei Glioblastomzelllinien GaMG und SNB19, untersucht. Die neuartigen HSP90 Inhibitoren zeigten in Kolonietest eine strahlensensibilisierende Wirkung in allen getesteten Tumorzelllinien. Weiterhin wurde mit diversen Methoden den Mechanismus der Radiosensibilisierung untersucht. Die HSP90 Inhibition erhöhte den Anteil der Zellen mit hypodiploiden DNA-Gehalt in den meisten untersuchten Tumorzelllinien. Außerdem induzierte die HSP90 Inhibition die Depletion der anti-apoptotischen Proteine AKT, pAKT und RAF-1 in allen Tumorzelllinien. Wie die erhöhte Expression von beiden Apoptosemarkern, aktivierte Caspase-3 und inaktiviertes PARP, nahe legt, wurde verstärkt die Caspase-abhängige Apoptose in den meisten untersuchten Tumorzelllinien nach HSP90 Inhibition eingeleitet. Laut Comet Assay induzierte die HSP90 Inhibition eine geringere DNA-Fragmentierung in bestrahlten Tumorzellen, gleichzeitig konnte aber eine langsamere Restitution der chromosomalen DNA festgestellt werden. Über die Messungen der γH2AX-Expression als Marker für DNA-Doppelstrangbrüche konnte eine erhöhte Induktion von DNA-Schäden nach HSP90 Inhibition und Bestrahlung sowie eine verlangsamte Reparatur der induzierten DNA-Schäden gemessen werden. Diese korrelierte mit der Depletion der DNA-Reparaturproteine KU70/KU80. Die HSP90 Inhibition führte zusätzlich zu einem ausgeprägten G2/M-Arrest, der durch die Bestrahlung verstärkt werden konnte. NVP-AUY922 induzierte außerdem eine Depletion der S-Phase. Die Depletion der Zellzyklus-regulierenden Proteine CDK1 und CDK4 sowie pRB korrelierte mit den beobachteten Zellzyklusstörungen. Die hier gewonnenen Ergebnisse verdeutlichen, dass der komplexe Mechanismus der Radiosensibilisierung nach HSP90 Inhibition die simultane Degradation diverser HSP90 Klientenproteine involviert, was verschiedene zelluläre Auswirkungen hat: verlangsamte Zellteilung durch anhaltende Zellzyklusstörungen, erhöhte DNA-Schäden und Verlangsamung der Reparatur der DNA-Schäden nach Bestrahlung sowie Apoptoseinduktion. Die HSP90 Inhibition induzierte gleichzeitig die Expression der Hitzeschockproteine HSP90 und HSP70, deren anti-apoptotischen Funktionen die radiosensibilisierenden Effekte der HSP90 Inhibitoren vermindern können. In dieser Arbeit wurden zwei Strategien getestet, um die Hochregulation von HSP90/HSP70 nach HSP90 Inhibition in den Tumorzelllinien A549 und GaMG zu unterdrücken. Zum einen wurden siRNAs gegen die stressinduzierbare α-Isoform von HSP90 angewendet, zum anderen wurde KNK437, eine Substanz die die Expression der HSP auf Transkriptionsebene unterdrückt, eingesetzt. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Transfektion mit siRNA gegen HSP90α gefolgt von NVP-AUY922 die Hochregulation von HSP90α um circa 50% unterdrückte. Allerdings wurde dadurch keine Erhöhung der NVP-AUY922-vermittelten Radiosensibilisierung erreicht. Es wurden außerdem keine signifikanten Veränderungen betreffend der Induktion und Reparatur der DNA-Schäden, Zellzyklusverteilung, Apoptoseinduktion sowie Expression der getesteten HSP90 Klientenproteine im Vergleich zu alleiniger HSP90 Inhibition festgestellt. Im dritten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die simultane Behandlung mit NVP-AUY922 und KNK437 die NVP-AUY922-vermittelte Hochregulation von HSP90 und HSP70 in beiden Tumorzelllinien temporär unterdrückt. Obwohl die alleinige Behandlung mit KNK437 in der A549-Tumorzelllinie laut Kolonietest radiosensibilisierend wirkte, konnte die simultane Behandlung mit beiden Inhibitoren die NVP-AUY922-vermittelte Radiosensibilisierung nicht erhöhen. Obwohl die Unterdrückung der Stressantwort nach HSP90 Inhibition mittels KNK437 in beiden Tumorzelllinien einen anhaltenden G2/M-Arrest induzierte, blieb die Expression der anti-apoptotischen HSP90-Klientenproteine AKT und RAF-1 unverändert im Vergleich zu NVP-AUY922. Außerdem wurde die inhibierende Wirkung von NVP-AUY922 auf die Reparatur der strahleninduzierten DNA-Schäden nicht erhöht. Die hier gezeigten in vitro Ergebnisse unterstützen die Anwendung von NVP-AUY922 und NVP-BEP800 für in vivo Studien sowie in klinischen Studien alleine oder in Kombination mit der Bestrahlung. Unsere Arbeit ist von besonderem Interesse für die Strahlentherapie, da NVP-AUY922 bereits in klinischen Studien getestet wird. N2 - Besides important improvement of tumor therapy, which increased the chance of survival for the patients, cancer remains the second cause of death in Germany. Among others, radiotherapy is one of the treatment options for tumor diseases. However, radiotherapy has some limitations due to the radiotoxicity on normal tissue and to the radioresistance of several tumors at therapeutic doses. One of the promising radiosensitizers of tumor cells seems to be the heat shock protein HSP90 – an essential molecular chaperone involved in folding, activation, translocation and degradation of its so called client proteins. The pharmacological inhibition of its chaperone function leads to simultaneous degradation of several HSP90 client proteins such as RAF-1, AKT, EGFR, survivin, DNA repair proteins and consequent disruption of several radioresistance-associated pathways. Several studies proved the radiosensitizing ability of geldanamycin and its derivates. In contrast to these drugs, the synthetic HSP90 inhibitors NVP-AUY922 and NVP-BEP800 are more water soluble and not hepatotoxic. In the first part of this work, we tested the effect of NVP-AUY922 and NVP-BEP800 (200 nM, 24 h prior irradiation) on the radiation response of tumor cell lines of different entities: the lung carcinoma A549, the fibrosarcoma HT1080 and the glioblastoma cell lines GaMG and SNB19. The colony forming assay revealed that pre-treatment with the novel HSP90 inhibitors increased the radiosensitivity of all tested tumor cell lines. Furthermore we investigated the mechanism of radiosensitization after HSP90 inhibition. HSP90 inhibition led to an increased percentage of tumor cells with hypodiploid DNA content (subG1 fraction) in most tested cell lines. Moreover, it led to the depletion of the anti-apoptotic HSP90 client proteins AKT, pAKT and RAF-1. In addition, it increased the pro-apoptotic caspase-3 and PARP cleavage in most of the tested cell lines. Our comet assay revealed a lower DNA fragmentation in drug-treated and irradiated tumor cells, but a slower restoration of DNA damage. Measurements of γH2AX expression as a sensitive marker for DNA-DSB showed an increased induction of DNA damage as well as DNA repair protraction in drug-treated and irradiated tumor cells. Inhibition of DNA repair after HSP90 inhibition was supported by the depletion of the DNA repair proteins KU70/KU80. Moreover the novel HSP90 inhibitors led to an increased G2/M-arrest, which could be enhanced by irradiation. In addition, NVP-AUY922 induced S-Phase depletion. The cell cycle disturbances correlated with the drug-mediated degradation of cell cycle regulating proteins CDK4, CDK1 and pRB. In conclusion, our results made clear that the complex mechanism of radiosensitization involves simultaneous degradation of several HSP90 client proteins, thus causing slower proliferation of the tumor cells due to dramatic cell cycle disturbances, increased DNA damage and protraction of DNA repair after irradiation as well as apoptosis induction. However, the radiosensitizing effect of the novel HSP90 inhibitors might be limited by the simultaneous drug-mediated induction of the expression of the anti-apoptotic heat shock proteins HSP90 and HSP70. In this study, we tested two strategies to suppress the drug-mediated up-regulation of HSP90 and HSP70 in the tumor cell lines A549 and GaMG. The first strategy was the siRNA-mediated down-regulation of the stress-inducible isoform HSP90α, combined with drug treatment and irradiation. The second strategy was the inhibition of the stress response by simultaneous treatment with the HSF-1 inhibitor KNK437. In the second part of this work we could show that pre-silencing of HSP90α followed by treatment with NVP-AUY922 indeed reduced the drug-mediated up-regulation of HSP90α to about 50%. However, it did not enhance the radiosensitizing effect of NVP-AUY922. In addition, it did not show any significant changes concerning the induction and the repair of DNA damage, the cell cycle distribution or the expression of the tested HSP90 client proteins AKT, RAF-1, CDK1 and CDK4 compared with drug-only treatment. In the third part of this work we could show that simultaneous treatment with NVP-AUY922 and KNK437 temporary suppressed the NVP-AUY922-mediated up-regulation of HSP90 and HSP70. Although treatment with KNK437 alone increased the radiosensitivity of A549 tumor cells as shown by colony forming assays, simultaneous treatment with both inhibitors did not increase NVP-AUY922-mediated radiosensitization in both tumor cell lines. Our cell cycle analyses revealed that the suppression of stress response after HSP90 inhibition by KNK437 led to a sustained G2/M-arrest in both tumor cell lines. However, the expression of the anti-apoptotic proteins AKT and RAF-1 remained unchanged compared with HSP90 inhibition alone. The evaluation of γH2AX expression showed that simultaneous treatment did not enhance NVP-AUY922-mediated inhibition of DNA repair after irradiation. Our in vitro results support the use of the novel HSP90 inhibitors in in vivo studies as well as in clinical studies alone or in combination with irradiation. This work is of particular interest for the radiation therapy of cancer, because the novel HSP90 inhibitor NVP-AUY922 is currently in clinical trials. KW - Hitzeschockprotein KW - HSP90 KW - HSP90 Inhibitor KW - Radiosensibilisatoren KW - heat shock protein KW - HSP90 KW - HSP90 inhibitor KW - radiosensitizers Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71984 ER - TY - THES A1 - Wassermann, Veronika T1 - Ueber die Beteiligung der Hitzeschockproteine HSP27 und HSP70 an einer Resistenz, Resistenzentwicklung unter CMF-Therapie T1 - Is heat shock protein expression an important faktor in drug resistance? N2 - Ein Problem der Therapie maligner Tumore ist die Resistez gegenüber Chemotherapeutika. Diskutiert wird ein Zusammenhang zur Expression von Hitzeschockproteinen (HSP). Insbesondere das in Mamma-Karzinomen stark exprimierte HSP27 und HSP70 scheinen hier beteiligt. Hitzeschockproteine sind Teil eines durch Noxen induzierten Mechanismus, welcher Schutz vor weiterer Noxenexposition verleiht, also die entsprechenen Zellen im Unterschied zu nicht exponierten Kontrollzellen zu überleben befähigt. Es kommt nach einem Streßereignis zu einer Veränderung von Zelltod unter nachfolgenden Bedingungen, z.B. Verhütung von Apoptose (physiologischer Zelltod). Tumortherapie mittels Zytostatika stellt eine „kontrollierte Apoptose“ dar. Ziel dieser Therapie muß es also folglich sein, eine HSP-Induktion zu vermeiden, da eine solche den Therapieerfolg und Benefit für den Patienten schmälert. Die Exposition einer Tumorzelle mit einem chemotherapeutisch wirksamen Medikament bedeutet für diese Zelle toxischen/oxidativen Streß, den sie nur durch Induktion entsprechender Abwehrmechanismen überleben kann. Diese Mechanismen haben letztlich einen wesentlichen Einfluß auf die Wirksamkeit des Medikamentes und Profit des Patienten durch die ihm angebotene Therapie. Eine frühe adaptive Zellantwort von Säugerzellen auf toxische Einflüsse stellt die Expression von Hitzeschockproteinen dar. Den Fokus der vorliegenden Untersuchungen stellen einerseits diejenigen Substanzen dar, welche heutzutage in der Therapie des Mamma-Karzinoms eingesetzt werden, den drei Einzelsubstanzen des CMF-Protokolls Methotrexat, 5-Fluorouracil und Cyclophosphamid, andererseits die Hitzeschockproteine mit der höchsten bekannten Bedeutung für Tumorwachstum. In einem ersten Schritt wurde in vitro mit einem Zellsystem, welches durch Transfektion mit dem humanen hsp27-Gen bei bekannter HSP70-Induzierbarkeit als einfaches isoliertes Zellsystem ein gutes Werkzeug zur spezifischen Untersuchung dieser beiden Proteine darstellt, untersucht werden, inwieweit sich diese speziellen Proteine durch die unterschiedlichen Substanzgruppen des CMF-Protokolls induzieren lassen. Es wurde also nach einer adaptiven Zellantwort in Form einer Induktion von HSP27 und HSP70 nachfolgend einer Noxenexposition gesucht werden. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die für diese beiden HSPs postulierte zytoprotektive Eigenschaften auch für Zytostatika gelten. Es wurde überprüft , inwieweit Chemotherapeutika unter dem Einfluß von HSP70 und HSP27 stehen, also inwieweit die Expression von HSP27 und HSP70 einen Zellschutz gegen toxischen Streß (durch CMF) in den verwendeten L929-Mausfibroblasten darstellen kann. N2 - Resistance to cytotoxic drugs is a major problem in tumor therapy. Paradoxycally both aquired and inhärent resistance to chemotherapeutica seem to be more common in tumors than in normal cells. A correllation to the expression of heat schock proteins (HSPs) is discussed. In particular, HSP27 and HSP70 seem to controbute to this phenomen. Our study focussed on the role of both HSPs in cellular response to methotrexate, 5-FU an cyclophosphamide, which are actually used in breast cancer therapy. KW - Hietzeschockprotein KW - Resistenzentwicklung KW - CMF-Therapie KW - Mammakarzinom KW - heat shock protein KW - resistance KW - cancer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12292 ER - TY - THES A1 - Redel, Andreas T1 - Charakterisierung der kardialen Funktion des Stressproteins alpha-B-Crystallin am isolierten Papillarmuskel der Maus T1 - Characterisation of the cardiac function of the stress protein alpha-B-Crystallin in isolated murine papillary muscles N2 - Eine familiäre Myopathie und Kardiomyopathie, der eine Missense-Mutation des alpha-B-Crystallin-Gens zugrunde liegt, weist auf eine wichtige Bedeutung des Stressproteins alpha-B-Crystallin im Herzen hin. Die chaperone-ähnlichen Eigenschaften von alpha-B-Crystallin und die unter kardialer Ischämie zu beobachtende schnelle Translokation vom Zytosol an das elastische Titin-Filamentsystem lassen eine protektive Rolle von alpha-B-Crystallin unter Stressbedingungen vermuten. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine eventuelle kardioprotektive Funktion von alphaB-Crystallin durch die Charakterisierung alpha-B-Crystallin gendeletierter Mäuse nachzuweisen. Wir etablierten hierfür ein Versuchssystem zur Untersuchung der Kontraktilität isolierter Papillarmuskeln im Organbad. Im Rahmen des Aufbaus unseres Versuchssystems untersuchten wir zunächst den Einfluss der Ca2+-Konzentration, der Temperatur und der Kontraktionsbedingungen (Auxotonie vs. Isometrie) auf die Kraft-Frequenz-Beziehung von murinem Myokard. Wir konnten zeigen, dass die Kraft-Frequenz-Beziehung von Myokardpräparaten der Maus von den genannten Versuchsbedingungen abhängig ist. Bei niedrigen Ca2+-Konzentrationen und Temperaturen ([Ca2+] = 1,0 mM, Temp. = 27 °C) ist sie positiv, flacht bei zunehmender Ca2+-Konzentration und Temperatur ab und ist für [Ca2+] = 5,0 mM, Temp. = 37 °C negativ. Auxotone Kontraktionsbedingungen führen im Vergleich zu isometrischen bei gleichen Ca2+-Konzentrationen und Temperaturen zu einem flacheren Verlauf der Kraft-Frequenz-Beziehung. Unter annähernd physiologischen Bedingungen verläuft die Kraft-Frequenz-Beziehung des Mäuse-Myokards flach bis leicht positiv. Im Gegensatz zum Menschen scheinen somit bei der Maus für eine Steigerung des Herz-Zeit-Volumens andere Mechanismen als eine positive Kraft-Frequenz-Beziehung von Bedeutung zu sein. Hierbei ist insbesondere der Frank-Starling-Mechanismus und die sympathoadrenerge Innervation des Herzens zu erwähnen. Zur Charakterisierung der kardialen Funktion von alphaB-Crystallin untersuchten wir die Kontraktilität isolierter Papillarmuskeln von Wildtyp- und alpha-B-Crystallin gendeletierten Mäusen unter simulierter Ischämie (Glucose- und Sauerstoffentzug) und Reperfusion im Organbad. Unter Kontrollbedingungen zeigten sich zwischen wt- und alpha-B-/- Muskeln keine Unterschiede in der Zuckungskraft, der Geschwindigkeit der Kraftentwicklung und der Relaxationszeit. Die während der 20-minütigen simulierten Ischämie entwickelte Kontraktur setzte jedoch bei den alpha-B-/- Muskeln signifikant früher ein und verlief signifikant stärker als bei wt-Muskeln. Nach einer 60-minütigen Reperfusionsphase blieb die Kontraktur der alpha-B-/- Muskeln im Vergleich zu wt-Muskeln signifikant erhöht. Bezüglich Zuckungskraft, Geschwindigkeit der Kraftentwicklung und Relaxationszeit zeigten sich weder während noch nach simulierter Ischämie deutliche Unterschiede zwischen den Muskeln beider Mäusestämme. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Fehlen von alpha-B-Crystallin am Gesamtherz nicht zu einer Störung der systolischen Herzfunktion, sondern zu einer eingeschränkten myokardialen Relaxationsfähigkeit unter Ischämie und Reperfusion führen würde. Da alpha-B-Crystallin unter kardialer Ischämie an das elastische Titin-Filamentsystem bindet, könnten die elastischen Eigenschaften des Myokards unter Ischämie durch einen Mangel an alpha-B-Crystallin derart beeinträchtigt werden, dass es zu einer höheren Rigidität der Muskulatur kommt. Eine Funktion von alpha-B-Crystallin im Herzen ist somit möglicherweise die Aufrechterhaltung der elastischen Eigenschaften des Myokards unter kardialer Ischämie und Reperfusion. N2 - Missense mutations of the alpha-B-Crystallin gene have been shown to cause familial myopathy and cardiomyopathy suggesting an important role of the stress protein alpha-B-Crystallin in cardiac function. The aim of this study was to investigate if alpha-B-Crystallin may play a cardioprotective role during cardiac ischemia/reperfusion using alpha-B-Crystallin-deficient (alpha-B-/-) mice. For this purpose we established an ischemia/reperfusion model of isolated perfused murine papillary muscles and first investigated the influence of Ca2+, temperature and contraction type (auxotonic vs. isometric) on the force-frequency-relation (FFR) of murine myocardium defining optimal experimental conditions for isolated murine papillary muscle preparations. Under isometric conditions low Ca2+ (1.0 mM) and low temperature (27°C) lead to a positive FFR, while at high Ca2+ and temperature (5,0 mM, 37°C) the FFR turned negative. Auxotonic contractions resulted in flattening of the FFR compared to isometric concentrations. Thus, under conditions mimicking the physiological situation best ([Ca2+] = 1,5 mM, 32°C, auxotony) the FFR of murine heart is flat indicating that in contrast to the human heart in the mouse heart in vivo a positive inotropic effect by increasing heart frequency does not contribute significantly to increase cardiac output. To characterise cardiac function of alpha-B-Crystallin papillary muscles from alpha-B-/- and wildtype mice were exposed to 20 min of simulated ischemia (withdrawal of glucose and oxygen) and 60 min of reperfusion. Under physiological conditions no differences in contractility of alpha-B-/- and wildtype mice were observed. However, during simulated ischemia the development of ischemic contracture started earlier and reached a significant higher value in alpha-B-/- than in wildtype muscles. The recovery of the contracture during simulated reperfusion was also significantly attenuated. Interestingly, twitch force was neither during ischemia nor during the reperfusion period significantly altered. This suggests that during ischemia alpha-B-Crystallin may rather serve to protect cardiac relaxation (diastolic function) than contraction itself. The molecular mechanisms underlying this pronounced pathological behaviour remain to be determined. Since alpha-B-Crystallin is known to bind to the elastic titin filament system during ischemia we propose that increased ischemia-induced cardiac muscle stiffness in alpha-B-/- mice result from reduced elastic properties of titin in the absence of alpha-B-Crystallin. Thus, one possible function of alpha-B-Crystallin in the heart might be to preserve myofibrillar elastic properties during ischemia/reperfusion. KW - alpha-B-Crystallin KW - Hitzeschockprotein KW - Ischämie-Reperfusions-Schaden KW - Kraft-Frequenz-Beziehung KW - Präkonditionierung KW - alpha-B-Crystallin KW - heat shock protein KW - ischemia reperfusion injury KW - force frequency relationship KW - preconditioning Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11984 ER -