TY - JOUR A1 - Timofeev, Oleg A1 - Schlereth, Katharina A1 - Wanzel, Michael A1 - Braun, Attila A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Pagenstecher, Axel A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Elsässer, Hans-Peter A1 - Stiewe, Thorsten T1 - p53 DNA Binding Cooperativity Is Essential for Apoptosis and Tumor Suppression In Vivo JF - Cell Reports N2 - Four molecules of the tumor suppressor p53 assemble to cooperatively bind proapoptotic target genes. The structural basis for cooperativity consists of interactions between adjacent DNA binding domains. Mutations at the interaction interface that compromise cooperativity were identified in cancer patients, suggesting a requirement of cooperativity for tumor suppression. We report on an analysis of cooperativity mutant p53(E177R) mice. Apoptotic functions of p53 triggered by DNA damage and oncogenes were abolished in these mice, whereas functions in cell-cycle control, senescence, metabolism, and antioxidant defense were retained and were sufficient to suppress development of spontaneous T cell lymphoma. Cooperativity mutant mice are nevertheless highly cancer prone and susceptible to different oncogene-induced tumors. Our data underscore the relevance of DNA binding cooperativity for p53-dependent apoptosis and tumor suppression and highlight cooperativity mutations as a class of p53 mutations that result in a selective loss of apoptotic functions due to an altered quaternary structure of the p53 tetramer. KW - mutant p53 KW - senescence KW - mice KW - tumorigenesis KW - restoration KW - damage responses KW - antioxidant function KW - p53-inducible regulator KW - p53-dependent apoptosis KW - cell-cycle arrest Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122168 VL - 3 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Lars T1 - Role and regulation of the p53-homolog p73 in the transformation of normal human fibroblasts T1 - Rolle und Regulation des p53-Homologs p73 in der Transformation normaler menschlicher Fibroblasten N2 - The prototyical tumor suppressor p53 is able to arrest cells after DNA damage or as a response to oncogene expression. The transactivation-competent (TA) isoforms of the more recently discovered p53 family member p73 also prevent tumors, but the underlying mechanisms are less well understood. The work presented here addressed this issue by using a cell culture model of tumorigenesis in which normal human diploid fibroblasts are stepwise transduced with oncogenes. Cells in pretransformed stages were shown to harbour high levels of TAp73 mRNA and protein. This positive regulation was probably a result of pRB inactivation and derepression of E2F1, a key activator of TAp73. Consequences for such cells included an increased sensitivity to the cytostatic drug adriamycin, slower proliferation and reduced survival at high cell density, as demonstrated by rescue experiments using siRNA-mediated knockdown of TAp73. In order to identify potential effector pathways, the gene expression profile of siRNA treated, matched fibroblast cell lines with high and low TAp73 levels were compared in DNA microarrays. These findings support the notion of TAp73 up-regulation as an anti-proliferative defense mechanism, blocking the progress towards full transformation. This barrier could be overcome by the introduction of a constitutively active form of Ras which caused a switch from TAp73 to oncogenic DeltaNp73 expression, presumably through the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. In summary, the results presented emphasize the tumor-suppressive function of TAp73 and indicate that its downregulation is a decisive event during the transformation of human cells by oncogenic Ras mutants. N2 - Der gut untersuchte Tumorsuppressor p53 vermag das Wachstum von Zellen nach DNA-Schädigung oder Onkogenaktivierung zu arretieren. Die transaktivierungsfähigen (TA) Isoformen von p73, eines kürzlich entdeckten Mitgliedes der p53-Familie, können ebenfalls die Tumorentstehung verhindern. Die Mechanismen sind hier aber noch sehr unvollkommen verstanden. Zu deren Untersuchung wurde in der vorliegenden Arbeit ein Zellkulturmodell der Tumorentstehung verwendet, bei dem normale humane diploide Fibroblasten schrittweise mit bestimmten Onkogenen transduziert wurden. Zellen in unvollständig transformierten Stadien hatten hohe Spiegel an TAp73-mRNA und -Protein. Diese positive Regulation war vermutlich eine Folge von pRB-Inaktivierung und der Derepression von E2F1, einem der wichtigsten Aktivatoren von TAp73. Beobachtete Konsequenzen für solche Zellen waren höhere Empfindlichkeit für Zytostatika wie Adriamycin, langsameres Wachstum und geringere Überlebensfähigkeit bei hoher Zelldichte, was durch Rescue-Experimente mit siRNA-vermitteltem TAp73-Knock down gezeigt werden konnte. Um mögliche Effektor-Signalwege zu identifizieren, wurden die Genexpressionsprofile von siRNA-behandelten Fibroblastenlinien, die sich nur im TAp73-Spiegel unterschieden, in DNA microarrays verglichen. Die Befunde daraus lassen den Schluss zu, dass die Hochregulation von TAp73 einen antiproliferativen Schutzmechanimus darstellt, der die vollständige Transformation verhindert. Diese Barriere konnte überwunden werden durch die zusätzliche Präsenz von aktiviertem Ras, das einen Wechsel der Expression von TAp73 zu der von onkogenem DeltaNp73 bewirkte. Dies ist vermutlich abhängig vom Phosphatidylinositol-Signalweg. Zusammenfassend wurde die Rolle von TAp73 als Tumorsuppressor weiter gefestigt, da die Niederregulierung des Proteins eine zentrale Rolle in der Transformation menschlicher Zellen durch onkogene Ras-Mutanten spielt. KW - Maligne Transformation KW - Fibroblast KW - Carcinogenese KW - Krebsforschung KW - Krebszelle KW - Protein p53 KW - Protein p73 KW - Apoptosis KW - Tumorigenese KW - p63 KW - tumorigenesis KW - p63 Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26877 ER - TY - THES A1 - Rotzer, Diana T1 - Biologische Charakterisierung der Rezeptoren für Transforming Growth Faktor-ß T1 - Biological charakterization of the receptors for Transforming Growth Factor-ß N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) reguliert eine Vielzahl zellulärer Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Über membrangebundene Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren werden TGF-ß Signale durch Phosphorylierung an Smad-Proteine, die intrazellulären Signaltransduktoren, weitergeleitet, die im Kern die Transkription spezifischer Gene modulieren. Obwohl die drei TGF-ß Isoformen, TGF-ß1, -ß2 und -ß3, äußerst homologe Proteine sind, unterscheiden sich die Phänotypen ihrer Genknockouts stark. Variabilität und Spezifität können auf vielerlei Arten und Ebenen der TGF-ß Signalübertragung erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternativ gespleißte Variante des TGF-ß Typ II Rezeptors (TßRII), TßRII-B, charakterisiert. Dieser Rezeptor ist, im Gegensatz zum bisher bekannten TßRII, in der Lage alle drei TGF-ß Isoformen hochaffin zu binden und in Abwesenheit eines unterstützenden Typ III Rezeptors (TßRIII) Signale über den Smad-Pathway weiterzuleiten. TßRII-B ist außerdem fähig ligandenabhängig mit den verschiedenen TGF-ß Rezeptortypen zu Oligomerisieren. Erste Hinweise auf Besonderheiten der TGF-ß2 Bindung an TßRII-B wurden mittels verschiedener zellbiologischer Ansätzen gewonnen. Aus Untersuchungen zur gewebespezifischen Expression des Rezeptors geht hervor, daß TßRII-B, im Vergleich zu TßRII, ein distinktes Expressionsmuster aufweist und v.a. in TGF-ß2-beeinflußten Geweben nachgewiesen werden kann. In diesen Erkenntnissen spiegelt sich die Bedeutung dieses Rezeptors für eine TGF-ß Isoform-spezifische Signalübertragung wider. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von TGF-ß und seinen Rezeptoren bei der Entstehung von Tumoren. B-Zellen einiger Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL), der häufigsten Form adulter Leukämie in westlichen Ländern, zeigen Resistenz gegenüber TGF-ß-vermittelter Wachstumsinhibierung und ein verändertes Expressionsmuster der TGF-ß Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche. In dieser Arbeit wird die Identifizierung und Charakterisierung zweier Mutationen innerhalb der putativen Signalpeptidsequenz des TGF-ß Typ I Rezeptors (TßRI) in B-Zellen TGF-ß resistenter CLL-Patienten beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Aminosäure-Austausch (L12Q) und eine ‚in-frame‘ Alanin-Deletion (A8) innerhalb einer aus 9 Alaninen bestehenden Sequenz. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutationen zwar keinen Einfluß auf Oberflächenexpression und Komplexbildungseigenschaften des TßRI haben, jedoch TGF-ß stimulierte Reportergeninduktion verringern, was eine kausale Beziehung bei der Entwicklung TGF-ß resistenter B-CLL-Zellen vermuten läßt. Ein Auftreten von Mutationen innerhalb der 9-Alanin-Sequenz des TßRI korreliert mit TGF-ß Insensitivität von B-CLL Zellen. Obwohl noch weitere Studien benötigt werden, um den präzisen molekularen Mechanismus zu verstehen, der zu TGF-ß Resistenz in B-CLL Zellen führt, kann spekuliert werden, daß TßRI Mutationen das Voranschreiten von B-CLL und evtl. anderen Tumorarten unterstützen. Gezieltes Screenen nach TßRI Signalpeptidsequenz Mutationen könnte demnach als prognostischer Indikator für Tumorprogression eingesetzt werden. N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) regulates a variety of cellular functions like proliferation, differentiation and apoptosis. It signals through membrane-bound serine/threonine kinase receptors, which upon stimulation phosphorylate Smad proteins, the intracellular signaltransducers, and thereby trigger their nuclear translocation and transcriptional activity. Although the three mammalian TGF-ß isoforms, TGF-ß1, -ß2 and –ß3, are highly homologous proteins, the phenotypes of their genknockouts reveal striking differences. Variability and specificity can be achieved on different levels of the TGF-ß signaltransduction. In this work an alternatively spliced variant of the TGF-ß type II receptor (TßRII), TßRII-B, is characterized, which in contrast to TßRII binds and mediates signaling of all TGF-ß isoforms. This signaling occurs via the Smad pathway and is independent of any supporting type III receptor (TßRIII). Therefore interaction and oligomerization of TßRII-B with the TGF-ß isoforms as well as the different TGF-ß receptor types was analyzed in detail. Furthermore we defined the characteristics of TGF-ß2 binding to TßRII-B. Expression studies demonstrate that TßRII-B expression is restricted to cells originating from tissues where the TGF-ß2 isoform has a predominant role. All that reflects the importance of this receptor splice-variant in TGF-ß isoform-specific signaling. The second part of this work focuses on the role of TGF-ß and its receptors in tumor development. B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common lymphoid cancer in Western societies, and is also currently incurable. B-cells from some B-CLL patients are resistant to the growth inhibitory effects of TGF-ß and show a different expression pattern of TGF-ß receptors at their cell surface. In this work the identification and characterization of two mutations within the putative signal sequence of the tßrI gene in B-cells from TGF-ß resistant B-CLL patients is described. Thereby a single aminoacid substitution (L12Q) is accompanied by an ‘in frame’ single alanine deletion within an 9-alanine stretch. It could be shown that this mutations do not mediate the apparent loss of functional TßRI in TGF-ß resistant B-CLL, but they attenuate reporter gene induction stimulated by TGF-ß, suggesting a causal relationship in the development of TGF-ß resistant B-CLL. The appearance of mutations within the 9-alanine stretch of the TßRI correlated with and predicted for B-CLL patient insensitivity to TGF-ß. Although more studies are needed to ascertain the precise molecular mechanism leading to TGF-ß resistance in B-CLL cells, it is tempting to speculate that these TßRI mutations may promote the progression of B-CLL and other cancers from their indolent to active states. This suggests that screening for TßRI signal sequence mutations can be employed as a prognostic indicator of B-CLL patient sensitivity to TGF-ß. KW - Transforming growth factor beta KW - Rezeptor KW - TGF-ß Rezeptoren KW - TßRII-B KW - chronische lymphatische Leukämie KW - Tumorgenese KW - TGF-ß receptors KW - TßRII-B KW - chronic lymphocytic Leukemia KW - tumorigenesis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180907 ER -