TY - THES A1 - Lukaszyk, Daniel T1 - Vergleich der Kollagenentwicklung und Differenzierungsfähigkeit humaner Stammzellen des Fettgewebes unter dem Einfluss des Prolyl-4- Hydroxylase-Inhibitors EDHB im 2D und 3D Modell T1 - Comparison of collagen development and differentiation ability of human adipose-derived stem cells under the influence of prolyl-4-hydroxylase inhibitor EDHB in a 2D and 3D Model N2 - Das Tissue Engineering von Fettgewebe befasst sich mit der Herstellung von biologisch äquivalenten Gewebekonstrukten mit dem Ziel, diese in der Regenerativen Medizin zur Deckung von Weichteildefekten einzusetzen. Für die Ausreifung, Funktion und das Überleben von Adipozyten wurde die Bedeutung der Extrazellulärmatrix (EZM) zunehmend deutlich.18-20 Untersuchungen zur EZM und ihrer Einflussnahme auf die Adipogenese wurden bislang hauptsächlich an konventionellen zweidimensionalen Zellkulturen unter Verwendung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow-derived MSC), Präadipozyten der Mauszelllinie 3T3-L1 und intramuskulären Präadipozyten aus Rindern (bovine intramuscular preadipocytes, BIP) vorgenommen.23,56,69,76,115 Ziel dieser Arbeit war es Erkenntnisse über den Einfluss der EZM auf die adipogene Differenzierungsfähigkeit unter Verwendung von humanen mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes (human adipose-derived stem cells, hASC) zu gewinnen. Um in vitro eine natürlichere Mikroumgebung der Zellen zu generieren, wurde neben einer 2D Kultur vergleichend ein 3D Modell bestehend aus multizellulären Sphäroiden verwendet.84,85 Zudem war die Bestimmung eines stabilen Housekeeping-Gens notwendig, um valide Ergebnisse in qPCR-Analysen von Genexpressionsstudien zu gewährleisten. Die Auswertung statistischer Parameter (Standardabweichung und Interquartilsbereich) sowie die Ergebnisse dreier zur Stabilitätsprüfung eingesetzten Softwares identifizierten EF1α als robustestes HKG. Der Zusammenhang zwischen der EZM-Entwicklung und der Adipogenese wurde durch Hemmung der Kollagenentwicklung unter Verwendung von Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat (EDHB) untersucht. Bei Betrachtung der Triglyceridsynthese mittels Histologie und quantitativer Analyse (Triglyceridassay) konnte in beiden Kultursystemen eine konzentrationsabhängige Hemmung der Adipogenese festgestellt werden. Im Unterschied zur 2D Kultur konnte der Triglyceridgehalt im 3D Modell annähernd auf das Niveau der nicht-induzierten Kontrolle gesenkt werden und damit ein tendenziell stärkerer negativer Effekt im 3D Modell demonstriert werden. In Untersuchungen zur Genexpression wurde die Expressionsrate der späten adipogenen Marker aP2 und C/EBPα maximal durch Zugabe von 0,05 mM EDHB gesenkt, wobei der Effekt in 3D erneut stärker ausgeprägt war. Bei Betrachtung der Kollagenentwicklung zeigte sich immunhistochemisch zunächst eine Adipogenese-assoziierte Entwicklung der Kollagene I, IV und VI im 2D und 3D Modell. Durch die Zugabe von EDHB ließ sich die Kollagenbildung gleichermaßen in 2D und 3D konzentrationsabhängig inhibieren. Damit konnte ein Rückgang der Synthese von drei für die Adipozyten relevanten Kollagenen zusammen mit der Störung der adipogenen Differenzierung nachgewiesen werden. Auf mRNA-Ebene hingegen war eine unterschiedliche Expression von Kollagen I und IV nachweisbar. Für Kollagen I wurde eine Abnahme der Expression bei Differenzierung der Zellen beobachtet, während die Expressionsrate von Kollagen IV erst mit Beginn der Adipogenese gesteigert wurde. Die Genexpression der untersuchten Kollagene wurde durch EDHB nicht negativ beeinflusst. Insgesamt weisen die Ergebnisse auf einen engen Zusammenhang der Kollagensynthese mit der Adipogenese hin. Inwieweit eine durch Zell-Matrix-Interaktionen ausgelöste Signaltransduktion und regulatorische Mechanismen in den Präadipozyten die Adipogenese beeinflussen, bleibt jedoch Gegenstand zukünftiger Forschung. N2 - Adipose tissue engineering focuses on the generation of biologically equivalent tissue constructs that can be used in regenerative medicine to cover tissue defects. The relevance of the extracellular matrix (ECM) in adipocyte maturation, function, and survival has become increasingly apparent.18-20 Studies on the ECM and its influence on adipogenesis have so far mainly been performed on conventional two-dimensional cell cultures using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (bone marrow-derived MSC), mouse cell line 3T3-L1 preadipocytes, and bovine intramuscular preadipocytes (BIP).23,56,69,76,115 The goal of the study was to gain insights into the role of the ECM on adipogenic differentiation capacity using human adipose-derived stem cells (hASC). To generate a more natural cell microenvironment in vitro, a 3D model consisting of multicellular spheroids was used in comparison to a 2D culture.84,85 Moreover, to ensure valid results in gene expression studies obtained by qPCR analyses, determination of a stable housekeeping gene was necessary. The evaluation of statistical parameters (standard deviation and interquartile range) and the results achieved by three softwares known for stability testing identified EF1α as the most robust HKG. The relationship between ECM development and adipogenesis was investigated by inhibition of collagen development using ethyl-3,4-dihydroxybenzoate (EDHB). Histological staining of lipids and quantitative analysis (triglyceride assay) revealed a concentration-dependent inhibition of adipogenesis in both culture systems. In contrast to the 2D culture, the triglyceride content in the 3D model could be reduced approximately to the level of the non-induced control, demonstrating an overall stronger inhibitory effect in the 3D model. In gene expression studies, the expression levels of the late adipogenic markers aP2 and C/EBPα were maximally decreased by addition of 0.05 mM EDHB, whereby the effect was again more pronounced in 3D. Regarding the collagen development, an adipogenesis-associated development of collagen I, IV, and VI was seen by immunohistochemical analysis in the 2D and 3D models. Addition of EDHB equally inhibited collagen formation in 2D and 3D in a concentration-dependent manner. This demonstrated a decrease in the synthesis of three collagens relevant to adipocytes along with the disruption of adipogenic differentiation. In contrast, a different expression pattern of collagen I and IV was detectable at the mRNA level. For collagen I, a decrease in expression was observed upon differentiation of the cells, whereas the expression level of collagen IV was increased only with the onset of adipogenesis. Both expression patterns were not affected by EDHB. Overall, the results indicate a close relationship of collagen synthesis with adipogenesis. However, the extent to which signal transduction triggered by cell-matrix interactions and regulatory mechanisms in preadipocytes influence adipogenesis remains the subject of future research. KW - Tissue engineering KW - Kollagen KW - Extrazellulärraum KW - Fettgewebe KW - Differenzierung KW - Extrazllulärmatrix KW - Prolyl-4-hydroxylase-Inhibitor KW - EDHB KW - Ethyl-3,4-dihydroxybenzoate Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240912 ER - TY - THES A1 - Lauber, Paloma T1 - Die Rolle individueller NFAT-Faktoren in Lymphozyten und Keratinozyten T1 - The role of individual NFAT factors in lymphocytes and keratinocytes N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2 in NK-Zellen und die Rolle der Faktoren NFATc1-4 und NFAT5 in Keratinozyten analysiert. Die Familie der Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) Transkriptionsfaktoren besteht aus fünf Mitgliedern, welche entscheidend die Gentranskription bei Immunantworten beeinflussen. Nach Antigenaktivierung wird in Lymphozyten die Expression des Nfatc1-Gens stark induziert. Die Akkumulation der dabei gebildeten kurzen Isoform NFATc1/αA ist für die Zytokinproduktion als Effektorfunktion sowie für die Proliferation und das Überleben aktivierter Zellen verantwortlich. Das kurze NFATc1-Protein unterscheidet sich nicht nur strukturell, sondern auch funktionell von fast allen anderen NFAT-Proteinen. Um neue Erkenntnisse über die Funktion der Isoform NFATc1/αA in Lymphozyten zu gewinnen, wurden KT12 NK-Zellen mit NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2- exprimierenden Vektoren transfiziert, geklont, stimuliert und anschließend auf ihre jeweilige Apoptoserate und die Zytokinsynthese bzw. -expression hin untersucht. Die gewählten KT12-Hybridoma-Zellen erwiesen sich allerdings in ihrer intendierten Funktion als Testzellen für die Über-Expression von NFATc-Proteinen in NK-Zellen als ungeeignet. Fehlregulationen von NFAT-Signalwegen werden mit einer fehlerhaften Entwicklung des Immunsystems, mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und mit Krebs in Verbindung gebracht. Um die Rolle von NFAT-Faktoren in Keratinozyten besser zu verstehen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten mit Differenzierungssignalen bzw. UVB-Licht stimuliert. Änderungen der Transkription von NFAT-Faktoren, Keratinozyten-spezifischen Proteinen und Chemokinen wurden mittels qRT-PCR-Assays detektiert und analysiert. Insgesamt konnte die Beteiligung von NFAT-Faktoren am Differenzierungsprozess und an der UV-Antwort von Keratinozyten gezeigt werden. Es zeigte sich tendenziell eine stärkere Induktion der kurzen NFATc1-Isoform im Vergleich zu langen NFATc1-Isoformen, was die Frage nach einer besonderen Funktion der kurzen NFATc1-Isoform in Keratinozyten aufwirft. Generell ließen sich besonders hohe Expressionslevel des Transkriptionsfaktors NFAT5 - verglichen mit anderen NFAT-Faktoren - messen. Für die Entwicklung von Therapien, welche die Ursachen und Folgen einer dysregulierten Hautbarrierenbildung behandeln, könnten sich weitere Studien zu einzelnen NFAT-Faktoren bzw. NFATc1-Isoformen als zielführend erweisen. N2 - In the present work the role of the transcription factors NFATc1/αA or NFATc1/ßC and NFATc2 in NK cells and the role of the factors NFATc1-4 and NFAT5 in keratinocytes were investigated. The nuclear factor of activated T-cell (NFAT) transcription factor family consists of five members that critically influence gene transcription in immune responses. Following antigen activation, expression of the Nfatc1 gene is strongly induced in lymphocytes. Accumulation of the short NFATc1/αA isoform - formed in this process - is responsible for cytokine production as an effector function and for proliferation along with the survival of activated cells. The short NFATc1 protein differs not only structurally but also functionally from almost all other NFAT proteins. To gain new insights into the function of the NFATc1/αA isoform in lymphocytes, KT12 NK cells were transfected with NFATc1/αA, NFATc1/ßC or NFATc2- expressing vectors. The KT12 cells were cloned, stimulated and subsequently analyzed for their respective apoptosis rates together with cytokine synthesis or expression. However, the selected KT12 hybridoma cells proved to be unsuitable in their function as test cells for the overexpression of NFATc proteins in NK cells. Misregulation of NFAT signaling pathways has been associated with defective development of the immune system and autoimmune diseases and cancer. To better understand the role of NFAT factors in keratinocytes, HaCaT cells and primary human keratinocytes were stimulated with differentiation signals and UVB light, respectively. Changes in transcription of NFAT factors, keratinocyte-specific proteins and chemokines were detected and analyzed by qRT-PCR assays. Overall, the involvement of NFAT factors in the differentiation process and UV response of keratinocytes was demonstrated. The short NFATc1 isoform tended to be more strongly induced compared with long NFATc1 isoforms, raising the question of a special function of the short NFATc1 isoform in keratinocytes. Particularly high expression levels of the transcription factor NFAT5 - compared to other NFAT factors - could be measured. For the development of therapies that treat the causes and consequences of dysregulated skin barrier formation further studies on individual NFAT factors or NFATc1 isoforms will prove useful. KW - Keratinozyt KW - Natürliche Killerzelle KW - Transkriptionsfaktor KW - Chemokin CXCL10 KW - Chemokine KW - NFAT KW - Differenzierung KW - UV-Strahlung KW - Keratine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240119 ER -