TY  - THES
A1  - Altrichter, Steffen
T1  - Labeling approaches for functional analyses of adhesion G protein-coupled receptors
T1  - Markierungsverfahren zur funktionellen Analyse von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
N2  - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs) comprises more than 800 members, which are divided into five families based on phylogenetic analyses (GRAFS classification): Glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2 and Secretin. The adhesion G protein-coupled receptor (aGPCR) family forms with 33 homologs in Mammalia the second largest and least investigated family of GPCRs. The general architecture of an aGPCR comprises the GPCR characteristics of an extracellular region (ECR), a seven transmembrane (7TM) domain and an intracellular region (ICR). A special feature of aGPCRs is the extraordinary size of the ECR through which they interact with cellular and matricellular ligands via adhesion motif folds. In addition, the ECR contains a so-called GPCR autoproteolysis-inducing (GAIN) domain, which catalyzes autoproteolytic cleavage of the protein during maturation. This cleavage leads to the formation of an N-terminal (NTF) and a C-terminal fragment (CTF), which build a unit by means of hydrophobic interactions and therefore appear as a heterodimeric receptor at the cell surface. In the past, it has been shown that the first few amino acids of the CTF act as a tethered agonist (TA) that mediates the activation of the receptor through the interaction with the 7TM domain. However, the molecular mechanism promoting the TA-7TM domain interaction remains elusive. This work reveals a novel molecular mechanism that does not require the dissociation of the NTF-CTF complex to promote release of the TA and thus activation of the aGPCR. The introduction of bioorthogonal labels into receptorsignaling- relevant regions of the TA of various aGPCRs demonstrated that the TA is freely accessible within the intact GAIN domain. This suggests a structural flexibility of the GAIN domain, which allows a receptor activation independent of the NTF-CTF dissociation, as found in cleavage-deficient aGPCR variants. Furthermore, the present study shows that the cellular localization and the conformation of the 7TM domain depends on the activity state of the aGPCR, which in turn indicates that the TA mediates conformational changes through the interaction with the 7TM domain, which ultimately regulates the receptor activity. In addition, biochemical analyses showed that the GAIN domain-mediated autoproteolysis of the human aGPCR CD97 (ADGRE5/E5) promotes further cleavage events within the receptor. This suggests that aGPCRs undergo cleavage cascades, which are initialized by the autoproteolytic reaction of the GAIN domain. Thus, it can be assumed that aGPCRs are subject to additional proteolytic events. Finally, the constitutive internalization of the NTF and the CTF of E5 was demonstrated by various labeling methods. It was possible to label both fragments independently and to follow their subcellular location in vitro. In summary, these obtained results contribute to a better understanding about the molecular mechanisms of activity and signaling of aGPCRs.
N2  - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) umfasst weit mehr
als 800 Mitglieder, welche aufgrund von phylogenetischen Analysen in fünf Familien
unterteilt werden (GRAFS Klassifizierung): Glutamat, Rhodopsin, Adhäsion,
Frizzled/Taste2 und Sekretin. Die Familie der Ädhesions-G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren (aGPCRs) bildet mit 33 Homologen in Säugetieren die zweitgrößte Familie
innerhalb der GPCRs. Die generelle Architektur eines aGPCRs weist die GPCR
typischen Merkmale einer extrazellulären Region (ECR), einer sieben
Transmembrandomäne (7TM) und einer intrazellulären Region (ICR) auf. Eine
Besonderheit stellt hierbei die außergewöhnliche Größe der ECR, welche über
vielfältige Domänen mit zellulären und matrixgebundenen Liganden interagieren, dar.
Zusätzlich umfasst die ECR eine sogenannte GPCR Autoproteolyse-induzierende
(GAIN) Domäne, an welcher während der Proteinreifung eine autoproteolytische
Spaltung stattfindet. Diese Spaltung führt zur Entstehung eines N-terminalen (NTF)
und C-terminalen Fragmentes (CTF), welche mittels hydrophober Wechselwirkung
eine Einheit an der Zelloberfläche und daher einen heterodimeren Rezeptor bilden.
In der Vergangenheit zeigte sich, dass die ersten paar Aminosäuren des CTF als
angebundener Agonist (TA) agieren und über die Interaktion mit der 7TM Domäne eine
Aktivierung des Rezeptors vermitteln. Der molekulare Mechanismus, welcher die
Wechselwirkung zwischen TA und 7TM Domänen fördert, ist jedoch weiterhin
unbekannt. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen molekularen Mechanismus, welcher
keine Dissoziation des NTF-CTF Komplexes benötigt, um eine Freisetzung des TA
und damit eine Aktivierung des aGPCR zu gewährleisten. Mittels der Einbringung von
bioorthogonalen Markierungen in rezeptorsignalisierungs-relevante Bereiche des TA
von diversen aGPCRs, wurde gezeigt, dass dieser innerhalb der intakten GAIN
Domäne freizugänglich vorliegt. Dies lässt auf eine strukturelle Flexibilität der GAIN
Domäne schließen, welche eine Rezeptoraktivierung unabhängig von der NTF-CTF
Dissoziation erlaubt, wie sie auch bei spaltungsdefizienten aGPCR Varianten
vorzufinden ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass sich die zelluläre
Lokalisation und die Konformation der 7TM Domäne abhängig vom Aktivitätszustand
des aGPCR ist, was wiederrum daraufhin deutet, dass der TA über die Interaktion mit
der 7TM Domäne eine Konformationsänderung vermittelt, welche letztendlich die
Rezeptoraktivität reguliert. Zudem zeigten biochemische Analysen, dass neben der
GAIN Domänen-vermittelten Autoproteolyse des humanen aGPCRs CD97
(ADGRE5/E5) weitere proteolytische Spaltungen innerhalb des Rezeptors stattfinden.
Dies deutet daraufhin, dass aGPCRs Spaltungskaskaden durchlaufen, welche über
die autoproteolytischen Reaktion der GAIN Domäne initialisiert werden. Dadurch kann
angenommen werden, dass aGPCRs zusätzlichen proteolytischen Ereignissen unterliegen. Schlussendlich konnte mittels diverser Markierungsverfahren die
konstitutive Internalisierung des NTF und des CTF von E5 nachgewiesen werden. Es
war möglich beide Fragmente unabhängig voneinander zu markieren und deren
subzelluläre Lokalisation in vitro zu verfolgen. Zusammenfassend tragen die
gewonnen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden
molekularen Mechanismen in Bezug auf Aktivität und Signalübertragung von aGPCRs
bei.
KW  - G-Protein gekoppelter Rezeptor
KW  - Labeling
KW  - Functional analyses
KW  - Adhesion GPCR
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207068
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rübeling, Karsten
T1  - Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung von Adenosinrezeptoren in humanen Melanomzelllinien
T1  - Identification and pharmacological characterization of adenosine receptors in human melanoma cell lines
N2  - Adenosin steuert seine physiologische Funktionen über die vier G-Protein gekoppelten Adenosinrezeptoren A1, A2A, A2B und A3 und kann enormen Einfluss auf die Zellphysiologie und das Immunsystem haben. Hohe Adenosinkonzentrationen in Tumorgeweben haben das Interesse vieler Forschungsgruppen geweckt und den Nachweis von AR und dessen tumorfördernde sowie -hemmende Wirkung auf diverse Krebszellen nach sich gezogen. Melanome sind für 90% der letal ausgehenden Hautkrebsformen verantwortlich, da bereits kleinste Formen metastasieren können und vielmals eine rein chirurgische Therapie keine Heilung verspricht. Bei ungünstiger Prognose schränken adjuvante und systemische Therapieergänzungen die Lebensqualität erheblich ein. Auf der Suche nach gezielteren und schonenderen Therapieansätzen gilt es, die Rolle des Adenosins im Tumorgeschehen weiter aufzuklären, was den Nachweis und die Charakterisierung von AR und deren rezeptorspezifisch-gekoppelte Effekte voraussetzt. Daher sollten in der hier vorliegenden Arbeit die fünf humanen Melanomzelllinien A375, Brown, MV3, SK MEL23 und MEL2A auf die Expression von AR untersucht werden. 
Zu Beginn wurden die Zellen mit Hilfe von Bindungsexperimenten unter Einsatz radioaktiv markierter Liganden ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]ZM 241385) auf das Vorliegen der vier AR-Subtypen untersucht. A1- und A3-AR wurden nach Bindungsstudien mit [3H]CCPA bzw. [3H]HEMADO ausgeschlossen und nicht weiter untersucht. Durch Bindungsstudien mit [3H]ZM 241385 konnten in den Zellen Brown, MV3, SK-MEL23 und MEL2A geringe Mengen von A2B-Rezeptoren detektiert werden. 
Es folgten funktionelle Untersuchungen zur Stimulation der AC mit den Liganden NECA und CGS 21680 unter besonderem Blick auf die Differenzierung zwischen einer A2A- oder A2B vermittelten Stimulation. Ein NECA vermittelter Anstieg des c[32P]AMP im AC-Versuch bestätigte die Anwesenheit von A2B-Rezeptoren in den Zellen A375, Brown, MV3 und SK-MEL23. Durch CGS 21680 kam es hingegen zu keiner AC-Stimulation, was eine A2A-AR-Beteiligung ausschloss. Zur Bestätigung einer A2B gekoppelten AC-Aktivität wurde zum Abschluss der Versuche die Wirkung von drei selektiven Antagonisten (DPCPX, SCH 58261 und MRE 3008 F20) auf ein NECA induziertes cAMP-Signal überprüft. Mit den drei Antagonisten konnte an den Zelllinien A375, Brown und MV3 die für A2B-AR zu erwartende Wirkung nachgewiesen und damit die Expression von A2B-AR in diesen Zellen bestätigt werden. 
Die gewonnenen Daten können als Ausgangspunkt weiterführender Untersuchungen genutzt werden, um die Rolle von AR in Krebszellen besser zu verstehen. Sie könnten als Grundlage für die Suche nach potenziellen Angriffspunkten für neue Therapieansätze dienen und so einen Beitrag für Fortschritte in der Behandlung von Tumoren leisten.
N2  - Adenosine regulates its physiological function through four G protein-coupled adenosine receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine can have a tremendous impact on cell physiology and the immune system. A high concentration of adenosine in tumour tissue has drawn the interest of many research groups which then led to the detection of AR and its tumour-promoting and tumour-inhibiting effect on various cancer cells. Melanomas are responsible for 90% of all fatal skin cancers since already the smallest types can metastasise and, in many cases, surgical treatment alone will prove insufficient. In case of an unfavourable prognosis, adjuvant and systemic additional therapeutic measures will considerably impair the patient’s quality of life.
In the search for more targeted and gentle therapeutic approaches it is crucial to further investigate the role of adenosine in tumour development which implies the detection and characterisation of AR and their receptor-specific coupled effects. Hence, in this thesis, the five human melanoma cell lines A375, Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A will be tested for the expression of AR.
In the beginning, the cells were tested for the presence of four AR-subtypes with the help of binding experiments employing radioactively marked ligands ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA and
[3H]ZM 241385). A1- and A3-AR were excluded after binding studies with [3H]CCPA and [3H]HEMADO and were not further investigated. Binding studies with [3H]ZM 241385 showed that small amounts of A2B-receptors were detectable in the cell lines Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A.
This was followed by functional analyses regarding the stimulation of the AC with the ligands NECA and CGS 21680. Particular attention was paid to a differentiation between an A2A- or A2B-induced stimulation. A NECA-induced increase of the c[32P]AMP in the AC-test confirmed the presence of A2B-receptors in the cell lines A375, Brown, MV3 and SK-MEL23. CGS 21680, however, did not cause an AC-stimulation, which excluded an A2A-AR-involvement. In order to confirm an A2B-coupled AC-activity, the impact of three selective antagonists (DPCPX, SCH 58261 and MRE 3008-F20) on a NECA-induced cAMP-signal was tested to complete testing. The expected impact for A2B-AR could be proven on the cell lines A375, Brown and MV3 with the three antagonists and thus confirming the expression of A2B-AR in these cells.
The data obtained can be used as a basis for further investigating the role of AR in cancer cells. They could be used in the search forpotential points of application for new therapeutic approaches and thus contribute to making progress in the treatment of tumours.
KW  - Adenosin
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - Adenosine
KW  - Adenosine receptor
KW  - Melanoma
KW  - Melanomzelllinien
KW  - Functional analyses
KW  - Human
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115137
ER  -