TY - THES A1 - Sowik, Thomas T1 - Assessment of the surface functionalization of SPION and DND nanomaterials for cellular uptake and fluorescence imaging T1 - Abschätzung der Oberflächenfunktionalisierung von SPION und DND Nanomaterialien für die Zellaufnahme und Fluoreszenzimaging N2 - The aim of this work was to synthesize and functionalize different bio-relevant nanomaterials like silica-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) as contrast agents for T2 magnetic resonance imaging (MRI) and detonation nanodiamond (DND) with the neurohormone peptide allatostatin 1 (ALST1) and a fluorescent dye. Analytical techniques for the determination and quantification of surface functional groups like amines, azides, and peptides were also developed and established. Thus, in the first part of the work, a TGF-1 binding peptide and allatostatin 1 (ALST1), both supposed to act as active tumour targeting vectors, were synthesized by solid-phase peptide synthesis (SPPS) and characterized by high pressure liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry. Then, azide-functionalized silica nanoparticles were synthesized by the Stöber process and characterized by transmission electron microscopy (TEM) and infrared spectroscopy (IR). The surface loading of amine and azide groups was determined by a new protocol. The azide groups were reduced with sodium boronhydride to amine and then functionalized with Fmoc-Rink Amide linker according to a standard SPPS protocol. Upon cleavage of Fmoc by piperidine, the resulting dibenzofulvene and its piperidine adduct were quantified by UV/Vis spectroscopy and used to determine the amount of amine groups on the nanoparticle surface. Then, ALST1 and related tyrosine- and phenylalanine substituted model peptides were conjugated to the azide-functionalized silica nanoparticles by copper(I)-catalyzed azide-alkyne dipolar cycloaddition (CuAAC). The successful peptide conjugation was demonstrated by the Pauly reaction, which however is only sensitive to histidine- and tyrosine-containing peptides. As a more general alternative, the acid hydrolysis of the peptides to their individual amino acid building blocks followed by derivatization with phenyl isothiocyanate (PITC) allowed the separation, determination, and quantification of the constituent amino acids by HPLC. In the second part of the work, amine- and azide-functionalized silica-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) were synthesized by co-precipitation and subsequent silica-coated based on the Stöber process and characterized by TEM and IR. The amine surface loading was determined by the method already established for the pure silica systems. The azide surface loading could also be quantified by reduction with sodium boronhydride to amine groups and then conjugation to Fmoc-Rink amide linker. Upon cleavage of Fmoc with piperidine, the total amine surface loading was obtained. The amount of azide surface groups was then determined from the difference of the total amine surface loading and the amine surface loading. Thus, it was possible to quantify both amine and azide surface groups on a single nanoparticle system. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) are potent T2 contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Due to their natural metabolism after injection into the blood stream, SPIONs mostly end up inside macrophages, liver, spleen or kidneys. To generate a potential target-specific SPION-based T2 contrast agent for MRI, the neurohormone peptide ALST1 was conjugated by CuAAC to the azide- and amine functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles, since ALST1 is supposed to target difficult-to-treat neuroendocrinic tumours due to its analogy to galanin and somastatin receptor ligands. The organic fluorescent dye cyanine 5 (Cy5) was also conjugated to the silica-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) via a NHS-ester to the amines to enable cell uptake studies by fluorescence microscopy. These constructs were characterized by TEM, dynamic light scattering (DLS), and IR. The amino acids of the conjugated ALST1 were determined by the HPLC method as described before for peptide-modified silica nanoparticle surfaces. Then, the relaxivity r2 was measured at 7 T. However, a r2 value of 27 L/mmolFe·s for the dual ALST1-/Cy5-functionalized silica-coated SPIONs was not comparable to T2 contrast agents in clinical use, since their relaxivity is commonly determined at 1.5 T, and no such instrument was available. However, it can be assumed that the synthesized dual ALST1-/Cy5-functionalized silica-coated SPION would show a lower r2 at 1.5 T than at 7T. Commercial T2 MRI contrast agents like VSOP-C184 from Ferropharm show at r2 values of about 30 L/mmolFe·s at 1.5 T. Still, the relaxivity of the new material has some potential for application as a T2 contrast agent. Then, the material was used in cell uptake studies by fluorescence microscopy with the conjugated Cy5 dye as a probe. The dual ALST1-/Cy5-functionalized silica-coated SPION showed a high degree of agglomeration with no cellular uptake unlike described for ALST1-functionalized nanoparticles in literature. It is assumed that upon agglomeration of the particles, constructs form which are unable to be internalized by the cellular endocytotic pathways anymore. As a future perspective, the tendency of the particle to agglomerate should be reduced by changing the coating material to polyethylene glycol (PEG) or chitosan, which are known to be bio-compatible, bio-degradable and prevent agglomeration. In the third part of the work, the rhenium compound [ReBr(CO)3(L)] with L = 2-phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthroline and its manganese analogue were synthesized by heating the ligand and rhenium pentacarbonyl bromide or and manganese pentacarbonyl bromide respectively, in toluene. However, [MnBr(CO)3(L)] was unstable upon illumination by UV light at 365 nm. Thus, it was dismissed for further application. The photophysical properties of [ReBr(CO)3(L)] were explored, by determination of the excited-state life time by the time-correlated single-photon counting (TCSPC) method and the quantum yield by a fluorescence spectrometer equipped with an integration sphere. A value of  = 455 ns, a Stokes shift of 197 nm and a rather low quantum yield =were found. Metal complexes are supposed to have superior properties compared to organic dyes due to their large Stokes shifts, long excited-state life times, and high quantum yields. Thus, amine- and azide-functionalized detonation nanodiamond (DND) as an alternative biological inert carrier system was functionalized with ALST1 to enhance its cell uptake properties. A luminescent probe for cell uptake studies using fluorescence microscopy was also attached, either based on the new rhenium complex or the commercially available organic dye Cy5, respectively. The aldehyde-functionalized rhenium complex was conjugated to the DND via oxime ligation, which is known to be a mild and catalyst-free conjugation method. The amount of peptide ALST1 on the DND was analyzed and quantified after acid hydrolysis and PITC derivatization by HPLC as described before. Then, the ALST1-/luminescent probe-functionalized DND was investigated for its photophysical properties by fluorescence spectroscopy. The Cy5-functionalized material showed a slightly lower fluorescence performance in aqueous solution than reported in literature and commercial suppliers with a life time  < 0.4 ns and quantum yields not determinable by integration sphere due to the week signal intensity. The rhenium complex-functionalized material had a very low signal intensity in only aqueous medium, and thus determination of life times and quantum yield by fluorescence spectroscopy was not possible. After incubation with MDA-MB 231 cells, the Cy5-functionalized DND could easily be detected due to its red fluorescence. However, it was not possible to visualize the rhenium complex-functionalized DND with fluorescence microscopy due to the low fluorescence intensity of the complex in aqueous medium and the lack of proper filters for the fluorescence microscope. Cy5-functionalized DND did not show any cellular uptake in fluorescence microscopy after conjugation with ALST1. Since the nanodiamond surface is known to strongly adsorb peptides and proteins, it is assumed that the peptide chain is oriented perpendicular to the nanoparticle surface and thus not able to interact with cell membrane receptors to promote cell uptake of the particles. As a future perspective, the ALST1-promoted cellular uptake of the DND should be improved by using different linker systems for peptide conjugation to prevent adsorption of the peptide chain on the particle surface. The new analytical methods for amino-, azide-, and peptide-functionalized nanoparticles have great potential to assist in the quantification of nanoparticle surface modifications by UV/Vis spectroscopy and HPLC. The determination of surface amine and azide groups based on the cleavage of conjugated Fmoc-Rink amide linker and detected by UV/Vis spectroscopy is applicable to all amine-/azide-functionalized nanomaterials. However, particles which form very stable suspension with the cleavage mixture can cause quantification problems due to scattering, making an accurate quantification of dibenzofulvene and its piperidine adduct impossible. The detection of tyrosine- and histidine-containing peptides based on the Pauly reaction is well-suited as a fast and easy-to-perform qualitative demonstration of successful peptide surface conjugation. However, its major drawback as a colourimetric approach is that coloured particles cannot be evaluated by this method. The amino acid analysis based on HPLC after acid hydrolysis of peptides conjugated to nanoparticle surfaces to its individual building blocks and subsequent derivatization with PITC, can be used on all nanomaterials with peptide or protein surface modification. It allows detection of amino acids down to picomolar concentrations and even enables analysis of very small peptide surface loadings. However, the resulting HPLC traces are difficult to analyze. Three new analytical methods based on UV/Vis and HPLC techniques have been developed and established. They assisted in the characterization of the synthesized DND and SPIONs with dual functionalization by ALST1 and Cy5 or [ReBr(CO)3(L)], respectively. However, the nanomaterials showed no cellular uptake due to a high tendency to agglomerate. The cellular uptake should be improved and the tendency to agglomerate of the SPIONs should be reduced by changing the surface coating from silica to either PEG or chitosan. Furthermore, different linker systems for connecting peptides to DND surfaces should be synthesized and evaluated to reduce potential peptide chain adsorption. N2 - Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese und Funktionalisierung biologisch relevanter Nanomaterialien wie die Silica-umhüllten superparamagnetischen Eisenoxid Nanopartikel (SPIONs) als Kontrastmittel für T2 gewichtete Magnetresonanztomographie (MRT) und Detonantionsnanodiamant mit dem Neurohormonpeptid Allatostatin 1 (ALST1) sowie einem Fluoreszenzfarbstoff. Des Weiteren sollten analytische Methoden zur Bestimmung und Quantifizierung von funktionellen Oberflächenmodifikationen wie Amine, Azide und Peptide entwickelt und etabliert werden. Aus diesem Grund wurden im ersten Teil der Arbeit ein TGF-1 bindendes Peptid und Allatostatin 1 (ALST1), welche beide spezifisch Tumorgewebe anzielen, mit Hilfe der Festphasen Peptid Synthese (SPPS) hergestellt und durch HPLC und Massenspektrometrie charakterisiert. Danach wurden Azid-funktionalisierte Silica-Partikel durch den Stöber Prozess hergestellt und mit Hilfe von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Infrarot Spektroskopie (IR) charakterisiert. Die Oberflächenbeladung von Aminen und Aziden wurde mit einer neuen Methode bestimmt. Azidgruppen wurden mit Natriumborhydrid zu Aminen reduziert und anschließend mit dem Fmoc-Rink Amid Linker unter Verwendung des allgemeinen SPPS Verfahrens. Durch die Abspaltung von Fmoc mit Piperidin wurden Dibenzofulven und sein Piperidin-Adduct gebildet und mit Hilfe von UV/Vis Spektroskopie quantifiziert um die Oberflächenbeladung der Amino-Gruppen auf den Nanopartikeln zu bestimmen. Danach wurden ALST1 und verwandte Tyrosin- und Phenylalanin- substituierte Modellpeptide synthetisiert und durch die Kuper(I)-katalysierte Azid-Alkin dipolare Cycloaddition (CuAAC) an die Oberfläche der Silica-Partikel konjugiert. Die erfolgreiche Peptidkonjugation wurde mit Hilfe der Pauly Reaktion, welche jedoch ausschließlich auf Tyrosin- und Histidin-haltige Peptide und Proteine anwendbar ist, nachgewiesen. Als eine universellere Alternative wurden die Peptid-konjugierten Nanomaterialien mit konzentrierter Salzsäure hydrolysiert und anschließend mit Phenylisothiocyanat (PITC) derivatisiert, was die Trennung, Bestimmung und Quantifikation der individuellen Aminosäuren des Peptids durch HPLC ermöglichte. In dem zweiten Teil dieser Arbeit wurden Amin- und Azid-funktionalisierte Silica-umhüllte superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (SPIONs) durch Co-Präzipitation und anschließender Silica-Ummantelung basierend auf dem Stöber Prozess synthetisiert und mit Hilfe von TEM und IR charakterisiert. Die Oberflächenbeladung der Aminogruppen wurde an Hand der bereits etablierten Methode für Silica-Partikel bestimmt. Die Oberflächenbeladung der Azidgruppen wurde quantifiziert durch deren Reduktion mit Natriumborhydrid zu Aminogruppen und der darauf folgenden Verknüpfung mit dem Fmoc-Rink Amid Linker. Durch die Abspaltung des Fmoc mit Piperidin und dessen Quantifizierung durch UV/Vis Spektroskopie wurde so die gesamte Aminogruppen Oberflächenbeladung erhalten. Die Oberflächenbeladung mit Azidgruppen wurde dann durch die Differenz aus gesamter Amin- und tatsächlicher Amin-Oberflächenbeladung berechnet. Auf diese Weise war es möglich die Oberflächenbeladung sowohl von Aminen, als auch von Aziden an nur einem einzigen Nanopartikelsystem zu bestimmen. SPIONs können als Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen verwendet werden. Jedoch werden sie auf Grund ihres Metabolismus nach der Injektion ins Blutsystem von Makrophagen, Leber, Milz und Niere aufgenommen. Um ein potentielles, gewebespezifisches SPION-basiertes Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen zu erzeugen wurde das Neurohormonpeptid ALST1 mit Hilfe der CuAAC an die Azid-/Amin-funktionalisierten Silica-ummantelten SPIONs konjugiert, da von ALST1 eine Spezifität auf schwierig zu behandelnde neuroendokrine Tumore vermutet wird, auf Grund seiner Ähnlichkeit zu Galanin und Somastatin Rezeptorliganden. Der organische Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 5 (Cy5) wurde ebenfalls an den Azid-/Amin-funktionalisierten Silica-ummantelten SPIONs über einen NHS-Ester konjugiert um Zellaufnahmestudien mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen. Diese Materialien wurden mit TEM, dynamischer Lichtstreuung (DLS) und IR charakterisiert. Die Aminosäuren des konjugierten ALST1 wurden an Hand der bereits für Silica-Partikel beschriebenen HPLC-Methode bestimmt. Danach wurde die Relaxivität r2 bei 7 T gemessen. Leider sind der gemessene Wert von 27 L/mmolFe·s für das duale System ALST1-/Cy5-functionaliserte Silica-ummantelte SPIONs nicht mit klinisch verwendete T2 Kontrastmittel zu vergleichen, da diese bei einer Feldstärke von 1.5 T verwendet werden. Es ist jedoch anzunehmen, dass das synthetisierte Nanopartikelsystem bei 1.5 T eine geringere Relaxivität r2 zeigen würde als bei 7 T. Jedoch zeigen kommerzielle Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen wie zum Beispiel VSOP-C184 von Ferropharm r2 Werte um die 30 L/mmolFe·s. Von daher hat das neue Material durchaus Potential als Kontrastmittel für T2-gewichtete MRT Messungen. Danach wurde das Material auf seine Zellaufnahme mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung des konjugierten Cy5 als Sonde untersucht. Die dualen ALST1-/Cy5-functionaliserte Silica-ummantelte SPIONs wurden mit MDA-MB 231 Zellen inkubiert, zeigten jedoch einen hohen Grad an Agglomeration, wobei große Konstrukte gebildet wurden die nicht mehr durch die zellularen Endozytosewege internalisiert werden konnten. Für weitere Anwendungen muss die Tendenz der Partikel zur Agglomeration verringert werden. Dies kann durch einen Wechsel der Hülle von Silica zu Polyethylenglykol (PEG) oder Chitosan erreicht werden, welche dafür bekannt sind Agglomeration zu verhindern als auch biologisch kompatibel, abbaubar zu sein. Im dritten Teil der Arbeit wurde die Rheniumverbindung [ReBr(CO)3(L)] mit L = 2-Phenyl-1H-imidazo[4,5-f][1,10]phenanthrolin und ihr Mangan-Analogon synthetisiert durch Erhitzen des Liganden und Bromopentacarbonylrhenium, beziehungsweise Bromopentacarbonyl-mangan, in Toluol. Der Komplex [MnBr(CO)3(L)] wurde jedoch wegen seiner Instabilität bei Belichtung mit UV-Licht der Wellenlänge 365 nm für weitere Anwendungen verworfen. Die photophysikalischen Eigenschaften von [ReBr(CO)3(L)] wurden untersucht durch die Bestimmung der Lebenszeit des angeregten Zustandes mit der time-correlated single-photon counting (TCSPC) Methode und die Quantenausbeute mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrometers welches mit einer Integrationsphäre ausgerüstet war. Ein Wert von  = 455 ns, einem Stokes shift von 197 nm und eine eher niedrige Quantenausbeute  = 0.05 wurden ermittelt. Es wird behauptet, dass Metallkomplexe den organischen Fluoreszenzfarbstoffen überlegende Stokes shifts, Lebenszeiten des angeregten Zustandes sowie Quantenausbeuten haben. Aus diesem Grund wurde der Amino- und Azid-funktionalisierte DND mit ALST1, auf Grund seiner Eigenschaft die Zellaufnahme zu verstärken, funktionalisiert. Des Weiteren wurde eine Fluoreszenzsonde für Zellaufnahmestudien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und die Partikeloberfläche konjugiert, welche entweder auf [ReBr(CO)3(L)] oder Cy5 basierten. Die Aldehyd-funktionalisierte Rheniumverbindung wurde über die Oxime Ligation an den Nanopartikel konjugiert, welche als milde und Katalysator-freie Konjugationsmethode bekannt ist. Die Menge des Peptids ALST1 auf der DND Oberfläche wurde durch HPLC nach saurer Hydrolyse und Derivatisierung mit PITC wie zuvor beschrieben analysiert und quantifiziert. Danach wurden die dualen ALST1-/Lumineszenzsonde-funktionalisierten DND in Bezug auf ihre photophysikalischen Eigenschaften mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Das Cy5-funktionaliserte Material zeigte in wässrigem Medium etwas geringere Lebenszeit des angeregten Zustandes mit  < 0.4 ns als in der Literatur beschrieben und eine nicht bestimmbare Quantenausbeute durch die Integrationssphäre auf Grund der schwachen Emissionsintensität. Das [ReBr(CO)3(L)]-funktionalisierte Material zeigte eine sehr geringe Emissionsintensität in wässrigen Medium, welche es unmöglich machte die Lebenszeit des angeregten Zustandes und die Quantenausbeute zu bestimmen. Es war nicht möglich das Rhenium Komplex-funktionalisierte Material auf Grund seiner geringen Emissionsintensität in der Fluoreszenzmikroskopie nach Inkubation mit MDA-MB 231 Zellen zu visualisieren. Nach der Inkubation des Cy5-functionalisierten DND mit MDA-MB 231 Zellen, konnte das Material sehr gut auf Grund seiner roten Fluoreszenz identifiziert werden. Jedoch zeigte es keine Internalisierung in die Zellen nach Konjugation mit ALST1. Es wird vermutet dass die Peptidkette flach auf die Nanodiamantoberfläche, welche für ihre starke, nicht-kovalente Interaktion mit Proteinen und Peptiden bekannt ist, adsorbiert ist. Für zukünftige Anwendungen muss die ALST1-vermittelte Zellaufnahme der Detonationsnanodiamanten verbessert werden. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung anderer Linker-Systeme zur Verbrückung von Peptid und Partikeloberfläche um Adsorption zu verhindern. Die neuen analytischen Methoden für Amino-, Azid-, und Peptid-funktionalisierte Nanopartikel haben großes Potential in der Quantifizierung von Oberflächenmodifikationen von Nanopartikeln durch HPLC und UV/Vis. Die Bestimmung von Oberflächenbeladungen von Amin- und Azidgruppen basierend auf der Abspaltung von konjugiertem Fmoc des Fmoc-Rink Amid Linkers und Detektion durch UV/Vis Spektroskopie ist anwendbar auf alle Amin- und Azid-funktionalisierten Nanomaterialien. Jedoch kann es bei Partikeln welche besonders stabilen Suspensionen mit der Abspaltlösung bilden zu Problemen in der Quantifikation von Dibenzofulven und seinem Piperidin Addukt mittels UV/Vis Spektroskopie auf Grund von Streuung kommen. Die Detektion von Tyrosin- und Histidin-enthaltenden Peptiden auf Nanopartikeloberflächen auf Grundlage der Pauly Reaktion ist besonders geeignet als schneller und einfach durchzuführender qualitativer Nachweis für die erfolgreiche Konjugation von Peptiden auf Nanopartikeloberflächen. Der Hauptnachteil ist jedoch, dass Partikel mit Eigenfarbe nicht verwendet werden können. Die Aminosäureanalyse auf Grundlage von HPLC nach saurer Hydrolyse von Peptid-funktionalisierten Nanomaterialien und anschließender Derivatisierung mit PITC kann für alle Peptid- oder Protein-modifizierten Nanomaterialien verwendet werden. Es ermöglicht die Detektion von bis zu pikomolaren Konzentrationen und damit die Quantifizierung sehr geringe Oberflächenbeladungen mit Peptiden und Proteinen. Jedoch sind die resultierenden HPLC Chromatogramme schwierig zu interpretieren. Drei neue analytische Methoden auf der Grundlage von UV/Vis und HPLC Techniken wurden entwickelt und etabliert. Sie halfen bei der erfolgreichen Charakterisierung der synthetisierten DND und SPIONs mit dualer Funktionalisierung durch ALST1 und Cy5, beziehungsweise [ReBr(CO)3(L)]. Jedoch zeigten die Nanomaterialien auf Grund der hohen Tendenz zur Agglomeration keine Zellaufnahme. Das weitere Vorgehen umfasst die Verbesserung der Zellaufnahme durch ersetzen der Silica-Hülle der SPIONs mit PEG oder Chitosan. Bei den DND müssen andere Linkersysteme in Betracht gezogen und dann synthetisiert werden, welche die Adsorption der Peptidkette auf der Oberfläche des Partikels verhindern. KW - Nanopartikel KW - Bioanorganische Chemie KW - Peptide KW - SPION KW - Nanodiamond KW - Neuropeptide Hormone KW - Particle analytics KW - fluorescence KW - SPION KW - Nanodiamant KW - Neuropeptidhormon KW - Partikelanalytik KW - Fluoreszenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103709 ER - TY - THES A1 - Khayenko, Vladimir T1 - Functional peptide-based probes for the visualization of inhibitory synapses T1 - Funktionelle peptidbasierte Sonden zur Visualisierung von hemmenden Synapsen N2 - Short functional peptidic probes can maximize the potential of high-end microscopy techniques and multiplex imaging assays and provide new insights into normal and aberrant molecular, cellular and tissue function. Particularly, the visualization of inhibitory synapses requires protocol tailoring for different sample types and imaging techniques and relies either on genetic manipulation or on antibodies that underperform in tissue immunofluorescence. Starting from an endogenous activity-related ligand of gephyrin, a universal marker of the inhibitory post-synapse, I developed a short peptidic multivalent binder with exceptional affinity and selectivity to gephyrin. By tailoring fluorophores to the binder, I have obtained Sylite, a probe for the visualization of inhibitory synapses, with an outstanding signal-to-background ratio, that bests the “gold standard” gephyrin antibodies both in selectivity and in tissue immunofluorescence. In tissue Sylite benefits from simplified handling, provides robust synaptic labeling in record-short time and, unlike antibodies, is not affected by staining artefacts. In super-resolution microscopy Sylite precisely localizes the post-synapse and enables accurate pre- to post-synapse measurements. Combined with complimentary tracing techniques Sylite reveals inhibitory connectivity and profiles inhibitory inputs and synapse sizes of excitatory and inhibitory neurons in the periaqueductal gray brain region. Lastly, upon probe optimization for live cell application and with the help of novel thiol-reactive cell penetrating peptide I have visualized inhibitory synapses in living neurons. Taken together, my work provided a versatile probe for conventional and super-resolution microscopy and a workflow for the development and application of similar compact functional synthetic probes. N2 - Kurze funktionelle peptidische Sonden können das Potenzial von High-End-Mikroskopietechniken und Multiplex-Imaging-Assays maximieren und neue Erkenntnisse über normale und abweichende Molekulare-, Zelluläre- und Gewebefunktionen liefern. Insbesondere die Visualisierung inhibitorischer Synapsen erfordert eine Anpassung des Protokolls an verschiedene Probentypen und Bildgebungsverfahren und ist entweder auf genetische Manipulationen oder auf Antikörper angewiesen, die in der Gewebeimmunfluoreszenz unterdurchschnittlich abschneiden. Ausgehend von einem endogenen aktivitätsbezogenen Liganden von Gephyrin, einem universellen Marker der hemmenden Postsynapse, habe ich einen kurzen peptidischen multivalenten Binder mit außergewöhnlicher Affinität und Selektivität zu Gephyrin entwickelt. Durch die Anpassung von Fluorophoren an das Bindemittel habe ich Sylite erhalten, eine Sonde für die Visualisierung inhibitorischer Synapsen mit einem hervorragenden Signal-Hintergrund-Verhältnis, das die "Goldstandard"-Gephyrin-Antikörper sowohl in der Selektivität als auch in der Gewebe-Immunfluoreszenz übertrifft. Im Gewebe profitiert Sylite von einer vereinfachten Handhabung, bietet eine robuste synaptische Markierung in rekordverdächtig kurzer Zeit und wird im Gegensatz zu Antikörpern nicht durch Färbungsartefakte beeinträchtigt. In der Super-Resolution-Mikroskopie lokalisiert Sylite präzise die Post-Synapse und ermöglicht genaue Messungen von Prä- zu Postsynapse. In Kombination mit ergänzenden Tracing-Techniken deckt Sylite die hemmende Konnektivität auf und erstellt Profile der hemmenden Eingänge und Synapsengrößen von erregenden und hemmenden Neuronen in der periaquäduktalen Grau Hirnregion. Schließlich habe ich nach Optimierung der Sonde für die Anwendung in lebenden Zellen und mit Hilfe eines neuartigen thiolreaktiven zelldurchdringenden Peptids hemmende Synapsen in lebenden Neuronen visualisiert. Insgesamt lieferte meine Arbeit eine vielseitige Sonde für konventionelle und superauflösende Mikroskopie und einen Arbeitsablauf für die Entwicklung und Anwendung ähnlicher kompakter funktioneller synthetischer Sonden. KW - Fluoreszenzsonde KW - Peptidsynthese KW - Neurowissenschaften KW - Inhibitorische Synapse KW - Gephyrin KW - Peptide KW - Fluorescent probes KW - Neuroscience KW - Inhibitory synapse KW - Super-Resolution Microscopy KW - Tissue staining Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320438 ER - TY - THES A1 - Chen, Jiangtian T1 - Functions of allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) in the regulation of food intake and sleep in Drosophila T1 - Funktion der Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) in Bezug zu Nahrungsaufnahme und Schlaf bei Drosophila N2 - Neuropeptides and peptide hormones carrying neural or physiological information are intercellular signalling substances. They control most if not all biological processes in vertebrates and invertebrates by acting on specific receptors on the target cell. In mammals, many different neuropeptides and peptide hormones are involved in the regulation of feeding and sleep. In \textit{Drosophila}, allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) are brain-gut peptides. The AstA receptors are homologues of the mammalian galanin receptors and the amino acid sequences of MIPs are similar to a part of galanin, which has an orexigenic effect and is implicated in the control of sleep behaviour in mammals. I am interested in dissecting pleiotropic functions of AstA and MIPs in the regulation of food intake and sleep in \textit{Drosophila}. \par In the first part of the dissertation the roles of brain-gut peptide allatostatin A are analysed. Due to the genetic and molecular tools available, the fruit fly \textit{Drosophila melanogaster} is chosen to investigate functions of AstA. The aims in this part are to identify pleiotropic functions of AstA and assign specific effects to the activity of certain subsets of AstA expressing cells in \textit{Drosophila} adults. A new and restricted \textit{AstA\textsuperscript{34}-Gal4} line was generated. The confocal imaging result showed that AstA neurons are located in the posterior lateral protocerebrum (PLP), the gnathal ganglia (GNG), the medullae, and thoracic-abdominal ganglion (TAG). AstA producing DLAa neurons in the TAG innervate hindgut and the poterior part of midgut. In addition, AstA are detected in the enteroendocrine cells (EECs).\par Thermogenetic activation and neurogenetic silencing tools with the aid of the \textit{UAS/Gal4} system were employed to manipulate the activity of all or individual subsets of AstA cells and investigate the effects on food intake, locomotor activity and sleep. Our experimental results showed that thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced food intake, which can be traced to AstA signalling by using \textit{AstA} mutants. In the locomotor activity, thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs resulted in strongly inhibited locomotor activity and promoted sleep without sexual difference, which was most apparent during the morning and evening activity peaks. The experimental and control flies were not impaired in climbing ability. In contrast, conditional silencing of the PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced sleep specifically in the siesta. The arousal experiment was employed to test for the sleep intensity. Thermogenetically activated flies walked significantly slower and a shorter distance than controls for all arousal stimulus intensities. Furthermore, PDF receptor was detected in the PLP neurons and the PLP neurons reacted with an intracellular increase of cAMP upon PDF, only when PDF receptor was present. Constitutive activation of AstA cells by tethered PDF increased sleep and thermogenetic activation of the PDF producing sLNvs promoted sleep specifically in the morning and evening. \par The study shows that the PLP neurons and/or EECs vis AstA signalling subserve an anorexigenic and sleep-regulating function in \textit{Drosophila}. The PLP neurons arborise in the posterior superior protocerebrum, where the sleep relevant dopaminergic neurons are located, and EECs extend themselves to reach the gut lumen. Thus, the PLP neurons are well positioned to regulate sleep and EECs potentially modulate feeding and possibly locomotor activity and sleep during sending the nutritional information from the gut to the brain. The results of imaging, activation of the PDF signalling pathway by tethered PDF and thermoactivation of PDF expressing sLNvs suggest that the PLP neurons are modulated by PDF from sLNv clock neurons and AstA in PLP neurons is the downstream target of the central clock to modulate locomotor activity and sleep. AstA receptors are homologues of galanin receptors and both of them are involved in the regulation of feeding and sleep, which appears to be conserved in evolutionary aspect.\par In the second part of the dissertation, I analysed the role of myoinhibitory peptides. MIPs are brain-gut peptides in insects and polychaeta. Also in \textit{Drosophila}, MIPs are expressed in the CNS and EECs in the gut. Previous studies have demonstrated the functions of MIPs in the regulation of food intake, gut motility and ecdysis in moths and crickets. Yet, the functions of MIPs in the fruit fly are little known. To dissect effects of MIPs regarding feeding, locomotor activity and sleep in \textit{Drosophila melanogater}, I manipulated the activity of MIP\textsuperscript{WÜ} cells by using newly generated \textit{Mip\textsuperscript{WÜ}-Gal4} lines. Thermogenetical activation or genetical silencing of MIP\textsuperscript{WÜ} celles did not affect feeding behaviour and resulted in changes in the sleep status. \par My results are in contradiction to a recent research of Min Soohong and colleagues who demonstrated a role of MIPs in the regulation of food intake and body weight in \textit{Drosophila}. They showed that constitutive silencing of MIP\textsuperscript{KR} cells increased food intake and body weight, whereas thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells decreased food intake and body weight by using \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver. Then I repeated the experiments with the \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver, but could not reproduce the results. Interestingly, I just observed the opposite phenotype. When MIP\textsuperscript{KR} cells were silenced by expressing UAS-tetanus toxin (\textit{UAS-TNT}), the \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT} flies showed reduced food intake. The thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells did not affect food intake. Furthermore, I observed that the thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells strongly reduced the sleep duration.\par In the third part of the dissertation, I adapted and improved a method for metabolic labelling for \textit{Drosophila} peptides to quantify the relative amount of peptides and the released peptides by mass spectrometry under different physiological and behavioural conditions. qRT-PCR is a practical technique to measure the transcription and the corresponding mRNA level of a given peptide. However, this is not the only way to measure the translation and production of peptides. Although the amount of peptides can be quantified by mass spectrometry, it is not possible to distinguish between peptides stored in vesicles and released peptides in CNS extracts. I construct an approach to assess the released peptides, which can be calculated by comparing the relative amount of peptides between two timepoints in combination with the mRNA levels which can be used as semiquantitative proxy reflecting the production of peptides during this period. \par After optimizing the protocol for metabolic labelling, I carried out a quantitative analysis of peptides before and after eclosion as a test. I was able to show that the EH- and SIFa-related peptides were strongly reduced after eclosion. This is in line with the known function and release of EH during eclosion. Since this test was positive, I next used the metabolic labelling in \textit{Drosophila} adult, which were either fed \textit{ad libitum} or starved for 24 hrs, and analysed the effects on the amount of AstA and MIPs. In the mRNA level, my results showed that in the brain \textit{AstA} mRNA level in the 24 hrs starved flies was increased compared to in the \textit{ad libitum} fed flies, whereas in the gut the \textit{AstA} mRNA level was decreased. Starvation induced the reduction of \textit{Mip} mRNA level in the brain and gut. Unfortunately, due to technical problems I was unable to analyse the metabolic labelled peptides during the course of this thesis.\par N2 - Neuropeptide und Peptidhormone sind interzelluläre Botenstoffe, die neuronale und physiologische Informationen tragen. Sie kontrollieren die meisten - wenn nicht alle - biologische Prozesse in Wirbeltieren und Wirbellosen durch ihre Wirkung auf spezifische Rezeptoren an den Zielzellen. So sind bei Säugetieren z.B. viele unterschiedliche Neuropeptide an der Regulierung des Freßverhaltens und des Schlafs beteiligt. In \textit{Drosophila} sind Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) typische Gehirn-Darm- Peptide. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe des Galanin-Rezeptors der Wirbeltiere, und die Aminosäurensequenz von MIP sind ähnlich zu einer Teilsequenz von Galanin, welches einen orexigenischen Effekt hat und mit der Kontrolle des Schlafverhaltens in Säugetieren verbunden ist. Ich bin interessiert an der Identifierung möglicher pleiotroper Funktionen von AstA und MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Schlaf in \textit{Drosophila}. \par Im ersten Teil der Dissertation wird die Rolle der Hirn-Darm- Peptide der AstA-Familie analysiert. Aufgrund der verfügbaren genetischen und molekularen Werkzeuge wurde die Taufliege \textit{Drosophila melanogaster} als Modell ausgewählt, um die Funktionen von AstA zu erforschen. Der Fokus lag dabei darauf, die pleiotropen Funktionen von AstA zu identifizieren, und herauszufinden, ob den verschiedenen AstA-exprimierenden Zelltypen jeweils unterschiedliche Funktionen zukommen. Eine neue, eingeschränkte AstA-Gal4-Linie wurde generiert. AstA-exprimierende Neuronen lassen sich im posterio-lateralen Protocerebrum (PLP), dem Gnathalganglion (GNG), der Medulla und dem thorakal-abdominalen Ganglion(TAG) finden. DLAa-Neuronen im TAG innervieren den Enddarm und den vorderen Teil des Mitteldarms. Ausserdem wird AstA auch in enteroendokrinen Zellen (EEC) im Mitteldarm exprimiert.\par Thermogenetische Aktivierung und neurogenetische Stillegung wurden zusammen mithilfe des UAS/Gal4-Systems eingesetzt, um die Aktivität vieler oder einzelner Untergruppen von AstA-Zellen zu manipulieren und die Effekte auf Nahrungsaufnahme, Laufaktivität und Schlaf zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierenden EEC Schlaf und Nahrungsaufnahme reduziert, was auf die signalisierende Funktion von AstA zurückzuführen ist. In der Laufaktivität führte die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierende EEC zu starker Hemmung, und förderte Schlaf ohne geschlechtsspezifischen Unterschied, was während der Aktivitätsgipfel am Morgen und Abend am besten zu beobachten war. Die Experimental- sowie die Kontrollfliegen waren im generellen Klettervermögen nicht beeinträchtigt. In Kontrast dazu reduzierte eine konditionale Stillegung von PLP-Neuronen und allen \textit{AstA-Gal4} exprimierenden Neuronen besonders den Siesta-Schlaf. Fliegen mit thermogenetisch aktivierten AstA-Zellen liefen wesentlich langsamer und weniger als die Kontrollgruppe bei allen Erregungsintensitäten. Außerdem wurde der PDF-Rezeptor in den PLP-Neuronen ermittelt. Die PLP-Neuronen reagierten auf PDF-Gabe mit einem intrazellulären Anstieg von cAMP nur dann, wenn der PDF-Rezeptor anwesend war. Konstitutive Aktivierung von AstA-Zellen durch "tethered" PDF steigerte den Schlaf, und thermogenetische Aktivierung von PDF-produzierenden sLNvs förderte Schlaf besonders am Morgen und Abend.\par Die Studie zeigt, dass die PLP-Neuronen und/oder EECs via AstA eine anorexigenische und schlafregulierende Funktion in \text{Drosophila} ausübt. PLP-Neuronen verzweigen im posterio-superioren Protocerebrum, wo die für Schlaf relevanten dopaminergen Neurone lokalisiert sind. Die EECs erstrecken sich bis zum Darmlumen. Daher sind die PLP-Neuronen gut positioniert, um Schlaf zu regulieren, und EECs modulieren potenziell die Verdauung und möglicherweise auch Laufaktivität und Schlaf durch Vermittlung der Nahrungsinformationen vom Darm zum Gehirn. Die Ergebnisse von Imaging, Aktivierung des PDF-wegs durch "tethered" PDF und Thermoaktivierung von PDF-exprimierenden s-LNvs weisen darauf hin, dass die PLP-Neuronen durch PDF aus sLNv-Uhr-Neuronen moduliert werden. AstA in den PLP-Neuronen scheint ein indirektes Ausgangssignal der inneren Uhr das die Laufaktivität und Schlaf modelliert. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe der Galanin-Rezeptoren; beide sind an der Regulierung von Ernährung und Schlaf beteiligt, was auf eine evolutionär bewahrte Funktion hindeutet. \par Im zweiten Teil der Dissertation habe ich die Rolle der MIP analysiert. MIP sind Hirn-Darm- Peptide der Insekten und Polychaeta. Auch in \textit{Drosophila} wird MIP durch Neurone im ZNS und durch EEC im Darm exprimiert. Bisherige Studien haben Funktionen von MIP bei der Nahrungsaufnahme, Regulation der Darmbewegung und Häutung in Motten und Grillen demonstriert. Für \textit{Drosophila} waren Funktionen von MIP nicht bekannt. Um mögliche Effekte von MIP bezüglich des Freßverhaltens, Laufaktivität und und Schlaf in \textit{Drosophila melanogaster} zu finden, habe ich die Aktivität von MIP\textsuperscript{WÜ}-Zellen mit Hilfe der neu in unserem Labor hergestellten \textit{Mip\textsuperscript{WÜ} -Gal4}-Linien manipuliert. Dabei konnte ich keinen Effekt auf das Freßverhalten finden, nachdem ich die MIP\textsuperscript{WÜ}–Zellen thermogenetisch aktiviert oder genetisch stillgelegt habe. Allerdings führte dies zu Änderungen des Schlafstatuses. \par Meine Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer neueren Veröffentlichung von Min Soohong und Kollegen, die eine Rolle der MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht von \textit{Drosophila} nachweisen konnten. Sie zeigten dass konstitutive Stillegung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht steigerte, während thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht durch \textit{MIP\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber verringerte. Ich habe daraufhin die Versuche mit der von Soohong eingesetzen \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber wiederholt, konnte aber damit die Ergebnisse nicht bestätigen. Interessanterweise habe ich genau das Gegenteil beobachtet. Wenn ich MIP\textsuperscript{KR}-Zellen durch Expresseion von UAS-Tetanustoxin (UAS-TNT) ausgeschaltet habe, zeigten die \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT}-Fliegen eine reduzierte Nahrungsaufnahme. Eine thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen hat die Nahrungsaufnahme nicht beeinflusst. Weiterhin habe ich beobachtet, dass die thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen die Schlafdauer stark reduziert.\par Im dritten Teil der Dissertation haben ich eine Methode zur metabolischen Markierung für \textit{Drosophila}-Peptide adaptiert und verbessert, um die relative Menge von Peptiden und die Peptidausschüttung mittels Massenspektrometrie unter verschiedenen physiologischen Bedingungen und Verhaltenskontexten zu quantifizieren. qRT-PCR ist eine praktische Technik um die Transkription und die entsprechende mRNA-Menge für ein gegebenes Peptid zu messen. Dies ist allerdings kein zwingendes Maß für die Translation und Menge eines Peptids. Massenspektrometisch kann die Peptidmenge zwar quantifiziert werden, es kann aber nicht zwischen in Vesikel gespeicherten Peptiden und ausgeschütteten Peptiden in ZNS-Extrakten unterschieden werden. Ich habe nach einem Zugang zu den ausgeschütteten Peptiden gesucht, die durch Vergleich der relativen Menge der Peptide zwischen zwei Zeitpunkten kalkuliert werden können, wenn die mRNA-Menge, welche ein semiquantitatives Proxy der Produktion der Peptide in dieser Periode darstellt, bekannt ist. \par Nachdem ich das Protokoll für die metabolische Markierung optimiert hatte, habe ich als Test eine quantitative Peptidomanalyse vor und nach dem Adultschlupf durchgeführt. Dabei konnte ich zeigen, dass die EH- und SIFa-relatierte Peptide nach dem Schlupf stark reduziert sind. Dies passt gut überein mit der bekannten Funktion und Freisetzung von EH während des Schlupfs. Da dieser Test positiv war, habe ich dann als nächsten Schritt die metabolische Markierung in adulten \textit{Drosophila} eingesetzt, die für 24h entweder \textit{ad libitum} gefüttert oder gehungert wurden, und geschaut, wie sich dies auf die Menge der AstA und MIP auswirkt. Meine Ergebnisse zeigten, dass das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Gehirn der Fliegen, die 24 Stunden gehungert haben im Vergleich zu \textit{ad libitum} gefütterten Fliegen steigt, während das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Darm sank. Hunger führte zur Reduzierung des \textit{Mip} mRNA-Spiegels in Gehirn und Darm. Wegen technischer Probleme konnte ich die metabolisch markierten Peptide während meiner Forschungsphase leider nicht mehr analysieren. \par KW - AstA KW - MIPs KW - Nahrungsaufnahme KW - Schlaf KW - Taufliege KW - Peptide KW - Drosophila Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156838 ER - TY - THES A1 - Benkert, Andreas T1 - Soft x-ray spectroscopic study of methanol and glycine peptides in different physical environments T1 - Weichröntgenspektroskopische Untersuchung von Methanol und Glycin Peptiden in unterschiedlichen physischen Umgebungen N2 - Ionenspezifische Effekte treten in einer Vielzahl von wässrigen Lösungen aus Elektrolyten und größeren Molekülen wie Peptiden auf. Die Ionen bewirken dabei Änderungen in Eigenschaften wie z.B. der Viskosität, den Aktivitäten von Enzymen, der Stabilität von Proteinen und deren Ein- bzw. Aussalzverhalten. Typischerweise wird die ionenabhängige Ausprägung derartiger Effekte mithilfe der Hofmeister–Serie beschrieben, die ursprünglich Ionen nach ihrer Fähigkeit ordnete, die Löslichkeit von Hühnereiweis in Wasser zu steigern oder zu unterdrücken. Die empirische Abfolge der Ionen in der Hofmeister–Serie kann jedoch bis heute nicht zweifelsfrei erklärt werden. Trotz weitreichender Bemühungen, ein molekulares Verständnis dieses Phänomens zu schaffen, konnte bisher keine Einigung über die zugrundeliegenden Mechanismen und die genauere Bestimmung und Lokalisierung der Wechselwirkung erzielt werden. Die resonante inelastische Weichröntgenstreuung (RIXS) kombiniert die beiden Methoden der Röntgenemissions– (XES) und Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS). So können mit RIXS Informationen sowohl über die besetzten als auch die unbesetzten elektronischen Zustände gesammelt und zu einem umfassenden Bild der elektronischen Struktur des Systems verknüpft werden, was diese Methode zu einem vielversprechenden Werkzeug macht, etwas mehr Licht auf die Thematik zu werfen. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse zielen deshalb darauf ab, ein verbessertes Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Salzen und Peptiden in wässriger Lösung zu schaffen. Hierfür wird systematisch der Einfluss verschiedenster physikalischer Umgebungen auf die elektronische Struktur von kleinen Molekülen (Methanol und von Glycin abgeleitete Peptide) mittels Weichröntgenspektroskopie, unterstützt durch Dichtefunktionaltheorie (DFT) Rechnungen, untersucht. In einem ersten Schritt werden isolierte Moleküle ohne jeglicheWechselwirkung zu ihrer unmittelbaren Umgebung anhand von Methanol in der Gasphase als Modelsystem untersucht. Hierbei wird insbesondere der lokale und elementspezifische Charakter von RIXS demonstriert und die lokale elektronische Struktur von Methanols Hydroxyl– und Methylgruppe untersucht. Mithilfe von DFT–Rechnungen werden die beobachteten Emissionslinien in den XES–Spektren der Emission bestimmter Molekülorbitale zugeordnet und deren relative Emissionsintensitäten erläutert. Für eine resonante Anregung der ersten Resonanz an der Sauerstoff–K–Absorptionskante werden starke Isotopeneffekte beobachtet, die durch dynamische Prozesse an der Hydroxylgruppe erklärt werden können. Dies dient als hervorragendes Beispiel für mögliche Auswirkungen, die eine lokale Änderung in der Geometrie oder Symmetrie des Moleküls auf dessen elektronische Struktur haben kann. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wird das untersuchte Probensystem um die Aminosäure Glycin und deren kleinste Peptide Diglycin und Triglycin, vorerst in ihrer kristallinen Form als Festkörper, erweitert. Mithilfe von RIXS–Karten der Stickstoff– und Sauerstoff–K–Absorptionskanten wird erneut, unterstützt durch DFT–Rechnungen, ein umfassendes Bild der elektronischen Struktur der Moleküle gezeichnet. Ähnlich zum Fall von Methanol werden die Emissionsspektren an der Stickstoff–K–Kante stark von dynamischen Prozessen an der protonierten Aminogruppe der Moleküle beeinflusst. Zudem wird gezeigt, dass RIXS gezielt dazu verwendet werden kann, das Stickstoffatom in der Peptidbindung anzuregen und die elektronische Struktur in dessen lokaler Umgebung zu untersuchen. Desweiteren wird ein einfaches Baukastenprinzip für XES–Spektren dazu genutzt, die spektralen Anteile der Emission aus Übergängen an den beiden Stickstoffatomen in Diglycin zu isolieren. In wässriger Lösung kann eine leichte Veränderung der elektronischen Struktur der Moleküle durch die Wechselwirkung mit benachbarten Wassermolekülen, vermutlich an den geladenen funktionellen Gruppen, beobachtet werden. Die Auswirkungen auf die XES–Spektren sind jedoch eher gering. Deutlich größere Veränderungen werden beobachtet, wenn man den Protonierungszustand der Moleküle über den pH–Wert der Lösung manipuliert. Sowohl die Protonierung der Carboxylgruppe für kleine pH–Werte als auch die Deprotonierung der Aminogruppe in basischer Lösung führen zu starken Veränderungen in den RIXS–Karten. In einer umfangreichen Untersuchung der XES–Spektren von Glycin als Funktion des pH–Wertes wird gezeigt, dass sich die Änderungen jedoch nicht nur örtlich begrenzt auf die Umgebung der manipulierten funktionellen Gruppe, sondern auch auf die elektronische Struktur in weiter entfernten Bereichen des Moleküls auswirken. Als Beispiel für Systeme in denen Hofmeister–Effekte beobachtet werden, werden zu guter Letzt gemischte wässrige Lösungen aus Diglycin und verschiedenen Salzen untersucht. Um den Einfluss verschiedener Kationen auf die elektronische Struktur der Diglycin Moleküle zu erfassen wird eine Reihe unterschiedlicher Chloride verwendet, wohingegen eine Reihe von Kaliumsalzen für die Untersuchung verschiedener Anionen herangezogen wird. In beiden Fällen werden ionenspezifische Auswirkungen auf die XES–Spektren von Diglycin beobachtet, die qualitativ der Sortierung innerhalb der Hofmeister–Serie folgen. Die beobachteten Änderungen deuten dabei darauf hin, dass Kationen unterschiedlich stark mit dem Sauerstoff in der Peptidbindung und dessen unmittelbarer Umgebung wechselwirken, wohingegen Anionen eine gesteigerte Affinität zur Aminogruppe von Diglycin aufweisen. N2 - Ion-specific effects occur in a huge variety of aqueous solutions of electrolytes and larger molecules like peptides, altering properties such as viscosity, enzyme activity, protein stability, and salting-in and salting-out behavior of proteins. Typically, these type of effects are rationalized in terms of the Hofmeister series, which originally orders cations and anions according to their ability to enhance or suppress the solubility of proteins in water. This empirical order, however, is still not understood yet. Quite some effort was made to gain a molecular level understanding of this phenomenon, yet no consensus has been found about the underlying mechanisms and the determination and localization of the interaction sites. Resonant inelastic soft x-ray scattering (RIXS) combines x-ray emission (XES) and absorption spectroscopies (XAS), probing the partial local density of states of both occupied and unoccupied electronic states and is thus a promising candidate to shed more light onto the issue. The studies presented in this work are directed towards an improved understanding of the interaction between salts and peptides. In order to address this topic, the impact of different physical environments on the electronic structure of small molecules (i.e., methanol and glycine derived peptides) is investigated systematically using soft x-ray spectroscopic methods, corroborated with density functional theory (DFT) calculations. In a first step, molecules without any interactions to the surrounding are investigated, using gas-phase methanol as a model system. Thereby, the local and element specific character of RIXS is demonstrated and used to separately probe the local electronic structure of methanol’s hydroxyl and methyl group, respectively. The attribution of the observed emission features to distinct molecular orbitals is confirmed by DFT calculations, which also quantitatively explain the different relative intensities of the emission features. For resonant excitation of the O K pre-edge absorption resonance, strong isotope effects are found that are explained by dynamical processes at the hydroxyl group. This serves as an excellent example for possible consequences of a local change in the geometric structure or symmetry of a molecule on its electronic structure. In the following, the sample system is expanded to the amino acid glycine and its smallest derived peptides diglycine and triglycine. As a first step, they are studied in their crystalline form in solid state. Again, a comprehensive picture of the electronic structure is developed by measuring RIXS maps at the oxygen and nitrogen K absorption edge, corroborated by DFT calculations. Similar to the case of methanol, dynamic processes at the protonated amino group of the molecules after exciting the nitrogen atom have a strong influence on the emission spectra. Furthermore, it is shown that RIXS can be used to selectively excite the peptide nitrogen to probe the electronic structure around it. A simple building block approach for XES spectra is applied to separate the contribution of the emission attributed to transitions into core holes at the peptide and the amino nitrogen, respectively. In the aqueous solution, the surrounding water molecules slightly change the electronic structure, probably via interactions with the charged functional groups. The effects on the x-ray emission spectra, however, are rather small. Much bigger changes are observed when manipulating the protonation state of the functional groups by adjusting the pH value of the solution. A protonation of the carboxyl group at low pH values, as well as a deprotonation of the amino group at high pH values lead to striking changes in the shape of the RIXS maps. In a comprehensive study of glycine’s XES spectra at varying pH values, changes in the local electronic structure are not only observed in the immediate surrounding of the manipulated functional groups but also in more distant moieties of the molecule. Finally, the study is extended to mixed aqueous solutions of diglycine and a variety of different salts as examples for systems where Hofmeister effects are observed. To investigate the influence of different cations and anions on the electronic structure of diglycine, two series of chlorine and potassium salts are used. Ion-specific effects are identified for both cases. Some of the changes in the x-ray emission spectra of diglycine in the mixed solutions qualitatively follow the Hofmeister series as a function of the used salt. The observed trends thereby indicate an increased interaction between the electron density around the peptide oxygen with the cations, whereas anions seem to interact with the amino group of the peptide. KW - Methanol KW - Röntgenspektroskopie KW - Peptide KW - XES KW - Glycin Peptide KW - glycine peptides KW - ionenspezifische Effekte KW - ion-specific effects KW - RIXS KW - Hofmeister-Serie KW - Inelastische Röntgenstreuung KW - Hofmeister KW - Gasphase KW - wässrige Lösung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147111 ER -