TY - THES A1 - Devine, Eric T1 - Increased removal of protein bound uremic toxins through reversible modification of the ionic strength during hemodiafiltration T1 - Erhöhte Elimination proteingebundener Urämietoxine durch reversible Modifikation der Ionenstärke während der Hämodiafiltration N2 - A large number of metabolic waste products accumulate in the blood of patients with renal failure. Since these solutes have deleterious effects on the biological functions, they are called uremic toxins and have been classified in three groups: 1) small water soluble solutes (MW < 500 Da), 2) small solutes with known protein binding (MW < 500 Da), and 3) middle molecules (500 Da < MW < 60 kDa). Protein bound uremic toxins are poorly removed by conventional hemodialysis treatments because of their high protein binding and high distribution volume. The prototypical protein bound uremic toxins indoxyl sulfate (IS) and p-cresyl sulfate (pCS) are associated with the progression of chronic kidney disease, cardiovascular outcomes, and mortality of patients on maintenance hemodialysis. Furthermore, these two compounds are bound to albumin, the main plasma protein, via electrostatic and/or Van-der-Waals forces. The aim of the present thesis was to develop a dialysis strategy, based on the reversible modification of the ionic strength in the blood stream by increasing the sodium chloride (NaCl) concentration, in order to enhance the removal of protein bound substances, such as IS and pCS, with the ultimate goal to improve clinical patient outcomes. Enhancing the NaCl concentration ([NaCl]) in both human normal and uremic plasma was efficient to reduce the protein bound fraction of both IS and pCS by reducing their binding affinity to albumin. Increasing the ionic strength was feasible during modified pre-dilution hemodiafiltration (HDF) by increasing the [NaCl] in the substitution fluid. The NaCl excess was adequately removed within the hemodialyzer. This method was effective to increase the removal rate of both protein bound uremic toxins. Its ex vivo hemocompatibility, however, was limited by the osmotic shock induced by the high [NaCl] in the substituate. Therefore, modified pre-dilution HDF was further iterated by introducing a second serial cartridge, named the serial dialyzers (SDial) setup. This setting was validated for feasibility, hemocompatibility, and toxin removal efficiency. A better hemocompatibility at similar efficacy was obtained with the SDial setup compared with the modified pre-dilution HDF. Both methods were finally tested in an animal sheep model of dialysis to verify biocompatibility. Low hemolysis and no activation of both the complement and the coagulation systems were observed when increasing the [NaCl] in blood up to 0.45 and 0.60 M with the modified pre-dilution HDF and the SDial setup, respectively. In conclusion, the two dialysis methods developed to transitory enhance the ionic strength in blood demonstrated adequate biocompatibility and improved the removal of protein bound uremic toxins by decreasing their protein bound fraction. The concepts require follow-on clinical trials to assess their in vivo efficacy and their impact on long-term clinical outcomes. N2 - Eine große Zahl von Stoffwechselprodukten akkumuliert im Blut urämischer Patienten mit Nierenversagen. Da diese Moleküle schädliche Wirkungen auf die biologischen Funktionen haben, werden sie als Urämietoxine bezeichnet. Man teilt sie in drei Gruppen ein: 1) kleine wasserlösliche Substanzen (MG < 500 Da), 2) kleine, proteingebundene Substanzen (MG < 500 Da), 3) Mittelmoleküle (500 Da < MG < 60 kDa). Proteingebundene Urämietoxine werden wegen ihrer starken Proteinbindung und ihres Verteilungsvolumen durch klassische Hämodialyseverfahrens nur schlecht entfernt. Die prototypischen proteingebundenen Urämietoxine Indoxylsulfat (IS) und p-Cresylsulfat (pCS) sind bei chronischen niereninsuffizienten Patienten mit dem Fortschreiten der Niereninsuffizienz, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und der Mortalität verbunden. Außerdem sind diese beiden Toxine an Albumin, dem wichtigsten Plasmaprotein, durch elektrostatische und/oder Van-der-Waals-Kräfte gebunden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Dialyseverfahren basierend auf einer reversiblen Modifikation der Ionenstärke im Blut durch Erhöhung der Natriumchlorid (NaCl)-Konzentration zu entwickeln, um die Entfernung von proteingebundenen Molekülen wie IS und pCS zu erhöhen und dadurch eine Verbesserung des klinischen Verlauf der Patienten zu erreichen. Die Erhöhung der NaCl-Konzentration ([NaCl]) sowohl in normalem als auch in urämischem menschlichem Plasma war geeignet, um den proteingebundenen Anteil von IS und pCS durch Schwächung ihrer Bindungsaffinität zu Albumin zu verringern. Die Erhöhung der Ionenstärke während einer modifizierten Prädilutions-Hämodiafiltration (HDF) konnte durch eine Erhöhung der [NaCl] in der Substitutionslösung umgesetzt werden; dabei wurde der NaCl-Überschuss innerhalb des Dialysators vollständig entfernt. Dieses Verfahren war effektiv, um die Entfernungsrate beider proteingebundenen Urämietoxine zu steigern; seine Ex-vivo-Hämokompatibilität war allerdings aufgrund des osmotischen Schocks infolge der hohen [NaCl] im Substituat begrenzt. Deshalb wurde eine Iteration der modifizierten Prädilutions-HDF durch Einbau eines zweiten, seriellen Dialysators vorgenommen, bezeichnet als serielles Dialysator System (SDial). Diese letzte Methode wurde dann bezüglich der Durchführbarkeit, der Hämokompatibilität und Toxinentfernung validiert. Durch das SDial-System konnte, verglichen mit der modifizierten Prädilutions-HDF, eine bessere Hämokompatibilität bei ähnlicher Wirksamkeit erzielt werden. Beide Methoden, modifizierte Prädilutions-HDF und SDial System, wurden abschließend in ein Tierdialysemodell mit Schafen transferiert, wobei eine zufriedenstellende Biokompatibilität demonstriert werden konnte. Beide, zur vorübergehenden Erhöhung der Ionenstärke im Blut entwickelten Dialyseverfahren zeigten bei zufriedenstellender Biokompatibilität eine verbesserte Entfernung proteingebundener Urämietoxine durch Reduktion ihrer proteingebundenen Fraktion. In einem nächsten Schritt sind klinische Studien erforderlich, die diese Konzepte bezüglich ihrer In-vivo-Wirksamkeit und ihrer langfristigen Wirkung auf den Krankheitsverlauf untersuchen. KW - Hämodiafiltration KW - Ionenstärke KW - Proteinbindung KW - Urämietoxine KW - Hämodialyse KW - Biokompatibilität KW - Ionic strength KW - protein binding KW - uremic toxin KW - hemodialysis KW - biocompatibility KW - Urämie KW - Toxin KW - Ionenstärke KW - Blut Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83583 ER - TY - THES A1 - Bergmann, Tim Jonas T1 - Pathways in uremic cardiomyopathy – the intracellular orchestrator PGC-1α in cell culture and in a mouse model of uremia T1 - Intrazelluläre Vorgänge bei Urämischer Kardiomyopathie – die Rolle von PGC-1α in Zellkultur und im Mausmodell N2 - For the past 20 years, chronic kidney disease (CKD) has remained one of the major causes of death worldwide. Cardiovascular events account for approximately 50% of deaths in CKD patients, underscoring the clinical relevance of the observed cardiac changes. These changes define uremic cardiomyopathy (UCM) and include left-ventricular hypertrophy (LVH), LV dilatation, and LV systolic and diastolic dysfunction. LVH is seen as the primary manifestation of UCM and is caused by a multitude of different systems including in-creased pre- and afterload and the renin-angiotensin system (RAS). More recent studies found that myocardial dysfunction is apparent before changes in the ventricular geome-try, like hypertrophy, occur to the uremic heart. This leads to the conclusion that LVH is not the cause of cardiac dysfunction, but one of the alterations caused by factors related to the uremic state itself. Among these factors that are independent of pressure and vol-ume overload, are cardiotonic steroids as well as the parathyroid hormone and the endo-thelin (ET-1) system. But we suggest a different substance to play an important role in UCM: Urea. Patients in end-stage renal disease (ESRD) display increased oxidative stress and urea has been found to increase levels of oxidative stress, at least in endothelial cells. Therefore, we investigated the effect that elevated urea levels, as seen in patients undergoing dialysis, have on cardiomyocytes. As the oxidative stress in a cell is regulated by mitochondrial processes, we suspected the mitochondrial orchestrator PGC-1α to play an important role. The uremic heart is in a state of elevated oxidative stress. This has been presented by multiple authors before. By conducting immunofluorescent staining for reactive oxygen species (ROS), we tried to replicate their findings and illustrate elevated levels of ROS. As the fluorescence analysis did not bear significant results, we approached oxidative stress from a different angle: Via mass spectrometry, we looked at the amino acids methionine, cysteine and betaine which are highly involved in sustaining the oxidative balance in the cell. Our findings in the media of urea-treated HL-1 cells lead us to the conclusion, that these cardiomyocytes were in a state of low antioxidative resources. Next, to find the intracellular mechanisms that connect uremia to oxidative stress and compromised energetics, we investigated possible downstream effectors of uremia. The urea-treated cardiomyocytes exhibited significant alterations regarding upstream effec-tors of PGC-1α: The protein kinases Akt and Erk were expressed and phosphorylated dif-ferently in a western blot analysis of uremic h9c2 cells and in mice with induced kidney failure. To combine these findings regarding the protein kinases Akt and Erk and oxidative stress, the Erk/p38 pathways seems conclusive (figure 20). This pathway links uremia and oxidative stress to intracellular effectors that have been found to influence the develop-ment of uremic cardiomyopathy. Another life-threatening alteration in uremic cardiomyopathy is a corrupted cardiac func-tion. The myocardium of uremic patients has shown to be more susceptible to ischemic damage and most patients receiving dialysis experience repeated episodes of intradialytic impairments in cardiac function. The urea-treated cardiomyocytes had a significantly higher oxygen consumption rate due to an inefficiently increased metabolism, most likely caused by an increased level of uncoupling. Taken together, the results of this study indicate that urea by itself plays a role in the de-velopment of uremic cardiomyopathy. So-called high-physiologic levels of urea have led to a mitochondrial inefficiency and an increase of oxidative stress in cardiomyocytes. The protein kinases Akt and Erk may work as effectors of urea to induce these changes via the Erk/p38 pathway. It seems very likely that the mitochondrial changes are mediated by the mitochondrial orchestrator PGC-1α. These observations might lead to further studies in-vestigating urea levels in dialysis patients. In the future, these might lead to a change of practice regarding tolerated urea levels in dialysis and help reduce the cardiac mortality of patients with chronic kidney disease. N2 - Chronische Niereninsuffizienz ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Da etwa die Hälfte dieser Todesfälle auf kardiovaskuläre Ursachen zurückzuführen sind, ist ein genaues Verständnis der kardialen Veränderungen entscheidend. Zu diesen zählen links-ventrikuläre Hypertrophie, linksventrikuläre Dilatation sowie systolischer und diastoli-scher Funktionsverlust. Zusammen prägen diese Veränderungen den Begriff der Urämischen Kardiomyopathie (UCM). Verschiedene Systeme spielen bei UCM zusammen, wie beispielsweise eine erhöhte Vor- und Nachlast und das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). Sie führen zur primären Manifestation der UCM: Die linksventrikuläre Hypertrophie (LVH). Allerdings konnten aktuellere Studien zeigen, dass die Funktion des urämischen Myokards bereits abnimmt, noch bevor Veränderungen der Ventrikelstruktur, wie Hypertrophie, messbar sind. Demnach ist LVH nicht einzig die Ursache des kardialen Funktionsverlusts, sondern eine von vielen Veränderungen bei chronischer Niereninsuffi-zienz. Zu den Faktoren, die unabhängig von Blutdruck und Volumensteigerung sind und eine Rolle bei den oben geschilderten Veränderungen spielen, gehören kardiotonische Steroide, das Parathyroidhormon und das Endothelinsystem (ET-1-System). Wir sehen Grund zur Annahme, dass Urea (Harnstoff) ein weiterer dieser Faktoren ist, der zu Verän-derungen des Herzmuskels führt und die Entstehung von UCM begünstigt. Dialysepatien-ten haben ein erhöhtes Level an oxidativem Stress und es wurde gezeigt, dass Urea in Endothelzellen zu erhöhtem oxidativem Stress führt. Deshalb behandelten wir Kardiomyozyten mit sogenannten hochphysiologischen Urea-Konzentrationen und untersuchten diese anschließend. Dabei setzten wir einen Schwerpunkt auf mitochondriale Prozesse, die zu erhöhtem oxidativen Stress führen können. Unser Interesse galt dabei insbesonde-re dem Transkriptionsfaktor PGC-1α, der als Regulator der Mitochondrien und Dirigent des intrazellulären Metabolismus gilt. Um ebenfalls erhöhte Konzentrationen von oxidativem Stress nachzuweisen, experimen-tierten wir mit immunofluoreszenten Färbungen. Hierdurch konnten wir nur einen Trend ohne Signifikanz feststellen. Deshalb näherten wir uns dem Problem aus einer anderen Richtung: mittels Massenspektrometrie. Wir untersuchten die Aminosäuren Methionin, Cystein und Betain, die für die Regulation des oxidativen Gleichgewichts wichtig sind. Im Medium von mit Urea behandelten HL-1 Zellen konnten wir nachweisen, dass die untersuchten Kardiomyozyten signifikant geringere Konzentrationen an antioxidativ wirkenden Aminosäuren hatten. Als nächstes untersuchten wir die intrazellulären Mechanismen zwischen Urämie und oxidativem Stress. In den mit Urea behandelten h9c2 Zellen und im Mausmodell fand sich eine signifikante Konzentrationssteigerung der Proteinkinase B (PKB/Akt) und Proteinkinase Erk. Diese Enzyme beeinflussen auch den Transkriptionsfaktor PGC-1α. Zusammenfüh-ren lassen sich unsere bisherigen Ergebnisse mittels der Erk/p38 Signalskaskade (Abb. 20). Urämie führt darin über Oxidativem Stress zu einer Beeinflussung intrazellulärer Effektoren, die zur Entstehung von Urämischer Kardiomyopathie beitragen. Eine weitere lebensbedrohliche Komplikation von Urämischer Kardiomyopathie ist die Verringerung der Herzfunktion. Bei urämischen Patienten ist das Myokard anfälliger für ischämiebedingten Schaden und bei den meisten Dialysepatienten zeigen sich wiederholt Episoden, in denen die Herzfunktion geschwächt ist. In der Zellkultur konnten wir dazu passende Veränderungen nachweisen. Aufgrund eines ineffizienten Metabolismus verbrauchten die mit Urea behandelten Zellen signifikant mehr Sauerstoff. Ursache dafür ist wahrscheinlich ein vermehrtes Entkoppeln (Uncoupling) der Mitochondrien. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass Urea in der Entwicklung von Urämischer Kardiomyopathie eine wichtige Rolle spielt. Hoch-physiologische Konzentrationen von Urea im Blut führen über die Erk/p38 Signalkaskade und die Proteinkinasen PKB und Erk zu einer ineffizienten Funktion der Mitochondrien und erhöhen den intrazellulären oxidativen Stress. Wir halten es für wahrscheinlich, dass der Transkriptionsfaktor PGC-1α die dazu führenden mitochondrialen Veränderungen reguliert. Diese Erkenntnisse können weitere Studien anregen, die die tolerierte Konzentration von Urea bei Dialysepatienten untersu-chen. Zukünftig kann dies zu einer strengeren Einstellung der Urea-Werte bei Dialysepati-enten führen. Möglicherweise lässt sich dadurch die Mortalität der Patienten mit chroni-scher Niereninsuffizienz senken. KW - Urämie KW - Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor KW - Nierenversagen KW - Chronische Niereninsuffizienz KW - Urämische Kardiomyopathie KW - Uremic cardiomyopathy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287061 ER -