TY - THES A1 - Rudorf, Antje T1 - Rekombinationshäufigkeit in Abhängigkeit vom Entbindungsalter der Mütter für das DMD-Gen (Xp 21.2) T1 - Frequency of recombination for DMD-Gene (Xp 21.2) in dependence on maternal age while childbirth N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Zusammenhang zwischen Alter und Rekombi-nationsrate für den Duchenne-Muskeldystrophie-Genabschnitt auf dem X-Chromosom (Xp21.2) zu ermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurden von über 200 am Humangenetischen Institut der Universität Würzburg untersuchten Familien 110 informative Stammbäume ausgewertet. Bei diesen Familien waren bereits im Rahmen der genetischen Beratung mehrere flankierende und intragene Marker des DMD-Genes bekannt. Um eine Vergleichbarkeit der einzelnen Personen zu erreichen, wurden die Grenzen des zu untersuchenden DNA-Bereiches bei den Markern DYS I,II,III sowie STR 56 gesetzt. Die Frauen wurden anschließend nach dem Entbindungsalter in drei Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 beinhaltet die unter 30-jährigen, Gruppe 2 die 30- bis 35-jährigen und Gruppe 3 die über 35-jährigen Frauen. Rekombinationen fanden sich in Gruppe 1 bei 17 von 129, in Gruppe 2 bei 9 von 40 und in Gruppe 3 bei 2 von 20 Frauen. Aus diesen Ergebnissen läßt sich χ² mit 2,513 bestimmen. Erst ab einem Wert von 5,99 kann man jedoch von einer Signifikanz sprechen. Somit gibt es keinen Zusammenhang zwischen dem Alter der Frauen bei der Entbindung und der Rekombinationsrate. Aufgrund anderer Arbeiten zum Thema Rekombinationsrate bei Autosomen in Abhängigkeit vom Alter wurde eine Abnahme der Rate im höheren Alter erwartet. Dies konnte jedoch bei der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Mögliche Fehlerquellen liegen hierbei in der stark variierenden Gruppengröße, dem Stichprobenumfang und falsch positiver Zuordnung bei der Phasenfestlegung. Außerdem besteht die Möglichkeit eines unterschiedlichen Rekombinatinsverhaltens bei Gonosomen im Vergleich zu Autosomen. Das Ergebnis dieser Arbeit ist trotz fehlender Signifikanz im Hinblick auf die genetische Beratung so zu beurteilen, daß jüngere Frauen (< 30 Jahre) kein erhöhtes Risiko für eine Rekombination tragen als Ältere (> 35 Jahre) und es damit in der Risikoberechnung bezüglich des Alters keine Unterschiede gibt. N2 - The aim of the work at hand is to determine the connection between age and recombination rate for the Duchenne muscle dystrophy-genetic segment on the X-chromosome (Xp21.2). In this clinical trial 110 informative family trees were evaluated out of over 200 families, who were examined at the human-genetic institute of the university of Wuerzburg. In these families several flanking and intragene markers of the DMD gene were already well-known in the context of the genetic consultation. In order to reach a comparability of the individual persons, the limits of the DNA range were placed with the markers DYS I, II, III as well as STR 56. Afterwards the participating women were divided into three groups to the maternal age at delivery. In Group 1 all women under 30 years of age are included, group 2 includes all 30- to 35-year-olds and the third group all women older than 35 years of age. Recombination were found in group 1 within 17 of 129, in group 2 in 9 of 40 and in group 3 in 2 of 20 women. From these results lets itself χ² with 2.513 determine. Nevertheless, only from a value of 5.99 one can speak of a significance. Thus there is no connection between the age of the women and the recombination rate. Due to other works to the subject recombination rate with autosome as a function of age a decrease of the rate was expected at the higher age. Nevertheless, this could not be proved at the present work. Possible sources of error lie, on this occasion, in the very varying group size, the random check circumference and wrongly positive allocation with the phase definition. In addition, the possibility of a different manner of recombination exists with gonosome in comparison to autosome. The result of this work is to be judged in spite of missing significance in view of the genetic consultation so that younger women (<30 years) no raised risk for a Recombination carry as old people (> 35 years) and there are no differences with it in the risk calculation with regard to the age. KW - DMD KW - BMD KW - Rekombination KW - Alter KW - DMD KW - BMD KW - recombination KW - age Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17452 ER - TY - THES A1 - Hoßfeld, Andrea T1 - Mutationsscreening im Ryanodinrezeptor 1 bei Patienten mit maligner Hyperthermie T1 - mutation screening of the ryanodine receptor 1 in patients with malignant hyperthermia N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden aus den Testzentren Würzburg und Wien DNA-Proben von Patienten, die im Laufe einer Anästhesie eine maligne Hyperthermie (MH) entwickelt hatten, und deren Angehörigen auf MH-verursachende Mutationen im Gen für den Ryanodinrezeptor 1 (RYR 1) untersucht. Es wurde dabei eine Hotspotregion des RYR 1 ausgewählt, für die bereits im Vorfeld mehrere Mutationen bekannt waren. Das Screening wurde mit Hilfe der Methode single-stranded conformation polymorphism (SSCP) durchgeführt. Eine dem abweichenden Laufverhalten eventuell zugrunde-liegende Mutation wurde anschließend durch die automatische Sequenzierung identifiziert. Unter 190 Patienten aus 126 Familien konnte in 18 Fällen eine Mutation gefunden werden. Das entspricht einer Detektionsrate von 14,29%. Insgesamt traten 10 verschiedene Mutationen auf, von denen eine (G6377A) vorher noch nicht beschrieben war. Die Mutationshäufigkeiten unterschieden sich zum Teil erheblich innerhalb der beiden untersuchten Populationen und im Vergleich zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Alle Indexpatienten und viele Angehörige hatten sich bereits einem in-vitro-Kontrakturtest (IVCT) zur Diagnostik der MH unterzogen. So konnten die Ergebnisse des IVCT mit denen der genetischen Untersuchung verglichen werden. Es fand sich eine gute Übereinstimmung, die die Zuverlässigkeit des IVCT stützt. Begleitend zur Screeninguntersuchung wurden die Methoden SSCP und automatische Sequenzierung hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit im Screening großer Patientenkollektive bewertet. Bei vergleichbarer Sicherheit ist mit dem SSCP in kürzerer Zeit bei geringerem Kostenaufwand eine größere Anzahl an Patientenproben auswertbar. Der Stellenwert der genetischen Diagnostik bei der MH wurde als ideale Methode zur Identifikation betroffener Familienmitglieder in MH-Familien mit bekannter Mutation bestätigt. N2 - Samples of patients with malignant hyperthermia during general anesthesia from the mh-centers Wien and Würzburg were investigated for mutations in the ryanodine receptor 1. Only hotspot regions were chosen. Screening was performed using the method single stranded conformation polymorphism (SSCP). Mutations were analysed by automatic sequenzing. In 190 patients from 126 families 18 mutations were found. Mutation frequence differed between the two analysed populations and compared to results of other studies. Results of genetic testing were compared to results of IVCT. High sensitivity and specifity of IVCT was confirmed. In addition the methods SSCP and automatic sequenzing were compared with respect to big patient collectives. With the SSCP samples can be analysed more quickly while security is comparably high and cost are lower. Genetic testing is the ideal method for identification of affected members in mh-families with known mutation. KW - maligne Hyperthermie KW - Ryr 1 KW - Mutation KW - Screening KW - malignant hyperthermia KW - ryr 1 KW - mutation KW - screening Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16545 ER - TY - BOOK A1 - Baierlein, Jochen T1 - Gesundheitsstatus und Gesundheitssystem in Deutschland und Ungarn : Ungarn auf dem Weg in die Europäische Union N2 - Es wurden Gesundheitsystem und der Gesundheitsstatus von Ungarn und Deutschland dargestellt. Eine kurze Abhandlung der EU-Osterweiterung sowie abschliessend eine Gegenüberstellung der System. KW - Gesundheitssystem KW - Gesundheitsstatus KW - Ungarn KW - Deutschland KW - EU Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15985 N1 - Aus rechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. ER - TY - THES A1 - Krüger, Miriam T1 - Schätzungen der männlichen und weiblichen Mutationsraten bei Duchennescher Muskeldystrophie T1 - Estimation of the male and female mutation rate in Duchenne muscular dystrophy N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung des Verhältnisses der männlichen und weiblichen Mutationsraten bei der Duchenneschen Muskeldystrophie (DMD), wobei jeweils zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden wird. Bei der Duchenneschen Muskeldystrophie handelt es sich um eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit. Es existiert derzeit keine kausale Therapie, die Patienten versterben meist im 2. Lebensjahrzehnt. Heterozygote Frauen, die in der Regel phänotypisch gesund sind, kommen als Überträgerinnen der Krankheit in Frage. Bislang gibt es keine absolut verlässlichen direkte Heterozygotentests, es können nicht alle Überträgerinnen identifiziert werden. Stattdessen wird bei einer genetischen Beratung das Risiko einer Frau, Überträgerin zu sein, berechnet. Hierbei werden zunächst mit Hilfe des Familienstammbaums sowie weiteren Phänotypinformationen wie dem Creatinkinase-Wert (CK), Informationen erfasst. Für die Berechnung sind dann die Neumutationsrate für DMD im Allgemeinen sowie das Verhältnis der männlichen (Ny) und weiblichen (My) Mutationsraten Grundlage (k = Ny / My). Die möglichst genaue Kenntnis des genannten Quotienten k ist daher wesentlich für die Ermittlung des Heterozygotenrisikos, um eine kompetente genetische Beratung dieser Frauen zu ermöglichen. Es galt ursprünglich die Annahme Ny = My und somit k =1. Aufgrund der durchgeführten Berechnungen konnte gezeigt werden, dass die Mutationsraten in weiblichen Keimzellen (My) und in männlichen Keimzellen (Ny) nicht, wie anfänglich angenommen, gleich groß sind. Es ist also My ungleich Ny, und somit k ungleich 1. Insbesondere muss hierbei zwischen Deletionen und Punktmutationen unterschieden werden. Es lässt sich sagen, dass für Deletionen My > Ny gilt, während für Punktmutationen My < Ny gilt (k = 3,04 also Ny ca 3 My). Die Ergebnisse zeigen, dass ca. 60% der Punktmutationen in der Spermatogenese entstehen, während fast die Gesamtheit der Deletionen in der Oogenese entsteht. Diese Erkenntnis hat für die humangenetische Beratung einer möglichen Konduktorin für die Duchennesche Muskeldystrophie eine große Bedeutung. Aufgrund unserer Berechnungen können wir davon ausgehen, dass bei Deletionen näherungsweise 50% der Fälle tatsächliche Neumutationen sind, während es sich in 50% der Fälle bei den Müttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tatsächlichen Neumutationen deutlich höher als durch theoretische Überlegungen früher angenommen (33%), während die Zahl der Konduktorinnen deutlich niedriger ist als angenommen (66%). Für eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Deletion vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu gebären, signifikant niedriger ist als das geschätzte Risiko unter der Annahme gleicher Mutationsraten in Oogenese und Spermatogenese. Für Punktmutationen können wir davon ausgehen, dass etwa 20% der Fälle tatsächliche Neumutationen sind, während es sich in 80% der Fälle bei den Müttern um Konduktorinnen handelt. Damit ist die die Zahl der tatsächlichen Neumutationen deutlich niedriger, während die Zahl der Konduktorinnen deutlich höher ist als angenommen. Für eine Mutter, die ein Kind mit Duchennescher Muskeldystrophie geboren hat, bei dem eine Punktmutation vorliegt, gilt nun, dass das Risiko, erneut ein krankes Kind zu gebären, deutlich höher ist als zunächst angenommen. N2 - The study shows the results of the estimation of the male and female mutation rates in Duchenne muscular dystrophy, where deletions and point mutations are seen separately. Duchenne muscular dystrophy is a X linked recessive, genetically lethal disorder. There is no causal therapy, most of the patients die before the age of 20. Heterozygote women, who do not show any symptoms are carriers and transmit the disease to their sons. There are no reliable tests for heterozygote women, not all carriers can be identified. Instead you do a calculation of the women’s risk being a carrier in a genetic consultation. Collecting information is done among other with the help of a family tree and the creatin kinase (CK). For the calculation you need the general mutation rate for DMD and the proportion of the male (Ny) and female (My) mutation rate (k = Ny / My). So it is important to know the quotient k exactly to do a correct calculation and to give a competent consultation to these women. Earlier it was assumed that Ny = My and so k =1. With the help of our calculations we could show that the female mutation rate (My) and the male mutation rate (Ny) are not equal. So it is My unequal í and k unequal 1. Besides we have to distinguish deletions and point mutations. It is seen for deletions that My > Ny whereas for point mutations My < Ny (k = 3,04 so í ca 3 Ny). The results show that about 60% of the point mutations arise in spermatogenesis whereas almost all deletions arise in oogenesis. This is of great importance for a genetic consultation of a possible carrier. We could show that in deletions about 50% of all the cases are new mutations whereas in the other 50% the mother is a carrier. So the number of real new mutations is significantly higher an earlier assumed in theory (33%) and the number of carriers significantly lower (66%). For a mother who has born a child with Duchenne muscular dystrophy having a deletion is therefore the risk of having another child suffering from the disease significantly lower than the estimated risk under the assumption of equal mutation rates in oogenesis and spermatogenesis. For point mutations we could show that about 20% of the cases are new mutations whereas in about 80% the mother is a carrier. So the number of real new mutations is significantly lower than assumed, whereas the number of carriers is significantly higher. For a mother who has born a child with Duchenne muscular dystrophy having a point mutation is therefore the risk of having another child suffering from the disease significantly higher than the estimated risk under the assumption of equal mutation rates in oogenesis and spermatogenesis. KW - Duchennesche Muskeldystrophie KW - Mutationsraten KW - Duchenne muscular dystrophy KW - mutationrate Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15833 ER - TY - THES A1 - Ziegler, Susanne T1 - Die altersabhängige Makuladegeneration : Untersuchung zur genetischen Assoziation des Apolipoproteins E und des Alpha-2-Makroglobulins T1 - Analysis of genetic association of apolipoprotein E and alpha-2-macroglobulin with age-related macular degeneration N2 - Die Arbeit dient der Aufklärung genetischer Ursachen der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) – einer komplexen Erkrankung mit bisher unklarer Ätiologie. Ziel der Arbeit war die Untersuchung einer möglichen Assoziation der AMD mit Polymorphismen in den Genen für Apolipoprotein E (ApoE) und Alpha-2-Makroglobulin. Voraussetzung für diese Arbeit waren Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998). Beide Studien belegen die Assoziation eines ApoE-Polymorphismus, dem ApoE-4-Allel, mit der AMD im Sinne eines protektiven Faktors: Bei den untersuchten AMD-Patienten war die Häufigkeit des ApoE-4-Allels signifikant geringer als in den Kontrollgruppen. Diese Assoziation sollte in der vorliegenden Arbeit an einem neuen und größeren Patientenkollektiv untersucht werden. Das ApoE-4-Allel ist ein Risikofaktor für Morbus Alzheimer (Corder et al, 1993). Wie AMD ist die Alzheimer Erkrankung eine neurodegenerative Erkrankung des Alters mit komplexer Ätiologie und Pathogenese. Deshalb wurde folgende Hypothese aufgestellt: Wenn das ApoE-4-Allel sowohl mit Morbus Alzheimer als auch mit der AMD assoziiert ist, sind möglicherweise auch andere, mit Morbus Alzheimer assoziierte Polymorphismen an den pathogenetischen Vorgängen der AMD beteiligt. Ausgehend von dieser Überlegung wurden neben den ApoE-Polymorphismen zwei häufige Polymorphismen eines weiteren Risikofaktors für Alzheimer untersucht: das Alpha-2-Makroglobulin (A2M). Die in den Studien vorbeschriebene, signifikant geringere Häufigkeit des ApoE-4-Allels bei AMD-Patienten konnte am vorliegenden Patientenkollektiv nicht nachvollzogen werden. Die ApoE-4-Allelfrequenz betrug in der Gruppe der AMD-Patienten 9,5% und in der Gruppe der altersgemäßen Kontrollpersonen ebenfalls 9,5% (p=0,998). Ein signifikantes Ergebnis brachte der Vergleich der ApoE-4-Allelhäufigkeit bei AMD-Patienten mit der Häufigkeit in der Gruppe „Normalbevölkerung“, die sich durch ein geringeres Durchschnittsalter auszeichnet (p= 0,001; Altersdurchschnitt 82,3 vs. 39,8 Jahre). Hier liegt aber vermutlich ein „selection bias“ zugrunde. Eine von Schachter et al. (1994) veröffentlichte Studie belegt die generelle Abnahme der Häufigkeit des ApoE-4-Allels in höheren Altersgruppen. Die Untersuchung der beiden A2M-Polymorphismen ergab keinen Hinweis auf eine mögliche Assoziation mit der AMD. Weder die A2M-Allelverteilung (p=0,649) noch die Verteilung der Genotypen (p=0,1) zeigte signifikante Unterschiede. Der Vergleich der Ergebnisse mit den bisher publizierten Studien zur Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD ergibt ein widersprüchliches Bild. Obwohl die Studien von Klaver et al. (1998) und Souied et al. (1998) eine Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD nachweisen, ist die Häufigkeitsverteilung des Allels in vier nachfolgenden Assoziationsstudien (Schmidt et al., 2000; Pang et al., 2000; Simonelli et al., 2001; Schultz et al. 2003) sowie in der vorliegenden Arbeit nicht signifikant. Allerdings belegen auch neuere Studien eindeutig eine Assoziation des Allels mit der AMD (Baird et al., 2004; Zareparsi et al., 2004). Möglicherweise stellt das ApoE-4-Allel einen protektiven Faktor dar, der Effekt ist aber in verschiedenen Populationen unterschiedlich stark ausgeprägt. Für Populationen mit schwächerer Ausprägung sind vermutlich große Studien¬gruppen notwendig, um bei einer Assoziationsstudie signifikante Frequenzunterschiede zu erhalten. Weiterhin könnte die Heterogenität der AMD ein Problem bei Assoziationsstudien darstellen. Denkbar wäre, dass unterschiedliche Formen der AMD auch mit unterschiedlichen genetischen Risikokonstellationen assoziiert sind. Eine mögliche Assoziation mit einem Polymorphismus würde in einem großen Patientenkollektiv, das unterschiedliche Formen der AMD enthält, statistisch nicht auffallen. Erst Untersuchungen an ausgewählten Patientengruppen, die nur einen streng definierten Phänotyp enthalten, würden den Effekt sichtbar machen. Einen Beleg hierfür bietet die Studie von Souied et al. (1998), die sich auf die exsudative Form der AMD beschränkt und eine deutlich signifikante Assoziation dieses Phänotyps mit dem ApoE-4-Allel nachweist. Der Aussagewert der bisher durchgeführten Studien zur Assoziation des ApoE-4-Allels mit der AMD ist noch begrenzt. Dennoch können Assoziationsstudien dazu beitragen, die genetischen Ursachen der AMD zu entschlüsseln und damit die Grundlage für neue Therapieansätze schaffen. Eine erfolgversprechende Strategie für zukünftige Assoziationsstudien ist sicherlich die Untersuchung an zahlenmäßig adäquaten und klinisch klar definierten Patientengruppen sowie einwandfreien, altersgemäßen Kontrollpersonen. N2 - Age-related macular degeneration (AMD) is the most common geriatric eye disorder in developed countries with almost 8 million affected individuals worldwide. AMD is characterized by pathologic changes in the central retina involving the choriocapillaris, Bruchs membrane, the retinal pigment epithelium and the neurosensory retina. Although exogenous as well as genetic factors have been implicated in the etiology of AMD, little is known about the basic mechanisms underlying this neurodegenerative disorder. Both apolipoprotein E (APOE), a major lipoprotein of the central nervous system, and alpha-2-macroglobulin (A2M), a serum protease inhibitor, have been associated with increased risk for several neurodegenerative conditions, in particular Alzheimer disease (AD). In contrast to its role in AD, some studies have associated the APOE4 allele with a decreased risk for AMD (Klaver et al., 1998; Souied et al., 1998). To further assess a possible association between AMD and APOE/A2M we analyzed the allele frequencies of the three alleles (APOE2, APOE3, APOE4) of the APOE gene as well as the two allele insertion/deletion polymorphism in the acceptor splice site of exon 18 of A2M in a sample of 400 AMD patients and 153 age-matched controls and 200 population-based controls. Our results show that the A2M-1/A2M-2 allele frequency in the AMD group is not significantly different from the controls (p=0,649). In addition, the reported association of the APOE4 allele with decreased risk was not confirmed in our study (frequency of APOE4 in patients vs.age-matched controls was 0,09 vs. 0,09; p=0,998). In conclusion, our results do not provide genetic support for a direct or indirect role of APOE or A2M in the development of AMD. KW - AMD KW - altersabhängig KW - Makuladegeneration KW - Assoziation KW - Apolipoprotein KW - age-related KW - macular KW - degeneration KW - association Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15472 ER - TY - THES A1 - Bechtold, Astrid T1 - Funktionelle und molekulare Pränataldiagnostik der Fanconi-Anämie T1 - Prenatal exclusion/confirmation of Fanconi Anemia via flowcytometry N2 - Die Zellzyklusanalyse an kultivierten Fruchtwasserzellen zur pränatalen Diagnostik der Fanconi-Anämie ist nicht hinreichend zuverlässig und sollte aufgrund der teilweisen Verfälschung des Ergebnisses durch tetraploide Zellen und unzureichende Mitogenantwort sowie eventuell einen hohen Anteil nichtstimulierbarer Zellen (sog. noncycling fraction) stets mit einer weiteren Untersuchung an Nabelschnurblutzellen bestätigt werden. Durch eine Kombination von Amnionzelll- und NS-Blut- Untersuchung mit Hilfe der Durchflußzytometrie kann die Diagnose FA dann in der Mehrzahl der Fälle sicher ausgeschlossen oder bestätigt werden. Diese funktionelle Testung ist insbesondere für das Screening von Niedrig-Risiko-Schwangerschaften geeignet, bei denen eine pränatale Diagnostik auf Grund eines auffälligen Ultraschallbefundes bei sonst leerer Familienanamnese durchgeführt wird. Indirekte und direkte Gendiagnostik setzen die Kenntnis des betroffenen Gens bzw. beider krankheitsverursachender Mutationen voraus. Im engen zeitlichen Fenster der pränatalen Diagnostik können diese nicht immer rechtzeitig bestimmt werden. In den Fällen, in welchen sowohl funktionelle als auch Gendiagnostik durchgeführt wurde, konnte das Ergebnis der funktionellen Diagnostik stets bestätigt werden. Die einzige Fehldiagnose unter den hier vorgestellten Familien beruhte auf der Tatsache, dass in diesem Fall das Ergebnis der Zellzyklustestung an kultivierten Fruchtwasserzellen nicht durch eine Untersuchung von Nabelschnurblut kontrolliert wurde. Werden sowohl Amnionzellen als auch Nabelschnurblut untersucht und wird die Untersuchung der Amnionzellen durch eine einfache Sensitivitätsmessung gegenüber MMC ergänzt, so ist die funktionelle pränatale Diagnostik eine verlässliche Methode zur Bestätigung oder zum Ausschluß der Diagnose Fanconi-Anämie. Die größtmögliche Sicherheit der pränatalen Diagnostik wird jedoch mit molekulargenetischen Methoden erreicht. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn Komplementationsgruppenzugehörigkeit und die Art der krankheitsverursachenden Mutationen vor Beginn der Schwangerschaft bekannt sind. N2 - Objective: To explore the potential of flowcytometry in the prenatal exclusion or confirmation of Fanconi anemia (FA). Methods: Indications for prenatal diagnosis were (1) FA-negative family history, but suspicious ultrasound findings such as radial ray aplasia, (2) FA-positive family history, but without knowledge of the affected gene and/or mutation. Amniotic fluid (AF) cell cultures and umbilical cord (UC) blood cultures were assayed for typical cell cycle changes (G2-phase accumulations) without and with Mitomycin C-treatments using single and dual parameter (BrdU-Hoechst) flowcytometry. Results: Single parameter flowcytometry correctly identified 2 positive and 9 negative cases on the basis of MMC-sensitivity of cultivated AF cells. Likewise, 8 negative cases and 2 positive cases were correctly predicted using bivariate flowcytometry of 72 h umbilical cord blood cultures. In contrast, bivariate flowcytometry applied to AF cells grown in the presence of bromodesoxyuridine (BrdU) yielded false positive and false negative results. Conclusions: Single parameter flowcytometry of AF-cell cultures and bivariate flowcytometry of UC-cell cultures have the potential to correctly predict the affected status in cases at risk for FA, whereas bivariate flow cytometry proved unreliable when applied to BrdU-substituted AF-cell cultures. Cases with a low a priori risk (e.g. sonographic finding of radial ray abnormalities and negative family history) would benefit most from flowcytometry as a rapid and economical prenatal screening procedure. KW - Fanconi-Anämie KW - Pränataldiagnostik KW - Durchflusszytometrie KW - Zellzyklus-Analyse KW - Prenatal diagnosis KW - Fanconi anemia KW - flowcytometry KW - cell cycle analysis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14663 ER - TY - THES A1 - Heinrich, Tilman T1 - Validierung der Zellzyklusdiagnostik bei Ataxia telangiectasia T1 - Exclusion/confirmation of Ataxia telangiectasia via cell cycle analysis N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse von Lymphozyten bei Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia beschrieben. Hierzu wurden die Daten von 327 Patienten ausgewertet. In 82 Fällen ergab sich eine Bestätigung der Verdachtsdiagnose, in 225 Fällen konnte das Vorliegen dieser Erkrankung ausgeschlossen werden, bei den übrigen untersuchten Fällen ergab die Zellzyklusanalyse Auffälligkeiten hinsichtlich des Proliferationsverhaltens der untersuchten Zellen und/oder ihrer Strahlensensitivität, die eine eindeutige Zuordnung zu einer der beiden Gruppen (AT-postiv/AT-negativ) zunächst nicht gestatteten. Diese Auffälligkeiten lassen sich teils auf technische Probleme (geronnenes Blut, langer Zeitraum zwischen Blutentnahme und Analyse), teils auf biologische Besonderheiten (bestehende Begleiterkrankungen wie Leukämie, Lymphom) zurückführen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von Lymphozyten ergibt als diagnostisch relevante Parameter den Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) sowie den Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF). Der Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1) ist ein Maß für die Stimulierbarkeit der Lymphozyten. Diese Stimulierbarkeit ist bei Zellen von AT-Patienten häufig vermindert, d.h. das Ausmaß der Mitogenantwort gibt ebenso einen Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung AT wie die Strahlensensitivität der Zellen. Letztere wird durch den zweiten der oben angeführten Parameter (G2/GF) repräsentiert. Der für die Erkrankung AT charakteristische Funktionsverlust des ATM-Proteins, welches im unbeeinträchtigten Zustand für die Kontrolle der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Schädigungen verantwortlich ist, führt typischerweise zu einer Erhöhung des Anteils von Zellen in der G2-Phase, nachdem diese Zellen ionisierender Strahlung ausgesetzt waren. Die zweidimensionale Auftragung dieser Parameter (G0,G1 gegen G2/GF) erlaubt in der Regel bereits eine guten Abgrenzung der Gruppe der AT-positiven gegen die AT-negativen Fälle. Die Berücksichtigung eines weiteren Parameters, nämlich des AFP-Wertes, gestattet darüberhinaus in mehreren Fällen die Zuordnung der oben erwähnten, zunächst unklaren Fälle zu einer dieser Gruppen. Die durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse von bestrahlten Lymphozyten kann daher als Screening-Methode bei der Untersuchung von Patienten mit der Verdachtsdiagnose Ataxia telangiectasia als ein dem CSA überlegenes Verfahren angesehen werden. Die Kombination dreier Parameter: 1) Anteil der nicht-proliferierenden Zellen (G0,G1), 2) Anteil der in der G2-Phase des 1. Zellzyklus verbleibenden Zellen bezogen auf die Wachstumsfraktion (G2/GF) und 3) AFP-Wert erlaubt hierbei im Rahmen der AT-Diagnostik in >93% der Fälle eine eindeutige Zuordnung zur Gruppe der AT-negativen bzw. AT-positiven Fälle. N2 - Ataxia telangiectasia (AT) is an autosomal recessive multisystem disorder with increased radiosensitivity and cancer susceptibility. The responsible gene (ATM) consists of 66 exons and a coding region of 9171 bp which precludes direct sequencing as a screening assay for confirmation or exclusion of the clinical suspicion of AT. Peripheral blood mononuclear cells of 327 patients refered for the exclusion of AT were exposed to ionizing radiation (IR) and incubated for 72 h in the presence of PHA. Using bivariate BrdU-Hoechst/Ethidium bromide flowcytometry, the following cell cycle parameters were ascertained: (1) proportion of non-proliferating (G0,G1) cells as a measure of mitogen response, (2) proportion of first cycle G2-phase cells relative to the growth fraction (G2/GF) as a measure of radiosensitivity. >93% of the cases could be unequivocally assigned either to the AT-negative or the AT-positive group of patients. Combination of cell cycle data with serum AFP concentrations led to the exclusion of AT in nearly all of the uncertain cases. We conclude that cell cycle testing complemented by serum AFP measurements fulfills the criteria as a rapid and economical screening procedure in the differential diagnosis of juvenile ataxias. KW - Ataxia telangiectasia KW - Zellzyklus KW - ATM KW - Durchflusszytometrie KW - Radiosensitivität KW - childhood ataxia KW - ataxia telangiectasia KW - cell cycle KW - flowcytometry KW - radiosensivitity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14654 ER - TY - THES A1 - Schmid, Christian T1 - Klinik und Genetik der myotonen Dystrophie Curschmann-Steinert, der facio-scapulo-humeralen Muskeldystrophie und der Gliedergürtelmuskeldystrophie T1 - clinic and genetic of myotonic dystrophie, facio-scapulo-humeral dystrophie and limb-girdle dystrophie N2 - Im ersten Teil dieser Arbeit wird überprüft, inwieweit bei einer Patientengruppe, die molekulargenetisch negativ auf fazioscapulohumerale Muskeldystrophie untersucht wurde, differentialdiagnostisch eine myotone Dystrophie in Frage kommt. Der zweite Abschnitt hat zum Ziel, zu kontrollieren, ob im Patientenkollektiv derer, die negativ auf eine häufige Mutation im -Sarkoglycangen (Adhalingen) getestet wurden, differentialdiagnostisch eine fazioscapulohumerale Muskeldystrophie in Betracht zu ziehen ist. N2 - In the first part of this work it is examined to what extent at a group of patients, which was examined molecular-genetically negatively for fazioscapulohumerale dystrophie, differential-diagnostically a myotonic dystrophie is applicable. The second section has the goal to check whether in the patient collective of those, which were tested negatively on a frequent mutation in the Sarkoglycangene (Adhalingene), differential-diagnostically a fazioscapulohumerale dystrophie to consider is. KW - Myotone Dystrophie KW - Gliedergürtelmuskeldystrophie KW - facio-scapulo-humeralen Muskeldystrophie KW - FSHD KW - myotonic dystrophie KW - facio-scapulo-humeral dystrophie KW - limb-girdle dystrophie KW - FSHD Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13329 ER - TY - THES A1 - Balzar, Alla T1 - Morbidität und Mortalität sowie Prognose kleiner Frühgeborener < 32 Schwangerschaftswochen 1995 bis 2001 T1 - Morbidity, mortality, and outcome of low birth weight premature infants born before 32 weeks of gestational age between 1995 and 2001 N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden die Krankenblätter 366 kleiner Frühgeborener (Schwangerschaftswochen (SSW) 23/0 bis 32/0), die im Zeitraum von 1995 bis 2001 in der Frauenklinik des Klinikums Süd Nürnberg aus Einlingsschwangerschaften geboren wurden, retrospektiv ausgewertet. 136 Schwangere wurden nach einem vorzeitigen Blasensprung entbunden. 16 Kinder sind innerhalb der Neonatalperiode gestorben. Erfasst wurden zum einen wichtige prä- und peripartale Faktoren, u.a. mütterliches Alter und Risiko,Schwangerschaftsalter, Indikation zur Schwangerschaftsbeendigung und Entbindungsmodus, und zum anderen fetale Outcome-Parameter wie Gewicht, Apgar Score, Nabelarterien-pH-Wert, Base Excess und Intubation. Darüber hinaus wurden für jedes Kind die Morbiditätsdiagnosen und bei gestorbenen Kindern die Todesursachen aufgenommen. In 37 % der Fälle lag der Frühgeburt ein vorzeitiger Blasensprung zugrunde, in 31 % eine vorzeitige Wehentätigkeit. Die übrigen 32 % wurden durch maternofetale Pathologie hervorgerufen. Das Gewicht der Frühgeborenen lag zu 75 % unter 1500 g. In einer schweren Azidose befanden sich 6 % der Kinder. Eine starke Abhängigkeit der Outcome-Parameter von Poleinstellung und Entbindungsmodus war nicht zu beobachten. Frühgeborene nach fetaler Entbindungsindikation wiesen ein schlechteres Outcome auf als nach maternaler Indikation. Von den beobachteten Krankheiten kam das Atemnotsyndrom am häufigsten vor (in 63 % der Fälle), bei 20 % der Kinder III.-IV. Grades. Hochgradige Retinopathie (Grade III-IV) wurde in 5,4 %, retrolentale Fibroplasie in 0,6 % der Fälle diagnostiziert. Ein Drittel der Kinder erkrankten an einer Sepsis. Bei 18 % entwickelte sich im Verlauf eine bronchopulmonale Dysplasie. Schwere Hirnblutungen (III.-IV. Grades) erlitten 4,5 % der Frühgeborenen, periventrikuläre Leukomalazie 3,6 % und nekrotisierende Enterokolitis 1,5 %. Die genannten Krankheiten traten mit zunehmendem Schwangerschaftsalter weniger häufig auf. Die Prognose verbesserte sich besonders stark in den SSW 28-30. 6 von 16 Todesfällen (38 %) entfielen auf die ersten 24 Lebensstunden. Die Todesursachen waren Unreife/Mangelgeburt (31 %), Sepsis (31 %), Fehlbildungen und intrauterine Asphyxie (jeweils 13 %). Die neonatale Mortalitätsrate nahm mit zunehmendem Geburtsgewicht deutlich ab: Von 33 % für Frühgeborene unter 500 g, auf 3 % ab 1000 g. Die mittlere Latenzperiode nach einem vorzeitigen Blasensprung betrug 9,1 Tage (in 90 % der Fälle bis zu 3 Wochen, Maximum: 10 Wochen). Kinder beider betrachteter Gruppen von 23-28 und 29-32 SSW profitierten vom angewendeten konservativen Management: Bezüglich der Lungenreife war eine klare Verbesserung zu beobachten, falls die RDS-Prophylaxe 48 Stunden vor der Geburt abgeschlossen war. Sepsis kam zwar in der Gruppe mit niedrigerem Gestationsalter häufiger vor, war jedoch nicht direkt abhängig von der Latenzperiode. Im Vergleich mit anderen aktuellen Studien lagen die in dieser Arbeit festgestellten Morbiditätsraten etwa gleichauf. Die Kinder des eigenen Kollektivs entwickelten aber seltener intraventrikuläre Hämorrhagie und periventrikuläre Leukomalazie. Die starke Abnahme von Morbidität und Mortalität mit zunehmendem Schwangerschaftsalter wird in den Vergleichsstudien ähnlich berichtet. Eine nicht vernachlässigbare Überlebenschance kann bereits ab 23 SSW gegeben sein (4 von 6 dieser Kinder überlebten die Neonatalperiode). Die Chancen auf ein gesundes Überleben jedoch steigen besonders in den SSW 28-30. Daher ist in den sehr frühen SSW die Prolongation der Schwangerschaft zu empfehlen. N2 - 1 Introduction 2 Patients and Methods 2.1 Collected Data 2.1.1 Mother 2.1.2 Child 2.2 Definitions 3 Results 3.1 Prenatal Factors 3.1.1 Maternal Age 3.1.2 Parity 3.1.3 Gestational Age 3.1.4 Maternal Risk 3.1.5 Fetal presentation 3.1.6 RDS Prophylaxis 3.1.7 Indications for delivery 3.1.8 Infection 3.1.9 Priming 3.2 Perinatal Factors 3.2.1 Mode of delivery 3.3 Outcome 3.3.1 Sex 3.3.2 Weight 3.3.3 Apgar Score 3.3.4 Cord pH Value 3.3.5 Base Excess 3.3.6 Lactate Value 3.3.7 Intubation 3.3.8 Influence of the Mode of Delivery on the Fetal Outcome 3.3.9 Influence of the Indication for Delivery on the Fetal Outcome 4 Discussion 4.1 Birth Factors and Outcome 4.1.1 Maternal Age 4.1.2 Influence of the Mode of Delivery 4.2 Morbidity 4.3 Delay of Delivery After Preterm Prelabor Rupture of the Membranes 4.3.1 Latency Period and Infantile Rate of Survival 4.3.2 Neonatal Sepsis 4.4 Survival of Very Low Birth Weight Infants 4.5 Mortality 5 Summary A Nomenclature Bibliography KW - Frühgeburt KW - Morbidität KW - Mortalität KW - früher vorzeitiger Blasensprung KW - preterm labor KW - morbidity KW - mortality KW - preterm prelabor rupture of the membranes Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13205 ER - TY - THES A1 - Endres, Karlheinz T1 - Zellzykluseffekte von Mitomycin C T1 - cellcycle effects of mitomycin C N2 - ZELLZYKLUSEFFEKTE VON MITOMYCIN C Im Rahmen dieser Arbeit sollten die durch Mitomycin C (MMC) exogen induzierten Zellzyklusstörungen mit den endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fanconi-Anämie in unterschiedlichen Zellsystemen (periphere Blutlymphozyten, lymphoblastoide Zellen und Fibroblasten) verglichen werden. Die Zellzyklusanalysen wurden mit der zweidimensionalen Durchflusszytometrie nach dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren durchgeführt. Mit diesem Verfahren ist es möglich zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen (Ellwart, Stunkel et al. 1981) zu unterscheiden und Verteilungen der Zellen in bis zu vier Zellzyklusphasen mit quantitativer Analyse der Populationen während der G0-G1-, G1-, S- und G2-Phasen zu erfassen (Kubbies 1989). Das Ausscheiden von Zellen aus dem Zellzyklus kann dabei über die Akkumulation in den entsprechenden Phasenanteilen des Zellzyklus erfasst werden. Die Induktion von Zellzyklusstörungen erfolgte mit dem bifunktionellen Alkylanz Mitomycin C. Die Applikation von Mitomycin C (MMC) führte dabei vor allem zu einer dosisabhängigen Zunahme der G2-Phasenanteile der Zellzyklen, was als Akkumulation von Zellen innerhalb dieses Kompartiments zu verstehen ist. Diese Akkumulation konnte bei den durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen mit der abgeleiteten Größe Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) proliferationsunabhängig erfasst werden. Die konzentrationsabhängige Zunahme der G2-Phasenakkumulation und die unterschiedliche Verteilung innerhalb der Zellzyklen wurden mit den beiden Parametern Increased S G2+G2`/GF und Increased S G2/GF festgehalten und ausgewertet. Die Untersuchungen mit peripheren Blutlymphozyten, lymphoblastoiden Zellen (B-LCL) und Fibroblasten von gesunden Kontrollpersonen zeigten, dass sich die durch Mitomycin C induzierten DNA-Schädigungen bei durchflußzytometrischen Zellzyklusanalysen vor allem als G2-Phasenakkumulation darstellen. Demgegenüber lagen die ermittelten Werte der S G2/GF von Fa-Individuen bereits bei Standardzellkulturen über denen der gesunden Versuchspersonen. Vor allem bei den Zellzyklusstudien mit peripheren Blutlymphozyten von Fanconi-Anämie Patienten zeigten sich bereits endogen eine massive Erhöhung der G2-Phasenanteile. Im Vergleich zu den untersuchten Kontrollen war die Mitomycin C induzierte Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen nicht beliebig steigerbar. Die untersuchten Zellsysteme zeigten verschiedene Proliferationsmuster und reagierten mit einer unterschiedlich starken Arretierung von Zellen in den G2-Phasen bei Zugabe von Mitomycin C. Als sensitivste Zellart reagierten subkutane menschliche Fibroblasten bei Applikation von Mitomycin C. Bei den durchgeführten Zellzyklusanalysen zeigte sich aber auch, dass bei hohen Konzentration von Mitomycin C (MMC) die zytoxischen Effekte von Mitomycin C überwiegen und es zu einem starken Rückgang des Zellwachstums kommt. Da die exogen induzierten Zellzyklusstörungen durch Mitomycin C bei gesunden Kontrollpersonen mit den typischen endogenen Störungen des Zellzyklus bei Fa-Individuen vergleichbar waren, kann als mögliche Ursache für Fanconi-Anämie auf einen DNA-Reparaturdefekt geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auch Zellen von obligat heterozygoten Fa-Individuen mit dem BrdU/Hoechst 33258-Ethidiumbromid Verfahren untersucht. War bei Fa-homozygoten Patienten bereits endogen die Akkumulation von Zellen in den G2-Phasen deutlich gegenüber den gesunden Kontrollpersonen erhöht, so konnte dies für Fa-heterozygote Individuen nicht gezeigt werden. Die ermittelten Werte der Summe der G2-Phasen / Wachstumsfraktion (S G2/GF) lagen zwar dabei vor allem bei den untersuchten peripheren Blutlymphozyten und subkutanen Fibroblasten etwas über den Kontrollen. Mit den hier vorgelegten Daten aus den Zellzyklusanalysen war aber keine Unterscheidung zwischen den obligat heterozygoten Fa-Individuen und den gesunden Probanden möglich. Die Ergebnisse stehen dennoch im Einklang mit den zytogenetischen Untersuchungen auf erhöhte Chromosomenbruchraten bei Verdacht auf Fanconi-Anämie. N2 - CELL CYCLE EFFECT`S OF MITOMYCIN C With this work the exogen induced effects of mitomycin C were compared in different cell systems (human blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and dermal fibroblasts) with the endogen existing cell cycle defects in Fanconi Anaemia. The cell cycle analysis were done via the BrdU/Hoechst flow cytometry. With this technique it is possible to detect and quantitate proliferating and non-proliferating fractions in the cell cycle (Ellwart, Stunkel et al. 1981). The method also allows to get information about the population of cells within the G0-G1-, G1-, S- and G2- phase (Kubbies 1989). The separation of cells during the cell cycle can be measured as an accumulation in the correspondent fraction. The induction of cell cycle arrest were done with the alkylating agent mitomycin C. After the application of mitomycin C cell cycle analysis showed an increase of the G2- phase, depending on the concentration of this agent. With the parameters sum of G2 / growth fraction (S G2/GF) and Increased S G2+G2`/GF and Increased S G2/GF the effects of mitomycin C were characterised. The cell cycle analysis with human blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and dermal fibroblasts from healthy persons showed, that the damage induced by mitomycin C is like an accumulation of cells in the G2- phase. Already the studies with cells from Fanconi Anaemia patients without treatment of mitomycin C showed elevated values for the sum of G2 / growth fraction (S G2/GF). Over all the arrest of cells in the G2- phase were mainly seen with cell cultures from human blood lymphocytes. In relation to healthy persons the mitomycin C induced accumulation of cells in the G2- phase couldn’t intensify as will by a higher concentration of the alkylating agent. The cell cycle analysis with blood lymphocytes, lymphoblastoid cells and fibroblasts showed different cellular proliferation and arrest in the G2- phase under the treatment of mitomycin C. As the most sensitive react dermal fibroblasts under the treatment with mitomycin C. Also the result of the cell cycle analysis demonstrate that at high levels of mitomycin C the cytotoxic effects predominate and the cell proliferation decrease. In the respect that the exogen induced effects by mitomycin C can compared with the endogen cell cycle defects in Fanconi Anaemia it is possible that a deficient DNA repair caused Fanconi Anaemia. Furthermore with this work cells from FA- heterozygotes were analysed. The data of the cell cycle analysis showed that it is not possible to decide between a healthy persons and a FA- heterozygotes. But the results correspondent with the cytogenetic analysis of higher chromosomal breakage level in Fanconi Anaemia. KW - Zellzykluseffekte KW - Mitomycin C KW - Zellzyklus KW - G2 Phase KW - Fanconi Anämie KW - cellcycle effects KW - mitomycin c KW - cellcycle KW - g2 phase KW - Fanconi Anaemia Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12647 ER - TY - THES A1 - Fach, Cornelia T1 - Selektive Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung eines hypermutablen Bereiches des Fanconi-Anämie-A (FANCA)-Gens aus Fibroblasten-Kulturen unterschiedlicher Passagen und Genotypen T1 - Selective amplification, cloning and sequencing of a hypermutable region of the Fanconi anemia A (FANCA) gene from fibroblast cultures of different passages and types of genes N2 - Fanconi-Anämie gehört zu den Chromosomenbruch-Syndromen und zeichnet sich durch eine genomische Instabilität aus. Die genomische Instabilität ist auch Ursache häufiger Rückmutationen. Solche kommen vermehrt in Genabschnitten hoher Sequenzvariabilität vor. Insbesondere gilt dies für das Exon 10 des FANCA-Gens. Dieser Abschnitt des Gens wurde herausgesucht, da dieser als hypermutabler Bereich in der Literatur beschrieben ist. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit Sequenzen des Exon 10 somatische Instabilität aufweisen. Hierzu wurden Fibroblasten eines Patienten und entsprechende Kontrollen in der Zellkultur seriell passagiert und gealtert. Im Zuge der Zellalterung konnte gezeigt werden, dass sich die Wachstumsrate verringerte. Die Zellen, die mit MMC behandelt wurden, stellten das Wachstum nach 1-2 Zellpassagen ein. Der Sequenzabschnitt aus FANCA wurde aus isolierter DNA der Zellen amplifiziert und im PCR-TOPO TA kloniert. Die erhaltenen Klone wurden sequenziert. Die Sequenzanalysen ergaben als häufigste Basensubstitution einen T nach C Austausch oder revers komplementär einen Austausch von A nach G. Dies wird als Artefakt interpretiert. Vermutliche Ursache ist die relativ hohe Fehlerrate der Taq-Polymerase. Für die Amplifizierung des Genomabschnittes aus dem FANCA-Gen sollte eine Polymerase verwendet werden, die eine höhere Genauigkeit als die Taq-Polymerase aufweist, wie z. B. die Pfu-Polymerase. N2 - Fanconi anemia belongs to the chromosome breakage syndromes and is characterised by a spontaneous chromosomal instability. This instability is also a cause of frequent back mutations. Such are increased in gene sections of high sequence variability. In particular this applies to the Exon 10 of the FANCA gene. This section of the gene was picked out, because this is described as hypermutable range in the literature. In this work it should be investigated if sequences of the Exon 10 show somatic instability. For this fibroblasts of a patient and appropriate controls in the cell culture were serially divided and aged. Because of the cell aging it could be shown that the growth rate was reduced. The cells, which were treated with MMC, stopped growth after 1-2 cell passages. The segment of the FANCA sequence was amplified from isolated DNA of the cells and cloned in the PCR TOPO TA. The received clones were made sequences. The sequence analyses resulted as the most frequent substitution a T to C exchange or revers complementary an exchange from A to G. This is interpreted as artifact. A supposed cause is the relatively high error rate of the Taq polymerase. For the amplification of the segment of the FANCA gene a polymerase should be used, which has a higher accuracy than the Taq polymerase, e.g. the Pfu polymerase. KW - Fanconi Anämie A KW - Zellkultur KW - PCR KW - Mutation KW - Hypermutabilität KW - Fanconi anemia A KW - cell culture KW - PCR KW - mutation KW - hypermutable Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10464 ER - TY - THES A1 - Göbel, Almut T1 - Jugendliche und Erwachsene mit Cornelia-de-Lange-Syndrom : Darstellung der Mannigfaltigkeit des klinischen Erscheinungsbildes anhand der Beschreibung von 17 Probanden T1 - Cornelia-de-Lange-syndrome in juvenile and adult patients N2 - Das Cornelia-de-Lange-Syndrom (CdLS) ist ein angeborenes Fehlbildungs- und Retardierungssyndrom, dessen Diagnose ausschließlich klinisch gestellt wird, wobei die charakteristischen Gesichtszüge, Fehlbildungen der oberen Extremitäten, Minderwuchs und geistige Behinderung wichtige Kriterien sind. Seit den Erstbeschreibungen wurden viele Arbeiten über dieses Syndrom veröffentlicht, die sich jedoch meist auf Erfahrungen mit Kindern beschränken. Ziel dieser Arbeit ist es, jugendliche und erwachsene Patienten mit CdLS zu beschreiben, um durch einen Einblick in ihre Biographie die Kenntnisse über diese Erkrankung zu stabilisieren und betroffenen Familien die Mannigfaltigkeit des Syndroms zu veranschaulichen. In einem weiteren Abschnitt werden Fälle aus der Literatur vorgestellt, in denen die Problematik der Schwangerschaft von Patientinnen mit CdLS und die Vererbbarkeit der Erkrankung besondere Beachtung findet. Die Adressen der Probanden stellte der Arbeitskreis „Cornelia de Lange-Syndrom e.V.“ zur Verfügung. Dieser Verein ist eine Initiative betroffener Familien, die deutschlandweit tätig ist und derzeit über 80 Patienten mit der Diagnose CdLS erfaßt hat. Anhand der Angaben aus Fragebögen und telefonischen Gesprächen mit den Eltern werden 17 Probanden beschrieben. N2 - CdLS is a well-known retardation syndrome, whose cause is still unknown. It consists of a characteristic face, upper limb defects, growth deficiency and mental handicap in a wide variabilty. After the reports of Brachmann 1916 and de Lange 1933 many patients with this syndrome were described, but mainly children. This study presents 17 juvenile and adult patients with CdLS to show their clinical phenotype and development in the adulthood and to illustrate the variety of the syndrome. A review of the literature shows the possibility of affected people to reproduce. The parents of all investigated patients are members in the German CdLS Foundation, which is an organisation to support involved families. Data were collected by questionaires and personal conversations with the parents. KW - Cornelia-de-Lange-Syndrom KW - Brachmann-de-Lange-Syndrom KW - Jugendliche und erwachsene Probanden KW - Cornelia-de-Lange-syndrome KW - Brachmann-de-Lange-syndrome KW - juvenile and adult patients Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10350 ER - TY - THES A1 - Stimmler, Patrick T1 - Zytogenetischer und durchflusszytometrischer Nachweis von Mosaizismus bei Fanconi Anämie T1 - xxx N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechs FA-Patienten und eine Patientin, bei der eine Fanconi Anämie ausgeschlossen wurde, auf das Vorhandensein eines Mosaizismus untersucht. Dabei wurde bei allen Patienten eine zytogenetische Chromosomenbruchanalyse durchgeführt und die Ergebnisse mit den Daten der durchflusszytometrischen Zellzyklusanalyse verglichen. Bei einer FA-Patientin konnte weder in der Chromosomenbruchanalyse noch in der Zellzyklusanalyse das Vorhandensein eines Mosaizismus nachgewiesen werden. Bei drei FA-Patienten gab es in der Auswertung der Metaphasen auf Chromosomenbrüchigkeit den Hinweis auf das Vorliegen einer Mosaik-Konstellation, wobei dies in einem Fall (Proband 5) besonders ausgeprägt war. Die Zellzyklusanalyse konnte das Vorhandensein eines Mosaizismus jedoch in allen drei Fällen nicht bestätigen. Bei einer FAPatientin zeigten sich die Chromosomen in der Chromosomenbruchanalyse nahezu unauffällig. Die erfolgreiche und komplette Selbstkorrektur spiegelte sich auch eindeutig in der Zellzyklusanalyse wider. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die zytogenetische Chromosomenbruchanalyse zum Nachweis eines Mosaizismus besser geeignet ist als die Zellzyklusanalyse, da sie eine höhere Sensitivität zu haben scheint. Um eine definitive Aussage sowohl über die Sensitivität, als auch die Spezifität beider Untersuchungen machen zu können, ist es nötig FAPatienten im Verlauf mehrmals zu untersuchen. Dabei müsste sowohl eine Chromosomenbruchanalyse als auch eine Durchflusszytometrie durchgeführt werden und die Ergebnisse dann mit dem klinischen Befinden bzw. den Blutwerten (Hämatokrit/Hämoglobinwert, Leukozyten-und Thrombozytenzahl) verglichen werden. Da das Vorhandensein eines Mosaizismus Konsequenzen für die Diagnose und eventuell Therapiefestlegung hat, erscheinen weitere Untersuchungen diesbezüglich sinnvoll. KW - Fanconi Anämie KW - Mosaizismus KW - Durchflusszytometrie KW - Chromosomenbruchanalyse KW - Zellzyklusanalyse KW - fanconi anemia KW - mosaicism KW - flow KW - cytometrie KW - chromosome KW - breakage KW - cell cycle studies Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8927 ER - TY - THES A1 - Kocot, Arkadius T1 - Molekulare Ursachen des hereditären Angioödems T1 - Molecular genetics of hereditary angioedema N2 - Mutationen im C1-Inhibitor(C1-INH)-Gen manifestieren sich in Form autosomal dominant vererbter Angioödeme (hereditäres Angioödem (HAE)), wobei zwei Typen unterschieden werden. Während der HAE-Typ I mit einer Häufigkeit von 85% auftritt und durch erniedrigte C1-INH-Plasmaspiegel mit daraus resultierender niedriger Aktivität gekennzeichnet ist, liegt beim HAE-Typ II ein in seiner inhibitorischen Funktion eingeschränktes neben dem intakten Protein vor. Beide Typen unterscheiden sich nicht hinsichtlich ihrer klinischen Symptomatik und können zur Ausbildung eines lebensbedrohlichen Larynxödems führen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die molekulargenetischen Ursachen des hereditären Angioödems untersucht. Mit Hilfe der DGGE als Screeningverfahren zur Mutationssuche im C1-Inhibitor-Gen wurde eine effiziente Methode etabliert, die eine Detektion von Punktmutationen, kleinen Deletionen und Insertionen ermöglichte. In deren Anschluss konnte durch Sequenzierung eine genaue Charakterisierung der Mutationen erfolgen. Im untersuchten Patientenkollektiv wurden 23 Mutationen bei Patienten mit HAE-Typ I identifiziert, von denen 19 bisher nicht bekannt waren. Dabei handelt es sich um 9 Missense- und 2 Nonsense-Mutationen, 5 kleine Deletionen (1-3 bp) sowie 3 Spleissmutationen, aus denen z. T. mit hoher Wahrscheinlichkeit ihre Bedeutung für die Ausbildung eines HAE erklärbar ist, wobei die Beurteilung der Kausalität der identifizierten Mutationen sich nach dem Mutationstyp und der Mutationslokalisation im Gen richtet. Erst durch die Charakterisierung des zugrundeliegenden Gendefekts wird eine Sicherung der Diagnose HAE und der Ausschluss anderer Differentialdiagnosen ermöglicht und führt damit zu einer Steigerung der Behandlungssicherheit betroffener Patienten. N2 - Mutations in the C1 esterase inhibitor (C1-INH) gene cause the autosomal dominant disorder hereditary angioedema (HAE). HAE type I (85% of kindreds) is characterized by diminished levels of functional and antigenic C1-INH, while patients with HAE type II synthetize a dysfunctional C1-INH protein having normal or raised antigenic levels. A severe complication of HAE is complete airway obstruction, caused by laryngeal edema. The presented thesis shows nineteen previously unknown mutations in the C1-INH gene causing HAE. Using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) followed by direct sequencing nine missense, two nonsense, three splicing mutations and five small deletions (1-3 bp) have been identified in the screened families. KW - Hereditäres Angioödem KW - HAE KW - C1-Inhibitor KW - C1-INH KW - hereditary angioedema KW - HAE KW - C1-inhibitor KW - C1-INH Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9227 ER - TY - THES A1 - Wuttke, Bettina T1 - Einfluß von Alter und Genotyp auf die Zellzyklusverteilung mononukleärer Zellen des peripheren Blutes nach Kurzzeitkultur und bivariater Durchflußzytometrie T1 - Influence of age and genotype on peripheral blood lymphocyte cultures using two-parameter flow cytometry N2 - Anhand konsekutiver Zellzyklen wird das Proliferationsmuster PHA-stimulierter Lymphozyten bei Fanconi Anämie (FA), Ataxia teleangiectasia (AT), AT-verwandter Syndrome und Aplastischer Anämie untersucht und die Zellzyklusdaten als Funktion von Probandenalter und klinischer Diagnose dargestellt. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass die Alterseinflüsse auf die Zellkinetik sehr viel geringer sind als die Einflüsse von Genotyp und Krankheitstyp. Die Methode der mehrparametrigen Duchflußzytometrie konnte in der Differentialdiagnostik der aplastischen Anämien des Kindesalters sowie in der Erfassung der Genotypen mit erhöhter Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung validiert werden. N2 - Peripheral blood mononuclear cells from patients with known fanconi anemia (FA), ataxia teleangiectasia (AT), AT-related syndromes and aplastic anemia were investigated. Mitogen response and cell cycle progression were assessed by BrdU-Hoechst flow cytometry. The results show, that this method used to detect such induced and spontaneous cell cycle changes is a highly sensitive technique for the assessment of genetic cell damage. KW - bivariate Durchflußzytometrie KW - Chromosomenbruchsyndrome KW - two-parameter flow cytometry KW - chromosomal breakage Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9177 ER - TY - THES A1 - Rost, Michael T1 - Genetisch bedingte und genetisch mitbedingte Erkrankungen im Krankengut einer Allgemeinarztpraxis T1 - Genetic diseases in the clinic of a general practitioner N2 - Statistische Erfassung von genetisch bedingten und genetisch mitbedingten Erkrankungen einer Allgemeinarztpraxis. Es soll verdeutlicht werden, dass die Allgemeinmedizin und die Humangenetik im Rahmen der drastischen genetischen Entwicklung der Forschung enger zusammenarbeiten und die Lehre in der Ausbildung der Allgemeinmediziner intensivierte werden sollte. N2 - A statistic of genetic diseases in the clinic of a general practitioner. General medicine and human genetic should strengthen their cooperation and the teaching of the general practitioners should be intensified in genetic things. KW - Allgemeinmedizin KW - Genetik KW - Primary care KW - genetics Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8906 ER - TY - THES A1 - Pokall, Jörg Fabian T1 - Somatische Gentherapie monogener Erbkrankheiten - Einfache Lösungen für einfache Defekte? T1 - Somatic gene therapy for monogeneic disorders - Simple solutions for simple defects ? N2 - Die Jahrtausendwende bildete den Rahmen einer lebhaften Zeit in der Gentherapie. Öffentlichkeitswirksame Berichte von bahnbrechenden Erfolgen schienen die Mühen jahrzehntelanger Grundlagenforschung endlich zu den prognostizierten Ergebnissen geführt zu haben, wenn auch vorerst nur in recht kleinen Nischen des Feldes. Begleitet von geschärfter öffentlicher Aufmerksamkeit, vor allem nach einem Todesfall im Rahmen einer gentherapeutischen Studie, schuf die Publikation des ersten therapeutischen Erfolges bei der „Severe Combined Immuno Deficiency“ (SCID) im Millenniumsjahr eine willkommene Atempause für die somatische Gentherapie. Da bei monogenen Defekten im Gegensatz zu polygenen bzw. multifaktoriell bedingten Leiden die Reparatur des jeweiligen Genlokus theoretisch zu einer vollständigen Korrektur führt, waren erste gentherapeutische Fortschritte vor allem in diesem Feld prognostiziert worden. Allerdings stellten sich diese Überlegungen sehr bald als ein in der täglichen Praxis der Laborarbeit mit immer neuen Hindernissen behaftetes Unternehmen heraus, so dass entgegen vorschnell geäußerter Ankündigungen die erwarteten Lösungen meist nur in Ansätzen zu Stande kamen. Ziel dieser Arbeit ist es, anhand ausgewählter monogener Erbkrankheiten den derzeitigen Stand der somatischen Gentherapie einer eingehenden Analyse zu unterziehen. N2 - The millenium set the stage for a vivid time in gene therapy. After decades of basic scientific work the often prematurely proclaimed breakthrough in this form of therapy finally seemed at hands, if only in a small niche of the field. After the death of one of the patients enrolled in a clinical gene therapy trial, the publication of the first clinical therapeutic success was met with sharpened public scrutiny. However, the successful replacement of the genetic defect in "severe combined immuno deficiency" led to some relaxation amongst researchers. As opposed to polygeneic disorders the simple correction of the single genetic defect in monogeneic disorders in theory should lead to a cure. Nevertheless over the years gene therapy was facing setbacks that in practice led to a rather reserved wording of positive results. Focusing on a choice of monogeneic disorders this work will analyse the current state of somatic gene therapy. KW - Gentherapie KW - Monogen KW - Erbkrankheiten KW - Vektoren KW - gene therapy KW - monogeneic KW - inherited disorders KW - vectors Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7994 ER - TY - THES A1 - Schulz, Heidi T1 - Towards a comprehensive description of the human retinal transcriptome: identification and characterization of differentially expressed genes T1 - Identifizierung und Charakterisierung von differenziell exprimierten Genen - ein Beitrag zur umfassenden Beschreibung des Transkriptoms der menschilchen Netzhaut N2 - The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3’-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases. N2 - Die menschliche Retina ist ein mehrschichtiges neuroektodermales Gewebe, das auf die Umwandlung von Lichtenergie in elektrische Impulse spezialisiert ist. Diese Impulse werden zum Gehirn weitergeleitet, wo sie als Bilder gesehen werden. Da die Retina experimentell leicht zugänglich ist und funktionelle Aspekte direkt untersucht werden können, nehmen Experimente an diesem Gewebe in der neurologischen Forschung seit mehr als einem Jahrhundert einen Spitzenplatz ein. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Funktionen der Retina durch eine enorme Differenzierung in mehr als 55 Zelltypen, die koordiniert miteinander in Kontakt treten, ermöglicht wird. Die hohe strukturelle und funktionelle Komplexität der Retina wiederum ist das Resultat ihres Transkriptoms und ihres Proteoms. Die Komplexität der Retina erschwert es, die Zahl aktiv transkribierter Gene in diesem Gewebe zu schätzen. Durch die vielfältigen Bemühungen, Gene zu identifizieren, die mit retinalen Erkrankungen in Zusammenhang stehen, konnten bisher 139 Genloci mit retinalen Krankheiten in Verbindung gebracht werden und in 90 Fällen wurden die jeweiligen Gene bereits kloniert . Während auf dem Gebiet der hereditären Erkrankungen damit bereits große Erfolge erzielt wurden, sind die Resultate, was komplexe Erkrankungen wie die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) betrifft, noch spärlich. AMD ist eine retinale Erkrankung, die einen signifikanten Prozentsatz der älteren Bevölkerung betrifft. Es wird angenommen, dass sowohl exogene als auf genetische Faktoren als Auslöser beteiligt sind. Um die Physiologie der Retina besser zu verstehen und die Identifikation von Genen, die in retinale Erkrankungen involviert sind, zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit ein Schwerpunkt auf die systematische Analyse des retinalen Transkriptoms gelegt. Etwa die Hälfte aller Gene, die bei retinalen Erkrankungen eine Rolle spielen und bis heute identifiziert wurden, werden überwiegend in der Retina exprimiert. Das Erstellen von Genexpressionsprofilen und die Identifikation von retina-spezifischen Transkripten ist daher der erste wichtige Schritt für die Charakterisierung von Kandidatengenen für retinale Erkrankungen. Zu diesem Zweck wurde eine „Expressed Sequence Tags“ (ESTs) Analyse durchgeführt, in der alle Retina „Clusters“ der UniGene Datenbank sowie 1080 einzelne ESTs einer laboreigenen, suppressiv-subtraktiv hybridisierten (SSH) cDNA Bank der menschlichen Retina bewertet. Insgesamt wurden 6603 EST „Clusters“ während dieser Arbeit untersucht und für 750 eine detaillierte in-silico Analyse angeschlossen. Die Expression der Gene wurde mittels reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht und mit quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) bestätigt. Außerdem wurden konventionelle und virtuelle Northern Blot Hybridisierungen zur Aufklärung der Expressionsprofile eingesetzt. Die Expressionsprofile von 337 EST „clustern“ führte zur Identifikation von 111 Transkripten, von denen 60 abundant oder spezifisch in der Retina exprimiert werden, drei eine hohe Expression im retinalen Pigmentepithel (RPE) zeigen und 48 sowohl in der Retina als auch im Gehirn vorkommen. Die Bewertung der ESTs zur Auswahl von Kandidatengenen erlaubte einen direkten Vergleich der beiden genutzten Datenressoucen, der UniGene Datenbank und der retinalen SSH (retSSH) cDNA Bank. Die Resultate zeigten, dass die Generierung einer SSH Bank zur Identifikation zellspezifischer Transkripte die effektivere Methode darstellt. Durch die Nutzung dieser cDNA Bank konnte nicht nur ein Großteil der Kandidatengene, sondern auch Gene mit einer niedrigen Expression identifiziert werden. Außerdem zeigt die cDNA Bank eine Anreicherung an Retina-Transkripten. Somit stellt die retSSH cDNA Bank eine wertvolle Quelle zu Identifizierung neuer retinaler Gene dar. Durch diese und andere Arbeiten konnte die vollständige kodierende Sequenz von 55 der 111 retinaspezifischen oder –abundanten Gene ermittelt werden. Mittels verschiedener Methoden wie bioinformatische Analysen, „EST assembly“, cDNA Bank „screening“ und „RACE-Experimenten“ konnten im Lauf dieser Arbeit mehrere Gene, darunter C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1 und GRM7, kloniert werden. Mit bioinformatischen Analysen und cDNA Bank „screening“ wurde die Volllänge cDNA Sequenz und die genomische Organisation von C7orf9 (alias RFRP), ermittelt. Das 1190 bp retinaspezifische Transkript auf Chromosom 7p15.3 kodiert ein Vorläuferprotein für mindestens zwei kleine Neuropeptide, RFRP-1 und RFRP-3. Da C7orf9 in einer kritischen Region für die dominante zystoide Makuladystrophie liegt, wurde eine mögliche Rolle für die Pathologie der Krankheit untersucht. Mittels Southern Blot Hybridisierungen und der Sequenzierung von C7orf9 zweier betroffener Patienten des gleichen Stammbaums, der für die Lokalisierung des Krankheitsgens verwendet worden war, konnte eine Beteiligung des Genes am Krankheitsbild ausgeschlossen werden. Mehrere Isoformen des C12orf7 Gens konnten mit Hilfe verschiedener Klone aus cDNA Bank „screeining“, PCR Amplifikationen und „RACE-Experimenten“ identifiziert werden. Die von Chromosom 12q13.13 transkribierten Genvarianten zeigen eine retinaspezifische Expression. Aufgrund der vielfältigen Spleißvarianten des Gens kann über die Eigenschaften des kodierten Proteins nur spekuliert werden. Das längste Transkript, das alle sechs Exone und die letzte Intron-Sequenz enthält, kodiert ein Protein mit 471 AS, das ein Kernlokalisierungssignal und fünf Ankyrin „Domains“ aufweist. Die Existenz mehrere Isoformen wurde auch in der Maus nachgewiesen, was auf eine funktionelle Relevanz in der Physiologie der Zelle hinweist. Fünf neue Spleißvarianten des Glutamat metabotropen Rezeptors 7 (GRM7) mit alternativen Exonen am 3´Ende wurden identifiziert und charakterisiert. Eine der neuen Varianten, GRM7_v3 kodiert ein 924 AS-langer Protein und stellt damit das mutmaßlich längste GRM7 Protein dar. Die Isoformen werden nicht retinaspezifisch, sondern verstärkt in neuronalen Gewebe exprimiert. Obwohl die funktionellen Eigenschaften der spezifischen Carboxyl-Enden noch nicht geklärt sind, ist bekannt, dass „axon-targeting“ von GRM7_v1 von den letzten 60 AS des Proteins vermittelt wird. Die neuen Isoformen könnten daher eine Rolle im subzellulären Transport des Proteins spielen. Das C1orf32 Gen, das vorwiegend in der Retina exprimiert wird, besitzt zehn Exone und liegt auf Chromosom 1q24.1. Mit bioinformatische Analysen konnten nicht nur die orthologen Gene des putativen Proteins mit 639 AS in Maus und Ratte, sondern auch das LISCH7 Gen als potentielles Mitglied der Genfamilie identifiziert werden. Für LISCH7 ist eine Funktion als „low density lipoprotein receptor“ bekannt, das C1orf32 Protein ist damit möglicherweise in den retinalen Fettstoffwechsel involviert. Störungen im Fettstoffwechsel sind als Ursache für AMD vorgeschlagen worden, die Rolle von C1orf32 in dieser komplexen Krankheit sollte deshalb untersucht werden. Expressionsanalysen des „death-associated protein-like 1“ (DAPL1) Gens zeigten eine hohe Expression sowohl in Retina als auch im retinales Pigmentepithel. Das 552 bp Transkript kodiert ein Protein mit 107 AS und liegt auf Chromosom 2q24.1. In-silico Analysen identifizierten 12 weitere verwandte Proteine verschiedener Spezies, die eine hohe Ähnlichkeit aufweisen und eine neue Proteinfamilie darstellen. Vor allem die Ähnlichkeit mit dem „death-associated“ Protein, das für den programmierten Zelltod essentiell ist, ist von besonderem Interesse. Apoptose ist meist der ultimative Grund der retinalen Degeneration und somit stellt DAPL1 ein ausgezeichnetes Kandidatengen für Retinopathien dar. C4orf11, lokalisiert auf Chromosom 4q21.22 und C14orf2, lokalisiert auf Chromosom 14q22.1, sind retinaspezifische Genen und werden in mehren Isoformen transkribiert. Die kodierten Proteine enthalten keine bekannten Domänen, wegen ihrer retinaspezifischen Transkription kann allerdings eine wichtige Rolle für die Funktion der Retina nicht ausgeschlossen werden. Als eines der langfristigen Ziele dieses Projekts wurden mehrere der geklonten Gene genotypisiert um „single nucleotide polymorphism“ (SNP) Karten zu erstellen. Die derzeitigen Projekte untersuchen die Haplotypfrequenzen der Kandidatengene in großen Kohorten von AMD Patienten und nicht betroffenen Kontrollpersonen. Die Kollektion von 111 retinaspezifischen oder –abundanten Genen, die in dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert wurden, hat damit eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung retinaler Erkrankungen gelegt. KW - Netzhaut KW - Transkription KW - Gen KW - Netzhaut KW - Transkriptome KW - Retina KW - Transcriptome KW - Retina Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7278 ER - TY - THES A1 - Gehrig, Andrea T1 - Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell T1 - Molecular studies of X-linked juvenile Retinoschisis - from gene defect to the mouse model N2 - Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte. N2 - The World Health Organization (WHO) estimates that worldwide approximately 15 million people are affected with hereditary retinal degenerations. Retinal dystrophies are clinically and genetically heterogeneous. To date, 90 retinal disease genes have been identified and of 139 retinal disease genes the chromosomal location is known. In this study, different strategies of disease gene cloning were utilized to elucidate the underlying genetic defects of selected retinopathies. This has led to the identification of the gene associated with X-linked juvenile retinoschisis (RS) by positional cloning. Both, functional analysis of the gene product, named retinoschisin (RS1), and the generation of a mouse model for RS provide novel insight into retinal physiology and the pathomechanism of the disease. The genomic organization of the interphotoreceptor matrix proteoglycan-1 (IMPG1) was established and its chromosomal localization was identified (6q13-15). Seven different human retinal dystrophies have previously been mapped to this region on chromosome 6. A possible genetic association between IMPG1 and two retinal dystrophies, North Carolina macular dystrophy (MCDR1) and progressive bifocal chorioretinal atrophy (PBCRA), was investigated. By means of linkage studies and mutation analysis in affected patients the involvement of IMPG1 in these two different diseases was ruled out. The genomic organization of diacylglycerol kinase-3 (DAGK3) was determined and the gene locus was mapped to chromosome 3q27-28. The autosomal dominant optic atrophy (OPA1) was independently localized to the same chromosomal region. This has prompted us to investigate the role of DAGK3 in OPA1. By mutation analysis such a correlation could be excluded. X-linked juvenile retinoschisis is a common cause of juvenile macular degeneration affecting approximately 300.000 young males worldwide. The disease is characterized by a slitting of the inner retinal layers resulting in cystic degeneration of the central retina. Half of the patients also develop peripheral manifestations. Our laboratory and others localized the RS gene to a 900 kb interval on the short arm of chromosome Xp22.2. Comparison of genomic DNA sequences with publicly available expressed sequence tags (ESTs) have identified a retina-specific transcript. This novel transcript is composed of six exons that encode a 224-amino acid protein including a 23 amino acid signal peptide. Bioinformatical analysis revealed that the putative protein consists almost exclusively of a discoidin domain wich is highly conserved from slime mold to human. Discoidin domains are implicated in cell adhesion or cell-cell interactions. On the basis of mutation analysis in patients affected with RS, we confirmed that the gene indeed is responsible for RS pathology. The RS1 protein is found at the cell surfaces of photoreceptors and bipolar cells and within the synaptic regions of the outer (OPL) and the inner plexiform layers (IPL) most likely as a homo-oligomeric complex. To clarify the function of the normal RS1 and to gain insight into RS pathogenesis a mouse model deficient of the endogenous RS1 protein was generated. For these purposes the genomic organization of the murine orthologous RS1 gene (Rs1h) was identified. Ophthalmologic and histologic analysis of Rs1h-/Y mice revealed significant parallels to the human RS phenotyp. Therefore, the knock-out mouse represents an ideal model to further study the underlying disease mechanism. Recently, we showed that apoptosis is the final pathway of photoreceptor degeneration in Rs1h-/Y mice. Most importantly this mouse model can serve as proof-of-concept for gene therapy. Towards this end we are testing adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer of RS1 into the defect murine retina. This may pave the way for a gene based future intervention in humans affected with this condition. KW - Maus KW - Retinoschisis KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - X-gebundene juvenile Retinoschisis KW - Gendefekt KW - Mausmodell KW - X-linked juvenile retinoschisis KW - gene defect KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212 ER - TY - THES A1 - Abdel Rahman, Faisal Mirghani T1 - Systematic analysis of genes expressed in the retinal pigment epithelium (RPE) and identification of candidates for genetic susceptibility to age-related macular degeneration (AMD) N2 - Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7%) were highly frequent (0.17-0.5%), and 14 (40%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD. N2 - Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache von gravierenden Einschränkungen des Sehvermögens im fortgeschrittenen Lebensalter. In den Industriestaaten ist die AMD zudem die Hauptursache für Altersblindheit. Die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung der AMD führen, sind bisher nur unzureichend bekannt. In den letzten Jahren hat es sich jedoch herausgestellt, dass das retinale Pigmentepithel (RPE) eine primäre Rolle in der Pathogenese der AMD spielt. Ziel dieser Arbeit war die systematische Analyse von Genen, welche im RPE differentiell exprimiert werden. Entsprechende Kandidatengene sollten auf deren mögliche Beteiligung an der Entstehung von Erkrankungen der Retina, insbesondere der AMD, untersucht werden. Zunächst wurden 2379 ESTs aus einer innerhalb der Arbeitsgruppe generierten RPE cDNA Bibliothek definiert. Die dazu verwendete cDNA Bibliothek wurde durch die Suppressions- Subtraktions Hybridisierungs-Technik (SSH) konstruiert. Diese Technik gestattet eine Normalisierung gegenüber redundanten Sequenzen und begünstigt gleichzeitig die Anreicherung von seltenen Transkripten. In einer ersten Phase wurden 1002 ESTs sequenziert und einer umfassenden bioinformatischen Analyse mit Hilfe der verfügbaren DNA- und Protein Datenbanken unterzogen. Der Vergleich der 1002 ESTs mit der Draft Sequenz des menschlichen Genoms ergab den Hinweis auf 168 bereits bekannte Gene, 51 mögliche Gene, 15 völlig unbekannte Transkripte und 41 nicht weiter zuordenbare cDNA Klone. 318 EST Cluster wurden einer reversen Northen-Blot Analyse unterzogen um hochexprimierte Gene zu identifizieren und damit Prioritäten für die weiteren Analysen zu setzen. Im Rahmen der Northern-Analyse wurden repräsentative Klone von 107 EST-Klustern mit cDNA Sonden der ursprünglichen cDNA-Bibliothek hybridisiert. Als Ergebnis dieser Analyse fanden sich 7 RPE-spezifische, 3 Retina-spezifische, 7 sowohl RPE- als auch Retinaspezifische sowie 7 auf einzelne Gewebe limitierte Transkripte. 29 EST Cluster erwiesen sich als ubiquitär exprimiert, und 54 Kluster konnten nicht näher zugeordnet werden. Von den 24 Transkripten mit spezifischer oder zumindest begrenzter Expression wurden 16 Klone zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Aus diesen Material wurden im Rahmen dieser Arbeit das Kandidatengen MGC2477 sowie 2 neue Isoformen des menschlichen TRPM3-Gens kloniert und näher charakterisiert. Weiterhin wurden polymorphe Varianten dieser beiden Isoformen und des menschlichen MTProtocadherin- Gens definiert. Im Gen MGC2477 wurden 15 SNPs identifiziert, wovon die Allelhäufigkeit des selteneren Allels bei 13 der SNPs über 20% lag. Für 10 der insgesamt 15 vii SNPs dieses Gens fanden sich bisher keine Einträge in den entprechenden Datenbanken. Die SNP-Suche wurde auch für das TRPM3-Gen durchgeführt und ergab 35 SNPs, wovon 30 (85,7%) als hochfrequent eingestuft werden konnten. 14 dieser 35 SNPs waren bisher nicht in den Datenbanken verzeichnet. Beim MT-Protocadherin-Gen fanden sich ebenfalls 35 SNPs, wobei 80% eine hohe Frequenz des selteneren Allels aufwiesen. In diesem Fall handelte es sich bei 23 der insgesamt 35 SNPs um bisher unbekannte Allele. Diese SNPs bilden den Ausgangspunkt zur Konstruktion der häufigsten Haplotypen der genannten Gene. Mit der Charakterisierung der Einzel-Nukleotid Polymorphismen der Kandidatengene wurde die Grundlage zur Durchführung von Fall/Kontrollstudien gelegt, in deren Rahmen die Bedeutung der jeweiligen Kandidatengene in der Pathogense der AMD untersucht werden kann. KW - Senile Makuladegeneration / Pigmentepithel / Genexpression KW - RPE KW - AMD KW - RPE specific genes Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7053 ER -