TY - THES A1 - Jensen, Katharina T1 - Untersuchungen zum mRNA Trans-Spleißen bei den humanparasitischen Cestoden Echinococcus multilocularis und Echinococcus granulosus T1 - mRNA trans-splicing in the human parasitic cestode Echinococcus multilocularis and Echinococcus granulosus N2 - SL-Trans-Spleißen ist ein Mechanismus zur Transkriptprozessierung, welcher bisher bei kinetoplastiden Protozoen, Trematoden und Nematoden beschrieben wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals das Gen für einen Spliced Leader (SL) aus den Cestoden E. multilocularis und E. granulosus charakterisiert. Ausgangspunkt waren Studien zur Genregulation des E. multilocularis Gens elp, welches für einen Faktor der ERM-Familie kodiert. Es konnte gezeigt werden, daß elp über mindestens zwei unterschiedliche Transkripte kodiert wird. Für eines dieser Transkripte konnte gezeigt werden, daß ein 32 Nukleotide langes, nicht-proteinkodierendes Exon über konservatives Spleißen mit dem startmethionin-kodierenden Exon II der elp-mRNA fusioniert wird. Der entsprechende Transkriptionsstartpunkt und zugehörige Promotorstrukturen konnten auf dem E. multilocularis Chromosom identifiziert werden. Ein zweites Transkript enthielt anstelle des 32 nt Exon I von elp ein alternatives 36 nt langes Exon am 5‘-Ende, welches nicht Teil des genomischen elp Lokus ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß dieses 36 nt lange Exon einen Spliced Leader (SL) von E. multilocularis darstellt. Eine Analyse von E. multilocularis cDNA-Bibliotheken ergab, daß sich das 36 nt Exon nicht nur am 5‘-Ende der elp-mRNA befindet, sondern in identischer Form auch am 5‘-Ende von mindestens elf anderen mRNAs von E. multilocularis. Das zugehörige SL-RNA-Gen konnte isoliert und vollständig charakterisiert werden. Es befand sich auf einem 1513 bp langen Fragment, welches auf dem E. multilocularis Genom als mehrfacher Repeat angeordnet ist. Auf DNA-Sequenzebene konnte gezeigt werden, daß dieses Gen signifikante Homologien zu bereits bekannten SL-RNA-Sequenzen von Trematoden und Turbellaria nicht jedoch zu solchen von Nematoden und kinetoplastiden Protozoen aufweist. Die Sekundärstruktur der kodierten SL-RNA besitzt zudem strukturelle Charakteristika, die für SL-RNAs anderer Organismen bereits bekannt sind. Zusammengenommen lassen diese Daten den Schluß zu, daß es sich bei dem 36 nt langen Exon in der Tat um einen SL von E. multilocularis handelt. Die für E. multilocularis identifizierten trans-gespleißten mRNAs kodieren für Faktoren, welche an einer Reihe unterschiedlicher Prozesse in der Zelle beteiligt sind. Signifikante Unterschiede in den Spektren der trans-gespleißten Faktoren bei Echinococcus und anderen Plathelminthen können als Hinweis gewertet werden, daß keine generelle Korrelation besteht zwischen Trans-Spleißen einer bestimmten mRNA und der biologischen Funktion des Faktors. Ein zum SL-Gen von E. multilocularis hoch homologes Gen konnte zudem auf chromosomaler DNA des Hundebandwurms E. granulosus identifiziert werden. Trans-Spleißen wird demnach nicht nur vom Fuchsbandwurm, sondern auch vom Hundebandwurm zur Genexpression genutzt. Im Falle von elp besteht die ungewöhnliche Situation, daß ein identisches Protein zwei verschiedene Transkripte kodiert von denen eines konventionell und das andere trans-gespleißt wird. Der Regulationsmechanismus dieses alternativen Cis/Trans-Spleißens wurde in dieser Arbeit untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß den zwei elp Transkripten auch zwei unterschiedliche Primärtranskripte zugrunde liegen. Die dabei erlangten Daten stehen in Einklang mit dem gegenwärtigen Modell, daß alternatives Cis/Trans-Spleißen an einer Splice Akzeptorstelle ausschließlich vom Vorhandensein einer stromaufwärts gelegenen Splice Donorstelle abhängt. Weitere Studien haben gezeigt, daß die Expression der trans-oder cis-gespleißten elp-mRNA weder stadien- noch isolat-oder zytospezifische ist. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit erstmals umfassende Daten zum Mechanismus des Trans-Spleißens bei einem Cestoden erlangt werden, was sich für weitere molekularbiologische Untersuchungen an diesem Organismus hervorragend ausnutzen läßt. In einer abschließenden Studie wurde versucht einen weiteren ERM-homologen Faktor, der eventuell auch über alternatives Cis/Trans-Spleißen exprimiert wird, über PCR mit degenerativen Primern zu identifizieren. Es konnte jedoch neben elp kein anderer homologer Faktor bestimmt werden. Dieses Ergebnis entspricht den bereits bei anderen niederen Eukaryonten durchgeführten Untersuchungen. N2 - For information in english regarding this dissertation please have a look at the following references: Brehm K, Jensen K, Frosch M (1999) Characterization of the genomic locus expressing the ERM-like protein of Echinococcus multilocularis. Mol Biochem Parasitol. 15, 147-152 Brehm K, Jensen K, Frosch M (2000) mRNA trans-splicing in the human parasitic cestode Echinococcus multilocularis. J Biol Chem. 275, 38311-38318 KW - Trans-Spleißen KW - Spleißen KW - Cestoden KW - Echinococcus KW - mRNA KW - splicing KW - echinococcus KW - cestode KW - trans-splicing KW - mRNA Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5842 ER - TY - THES A1 - Kroner, Antje T1 - Klonierung und Charakterisierung von Rezeptorkinasen der EGF- und TGF-Beta-Familie des kleinen Fuchsbandwurmes Echinococcus multilocularis T1 - Cloning and characterization of receptor kinases from the EGF- and TGF ß- family from the fox tapeworm Echinococcus multilocularis N2 - Rezeptorkinasen spielen eine wichtige Rolle in der Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung und sind möglicherweise an hormonellen Kommunikations- Mechanismen zwischen parasitären Helminthen und ihren Säugetier- Wirten beteiligt. In dieser Arbeit wurden erstmals eine Rezeptor- Tyrosinkinase der EGF Familie, eine Serin- Threoninkinase der TGF- Familie sowie ein intrazellulärer Signaltransduktionsfaktor der Smad- Familie aus dem Fuchsbandwurm Echinococcus multilocularis charakterisiert. Mittels degenerativer PCR und 3´/ 5´-RACE Methoden konnten drei E. multilocularis cDNAs identifiziert und vollständig charakterisiert werden, welche für (i) eine Tyrosinkinase (EmRTK1) der EGF Rezeptor- Familie (5160 bp cDNA, 1564 Aminosäuren); (ii) eine Serin – Threoninkinase (EmRSK1) der TGF-Rezeptor - Familie (1892 bp cDNA, 543 Aminosäuren); und (iii) einen intrazellulären Signaltransduktor der Smad Familie (1530 bp cDNA, 318Aminosäuren) kodieren. Anhand von Sequenzvergleichen der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigten alle drei Faktoren für die jeweilige Proteinfamilie typische Domänenstrukturen und hohe Homologien zu bereits bekannten Faktoren aus Säugern. Der zugehörige chromosomale Locus wurde in allen drei Fällen vollständig charakterisiert. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte die Expression von emrtk-1, emrsk-1 und emsmadA in den Larvenstadien Metacestode und Protoskolex während der Infektion des Zwischenwirtes nachgewiesen werden. Anhand dieser Daten kann vermutet werden, dass die beschriebenen Rezeptoren und EmSmadA eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Parasiten spielen und möglicherweise an Mechanismen der Wirt- Parasit Interaktion während der alveolären Echinokokkose beteiligt sind. N2 - Receptor kinases play an important role in the communication of cells with their environment and could be involved in hormonal communication- mechanisms between parasitic helminths and their mammalian hosts. This work describes, for the first time, the identification and characterization of a receptor- tyrosinkinase of the EGF- receptor family, a serin- threoninkinase of the TGF-- receptor family, and an intracellular signal transduction factor of the Smad- Familie from the fox- tapeworm Echinococcus multilocularis. Using degenerative PCR and 3´/ 5´-RACE methods, E. multilocularis cDNAs coding for (i) a tyrosinkinase (EmRTK1) of the EGF family (5160 bp cDNA, 1564 amino acids); (ii) a serin – threoninkinase (EmRSK1) of the TGF- family (1829 bp cDNA, 543 amino acids); and (iii) an intracellular signal-transductor of the Smad family (1530 bp cDNA, 318 amino acids) could be identified and completely characterized. Furthermore, the chromosomal loci for all three factors were completely characterized. Structural analyses revealed that all three Echinococcus factors displayed domain structures which are characteristic of the respective protein families. Furthermore, on the amino acid sequence level, all three factors shared considerable homologies with corresponding host factors. Using RT-PCR analysis, emrtk-1, emrsk-1 and emsmadA were shown to be expressed in the larval stages metacestode and protoscolex during the infection of the intermediate host. According to this data, the described receptors and EmSmadA are likely to play an important role in the parasitic development and could be involved in mechanisms of the host- parasite interaction during alveolar echinococcosis. KW - Echinococcus multilocularis KW - Rezeptorkinasen KW - EGF-Rezeptor KW - TGFß-Rezeptor KW - Smad KW - Echinococcus multilocularis KW - rezeptorkinases KW - EGF-receptor KW - TGFß-receptor KW - Smad Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5681 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Sabine T1 - Die funktionelle Relevanz humoraler und zellulärer Immunreaktionen gegen Campylobacter jejuni in der Pathogenese von Immunneuropathien T1 - The functional relevance of humoral and cellulare immune responses to Campylobacter jejuni in the pathogenesis of acute neuropathies. N2 - Verschiedene mögliche Pathomechanismen einer Campylobacter jejuni-spezifischen Immunantwort bei der Entstehung akuter Immunneuropathien wurden untersucht. Neben anderen wurden für die Untersuchungen auch C. jejuni-Stämme eingesetzt, welche von Guillain-Barré- (GBS) und Miller-Fisher-syndrome (MFS) Patienten isoliert worden waren. Es wurden Ultraschall-Gesamt-Homogenate der C. jejuni Stämme sowie von Salmonella typhimurium als Kontrollbakterium hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Proteinfraktionen isoliert und die Lipopolysaccharide (LPS) der Bakterien isoliert. Durch Immunisierung von Ratten mit diesen C. jejuni-Präparationen konnten keine Krankheitszeichen der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN) ausgelöst werden. Trotz Produktion hoher Titer C. jejuni-spezifischer Antikörper verlief in diesen Tieren eine anschließend durch P2-spezifische T-Lymphozyten induzierte adoptiv transferierte EAN (AT-EAN) nicht schwerer als in mit komplettem Freund´schen Adjuvans (CFA) kontrollimmunisierten Ratten. Nach Immunisierung mit C. jejuni-Protein wurden C. jejuni-spezifische T-Zellen von Lewis-Ratten gewonnen, die mit allen getesteten C. jejuni-Stämmen als Antigen reagieren, jedoch zeigten C. jejuni-spezifische Ratten-T-Zellen in vitro keine Kreuzreaktivität mit PNS-Antigenen und induzierten in vivo keine Neuritis. Im Modell der EAN läßt sich durch Füttern des Antigens eine natürliche orale Toleranz induzieren, welche die Tiere gegen eine aktiv induzierte EAN resistent macht. Die immunologische Auswirkung der enteralen Gabe von C. jejuni-LPS auf die natürliche Immuntoleranz wurde untersucht. Dabei konnte bei diskrepanten Ergebnissen keine pathogene Bedeutung von enteralen C. jejuni-Antigenen in der Ratte festgestellt werden. Zur Generation und Untersuchung C. jejuni-spezifischer monoklonaler Antikörper wurden Balb/c-Mäuse mit C. jejuni-LPS-Präparationen in CFA immunisiert und die Milzzellen dieser Tiere mit Maus-Myelomzellen fusioniert. Es konnte eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern etabliert werden. Selektive Spezifitäten der monoklonalen Antikörper für C. jejuni-LPS oder -protein wurden detektiert, die meisten der monoklonalen Antikörper als IgM, einige als IgG charakterisiert. Die Antikörper reagieren mit allen getesteten C. jejuni-Stämmen sowohl im ELISA als auch im Western Blot kreuz. Eine Reaktivität der Antikörper mit verschiedenen Gangliosiden konnte nicht nachgewiesen werden. Zur Untersuchung eines elektrophysiologisch fassbaren blockierenden Effektes von C. jejuni-spezifischen Antikörpern wurden Makro-patch-clamp-Untersuchungen am Mäusezwerchfell mit dialysierten Seren von C. jejuni-immunisierten Ratten durchgeführt. Einige der C. jejuni-Antiseren blockierten die präsynaptische Quantenfreisetzung partiell. Dieser Effekt war C. jejuni-spezifisch und durch Salmonella-Antiserum oder Kontrollseren CFA-immunisierter Tiere nicht induzierbar. Ein von uns generierter monoklonaler IgG-Antikörper gegen C. jejuni-LPS wurde ebenfalls in Makro-patch-clamp-Untersuchungen getestet und blockierte die Quantenfreisetzung. Weiterhin wurden humane T-Zellen gegen C. jejuni HB 93-13 generiert. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß diese Zellen mit anderen C. jejuni-Stämmen, jedoch nicht mit Salmonellen, kreuzreagieren und ausschließlich Proteine jedoch nicht LPS erkennen. Die generierten Zellen sind alle HLA-DR restringiert und der Phänotyp wurde als CD 4+/CD 8-, /-TZR+ identifiziert. Einige der C. jejuni-spezifischen T-Zell-Linien zeigten eine starke oder partielle Kreuzreaktivität mit humanem rekombinantem P2-Protein des PNS und mit einzelnen P2-Peptiden. Dieser Befund belegt erstmals, dass durch Konfrontation mit C. jejuni eine zelluläre Immunantwort angestoßen werden kann, die in autoimmuner Weise mit Myelinprotein des PNS kreuzreagiert. N2 - The present study evaluates the putative pathogenic role of a Campylobacter jejuni directed immune response in the pathogenesis of acute neuropathies. Among other C. jejuni strains, strains isolated from Guillain-Barré- (GBS) and Miller-Fisher syndrome (MFS) patients were used for this investigation. By sonication, total homogenate of different C. jejuni strains and Salmonella typhimurium, which served as a control, were prepared. Additionally, different protein fractions and bacterial lipopolysaccharides (LPS) were isolated. Immunization of rats with C. jejuni preparations did not lead to clinical manifestation of active experimental autoimmune neuritis (EAN). Furthermore, the severity of adoptive transfer-EAN (AT-EAN), induced by adoptively transferred P2-specific T cells was not altered in rats that had been previously immunized with C. jejuni for production of high anti-C. jejuni antibody titers. C. jejuni-specific T cell lines were generated from Lewis rats immunized with C. jejuni proteins. These T cells proliferated in an antigen-specific manner in the presence of extracts from different C. jejuni strains. C. jejuni-specific rat T cells did not show any cross-reactive proliferation to peripheral nervous system (PNS) antigens. Furthermore, it was not possibe to induce neuritis by adoptive transfer of C. jejuni-specific T cells in vivo. Oral application of myelin antigens induces oral tolerance which renders rats resistant to actively induced EAN. This observation lead to analyse the immunological consequences of oral administration of C. jejuni LPS with respect to the induction of tolerance. C. jejuni/myelin-fed rats developed accelerated clinical sings of EAN compared to control animals. Thus, oral administration of C. jejuni HB 93-13 LPS inhibited the induction of myelin-specific oral tolerance. In order to investigate the humoral immune response, monoclonal C. jejuni-specific antibodies were isolated by immunization of Balb/c mice with C. jejuni LPS preparations emulsified in complete Freund´s adjuvant (CFA). Splenocytes from primed animals were fused with myeloma cells. A number of monoclonal antibodies were characterized. These monoclonal antibodies were either specific for C. jejuni LPS or C. jejuni proteins. These immunoglobulins were characterized to be predominantly IgM, but also IgG antibodies could be found. ELISA and western blot analysis verified cross-reactivity of antibodies with different C. jejuni strains. However, the antibodies were not able to recognize gangliosides. Electrophysiological investigations were used to determine a possible blocking effect of C. jejuni-specific antibodies at the neuromusculare endplate. Alteration of neuromuscular transmission at the diaphragm of mice after appling dialysed sera of C. jejuni immunized rat, were investigated using patch-clamp. Several C. jejuni antisera were able to partially block the pre-synaptic quantal release. This effect was C. jejuni-specific and was not inducible by Salmonella typhimurium antisera or control sera, obtained from CFA immunized animals. Additionally, one of the generated monoclonal C. jejuni LPS specific IgG antibodies was able to block the quantal release. Finally, we were able to generate human T cells reacting specifically with C. jejuni HB 93-13. For the first time it could be shown, that these cells respond to homogenates of other C. jejuni strains but not to Salmonella typhimurium homogenate. Specifically C. jejuni proteins but not C. jejuni LPS were recognized by the human T cell lines. The generated T cells were all HLA-DR restricted and identified to be CD4+/CD8-, /-TCR+. A few of the C. jejuni-specific T cell lines demonstrated a strong cross-reactivity to a PNS-component, the recombinant human P2-protein and single P2-peptides. This observation shows that C. jejuni induces a variety of antigen-specific and non-specific immune responses which are able to facilitate or even trigger autoimmunity against the PNS as occuring in GBS or the MFS. KW - Campylobacter jejuni KW - Immunreaktion KW - Guillain-Barr'e-Syndrom KW - Campylobacter jejuni KW - Guillain-Barré Syndrom KW - Campylobacter jejuni KW - Guillain-Barré syndrome Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5531 ER - TY - THES A1 - Abele, Tobias T1 - Invasion, Replikation und Stadienkonversion von Toxoplasma gondii in permanenten ZNS-Zelllinien der Ratte T1 - Invasion, replication and stageconversion of Toxoplasma gondii in permanent CNS-celllines of the rat N2 - Permanente ZNS-Zelllinien der Ratte wurden mit Toxoplasma gondii unter Betrachtung der Invasions-, Replikations- und Stadienkonversionfähigeit des Parasiten infiziert. Additiv zu bekannten Tiermodellen konnte so ein Zellkulturmodell zur Erforschung der zerebralen Persistenz des Protozoons etabliert werden. N2 - Permanent CNS-Celllines of the rat were infected by Toxoplasma gondii under special interest on the ability of invasion, replication and stageconversion of the parasite in the host-cells. Additional to the known Animal-models a new Cell-culture-model for the investigation of the cerebral persistance of the protozoan could be established. KW - Toxoplasma gondii KW - ZNS-Infektion KW - Parasit KW - zerebrale Persistenz KW - Toxoplasma gondii KW - CNS-Infection KW - Parasite KW - cerebral persistance Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4521 ER - TY - THES A1 - Dostal, Stefan T1 - Molekulare Differenzierung von Mykobakterien T1 - Molecular differentiation of Mycobacteria N2 - Die Differenzierung von Mykobakterien auf Speziesebene mithilfe von herkömmlichen biochemischen Testverfahren ist langwierig, was zu signifikanten Verzögerungen in der Diagnostik führt. Molekulare Identifizierung hingegen weist, verglichen mit der phänotypischen Identifizierung, zwei entscheidende Vorteile auf: es kommt dabei zu einem Geschwindigkeitszuwachs und zu einer höheren Genauigkeit des Diagnoseerfahrens. Der Informationsgehalt des 5’-Endes des 16S-rRNA-Gens ist ausreichend für die Identifizierung der meisten bakteriellen Spezies. Wegen der vielen fehlerhaften Datenbestände können öffentliche Sequenzdatenbanken die benötigten Referenzsequenzen jedoch nicht zur Verfügung stellen. Es wurde deshalb eigens eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Sequenzen geschaffen. Die Sequenzen beinhalten beide Stränge der 5’-16S-rDNA (E. coli-Position 54-510) von 125 Stammsammlungisolaten. Dabei wurden alle bis zum 31.03.2000 valide beschriebenen Arten (n=89) und einige weitere, bereits veröffentlichte Sequevare-Varianten eingeschlossen. Konnten Stämme anhand der 16S-Sequenzen nicht unterschieden werden, wurde zusätzlich die Sequenz der „Internal Transcribed Spacer Region“ bestimmt (n=45). Insgesamt existierten von den Stämmen, die anhand ihrer 16S-rDNA-Sequenz nicht eindeutig zu identifizieren waren, 77 Isolate in der öffentlichen Datenbank Genbank. Den neu analysierten Sequenzen gegenübergestellt weisen diese im paarweisen Vergleich eine durchschnittliche Diskrepanz von 4,31 Basen auf. Durch die vergleichende 5‘-16S-rDNA-Sequenzanalyse war es möglich 64 der 89 validen Spezies zu identifizieren (71.9%). Nach Hinzunahme der ITS-Sequenz war es möglich, weitere 15 Spezies zu differenzieren. Nur die Arten des M. tuberculosis complex, M. marinum und M. ulcerans und die M. avium Subspezies konnten weder durch 5‘16S-rDNA-Sequenzanalyse noch anhand der ITS-Sequenz differenziert werden. Die Sequenzen aller Stämme sind abrufbar in der Datenbank des RIDOM-Projekts (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Weiterführende Informationen (z.B. taxonomischer oder medizinischer Art) vervollständigen zusammen mit einem Algorithmus zur genotypischen Identifizierung aller valide beschriebenen Mykobakterien dieses Angebot. Nach ausführlicher Analyse verschiedener Mykobakterien Spezies ist es nun in der Tat möglich, die meisten Mykobakterien Arten anhand der vergleichenden Seqenzanalyse der 16S-rDNA und ITS zu unterscheiden. Voraussetzung hierfür ist eine Datenbank mit qualitativ hochwertigen Referenzsequenzen. Bereits in naher Zukunft ist die Anwendung dieses Verfahrens im Routinebetrieb, v.a. in Referenzlaboratorien, denkbar. N2 - Differentiation of mycobacteria to the species level by conventional biochemical tests is laborious, leading to significant delays in diagnosis. Molecular identification on the other hand provides two primary advantages to phenotypic identification: rapid turn-around time and improved accuracy. The information content of the 5'-end of the 16S-rRNA gene is sufficient for identification of most bacterial species. However, sequence based identification is hampered by many faulty sequence entries in publicly accessible databases. In order to establish an improved 16S-rDNA sequence database for identification of clinical isolates both strands of the 5'-16S-rDNA (E. coli position 54-510) from 125 mycobacterial culture collection isolates were sequenced. All until 31.03.2000 valid described species (n=89) and some published sequevar variants were included. If the 16S rDNA sequences were not discriminatory enough, the internal transcribed spacer (ITS) region sequences (n=45) were also determined. In total 77 identical 16S-rDNA-strains had been sequenced by others before. Comparing these GenBank entries with our sequences, there were on average 4.31 differences. By 5'-16S-rDNA sequencing it was possible to identify 64 of 89 different mycobacterial species (71.9%). With the additional input of the ITS sequence, further 15 species could be differentiated. Only M. tuberculosis complex species, M. marinum and M. ulcerans and the M. avium subspecies could neither be differentiated by 5'-16S rDNA- nor by ITS-sequencing. The sequences are available for public similarity searches in the database of the RIDOM project (“Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms”). Further information (e.g. taxonomic, medical) together with an algorithm for genotypic identification of all mycobacteria complements this service. In conclusion, it could be shown in this exhaustive analysis of different mycobacterial species, that it is indeed possible to differentiate most mycobacterial species by sequence analysis of 16S-rDNA or ITS, if a high quality sequence reference database is available. This technique should be, therefore, considered for routine application especially in reference laboratories in the future. KW - Mykobakterien KW - molekulare Differenzierung KW - molekulare Identifizierung KW - Phylogenie KW - 16S-rDNA KW - Sequenzanalyse KW - Mycobacteria KW - molecular differentiation KW - molecular identification KW - phylogeny KW - 16S-rDNA KW - sequence analysis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3348 ER - TY - THES A1 - Kurzai, Oliver T1 - Molekulare Charakterisierung pH-regulierter Gene bei der humanpathogenen Hefespezies Candida dubliniensis und ihr Nutzen für die epidemiologische Diagnostik T1 - PH-regulated genes of the pathogenic yeast Candida dubliniensis and their impact in epidemiological diagnostics N2 - Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung. N2 - Candida dubliniensis is a recently described pathogenic yeast species that is phylogenetically closely related to Candida albicans. In routine clinical diagnostic procedures both species are not differentiated due to the unique ability of C. dubliniensis to form germ-tubes and chlamydospores as C. albicans. Most C. dubliniensis isolates have been recovered from the oropharynx of HIV-infected patients. PHR1 and PHR2 are functionally homologous genes of C. albicans responsible for crosslinking b-1,3- and b-1,6-glucans of the yeast cell wall. These genes are characterized by a unique pattern of pH-dependent transcription. Deletion of each of these genes results in a pH-dependent phenotype with aberrant in vitro morphogenesis and reduced virulence in an animal model. Here, PHR homologous genes of C. dubliniensis are characterized. CdPHR1 is 90.5 per cent homologous to PHR1, CdPHR2 is 91.7 per cent homologous to PHR2. Like PHR1, CdPHR1 is only expressed in neutral to alkaline conditions, whereas CdPHR2 transcript - as with PHR2 - can only be found in acidic conditions. Functional homology of CdPHR1 with PHR1 is shown by complementation of a phr1 phenotype in C. albicans with CdPHR1. The native promoter of CdPHR1 is thereby shown to be functional in C. albicans. In contrast CdPHR1 is expressed in a pH-independent manner in bakers yeast Saccharomyces cerevisiae. This constitutive expression is not altered by additional integration of a dominant active allele of RIM101, encoding the transcription factor, that ensures pH-dependent gene expression in C. albicans. CdPHR1 is not expressed in C. glabrata and Aspergillus nidulans. A rapid PCR-test for discrimination between C. albicans and C. dubliniensis is constructed based on sequence differences between PHR1 and CdPHR1. This test is evaluated in an epidemiological study with 133 chlamydospore-positive clinical yeast isolates. 21 oropharyngeal isolates are retrospectively identified as C. dubliniensis, resulting in a prevalence of 30 per cent in this patient collective. PCR-results are confirmed by sequencing rDNA (V3, ITS1, ITS2). Phenotypic tests for identification of C. dubliniensis are evaluated with respect to their diagnostic potential. Whereas chlamydospore-morphology and colony colour on Chromagar Candida are not suited for reliable discrimination, and the growth deficit of C. dubliniensis at 45°C is sensitive but not specific, colony morphology on Staib agar corresponds 100 per cent to the molecular biology data. All C. dubliniensis isolates are biochemically characterized using the Micronaut RC system. The test for b-glucosidase activity within this system shows a high discriminatory potential. Susceptibility testing reveals, that the C. dubliniensis isolates are more sensitive to antifungals than the C. albicans isolates. C. dubliniensis and C. albicans rely on interchangeable mechanisms to react to the ambient pH. Furthermore, pH-regulated expression of cell wall associated genes is closely linked to morphogenesis. Despite this, C. dubliniensis is not only less virulent than C. albicans but also displays a distinct epidemiology characterized by a preference for oropharyngeal colonialization and infection of HIV-positive patients. To reveal the reasons for this, reliable identification of C. dubliniensis is necessary. For that purpose, a rapid PCR test is introduced together with an evaluation of currently available phenotypic methods. Thoroughly characterized isolates of both species are available for further studies. KW - Candida KW - albicans KW - dubliniensis KW - pH KW - PHR KW - CdPHR KW - RIM101 KW - Zellwand KW - Candida KW - albicans KW - dubliniensis KW - pH KW - PHR KW - CdPHR KW - RIM10 KW - cell wall Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182281 ER - TY - THES A1 - El-Barkani, Abdelmalic T1 - Molekulargenetische Charakterisierung des pH-regulierten Dimorphismus und der pH-abhängigen Genexpression von Candida albicans und Entwicklung eines Reportersystem für Candida glabrata T1 - Molecular genetic Characterisation of the pH Regulated Dimorphism and the pH Dependent Gene Expression of Candida albicans and Development of a Reporter System for Candida glabrata N2 - Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können. N2 - Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata. KW - Candida albicans KW - Wasserstoffionenkonzentration KW - Genexpression KW - Torulopsis glabrata KW - Markierungsgen KW - Candida albicans KW - pH KW - Dimorphismus KW - Genexpression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - Reportergen KW - Candida albicans KW - pH KW - dimorphism KW - gene expression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - reporter gene Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1125 ER - TY - THES A1 - Heinz, Werner J. T1 - Identifikation und Charakterisierung von PHR3, einem zu der PHR/GAS-Familie homologen Gen bei Candida albicans T1 - Identification and characterization of PHR3, a gene homologous to the PHR/GAS familiy of candida albicans N2 - Es konnte mit PHR3 bei Candida albicans ein drittes GAS-homologes Gen nachgewiesen werden. Dieses weist überzeugende Übereinstimmungen der Nuklein- und Aminosäurensequenz und mit der fehlenden GPI-Verankerungsstelle und der pH-konstitutiven Expression auch interessante Unterschiede zu den bisher bekannten Genen der PHR-Familie auf. Eine funktionelle Homologie zu den weiteren PHR-Genen bei Candida albicans konnte nicht belegt werden. Es sind bisher in verschiedenen Spezies mehrere homologe Gene dieser Familie nachgewiesen worden. So sind auch bei Candida albicans weitere möglich und die endgültige Zahl der PHR-Gene wird erst nach Abschluß des Candida albicans-Genomprojektes bestimmt werden können. Der Zweck mehrerer homologer Gene ist insbesondere für die bei unterschiedlichen pH-Werten vorliegenden Proteine Phr1p und Phr2p noch nicht bekannt. Eine mögliche Erklärung ist, dass ihre Translation auf unterschiedliche Weise die Expression anderer Gene oder die Prozessierung und Funktion von Proteinen beeinflusst. Eine solche feine Regulation von Wachstums- und Virulenzfaktoren und somit eine Anpassung an Umweltbedingungen und Infektionswege ist für die Pathogenität von Candida albicans von Bedeutung. Die spezifischen Faktoren für die Induktion von PHR3 sind, sollte eine differenzierte Regulation vorliegen, dagegen ebenso wenig wie für GAS4, als nähestes verwandtes Gen, und für die weiteren GAS-Gene bekannt. Zum Nachweis einer solchen signalspezifischen Transkription sind Experimente mit anderen Versuchsanordnungen, mit welchen sich komplexere Milieus und Infektionswege untersuchen lassen, wie DNA-Chips oder induktionsabhängige Signalkassetten (Morschhäuser et al., 1999; Staib et al., 1999) hilfreich. Da eine fehlende C-terminale Region bei GAS1 zur Sekretion eines vergrößerten Proteins mit Hypermannosylierung der serinreichen Region führt (Popolo et Vai, 1998), erscheint auch eine extrazelluläre Funktion von Phr3p, welches dieses hydrophobe 3’ Ende nativ nicht besitzt, möglich. Dabei ist eine zu Phr1p und Phr2p ähnliche oder gleiche enzymatische Funktion, welche in Diskussion 112 unterschiedlichen Kompartimenten oder von unterschiedlicher Lokalisation aus den Aufbau der Zellwand beeinflusst, denkbar. KW - PHR3 KW - PHR/GAS KW - Candida albicans KW - PHR3 KW - PHR/GAS KW - candida albicans Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179719 ER -