TY - THES A1 - Thomas, Sarah Katharina T1 - Design of novel IL-4 antagonists employing site-specific chemical and biosynthetic glycosylation T1 - Herstellung neuer IL-4 basierter Antagonisten durch zielgerichtete chemische und biosynthetische Glykosylierung N2 - The cytokines interleukin 4 (IL-4) and IL-13 are important mediators in the humoral immune response and play a crucial role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, such as asthma, allergies, and atopic dermatitis. Hence, IL-4 and IL-13 are key targets for treatment of such atopic diseases. For cell signalling IL-4 can use two transmembrane receptor assemblies, the type I receptor consisting of receptors IL-4R and γc, and type II receptor consisting of receptors IL-4R and IL-13R1. The type II receptor is also the functional receptor of IL-13, receptor sharing being the molecular basis for the partially overlapping effects of IL-4 and IL-13. Since both cytokines require the IL-4R receptor for signal transduction, this allows the dual inhibition of both IL-4 and IL-13 by specifically blocking the receptor IL-4R. This study describes the design and synthesis of novel antagonistic variants of human IL-4. Chemical modification was used to target positions localized in IL-4 binding sites for γc and IL-13R1 but outside of the binding epitope for IL-4R. In contrast to existing studies, which used synthetic chemical compounds like polyethylene glycol for modification of IL-4, we employed glycan molecules as a natural alternative. Since glycosylation can improve important pharmacological parameters of protein therapeutics, such as immunogenicity and serum half-life, the introduced glycan molecules thus would not only confer a steric hindrance based inhibitory effect but simultaneously might improve the pharmacokinetic profile of the IL-4 antagonist. For chemical conjugation of glycan molecules, IL-4 variants containing additional cysteine residues were produced employing prokaryotic, as well as eukaryotic expression systems. The thiol-groups of the engineered cysteines thereby allow highly specific modification. Different strategies were developed enabling site-directed coupling of amine- or thiol- functionalized monosaccharides to introduced cysteine residues in IL-4. A linker-based coupling procedure and an approach requiring phenylselenyl bromide activation of IL-4 thiol-groups were hampered by several drawbacks, limiting their feasibility. Surprisingly, a third strategy, which involved refolding of IL-4 cysteine variants in the presence of thiol- glycans, readily allowed synthesis of IL-4 glycoconjugates in form of mixed disulphides in milligram amount. This approach, therefore, has the potential for large-scale synthesis of IL-4 antagonists with highly defined glycosylation. Obtaining a homogenous glycoconjugate with exactly defined glycan pattern would allow using the attached glycan structures for fine-tuning of pharmacokinetic properties of the IL-4 antagonist, such as absorption and metabolic stability. The IL-4 glycoconjugates generated in this work proved to be highly effective antagonists inhibiting IL-4 and/or IL-13 dependent responses in cell-based experiments and in in vitro binding studies. Glycoengineered IL-4 antagonists thus present valuable alternatives to IL-4 inhibitors used for treatment of atopic diseases such as the neutralizing anti-IL-4R antibody Dupilumab. N2 - Die Zytokine Interleukin-4 (IL-4) und IL-13 sind zentrale Mediatoren in der humoralen Immunantwort und sind wesentlich an der Entstehung chronisch inflammatorischer Erkrankungen, wie Asthma, Allergien und atopischer Dermatitis beteiligt. Daher werden IL- 4 und IL-13 als wichtige therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung atopischer Erkrankungen betrachtet. Zur Signaltransduktion aktiviert IL-4 zwei heterodimere Rezeptorkomplexe, den Typ I Rezeptor bestehend aus den Untereinheiten IL-4R und γc und den Typ II Rezeptor, der sich aus IL-4R und IL-13R1 zusammensetzt. Der Typ II Rezeptor wird auch von IL-13 zur Signalweiterleitung genutzt, wodurch sich die teilweise überschneidenden Funktionen der beiden Zytokine erklären lassen. Die überlappende Rezeptornutzung erlaubt es durch eine gezielte Blockade des IL-4R-Rezeptors sowohl IL-4, als auch IL-13 gleichzeitig zu inhibieren. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung neuartiger IL-4 basierter Antagonisten. Dazu wurden ausgewählte Positionen innerhalb der IL-4 Bindestelle für γc and IL-13R1, jedoch außerhalb des Bindeepitops für IL-4R gezielt chemisch modifiziert. Im Gegensatz zu bereits existierenden Studien, die synthetische Gruppen wie Polyethylenglykol (PEG) zur chemischen Modifizierung von IL-4 nutzten, wurden in dieser Arbeit Glykane als natürliche Alternative zu PEG an IL-4 gekoppelt. Da sich Glykosylierung auf wichtige pharmakologische Eigenschaften proteinbasierter Therapeutika, wie Immunogenität oder Serum Halbwertszeit, positiv auswirken kann, würde der Zucker in dieser Strategie nicht nur den auf sterischer Hinderung basierenden inhibitorischen Effekt vermitteln, sondern könnte gleichzeitig zu einer Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften des IL-4 Inhibitors beitragen. Zur chemischen Zucker-Kopplung wurden zusätzliche Cystein-Reste in IL-4 eingebracht, deren freie Thiol-gruppen eine hochspezifische Modifizierung der IL-4 Mutanten erlauben. Die IL-4 Cystein-Mutanten wurden rekombinant in prokaryotischen und eukaryotischen Expressionssystemen hergestellt. Anschließend wurden verschiedene Strategien entwickelt, die eine ortsspezifische Kopplung Amin- und Thiol-haltiger Zucker an die eingebrachten Cystein-Reste in IL-4 ermöglichen. Eine Linker-basierte Reaktion, sowie ein Kopplungsansatz, der eine Aktivierung der Thiol-Gruppe mittels Bromselenobenzol erforderte, wiesen einige Nachteile auf, die eine erhebliche Einschränkung ihrer technischen Durchführbarkeit zur Folge hatte. Eine dritte Strategie hingegen, die eine Rückfaltung derIL-4 Cystein-Mutanten in Anwesenheit von Thiol-Glykanen involvierte, erlaubte eine effiziente Herstellung von IL-4 Glykokonjugaten in Form gemischter Disulfide im Milligrammbereich. Dieser Ansatz könnte somit zur Produktion homogen glykosylierter IL-4 Antagonisten im Großmaßstab eingesetzt werden. Die Herstellung homogener Glykokonjugate mit klar definierten Glykosylierungsmuster würde es erlauben über die gekoppelten Glykanstrukturen die pharmakologischen Eigenschaften von IL-4, wie Absorption und metabolische Stabilität, gezielt zu modulieren. Die hergestellten IL-4 Glykokonjugate erwiesen sich als hochwirksame Antagonisten, die die Aktivität von IL-4 und IL-13 in zellbasierten Experimenten inhibieren konnten. Glykosylierte IL-4 Antagonisten stellen somit eine vergleichbare Alternative zu gängigen IL-4 Inhibitoren dar, die zur Behandlung von atopischen Erkrankungen eingesetzt werden, wie beispielweise der neutralisierende anti-IL-4R Antikörper Dupilumab. KW - Glykosylierung KW - Modifizierung KW - Interleukin KW - Inhibitor KW - Entzündung KW - Glykomodifizierung KW - Interleukin-4 Antagonist KW - TH2 Immunantwort KW - Proteinmodifizierung KW - Rezeptorblocker Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175172 ER - TY - THES A1 - Kucka, Kirstin Michaela T1 - Charakterisierung eines neuen Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptor 2 (TNFR2) Agonisten: Der heteromere, membranständige Ligand Lymphotoxin α\(_2\)β T1 - Characterization of a novel tumor necrosis factor (TNF) receptor 2 (TNFR2) agonist: the heteromeric, membrane bound ligand lymphotoxin α\(_2\)β N2 - Seit mehr als zwei Jahrzehnten ist bekannt, dass nicht nur der Tumor Nekrose Faktor-α (=TNF-α) sondern auch Lymphotoxin-α (=LTα) in Form von Trimeren an TNFR1 und TNFR2 binden kann. Durch diese Fähigkeit an beide Rezeptoren zu binden, haben diese zwei Liganden eine essentielle Rolle in der Entwicklung und dem Verlauf von Autoimmunerkrankungen. Bereits mit Beginn der 1990er Jahren wurde gezeigt, dass LTα nicht nur in Form von Homotrimeren vorliegt, sondern auch mit dem verwandten TNF-Superfamilie Liganden Lymphotoxin β (=LTβ) Heterotrimere bilden kann. Hierbei lagern sich LTα und LTβ in Form von LTα2β und LTαβ2 zusammen. Die initialen Experimente mit diesen Heterotrimeren zeigten bereits Unterschiede von LTα2β und LTαβ2. Während LTα2β wie LTα an den TNFR1 bindet, kann LTαβ2 weder an TNFR1 noch TNFR2 binden und interagiert mit einem eigenen Rezeptor namens Lymphotoxin β Rezeptor (=LTβR). Da bereits zwei Liganden (TNF und LTα) für TNFR1 und TNFR2 bekannt waren, wurde LTα2β bis heute nicht weiter charakterisiert. LTαβ2 hingegen war lange Zeit der einzige bekannte Ligand für den LTβR, weshalb die LTαβ2-LTβR-Interaktion ausführlich untersucht wurde. Diese Arbeit fokusiert sich auf die Charakterisierung von LTα2β. Hierfür wurde die einzige bekannte Eigenschaft aus den 90er Jahren von LTα2β nämlich die Bindung an TNFR1 aufgegriffen und um die Rezeptoren TNFR2 und LTβR erweitert. Diese Arbeit zeigt, dass LTα2β nicht nur an den TNFR1, sondern auch an TNFR2 und schwach an LTβR bindet. Trotz der asymmetrischen Bindestellen kann membrangebundenes LTα2β TNFR1 und TNFR2 nicht nur binden, sondern ist auch in der Lage diese zu aktivieren. Diese Arbeit gibt erste Einblicke in die Komplexizität dieses Heterotrimers indem gezeigt wird, dass LTα2β sowohl in seiner löslichen als auch in seiner membrangebundenen Form den TNFR1 aktivieren kann, während der TNFR2 nur durch das membranständige LTα2β aktiviert wird. Aufgrund der aktivierenden Eigenschaften von membranständigem LTα2β und LTαβ2 auf die murine (=mu) Panc02-Zelllinie wird ein ersten Ausblick auf mögliche weitergehende Experimente in mausbasierten Modellen gegeben. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass mit membranständigem LTα2β ein neuer TNFR2 Agonist gefunden wurde. N2 - Since more than two decades it is known, that not only the Tumor Necrosis Factor-α (=TNF-α) but also lymphotoxin-a (=LTα) bind to TNFR1 and TNFR2. Because of their ability to interact with both of these two receptors, the two ligands play a crucial role in the development and persistence of autoimmune diseases. Already at the beginning of the 1990th, it has been shown that LTα forms homotrimers but is also able to form heterotrimers with the related TNF-Superfamily ligand lymphotoxin-β (=LTβ). Thereby, LTα and LTβ associate to form LTα2β and LTαβ2. Initial experiments already have shown differences between LTα2β and LTαβ2. While LTα2β can bind to TNFR1 like LTα, LTαβ2 can bind neither to TNFR1 nor to TNFR2 but interacts with its own receptor called LTβR. Due to the fact that already two ligands (LTα and TNF) for TNFR1 and TNFR2 were known, LTα2β was not further characterized. Since LTαβ2 was the only known ligand for the LTβR, this LTαβ2-LTβR interaction was further and intensively investigated. This work is focused on LTα2β and its characterization. For this purpose the initial and only finding reported for in the 1990th namely the binding to TNFR1 were taken up and expanded for the interaktion with TNFR2 and LTβR. The results of this work show that LTα2β can not only bind to TNFR1, but also to TNFR2 and weaker to LTβR. Despite its asymmetric binding sites, membrane bound LTα2β was shown not only to bind, but also to be able to activate TNFR1 and TNFR2. This work shows that LTα2β can activate the TNFR1 receptor in its soluble and membrane bound form while TNFR2 can only be activated by membrane bound LTα2β. Due to the activating properties of membrane bound LTα2β and LTαβ2 on murine (=mu) Panc02 cells a first outlook on further experiments in mouse based models will be given. These findings show, that membrane bound LTα2β is a new TNFR2 agonist. KW - Ligand KW - Agonist KW - Lymphotoxin KW - Ligand-Rezeptor-Interaktion KW - TNF Superfamilie KW - TNFR2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249824 ER - TY - THES A1 - von Meyer, Katharina T1 - Molecular characterization of defensin-like proteins in the fertilization process of \(Nicotiana\) \(tabacum\) T1 - Molekulare Charakterisierung Defensin-ähnlicher Proteine beim Befruchtungsvorgang in \(Nicotiana\) \(tabacum\) N2 - Flowering plants or angiosperms have developed a fertilization mechanism that involves a female egg and central cell, as well as two male sperm cells. A male gametophyte carries the two non-mobile sperm cells, as they need to be delivered to the female gametophyte, the embryo sac. This transport is initiated by a pollen grain that is transmitted onto the stigma of the angiosperm flower. Here it hydrates, germinates, and forms a pollen tube, which navigates through the female plant tissue towards the ovary. The pollen tube grows into an ovule through the funiculus and into one of the two synergid cells. There, growth arrests and the pollen tube bursts, releasing the two sperm cells. One of the sperm cells fuses with the egg cell, giving rise to the embryo, the other one fuses with the central cell, developing into the endosperm, which nourishes the embryo during its development. After a successful fertilization, each ovule develops into a seed and a fruit is formed. This usually consists of several fertilized ovules. The directional growth of the pollen tube through the maternal tissues towards the ovule, as well as sperm cell release, requires a complex communication between the male and the female gametophyte to achieve reproductive success. Over the last years many studies have been performed, contributing to the understanding of cell-cell communication events between the two gametophytes, nevertheless still many aspects remain to be elucidated. This work focused on two topics: i.) Analysis of biological processes affected by pollination and fertilization in the Nicotiana tabacum flower and identification of cysteine rich proteins (CRPs) expressed via isolating and sequencing RNA from the tissue and analyzing the resulting data. ii.) Identification of the defensin-like protein (DEFL) responsible for pollen tube attraction towards the ovule in tobacco. First, tissue samples of pollen tubes and mature ovules were taken at different stages of the fertilization process (unpollinated ovules, after pollination, and after fertilization of the flower). RNA was then isolated and a transcriptome was created. The resulting reads were assembled and transcriptome data analysis was performed. Results showed that pollen tubes and mature ovules differ severely from each other, only sharing about 23 % of the transcripts, indicating that different biological processes are dominant in the two gametophytes. A MapMan analysis revealed that in the pollen tube the most relevant biological processes are related to the cell wall, signaling, and transport, which supports the fact that the pollen tube grows fast to reach the ovule. On the other hand, in the ovule the values of highest significance were obtained for processes related to protein synthesis and regulation. Upon comparing the transcripts in the ovule before and after pollination, as well as after fertilization, it showed that pollination of the flower causes a bigger alteration in the ovule on the transcriptomic level compared to the step from pollination to fertilization. A total of 953 CRPs were identified in Nicotiana tabacum, including 116 DEFLs. Among those, the peptide responsible for pollen tube attraction towards the ovule should be found. Based on in-silico analysis four candidate peptides were chosen for further analysis, two of which had increased expression levels upon pollination and fertilization and the other two displayed an opposite expression. Quantitative real time PCR experiments were performed for the candidates, confirming the in-silico data in vivo. The candidate transcripts were then expressed in a cell free system and applied to pollen tubes in order to test their effect on the growing cells. Positive controls were used, where pollen tubes grew towards freshly dissected ovules. The four candidates did not provoke a pollen tube attraction towards the peptide, leaving open the chance to work on the 112 remaining DEFLs in the future. N2 - Für den Befruchtungsvorgang von Blütenpflanzen, bzw. Angiospermen werden je eine weibliche Eizelle und Zentralzelle, sowie zwei männliche Spermazellen benötigt. Da diese Spermazellen immobil sind, werden diese zum weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, transportiert. Dieser Vorgang wird eingeleitet, indem ein Pollenkorn auf die Narbe des Blütenstempels gelangt. Dort hydriert es, keimt aus und bildet einen Pollenschlauch aus, welcher sich mittels Richtungswachstum durch den Griffel zum Fruchtknoten der Pflanze hin ausdehnt. Der Pollenschlauch wächst daraufhin durch den Funikulus zu den Samenanlagen hin, in eine der beiden Synergiden hinein, wo das Zellwachstum eingestellt wird. Der Pollenschlauch platzt und die zwei Spermazellen werden freigegeben. Eine dieser Spermazellen verschmilzt mit der Eizelle, woraus ein Embryo entsteht, während die andere Spermazelle mit der Zentralzelle verschmilzt, die sich zum Endosperm entwickelt und den Embryo während seiner Entwicklung mit Nährstoffen versorgt. Nach einer erfolgreichen Befruchtung bildet sich aus jeder Eizelle ein Samen aus, in der Regel bilden mehrere befruchtete Eizellen dann einen Fruchtkörper. Eine erfolgreiche Fortpflanzung erfordert eine hochkomplexe Kommunikation zwischen männlichem und weiblichem Gametophyten, die sowohl beim Richtungswachstum des Pollenschlauchs durch das weibliche Pflanzengewebe hin zu den Samenanlagen eine essentielle Rolle spielt, als auch bei der Freisetzung der Spermazellen. Während der letzten Jahre wurden viele Studien durchgeführt, die zum Verstehen dieser Zell-Zell Kommunikation beigetragen haben, dennoch gibt es einige unbekannte Aspekte, die noch zu untersuchen sind. Diese Arbeit konzentriert sich auf zwei Themen: i.) Die Analyse der biologischen Prozesse, die von der Bestäubung und Befruchtung der Blüte in Nicotiana tabacum beeinflusst werden, sowie die Identifizierung von cysteinreichen Proteinen (CRPs), die während dieses Prozesses exprimiert werden. Hierfür wurde RNA aus dem Gewebe isoliert, sequenziert und die resultierenden Daten analysiert. ii.) Die Identifizierung des Defensin-ähnliche Proteins (DEFL), welches für das Anlocken des Pollenschlauchs zu den Samenanlagen hin in Tabak verantwortlich ist. Zunächst wurden Gewebeproben von Pollenschläuchen, sowie von reifen Samenanlagen in verschiedenen Stadien der Befruchtung entnommen (unbestäubte Samenanlagen, nach der Bestäubung und nach Befruchtung der Blüte). Von diesen Geweben wurde im Anschluss die RNA isoliert und ein Transkriptom erstellt. Die erhaltenen Sequenzfragmente wurden zusammengesetzt und die resultierenden Daten analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sich Pollenschläuche und Samenanlagen stark voneinander unterscheiden; nur 23 % der Transkripte wurden in beiden Geweben gefunden. Eine Untersuchung mit MapMan hat gezeigt, dass die relevantesten biologischen Prozesse im Pollenschlauch mit Zellwand, Signalwegen und Transportvorgängen assoziiert sind. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass der Pollenschlauch schnell wachsen muss, um die Spermazellen zu den Samenanlagen zu transportieren. In den Samenanlagen haben hingegen die Prozesse den höchsten Signifikanzwert, welche mit Proteinsynthese und –regulation zusammenhängen. Wenn man die Transkripte in den Samenanlagen vor der Bestäubung, nach der Bestäubung, sowie nach der Befruchtung betrachtet, stellt man fest, dass die Bestäubung mit einer größeren Veränderung auf Transkriptomlevel einhergeht als der Schritt zwischen Bestäubung und Befruchtung. Es konnten insgesamt 953 CRPs in Nicotiana tabacum identifiziert werden, wovon 116 DEFLs sind. Es sollte herausgefunden werden, welches dieser DEFLs für das Anlocken des Pollenschlauchs zu den Samenanlagen hin verantwortlich ist. Auf Basis von in-silico Analysen wurden vier Kandidatentranskripte ausgewählt, die näher untersucht wurden; bei zweien davon wurde ein ansteigendes Expressionsniveau bei Bestäubung und Befruchtung festgestellt; die anderen beiden Kandidaten zeigten ein gegensätzliches Expressionsmuster. Mittels quantitativer real-time PCR konnten die in-silico Daten in-vivo bestätigt werden. In einem zell-freien System wurden die Kandidatentranskripte exprimiert und auf Pollenschläuche gegeben, um ihren Effekt auf die wachsenden Zellen zu beobachten. Als Positivkontrollen wurden frisch präparierte Samenanlagen verwendet. Keines der vier Kandidatenproteine hat ein Anlocken der Pollenschläuche bewirkt, sodass noch die 112 verbleibenden DEFLs zur weiteren Untersuchung bereitstehen. KW - Samenpflanzen KW - Fortpflanzung KW - Plant fertilization KW - Fortpflanzungsmechanismen KW - Blütenpflanzen Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192141 ER - TY - THES A1 - Duan, Xiaodong T1 - Development of new channelrhodopsin versions with enhanced plasma membrane targeting and high calcium/sodium conductance T1 - Entwicklung neuer Channelrhodopsin-Versionen mit verbessertem Plasmamembrantargeting und hoher Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit N2 - The technique to manipulate cells or living animals by illumination after gene transfer of light-sensitive proteins is called optogenetics. Successful optogenetics started with the use of the light-gated cation channel channelrhodopsin-2 (ChR2). After early demonstrations of the power of ChR2, further light-sensitive ion channels and ion pumps were recruited to the optogenetic toolbox. Furthermore, mutations and chimera of ChR2 improved its versatility. However, there is still a need for improved optogenetic tools, e.g. with higher permeability for calcium or better expression in the plasma membrane. In this thesis, my work focuses on the design of highly functional channelrhodopsins with enhanced Na+ and Ca2+ conductance. First, I tested different N-terminal signal peptides to improve the plasma membrane targeting of Channelrhodopsins. We found that a N-terminal peptide, named LR, could improve the plasma membrane targeting of many rhodopsins. Modification with LR contributed to three to ten-fold larger photocurrents (than that of the original version) of multiple channelrhodopsins, like ChR2 from C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs, and the light-activated pump rhodopsins KR2, Jaw, HR. Second, by introducing point mutation, I could further improve the light sensitivity and photocurrent of different channelrhodopsins. For instance, ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 and PsChR D139H 2.0 exhibited hundred times larger photocurrents than wild type ChR2 and they show high light sensitivity. Also, the Ca2+ permeable channelrhodopsins PsCatCh 2.0f and PsCatCh 2.0e show very large photocurrents and fast kinetics. In addition, I also characterized a novel bi-stable CeChR (from the acidophilic green alga Chlamydomonas eustigma) with a much longer closing time. Third, I analysed the ion selectivity of different ChRs, which provides a basis for rational selection of channelrhodopsins for different experimental purposes. I demonstrate that ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff and CeChR are highly proton conductive, compared with wild type PsChR. Interestingly, Chronos has the lowest potassium conductance among these channelrhodopsins. Furthermore, I found that mutation of an aspartate in TM4 of ChR2 (D156) and PsChR (D139) to histidine obviously increased both the sodium and calcium permeability while proton conductance was reduced. PsChR D139H 2.0 has the largest sodium conductance of any published channelrhodopsin variants. Additionally, I generated PsCatCh 2.0e which exhibits a ten-fold larger calcium current than the previously reported Ca2+ transporting CrChR2 mutant CatCh. In summary, my research work 1.) described strategies for improving plasma membrane trafficking efficiency of opsins; 2.) yielded channelrhodopsins with fast kinetics or high light sensitivity; 3.) provided optogenetic tools with improved calcium and sodium conductance. We could also improve the performance of channelrhodopsins with distinct action spectra, which will facilitate two-color neural excitation, both in-vitro and in-vivo. N2 - Die Technik, Zellen oder lebende Tiere nach dem Gentransfer lichtempfindlicher Proteine durch Belichtung zu manipulieren, wird als Optogenetik bezeichnet. Erfolgreiche Optogenetik begann mit der Verwendung des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2). Nach frühen erfolgreichen Versuchen mit ChR2 wurden weitere lichtempfindliche Ionenkanäle und Ionenpumpen als optogenetische Werkzeuge etabliert. Darüber hinaus verbesserten Mutationen und Chimären von ChR2 seine Vielseitigkeit. Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an verbesserten optogenetischen Werkzeugen, z. mit höherer Permeabilität für Calcium oder besserer Expression in der Plasmamembran. In dieser Arbeit beschäftige ich mich mit dem Design hochfunktioneller Channelrhodopsine mit verbesserter Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit. Zuerst habe ich verschiedene N-terminale Signalpeptide getestet, um die Anreicherung von Channelrhodopsinen in der Plasmamembran (“Plasmamembran-Targeting”) zu verbessern. Wir fanden heraus, dass ein N-terminales Peptid namens LR das Plasmamembran-Targeting vieler Rhodopsine verbessern kann. Die Modifikation mit LR trug zu drei- bis zehnfach größeren Photoströmen (als die der Originalversion) von mehreren Channelrhodopsinen bei, wie ChR2 von C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs und der lichtaktivierten Pump-Rhodopsine KR2, Jaw, HR. Zweitens konnte ich durch Mutagenese die Lichtempfindlichkeit und/oder den Photostrom verschiedener Channelrhodopsine weiter verbessern. Beispielsweise zeigten ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 und PsChR D139H 2.0 hundertmal größere Photoströme als Wildtyp-ChR2 und sie zeigen eine hohe Lichtempfindlichkeit. Auch die Ca2+-permeablen Kanalrhodopsine PsCatCh 2.0f und PsCatCh 2.0e zeigen sehr große Photoströme und eine schnelle Kinetik. Außerdem habe ich ein neues bistabiles CeChR (aus der azidophilen Grünalge Chlamydomonas eustigma) mit einer viel längeren Schließzeit charakterisiert. Drittens analysierte ich die Ionenselektivität verschiedener ChRs, die eine Grundlage für die rationale Selektion von Channelrhodopsinen für verschiedene experimentelle Zwecke bietet. Ich zeige, dass ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff und CeChR im Vergleich zu Wildtyp-PsChR eine hohe Protonenleitfähigkeit aufweisen. Interessanterweise weist Chronos die niedrigste Kaliumleitfähigkeit unter diesen Channelrhodopsinen auf. Außerdem fand ich, dass die Mutation eines Aspartats in TM4 von ChR2 (D156) und PsChR (D139) zu Histidin offensichtlich sowohl die Natrium- als auch die Calciumpermeabilität erhöht, während die Protonenleitfähigkeit verringert ist. PsChR D139H 2.0 weist die größte Natriumleitfähigkeit aller veröffentlichten Channelrhodopsin-Varianten auf. Zusätzlich erzeugte ich PsCatCh 2.0e, das einen zehnmal größeren Calciumstrom als die zuvor berichtete Ca2+-transportierende CrChR2-Mutante CatCh aufweist. Zusammenfassend ergab meine Dissertationsarbeit: 1.) Strategien zur Verbesserung der Expression von Opsinen in der Plasmamembran; 2.) Gut exprimierende Channelrhodopsine mit schneller Kinetik oder hoher Lichtempfindlichkeit; 3.) Neue optogenetische Werkzeuge mit verbesserter Calcium- und Natriumleitfähigkeit. Auch konnte ich die Leistung von Channelrhodopsinen mit unterschiedlichen Aktionsspektren verbessern, was die zweifarbige neuronale Anregung sowohl in vitro als auch in vivo erleichtern sollte. KW - Optogenetik KW - Channelrhodopsinen KW - optogenetic KW - channelrhodopsin KW - molecular engineering KW - voltage clamp Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188397 ER - TY - THES A1 - Bergmann Bueno, Amauri T1 - Ecophysiological adaptations of cuticular water permeability of plants to hot arid biomes T1 - Ökophysiologische Anpassungen der kutikulären Wasserpermeabilität von Pflanzen an heiße aride Biome N2 - Arid environments cover almost one-third of the land over the world. Plant life in hot arid regions is prone to the water shortage and associated high temperatures. Drought-stressed plants close the stomata to reduce water loss. Under such conditions, the remaining water loss exclusively happens across the plant cuticle. The cuticular water permeability equals the minimum and inevitable water loss from the epidermal cells to the atmosphere under maximally stomatal closure. Thus, low cuticular water permeability is primordial for plant survival and viability under limited water source. The assumption that non-succulent xerophytes retard water loss due to the secretion of a heavier cuticle is often found in the literature. Intuitively, this seems to be plausible, but few studies have been conducted to evaluate the cuticular permeability of xerophilous plants. In chapter one, we investigated whether the cuticular permeability of Quercus coccifera L. grown in the aridest Mediterranean-subtype climate is indeed lower than that of individuals grown under temperate climate conditions. Also, the cuticular wax chemical compositions of plants grown in both habitats were qualitatively and quantitatively analysed by gas-chromatography. In few words, our findings showed that although the cuticular wax deposition increased in plants under Mediterranean climate, the cuticular permeability remained unaltered, regardless of habitat. The associated high temperatures in arid regions can drastically increase the cuticular water permeability. Thereby, the thermal stability of the cuticular transpirational barrier is decisive for safeguarding non-succulent xerophytes against desiccation. The successful adaptation of plants to hot deserts might be based on finding different solutions to cope with water and heat stresses. Water-saver plants close the stomata before the leaf water potential drastically changes in order to prevent damage, whereas water-spender plants reduce the leaf water potential by opening the stomata, which allow them to extract water from the deep soil to compensate the high water loss by stomatal transpiration. In chapter two, we compare the thermal stability of the cuticular transpiration barrier of the desert water-saver Phoenix dactylifera L. and the water-spender Citrullus colocynthis (L.) Schrad. In short, the temperature-dependent increase of the cuticular permeability of P. dactylifera was linear over the whole temperature range (25-50°C), while that of C. colocynthis was biphasic with a steep increase at temperatures ≥ 40°C. This drastic increase of cuticular permeability indicates a thermally induced breakdown of the C. colocynthis cuticular transpiration barrier, which does not occur in P. dactylifera. We further discussed how the specific chemical composition of the cutin and cuticular waxes might contribute to the pronounced thermal resistance of the P. dactylifera cuticular transpiration barrier. A multitude of morpho and physiological modifications, including photosynthetic thermal tolerance and traits related to water balance, led to the successful plant colonisation of hot arid regions over the globe. High evaporative demand and elevated temperatures very often go along together, thereby constraining the plant life in arid environments. In chapter 3, we surveyed cuticular permeability, leaf thermal tolerance, and cuticular wax chemical composition of 14 non-succulent plant species native from some of the hottest and driest biomes in South-America, Europe, and Asia. Our findings showed that xerophilous flowering plants present high variability for cuticular permeability and leaf thermal tolerance, but both physiological features could not be associated with the species original habitat. We also provide substantial evidence that non-succulent xerophytes with more efficient cuticular transpirational barrier have higher leaf thermal tolerance, which might indicate a potential coevolution of these features in hot arid biomes. We further discussed the efficiency of the cuticular transpiration barrier in function to the cuticular wax chemical composition in the general discussion section. N2 - Trockene Trockene Lebensräume bedecken fast ein Drittel der Landoberfläche der Erde. Das Pflanzenleben in Trockengebieten ist durch Wasserknappheit und hohe Temperaturen gekennzeichnet. Durch Trockenheit beanspruchte Pflanzen schließen die Stomata, um den Wasserverlust zu reduzieren. Unter diesen Bedingungen erfolgt der verbleibende Wasserverlust ausschließlich über die pflanzliche Kutikula. Die kutikuläre Wasserpermeabilität entspricht dem minimalen und unvermeidbaren Wasserverlust aus den Epidermiszellen an die Atmosphäre. Daher ist eine niedrige kutikuläre Wasserpermeabilität für die Lebensfähigkeit der Pflanzen unter begrenzter Wasserverfügbarkeit entscheidend. Die Annahme, dass xerophile Pflanzen den Wasserverlust aufgrund der Ausbildung einer speziellen Kutikula verringern, findet sich häufig in der Literatur. Intuitiv erscheint dies plausibel, jedoch wurden nur wenige Studien durchgeführt, um die kutikuläre Wasserpermeabilität von xerophilen Pflanzen zu untersuchen. Im ersten Kapitel wurde getestet, ob die kutikuläre Wasserpermeabilität von Quercus coccifera L., angezogen im ariden Klima des mediterranen Subtyps, tatsächlich geringer ist als die von Pflanzen derselben Art, die unter gemäßigten Klimabedingungen kultiviert wurden. Außerdem wurde die chemische Zusammensetzung der kutikulären Wachse von Pflanzen, die in beiden Habitaten angezogen wurden, quantitativ und qualitativ durch Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion- beziehungsweise Massenspektrometrie-Kopplung analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die kutikuläre Wasserpermeabilität unter beiden Anzuchtbedingungen vergleichbar war, obwohl die Pflanzen, die unter dem mediterranen Klima wuchsen, eine höhere Menge an kutikulären Wachsen aufwiesen. Die hohen Temperaturen in trockenen Regionen können die Wasserdurchlässigkeit der pflanzlichen Kutikula drastisch erhöhen. Dabei ist die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere entscheidend für den Austrocknungsschutz xerophiler Pflanzen. Die erfolgreiche Anpassung von Wüstenpflanzen kann auf verschiedenen Strategien zur Bewältigung von Wassermangel und Hitze beruhen. Wassersparende Pflanzen (water-save plants) schließen die Stomata, bevor sich das Wasserpotenzial drastisch ändert, um Schädigungen zu verhindern. Wasserverschwendende Pflanzen (water-spender plants) reduzieren das Wasserpotenzial durch das Öffnen der Stomata. Dadurch können diese Pflanzen Wasser aus tiefen Bodenschichte nachziehen, um den hohen stomatären Wasserverlust zu kompensieren. Im zweiten Kapitel wurde die thermische Stabilität der kutikulären Transpirationsbarriere der beiden Wüstenpflanzen Phoenix dactylifera L. (saver) und Citrullus colocynthis (L.) Schrad. (spender) verglichen. Der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von P. dactylifera verlief linear über einen Temperaturbereich von 25°C bis 50°C. Dagegen war der temperaturabhängige Anstieg der kutikulären Wasserpermeabilität von C. colocynthis zweiphasig. Der steile Anstieg der kutikulären Permeabilität bei Temperaturen ≥ 35°C weist auf eine thermisch induzierte Schädigung der kutikulären Transpirationsbarriere hin. Die spezielle chemische Zusammensetzung der Kutinmatrix und der kutikulären Wachse trägt zur ausgeprägten thermischen Resistenz der kutikulären Transpirationsbarriere von P. dactylifera bei. Die erfolgreiche Besiedlung von heißen und trockenen Regionen der Erde beruht auf einer Vielzahl von morphologischen und physiologischen Anpassungen wie der fotosynthetischen Hitzetoleranz. Eine hohe Verdunstungskapazität und hohe Temperaturen treten oft zusammen auf, wodurch das Pflanzenleben in ariden Klimazonen eingeschränkt wird. In Kapitel 3 wurde die kutikuläre Wasserpermeabilität, die kutikuläre Wachszusammensetzung sowie die fotosynthetische Hitzetoleranz von 14 nicht-sukkulenten Pflanzenarten aus einigen der heißesten und trockensten Biome Südamerikas, Europas und Asiens untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die ausgewählten xerophilen Pflanzen eine hohe Variabilität in der kutikulären Wasserpermeabilität und der fotosynthetischen Hitzetoleranz aufwiesen. Beide physiologischen Merkmale konnten jedoch nicht mit dem ursprünglichen Standort der Arten assoziiert werden. Dennoch weisen xerophile Pflanzen mit einer effizienteren kutikulären Transpirationsbarriere eine höhere Hitzetoleranz auf, was auf eine mögliche Koevolution dieser Merkmale in trockenen Biomen hinweisen könnte. Darüber hinaus wurde die Effizienz der kutikulären Transpirationsbarriere in Zusammenhang mit der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse diskutiert KW - Plant cuticle KW - Arid biomes KW - Cuticular transpiration KW - Cuticular waxes KW - Water stress KW - Heat stress Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167832 ER - TY - THES A1 - Seufert, Pascal T1 - Chemical and physical structure of the barrier against water transpiration of leaves: Contribution of different wax compounds T1 - Chemischer und physikalischer Aufbau der Wassertranspirationsbarriere von Blättern: Beitrag verschiedener Wachskomponenten N2 - The cuticle is constituted of the biopolymer cutin and intra- and epicuticular waxes. In some cases, it has epicuticular wax crystals, protruding from the epicuticular wax film. One of the most important tasks is protection against desiccation. Many investigations were conducted to find the transport limiting component of the cuticle. It is evidentially confirmed that the waxes form this barrier. These waxes are multifactorial blends made of very-long-chain aliphatic (VLCA) compounds and triterpenoids (TRP). The VLCAs were proposed to constitute the transpiration barrier to water. However, experimental confirmation was lacking so far. The present study focuses on the development of a method to selectively extract TRPs from the cuticle and the impact of the removal on the transpiration barrier. The plants deployed in this study exhibited several features. They had no epicuticular crystals on their surfaces, were astomatous, had a rather durable and possibly isolatable cuticle. A broad range of wax compositions was covered from plants with no TRP content and low wax load like Hedera helix and Zamioculcas zamiifolia to plants with high TRP content and high wax load like Nerium oleander. The selective extraction was conducted using a sequence of solvents. TRPs were extracted almost exhaustively from CMs with the first MeOH extract. Only a minor amount of shorter chained VLCAs was obtained. The remaining waxes, consisting mostly of VLCAs and some remnant TRPs, were removed with the following TCM extract. After the extractions, the water permeance of native cuticular membranes (CM), MeOH extracted (M) and dewaxed cuticular discs (MX) was investigated gravimetrically. Compared to the water permeance of CMs, Ms showed no or only a small increase in water conductance. MXs, however, always showed strongly increased values. The knowledge about the wax compounds constituting the transport-limiting properties is vital for different projects. For various issues, it would be favourable to have a standardized wax mixture as an initial point of research. It could be used to develop screening procedures to investigate the impact of adjuvants on cuticular waxes or the influence of wax constituents on the properties of cuticular waxes. This work concentrated on the development of an artificial wax mixture, which mimics the physical properties of a plant leaf wax sufficiently. As target wax, the leaf wax of Schefflera elegantissima was chosen. The wax of this plant species consisted almost exclusively of VLCAs, had a rather simple composition regarding compound classes and chain length distribution and CMs could be isolated. Artificial binary, ternary and quaternary waxes corresponding to the conditions within the plant wax were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD) techniques and Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phase diagrams were mapped out for a series of binary, ternary and quaternary wax mixtures. FTIR experiments were conducted using, ternary and a quaternary artificial wax blends. The blends were chosen to represent the conditions within the wax of the adaxial CM plant wax. The FTIR experiments exhibited an increasing resemblance of the artificial wax to the plant wax (adaxial CM wax) with an increasing number of compounds in the artificial wax. The same trend was found for DSC thermograms. Thermograms of ternary and quaternary blends exhibited more overlapping peaks and occurred in a temperature range more similar to the range of the whole leaf plant wax. The XRD spectrum at room temperature showed good conformity with the quaternary blend. The current work illustrates a method for selective extraction of TRPs from isolated CMs. It gives direct experimental proof of the association of the water permeance barrier with the VLCA rather than to the TRPs. Furthermore, the possibility to mimic cuticular waxes using commercially available wax compounds is investigated. The results show promising feasibility for its viability, enabling it to perform as a standardized initial point for further research (e.g. to examine the influence of different constituents on waxes), revealing valuable knowledge about the structure and the chemistry-function relationship of cuticular waxes. N2 - Die Kutikula ist eine der vielen Anpassungen, die Pflanzen entwickelten um nach der Besiedelung des Landes mit den Herausforderungen ihrer neuen Umgebung fertig zu werden. Sie überzieht überirdische Pflanzenorgane, wie Blüten oder Blätter und erfüllt verschiedene Aufgaben. Hierzu besteht sie aus dem biopolymer Kutin und intra- sowie epikutikulären Wachs. Studien, die sich mit der Lokalisierung der transporteinschänkenden Barriere beschäftigten, zeigten, dass die Wachse sie bilden. Diese sind vielschichtige Mischungen aus langkettigen aliphatischen Verbindungen (VLCA) und pentazyklischen Verbindung wie Triterpenen (TRP). Es wird davon ausgegangen, dass VLCAs die Barriere aufbauen, ein direkter experimenteller Nachweis dafür wurde jedoch noch nicht erbracht. In dieser Arbeit wurde daher ein Verfahren zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen (CM) entwickelt und deren Auswirkung auf die Transpirationsbarriere untersucht. Die untersuchten Pflanzen wiesen keine epikutikuläre Kristalle auf, hatten keine Stomata auf der Kutikula der Blattoberseite und es war möglich ihre Kutikula zu isolieren. Die Zusammensetzung der Wachse variierte von wenig Wachs ohne TRPs (z. B. Hedera helix, Zamioculcas zamiifolia) hin zu pflanzen mit großer Wachsmenge und hohem TRP- Anteil (Nerium oleander). Die selektive Extraktion wurde durch die sequenzielle Nutzung zweier Lösemittel erreicht. TRPs wurden fast vollständig mit Methanol (MeOH) entfernt, während VLCAs überwiegend nur mit Chloroform (TCM) extrahiert werden konnten. Die gravimetrische Bestimmung der Wassertranspiration von unbehandelten, mit Methanol extrahierten (M) und entwachsten Membranen (MX) in Transpirationskammern zeigte bei allen untersuchten Pflanzenarten einen einheitlichen Trend auf. Im Vergleich zu CMs erhöhte sich die Transpirationsrate bei Ms nicht oder nur geringfügig, während bei MXs ein starker Anstieg festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse stellen den ersten direkten experimentellen Nachweis der Verbindung von VLCAs zur Transpirationsbarriere kutikulärer Wachse dar. Mit dem Wissen, sich bei der Untersuchung der Permeation durch die Kutikula sich nur auf die VLCA Fraktion beschränken zu müssen können weitere Projekte effizient angegangen werden. Ein leicht erhältliches Standartwachsgemisch könnte Ausgangspunkt für die Untersuchung des Einflusses verschiedener Pflanzenwachskomponenten auf deren physikalische Eigenschaften dienen. Als Zielwachs diente das Blattwachs von Schefflera elegantissima. Es bestand fast ausschließlich aus VLCAs, hatte eine recht einfache Zusammensetzung bezüglich der Stoffklassen und Kettenlängenverteilung und die Kutikula war isolierbar. Mit Hilfe von dynamische Differentialkalorimetrie (DSC), Röntgenbeugung (XRD) und Fouriertransformierter Infrarot (FTIR) Spektroskopie wurden binäre, ternäre und quaternäre Gemische, die Verhältnisse im Pflanzenwachs wiederspiegelten, untersucht und Phasendiagramme erstellt. Phasendiagramme wurden von einer Reihe der binären Gemische, bestehend aus Alkanen oder Alkoholen, ternären Gemischen aus zwei Alkanen und einem Alkohol und quaternären Gemischen aus zwei Alkanen und zwei Alkoholen erstellt. FTIR-spektroskopische Versuche zeigten mit zunehmender Komponentenzahl eine erhöhte Ähnlichkeit der artifiziellen Wachse zum Pflanzenwachs (adaxiale isolierte Kutikula). Ein ähnlicher Trend wurde für die Ähnlichkeit der Thermogramme der artifiziellen Gemische zum Pflanzenwachs (aus dem Extrakt ganzer Blätter) ersichtlich. Das Diffraktogramm des quaternären Waches stimmte auf Raumtemperatur gut mit dem des Pflanzenwachses (adaxiale isolierte Kutikula) ein. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen. Sie zeigt einen direkten experimentellen Nachweis für die Assoziation der Transpirationsbarriere zu den VLCAs und nicht zu den TRPs. Zusätzlich wird die Möglichkeit kutikulare Wachse mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Wachskomponenten nachzustellen untersucht, was vielversprechende Ergebnisse liefert. Dieses Wachs könnte daher als standardisierter Ausgangspunkt für weitere Experimente (z. B. zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Wachskomponenten auf dessen physikalische Eigenschaften) dienen. Dies könnte wertvolle Informationen über die Struktur und die Beziehung zwischen chemischer Zusammensetzung und der Funktion kutikulärer Wachse liefern. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - FT-IR-Spektroskopie KW - Differential scanning calorimetry KW - Very-long-chain aliphatic KW - X-ray diffraction KW - Selective extraction Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208963 ER - TY - THES A1 - Scheide-Nöth, Jan-Philipp T1 - Activation of the Interleukin-5 receptor and its inhibition by cyclic peptides T1 - Aktivierung des IL-5 Rezeptors und dessen Inhibierung durch zyklische Peptide N2 - The cytokine interleukin-5 (IL-5) is part of the TH2-mediated immune response. As a key regulator of eosinophilic granulocytes (eosinophils), IL-5 controls multiple aspects of eosinophil life. Eosinophils play a pathogenic role in the onset and progression of atopic diseases as well as hypereosinophilic syndrome (HES). Here, cytotoxic proteins and pro-inflammatory mediators stored in intracellular vesicles termed granula are released upon activation thereby causing local inflammation to fight the pathogen. However, if such inflammation persists, tissue damage and organ failure can occur. Due to the close relationship between eosinophils and IL-5 this cytokine has become a major pharmaceutical target for the treatment of atopic diseases or HES. As observed with other cytokines, IL-5 signals by assembling a heterodimeric receptor complex at the cell surface in a stepwise mechanism. In the first step IL-5 binds to its receptor IL-5Rα (CD125). This membrane-located complex then recruits the so-called common beta chain βc (CD131) into a ternary ligand receptor complex, which leads to activation of intracellular signaling cascades. Based on this mechanism various strategies targeting either IL-5 or IL-5Rα have been developed allowing to specifically abrogate IL-5 signaling. In addition to the classical approach of employing neutralizing antibodies against IL 5/IL-5Rα or antagonistic IL-5 variants, two groups comprising small 18 to 30mer peptides have been discovered, that bind to and block IL-5Rα from binding its activating ligand IL-5. Structure-function studies have provided detailed insights into the architecture and interaction of IL-5IL-5Rα and βc. However, structural information for the ternary IL-5 complex as well as IL-5 inhibiting peptides is still lacking. In this thesis three areas were investigated. Firstly, to obtain insights into the second receptor activation step, i.e. formation of the ternary ligand-receptor complex IL-5•IL-5Rα•βc, a high-yield production for the extracellular domain of βc was established to facilitate structure determination of the ternary ligand receptor assembly by either X-ray crystallography or cryo-electron microscopy. In a second project structure analysis of the ectodomain of IL-5Rα in its unbound conformation was attempted. Data on IL-5Rα in its ligand-free state would provide important information as to whether the wrench-like shaped ectodomain of IL-5Rα adopts a fixed preformed conformation or whether it is flexible to adapt to its ligand binding partner upon interaction. While crystallization of free IL-5Rα failed, as the crystals obtained did not diffract X rays to high resolution, functional analysis strongly points towards a selection fit binding mechanism for IL-5Rα instead of a rigid and fixed IL-5Rα structure. Hence IL-5 possibly binds to a partially open architecture, which then closes to the known wrench-like architecture. The latter is then stabilized by interactions within the D1-D2 interface resulting in the tight binding of IL-5. In a third project X-ray structure analysis of a complex of the IL-5 inhibitory peptide AF17121 bound to the ectodomain of IL-5Rα was performed. This novel structure shows how the small cyclic 18mer peptide tightly binds into the wrench-like cleft formed by domains D1 and D2 of IL-5Rα. Due to the partial overlap of its binding site at IL-5Rα with the epitope for IL-5 binding, the peptide blocks IL-5 from access to key residues for binding explaining how the small peptide can effectively compete with the rather large ligand IL-5. While AF17121 and IL-5 seemingly bind to the same site at IL-5Rα, functional studies however showed that recognition and binding of both ligands differ. With the structure for the peptide-receptor complex at hand, peptide design and engineering could be performed to generate AF17121 analogies with enhanced receptor affinity. Several promising positions in the peptide AF17121 could be identified, which could improve inhibition capacity and might serve as a starting point for AF17121-based peptidomimetics that can yield either superior peptide based IL-5 antagonists or small-molecule-based pharmacophores for future therapies of atopic diseases or the hypereosinophilic syndrome. N2 - Das Zytokin Interleukin-5 (IL-5) nimmt eine zentrale Rolle im Zellzyklus von eosinophlien Granulozyten (Eosinophile) ein, indem es beispielsweise die Differenzierung, Aktivierung und Apoptose dieser Zellen steuert. Als Immunantwort auf Pathogene kommt es zur Aktivierung von Eosinophilen. Dieses führt zur Freisetzung von in intrazellulären Vesikeln (Granula) gespeicherten zytotoxischen Proteinen und proinflammatorischen Mediatoren, wodurch lokale Entzündungen verursacht werden, um den Erreger zu bekämpfen. Fehlregulationen (übermäßige Produktion) von eosinophilen Granulozyten können zu Gewebeschäden und Organversagen führen, wenn diese über einen längeren Zeitraum bestehen, und sind insbesondere mit dem Ausbruch und Fortschreiten von atopischen Erkrankungen sowie dem Hypereosinophilen Syndrom (HES) assoziiert. IL-5 muss, um die Eosinophilen aktivieren zu können, an einen heterodimeren Transmembranrezeptor binden. Im ersten Schritt bindet IL-5 an seinen zytokin-spezifischen Rezeptor IL-5Rα (CD125). Dieser membrangebundene Komplex rekrutiert dann die sogenannte gemeinsame („common“) beta-Kette βc (CD131) in einen ternären Liganden Rezeptorkomplex, was zur Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden führt. Aufgrund dieser engen Beziehung zwischen Eosinophilen und IL-5 ist dieses Zytokin in den Fokus der pharmazeutischen Industrie für die Behandlung atopischer Erkrankungen oder HES gerückt. Bisherige Therapien basieren auf der Unterdrückung der Immunreaktion durch Corticosteroide, neutralisierende gegen IL 5/IL-5Rα gerichtete Antikörper oder antagonistische IL-5 Varianten. Eine alternative Therapiemöglichkeit stellen IL-5 inhibierende Peptide dar, welche an IL 5Rα binden und hierbei die Bindung des aktivierenden Liganden (IL-5) hemmen. Derzeit stehen Strukturen vom binären IL-5IL-5Rα Komplex und von βc im ungebundenen Zustand zur Verfügung. Zudem konnten wichtige Wechselwirkungen im binären Komplex identifiziert werden. Allerdings sind vom ternären IL-5 Komplex und den IL-5 inhibierenden Peptiden keinerlei Strukturdaten bekannt. Um im Rahmen dieser Arbeit Einblicke in den zweiten Rezeptoraktivierungsschritt, d.h. die Bildung des ternären Ligand-Rezeptor Komplexes IL-5•IL-5Rα•βc, zu erhalten, wurde ein Herstellungsverfahren für die extrazelluläre Domäne von βc etabliert. Zusammen mit den optimierten Reinigungsverfahren für IL-5 und IL 5Rα konnte hiermit eine gute Grundlage für zukünftige Strukturanalysen des ternären IL-5 Komplexes geschaffen werden. In einem zweiten Projekt wurde versucht, die Struktur der Ektodomäne von IL 5Rα in ihrem freien Zustand aufzuklären. Diese Strukturdaten würden wichtige Informationen darüber liefern, ob die bisher bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur der IL-5Rα Ektodomäne in einer rigiden, vorgebildeten Konformation vorliegt, oder ob die Architektur der Ektodomäne bei Bindung flexibel an ihren Liganden angepasst wird. Während die Kristallisation von IL-5Rα ohne einen Bindepartner fehlschlug, deuten neue Funktionsanalysen auf einen „selection fit binding mechanism“ für IL-5Rα hin. Der relativ große Ligand IL-5 bindet daher sehr wahrscheinlich an eine teilweise „offene“ Rezeptorkonformation, die erst nach Bindung die bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur annimmt. In einem dritten Projekt wurde eine Strukturanalyse des Komplexes des IL-5 inhibierenden AF17121 Peptids gebunden an die Ektodomäne von IL-5Rα durchgeführt. Anhand dieser neuen Struktur lässt sich erklären, wie das kleine zyklische 18mer Peptid effektiv mit dem wesentlich größeren Liganden IL-5 um die Bindung am Rezeptor konkurrieren kann. Aufgrund der Überlappung der Bindestellen von AF17121 und IL-5 am Rezeptor IL 5Rα blockiert das Peptid den Zugang von IL-5 an seinen Rezeptor. Obwohl AF17121 und IL-5 in einem ähnlich Strukturbereich in IL-5Rα binden, zeigen funktionelle Studien, dass sich Erkennung und Bindung beider Liganden unterscheiden. Mit der vorliegenden Struktur vom Peptid Rezeptor Komplex konnte ein strukturbasiertes Peptid-Design durchgeführt und so AF17121 Varianten mit verbesserter Rezeptorbindung erzeugt werden. Dabei wurden mehrere Positionen im Peptid AF17121 identifiziert, die dessen Inhibierungseigenschaften möglicherweise verbessern. Somit konnte ein weiterer Grundstein für die Entwicklung von effektiveren Peptid-basierten IL 5 Antagonisten oder sogar nicht-peptidischen Inhibitoren für zukünftige Therapieansätze gegen atopische Erkrankungen oder HES gelegt werden. KW - Interleukin 5 KW - Eosinophiler Granulozyt KW - atopic diseases KW - eosinophil KW - interleukin-5 signaling KW - peptide-based interleukin-5 inhibitor KW - peptide engineering KW - receptor KW - functional studies KW - structure analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182504 ER - TY - THES A1 - Lange, Manuel T1 - Mutanten im RES-Oxylipin Signalweg von \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Mutants in RES-Oxylipin Signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Reaktive elektrophile Spezies-Oxylipine (RES-Oxylipine) finden sich in Pflanzen- und Tierzellen und zeichnen sich durch eine für sie typische Anordnung von Atomen aus: einer α,β ungesättigten Carbonyl Gruppe. In Pflanzenzellen gehören unter anderem 2-(E)-Hexenal und die Vorstufe der Jasmonsäure 12-Oxophytodiensäure (OPDA) zu den RES-Oxylipinen, in Tierzellen z.B. Prostaglandin A1 (PGA). RES-Oxylipine üben Signalfunktionen aus, wie dies in Pflanzenzellen funktioniert ist jedoch noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit ist dabei einen möglichen RES-Oxylipin Signalweg aufzuklären und die beteiligten Gene zu identifizieren. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Expressionsrate von bestimmten Genen wie z.B. GST6 durch RES-Oxylipine spezifisch induziert wird. Zur Untersuchung des RES-Oxylipin Signalweges wurde der GST6 Promotor vor das Luciferase-Gen fusioniert, um so ein RES-Oxylipin spezifisches Reportersystem zu erhalten. Die Ethylmethansulfonat mutagenisierten Linien wurden auf geänderte Luciferase-Aktivität hin untersucht. Dabei wurden drei Mutanten isoliert, die in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Eine zeigte basal erhöhte Luciferase-Aktivität (constitutive overexpresser 3 = coe3) und die anderen beiden erniedrigte Luciferase-Aktivität nach PGA Gabe (non responsive 1 und 2 = nr1 und nr2). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phänotypen in allen 3 Mutanten rezessiv vererbt werden und die Mutanten nicht zueinander allel sind. Zudem war die veränderte Luciferase-Aktivität nicht durch geänderte Phytohormonspiegel oder durch Mutationen im GST6 Promotor erklärbar. Auf die Gabe von RES, wie Benzylisothiocyanat oder Sulforaphan, sowie auf endogene RES-Oxylipine, wie OPDA und Hexenal, reagierten die Mutanten auf ähnliche Weise, wie nach PGA Gabe. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass sich die drei Mutanten stark voneinander unterschieden. Das Transkriptom kontrollbehandelter coe3 Pflanzen unterschied sich stark von dem der GST6::LUC Pflanzen. Die Mutante war trockenstressresistenter zudem war sie sensibler gegenüber NaCl, was jedoch nicht von einer veränderten Reaktion auf Abscisinsäure herrührte. Des Weiteren war der Chlorophyllabbau bei dunkel inkubierten Blättern geringer. Bei der Lokalisierung der Mutation, die noch nicht abgeschlossen ist, konnten Chromosom 2 und 5 als die wahrscheinlichsten Kandidaten ermittelt werden. Weitere Analysen sind nötig um den Bereich weiter eingrenzen zu können. Die Mutante nr1, die sich durch verminderte Reaktion auf RES-Oxylipine auszeichnete, zeigte einen kleineren Wuchs und ein deutlich verzögertes Blühen. Außerdem wies die Mutante erhöhte Argininspiegel in ihren Blättern auf. Das Transkriptom unterschied sich sowohl bei kontrollbehandelten, als auch bei PGA behandelten nr1 Pflanzen massiv von denen der gleichbehandelten Kontrollen. Auch die nr1 schien trockenstressresistenter zu sein, sie war im Gegensatz zur coe3 aber robuster gegenüber höheren Konzentrationen an NaCl. Mit Hilfe eines „Next Generation Genome-Mappings“ war es möglich die Mutation am Ende von Chromosom 3 zu lokalisieren und auf fünf mögliche Gene einzugrenzen. Weitere Untersuchungen müssen nun klären, welches dieser Gene ursächlich für den Phänotyp der geänderten Luciferase-Aktivität ist. Die zweite Mutante mit einer reduzierten Reaktion auf RES-Oxylipine war die nr2. Überraschender Weise unterschied sich das Transkriptom kontrollbehandelter nr2 Pflanzen deutlich stärker von dem der gleichbehandelten GST6::LUC Pflanzen, als das nach PGA Gabe der Fall war. Sie reagierte nur mit sehr schwacher Luciferase-Aktivität auf Verwundung und war zudem deutlich sensibler gegenüber Trockenheit. Für eine zukünftige Lokalisation der ursächlichen Mutation wurden entsprechende Kreuzungen durchgeführt aus deren Samen jederzeit mit einer Selektionierung begonnen werden kann. Mit dieser Arbeit konnte ein erster großer Schritt in Richtung Identifikation der, für die geänderte Luciferase-Aktivität, verantwortlichen Mutation gemacht werden, sowie erste Reaktionen der Mutanten auf abiotische Stressfaktoren untersucht werden. Somit ist man der Entdeckung von Signaltransduktionsfaktoren, die RES-Oxylipinabhängig reguliert werden, einen wichtigen Schritt näher gekommen. N2 - Reactive electrophilic species oxylipins (RES-oxylipins) can be found in plant and animal cells and contain an α,β unsaturated carbonyl group. In plant cells 2-(E)-hexenal and 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA), the precursor of jasmonic acid, belong to the RES-oxylipins, in animal cells prostaglandin A1 (PGA). RES-oxylipins play an important role in signal transduction but it is still unknown how this functions in plant cells. In previous publications, it could be shown, that RES-oxylipins induce the expression of certain genes like GST6 specifically. To further investigate the possibility of a RES-oxylipin pathway the GST6 promotor was fused to the luciferase gene to get a RES-oxylipin sensitive reporter system. The ethyl methanesulfonate (EMS) mutagenized lines were screened for altered luciferase activity under basal conditions and after treatment with PGA. Three lines were selected for further investigation: one with a constitutive higher luciferase activity (constitutive overexpresser 3 = coe3) and two with a reduced luciferase activity after PGA treatment (non responsive 1 and 2 = nr1 and nr2). In this thesis, it could be shown, that the mutation, which is responsible for the altered luciferase activity, is recessive and not allelic to each other. Furthermore, neither altered phytohormone levels nor mutations in the GST6 promotor are responsible for the changes in the luciferase activity. The response of these mutants to RES, like benzyl isothiocyanate (BITC) or sulforaphane, or endogenous RES-oxylipins, like OPDA or hexenal, is comparable to the response to PGA treatment. Further investigations show huge differences between the mutants. Control treated coe3 plants had very different transcriptomes compared to the control line. The coe3 mutant was more resistant to drought stress but more susceptible to salt compared to the control. This was not due to a changed response to abscisic acid (ABA). Another observed phenotype was the reduced chlorophyll depletion in dark incubated leaves. The localization of the mutation could not be completed within this thesis but chromosome 2 and 5 could be identified as most likely positions. Further investigations on this topic are needed to complete the localization. The nr1 mutant showed a reduced growth and delayed flowering phenotype and higher arginine levels could be detected in the leaves. The transcriptome exhibited huge differences after both control treatment and PGA treatment compared to the GST6::LUC. In drought experiments, the nr1 was also more resistant but, compared to the coe3, also more robust against higher salt concentrations. By next generation genome mapping it was possible to locate the mutation, which was responsible for the changes in luciferase activity after PGA treatment, at the end of chromosome 3. So there are five genes left who might be responsible for the observed phenotypes. Further investigations have to show which one is the one causing the phenotype. The nr2, as the third mutant investigated in this thesis showed highest differences to the GST6::LUC line after control treatment. It only had weak luciferase activity after wounding and was more susceptible to drought then the control. For further mapping experiments of the mutation in the nr2 mutant, F2 lines were generated. These are now ready to use to set up a mapping population. With this thesis it was possible to provide a milestone in identification of the mutations responsible for the changes in luciferase activity and in investigation of different abiotic stress responses. Now we are one step closer to discover signal transduction factors which are regulated by RES-oxylipins. KW - Arabidopsis thaliana KW - RES-Oxylipine Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166085 ER - TY - THES A1 - Lindenberg [verh. Schubert], Annekathrin T1 - Timing of sensory preferences in \(Camponotus\) Ants T1 - Zeitliche Anpassung sensorischer Präferenzen in \(Camponotus\) Ameisen N2 - Ants belong to the most successful insects living on our planet earth. One criterion of their tremendous success is the division of labor among workers that can be related to age (age¬– or temporal polyethism) and/ or body size (size–related polymorphism). Young ants care for the queen and brood in the nest interior and switch to foraging tasks in the outside environment with ongoing age. This highly flexible interior–exterior transition probably allows the ant workers to properly match the colony needs and is one of the most impressive behaviors a single worker undergoes during its life. As environmental stimuli are changing with this transition, workers are required to perform a new behavioral repertoire. This requires significant adaptions in sensory and higher¬–order integration centers in the brain, like the mushroom bodies. Furthermore, foragers need proper time measuring mechanisms to cope with daily environmental changes and to adapt their own mode of life. Therefore, they possess a functional endogenous clock that generates rhythms with a period length of approximately 24 hours. The species–rich genus of Camponotus ants constitute a rewarding model to study how behavioral duties of division of labor were performed and modulated within the colony and how synaptic plasticity in the brain is processed, as they can divide their labor to both, age and body size, simultaneously. In my PhD thesis, I started to investigate the behavioral repertoire (like foraging and locomotor activity) of two sympatric Camponotus species, C. mus and C. rufipes workers under natural and under controlled conditions. Furthermore, I focused on the division of labor in C. rufipes workers and started to examine structural and ultrastructural changes of neuronal architectures in the brain that are accompanied by the interior–exterior transition of C. rufipes ants. In the first part of my thesis, I started to analyze the temporal organization of task allocation throughout the life of single C. rufipes workers. Constant video–tracking of individually labeled workers for up to 11 weeks, revealed an age–related division of labor of interior and exterior workers. After emergence, young individuals are tended to by older ones within the first 48 hours of their lives before they themselves start nurturing larvae and pupae. Around 52% switch to foraging duties at an age of 14–20 days. The workers that switched to foraging tasks are mainly media–sized workers and seem to be more specialized than nurses. Variations in proportion and the age of switching workers between and within different subcolonies indicate how highly flexible and plastic the age–related division of labor occurs in this ant species. Most of the observed workers were engaged in foraging tasks exclusively during nighttime. As the experiments were conducted in the laboratory, they are completely lacking environmental stimuli of the ants´ natural habitat. I therefore asked in a second study, how workers of the two closely related Camponotus species, C. rufipes and C. mus, adapt their daily activity patterns (foraging and locomotor activity) under natural (in Uruguay, South America) and controlled (in the laboratory) conditions to changing thermal conditions. Monitoring the foraging activity of both Camponotus species in a field experiment revealed, that C. mus workers are exclusively diurnal, whereas C. rufipes foragers are predominantly nocturnal. However, some nests showed an elevated daytime activity, which could be an adaption to seasonally cold night temperatures. To further investigate the impact of temperature and light on the differing foraging activity patterns in the field, workers of both Camponotus species were artificially exposed to different thermal regimes in the laboratory, simulating local winter and summer conditions. Here again, C. mus workers display solely diurnal locomotor activity, whereas workers of C. rufipes shifted their locomotor activity from diurnal under thermal winter conditions to nocturnal under thermal summer conditions. Hence, the combination of both, field work and laboratory studies, shows that daily activity is mostly shaped by thermal conditions and that temperature cycles are not just limiting foraging activity but can be used as zeitgeber to schedule the outside activities of the nests. Once an individual worker switches from indoor duties to exterior foraging tasks, it is confronted with an entirely new set of sensory information. To cope with changes of the environmental conditions and to facilitate the behavioral switch, workers need a highly flexible and plastic neuronal system. Hence, my thesis further focuses on the underlying neuronal adaptations of the visual system, including the optic lobes as the primary visual neuropil and the mushroom bodies as secondary visual brain neuropil, that are accompanied with the behavioral switch from nursing to foraging. The optic lobes as well as the mushroom bodies of light–deprived workers show an `experience–independent´ volume increase during the first two weeks of adulthood. An additional light exposure for 4 days induces an `experience–dependent´ decrease of synaptic complexes in the mushroom body collar, followed by an increase after extended light exposure for 14 days. I therefore conclude, that the plasticity of the central visual system represents important components for the optimal timing of the interior–exterior transitions and flexibility of the age–related division of labor. These remarkable structural changes of synaptic complexes suggest an active involvement of the mushroom body neuropil in the lifetime plasticity that promotes the interior–exterior transition of Camponotus rufipes ants. Beside these investigations of neuronal plasticity of synaptic complexes in the mushroom bodies on a structural level, I further started to examine mushroom body synaptic structures at the ultrastructural level. Until recently, the detection of synaptic components in projection neuron axonal boutons were below resolution using classical Transmission Electron Microscopy. Therefore, I started to implement Electron Tomography to increase the synaptic resolution to understand architectural changes in neuronal plasticity process. By acquiring double tilt series and consecutive computation of the acquired tilt information, I am now able to resolve individual clear–core and dense–core vesicles within the projection neuron cytoplasm of C. rufipes ants. I additionally was able to reveal single postsynaptic Kenyon cell dendritic spines (~62) that surround one individual projection neuron bouton. With this, I could reveal first insights into the complex neuronal architecture of single projection neuron boutons in the olfactory mushroom body lip region. The high resolution images of synaptic architectures at the ultrastructural level, received with Electron Tomography would promote the understanding of architectural changes in neuronal plasticity. In my PhD thesis, I demonstrate that the temporal organization within Camponotus colonies involves the perfect timing of different tasks. Temperature seems to be the most scheduling abiotic factors of foraging and locomotor activity. The ants do not only need to adapt their behavioral repertoire in accordance to the interior–exterior switch, also the parts in the peripheral and central that process visual information need to adapt to the new sensory environment. N2 - Ameisen gehören zu den erfolgreichsten Insekten unserer Erde. Hauptverantwortlich für ihren enormen Erfolg ist die Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste. Ameisenarbeiterinnen können sich ihre Aufgaben abhängig ihrer Körpergröße teilen (Größenpolymorphismus), indem unterschiedlich große Tiere verschiedenen Aufgaben in der Kolonie nachgehen. Zusätzlich kann die Arbeitsteilung aber auch altersbedingt sein (auch genannt Alters– oder zeitlicher Polyethismus): Junge Ameisen kümmern sich um die Königin und Brut innerhalb des Nestes, bevor sie mit zunehmendem Alter das Nest verlassen und zu Futtersammlerinnen (Furageuren) werden. Der extrem anpassungsfähige Wechsel von Innen¬– zu Außendiensttieren ist einer der erstaunlichsten Verhaltensweisen, die Arbeiterinnen an den Tag legen und ermöglicht es ihnen, den unterschiedlichen Bedürfnissen ihrer Kolonie nachzugehen. Der Übergang der Ammentätigkeit zum Furagieren ist mit beträchtlichen Veränderungen der sensorischen Umgebung der einzelnen Arbeiterinnen verbunden und erfordert eine Verhaltensanpassung an diese neuen Gegebenheiten. Wenn sich die Verhaltensweisen der Arbeiterinnen ändert, führt das zu Anpassungen der sensorischen und höheren Verschaltungszentren in bestimmten Gehirnarealen. Eines dieser sensorischen Verarbeitungszentren sind die Pilzkörper. Außerdem müssen Furageure in der Lage sein, tägliche Veränderungen ihrer Umwelt wahrzunehmen, um ihre Verhaltensweisen stets optimal an die sich ändernde Umwelt anzupassen. Dafür brauchen sie eine funktionierende innere Uhr, die rhythmisch mit einer Periodenlänge von ca. 24 Stunden läuft. Die artenreiche Gattung der Camponotus Ameisen ist ein geeigneter Organismus, um die Verhaltensweisen die mit der Arbeitsteilung der Arbeiterinnenkaste einhergehen, zu untersuchen, da sowohl der Größenpolymorphismus als auch der Alterspolyethismus zeitgleich in dieser Gattung auftauchen können. Dadurch eignen sich Camponotus Ameisen auch hervorragend, um strukturelle Veränderungen synaptischer Komplexe im Gehirn, die sich durch die Arbeitsteilung ändern können, zu untersuchen. In meiner Doktorarbeit habe ich damit angefangen, die Verteilung von bestimmten Aufgaben (Ammen und Furageure) von C. rufipes Arbeiterinnen zu untersuchen. Mithilfe von Videoaufnahmen über elf Wochen, konnte ich sowohl eine altersabhängige, als auch eine größenabhängige Arbeitsteilung zwischen Ammen und Furageuren für diese Art zeigen. Frisch geschlüpfte Tiere wurden innerhalb der ersten 48 Stunden von anderen Ammen umsorgt, bevor sie selbst zu Ammen wurden und Aufgaben wie Brutpflege übernommen haben. Nach rund 14–20 Tagen sind 53% der Ammen zu Furageuren gewechselt. Zusätzlich zu der altersabhängigen Arbeitsteilung konnte ich zeigen, dass die Körpergröße der Ammen deutlich breiter gestreut ist als die der Furageure, was in einer höheren Spezialisierung der Furageure resultiert. Proportionale Unterschiede des Alters und der Größe der Tiere, die diesen Wechsel vollzogen haben zeigen, wie hoch flexibel und anpassungsfähig die Arbeitsteilung innerhalb der Arbeiterinnenkaste sein kann. Die meisten der beobachteten Furageure waren außerdem fast ausschließlich nachtaktiv. Da ich diese Experimente im Labor durchgeführt habe, fehlt es komplett an der natürlichen sensorischen Umgebung der Tiere. In dem zweiten Teil meiner Doktorarbeit habe ich mich damit beschäftigt, ob sich tägliche Aktivitätsmuster (Furagier– und Bewegungsaktivität) von Arbeiterinnen zweier nah verwandter Camponotus Arten (C. rufipes und C. mus) unter natürlichen Bedingungen (in Uruguay, Südamerika) und unter kontrollierten Bedingungen (im Labor), in Abhängigkeit von den abiotischen Faktoren Licht und Temperatur, verändern können. Meine Ergebnisse zeigen, dass C. mus Arbeiterinnen unter natürlichen Bedingungen strikt tagaktiv sind, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen vornehmlich nachts furagierten. Ein paar C. rufipes Nester zeigten allerdings eine erhöhte Furagieraktivität tagsüber, was auf die saisonal kalten Nächte zurückzuführen sein könnte. Um den Einfluss von Licht und Temperatur, der sich auf die Furagieraktivität im Feld gezeigt hat, genauer untersuchen zu können, wurden Arbeiterinnen beider Camponotus Arten verschiedenen Licht– und Temperaturbedingungen im Labor ausgesetzt. Auch hier zeigten Arbeiterinnen der Gattung C. mus eine strikt tagaktive Bewegungsaktivität, wohingegen C. rufipes Arbeiterinnen von tagaktiv unter Winter Temperaturbedingungen zu nachaktiv unter Sommer Temperaturbedingungen wechselten. Die Kombination aus den Ergebnissen der Feld– und Laborstudien zeigen deutlich, dass die generelle Aktivität der beiden Arten hauptsächlich durch Licht und Temperatur beeinflusst wird und dass Temperaturzyklen nicht nur ein limitierender Faktor der Furagieraktivität sind, sondern auch als Zeitgeber dienen können um Aktivität generell zu regulieren. Wenn der Übergang von Innen– zu Außendiensttieren stattgefunden hat, ändert sich die komplette sensorische Umgebung der Furageure. Um diese Veränderungen verarbeiten zu können, brauchen Arbeiterinnen ein hoch anpassungsfähiges und flexibles neuronales System. Daher beschäftigte ich mich in meiner Doktorarbeit außerdem mit den zugrundeliegenden neuronalen Anpassungen der visuellen Verarbeitungsregionen im Gehirn, wie die optischen Loben und die Pilzkörper, die mit dem Wechsel von Ammen zu Furageuren einhergehen. Ich konnte zeigen, dass die optischen Loben und die Pilzkörper von im Dunkeln gehaltenen Arbeiterinnen eine `Erfahrungs–unabhängige´ Volumenszunahme innerhalb der ersten zwei Wochen nach dem Schlupf zeigen. Eine folgende Lichtexposition von vier Tagen führte zu einer `Erfahrungs–abhängigen´ Abnahme der synaptischen Strukturen im Pilzkörper, die allerdings durch eine länger anhaltende Lichtexposition von 14 Tagen wieder anstieg. Diese Plastizität des zentralen visuellen Nervensystems repräsentiert eine wichtige Komponente für die optimale zeitliche Anpassung des Wechsels von Ammen zu Furageuren und die enorme Flexibilität der altersabhängigen Arbeitsteilung. Außerdem scheinen die Pilzkörper durch diese beeindruckenden strukturellen Veränderungen der synaptischen Komplexe aktiv an dieser neuronalen Plastizität beteiligt zu sein und daher den Übergang von Innen– zu Außendiensttieren in C. rufipes Ameisen zu unterstützen. Neben meinen Untersuchungen zur neuronalen Plastizität synaptischer Komplexe im Pilzkörper auf der strukturellen Ebene, habe ich damit begonnen, diese Plastizität der neuronalen Komplexe auch auf Ultrastruktur Ebene zu untersuchen. Durch die zu geringe Auflösungsmöglichkeit der klassischen Transmissions Elektronenmikroskopie, konnten bisher einzelne synaptischer Komponenten in den axonalen Endigungen der Projektionsneurone nicht detektiert werden. Deswegen habe ich damit angefangen, die Methode der Elektronen Tomographie zu etablieren um die Auflösung synaptischer Komplexe zu verbessern. Mit dieser höheren Auflösung ist es möglich, bauliche Veränderungen der synaptischen Komplexe in Plastizitätsprozessen besser zu verstehen. Mit der Durchführung von `double tilt´ Serien und der anschließenden Verarbeitung der erhaltenen Bildinformation, war es mir möglich, einzelne `clear–core´ und `dense–core´ Vesikel innerhalb des Zytoplasmas der Projektionsneurone von C. rufipes Ameisen detektieren. Außerdem konnte ich mit dieser Methode einzelne postsynaptische dendritische Dornen der Kenyon Zellen (~62) identifizieren, die ein einzelnes Endknöpfchen eines Projektionsneurons umgeben. In diesem Teil meiner Arbeit konnte ich erste Einblicke in die komplexe neuronale Bauweise einzelner Endigungen der Projektionsneurone in der olfaktorischen Region der Pilzkörper zeigen. Die hochauflösenden Bilder synaptischer Komplexe auf dem Ultrastruktur Level, die man mit der Elektronen Tomographie erzielen kann, bringen das Verständnis baulicher Veränderungen innerhalb der neuronales Plastizität voran. In meiner Doktorarbeit konnte ich zeigen, dass die zeitliche Organisation verschiedener Aufgaben innerhalb der Kolonien von Camponotus Ameisen einer perfekten Zeitplanung bedarf. Hier scheinen die abiotischen Faktoren Temperatur und Licht den größten Einfluss auf die Furagieraktivität und die generelle Aktivität zu haben. Die Ameisenarbeiterinnen müssen nicht nur ihre Verhaltensweise nach dem Übergang von Ammen zu Furageuren anpassen, es müssen sich auch die Teile des Gehirns, die für die Verarbeitung visueller Reize zuständig sind, dieser neuen sensorischen Umgebung anpassen. KW - Rossameise KW - Pilzkörper KW - Arbeitsteilung KW - Furagieraktivität KW - foraging activity KW - Neuronales visuelles System KW - neuronal visual system KW - Camponotus rufipes Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160948 ER - TY - THES A1 - Tang, Ruijing T1 - Optogenetic Methods to Regulate Water Transport and Purify Proteins T1 - Optogenetische Methoden zur Regulierung des Wassertransports und zur Reinigung von Proteinen N2 - Water transport through the water channels, aquaporins (AQPs), is involved in epithelial fluid secretion and absorption, cell migration, brain edema, adipocyte metabolism, and other physiological or pathological functions. Modulation of AQP function has therapeutic potential in edema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma, etc. The function of AQPs is in response to the osmotic gradient that is formed by the concentration differences of ions or small molecules. In terms of brain edema, it is a pathophysiological condition, resulting from dysfunction of the plasma membrane that causes a disorder of intracellular ion homeostasis and thus increases intracellular fluid content. Optogenetics can be used to regulate ion transport easily by light with temporal and spatial precision. Therefore, if we control the cell ion influx, boosting the water transport through AQPs, this will help to investigate the pathological mechanisms in e.g. brain edema. To this end, I investigated the possibility for optogenetic manipulating water transport in Xenopus oocytes. The main ions in Xenopus oocyte cytoplasm are ~10 mM Na+, ~50 mM Cl- and ~100 mM K+, similar to the mammalian cell physiological condition. Three light-gated channels, ChR2-XXM 2.0 (light-gated cation channel), GtACR1 (light-gated anion channel) and SthK-bPAC (light-gated potassium channel), were used in my study to regulate ion transport by light and thus manipulate the osmotic gradient and water transport. To increase water flow, I also used coexpression of AQP1. When expressing ChR2-XXM 2.0 and GtACR1 together, mainly Na+ influx was triggered by ChR2-XXM2.0 under blue light illumination, which then made the membrane potential more positive and facilitated Cl- influx by GtACR1. Due to this inward movement of Na+ and Cl-, the osmotic gradient was formed to trigger water influx through AQP1. Large amounts of water uptake can speedily increase the oocyte volume until membrane rupture. Next, when co-expressing GtACR1 and SthK-bPAC, water efflux will be triggered with blue light because of the light-gated KCl efflux and then oocyte shrinking could be observed. I also developed an optogenetic protein purification method based on a light-induced protein interactive system. Currently, the most common protein purification method is based on affinity chromatography, which requires different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH 4.5 - 6 and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. The change in conditions could influence the activity of target proteins. So, an easy and flexible protein purification method based on the photo-induced protein interactive system iLID was designed, which regulates protein binding with light in mild conditions and does not require a change of solution composition. For expression in E. coli, the blue light-sensitive part of iLID, the LOV2 domain, was fused with a membrane anchor and expressed in the plasma membrane, and the other binding partner, SspB, was fused with the protein of interest (POI), expressed in the cytosol. The plasma membrane fraction and the soluble cytosolic fraction of E. coli can be easily separated by centrifugation. The SspB-POI can be then captured to the membrane fraction by light stimulation and released to clean buffer in the dark after washing. This method does not require any specific column and functions in mild conditions, which are very flexible at scale and will facilitate extensive protein engineering and purification of proteins, sensitive to changed buffer conditions. N2 - Der Wassertransport durch die Wasserkanäle, Aquaporine (AQPs), ist unter anderem an der Sekretion und Absorption der Epithelflüssigkeit, der Zellmigration, dem Hirnödem und dem Adipozytenstoffwechsel beteiligt. Die Modulation der AQP-Funktion hat therapeutisches Potenzial bei Ödemen, Krebs, Fettleibigkeit, Hirnverletzungen, Glaukom usw. Die Funktion von AQPs reagiert auf den osmotischen Gradienten, der durch Konzentrationsunterschiede von Ionen oder kleinen Molekülen gebildet wird. In Bezug auf das Hirnödemhandelt es sich um einen pathophysiologischen Zustand, der aus einer Funktionsstörung der Plasmamembran resultiert und eine Störung der intrazellulären Ionenhomöostase verursacht und somit den intrazellulären Wassergehalt erhöht. Die Optogenetik kann verwendet werden, um den Ionentransport durch Licht mit zeitlicher und räumlicher Präzision leicht zu regulieren. Wenn wir also den Ioneneinstrom in die Zelle erhöhen, wird dies den Wasserimport durch AQPs fördern. ... KW - Optogenetics KW - Aquaporin KW - ChR2 KW - GtACR1 KW - SthK-bPAC KW - Protein Purification KW - iLID Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231736 ER - TY - THES A1 - Müller, Heike Milada T1 - Anpassung an Trocken- und Salzstress: Untersuchungen an Modellpflanzen und Extremophilen T1 - Adaptation to drought and salt stress: studies on model plants and extremophiles N2 - Die wahrscheinlich größten Probleme des 21. Jahrhunderts sind der Klimawandel und die Sicherstellung der Nahrungsmittelversorgung für eine steigende Zahl an Menschen. Durch die Zunahme von extremen Wetterbedingungen wie Trockenheit und Hitze wird der Anbau konventioneller, wenig toleranter Nutzpflanzen erschwert und die dadurch notwendige, steigende Bewässerung der Flächen führt darüber hinaus zu einer zusätzlichen Versalzung der Böden mit für Pflanzen toxischen Natrium- und Chlorid-Ionen. Kenntnisse über Anpassungsstrategien salztoleranter Pflanzen an Salzstress, aber auch detailliertes Wissen über die Steuerung der Transpiration und damit des Wasserverlusts von Pflanzen sind daher wichtig, um auch künftig ertragreiche Landwirtschaft betreiben zu können. In dieser Arbeit habe ich verschiedene Aspekte der pflanzlichen Stressphysiologie bearbeitet, die im Folgenden getrennt voneinander zusammengefasst werden. I. Funktionelle Unterschiede der PYR/PYL-Rezeptoren von Schließzellen Entscheidend für den Wasserstatus von Pflanzen ist die Kontrolle des Wasserverlusts durch Spaltöffnungen (Stomata), die von einem Paar Schließzellen gebildet werden. Externe Faktoren wie Licht, Luftfeuchtigkeit und CO2, sowie interne Faktoren wie das Phytohormon Abszisinsäure (ABA) regulieren über Signalkaskaden die Stomaweite und dadurch den Wasserverlust. Die zugrunde liegenden Signalkaskaden überlappen teilweise. Vor allem der Stomaschluss durch erhöhtes CO2 und ABA weisen viele Gemeinsamkeiten auf und die Identifizierung des Konvergenzpunktes beider Signale ist immer noch aktueller Gegenstand der Forschung. Von besonderem Interesse sind dabei die in Schließzellen exprimierten ABA-Rezeptoren der PYR/PYL-Familie. Denn obwohl bislang nicht nachgewiesen werden konnte, dass CO2 zu einem Anstieg des ABA-Gehalts von Schließzellen führt deuten einige Studien darauf hin, dass die ABA-Rezeptoren selbst am CO2-Signalweg beteiligt sind. Durch Untersuchungen der Stomareaktion von Arabidopsis ABA-Rezeptormutanten konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass die in Schließzellen exprimierten ABA-Rezeptoren der PYR/PYL-Familie funktionale Unterschiede aufweisen. Fünffach-Verlustmutanten der ABA-Rezeptoren PYR1, PYL2, 4, 5 und 8 (12458) waren in ihrem ABA-induzierten Stomaschluss beeinträchtigt und nur die Komplementation mit PYL2 und in geringerem Maße PYR1 konnte die ABA-Sensitivität wiederherstellen. Die Stomata von 12458-Verlustmutanten waren außerdem insensitiv gegenüber erhöhtem CO2, was auf eine Beteiligung der ABA-Rezeptoren am CO2-induzierten Stomaschluss hindeutet und diese Sensitivität konnte nur durch die Komplementation mit PYL4 oder PYL5, nicht aber mit PYL2 wiederhergestellt werden. Somit konnten in dieser Arbeit erstmals funktionelle Unterschiede der PYR/PYLs beim Stoma-Schluss nachgewiesen werden. Alle externen und internen Stomaschluss-Signale haben außerdem Einfluss auf die Genexpression der Schließzellen und führen zu individuellen expressionellen Adaptionen. In vorangegangenen Microarray Studien konnte gezeigt werden, dass jeder Stimulus auch die Expression eines distinkten Sets an ABA-Rezeptoren beeinflusst. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich außerdem zeigen, dass die Expression der ABA-Rezeptoren bereits auf kleine Änderungen der ABA-Konzentration der Schließzellen reagiert und dass diese sich außerdem in ihrer Sensitivität gegenüber ABA unterschieden. Geringe Änderungen der ABA-Konzentration von Schließzellen haben demnach Auswirkungen auf deren Rezeptor-zusammensetzung. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Rezeptoren die Expression unterschiedlicher nachgeschalteter Gene beeinflussen, was darauf hindeutet, dass Anpassungen des Rezeptorpools durch geringe Änderungen des ABA-Gehalts von Schließzellen schlussendlich auf genexpressioneller Ebene zur längerfristigen Adaption an externe Bedingungen führen und die Rezeptoren auch hier funktional verschieden sind. II. Stomatäre Besonderheiten der toleranten Dattelpalme (Phoenix dactylifera) Dattelpalmen kommen natürlicherweise an besonders trockenen und heißen Standorten vor, an denen es aufgrund der harschen Bedingungen nur sehr wenigen Pflanzen möglich ist überhaupt zu wachsen. Ein naheliegender Grund für die herausragende Toleranz dieser Art gegenüber wasserlimitierenden Bedingungen ist eine Anpassung der stomatären Regulation zu Gunsten des Wasserhaushalts. In dieser Arbeit konnte ich durch vergleichende Untersuchungen der lichtabhängigen Transpiration sowie dem ABA-induzierten Stomaschluss grundlegende Unterschiede in der Stomaphysiologie der Dattelpalmen und der eher sensitiven Modellpflanze Arabidopsis thaliana nachweisen. Blattgaswechselmessungen zeigten, dass Dattelpalmen in der Lage sind die Spaltöffnungen bei niedrigen Lichtintensitäten, bei denen Arabidopsis bereits deutlich geöffnete Stomata aufwies, geschlossen zu halten. Der bedeutendste Unterschied in der Stomaphysiologie von Dattelpalmen und Arabidopsis lag aber im ABA-induzierten Stomaschluss. Während über die Petiole verabreichtes ABA bei Arabidopsis innerhalb von 15 Minuten zu einem vollständigen Stomaschluss führte, konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass der ABA-induzierte Stomaschluss der Datteln nitratabhängig ist. ABA allein führte nur zu einem sehr langsamen Stomaschluss der innerhalb einer Stunde nicht vollständig abgeschlossen war. Nur in Gegenwart von Nitrat führte die ABA-Gabe in den Transpirationsstrom der Fiederblätter der Datteln zu einem schnellen und vollständigen Stomaschluss. In Arabidopsis wird der in Schließzellen vorkommende Anionenkanal AtSLAC1 durch eine über den ABA-Signalweg vermittelte Phosphorylierung aktiviert, was schlussendlich zur Aktivierung spannungsabhängiger Kationenkanäle und zum Ausstrom von Kalium aus den Schließzellen führt. Es konnte gezeigt werden, dass die Nitratabhängigkeit der ABA-Antwort der Schließzellen von Dattelpalmen auf Eigenschaften von PdSLAC1 zurückzuführen ist und dieser Kanal nur in Anwesenheit von extrazellulärem Nitrat aktivierbar ist. Mittlerweile konnte, unter anderem basierend auf diesen Ergebnissen, eine Tandem-Aminosäuresequenz identifiziert werden, die die SLAC-Homologe monokotyler Pflanzen wie der Dattelpalme von der dikotyler Pflanzen unterscheidet und zumindest teilweise für die nitratabhängige Aktivierung des Stomaschlusses vieler monokotyler verantwortlich ist. III. Die Salztoleranz von Phoenix dactylifera und Chenopodium quinoa Sowohl Dattelpalmen als auch C. quinoa weisen, verglichen mit den meisten anderen Pflanzen, eine hohe Toleranz gegenüber NaCl-haltigen Böden auf. In dieser Arbeit habe ich die Salztoleranz beider Arten untersucht, um so Strategien zu identifizieren, die diesen Pflanzen diese gesteigerte Toleranz ermöglichen. Dattelpalmen können natürlicherweise auf salzigen Böden wachsen. Makroskopisch weisen diese Pflanzen aber keine Anpassungen wie bspw. Salzdrüsen auf und bislang ist unklar wie Dattelpalmen mit dem NaCl aus dem Boden umgehen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass der Natriumgehalt der Fiederblätter der Datteln durch eine sechswöchige Bewässerung mit 600mM NaCl, was ungefähr der Konzentration von Meerwasser entspricht, nicht zunimmt. Demnach sind Datteln so genannte „Exkluder“, also Pflanzen, die eine übermäßige Natriumaufnahme in photosynthetisch aktives Gewebe vermeiden. Der Natriumgehalt der Wurzeln dagegen nahm unter Salzstress aber zu. Diese Zunahme war allerdings in unterschiedlichen Bereichen der Wurzeln verschieden stark. Flammenphotometrische Messungen ergaben einen vom Wurzelansatz ausgehenden graduellen Anstieg des Natriumgehalts, der an der Wurzelspitze am höchsten war. Darüber hinaus konnte eine Induktion von PdSOS1, einem putativen Na+/H+-Antiporter in diesen unteren, natriumhaltigen Bereichen nachgewiesen werden. Eine hohe SOS1-Aktivität gilt bereits in anderen toleranten Arten als Schlüsselmerkmal für deren Toleranz und die gesteigerte Expression von PdSOS1 deutet auf eine erhöhte Natrium-Exportrate aus der Wurzel zurück in den Boden in diesen unteren Bereichen hin, was schlussendlich den Ausschluss von Natrium vermitteln könnte. In sensitiven Arten führt Salzstress häufig zu einer Abnahme der Kaliumkonzentration des Gewebes. Interessanterweise war dies weder für das Blatt- noch das Wurzelgewebe der Dattelpalmen der Fall. Der Kaliumgehalt beider Gewebe blieb trotz der Bewässerung der Pflanzen mit Salzwasser konstant. Auf expressioneller Ebene konnte ich darüber hinaus zeigen, dass PdHAK5, ein putativer hochaffiner Kaliumtransporter, der unter Kontrollbedingungen überwiegend in den oberen Wurzelabschnitten exprimiert wurde, durch den Salzstress dort reprimiert wurde. PdKT, ebenfalls ein putatives Kalium-Transportprotein dagegen, wurde nicht durch die Salzbehandlung beeinflusst, was zusammengenommen darauf hindeutet, dass das Aufrechterhalten des Kaliumgehalts bei Salzstress durch die differentielle Regulation verschiedener Kaliumaufnahmesysteme gewährleistet wird. Der effiziente Ausschluss von Natrium zusammen mit dem hohen K+/Na+-Verhältnis könnten demnach Schlüsselmerkmale für die hohe Salztoleranz von Phoenix dactylifera darstellen. Quinoa ist, ähnlich wie die Dattelpalme, eine salztolerante Nutzpflanze. Im Gegensatz zu Dattelpalmen weist Quinoa allerdings besondere Strukturen auf der Epidermis auf, die so genannten epidermalen Blasenhaare (englisch: epidermal bladder cells, EBCs). Die Funktion dieser ballonartig vergrößerten Zellen als externe Salzspeicher wird seit längerem diskutiert. Flammenphotometrische Messungen des Natriumgehalts von Quinoa unter Salzstressbedingungen ergaben, dass Quinoa anders als Dattelpalmen, Natrium in die oberirdischen, photosynthetisch aktiven Organe aufnimmt. Auch die Zunahme des Natriumgehalts der EBCs konnte ich nachweisen. Junge Blätter haben eine hohe Dichte an intakten EBCs, was deren Funktion als externe Salzspeicher besonders zum Schutz dieser jungen Blätter nahelegt. mRNA-Sequenzierungen ergaben darüber hinaus, dass die EBCs bereits unter Kontrollbedingungen viele in grundlegende Stoffwechselprozesse involvierte Gene sowie membranständige Transportproteine differentiell exprimieren. Diese Unterschiede im Transkriptom der EBCs zum Blattgewebe zeigen, dass katabole Stoffwechselwege nur eine untergeordnete Rolle in den hochspezialisierten EBCs spielen und deren Stoffwechsel auf dem Import energiereicher Zucker und Aminosäuren basiert. Mittels qPCR-Messungen und RNA-Sequenzierungen konnte ich die gewebespezifische Expression verschiedener Transportproteine nachweisen, die eine gerichtete Aufnahme von Natrium in EBCs ermöglichen könnten. Besonders die differentielle Expression eines Natriumkanals der HKT1-Familie deutet auf dessen Beteiligung an der Natriumbeladung der EBCs hin. CqHKT1.2 wurde ausschließlich in EBCs exprimiert und die elektrophysiologische Charakterisierung dieses Transportproteins ergab eine spannungsabhängige Natriumleitfähigkeit. Dieser Natriumkanal kann demnach die Natriumaufnahme bei Membranspannungen nahe dem Ruhepotential in die EBCs vermitteln und die Deaktivierung des CqHKT1.2 bei depolarisierenden Membranspannungen kann darüber hinaus einen Efflux von Na+ aus den EBCs verhindern. Auch das Expressionsmuster eines putativen Na+/H+-Antiporters (CqSOS1) der nur sehr gering in EBCs aber deutlich höher in Blattgewebe exprimiert wurde, deutet auf eine indirekte Beteiligung dieses SOS1 an der Beladung der EBCs hin. Bereits charakterisierte SOS1-Proteine anderer Pflanzen zeigten unter physiologischen Bedingungen eine Natriumexport-Aktivität. CqSOS1 könnte demnach den Export von Natrium aus Mesophyll- und Epidermiszellen der Blätter in den Apoplasten vermitteln, welches dann über CqHKT1.2 in die EBCs aufgenommen wird. Trotz der Natriumaufnahme in die oberirdischen Teile und die EBCs führte die Salzbehandlung ähnlich wie bei den Datteln nicht zu einer Abnahme des bemerkenswert hohen Kaliumgehalts. Mittels qPCR-Untersuchungen konnte ich die Expression verschiedener HAK-Orthologe nachweisen, deren Aktivität die Aufrechterhaltung des Kaliumgehalts unter Salzstress vermitteln könnten. Frühere Studien konnten zeigen, dass Salzstress bei Quinoa wie bei vielen salztoleranten Arten zu einem Anstieg der Konzentration von kompatiblen gelösten Substanzen und besonders von Prolin führt. In dieser Arbeit konnte ich die hohe Expression eines Prolintransporters in EBCs nachweisen, was eher auf einen importbasierten Anstieg der Prolinkonzentration als auf die Synthese innerhalb der EBCs schließen lässt. Zusammengefasst ergaben der Anstieg des Natriumgehalts der EBCs in Verbindung mit den Ergebnissen der RNA-Sequenzierung und den ergänzenden qPCR Messungen, dass die EBCs von Quinoa bereits unter Kontrollbedingen für die Aufnahme von überschüssigen Ionen unter Salzstress spezialisierte Zellen sind, deren Spezialisierung auf dem Import von energiereichreichen Zucken und anderen Substanzen basiert. N2 - The greatest problem faced by the 21st century are climate change and maintaining the food security for an increasing number of people. The increase in extreme weather events, such as drought and heat, makes it difficult to cultivate conventional crops that are not stress tolerant. As a result, increasing irrigation of arable land leads to additional salinization of soils with plant-toxic sodium and chloride ions. Knowledge about the adaptation strategies of salt-tolerant plants to salt stress as well as detailed knowledge about the control of transpiration and thus of the water loss of these plants are therefore important in order to be able to guarantee productive agriculture in the future. In this work, I have worked on various aspects of plant stress physiology, which will be summarized separately below. I. Functional differences of guard cell PYR / PYL receptors A tight regulation of the transpirational water loss through stomata, which are formed by a pair of guard cells, is crucial for regulating the water status of plants. External factors such as light, humidity and CO2 as well as internal factors such as the phytohormone ABA regulate the stoma width and thus the loss of water via individual signal cascades. However, the underlying signaling cascades partly overlap. In particular, the cascades involved in stomatal closure due to increasing CO2 and ABA overlap and the identification of a convergence point of both signals is still the subject of ongoing research. In this context, the ABA receptors of the PYR/PYL family that are expressed in guard cells are of particular interest. Although it has not yet been demonstrated that CO2 leads to an increase in the ABA content of guard cells, some studies indicate that the ABA receptors themselves are involved in the CO2 signaling pathway By studying the stomatal response of Arabidopsis ABA receptor mutants, I demonstrated that the PYR / PYL family ABA receptors expressed in guard cells show functional differences. Pentuple knock out mutants of the ABA receptors PYR1, PYL2, 4, 5, and 8 (12458) showed impairment in ABA-induced stomatal closure, and only complementation with PYL2 and, to a lesser extent, PYR1 could restore ABA sensitivity. Additionally, the stomata of the 12458 knockout mutants were also insensitive to elevated CO2 and the sensitivity could only be restored be the complementation with the receptors PYL4 and PYL5 suggesting an involvement of the ABA receptors in the CO2-induced stomatal closure. Furthermore, all external and internal stimuli that lead to stomatal closure influence the gene expression of guard cells leading to individual adaptions on the gene expression level. Previous microarray studies have shown that each stimulus also affects the expression of a distinct set of ABA receptors. In this work, I showed that the expression of ABA receptors already responded to small changes in the ABA concentration of guard cells and that the receptor expression also differed in their sensitivity to ABA. Small changes in the ABA concentration of guard cells could therefore influence their receptor composition. In addition, I was able to show that the receptors affect the expression of different downstream genes, suggesting that adjustments of the receptor pool by small changes in the ABA content of guard cells ultimately lead to long-term adaptations to external conditions at the gene expression level. II. Specific features of the stomata of the extremely tolerant date palm (Phoenix dactylifera) Date palms naturally occur in particularly dry and hot locations, where due to the harsh conditions only very few plant species are able to grow at all. One possible reason for the outstanding tolerance of this species to water-limiting conditions is an adaptation of the stomatal regulation in favor of maintaining water balance. In this work, I was able to demonstrate fundamental differences in the stomatal physiology of date palm and the rather sensitive model plant Arabidopsis thaliana by comparative studies of light-dependent transpiration and ABA-induced stoma closure. Leaf gas exchange measurements showed that date palm can keep the stomata closed at low light intensities, where Arabidopsis already had clearly opened stomata. However, the most significant difference in the stomatal physiology between date palm and Arabidopsis was found in the ABA-induced stomatal closure. While ABA fed via the petiole resulted in complete stomatal closure within 15 minutes in Arabidopsis, I showed that ABA-induced stomatal closure is nitrate-dependent in date palm. ABA alone only resulted in a very slow stomatal closure that was not fully completed within one hour. Only in the presence of nitrate did the feeding of ABA into the transpiration stream of date palm pinates lead to a rapid and complete stomatal closure. In Arabidopsis, the guard cell-expressed anion channel AtSLAC1 is activated by ABA signaling-mediated phosphorylation, triggering voltage-dependent cation channels to open and ultimately channeling potassium out of the guard cells. It could be shown that the nitrate dependence of the ABA response of the date palm guard cells is due to properties of PdSLAC1 and that this channel can only be activated in the presence of extracellular nitrate. Based on these results, a tandem amino acid sequence has now been identified, that distinguishes the SLAC homologues of monocotyledonous plants (including date palm) from dicotyledonous plants (including Arabidopsis) and is at least partially responsible for the nitrate-dependent activation of the stoma conductance of many monocots. III. The strategies behind the salt tolerance of P. dactylifera and Chenopodium quinoa Both date palms and C. quinoa have a high tolerance to NaCl-containing soils compared to most other plant species. In this work, I studied the salt tolerance of both species to identify strategies that allow these plants to grow under salt stress conditions. Date palm naturally grows on saline soils along the coast of the Arabian Peninsula. However, they do not possess any macroscopic adaptations such as salt glands. So far it is unclear how date palms handle excessive NaCl from the soil. In this work, I was able to show that the sodium content of date palm pinates does not increase after a six-week irrigation with 600mM NaCl, which is roughly the concentration of seawater. Accordingly, date palm is a so-called "excluder", i.e. a plant that avoids excessive sodium uptake into photosynthetically-active tissue. The sodium content of roots, however, increased under salt stress. But this increase was different in different areas of the roots. Flame photometric measurements revealed a gradual increase in sodium content from upper to lower parts of the roots, which was highest at the root tip. In addition, induction of PdSOS1, a putative Na+/H+ antiporter in these lower sodium-containing regions has been demonstrated. High SOS1 activity is already considered to be a key feature of tolerance in other species, and increased expression of PdSOS1 indicates increased sodium export rates from the root back into the soil in these lower areas, which could ultimately mediate the exclusion of sodium. In sensitive plant species, salt stress often leads to a decrease in the potassium concentration of the tissue. Interestingly, this was not the case for date palm leaf or root tissue. The potassium content of both tissues remained constant despite irrigation of the plants with salt water. On the expression level, I also showed that PdHAK5, a putative high-affinity potassium transporter predominantly expressed in the upper root sections under control conditions, was repressed by the salt stress there. In contrast, PdKT, also a putative potassium transport protein, was not affected by the salt treatment, suggesting that maintenance of potassium content in salt stress is ensured by the differential regulation of various potassium uptake systems. The efficient exclusion of sodium together with the high K+/Na+ ratio could therefore be key features of the high salt tolerance of Phoenix dactylifera. Quinoa, like the date palm, is a salt-tolerant crop but in contrast to date palms quinoa has special structures on the epidermis, the so-called epidermal bladder cells (EBCs). The function of these balloon-like enlarged cells as external salt dumpers has been proposed. Flame photometric measurements of the sodium content of quinoa under salt stress conditions showed that quinoa, unlike date palm, absorbs sodium in the above-ground, photosynthetically active parts. I was also able to prove the increase in the sodium content of the EBCs. Young leaves are equipped with a high density of intact EBCs, suggesting their function as external salt stores, especially for the protection of these young leaves. In addition, mRNA sequencing revealed that the EBCs, already under control conditions, differentially express many genes involved in basic metabolic processes as well as membrane-bound transport proteins. These differences in the transcriptome of EBCs to leaf tissue show that catabolic pathways such as photosynthesis play only a minor role in the highly specialized EBCs and their metabolism is based on the import of high energy compounds such as sugars or amino acids. Using qPCR measurements and RNA sequencing, I was able to demonstrate the tissue-specific expression of various transport proteins, which could allow unidirectional uptake of sodium in EBCs. In particular, the differential expression of a sodium channel of the HKT1 family indicates its involvement in the sodium loading of the EBCs. CqHKT1.2 was expressed exclusively in EBCs and the electrophysiological characterization of this transport protein revealed a voltage-dependent sodium conductivity. Thus, this sodium channel can mediate sodium uptake into EBCs at normal membrane voltages, and deactivation of CqHKT1.2 at depolarized membrane voltages can prevent efflux of Na+ out of the EBCs. The expression pattern of a putative Na+/H+ antiporter (CqSOS1), which is expressed only very low in EBCs but significantly higher in leaf tissue, indicates an indirect involvement of this SOS1 in the loading of the EBCs. SOS1 proteins from other plant species that have already been characterized showed a sodium export activity under physiological conditions. Thus, CqSOS1 could mediate the export of sodium from mesophyll and epidermis cells of the leaves in the apoplasts, which is then absorbed into the EBCs via CqHKT1.2. Similar to the results of date palm, the sodium uptake into the above ground parts and the EBCs of quinoa during the salt treatment did not lead to a decrease in the remarkably high potassium content of quinoa. Using qPCR studies, I was able to demonstrate the expression of various HAK orthologues, the activity of which could mediate the maintenance of potassium levels under salt stress. Previous studies have shown that salt stress in quinoa, as in many tolerant species, leads to an increase in the concentration of compatible solutes and particularly proline. In this work, I was able to demonstrate the high expression of a proline transporter in EBCs, suggesting an import-based increase in proline concentration rather than synthesis within the EBCs. In summary, the increase in sodium in EBCs together with the RNA-Seq analyses and the complementary qPCR measurements revealed that the Quinoa EBCs under control conditions are already equipped for the uptake of excess ions under salt stress, with a metabolism that strongly depends on the import of high-energy compounds such as sugars and amino acids. KW - Botanik KW - Salzresistenz KW - Dürreresistenz KW - abiotische Stresstoleranz von Pflanzen KW - abiotic stress tolerance of plants Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179005 ER - TY - THES A1 - Kumari, Khushbu T1 - The role of lipid transfer proteins (LTPs) during the fertilization process in Arabidopsis thaliana T1 - Untersuchungen zur Rolle von Lipidtransferproteinen (LTPs) während des Befruchtungsprozesses in Arabidopsis thaliana N2 - Double fertilization is a defining characteristic of flowering plants (angiosperms). As the sperm cells of higher plants are non-motile, they need to be transported to the female gametophyte via the growing pollen tube. The pollen-tube journey through the female tissues represents a highly complex process. To provide for successful reproduction it demands intricate communication between the cells of the two haploid gametophytes - the polar growing pollen tube (carrying the two non-motile sperm cells) and the ovule (hosting the egg cell/synergid cells). The polar growth of the pollen tube towards the female gamete is guided by different signaling molecules, including sugars, amino acids and peptides. Some of these belong to the family of lipid transfer proteins (LTPs), which are secreted cysteine-rich peptides. Depending on the plant species several lines of evidence have also suggested potential roles for LTPs during pollen germination or pollen-tube guidance. Although Arabidopsis thaliana has 49 annotated genes for LTPs, several of which are involved in plant immunity and cell-to-cell communication, the role of most members of this family during fertilization is unknown. The aim of this project was therefore to systematically identify LTPs which play a role in the fertilization process in A. thaliana, particularly during pollen tube guidance. To identify candidate proteins, the expression profile of LTPs in reproductive tissue was investigated. This was accomplished by in-silico bioinformatic analysis using different expression databases. Following confirmion of these results by qRT-PCR analysis, seven Type-I nsLTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 and LTP12) were found to be exclusively expressed in pistils. Except for LTP12, all other pistil expressed LTPs were transcriptionally induced upon pollination. Using reporter-based transcriptional and translational fusions the temporal and spatial expression patterns together with protein localizations for LTP2, 3, 4, 5, 6, and 12 were determined in planta. Stable transgenic plants carrying PromLTP::GUS constructs of the six different LTP candidates showed that most of LTPs were expressed in the stigma/stylar region and were induced upon pollination. With respect to protein localization on the cellular level, they split into two categories: LTP2, LTP5 and LTP6 were localized in the cell wall, while LTP3, LTP4 and LTP12 were specifically targeted to the plasma membrane. For the functional characterization of the candidate LTPs, several T-DNA insertion mutant plant lines were investigated for phenotypes affecting the fertilization process. Pollen development and quality as well as their in-vitro germination rate did not differ between the different single ltp mutant lines and wildtype plants. Moreover, in-vivo cross pollination experiments revealed that tube growth and fertilization rate of the mutant plants were similar to wildtype plants. Altogether, no discernible phenotype was evident in other floral and vegetative parts between different single ltp mutant lines and wildtype plants. As there was no distinguishable phenotype observed for single ltp-ko plants, double knock out plants of the two highly homologous genes LTP2 (expressed in the female stigma, style and transmitting tract) and LTP5 (expressed in the stigma, style, pollen pollen-tube and transmitting tract) were generated using the EPCCRISPR-Cas9 genome editing technique. Two ltp2ltp5 mutant transgenic-lines (#P31-P2 and #P31-P3) with frameshift mutations in both the genes could be established. Further experiments showed, that the CRISPR/Cas9-mediated knock-out of LTP2/LTP5 resulted in significantly reduced fertilization success. Cell biological analyses revealed that the ltp2ltp5 double mutant was impaired in pollen tube guidance towards the ovules and that this phenotype correlated with aberrant callose depositions in the micropylar region during ovule development. Detailed analysis of in-vivo pollen-tube growth and reciprocal cross pollination assay suggested that, the severely compromised fertility was not caused by any defect in development of the pollen grains, but was due to the abnormal callose deposition in the embryo sac primarily concentrated at the synergid cell near the micropylar end. Aberrant callose deposition in ltp2ltp5 ovules pose a complete blockage for the growing pollen tube to change its polarity to enter the funiculus indicating funicular and micropylar defects in pollen tube guidance causing fertilization failure. Our finding suggests that female gametophyte expressed LTP2 and LTP5 play a crucial role in mediating pollen tube guidance process and ultimately having an effect on the fertilization success. In line with the existence of a N-terminal signal peptide, secreted LTPs might represent a well-suited mobile signal carrier in the plant’s extracellular matrix. Previous reports suggested that, LTPs could act as chemoattractant peptide, imparting competence to the growing pollen tube, but the molecular mechanism is still obscure. The results obtained in this thesis further provide strong evidence, that LTP2/5 together regulate callose homeostasis and testable models are discussed. Future work is now required to elucidate the detailed molecular link between these LTPs and their potential interacting partners or receptors expressed in pollen and synergid cells, which should provide deeper insight into their functional role as regulatory molecules in the pollen tube guidance mechanism. N2 - Die ‚doppelte Befruchtung‘ ist ein charakteristisches Merkmal von Blütenpflanzen (Angiospermen). Da im Gegensatz zu vielen anderen Organismen die Spermien höherer Pflanzen nicht beweglich sind, müssen sie über den wachsenden Pollenschlauch zum weiblichen Gametophyten transportiert werden. Die je nach Pflanze durchaus lange Reise des Pollenschlauchs durch das weibliche Gewebe ist ein sehr komplexer Vorgang. Um eine erfolgreiche Reproduktion zu gewährleisten, ist eine fein abgestimmte Kommunikation zwischen den Zellen der beiden haploiden Gametophyten erforderlich - dem polar wachsenden Pollenschlauch (welcher die beiden nicht beweglichen Spermien trägt) und der Samenanlage (in der sich die Eizellen und Synergiden befinden). Das polare Wachstum des Pollenschlauchs in Richtung des weiblichen Gameten wird von verschiedenen Signalmolekülen gesteuert, darunter Zucker, Aminosäuren und Cystein-reiche Peptide (CRPs). Einige dieser Signalmoleküle gehören zur Familie der Lipidtransferproteine (LTPs), welche ebenfalls zur Klasse der CRPs gehören. Abhängig von der Pflanzenart deuten mehrere Hinweise auf eine mögliche Rolle von LTPs während der Pollenkeimung oder der Pollenschlauch-Navigation hin. Obwohl das Genom von Arabidopsis thaliana für mehr als 49 annotierte LTP-Gene kodiert, von denen einige an der ‚angeborenen Immunitätsreaktion‘ von Pflanzen sowie der Kommunikation von Zelle zu Zelle beteiligt sind, ist die physiologische Rolle der meisten Mitglieder dieser Familie während des Befruchtungsvorgangs bisher unbekannt. Ziel dieses Projekts war es daher, systematisch solche LTPs zu identifizieren, die eine Rolle bei der Befruchtung von A. thaliana spielen, insbesondere bei der Navigation des Pollenschlauchs zur Eizelle. Um diese LTP Proteine zu identifizieren, wurde zunächst das Expressionsprofil von LTPs in reproduktiven Gewebe untersucht. Dies wurde durch bioinformatische ‚in-silico‘ Analyse unter Verwendung verschiedener Expressionsdatenbanken erreicht. Nach Bestätigung dieser Ergebnisse durch qRT-PCR- Analyse wurde festgestellt, dass sieben Typ-I-LTPs (LTP1, LTP2, LTP3, LTP4, LTP5, LTP6 und LTP12) präferentiell im Stempel exprimiert werden. Mit Ausnahme von LTP12 wurden darüber hinaus alle anderen Stempel-exprimierten LTPs nach Bestäubung auf transkriptioneller Ebene induziert. Unter Verwendung von Reporter-basierten Transkriptions- und Translationsfusionen wurden die zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster zusammen mit Proteinlokalisationen für LTP2, 3, 4, 5, 6 und 12 ‚in planta‘ bestimmt. Stabile transgene Pflanzen, die PromLTP::GUS-Konstrukte der sechs verschiedenen LTP- Kandidaten exprimierten, zeigten, dass die meisten LTPs in der Stigma/Stylar-Region abundant waren und tatsächlich bei der Bestäubung induziert wurden. Die anschließende Proteinlokalisierung auf zellulärer Ebene klassifizierte diese LTPs in zwei Kategorien: LTP2, LTP5 und LTP6 wurden in der Zellwand lokalisiert, während LTP3, LTP4 und LTP12 spezifisch an der Plasmamembran lokalisierten. Zur funktionellen Charakterisierung der Kandidaten-LTPs wurden mehrere T-DNA- Insertionsmutanten auf Phänotypen hinsichtlich des Befruchtungsprozesses untersucht. Die Pollenentwicklung sowie die ‚in-vitro‘ Keimrate des Pollens unterschieden sich dabei nicht zwischen den verschiedenen LTP-Mutantenlinien und Wildtyp-Pflanzen. Darüber hinaus ergaben ‚in-vivo‘ Kreuzbestäubungsexperimente, dass das Pollenschlauchwachstum und die Befruchtungsrate der mutierten Pflanzen im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen ähnlich waren. Insgesamt war kein erkennbarer Phänotyp in der Blütenentwickung oder der vegetativen Entwicklung zwischen verschiedenen LTP-Einzel-Mutanten und Wildtyp-Pflanzen erkennbar. Aufgrund möglicher funktioneller Redundanz, und der Tatsache, dass für einzelne LTP ‚knock- out‘ Pflanzen kein unterscheidbarer Phänotyp beobachtet wurde, wurden Verlustmutanten der beiden hoch homologen und ko-exprimierten Gene LTP2 und LTP5 unter Verwendung der EPC-CRISPR-Cas9-Genomeditiertechnik erzeugt. Zwei ltp2ltp5-mutierte transgene Linien (# P31-P2 und # P31-P3) mit In-Frame-Mutationen in beiden Genen konnten dabei etabliert werden. Weitere Experimente zeigten, dass das CRISPR/Cas9-vermittelte Ausschalten von LTP2 und LTP5 zu einem signifikant verringerten Befruchtungserfolg in diesen Linien führte. Zellbiologische Analysen ergaben, dass die ltp2ltp5 Doppelmutante in der Pollenschlauch- Navigation zu den Ovulen hin beeinträchtigt war und dass dieser Phänotyp mit Kalloseablagerungen in der Region der Mikropyle während der Ovulen-Entwicklung in diesen Linien korrelierte. Eine detaillierte Analyse des ‚in-vivo‘ Wachstums der Pollenschläuche sowie eines wechselseitigen Bestäubungstests ergab, dass die stark beeinträchtigte Befruchtung nicht durch einen Entwicklungsdefekt im männlichen Gametophyten, dem Pollen, verursacht wurde. Stattdessen konnte die beeinträchtigte Befruchtung auf die abnormale Kalloseabscheidung im weiblichen Gametophyten, dem Embryosack, zurückgeführt werden. Interessanterweise, konzentrierte sich die Kalloseabscheidung in der ltp2ltp5 Doppelmutante hauptsächlich im Bereich der Synergiden, am mikropylaren Ende des Embryosacks. Für den wachsenden Pollenschlauch stellen diese im Vergleich zum Wildtyp untypischen Kalloseablagerungen in ltp2ltp5-Mutanten in der Nähe der Eizellen möglicherweise eine Blockade für die Perzeption von Ovulen-Signalen dar. Dies behindert die erforderliche Richtungsänderung des polar gerichteten Wachstums und somit die Fähigkeit des Pollenschlauchs, entlang des Funikulus zu wachsen und in die Mikropyle eindringen zu können. Diese Beobachtung zeigt, dass funikuläre und mikropylare Defekte in der Pollenschlauch-Navigation den Befruchtungserfolg vermindern. Die Ergebnisse dieser Dissertation legen nahe, dass der weibliche Gametophyt, in welchem LTP2 und LTP5 exprimiert werden, eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Pollenschlauch-Navigation spielt und letztendlich auch einen messbaren Einfluss auf den Befruchtungserfolg hat. Aufgrund der Existenz eines N-terminalen Signalpeptids und der damit verbundenen Sekretion in den Apoplasten könnten LTPs als Signalmoleküle in der extrazellulären Matrix der Pflanze fungieren. Frühere Arbeiten deuteten bereits an, dass LTPs als chemoattraktive Peptide wirken könnten und dem wachsenden Pollenschlauch die Kompetenz verleihen könnten, die Signale der Eizellen wahrzunehmen. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus ist jedoch noch immer unbekannt. Die in dieser Dissertation erzielten Ergebnisse liefern jedoch starke Hinweise darauf, dass LTP2/5 zusammen die Homöostase der Kallosebildung regulieren. Mögliche Modelle zur Aktivität von LTPs im Kontext der Regulation der Kallose-Homöostase werden vorgestellt und diskutiert. Zukünftige Arbeiten sind nun erforderlich, um die detaillierte molekulare Verbindung zwischen diesen LTPs und ihren potenziellen Interaktionspartnern oder Rezeptoren, die in Pollen- und Synergidzellen exprimiert werden, aufzuklären. Diese sollten einen tieferen Einblick in die funktionelle Rolle von LTP2 und LTP5 als regulatorische Moleküle für die Pollenschlauch- Navigation geben. KW - Fertilization in angiosperm KW - Lipid Transfer Protein Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199613 ER - TY - THES A1 - Voß, Lena Johanna T1 - Änderungen der Membranspannung und der Osmolarität als Auslöser für Calciumsignale in Pflanzen – Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare T1 - Induction of Calcium Signals by Changes in Membrane Potential and Osmolarity – Studies on Guard Cells of Nicotiana tabacum and Polypodium vulgare N2 - Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt. N2 - Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels. The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded. The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata. KW - Schließzelle KW - Nicotiana tabacum KW - Polypodium vulgare KW - Calcium Imaging KW - Elektrophysiologie KW - Schließzellen KW - Farne KW - Abscisinsäure KW - Oregon Green-BAPTA KW - Fura-2 KW - Hyperpolarisierung KW - guard cells KW - ferns KW - abscisic acid KW - hyperpolarisation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639 ER - TY - THES A1 - Reyer, Antonella T1 - Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen T1 - Characterisation of Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii as a non-invasiv, optogenetic tool for the functional analysis of electical signals in plants N2 - Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert. N2 - Like animals, plants have the ability to generate electrical signals – membrane potential changes on the plasma membrane. Electrical signals represent the earliest answers that can be observed in plant cells in the course of changing external and internal conditions. Stimuli such as cold, heat, wounding, herbivory and pathogens, as well as physiological processes such as growth and pollination, lead to changes in the potential of the plasma membrane of plant cells. Most of these membrane potential changes consist of rapid depolarization, followed by repolarization of the membrane potential, the kinetics of which can be highly variable depending on the stimulus. In contrast to animals, knowledge about the molecular basis of the generation and transmission of electrical signals in plants is poorly understood. Exceptions include "classically excitable plants" such as the Venus fly trap or mimosa, in which a touch stimulus leads to the triggering of a characteristic action potential, which subsequently leads to an elastic movement based on differential turgor changes. In all other plants, the kinetics of membrane potential changes are highly variable, depending on the stimulus and the physiological state of the cells and – with the exception of the reaction to a cold stimulus – can only be repeated after long latency periods. This prevents a systematic analysis of the molecular basis of electrical signals in most plants. The aim of this work was therefore to establish a non-invasive tool for the functional analysis of electrical signals in plants based on the channelrhodopsin-2 ChR2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, which has been used in neurobiology since 2005. ChR2 is a blue light-activated cation channel that needed all-trans retinal as a cofactor in order to function. In this work, different variants of the ChR2, with a focus on C128T and especially D156C, also known as ChR2-XXL, were used. ChR2 could already be functionally represented by M. Baumann in the context of her dissertation in the transient expression system Nicotiana benthamiana. In the present work, the system was expanded and particularly promising ChR2 variants were characterized not only in N. benthamiana, but also in stable Arabidopsis thaliana lines. The ChR2-XXL identified a suitable optogenetic tool for examining electrical signals in plants. ChR2-XXL offers the possibility to depolarize the membrane potential by short, 5 s blue light pulses on average by 95 mV and then to investigate the repolarization phase. Blue light-inducible, ChR2-XXL-mediated depolarizations could be triggered reproducibly and repeatedly on the same cells as often as desired. ChR2-XXL enables research into the previously inadequate molecular components of the repolarization of the membrane potential in plants. In animal cells, voltage-dependent sodium channels generate depolarization, while voltage-dependent potassium channels determine the depolarization kinetics. The ion gradients changed compared to animal cells suggest that plant depolarization is essentially due to Ca2+-dependent anion channels, which depolarize the membrane potential through the efflux of Cl-. For repolarization, the involvement of outward rectifying potassium channels is postulated. On the other hand, participation of PM H+-ATPases is also suspected, which at the same time make an essential contribution to the generation of the resting potential. In the present work, the use of ChR2-XXL made it possible for the first time to investigate both potential components of the repolarization phase, potassium channels and PM H+-ATPases, using a non-invasive, anion-independent method of depolarization. Through the use of mutants and potassium channel inhibitors, a possible contribution of the outward rectifying potassium channel Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (GORK) to the repolarization phase in Arabidopsis mesophyll cells could almost be excluded. The outward-rectifying potassium channel GORK only opens at membrane potentials more positive than the equilibrium potential for potassium ions (EK (-118 mV)). Since the ChR2-inducible depolarizations, like many natural stimuli, hardly reach this value or only exceed it slightly, GORK makes a minor contribution to repolarization. This suggested that the repolarization from EK to the resting potential at approximately -180 mV, on the other hand, may be accomplished by PM H+-ATPases. The effects of the PM H+-ATPase inhibitor sodium orthovanadate and the PM H+-ATPase activator fusicoccin on the repolarization phase supported this hypothesis. The repolarization kinetics were slowed by inhibition of the PM H+-ATPases and accelerated by their activation. This made it possible for the first time to study the exact influence of the PM H+-ATPases on restoring the membrane potential during repolarization in mesophyll cells. It was also observed that repolarization could be accelerated in the presence of the potassium channel blocker Ba2+. In accordance with the 'pump-and-leak' model, this indicates that weakly inwardly-rectifying potassium channels, such as the Arabidopsis K+ Transporter 2 (AKT2) counteract the PM H+-ATPase-generated proton gradient and thus the resting potential from the sum of the moving charges of pumps and potassium channels is determined. The potential of optogenetic, rhodopsin-based tools for the molecular analysis of electrical signals, in particular using the wide range of light-controlled pumps and channels, their spectral diversity and their intersection with selected Arabidopsis mutants is discussed. KW - pflanzliche Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - elektrische Signale KW - Arabidopsis thaliana KW - Optogenetik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671 ER - TY - THES A1 - Lehmann, Julian T1 - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie beleuchtet den Oligomerisierungsstatus pflanzlicher Membranproteine T1 - Super-resolution microscopy elucidates the stoichiometry of plant membrane proteins N2 - SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu. N2 - Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranproteine KW - Oligomerisation KW - Superresolution microscopy KW - SLAC/SLAH KW - PALM stoichiometry Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211762 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Nadine T1 - Eine vergleichende biophysikalische Analyse von Hitze- und Trockentoleranzstrategien der Wüstenpflanze Phoenix dactylifera und Nutzpflanzen der gemäßigten Klimazonen T1 - A comparative biophysical analysis of heat and drought tolerance strategies of the desert plant Phoenix dactylifera and crops of temperate climates N2 - Der Klimawandel geht einher mit einem Anstieg der globalen Durchschnittstemperatur und einem dadurch induzierten Wassermangel. Diese beiden abiotischen Stressfaktoren führen zu einer Reduzierung der landwirtschaftlichen Erträge und Biomassen von Kulturpflanzen. Daher ist eine Anpassung der betroffenen Pflanzenarten an das sich ändernde Klima erforderlich, um die landwirtschaftliche Produktivität in Zukunft aufrechtzuerhalten. Gegenwärtig ist unser Wissen über Strategien zur Toleranz gegenüber abiotischem Stress sowie über Genom- und Transkriptionsinformationen auf wenige Modellorganismen von Angiospermen beschränkt, so dass diese Informationen die Basis für die Forschung an Trockenheit und Hitzestress darstellen. Die Untersuchung der Stressadaption innerhalb und zwischen verschiedenen Pflanzengattungen ist von besonderer Relevanz. Vor diesem Hintergrund habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit die Überlebensstrategie der extremophilen Wüstenpflanze Phoenix dactylifera (Dattelpalme) im Vergleich zu zwei Mesophilen, der Kulturpflanze Hordeum vulgare (Gerste) und der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, untersucht. Dattelpalmen sind nicht sukkulente Wüstenpflanzen, die auch unter extremen Trocken- und Hitzebedingungen in den Wüsten der Arabischen Halbinsel wachsen und ertragreich Früchte produzieren. In Phoenix dactylifera ist bislang weder die Molekularbiologie und –physiologie der Schließzellen, vor allem der Anionenkanäle, verstanden, noch wurde der Hitzeschutz ihrer Zuckertransportproteine untersucht. Um die stomatäre Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA (Abscisinsäure) zu verstehen, klonierten wir die Hauptkomponenten des schnellen ABA-Signalwegs von Schließzellen und analysierten den Öffnungsmechanismus der Anionenkanäle aus der Dattelpalme und der Gerste vergleichend zu dem Anionenkanal aus Arabidopsis im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Beide monokotyledonen Pflanzenarten (Gerste und Dattelpalme) besitzen stomatäre Komplexe, die aus Schließzellen und Nebenzellen bestehen. Dies unterscheidet die Monokotyledonen von den Dikotyledonen, die normalerweise Stomakomplexe aufweisen, die nur aus einem Paar Schließzellen gebildet werden. Interessanterweise schlossen sich Dattelpalmen- und Gerstenstomata als Reaktion auf das Trockenstresshormon ABA nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat. Der heterolog-exprimierte Anionenkanal PdSLAC1 wird durch die ABA-Kinase PdOST1 aktiviert und diese Aktivierung wird durch die Koexpression der PP2C-Phosphatase ABI1 gehemmt. Daher wird PdSLAC1 wie seine Orthologen aus Gerste und Arabidopsis durch ein ABA-abhängiges Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsnetzwerk gesteuert. PdOST1 aktivierte den Anionenkanal PdSLAC1 jedoch nur in Gegenwart von extrazellulärem Nitrat - eine elektrische Eigenschaft, die PdSLAC1 mit HvSLAC1 der Gerste gemein hat, sich jedoch von AtSLAC1 unterscheidet. Angesichts der Tatsache, dass in Gegenwart von Nitrat ABA den Stomaschluss verstärkt und beschleunigt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass bei Dattelpalmen und Gerste Nitrat als Ligand zum Öffnen von SLAC1 benötigt wird. Dies initiiert die Depolarisation der Schließzellen und leitet schließlich den Stomaschluss ein, um den Wasserverlust der Pflanzen unter Trockenstressbedingungen zu minimieren. Um die monokotyledone spezifische Nitratabhängigkeit von SLAC1 zu verstehen, führten wir ortsgerichtete Mutagenesestudien auf Basis eines 3D-Modells durch, welche zudem vergleichende Studien an Chimären von Monokotylen- und Dikotylen-SLAC1 Anionenkanälen umfassten. Unsere Struktur-Funktions-Forschung identifizierte zwei Aminosäurenreste auf der Transmembrandomäne 3 (TMD3), die eine wesentliche Rolle bei der Nitrat-abhängigen Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen monokotyledoner Pflanzen spielen. Die phylogenetische Analyse ergab schließlich, dass während der Evolution die für Monokotlyedonen spezifische Nitrat-abhängige Regulierung erst nach der Trennung in Monokotyledonen und Dikotyledonen auftrat. Durch die Nitrat-sensitive Regulierung von SLAC1 Anionenkanälen beruht der schnelle Stomaschluss von Monokotyledonen auf dem Zusammenspiel des Trockenstresshormons ABA und dem Stickstoffhaushalt der Pflanze. Da der ABA-Signalweg von Arabidopsis umfassend untersucht wurde, könnte die Entdeckung des monokotyledonen spezifischen Nitrat-abhängigen Motivs in TMD3 nun als Stellschraube zur Verbesserung der Züchtungsprogramme dikotyledoner Nutzpflanzen dienen. Wüstenpflanzen leiden nicht nur unter Trockenheit, sondern auch unter extremem Hitzestress. Wir konnten zeigen, dass hitzebelastete Dattelpalmen große Mengen der flüchtigen Kohlenwasserstoffverbindung Isopren (2-Methyl-1,3-Butadien) produzieren und emittieren. Durch die vorübergehende Freisetzung von Isopren kann die Pflanze die Photosynthese auch bei extremen Temperaturen betreiben. Es ist jedoch nicht bekannt, ob und wie Isopren in Hitzeperioden auch Transportprozesse durch biologische Membranen schützt. Um den Einfluss von Isopren auf den Transmembrantransport zu untersuchen, identifizierten und klonierten wir den Protonen-gekoppelten Saccharosetransporter 1 (PdSUT1) der Dattelpalme und verglichen seine elektrischen Eigenschaften mit ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Interessanterweise waren das elektrische Verhalten, die kinetischen Eigenschaften und die Temperaturabhängigkeit beider Transporter ähnlich. Die Anwendung von Isopren veränderte jedoch massiv die Affinität von ZmSUT1 zu seinem Substrat Saccharose, während die Affinität des Transporters der Dattelpalme nur schwach beeinflusst wurde. Es wird angenommen, dass die Membranfluidität unter Hitzestress erniedrigt ist, welches durch Interkalierung von Isopren mit den Fettsäureketten biologischer Membrane einhergeht. Dies und die Unempfindlichkeit von PdSUT1 gegenüber Isopren deuten darauf hin, dass der Saccharosetransporter PdSUT1 aus der Wüstenpflanze auch bei hohen Temperaturen Saccharose mit hoher Affinität transportiert. Zukünftige Studien müssen nun klären, ob der flüchtige Kohlenwasserstoff Isopren einen direkten Einfluss auf den Transporter selbst hat oder Isopren in die Membran integriert und damit indirekt die Eigenschaften von Transportproteinen beeinflusst. Unabhängig von der Wirkungsweise von Isopren sollte nicht unerwähnt bleiben, dass PdSUT1 gegenüber Isopren weniger empfindlich ist als sein Ortholog ZmSUT1 aus Mais. Dies kann auf eine Anpassung des Saccharosetransporters an die extremen Hitzeperioden und die damit einhergehende Isoprenemission von Dattelpalmen zurückzuführen sein. N2 - Low water availability and heat stress present major barriers to achievíng high biomass and full yield potential in crops. Global climate change is accompanied by a subtle increase in the severity of these abiotic stresses. Thus, the adaptation of crop species to the changing climate is required in order to sustain agricultural productivity in the future. Currently, our knowledge of plant strategies for abiotic stress tolerance as well as genomic and transcriptional information is limited to a few model angiosperms, providing a starting point for the understanding of responses to drought and/or heat stress, within and across species. In the framework of my PhD thesis, we followed a different strategy to learn about abiotic stress tolerance: we studied the survival strategy of the extremophilic desert plant Phoenix dactylifera (date palm) in comparison to the crop Hordeum vulgare (barley) and the model plant Arabidopsis thaliana, both from temperate zones. Date palms grow and produce fruits even under extreme drought and heat conditions in the deserts of the Arabian Peninsula. Neither the molecular biology and physiology of guard cells nor the heat protection of transport protein mediated sugar and ion transport processes have been studied so far in this non-succulent desert plant, Phoenix dactylifera. To understand the stomatal response to the water stress phytohormone ABA (abscisic acid), we cloned the major components for guard cell fast abscisic acid signaling and analysed the anion channel opening mechanism of the date palm side by side with barley and Arabidopsis in Xenopus oocytes. Both monocot plant species (barley and date palm) possess stomatal complexes consisting of guard cells and subsidiary cells. This distinguishes monocot species from dicots, which usually exhibit stomatal complexes formed by a pair of guard cells only. Interestingly, date palm and barley stomata closed in response to the drought stress hormone ABA only in the presence of extracellular nitrate. Heterologously expressed Phoenix SLAC1-type anion channel PdSLAC1 is activated by the ABA kinase PdOST1 and this activation is inhibited by the coexpression of PP2C phosphatase ABI1 – thus like its counterparts from barley and Arabidopsis, PdSLAC1 is controlled by an ABA-dependent phosphorylation/dephosphorylation network. However, PdOST1 did activate the desert plant anion channel PdSLAC1 only in the presence of extracellular nitrate – an electrical property that PdSLAC1 shares with the barley SLAC1 but distinguishes both monocot SLAC1 channels from AtSLAC1. Given that, in the presence of nitrate, ABA enhanced and accelerated stomatal closure, our findings indicate that the guard cell osmotic motor driving stomatal closure in date palm and barley uses nitrate as the signal to open the major anion channel SLAC1. This initiates guard cell depolarization and finally stomatal closure to prevent plant wilting under drought stress conditions. To understand the monocot-specific SLAC1 nitrate dependency, we performed a 3D-model- based site-directed mutagenesis study including chimeric channels between monocot and dicot SLAC1 anion channels. Our structure-function research identified two residues on transmembrane domain 3 (TMD3) that play an essential role in nitrate-dependent gating of monocot SLAC1-type anion channels. Phylogenetic analysis finally revealed that during evolution the monocot specific nitrate-dependent gating was established after the split between monocots and dicots. Thus, the success of monocot species may in part rely on the integration of drought signals (ABA) and the nitrogen nutrition status of the plant via nitrate-sensitive gating of SLAC1 anion channels. Since the Arabidopsis ABA-signaling pathway has been extensively studied, the discovery of the monocot-specific nitrate dependent motif on TMD3 could now serve as a set screw to improve the breeding programs of dicot agricultural crops. Desert plants not only suffer from drought but also from extreme heat stress. We could show that heat-stressed date palms produce and emit high amounts of the volatile hydrocarbon compound isoprene (2-Methyl-1,3-Butadien). The temporary release of isoprene allows the plant to perform photosynthesis even under extreme temperatures. However, it is not known whether and how isoprene also protects transport processes across biological membranes in periods of heat. To study the influence of isoprene on transmembrane transport, we identified and cloned the date palm proton-coupled sucrose transporter 1 (PdSUT1) and compared its electrical properties with ZmSUT1 (Zea mays Sucrose Transporter 1) in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. Interestingly, the electrical behavior, the kinetic properties and the temperature dependence of both carriers were similar. However, the response to isoprene application massively altered the affinity of ZmSUT1 to its substrate sucrose while the affinity of the date palm transporter was only weakly affected. The intercalation of isoprene with the fatty acid chains of biological membranes is believed to decrease the membrane fluidity under heat stress. This and the insensitivity of PdSUT1 towards isoprene may indicate that the desert plant sucrose transporter PdSUT1 transports sucrose with high affinity even at high temperatures. Future studies must now clarify whether the volatile hydrocarbon isoprene has a direct influence on the carrier itself or isoprene integrates into the membrane and thus indirectly influences the properties of transport proteins. Regardless of the mode of action of isoprene, it remains to be noted that PdSUT1 is less sensitive to isoprene than its orthologue from maize. This may be an adaptation of the sucrose carrier to the extreme heat periods and the accompanying isoprene emission from date palms. KW - Dattelpalme KW - Gerste KW - Elektrophysiologie KW - Hitzestress KW - Schließzelle KW - Anionenkanal KW - Zuckertransporter KW - SLAC1 KW - SUT1 KW - Signaltransduktion KW - ZmSUT1 KW - Phoenix dactylifera KW - Hordeum vulgare KW - Zea mays Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186491 ER - TY - THES A1 - Zhu, Mo T1 - Germination and differentiation of \(Blumeria\) \(graminis\) ascospores and effects of UV-C and white light irradiation on \(B.\) \(graminis\) conidial prepenetration T1 - Keimung und Differenzierung von \(Blumeria\) \(graminis\) Ascosporen und Effekte von UV-C und Weißlichtbestrahlung auf die Konidienpräpenetration von \(B.\) \(graminis\) N2 - Blumeria graminis, the obligate biotrophic grass powdery mildew, is a highly pathogenic fungus capable of inflicting foliar diseases and of causing severe yield losses. There is asexual and sexual propagation in the life cycle of B. graminis. In the epidemiological processes of this pathogen, both types of spores - asexual conidia and sexual ascospores – are crucial. Conidia of B. graminis are demonstrated to perceive cuticular very-long-chain aldehydes as molecular signal substances notably promoting germination and differentiation of the infection structure (the appressorium) – the prepenetration processes – in a concentration- and chain-length-dependent manner. Conidial germination and appressorium formation are known to be dramatically impeded by the presence of free water on the host surface. However, sexually formed ascospores are reported to easily germinate immersed in water. There are abundant assays on conidial prepenetration processes. However, with respect to the stimulating effects of very-long-chain aldehydes and to the influence of the presence of free water, ascosporic prepenetration processes are still obscure. In order to study the effects of very-long-chain aldehydes on the ascosporic prepenetration processes of wheat powdery mildew fungus B. graminis f. sp. tritici, Formvar®-based in vitro systems were applied to exclude the secondary host effects (such as host resistance) and to reproducibly provide homogeneous hydrophobic substratum surfaces. By the presence of even-numbered very-long-chain aldehydes (C22 - C30), the appressorium formation of the ascospores was notably triggered in a chain-length dependent manner. N-octacosanal (C28) was the most inducing aldehyde tested. Unlike conidia, ascospores could easily differentiate immersed in water and showed a more variable differentiation pattern even with a single germ tube differentiating an appressorium. To evaluate the alternative management against barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei, the suppressing effects of UV-C irradiation on the developmental processes of conidia on artificial surfaces (in vitro) and on host leaf surfaces (in vivo) were assayed. In vitro and in vivo, a single dose of 100 J m-2 UV-C was adequate to decrease conidial germination to < 20 % and to reduce appressorium formation to values < 5 %. UV-C irradiation negatively affected colony pustule size and vegetative propagation. Under photoperiodic conditions of 2h light/16h dark, 6h dark/12h light or 6h dark/18h light, UV-C-treated conidia showed photoreactivation (photo-recovery). White light-mediated photoreactivation was most effective immediately after UV-C irradiation, suggesting that a prolonged phase of darkness after UV-C application increased the efficacy of management against B. graminis. UV-C irradiation increased transcript levels of three putative photolyase genes in B. graminis, indicating those were probably involved in photoreactivation processes. However, mere white light or blue light (wavelength peak, 475 nm) could not induce the up-regulation of these genes. To determine whether visible light directly impacted the prepenetration and penetration processes of this powdery mildew pathogen, conidia of Blumeria graminis f. sp. hordei and Blumeria graminis f. sp. tritici were inoculated onto artificial surfaces and on host leaf surfaces. Samples were analyzed after incubation periods under light conditions (white light intensity and spectral quality). Increasing white light intensities directly impaired conidial prepenetration processes in vitro but not in vivo. Applying an agar layer under the wax membrane compensated for conidial water loss as a consequence of high white light irradiation. Light stimulated in vitro and in vivo the appressorium elongation of B. graminis in a wavelength-dependent manner. Red light was more effective to trigger the elongation of appressorium than blue light or green light assayed. Taken together, the findings of this study demonstrate that 1) a host surface recognition principle based on cuticular very-long-chain aldehydes is a common feature of B. graminis f. sp. tritici ascospores and conidia; 2) the transcriptional changes of three putative photolyase genes in B. graminis are mediated in a UV-C-dependent manner; 3) light directly affected the (pre)penetration processes of B. graminis. N2 - Blumeria graminis, der obligate biotrophe Grasmehltau, ist ein hochpathogener Pilz, der in der Lage ist, Blätter zu schädigen und in Getreidekulturen schwere Ertragsverluste zu verursachen. Im Lebenszyklus von B. graminis kommen sowohl sexuelle als auch asexuelle Reproduktion vor. In den epidemiologischen Prozessen dieses Erregers sind beide Arten von Sporen - asexuelle Konidien und sexuelle Ascosporen - von entscheidender Bedeutung. Conidien von B. graminis reagieren nachweislich auf kutikuläre, sehr langkettige Aldehyde als molekulare Signalstoffe, die insbesondere die Keimung und Differenzierung der Infektionsstruktur (das Appressorium) - die Präpenetrationsprozesse - konzentrations- und kettenlängenabhängig fördern. Es ist bekannt, dass die Konidienkeimung und Appressoriumbildung durch die Anwesenheit von freiem Wasser auf der Wirtsoberfläche dramatisch behindert wird, während sexuell gebildete Ascosporen unter diesen Bedingungen keimen. Es gibt zahlreiche Untersuchungen zu Konidien-Präpenetrationsprozessen. Im Hinblick auf die stimulierende Wirkung von langkettigen Aldehyden und den Einfluss von freiem Wasser sind die askosporischen Präpenetrationsprozesse jedoch noch unklar. Um die Effekte langkettiger Aldehydmoleküle auf die ascosporischen Präpenetrationsprozesse von Weizenmehltaupilz zu untersuchen, wurde B. graminis f. sp. tritici auf Formvar®-basierten In-vitro-Systemen angewendet. Dadurch konnten sekundäre Wirtseffekte (wie Wirtsresistenz) ausgeschlossen und homogene hydrophobe Substratoberflächen reproduzierbar bereitgestellt werden. Die Anwesenheit geradzahliger sehr langkettiger Aldehyde (C22 – C30) erhöhte deutlich die Ausbilung des Appressoriums von Ascosporen. Von den getesteten Aldehyden zeigte n-Octacosanal (C28) die größte Induktionskraft. Im Gegensatz zu Konidien konnten bei Ascosporen auch unteri Anwesenheit von freiem Wasser variable Differenzierungsmuster festgestellt werden, bei denen auch einzelne Keimröhren zur Differenzierung des Appressoriums führten. Zur Bewertung der alternativen Bekämpfung gegen Gerstenmehltaupilz Blumeria graminis f. sp. hordei wurde die Unterdrückungswirkung von UV-C-Strahlung auf die Entwicklungsprozesse von Konidien auf künstlichen Oberflächen (in vitro) und auf Wirtsblattoberflächen (in vivo) untersucht. In vitro und in vivo war eine Einzeldosis von 100 J m-2 UV-C ausreichend, um die Konidienkeimung auf < 20 % zu verringern und die Appressoriumsbildung auf Werte < 5 % zu reduzieren. Die UV-C-Bestrahlung beeinflusste die Größe der Kolonepusteln und die vegetative Vermehrung negativ. UV-C behandelte Konidien wurden unterschiedlichen Lichtverhältnissen ausgesetzt: 2 h hell / 16 h dunkel, 6 h dunkel / 12 h hell und 6 h dunkel / 18 h hell. Dabei zeigten sie unterschiedliche Photoreaktivierungsaktivitäten. Die Weißlicht-vermittelte Photoreaktivierung war unmittelbar nach der UV-C-Behandlung am effektivsten, was darauf hindeutet, dass eine verlängerte Phase der Dunkelheit nach der UV-C-Anwendung die Wirksamkeit des Managements gegen B. graminis erhöhte. UV-C-Bestrahlung erhöhte die Transkriptmengen von drei mutmaßlichen Photolyase-Genen in B. graminis, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich an Photoreaktivierungsprozessen beteiligt waren. Weißes oder blaues Licht (Wellenlängen-Peak, 475 nm) konnte die Hochregulation dieser Gene nicht induzieren. Um zu bestimmen, ob sichtbares Licht direkt auf die Präpenetrations- und Penetrationsvorgänge dieses Mehltau-Erregers einwirkt, wurden Konidien von Blumeria graminis f. sp. hordei und Blumeria graminis f. sp. tritici auf künstliche Oberflächen und auf Wirtsblattoberflächen inokuliert. Die Proben wurden nach Inkubationunter verschiedenen Lichtbedingungen (Weißlichtintensität und Spektralqualität) analysiert. Das Auftragen einer Agarschicht unter der Wachsmembran kompensierte den Wasserverlust der Konidien als Folge der Bestrahlung mit hoher Lichtintensität. Zunehmende Weißlichtintensitäten beeinträchtigten Konidienpräpenetrationsprozesse direkt in vitro, aber nicht in vivo. Eine wellenlängenabhängige Stimulation der Verlängerung des Appressoriums konnte sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet werden. Dabei war rotes Licht wirksamer, um die Verlängerung des Appressoriums auszulösen, als blaues oder grünes Licht. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass 1) ein Prinzip der Wirtsoberflächenerkennung basierend auf kutikulären, sehr langkettigen Aldehyden ein gemeinsames Merkmal von B. graminis f sp. tritici Ascosporen und Konidien ist; 2) die Transkriptionsänderungen von drei putativen Photolyase-Genen in B. graminis in einer UV-C-abhängigen Weise vermittelt werden und 3) Licht direkt die (Vor-) Penetrationsvorgänge von B. graminis beeinflusste. KW - Powdery mildew fungus KW - Germination and differentiation KW - Cuticle KW - Irradiation KW - Blumeria graminis KW - Bestrahlung Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166470 ER - TY - THES A1 - Kreckel, Jennifer T1 - Das Adapterprotein TRAF2 und seine Bedeutung für die Todesrezeptor-vermittelte Signaltransduktion T1 - The adaptor protein TRAF2 and its meaning for the death receptor induced signal transduction N2 - Während die Rolle des tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in der Signaltransduktion der TRAF-interagierenden Rezeptoren der TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) bereits in der Vergangenheit umfassend erforscht wurde, ist die Rolle und Funktion dieses Adapterproteins für die Signalgebung der Todesrezeptoren nicht vollständig aufgeklärt. Die unklare Funktion der Really Interesting New Gene (RING) E3 Ligase Domäne in TRAF2 und die Abhängigkeit von Caspasen für die Aktivierung des klassischen nuclear factor κB (NFκB)-Signalweges führten in dieser Arbeit zur Herstellung von CRISPR/Cas9 knockout (KO) Zellen, bei denen TRAF2 in der Kolorektalkarzinomzelllinie HCT116 als auch in den Fibrosarkomzellen HT1080 ausgeschaltet wurde. Diese Zellen wurden zuvor so modifiziert, dass die Apoptose „downstream“ der Caspase-8-Aktivierung nicht weiter induzierbar war. HCT116-Zellen exprimierten hierzu ein mutiertes Allel der Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) und HT1080-Bcl2-TNFR2 Zellen das anti-apoptotische Protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2). Im Fokus dieser Arbeit waren die Todesrezeptoren TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 und Cluster of Differentiation(CD)95. In den TRAF2-KO Zelllinien war der alternative NFκB Signalweg konstitutiv aktiv und der TNFR1-induzierte klassische NFκB-Signalweg inhibiert. Die proinflammatorische Signalgebung in Form der Interleukin (IL)8 Produktion war in den CD95-artigen Todesrezeptoren signifikant, aber nicht vollständig, reduziert und erfolgte Caspase-8-Aktivität unabhängig. Der Effekt der TRAF2-Deletion konnte durch eine Rekonstitution von TRAF2, jedoch nicht durch eine Überexpression von TRAF1 wiederhergestellt werden. Des Weiteren führte die TRAF2-Defizienz zu einer verstärkten Procaspase-8- Prozessierung nach Aktivierung von Todesrezeptoren, die überraschenderweise mit einer Reduktion der Caspase-8-Aktivität einherging. Die Prozessierung der Procaspase-8, jedoch nicht die Aktivierung des klassischen NFκB-Signalweges wurde vermutlich durch eine verringerte Rekrutierung von cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP)1 an den TNFR1 erreicht. Die Expression der anti-apoptotischen Proteine FADD-like ICE (FLICE) Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) und cIAP1 wurde nicht von der TRAF2-Depletion beeinflusst. Somit konnte in dieser Arbeit ein nicht-obligatorischer Effekt von TRAF2 auf die Regulation der proinflammatorischen Todesrezeptor-vermittelten Signaltransduktion nachgewiesen werden, die durch TRAF1 nicht ersetzt werden kann. Des Weiteren wurde eine bisher nicht beschriebene, stabilisierende Wirkung von TRAF2 auf die Capsase-8-Aktivität gezeigt. N2 - The role of tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor (TRAF)2 in signaltransduction of TRAF-interacting receptors of the TNF Receptor (TNFR)- Superfamily (TNFRSF) is well-studied during the last decades. The role and the function of this adapter protein for the signaling of death receptors, however, still remains largely unclear. Ambiguous E3 ligase function of their TRAF2-Really Interesting New Gene (RING) domain and the dependency from caspase-8 for classical nuclear factor κB (NFκB) activation resulted in this work in the generation of TRAF2-Knockout (KO) CRISPR/Cas9 cells both in the colorectal carcinoma cell line HCT116 and in the fibrosarcoma cell line HT1080. These cell lines were previously modified to gain apoptosis-resistance downstream the activation of caspase-8. Therefore, HCT116 cells expressed a mutated allele of the phosphoinositide-3-kinase (PI3K) and HT1080-TNFR2 cells expressed the anti-apoptotic protein B-cell lymphoma 2 (Bcl2). Focus of this study was the death receptors TNFR1, TNF-Related Apoptosis Inducing Receptor (TRAILR)1/2 and Cluster of Differentiation (CD)95. TRAF2-KO cells displayed a constitutive active alternative NFκB pathway and inhibition of the TNFR1-induced classical NFκB pathway. The stimulation of proinflammatory signaling in the form of upregulation of interleukin (IL)8 production was reduced partially but significantly in CD95-type death receptors and in a caspase-8-activity independent way. The reconstitution of TRAF2 but not an overexpression of TRAF1 was able to reverse the effects of TRAF2 deficiency. Additionally, the TRAF2-depletion increased DR-induced procaspase-8-processing, surprisingly resulting in the downregulation of caspase-8-activity. Processing of procaspase-8, but not the activation of the classical NFκB-pathway were presumably achieved by an inhibition of the recruitment of cellular inhibitor of apoptosis protein 1 (cIAP1) to the TNFR1. Expression of the anti-apoptotic proteins FLICE Inhibitory Protein (FLIP)Long(L), FLIPShort(S) and cIAP1 were unaffected by TRAF2-depletion. Taken together, this work was able to show a non-obligate effect of TRAF2 in the regulation of DR-induced proinflammatory signaling, which was not restorable by TRAF1. Furthermore, we saw a stabilizing effect of TRAF2 on caspase-8 activity, which was not described previously. KW - Adapterproteine KW - TRAF KW - Signaltransduktion KW - TRAF2 KW - Todesrezeptor Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200384 ER - TY - THES A1 - Walper [geb. Schwarz], Elisabeth T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren in der pflanzlichen Antwort auf das Oxylipin 9-Hydroxyoktadekatriensäure (9-HOT) T1 - Identification and characterization of transcription factors in the plant signaling Response to the oxylipin 9-hydroxyoctadekatrienoic acid (9-HOT) N2 - Oxylipine werden in der Pflanze unter Stressbedingungen gebildet. Die dafür notwendige Oxidation von Fettsäuren wird entweder nicht-enzymatisch über Radikale wie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder enzymatisch über Lipoxygenasen katalysiert. Abhängig von der Position der Oxidation in der Fettsäure entstehen dabei C13- oder C9-Oxylipine. Sehr gut erforscht sind C13-Oxylipine wie Jasmonsäure (JA), die bei biotischem Stress und Verwundung gebildet werden und bei exogener Gabe das Wurzelwachstum von Arabidopsis thaliana hemmen. Die C9-Oxylipine wie 9-Hydroxyoktadekatriensäure (9-HOT) sind erst wenig erforscht. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Transkriptionsfaktoren, mit dem Fokus auf 9-HOT-vermittelte Signalwegen in Arabidopsis thaliana. Da bekannt ist, dass auch sie zu einer Hemmung des Wurzelwachstums führen, wurde dazu die Untersuchung des Wurzelwachstums von 10 Tage alten Keimlingen etabliert. Funktionsgewinn-Mutanten des Transkriptionsfaktors TGA5 sowie des TGA5-Zielgens CYTOCHROM P450 MONOOXYGENASE CYP81D11 zeigten auf 9-HOT ein verglichen mit Col-0 deutlich besseres Wurzelwachstum. Die AtTORF-Ex-Kollektion, eine große Sammlung an Überexpressions-Linien verschiedener Transkriptionsfaktoren, wurde hinsichtlich Wurzelwachstums auf dem Oxylipin 9-HOT analysiert. Die Gesamtheit der untersuchten Pflanzen enthielt 263 unabhängige TF-Expressions-Konstrukte. Von 6087 untersuchten Pflanzen zeigten 201 Pflanzen keine Hemmung des Wurzelwachstums auf 9-HOT. Dabei konnten 80 verschiedene Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, deren Überexpression die Wurzelwachstums-hemmende Wirkung von 9-HOT kompensiert. Es zeigte sich eine Häufung von Transkriptionsfaktoren der ERF- (ethylene responsive factor) Familie. Die verstärkte Expression der nahe verwandten Transkriptionsfaktoren ERF106 und ERF107 ermöglichte sowohl auf 9-HOT als auch auf 9-KOT ein längeres Wurzelwachstum im Vergleich zum Wildtyp. Die Genexpression von ERF106 und ERF107 wird durch Überflutung aktiviert. Durch Überflutung wird im Wildtyp die Expression von Hypoxia-Antwort-Genen wie HRE1, SUS4 oder PDC1 induziert. In den Funktionsverlust-Mutanten sind diese Gene in der Expression aber nicht beeinflusst. Auch ist nach Überflutung im normalen Tag / Nacht-Rhythmus kein signifikanter Unterschied im Überleben zwischen Col-0 und den Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 nachweisbar. Zur Identifikation möglicher Ziel-Gene von ERF106 und ERF107 wurden Transkriptom-Analysen durchgeführt. Die Funktionsverlust-Mutanten erf106, erf107 und erf106xerf107 zeigten weder im Grundzustand noch nach 4 Stunden Überflutung Veränderungen in den bekannten Hypoxia-Antwort-Genen. Die Funktionsgewinn-Mutanten von ERF106 und ERF107 zeigten in der Transkriptom-Analyse eine deutliche Aktivierung von Genen, die wichtig für Entgiftung und Stressabwehr sind. Ebenso wurden wichtige Biosynthese-Gene aus der Camalexin- und Glukosinolat-Synthese in den Funktionsgewinn-Mutanten verstärkt exprimiert. Des Weiteren konnte eine verringerte Expression von Genen beobachtet werden, die wichtig für die Regulation der Eisen-Aufnahme sind, darunter bHLH-Transkriptionsfaktoren, der Eisen-Transporter IRON REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) und die Eisen-Reduktase FERRIC REDUCTION OXIDASE 2 (FRO2). Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit durch die Untersuchung der AtTORF-Ex-Kollektion mehrere TF identifiziert, die wichtige Abwehr-Gene gegen Stress- und Vergiftung sowie bedeutende Gene im Bereich der Biosynthese und Eisenaufnahme regulieren können, um so die Antwort auf C9-Oxylipine zu beeinflussen. N2 - Oxylipins are built under stress conditions. They are the results of fatty acids oxidation that occurs either non-enzymatically by the action of free radicals like reactive oxygen species (ROS) or enzymatically by lipoxygenases conversion. There are two kinds of oxylipins, C13- or C9-, according to the position of the oxidation on the fatty acid back bone. Whereas C13-oxlipins like jasmonic acid (JA) are well characterized, little is known about C9-oxylipins like 9-hydroxyoctadecatrienoic acid (9-HOT). Both of them are generated as consequence of biotic stress or wounding and a common phenotypical mark is their ability to inhibit root growth of Arabidopsis seedlings. Preliminary studies have demonstrated that overexpression of the transcription factor TGA5 or its target gene CYTOCHROM P450 MONOOXYGENASE CYP81D11 make the plants more resistant than wildtype Col-0 to oxylipins-driven root inhibition. The aim of the work presented in this thesis was to identify and characterize transcription factors involved in 9-HOT induced signaling. At the beginning, a screening aiming at the identification of transcription factors involved in the 9-HOT signaling was set up. The root growth of 10 day old seedlings from the AtTORF-Ex-collection grown on 9-HOT containing medium was analyzed. All analyzed plants harbor 263 independent TF expression constructs. Of 6087 analyzed plants 201 plants showed no inhibition of root growth on 9-HOT. Plant overexpressing 80 different transcription factors showed a long root-phenotype on 9-HOT containing medium, indicating that in this plants the 9-HOT activated signaling was impaired. Among them, ERF-transcription factor family was overrepresented. Overexpression of the closely related ERF106 and ERF107 enabled longer root growth compared to wild-type on 9-HOT as well as on 9-KOT. Analysis of the stimuli inducing the alteration of the expression of ERF106 and ERF107, identified submergence as one of the main one. Under hypoxic conditions in wildtype, the expression of hypoxia-response-genes like HRE1, SUS4 or PDC1 is induced. Expression levels of these genes are not affected in erf106, erf107 and erf106xerf107 loss-of-function mutants. Examination of the survival rate after submergence did not reveal significant differences between Col-0 and the loss-of-function-mutants erf106, erf107 und erf106xerf107, at least under normal day-night-rhythm. To identify target genes of ERF106 and ERF107, transcriptome analysis were performed. The loss-of-function-mutants erf106, erf107 and of their double mutant did not show any differences in the known hypoxia responses, neither in control nor 4 hours after submergence. The gain-of-function-mutants of ERF106 and ERF107 exhibit a distinct gene activation of genes important for detoxification and stress regulation and defense. Moreover, genes for camalexin and glucosinolate biosynthesis pathway were up-regulated in these gain-of-function mutants. Genes crucial for regulation of iron uptake like bHLH transcription factors, iron transporter IRON REGULATED TRANSPORTER 1 (IRT1) and iron reductase FERRIC REDUCTION OXIDASE 2 (FRO2), whereas, show a reduced expression in these mutants. The analysis of the AtTORF-Ex-collection revealed some interesting TFs that can regulate genes important for stress response and detoxification, and thereby influence the response to C9-oxylipins. KW - Oxylipine KW - 9-HOT KW - Transkriptionsfaktor KW - 9-Hydroxyoktadekatriensäure KW - AtTORF-Ex-Kollektion KW - Stress KW - Signalling Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128047 ER - TY - THES A1 - Graus, Dorothea T1 - Auswirkungen einer V-PPase-Überexpression auf Nicotiana benthamiana Blattzellen und deren physiologische Bedeutung unter Salzbelastung T1 - The Effects of V-PPase overexpression on Nicotiana benthamiana leaf cells and their physiological significance under saline load N2 - Vakuoläre PPasen (V-PPase) in Landpflanzen dienen dem Transport von Protonen in die Vakuole und dem Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, während sie gleichzeitig durch Hydrolyse eine Anreicherung des toxischen PPi im Cytosol verhindern. Zahlreiche Publikationen bewiesen bereits positive Effekte der stabilen V-PPase-Überexpression in Pflanzen. Unter anderem zeigte die Ackerschmalwand, Tabak, Reis und Tomate eine erhöhte Biomasse und gesteigerte Stresstoleranz auf Grund einer erhöhten stabilen V-PPase Ex-pression. Um die zugrundeliegenden Prozesse ohne potenzielle pleiotropische Effekte während der Pflanzenentwicklung zu analysieren, wurden in der vorliegenden Dissertation die physiologischen Auswirkungen einer transienten V-PPase-Überexpression in Nicotiona benthamiana Blättern und die Einflussnahme von NaCl quantitativ erfasst. Zu diesem Zweck wurden zwei endogene V-PPasen (NbVHP1 und NbVHP2) aus N. bentha-miana zunächst bioinformatisch und dann auf Transkriptionsebene mittels quantitativer Real-Time-PCR identifiziert. Die endogenen V-PPasen wurden mittels der Agrobakterien-Infiltrationstechnik transient in N. benthamiana Blättern und ihre vakuoläre Lokalisation mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bestätigt. Die Protonenpump-Funktion der überexprimierten NbVHPs konnte mit der Patch-Clamp-Technik anhand des vier-fach erhöhten Protonenpump-stroms in den isolierten Mesophyllvakuolen verifiziert werden. Im Zuge der elektro-physiologischen Charakterisierung der endogenen N. benthamiana V-PPasen konnte die für V-PPasen typische Sensitivität gegenüber cytosolischem Calcium bestätigt werden, welche sich bei einem erhöhten Calcium-Spiegel in einer Hemmung der Pumpströme äußerte. Ferner wurde ihre gleichartige Substrataffinität (Km von 65 µM PPi) unabhängig des vakuolären pHs zwischen 5,5 und 7,5 festgestellt. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit analog durchgeführten Messungen an der bereits publizierten AtVHP1 von A. thaliana bestätigte die große Homo-logie der V-PPasen von Landpflanzen. Im Gegensatz zu den erwünschten Auswirkungen der stabilen V-PPase Überexpression resultierte diese starke transiente Überexpression nach drei Tagen im Absterben makroskopischer Blattbereiche. Das Ausmaß dieser Nekrosen wurde anhand des vorhandenen PhotosystemII in den transformierten Blättern mit der Puls-Amplituden-Modulations-Technik quantifiziert. Die analoge transiente Überexpression einer löslichen PPase (IPP1) führte allerdings zu keinerlei negativen Effekten für die Pflanze, wodurch die erhöhte Protonentransportaktivität im Gegensatz zur Hydrolyseaktivität der V-PPasen als Ursache des Zellsterbens verifiziert werden konnte. Aufgrund dieser unerwarteten negativen Auswirkungen der transienten V-PPase-Überex-pression auf die Blattvitalität wurde zusätzlich die Salzstresstoleranz der Blätter untersucht. Unter Berücksichtigung des kurzen Transformations- und damit Beobachtungszeitfensters wurde ein Salzapplikationsverfahren etabliert, bei dem simultan mit der Agrobakterien-infiltration 200 mM NaCl direkt in den Blattapoplasten eingeführt wurde. Anhand einer Zu-nahme in sowohl der Transskriptmenge der V-PPase als auch des PPi-induzierten Protonen-pumptransportes über den Tonoplasten wurde gezeigt, dass die NaCl-Anwesenheit im Blatt eine erhöhte Aktivität der endogenen V-PPasen des N. benthaminan Pflanzen bewirkte. Der gleichzeitige tendenzielle Rückgang der V-ATPase-Pumpaktivität in salzbehandelten Mesophyllvakuolen lässt vermuten, dass die V-PPasen eine größere Rolle bei der Bewahrung des vakuolären pH-Wertes und der protonenmotorische Kraft (PMF) unter Salzstress ein-nimmt. Interessanterweise führte die Salzapplikation bei einer V-PPase-Überexpression zu keinen additiven negativen Effekten, sondern verhinderte sogar das Auftreten der Nekrosen. Um dieses Phänomen zu ergründen, wurde zunächst mit Hilfe von Apoplastenwaschungen und Natrium-Konzentrationsmessungen bestätigt, dass das injizierte NaCl im Blatt verblieb und von den Blattzellen aufgenommen wurde. Für weitere Studien der Ursachen der Nekrosen wurden in-vivo-pH-, Membranpotenzial- und Metabolitmessungen durchgeführt. Während in V-PPase-überexprimierenden Zellen der vakuoläre pH-Wert zu Kontrollvakuolen signifikant sank, blieb er mit zusätzlicher Salzbehandlung auf Kontrollniveau. Des Weiteren schwächte die Salzapplikation die starke Depolarisation der Plasmamembran nach V-PPase-Über-expression um mehr als die Hälfte ab. Hingegen konnten keine nennenswerten Ver-änderungen im Metabolit- und Ionengehalt des Blattgewebes bei V-PPase-Überexpression festgestellt werden. Lediglich der Natrium- und Chlorid-Spiegel waren bei salz-behandelten Blättern erwartungsgemäß erhöht. Diese Ergebnisse bekräftigten, dass der stark erhöhte V-PPase-vermittelte Protonenpumpstrom und weniger metabolische Veränderungen für die Nekrosen von V-PPase-überexprimierte Pflanzen verantwortlich ist. Diese negativen Auswirkungen werden offensichtlich durch die Salzbehandlung stark vermindert, da die Aufnahme der Salz-ionen über Protonen-Na+/K+-Antiporter wie NHX antagonistisch auf die V-PPase verursachte Protonenanreicherung und die daraus folgende Veränderung des Membran-potentials und der PMF entgegenwirkt. In diese Arbeit wurde in einem neuen Blickwinkel deutlich, dass die natürliche Expressions-kontrolle der V-PPase in ausdifferenzierten Pflanzenzellen sich den Umweltbedingungen anpasst, um das Gleich-gewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der Pumpaktivität zu halten. N2 - The plant vacuolar PPases (V-PPase) transport protons across the tonoplast from the cytosol into the vacuole. This establishes a trans-tonoplast electrochemical gradient and prevents the accumulation of toxic PPi in the cytosol. Many publications have already shown positive effects of stable V-PPase overexpression in plants. Arabidopsis, tobacco, rice and tomato for example, all showed increased biomass and greater stress tolerance with stable V-PPase overexpression. To understand the underlying processes without potential pleiotropic effects during plant development, we characterised V-PPase in Nicotiana benthamiana leaves using an electrophysiological approach, and investigated its physiology in overexpressing plants, concentrating on its regulation by NaCl. Two endogenous V-PPases (NbVHP1 and NbVHP2) from N. benthamiana were identified using bioinformatics and quantified with real-time PCR. Endogenous V-PPases were transiently overexpressed using Agrobacteria in N. benthamiana leaves, with their vacuolar localisation confirmed by fluorescence labelling. The proton pump activity of the NbVHPs was verified by a fourfold increase in the patch clamp-recorded proton current response of isolated mesophyll vacuoles. For the electrophysiological characterisation of the endogenous V-PPases, the V-PPase-typical cytosolic calcium sensitivity was confirmed; the proton pump became inhibited with increased calcium levels. Furthermore, their similar substrate affinity, a Km of 65 μM PPi, was found to be independent of the vacuolar pH between 5.5 and 7.5. Both attributes were comparable to the already published AtVHP1 of Arabidopsis thaliana, showing a high homology of plant V-PPases. The physiological effects of V-PPase overexpression was obvious from the time-delayed death of transformed cells. In contrast to the desired effects of stable V-PPase over-expression, this strong transient overexpression resulted in macroscopic dead leaf areas after three days. The extent of these necroses was quantified by counting the existing photosystems in the transformed leaves using the pulse-amplitude modulation technique (PAM). In contrast, no necrosis was found in plants where a soluble PPase (IPP1) was over-expressed. This supports the hypothesis that the increased proton transport activity of V-PPases, not the hydrolysis activity, is the cause of cell death. Because of these unexpected negative effects of transient V-PPase over-expression on leaf vitality, the salt stress tolerance of the leaves was also examined. The short transformation and observation time window meant we needed to establish a new way of salt application; we injected 200 mM NaCl directly into the leaf apoplast simultaneously with the agrobacterial material. Absorption of NaCl by leaf cells was confirmed by apoplast washing and sodium concentration measurements. The NaCl treatment increased the amount of transcripts of endogenous V-PPases in tobacco and increased the PPi-induced proton transport across the vacuolar membrane. The concomitant decline in V-ATPase pumping activity in saline-treated mesophyll vacuoles indicates that V-PPases have a significant role in maintaining the vacuolar pH and proton motive force (PMF) under saline conditions. Interestingly, simultaneous salt administration with V-PPase overexpression did not result in an additive negative effect but did prevent the occurrence of necrotic leaf areas. For further analysis of the necrosis, in vivo pH, membrane potential and metabolite measurements were performed. Under V-PPasen over-expression and salt treatment, the vacuolar pH remained constant and did not decrease as it did in non-salt-treated V-PPase over-expressing cells. Furthermore, the salt application attenuated the strong depolarisation of the plasma membrane by more than a half in V-PPase overexpressing plants, but no noteworthy changes in cell metabolism could be detected by metabolite and ion concentration measurements. Only the Na+ and Cl- levels were, as expected, increased in salt-treated leaves. This decrease in vacuolar pH alongside a membrane depolarisation confirms that the strong proton pump current of the V-PPase overexpressing vacuoles is the cause of the observed necrosis. These negative effects are obviously greatly reduced by salt treatment, since the uptake of the salt ions via proton:Na+/K+ antiporters such as NHX acts as an antagonist to V-PPase-induced proton accumulation in the vacuole and the consequent change in membrane potential and PMF. This work reveals in a new perspective, that the natural expression control of V-PPase in differentiated plant cells adapts to environmental conditions to balance the positive and negative effects of pumping activity. KW - Pyrophosphatase KW - Vakuole KW - Nicotiana benthamiana KW - Membrantransport KW - Salzstress KW - transiente Transformation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193676 ER -