TY - JOUR A1 - Mammadova-Bach, Elmina A1 - Braun, Attila T1 - Zinc homeostasis in platelet-related diseases JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Zn\(^{2+}\) deficiency in the human population is frequent in underdeveloped countries. Worldwide, approximatively 2 billion people consume Zn\(^{2+}\)-deficient diets, accounting for 1–4% of deaths each year, mainly in infants with a compromised immune system. Depending on the severity of Zn\(^{2+}\) deficiency, clinical symptoms are associated with impaired wound healing, alopecia, diarrhea, poor growth, dysfunction of the immune and nervous system with congenital abnormalities and bleeding disorders. Poor nutritional Zn\(^{2+}\) status in patients with metastatic squamous cell carcinoma or with advanced non-Hodgkin lymphoma, was accompanied by cutaneous bleeding and platelet dysfunction. Forcing Zn\(^{2+}\) uptake in the gut using different nutritional supplementation of Zn\(^{2+}\) could ameliorate many of these pathological symptoms in humans. Feeding adult rodents with a low Zn\(^{2+}\) diet caused poor platelet aggregation and increased bleeding tendency, thereby attracting great scientific interest in investigating the role of Zn\(^{2+}\) in hemostasis. Storage protein metallothionein maintains or releases Zn\(^{2+}\) in the cytoplasm, and the dynamic change of this cytoplasmic Zn\(^{2+}\) pool is regulated by the redox status of the cell. An increase of labile Zn\(^{2+}\) pool can be toxic for the cells, and therefore cytoplasmic Zn\(^{2+}\) levels are tightly regulated by several Zn\(^{2+}\) transporters located on the cell surface and also on the intracellular membrane of Zn\(^{2+}\) storage organelles, such as secretory vesicles, endoplasmic reticulum or Golgi apparatus. Although Zn\(^{2+}\) is a critical cofactor for more than 2000 transcription factors and 300 enzymes, regulating cell differentiation, proliferation, and basic metabolic functions of the cells, the molecular mechanisms of Zn\(^{2+}\) transport and the physiological role of Zn\(^{2+}\) store in megakaryocyte and platelet function remain elusive. In this review, we summarize the contribution of extracellular or intracellular Zn\(^{2+}\) to megakaryocyte and platelet function and discuss the consequences of dysregulated Zn\(^{2+}\) homeostasis in platelet-related diseases by focusing on thrombosis, ischemic stroke and storage pool diseases. KW - Zinc KW - platelets KW - hemostasis KW - thrombosis KW - ischemic stroke KW - storage-pool diseases Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285554 SN - 1422-0067 VL - 20 IS - 21 ER - TY - JOUR A1 - Kraft, Peter A1 - Drechsler, Christiane A1 - Gunreben, Ignaz A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Stoll, Guido A1 - Heuschmann, Peter Ulrich A1 - Kleinschnitz, Christoph T1 - Von Willebrand Factor Regulation in Patients with Acute and Chronic Cerebrovascular Disease: A Pilot, Case-Control Study JF - PLoS ONE N2 - Background and Purpose In animal models, von Willebrand factor (VWF) is involved in thrombus formation and propagation of ischemic stroke. However, the pathophysiological relevance of this molecule in humans, and its potential use as a biomarker for the risk and severity of ischemic stroke remains unclear. This study had two aims: to identify predictors of altered VWF levels and to examine whether VWF levels differ between acute cerebrovascular events and chronic cerebrovascular disease (CCD). Methods A case–control study was undertaken between 2010 and 2013 at our University clinic. In total, 116 patients with acute ischemic stroke (AIS) or transitory ischemic attack (TIA), 117 patients with CCD, and 104 healthy volunteers (HV) were included. Blood was taken at days 0, 1, and 3 in patients with AIS or TIA, and once in CCD patients and HV. VWF serum levels were measured and correlated with demographic and clinical parameters by multivariate linear regression and ANOVA. Results Patients with CCD (158±46%) had significantly higher VWF levels than HV (113±36%, P<0.001), but lower levels than AIS/TIA patients (200±95%, P<0.001). Age, sex, and stroke severity influenced VWF levels (P<0.05). Conclusions VWF levels differed across disease subtypes and patient characteristics. Our study confirms increased VWF levels as a risk factor for cerebrovascular disease and, moreover, suggests that it may represent a potential biomarker for stroke severity, warranting further investigation. KW - cerebrovascular diseases KW - sex addiction KW - biomarkers KW - ischemic stroke KW - blood KW - stroke KW - platelets KW - demography Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119588 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Gromova, Kira V. T1 - Visualization of the Smad direct signaling response to Bone Morphogenetic Protein 4 activation with FRET-based biosensors T1 - Visualisierung der Smad-vermittelten Signaltransduktion nach Aktivierung mit "Bone Morphogenetic Protein" 4 mittels FRET-basierter Biosensoren N2 - The Transforming Growth Factor (TGF) superfamily of cytokines and their serine/threonine kinase receptors play an important role in the regulation of cell division, differentiation, adhesion, migration, organization, and death. Smad proteins are the major intracellular signal transducers for the TGF receptor superfamily that mediate the signal from the membrane into the nucleus. Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-4) is a representative of the TGF superfamily, which regulates the formation of teeth, limbs and bone, and also plays a role in fracture repair. Binding of BMP-4 to its receptor stimulates phosphorylation of Smad1, which subsequently recruits Smad4. A hetero-oligomeric complex consisting of Smad1 and Smad4 then translocates into the nucleus and regulates transcription of target genes by interacting with transcription factors. Although the individual steps of the signaling cascade from the receptor to the nucleus have been identified, the exact kinetics and the rate limiting step(s) have remained elusive. Standard biochemical techniques are not suitable for resolving these issues, as they do not offer sufficiently high sensitivity and temporal resolution. In this study, advanced optical techniques were used for direct visualization of Smad signaling in live mammalian cells. Novel fluorescent biosensors were developed by fusing cyan and yellow fluorescent proteins to the signaling molecules Smad1 and Smad4. By measuring Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) between the two fluorescent proteins, the kinetics of BMP/Smad signaling was unraveled. A rate-limiting delay of 2 - 5 minutes occurred between BMP receptor stimulation and Smad1 activation. A similar delay was observed in the complex formation between Smad1 and Smad4. Further experimentation indicated that the delay is dependent on the Mad homology 1 (MH1) domain of Smad1. These results give new insights into the dynamics of the BMP receptor – Smad1/4 signaling process and provide a new tool for studying Smads and for testing inhibitory drugs. N2 - Die Transforming Growth Factor" (TGF)-Superfamilie der Cytokine und ihrer Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle bei der Regulierung der Zellteilung, -differenzierung, -adhäsion, -migration, -organisation, und beim Zelltod. Die Smad-Proteine sind die wichtigsten intrazellulären Signalüberträger für die TGF-Rezeptor-Familie, da sie das Signal von der Zellmembran zum Kern übermitteln. Das ,,Bone Morphogenetic Protein4" (BMP-4) ist ein Vertreter der TGF-Familie, der die Bildung von Zähnen, Gliedmaßen und Knochen reguliert und darüber hinaus eine Rolle bei der Frakturheilung spielt. Das Binden von BMP-4 an seinen Rezeptor stimuliert die Phosphorylierung von Smad1, welches in der Folge Smad4 rekrutiert. Ein hetero-oligomerer Komplex bestehend aus Smad1 und Smad4 verlagert sich dann in den Zellkern, wo er durch Interaktion mit Transkriptionsfaktoren die Transkription von Zielgenen reguliert. Obwohl die einzelnen Schritte der Signalkaskade vom Rezeptor bis in den Zellkern bereits identifiziert wurden, blieben die Kinetik und die geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte bisher unbekannt. Gängige biochemische Methoden eignen sich nicht um diese Fragen zu lösen, da sie nicht über ausreichende Empfindlichkeit und zeitliches Auflösungsvermögen verfügen. In der vorliegenden Arbeit wurden hochentwickelte optische Techniken angewandt, um die Smad-vermittelte Signaltransduktion direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Neue fluoreszierende Biosensoren wurden konstruiert, indem gelb- und cyan-fluoreszierende Proteine mit den Signalmoleküle Smad1 und Smad4 fusioniert wurden. Durch Messung des "Fluorescent Resonance Energy Transfer" (FRET) zwischen den zwei fluoreszierenden Proteinen konnte die Kinetik der BMP-Smad-Signalkaskade bestimmt werden. Zwischen der Stimulation des Rezeptors und der Aktivierung von Smad1 trat eine geschwindigkeitsbegrenzende Verzögerung von 2-5 Minuten auf. Eine ähnliche Verzögerung wurde bei der Bildung des Komplexes aus Smad1 und Smad4 beobachtet. Weitere Experimente zeigten, dass die Verzögerung von der Mad-Homologie-Domäne 1 (MH1) von Smad1 abhängt. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben neue Einblicke in die Dynamik der BMP-Rezeptor-Smad1/4 Signaltransduktion und stellen neue Werkzeuge zur Untersuchung von Smads und zur Austestung inhibitorischer Wirkstoffe zur Verfügung. KW - FRET KW - Mikroskopie KW - Signaltransduktion KW - Smad KW - BMP KW - FRET KW - microscopy KW - signaling KW - Smad KW - bone morphogenetic protein KW - fluorescent protein Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25855 ER - TY - THES A1 - Blachutzik, Jörg O. T1 - Visualisierung von Plasmamembran-Domänen in Arabidopsis thaliana T1 - Visualization of plasma membrane domains in Arabidopsis thaliana N2 - Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen. N2 - In this work, membrane nanodomains have been visualized in planta via confocal microscopy of group 1b Remorin proteins fused to fluorescent proteins. Within these nanodomains, sterol-dependent Remorins originating from different plant species accumulated as shown by multiple color colocalization microscopy, and through which it was statistically verified by high Spearman and Pearson correlation coefficients. Thus, group 1b Remorins were established here as reliable marker proteins for plasma membrane (PM) nanodomains in plants. Since individual domains did not exhibit any kind of lateral movement within the plane of the membrane, a stabilization of them from cytoskeletal components as well as from components of the cell wall was presumed. Other proteins such as trans-membrane Tetraspanins and GPI-anchored proteins like SKU5 were ruled out as possible candidates being involved in the maintenance of domains´ lateral stability. For two Remorins originating from Arabidopsis thaliana, sites of posttranslational lipid modifications, which allow the proteins to anchor to the plasma membrane, were revealed. In experiments using truncated Remorins with these modification sites deleted, the mutant Remorins appeared to be no longer located at the PM but rather within the cytosol. Truncated Remorins re-appeared at the PM as soon as the full length Remorin proteins were co-expressed. In close proximity to the sites of lipid modifications a highly conserved C-terminal region, whose likely role is to facilitate homo-Remorin protein interactions, was uncovered. Therefore Remorins could possibly be involved in the molecular organization of a filamentous protein structure that could help mediate the stability and maintenance of individual domains. As well, the sizes of individual nanodomains were empirically measured in Arabidopsis thaliana mesophyll cells with STED microscopy, which allowed for optical measurements of domains with 60nm resolution, and were narrowly distributed in a histogram of domain diameters with an average diameter of 97 ± 4nm. One possible physiological role of PM-based nanodomains was demonstrated to be the ABA-mediated, calcium-dependent regulation of the SLAH3 anion channel. At the inception of the regulation, SLAH3 becomes activated upon phosphorylation by calcium-dependent protein kinases of the CDPK-family, CPK21 and CPK23. Both CPK´s in turn are regulated by the ABA-dependent phosphatases ABI1 and ABI2. As visualized by fluorescence colocalization microscopy for the first time, the interactions between SLAH3 and CPK21, as well as interactions between CPK21 and ABI1 were restricted to PM compartments. As well, these protein interactions were corroborated by also imaging them in planta using the bimolecular fluorescence complementation technique - involving group 1b Remorins as the established marker proteins for PM nanodomains. KW - Plasmamembran KW - Fluoreszmikroskopie KW - Ackerschmalwand KW - plasma membrane KW - fluorescence microscopy KW - Remorin KW - protoplasts KW - Protoplasten Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71925 ER - TY - JOUR A1 - Koenig, Sebastian A1 - Wolf, Reinhard A1 - Heisenberg, Martin T1 - Visual Attention in Flies-Dopamine in the Mushroom Bodies Mediates the After-Effect of Cueing JF - PLoS ONE N2 - Visual environments may simultaneously comprise stimuli of different significance. Often such stimuli require incompatible responses. Selective visual attention allows an animal to respond exclusively to the stimuli at a certain location in the visual field. In the process of establishing its focus of attention the animal can be influenced by external cues. Here we characterize the behavioral properties and neural mechanism of cueing in the fly Drosophila melanogaster. A cue can be attractive, repulsive or ineffective depending upon (e.g.) its visual properties and location in the visual field. Dopamine signaling in the brain is required to maintain the effect of cueing once the cue has disappeared. Raising or lowering dopamine at the synapse abolishes this after-effect. Specifically, dopamine is necessary and sufficient in the αβ-lobes of the mushroom bodies. Evidence is provided for an involvement of the αβ\(_{posterior}\) Kenyon cells. KW - dopamine transporters KW - Drosophila melanogaster KW - synapses KW - dopaminergics KW - dopamine KW - sensory cues KW - RNA interference KW - vision Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179564 VL - 11 IS - 8 ER - TY - THES A1 - Sareen, Preeti T1 - Visual attention in Drosophila melanogaster T1 - Visuelle Aufmerksamkeit bei Drosophila melanogaster N2 - There is such vast amount of visual information in our surroundings at any time that filtering out the important information for further processing is a basic requirement for any visual system. This is accomplished by deploying attention to focus on one source of sensory inputs to the exclusion of others (Luck and Mangun 2009). Attention has been studied extensively in humans and non human primates (NHPs). In Drosophila, visual attention was first demonstrated in 1980 (Wolf and Heisenberg 1980) but this field remained largely unexplored until recently. Lately, however, studies have emerged that hypothesize the role of attention in several behaviors but do not specify the characteristic properties of attention. So, the aim of this research was to characterize the phenomenon of visual attention in wild-type Drosophila, including both externally cued and covert attention using tethered flight at a torque meter. Development of systematic quantifiable behavioral tests was a key aspect for this which was not only important for analyzing the behavior of a population of wild-type flies but also for comparing the wild-type flies with mutant flies. The latter would help understand the molecular, genetic, and neuronal bases of attention. Since Drosophila provides handy genetic tools, a model of attention in Drosophila will serve to the greater questions about the neuronal circuitry and mechanisms involved which might be analogous to those in primates. Such a model might later be used in research involving disorders of attention. Attention can be guided to a certain location in the visual field by the use of external cues. Here, using visual cues the attention of the fly was directed to one or the other of the two visual half-fields. A simple yet robust paradigm was designed with which the results were easily quantifiable. This paradigm helped discover several interesting properties of the cued attention, the most substantial one being that this kind of external guidance of attention is restricted to the lower part of the fly’s visual field. The guiding cue had an after-effect, i.e. it could occur at least up to 2 seconds before the test and still bias it. The cue could also be spatially separated from the test by at least 20° and yet attract the attention although the extent of the focus of attention (FoA) was smaller than one lower visual half-field. These observations excluded the possibility of any kind of interference between the test and the cue stimuli. Another interesting observation was the essentiality of continuous visibility of the test stimulus but not the cue for effective cuing. When the contrast of the visual scene was inverted, differences in response frequencies and cuing effects were observed. Syndirectional yaw torque responses became more frequent than the antidirectional responses and cuing was no longer effective in the lower visual field with inverted contrast. Interestingly, the test stimulus with simultaneous displacement of two stripes not only effectuated a phasic yaw torque response but also a landing response. A 50 landing response was produced in more than half of the cases whenever a yaw torque response was produced. Elucidation of the neuronal correlates of the cued attention was commenced. Pilot experiments with hydroxyurea (HU) treated flies showed that mushroom bodies were not required for the kind of guidance of attention tested in this study. Dopamine mutants were also tested for the guidance of attention in the lower visual field. Surprisingly, TH-Gal4/UAS-shits1 flies flew like wild-type flies and also showed normal optomotor response during the initial calibration phase of the experiment but did not show any phasic yaw torque or landing response at 18 °C, 25 °C or 30 °C. dumb2 flies that have almost no D1 dopamine receptor dDA1 expression in the mushroom bodies and the central complex (Kim et al. 2007) were also tested and like THGal4/ UAS-shits1 flies did not show any phasic yaw torque or landing response. Since the dopamine mutants did not show the basic yaw torque response for the test the role of dopamine in attention could not be deduced. A different paradigm would be needed to test these mutants. Not only can attention be guided through external cues, it can also be shifted endogenously (covert attention). Experiments with the windows having oscillating stripes nicely demonstrated the phenomenon of covert attention due to the production of a characteristic yaw torque pattern by the flies. However, the results were not easily quantifiable and reproducible thereby calling for a more systematic approach. Experiments with simultaneous opposing displacements of two stripes provide a promising avenue as the results from these experiments showed that the flies had a higher tendency to deliver one type of response than when the responses would be produced stochastically suggesting that attention increased this tendency. Further experiments and analysis of such experiments could shed more light on the mechanisms of covert attention in flies. N2 - Zu jedem Zeitpunkt stellt unsere Umgebung eine so große Menge an visueller Information zur Verfügung, dass das Herausfiltern der wichtigen Informationen für eine weitere Verarbeitung eine grundlegende Herausforderung für jedes komplexe visuelle System darstellt. Bewerkstelligt wird dies u.a. mittels der selektiven Aufmerksamkeit, die die sensorischen Inputs einer Quelle, unter Ausschluss aller anderen, hervorhebt (Luck und Mangun 2009). Aufmerksamkeit wurde an Menschen und nichtmenschlichen Primaten bereits ausgiebig untersucht. Visuelle Aufmerksamkeit bei Drosophila konnte 1980 zum ersten Mal nachgewiesen werden (Wolf und Heisenberg 1980), jedoch blieb dieses Feld bis heute großen Teils unerforscht. In jüngster Zeit tauchten Studien auf, die der Aufmerksamkeit eine Rolle bei verschiedenen Verhaltensleistungen zuweisen, ohne jedoch die charakteristischen Eigenschaften von Aufmerksamkeit zu spezifizieren. Es ist das Ziel dieser Arbeit, das Phänomen der sowohl durch externe Reize ausgelösten, als auch endogen erzeugten (covert attention) visuellen Aufmerksamkeit bei wildtypischen Drosophila im stationären Flug am Drehmoment-Messgerät zu charakterisieren. Hierbei ist ein wesentlicher Aspekt durch die Entwicklung von quantitativen Tests das Verhalten von wildtypischen Fliegen so zu analysieren, dass es mit dem Verhalten genetischer Varianten verglichen werden kann. Ein solcher Vergleich würde helfen, die molekularen, genetischen und neuronalen Grundlagen der Aufmerksamkeit zu verstehen, da bei Drosophila für solche Untersuchungen einfach anwendbare genetische Werkzeuge zur Verfügung stehen. Ein Modell der Aufmerksamkeit bei Drosophila könnte auch für die visuelle Aufmerksamkeit bei Primaten relevant sein, falls diese Systeme homolog sind, d.h. in der Stammesgeschichte einen gemeinsamen Ursprung haben. Mittels äußerer Reize lässt sich die Aufmerksamkeit auf einen bestimmten Ort im visuellen Feld führen. In dieser Arbeit wird die Aufmerksamkeit einer Fliege durch visuelle Reize auf jeweils eines der beiden visuellen Halbfelder gelenkt. Es wird ein einfaches und robustes Paradigma entwickelt, dessen Ergebnisse ohne viel Aufwand quantifizierbar sind. Eine wesentliche Eigenschaft der exogen gelenkten visuellen Aufmerksamkeit, zu deren Entdeckung dieses Paradigma unter anderen beigetragen hat, ist, dass diese Art der Lenkung der Aufmerksamkeit auf den unteren Teil des visuellen Feldes der Fliege beschränkt ist. Der lenkende Reiz hat einen Nacheffekt, das heißt, er kann bis zu zwei Sekunden vor dem Test auftreten und dessen Ergebnis trotzdem beeinflussen. Auch bei einer räumlichen Trennung des Reizes vom Test um mindestens 20° kann er noch die Aufmerksamkeit auf diesen ziehen, wobei hier dann die Ausdehnung des Aufmerksamkeitsfeldes kleiner als ein unteres visuelles Halbfeld 52 ist. Durch diese Beobachtungen wird eine mögliche Interferenz zwischen Reiz und Test ausgeschlossen. Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass für ein effektives Lenken der Aufmerksamkeit der Teststimulus aber nicht der lenkende Reiz durchgehend sichtbar sein muss. Eine Invertierung des Kontrastes der visuellen Reizgebung führt zu veränderten Antwortfrequenzen und Effekten der Aufmerksamkeitslenkung. So treten syndirektionale Drehmoment-Antworten häufiger auf als antidirektionale und die Lenkung der Aufmerksamkeit im unteren visuellen Feld durch einen vorhergehenden Reiz tritt nicht auf. Interessanterweise kann der Teststimulus, die simultane Verschiebung zweier Streifen nicht nur eine phasische Drehmoment-Antwort, sondern auch einen Landeversuch auslösen. Dieser wird in mehr als der Hälfte aller Fälle, in denen eine Drehmomentantwort gezeigt wird, beobachtet. Eine Untersuchung der neuronalen Korrelate der reizgelenkten Aufmerksamkeit wurde begonnen. In Pilotexperimenten mit Fliegen, die mit Hydroxyharnstoff (HU) behandelt worden waren, zeigte sich, dass die adulten Pilzkörper nicht für diese Art der Lenkung der Aufmerksamkeit, wie sie in der vorliegenden Arbeit untersucht wird, benötigt werden. Des weiteren wurden auch Fliegenmutanten mit Defekten im Dopamin-System getestet. Überraschenderweise flogen TH-Gal4/UAS-shits1 Fliegen wie wildtypische Fliegen und zeigten auch ein normales optomotorisches Verhalten während der anfänglichen Kalibrierungsphase des Experimentes. Sie zeigten jedoch weder phasische Drehmoment-Antworten noch Landeversuche bei 18°C, 25°C oder 30°C. Auch dumb2 Fliegen, die so gut wie keine D1 Dopaminrezeptoren in den Pilzkörpern und im Zentralkomplex exprimieren (Kim et al. 2007), zeigten die gleichen Verhaltensdefekte wie TH-Gal4/UAS-shits1 -Fliegen. Da bei den Dopaminmutanten die phasische Drehmomentantwort fehlte, konnte die Bedeutung von Dopamin für Aufmerksamkeit aus diesem Test nicht abgeleitet werden. Um diese Mutanten zu testen, bedarf es eines anderen Paradigmas. Die Richtung der Aufmerksamkeit kann nicht nur durch äußere Reize gelenkt, sondern auch endogen verändert werden (covert attention). Experimente mit zwei oszillierenden Streifenmustern in der rechten und linken Sehfeld-Hälfte verdeutlichen das Phänomen der endogen gesteuerten Aufmerksamkeit anschaulich, da die Fliegen hierbei charakteristische Drehmomentmuster für das eine oder andere Muster erzeugen. Weil diese Einzelbeobachtungen aber nicht leicht quantifizierbar sind, ist hier ein neuer Ansatz notwendig. Die obigen Experimente mit zwei einzelnen Streifen, die gleichzeitig nach rechts und links versetzt werden, versprechen systematischere Ergebnisse. Die Fliegen neigen stärker dazu einen bestimmten Antwort-Typ (Drehmoment nach links bzw. nach rechts) beizubehalten, als eine statistische Verteilung annehmen ließe. Es ist zu vermuten, dass dieser Effekt durch die Aufmerksamkeit hervorgerufen wird. Die Analyse solcher Experimente könnte also die endogene Steuerung der Aufmerksamkeit beleuchten. KW - Visuelle Aufmerksamkeit KW - Taufliege KW - Visuelle Aufmerksamkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Visual attention KW - Drosophila melanogaster KW - torque meter Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69616 ER - TY - JOUR A1 - Koenig, Sebastian A1 - Wolf, Reinhard A1 - Heisenberg, Martin T1 - Vision in Flies: Measuring the Attention Span JF - PLoS ONE N2 - A visual stimulus at a particular location of the visual field may elicit a behavior while at the same time equally salient stimuli in other parts do not. This property of visual systems is known as selective visual attention (SVA). The animal is said to have a focus of attention (FoA) which it has shifted to a particular location. Visual attention normally involves an attention span at the location to which the FoA has been shifted. Here the attention span is measured in Drosophila. The fly is tethered and hence has its eyes fixed in space. It can shift its FoA internally. This shift is revealed using two simultaneous test stimuli with characteristic responses at their particular locations. In tethered flight a wild type fly keeps its FoA at a certain location for up to 4s. Flies with a mutation in the radish gene, that has been suggested to be involved in attention-like mechanisms, display a reduced attention span of only 1s. KW - eye movements KW - attention KW - Drosophila melanogaster KW - torque KW - motion KW - insect flight KW - eyes KW - vision Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179947 VL - 11 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Patil, Sandeep S. A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Adelfinger, Marion A1 - Donat, Ulrike A1 - Hess, Michael A1 - Weibel, Stephanie A1 - Nolte, Ingo A1 - Frentzen, Alexa A1 - Szalay, Aladar A. T1 - Virotherapy of Canine Tumors with Oncolytic Vaccinia Virus GLV-1h109 Expressing an Anti-VEGF Single-Chain Antibody JF - PLoS One N2 - Virotherapy using oncolytic vaccinia virus (VACV) strains is one promising new strategy for cancer therapy. We have previously reported that oncolytic vaccinia virus strains expressing an anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) single-chain antibody (scAb) GLAF-1 exhibited significant therapeutic efficacy for treatment of human tumor xenografts. Here, we describe the use of oncolytic vaccinia virus GLV-1h109 encoding GLAF-1 for canine cancer therapy. In this study we analyzed the virus-mediated delivery and production of scAb GLAF-1 and the oncolytic and immunological effects of the GLV-1h109 vaccinia virus strain against canine soft tissue sarcoma and canine prostate carcinoma in xenograft models. Cell culture data demonstrated that the GLV-1h109 virus efficiently infect, replicate in and destroy both tested canine cancer cell lines. In addition, successful expression of GLAF-1 was demonstrated in virus-infected canine cancer cells and the antibody specifically recognized canine VEGF. In two different xenograft models, the systemic administration of the GLV-1h109 virus was found to be safe and led to anti-tumor and immunological effects resulting in the significant reduction of tumor growth in comparison to untreated control mice. Furthermore, tumor-specific virus infection led to a continued production of functional scAb GLAF-1, resulting in inhibition of angiogenesis. Overall, the GLV-1h109-mediated cancer therapy and production of immunotherapeutic anti-VEGF scAb may open the way for combination therapy concept i.e. vaccinia virus mediated oncolysis and intratumoral production of therapeutic drugs in canine cancer patients. KW - angiogenesis KW - microenvironment KW - model KW - cancer KW - therapy KW - pet dogs KW - nude-mice KW - breast-tumors KW - microvascular density KW - endothelial growth-factor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130039 VL - 7 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Gholami, Sepideh A1 - Chen, Chun-Hao A1 - Belin, Laurence J. A1 - Lou, Emil A1 - Fujisawa, Sho A1 - Antonacci, Caroline A1 - Carew, Amanda A1 - Chen, Nanhai G. A1 - De Brot, Marina A1 - Zanzonico, Pat B. A1 - Szalay, Aladar A. A1 - Fong, Yuman T1 - Vaccinia virus GLV-1h153 is a novel agent for detection and effective local control of positive surgical margins for breast cancer JF - Breast Cancer Research N2 - Introduction: Surgery is currently the definitive treatment for early-stage breast cancer. However, the rate of positive surgical margins remains unacceptably high. The human sodium iodide symporter (hNIS) is a naturally occurring protein in human thyroid tissue, which enables cells to concentrate radionuclides. The hNIS has been exploited to image and treat thyroid cancer. We therefore investigated the potential of a novel oncolytic vaccinia virus GLV1h-153 engineered to express the hNIS gene for identifying positive surgical margins after tumor resection via positron emission tomography (PET). Furthermore, we studied its role as an adjuvant therapeutic agent in achieving local control of remaining tumors in an orthotopic breast cancer model. Methods: GLV-1h153, a replication-competent vaccinia virus, was tested against breast cancer cell lines at various multiplicities of infection (MOIs). Cytotoxicity and viral replication were determined. Mammary fat pad tumors were generated in athymic nude mice. To determine the utility of GLV-1h153 in identifying positive surgical margins, 90% of the mammary fat pad tumors were surgically resected and subsequently injected with GLV-1h153 or phosphate buffered saline (PBS) in the surgical wound. Serial Focus 120 microPET images were obtained six hours post-tail vein injection of approximately 600 mu Ci of I-124-iodide. Results: Viral infectivity, measured by green fluorescent protein (GFP) expression, was time-and concentrationdependent. All cell lines showed less than 10% of cell survival five days after treatment at an MOI of 5. GLV-1h153 replicated efficiently in all cell lines with a peak titer of 27 million viral plaque forming units (PFU) ( < 10,000-fold increase from the initial viral dose) by Day 4. Administration of GLV-1h153 into the surgical wound allowed positive surgical margins to be identified via PET scanning. In vivo, mean volume of infected surgically resected residual tumors four weeks after treatment was 14 mm(3) versus 168 mm(3) in untreated controls (P < 0.05). Conclusions: This is the first study to our knowledge to demonstrate a novel vaccinia virus carrying hNIS as an imaging tool in identifying positive surgical margins of breast cancers in an orthotopic murine model. Moreover, our results suggest that GLV-1h153 is a promising therapeutic agent in achieving local control for positive surgical margins in resected breast tumors. KW - conservation KW - carcinoma KW - mastectomy KW - metastases KW - stage-i KW - thyroid-cancer KW - radiation-therapy KW - conserving surgery KW - sodium-iodide symporter Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122140 VL - 15 IS - R26 ER - TY - JOUR A1 - Bárcena-Uribarri, Iván A1 - Thein, Marcus A1 - Maier, Elke A1 - Bonde, Mari A1 - Bergström, Sven A1 - Benz, Roland T1 - Use of Nonelectrolytes Reveals the Channel Size and Oligomeric Constitution of the Borrelia burgdorferi P66 Porin JF - PLoS ONE N2 - In the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi, the outer membrane protein P66 is capable of pore formation with an atypical high single-channel conductance of 11 nS in 1 M KCl, which suggested that it could have a larger diameter than ‘normal’ Gram-negative bacterial porins. We studied the diameter of the P66 channel by analyzing its single-channel conductance in black lipid bilayers in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii. We calculated the filling of the channel with these nonelectrolytes and the results suggested that nonelectrolytes (NEs) with hydrodynamic radii of 0.34 nm or smaller pass through the pore, whereas neutral molecules with greater radii only partially filled the channel or were not able to enter it at all. The diameter of the entrance of the P66 channel was determined to be \(\leq\)1.9 nm and the channel has a central constriction of about 0.8 nm. The size of the channel appeared to be symmetrical as judged from one-sidedness of addition of NEs. Furthermore, the P66-induced membrane conductance could be blocked by 80–90% by the addition of the nonelectrolytes PEG 400, PEG 600 and maltohexaose to the aqueous phase in the low millimolar range. The analysis of the power density spectra of ion current through P66 after blockage with these NEs revealed no chemical reaction responsible for channel block. Interestingly, the blockage of the single-channel conductance of P66 by these NEs occurred in about eight subconductance states, indicating that the P66 channel could be an oligomer of about eight individual channels. The organization of P66 as a possible octamer was confirmed by Blue Native PAGE and immunoblot analysis, which both demonstrated that P66 forms a complex with a mass of approximately 460 kDa. Two dimension SDS PAGE revealed that P66 is the only polypeptide in the complex. KW - radii KW - hydrodynamics KW - SDS polyacrylamide gel electrophoresis KW - molecular mass KW - outer membrane proteins KW - single channel recording KW - blue native polyacrylamide gel electrophoresis KW - borrelia burgdorferi Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-129965 VL - 8 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Karus, Christine T1 - Untersuchung der Architektur von Proteinstrukturen des Ranvier-Schnürrings mittels der super-hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM T1 - Investigation of the architecture of protein structures of the Node of Ranvier using the super-high resolution microscopy method dSTORM N2 - Ranvier-Schnürringe spielen eine entscheidende Rolle bei der schnellen Weiterleitung von elektrischen Impulsen in Nervenzellen. Bei bestimmten neurologischen Erkrankungen, den Neuropathien, kann es zu Störungen in der ultrastrukturellen Organisation verschiedener Schnürring-Proteine kommen (Doppler et al., 2018, Doppler et al., 2016). Eine detailliertere Kenntnis der genauen Anordnung dieser Schnürring-Proteine und eventueller Abweichungen von dieser Anordnung im Krankheitsfall, könnte der Schlüssel zu einer vereinfachten Diagnostik von bestimmten Neuropathie- Formen sein. Ziel meiner Arbeit war es daher, die Untersuchung der ultrastrukturellen Architektur der (para-)nodalen Adhäsionsproteine Neurofascin-155 und Caspr1 unter Verwendung der super-hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) an murinen Zupfnervenpräparaten zu etablieren. Nach erster Optimierung der Probenpräparation für die 2-Farben-dSTORM sowie der korrelationsbasierten Bildanalyse, konnte ich mittels modellbasierter Simulation die zugrundeliegende Molekülorganisation identifizieren und mit Hilfe der Ergebnisse aus früheren Untersuchungen validieren. In einem translationalen Ansatz habe ich anschließend humane Zupfnervenpräparate von 14 Probanden mit unterschiedlichen Formen einer Neuropathie mikroskopiert und ausgewertet, um die Anwendbarkeit dieses Ansatzes in der Diagnostik zu testen. Obgleich keine signifikanten Unterschiede zwischen physiologischem und pathologischem neurologischem Gewebe hinsichtlich Neurofascin-155 und Caspr1 festgestellt werden konnten, scheint der Ansatz grundsätzlich dennoch vielversprechend zu sein, bedarf jedoch noch weiteren Anstrengungen hinsichtlich Probenpräparation, Auswertungs- und Versuchsprotokollen und einer größeren Anzahl an humanen Biopsien mit homogenerem Krankheitsbild. N2 - Nodes of Ranvier play a critical role in the rapid transmission of electrical impulses in neurons. In certain neurological diseases, the neuropathies, there may be disturbances in the ultrastructural organization of various nodal and paranodal proteins (Doppler et al., 2018, Doppler et al., 2016). A more detailed knowledge of the exact arrangement of these nodal and paranodal proteins and possible deviations from this arrangement in disease, could be the key to a simplified diagnosis of certain neuropathy forms. Therefore, the aim of my work was to establish the investigation of the ultrastructural architecture of the (para-)nodal adhesion proteins Neurofascin-155 and Caspr1 using the super-high resolution microscopy method dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) on murine teased fibers. After initial optimization of sample preparation for 2-color dSTORM as well as correlation-based image analysis, I was able to identify the underlying molecular organization using model-based simulation and validate it using results from previous studies. In a translational approach, I then microscoped and evaluated human teased fibers from 14 subjects with different forms of neuropathy to test the applicability of this approach in diagnostics. Although no significant differences were found between physiological and pathological neurological tissue with respect to Neurofascin-155 and Caspr1, the approach still seems promising in principle, but requires further efforts with respect to sample preparation, evaluation and experimental protocols, and a larger number of human biopsies with more homogeneous disease patterns. KW - dSTORM KW - Ranvier-Schnürring Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-274568 N1 - die Dissertation ist ein Kooperationsprojekt dieser beiden Fakultäten ER - TY - JOUR A1 - Balakrishnan, Ashwin A1 - Hemmen, Katherina A1 - Choudhury, Susobhan A1 - Krohn, Jan-Hagen A1 - Jansen, Kerstin A1 - Friedrich, Mike A1 - Beliu, Gerti A1 - Sauer, Markus A1 - Lohse, Martin J. A1 - Heinze, Katrin G. T1 - Unraveling the hidden temporal range of fast β2-adrenergic receptor mobility by time-resolved fluorescence JF - Communications Biology N2 - G-protein-coupled receptors (GPCRs) are hypothesized to possess molecular mobility over a wide temporal range. Until now the temporal range has not been fully accessible due to the crucially limited temporal range of available methods. This in turn, may lead relevant dynamic constants to remain masked. Here, we expand this dynamic range by combining fluorescent techniques using a spot confocal setup. We decipher mobility constants of β\(_{2}\)-adrenergic receptor over a wide time range (nanosecond to second). Particularly, a translational mobility (10 µm\(^{2}\)/s), one order of magnitude faster than membrane associated lateral mobility that explains membrane protein turnover and suggests a wider picture of the GPCR availability on the plasma membrane. And a so far elusive rotational mobility (1-200 µs) which depicts a previously overlooked dynamic component that, despite all complexity, behaves largely as predicted by the Saffman-Delbrück model. KW - G-protein-coupled receptors KW - molecular mobility KW - temporal range Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301140 VL - 5 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Wölfel, Angela A1 - Sättele, Mathias A1 - Zechmeister, Christina A1 - Nikolaev, Viacheslov O. A1 - Lohse, Martin J. A1 - Boege, Fritz A1 - Jahns, Roland A1 - Boivin-Jahns, Valérie T1 - Unmasking features of the auto-epitope essential for β\(_1\)-adrenoceptor activation by autoantibodies in chronic heart failure JF - ESC Heart Failure N2 - Aims Chronic heart failure (CHF) can be caused by autoantibodies stimulating the heart via binding to first and/or second extracellular loops of cardiac β1-adrenoceptors. Allosteric receptor activation depends on conformational features of the autoantibody binding site. Elucidating these features will pave the way for the development of specific diagnostics and therapeutics. Our aim was (i) to fine-map the conformational epitope within the second extracellular loop of the human β\(_1\)-adrenoceptor (β1ECII) that is targeted by stimulating β\(_1\)-receptor (auto)antibodies and (ii) to generate competitive cyclopeptide inhibitors of allosteric receptor activation, which faithfully conserve the conformational auto-epitope. Methods and results Non-conserved amino acids within the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop (compared with the amino acids constituting the ECII loop of the β\(_2\)-adrenoceptor) were one by one replaced with alanine; potential intra-loop disulfide bridges were probed by cysteine–serine exchanges. Effects on antibody binding and allosteric receptor activation were assessed (i) by (auto)antibody neutralization using cyclopeptides mimicking β1ECII ± the above replacements, and (ii) by (auto)antibody stimulation of human β\(_1\)-adrenoceptors bearing corresponding point mutations. With the use of stimulating β\(_1\)-receptor (auto)antibodies raised in mice, rats, or rabbits and isolated from exemplary dilated cardiomyopathy patients, our series of experiments unmasked two features of the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop essential for (auto)antibody binding and allosteric receptor activation: (i) the NDPK\(^{211–214}\) motif and (ii) the intra-loop disulfide bond C\(^{209}\)↔C\(^{215}\). Of note, aberrant intra-loop disulfide bond C\(^{209}\)↔C\(^{216}\) almost fully disrupted the functional auto-epitope in cyclopeptides. Conclusions The conformational auto-epitope targeted by cardio-pathogenic β\(_1\)-receptor autoantibodies is faithfully conserved in cyclopeptide homologues of the β\(_1\)EC\(_{II}\) loop bearing the NDPK\(^{211–214}\) motif and the C\(^{209}\)↔C\(^{215}\) bridge while lacking cysteine C216. Such molecules provide promising tools for novel diagnostic and therapeutic approaches in β\(_1\)-autoantibodypositive CHF. KW - antibody/autoantibody KW - β1-adrenoceptor/β1-adrenergic receptor KW - chronic heart failure KW - conformational auto-epitope KW - cyclic peptides/cyclopeptides KW - cyclopeptide therapy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235974 VL - 7 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Liess [née Eller], Anna Katharina Luise T1 - Understanding the regulation of the ubiquitin-conjugating enzyme UBE2S T1 - Die Regulation des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S N2 - The ubiquitination of proteins serves as molecular signal to control an enormous number of physiological processes and its dysregulation is connected to human diseases like cancer. The versatility of this signal stems from the diverse ways by which ubiquitin can be attached to its targets. Thus, specificity and tight regulation of the ubiquitination are pivotal requirements of ubiquitin signaling. Ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) act at the heart of the ubiquitination cascade, transferring ubiquitin from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin ligase (E3) or substrate. When cooperating with a RING-type E3, ubiquitin-conjugating enzymes can determine linkage specificity in ubiquitin chain formation. Our understanding of the regulation of E2 activities is still limited at a structural level. The work described here identifies two regulation mechanisms in UBE2S, a cognate E2 of the human RING-type E3 anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). UBE2S elongates ubiquitin chains on APC/C substrates in a Lys11 linkage-specific manner, thereby targeting these substrates for degradation and driving mitotic progression. In addition, UBE2S was found to have a role in DNA repair by enhancing non-homologous end-joining (NHEJ) and causing transcriptional arrest at DNA damage sites in homologous recombination (HR). Furthermore, UBE2S overexpression is a characteristic feature of many cancer types and is connected to poor prognosis and diminished response to therapy. The first regulatory mechanism uncovered in this thesis involves the intramolecular auto-ubiquitination of a particular lysine residue (Lys+5) close to the active site cysteine, presumably through conformational flexibility of the active site region. The Lys+5-linked ubiquitin molecule adopts a donor-like, ‘closed’ orientation towards UBE2S, thereby conferring auto-inhibition. Notably, Lys+5 is a major physiological ubiquitination site in ~25% of the human E2 enzymes, thus providing regulatory opportunities beyond UBE2S. Besides the active, monomeric state and the auto-inhibited state caused by auto-ubiquitination, I discovered that UBE2S can adopt a dimeric state. The latter also provides an auto-inhibited state, in which ubiquitin transfer is blocked via the obstruction of donor binding. UBE2S dimerization is promoted by its unique C-terminal extension, suppresses auto-ubiquitination and thereby the proteasomal degradation of UBE2S. Taken together, the data provided in this thesis illustrate the intricate ways by which UBE2S activity is fine-tuned and the notion that structurally diverse mechanisms have evolved to restrict the first step in the catalytic cycle of E2 enzymes. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen fungiert als molekulares Signal zur Kontrolle einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wobei eine gestörte Regulation der Ubiquitinierung eng mit zahlreichen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, verbunden ist. Aufgrund der verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten von Ubiquitin, die das zelluläre Schicksal des Zielproteins bestimmen, sind Spezifität und stringente Regulation unabkömmliche Voraussetzungen im Ubiquitinierungsprozess. Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) fungieren in der Mitte der Ubiquitinierungskaskade. Sie übernehmen ein Ubiquitinmolekül vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1) und übertragen es auf eine Ubiquitin-Ligase (E3) oder direkt auf das Zielprotein. Arbeiten Ubiquitin-konjugierende Enzyme mit E3s des RING-Typus zusammen, so bestimmen E2s die Art der Verknüpfung. Die Regulation der Aktivität Ubiquitin-konjugierender Enzyme auf struktureller Ebene ist jedoch bisher nur bedingt verstanden. Die hier dargelegte Arbeit umfasst die Identifizierung zweier Regulationsmechanismen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S. UBE2S arbeitet mit einem humanen E3 des RING-Typus‚ dem ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome‘ (APC/C) zusammen und bildet Lys11-spezifische Ubiquitinketten auf Substraten des APC/Cs. Hierdurch werden die Substrate für den Abbau durch das Proteasom markiert, was das Fortschreiten der Mitose bedingt. Zusätzlich wird UBE2S eine Rolle in der DNS-Reparatur zugeschrieben. Hierbei verstärkt UBE2S die nicht-homologe Rekombination (NHEJ) und verhindert außerdem die Transkription an DNS-Bruchstellen, die durch Homologe Rekombination (HR) repariert werden. Die Überexpression von UBE2S ist ein Charakteristikum verschiedenster Krebsarten, vermindert den Erfolg herkömmlicher Krebstherapien, und führt somit zu schlechten Prognosen für betroffenen Patienten. Der erste hier beschriebene Regulationsmechanismus beinhaltet die intramolekulare Ubiquitinierung eines Lysins (Lys+5) nahe des katalytischen Cysteins, mutmaßlich durch strukturelle Flexibilität der Region des aktiven Zentrums. Das Lys+5-verknüpfte Ubiquitin nimmt eine Donorubiquitin-ähnliche Position auf UBE2S ein, wodurch UBE2S gehemmt wird. Da ein Lysin an der Position +5 in ~25% der humanen E2-Enzyme vorhanden und eine physiologische Ubiquitinierungsstelle ist, birgt dieser Mechanismus Regulationsmöglichkeiten über UBE2S hinaus. Zusätzlich zum aktiven monomeren Zustand und dem durch Autoubiquitinierung ausgelösten inhibierten Zustand, kann UBE2S auch als Dimer vorliegen. In diesem Zustand ist es ebenfalls inaktiv, da die Donorubiquitin-Bindestelle auf UBE2S durch ein zweites Molekül des E2s blockiert wird. Begünstigt wird die Dimerisierung durch die C-terminale Verlängerung von UBE2S und verhindert so deren Autoubiquitinierung, und folglich den proteasomalen Abbau von UBE2S. Es handelt sich hierbei somit um einen zweiten Regulationsmechanismus von UBE2S. Zusammenfassend veranschaulichen die in dieser Arbeit dargelegten Daten die komplexen Möglichkeiten, durch die die Aktivität von UBE2S reguliert werden kann, sowie die Erkenntnis, dass strukturell unterschiedliche Mechanismen existieren, um den ersten Schritt der von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen katalysierten Reaktion zu hemmen. KW - E2 KW - Regulation KW - Ubiquitin KW - Mechanismus KW - UBE2S KW - structural mechanism KW - Ubiquitin-conjugating enzyme KW - regulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204190 ER - TY - THES A1 - Truongvan, Ngoc T1 - Understanding the dual specificity of UBA6 T1 - Einblick in die duale Spezifität von UBA6 N2 - Ubiquitylation is a protein post translational modification, in which ubiquitin is covalently attached to target protein substrates resulting in diverse cellular outcomes. Besides ubiquitin, various ubiquitin-like proteins including FAT10 exist, which are also conjugated to target proteins. The underlying modification mechanisms are conserved. In the initial step, ubiquitin or a ubiquitin-like protein is thioester-linked to a catalytic cysteine in the E1activating enzyme in an ATP-dependent manner. The respective protein modifier is then transferred to an E2 conjugating enzyme in a transthioesterification reaction. Finally, an E3 ubiquitin ligase E3 catalyzes the covalent attachment of the protein modifier to a substrate. In the case of ubiquitin, multiple ubiquitin molecules can be attached to a substrate in the form of either linear or branched polyubiquitin chains but also as single ubiquitin modifications. Depending on the nature of the ubiquitin chain, the substrates are destined to various cellular processes such as their targeted destruction by the proteasome but also non-degradative outcomes may occur. As stated above FAT10 is a ubiquitin-like protein modifier which typically targets proteins for proteasomal degradation. It consists of two ubiquitin-like domains and is mainly expressed in cells of the human immune system. The reported involvement of FAT10 modifications in cancers and other diseases has caught the attention of the scientific community as an inhibition of the FAT10ylation process may provide avenues for novel therapeutic approaches. UBA6 is the E1 activating enzyme that resides at the apex of the FAT10 proteasomal degradation pathway. UBA6 not only recognizes FAT10 but can also activate ubiquitin as efficiently as the ubiquitin specific E1 UBA1. The dual specificity of UBA6 may complicate the inhibition FAT10ylation since targeting the active site of UBA6 will also inhibit the UBA6-catalyzed ubiquitin activation. Therefore, it is important to understand the underlying principles for the dual specificity of UBA6 prior to the development of compounds interfering with FAT10ylation. In this thesis important novel insights into the structure and function of UBA6 were derived by X-ray crystallography and biochemical methods. The first crystal structure of UBA6 reveals the multidomain architecture of this enzyme in atomic detail. The enzyme is composed of a rigid core including its active and inactive adenylation domains as well as a 4 helix bundle. Overall, the molecule adopts a “Y” shape architecture with the core at the base and the first and second catalytic half domains forming one arm of the “Y” and the ubiquitin fold domain constituting the other arm. While UBA6 shares the same domain architecture as UBA1, substantial differences were revealed by the crystal structure. In particular, the first catalytic half domain undergoes a significant shift to a position more distal from the core. This rigid body movement is assumed to generate room to accommodate the second ubiquitin-like domain of FAT10. Differences are also observed in a hydrophobic platform between the core and the first catalytic half domain and the adenylation active site in the core, which together from the binding sites for ubiquitin and FAT10. Site directed mutagenesis of key residues in these areas altered the UBA6-catalyzed activation of ubiquitin and FAT10. UBA6 variants were generated with the goal of trying to block the activation of FAT10 while still maintaining that of ubiquitin activation, in order to fully explain the dual specificity of UBA6. However, none of these mutations could block the activation of FAT10, while some of these UBA6 variants blocked ubiquitin activation. Preliminary inhibition assays with a group of E1 inhibitors belonging to the adenosyl sulfamate family demonstrated potent inhibition of FAT10ylation for two compounds. The dual specificity of UBA6 hence needs to be further examined by biochemical and structural methods. In particular, the structure of a complex between UBA6 and ubiquitin or FAT10 would provide key insights for further biochemical studies, ultimately allowing the targeted inhibition of the FAT10ylation machinery. N2 - Der Prozess der Ubiquitinierung stellt eine posttranslationale Modifikation dar, bei der das kleine Protein Ubiquitin kovalent an ein Zielprotein angehängt wird, was zu verschiedenen zellulären Effekten führt. Neben Ubiquitin existieren verschiedene ubiquitinähnliche Proteine, wie z.B. FAT10, die an Zielproteine angehängt werden können. Die der Modifikation zugrunde liegenenden Mechanismen der Proteinmodifikation sind konserviert. Im ersten Schritt wird Ubiquitin oder das ubiquitinähnliche Protein in einer ATP-abhängigen Reaktion kovalent an das katalytische Cystein des aktivierenden Enzyms (E1) gebunden. Danach wird es durch Transthioestherifizierung an ein konjugierendes Enzym (E2) übertagen und schließlich durch eine Ligase (E3) kovalent an das Substrat gehängt. Ubiquitin kann entweder einzeln oder in Form linearer oder verzweigter Ketten an ein Substrat angehängt werden, was wiederum zu verschiedenen funktionalen Konsequenzen wie dem Abbau das Proteins durch das Proteasom führen kann. Wie schon erwähnt ist FAT10 ein ubiquitinähliches Protein, das üblicherweise Zielproteine für den Abbau durch das Proteasom markiert. Es besteht aus zwei ubiquitinähnlichen Domänen und wird im Menschen hauptsächlich in Zellen des Immunsystems exprimiert. Die Beteiligung von FAT10 an der Entstehung von Krebs and anderen Krankheiten hat die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft erregt, da Inhibition des ‚FAT10ylation‘ Prozesses einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen könnte. UBA6 fungiert hierbei als E1 s Enzym, das am Anfang des FAT10-abhängigen proteasomalen Abbaus steht. UBA6 aktiviert neben FAT10 auch Ubiquitin mit ähnlicher Effizienz wie das ubiquitinspezifische E1 UBA1. Diese Bispezifität von UBA6 könnte die Inhibition der FAT10ylierung erschweren, da die Inhibition der katalytischen UBA6 Aktivität gleichzeitig UBA6-abhängige Ubiquitinaktivierung behindern würde. Daher ist für die zukünfitge Entwicklung FAT10-spezifischer UBA6 Inhibitoren ein grundlegendes Verständnis der UBA6 Bispezifität unerlässlich. In dieser Dissertation wurden wichtige, neue Einsichten in die Struktur und Funktion von UBA6 durch Röntgenkristallographie und biochemische Methoden gewonnen. Die erste Kristallstruktur von UBA6 zeigt die Multidomänenarchitektur des Enzyms bei atomarer Auflösung. Das Protein besteht aus einem starren Kern, der sowohl seine aktive als auch inaktive Adenylierungsdomäne sowie ein 4-Helix Bündel enthält. Das Molekül nimmt eine an ein Y erinnnernde Form ein, in der der Kern die Basis, die erste und zweite katalytischen Halbdomänen einen Arm und die ubiquitinähnliche gefaltete Domäne den zweiten Arm darstellen. Zwar ähneln sich der Domänenaufbau von UBA6 und UBA1, jedoch zeigte die Kristallstruktur bedeutende Unterschiede zwischen den beiden auf. Speziell die erste katalytische Halbdomäne ist in UBA6 im Vergleich zu UBA1weiter vom Enzymkern entfernt. Diese ‚Bewegung‘ erlaubt wahrscheinlich die Platzierung der zweiten UBL-Domäne von FAT10. Weitere Unterschiede konnten auch in der hydrophoben Oberfläche zwischen Kern, erster katalytischer Halbdomäne und dem aktiven Zentrum für die Adenylierung im Kern beobachtet werden, die zusammen die Bindestelle für Ubiquitin und FAT10 bilden. Durch ortsgerichtete Mutagenese von Schlüsselpositionen in dieser Region kontte die UBA6-katalysierte Aktivierung von entweder Ubiquitin oder FAT10 unterbunden werden. Um die Bispezifität von UBA6 zu entschlüsseln wurden UBA6 Varianten mit dem Ziel erzeugt, die Aktivierung von FAT10 unter Aufrechterhaltung der von Ubiquitin zu blockieren. Obwohl keine dieser Mutationen die FAT10-Aktivierung unterband, verhinderten einige jedoch die Aktivierung von Ubiquitin. Vorläufige Inhibitionsexperimente mit E1-Inhibitoren aus der Adenosylsulfamat Klasse zeigten starke Inhibition der FAT10ylierung durch zwei Verbindungen. Die Bispezifität von UBA6 bedarf weiterer strukturbiologischer und biochemischer Untersuchungen. Vor allem Kristallstrukturen von UBA6 in FAT10 und Ubiquitin-gebundener Form würden wichtige Erkenntnisse für weiteregehende biochemische Untersuchungen und schließlich die gezielte Unterdrückung der FAT10ylierungsmaschinerie liefern. KW - Ubiquitylation KW - FAT10ylation KW - UBA6 KW - UBE2Z Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244579 ER - TY - JOUR A1 - Goos, Carina A1 - Dejung, Mario A1 - Wehman, Ann M. A1 - M-Natus, Elisabeth A1 - Schmidt, Johannes A1 - Sunter, Jack A1 - Engstler, Markus A1 - Butter, Falk A1 - Kramer, Susanne T1 - Trypanosomes can initiate nuclear export co-transcriptionally JF - Nucleic Acids Research N2 - The nuclear envelope serves as important messenger RNA (mRNA) surveillance system. In yeast and human, several control systems act in parallel to prevent nuclear export of unprocessed mRNAs. Trypanosomes lack homologues to most of the involved proteins and their nuclear mRNA metabolism is non-conventional exemplified by polycistronic transcription and mRNA processing by trans-splicing. We here visualized nuclear export in trypanosomes by intra- and intermolecular multi-colour single molecule FISH. We found that, in striking contrast to other eukaryotes, the initiation of nuclear export requires neither the completion of transcription nor splicing. Nevertheless, we show that unspliced mRNAs are mostly prevented from reaching the nucleus-distant cytoplasm and instead accumulate at the nuclear periphery in cytoplasmic nuclear periphery granules (NPGs). Further characterization of NPGs by electron microscopy and proteomics revealed that the granules are located at the cytoplasmic site of the nuclear pores and contain most cytoplasmic RNA-binding proteins but none of the major translation initiation factors, consistent with a function in preventing faulty mRNAs from reaching translation. Our data indicate that trypanosomes regulate the completion of nuclear export, rather than the initiation. Nuclear export control remains poorly understood, in any organism, and the described way of control may not be restricted to trypanosomes. KW - molecular biology KW - nuclear export KW - trypanosomes KW - mRNA KW - nuclear envelope Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177709 VL - 47 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Szalay, Aladar A A1 - Weibel, Stephanie A1 - Hofmann, Elisabeth A1 - Basse-Luesebrink, Thomas Christian A1 - Donat, Ulrike A1 - Seubert, Carolin A1 - Adelfinger, Marion A1 - Gnamlin, Prisca A1 - Kober, Christina A1 - Frentzen, Alexa A1 - Gentschev, Ivaylo A1 - Jakob, Peter Michael T1 - Treatment of malignant effusion by oncolytic virotherapy in an experimental subcutaneous xenograft model of lung cancer JF - Journal of Translational Medicine N2 - Background Malignant pleural effusion (MPE) is associated with advanced stages of lung cancer and is mainly dependent on invasion of the pleura and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) by cancer cells. As MPE indicates an incurable disease with limited palliative treatment options and poor outcome, there is an urgent need for new and efficient treatment options. Methods In this study, we used subcutaneously generated PC14PE6 lung adenocarcinoma xenografts in athymic mice that developed subcutaneous malignant effusions (ME) which mimic pleural effusions of the orthotopic model. Using this approach monitoring of therapeutic intervention was facilitated by direct observation of subcutaneous ME formation without the need of sacrificing mice or special imaging equipment as in case of MPE. Further, we tested oncolytic virotherapy using Vaccinia virus as a novel treatment modality against ME in this subcutaneous PC14PE6 xenograft model of advanced lung adenocarcinoma. Results We demonstrated significant therapeutic efficacy of Vaccinia virus treatment of both advanced lung adenocarcinoma and tumor-associated ME. We attribute the efficacy to the virus-mediated reduction of tumor cell-derived VEGF levels in tumors, decreased invasion of tumor cells into the peritumoral tissue, and to viral infection of the blood vessel-invading tumor cells. Moreover, we showed that the use of oncolytic Vaccinia virus encoding for a single-chain antibody (scAb) against VEGF (GLAF-1) significantly enhanced mono-therapy of oncolytic treatment. Conclusions Here, we demonstrate for the first time that oncolytic virotherapy using tumor-specific Vaccinia virus represents a novel and promising treatment modality for therapy of ME associated with advanced lung cancer. KW - Oncolytic virotherapy KW - Malignant effusion KW - Lung cancer KW - VEGF KW - Lungenkrebs KW - Vascular endothelial Growth Factor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96016 UR - http://www.translational-medicine.com/content/11/1/106 ER - TY - THES A1 - Luckner, Sylvia T1 - Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis T1 - Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis N2 - Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and extensively drug resistant strains. Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial ß-ketoacyl synthase and InhA, the mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway and validated drug targets. In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be accommodated in a cytosolic environment. InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD+-PT70 were solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP reductases. N2 - Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich. Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die mycobakterielle ß-ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika. In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann. InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD+-PT70 Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist. Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“ schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“ Inhibitoren verwendet werden. KW - Tuberkelbakterium KW - Multidrug-Resistenz KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäure-Synthase KW - Zellwand KW - Kristallstruktur KW - tuberculosis KW - multi-drug-resistance KW - drug development KW - fatty acid synthesis KW - cell wall KW - crystal structure KW - structure based drug design Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43621 ER - TY - THES A1 - Chouhan, Nitin Singh T1 - Time-odor learning in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Olfaktorisches Zeitgedächtnis bei \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Endogenous clocks help animals to anticipate the daily environmental changes. These internal clocks rely on environmental cues, called Zeitgeber, for synchronization. The molecular clock consists of transcription-translation feedback loops and is located in about 150 neurons (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich-Förster, 2005). The core clock has the proteins Clock (CLK) and Cycle (CYC) that together act as a transcription activator for period (per) and timeless (tim) which then, via PER and TIM block their own transcription by inhibiting CLK/CYC activity (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Light signals trigger the degradation of TIM through a blue-light sensing protein Cryptochrome (CRY) and thus, allows CLK/CYC to resume per and tim transcription (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Therefore, light acts as an important Zeitgeber for the clock entrainment. The mammalian clock consists of similarly intertwined feedback loops. Endogenous clocks facilitate appropriate alterations in a variety of behaviors according to the time of day. Also, these clocks can provide the phase information to the memory centers of the brain to form the time of day related associations (TOD). TOD memories promote appropriate usage of resources and concurrently better the survival success of an animal. For instance, animals can form time-place associations related to the availability of a biologically significant stimulus like food or mate. Such memories will help the animal to obtain resources at different locations at the appropriate time of day. The significance of these memories is supported by the fact that many organisms including bees, ants, rats and mice demonstrate time-place learning (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Previous studies have shown that TOD related memories rely on an internal clock, but the identity of the clock and the underlying mechanism remain less well understood. The present study demonstrates that flies can also form TOD associated odor memories and further seeks to identify the appropriate mechanism. Hungry flies were trained in the morning to associate odor A with the sucrose reward and subsequently were exposed to odor B without reward. The same flies were exposed in the afternoon to odor B with and odor A without reward. Two cycles of the 65 reversal training on two subsequent days resulted in the significant retrieval of specific odor memories in the morning and afternoon tests. Therefore, flies were able to modulate their odor preference according to the time of day. In contrast, flies trained in a non-reversal manner were unable to form TOD related memories. The study also demonstrates that flies are only able to form time-odor memories when the two reciprocal training cycles occur at a minimum 6 h interval. This work also highlights the role of the internal state of flies in establishing timeodor memories. Prolonged starvation motivates flies to appropriate their search for the food. It increases the cost associated with a wrong choice in the T-maze test as it precludes the food discovery. Accordingly, an extended starvation promotes the TOD related changes in the odor preference in flies already with a single cycle of reversal training. Intriguingly, prolonged starvation is required for the time-odor memory acquisition but is dispensable during the memory retrieval. Endogenous oscillators promote time-odor associations in flies. Flies in constant darkness have functional rhythms and can form time-odor memories. In contrast, flies kept in constant light become arrhythmic and demonstrated no change in their odor preference through the day. Also, clock mutant flies per01 and clkAR, show compromised performance compared to CS flies when trained in the time-odor conditioning assay. These results suggest that flies need a per and clk dependent oscillator for establishing TOD related memories. Also, the clock governed rhythms are necessary for the timeodor memory acquisition but not for the retrieval. Pigment-Dispersing Factor (PDF) neuropeptide is a clock output factor (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). pdf01 mutant flies are unable to form significant time-odor memories. PDF is released by 8 neurons per hemisphere in the fly brain. This cluster includes the small (s-LNvs) and large (l-LNvs) ventral lateral neurons. Restoring PDF in these 16 neurons in the pdf01 mutant background rescues the time-odor learning defect. The PDF neuropeptide activates a seven transmembrane G-protein coupled receptor (PDFR) which is broadly expressed in the fly brain (Hyun et al., 2005). The present study shows that the expression of PDFR in about 10 dorsal neurons (DN1p) is sufficient for robust time-odor associations in flies. 66 In conclusion, flies use distinct endogenous oscillators to acquire and retrieve time-odor memories. The first oscillator is light dependent and likely signals through the PDF neuropeptide to promote the usage of the time as an associative cue during appetitive conditioning. In contrast, the second clock is light independent and specifically signals the time information for the memory retrieval. The identity of this clock and the underlying mechanism are open to investigation. N2 - Die endogenen circadianen Uhren helfen Tieren, die täglichen Veränderungen der Umwelt zu antizipieren. Diese internen Uhren stützen sich auf externe Umweltreize, sogenannte Zeitgeber, die den Tagesrhythmus vorgeben. Im Fliegengehirn bilden etwa 150 Neuronen die zentrale innere Uhr (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich- Förster, 2005). Diese Neuronen exprimieren die molekulare Uhr, die aus Transkriptions- Translations-Feedback-Schleifen besteht. Die Uhr besitzt die Proteine Clock (CLK) und Cycle (CYC), die zusammen die Transkription von period (per) und timeless (tim) aktivieren. PER und TIM bilden dann ein Heterodimer um die Transkription von clk und cyc zu blockieren (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Lichtsignale lösen den Abbau von TIM durch das für blaues Licht sensitive‚ 'Sensing Protein Cryptochrome‘ (CRY) aus, daß wiederum CLK und CYC freisetzt um die per und tim Transkription wieder aufzunehmen (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Daher wirkt Licht als wichtiger Zeitgeber. Die innere Uhr der Säuger besteht aus ähnlich miteinander verflochtenen Rückkopplungsschleifen. Die internen Uhren ermöglichen und erleichtern Verhaltensveränderungen in einer Vielzahl von Situation, entsprechend der Tageszeit. Zudem wird die Information den jeweiligen Speicherorten im Gehirn bereit gestellt, um zeitbezogene Gedächtnisbildung zu ermöglichen. Zeitabhängige Gedächtnisbildung sorgt für eine angemessene Nutzung der Ressourcen und sichert gleichzeitig das Überleben des Tieres. Zum Beispiel können Tiere Zeit-Ort-Assoziationen im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit einer biologisch wichtigen Ressource, wie Nahrung oder Paarungspartnern bilden. Solche Assoziationen helfen dem Tier Ressourcen an verschiedenen Orten, abhängig von der Tageszeit, zu erschließen. Die Wichtigkeit dieser Fähigkeit wird durch die Tatsache gestützt, daß zum Beispiel Bienen, Ameisen, Ratten und Mäuse ein zeitlich abhängiges Ortgedächtnis bilden können (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Frühere Studien haben gezeigt, daß zeitbezogene Erinnerungen auf einer internen Uhr beruhen. Die genaue Identität dieser Uhr und die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht ausreichend bekannt. In der vorliegenden Studie wird gezeigt, daß Fliegen in der Lage sind ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Zudem wird versucht die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Hungrige Fliegen werden zu verschiedenen Tageszeiten konditioniert verschiedene Gerüche mit einer Saccharose-Belohnung zu assoziieren. Morgens ist Geruch A mit Zucker gepaart während Geruch B ohne Zucker präsentiert wird, am Nachmittag ist Geruch B belohnt, Geruch A nicht. Dieses reziproke Training wird an zwei aufeinander folgenden Tagen durchgeführt. Am dritten Tag werden die Fliegen entweder am Morgen oder Nachmittag auf ihre Geruchspräferenz zwischen A und B getestet. Die Fliegen modulieren ihre Geruchspräferenz abhängig von der Tageszeit. Im Gegensatz dazu sind Fliegen, die nicht mittels eines reziproken Trainings konditioniert wurden, nicht in der Lage, ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Fliegen nur dann in der Lage sind zeitbezogene Erinnerungen zu bilden, wenn die beiden reziproken Trainingszyklen mindestens 6 h voneinander getrennt durchgeführt werden. Die Arbeit ebeleuchtet zudem die Rolle des internen Zustands der Fliegen im Kontext des zeitabhängigen olfaktorischen Gedächtnisses. Länger andauernder Hunger motiviert die Fliegen stärker ihre Suche nach Nahrung zeitlich anzupassen. Schon ein Zyklus reziproken Trainings reicht für die Bildung Zeit-spezifischen Geruchsgedächtnisses aus. Die Erhöhung der Kosten, die mit einer falschen Wahl in einem T-maze-Test verbunden ist, kann offenbar zeitabhängige Änderungen der Geruchspräferenzen in Fliegen begünstigen. Erstaunlicherweise begünstigt der Hunger speziell die Gedächtnisbildung, ist jedoch für den Test nicht erforderlich. Endogene circadiane Oszillatoren werden für das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis der Fliegen gebraucht. Fliegen, die im Dauerdunkel gehalten wurden, zeigen rhythmisches Verhalten so wie zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis. Im Gegensatz dazu sind im Dauerlicht aufgezogene Fliegen arrhythmisch und zeigen kein Zeit-spezifisches Geruchsgedächtnis. Zudem sind auch die arrhythmischen Mutanten per01 und clkAR in der Zeit-Geruchskonditionierung gestört. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Fliegen einen per- und clk-abhängigen Oszillator benötigen, der von externen Lichtsignalen abhängig ist, um ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Außerdem wird der durch die innere Uhr vorgegebene Rhythmus nur während der Gedächtnisbildung und nicht für das Abrufen des Gelernten benötigt. Pigment dispersing factor (PDF) ist ein Neuropeptid, das von Neuronen der inneren Uhr gebildet wird (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). Die pdf01-Mutante ist nicht in der Lage ein signifikantes zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. PDF wird von jeweils einer Gruppe von 8 Neuronen pro Hemisphäre, die die kleinen und großen ventral-lateralen Neuronen umfaßt, sezerniert. Die Wiederherstellung der Expression von PDF in diesen 16 Neuronen im pdf01 Mutanten Hintergrund, rettet das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis. Das PDF-Neuropeptid aktiviert einen sieben-Transmembran-G-Protein- gekoppelten Rezeptor (PDFR), der weit verbreitet im Fliegenhirn exprimiert wird (Hyun et al., 2005). Diese Studie zeigt, daß die Expression von PDFR in ~ 10 dorsalen Neuronen (DN1p) für eine robuste zeitabhängige olfaktorische Gedächtnisbildung in Fliegen ausreicht. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Fliegen verschiedene endogene Oszillatoren benutzen um ein zeitabhängiges olfaktorische Gedächtnis zu bilden und abzurufen. Der erste Oszillator ist lichtabhängig und wahrscheinlich durch das PDF- Neuropeptid vermittelt. Es ermöglicht die Verwendung der Information 'Zeit' als assoziatives Signal während der appetitiven Konditionierung. Im Gegensatz dazu ist die zweite Uhr lichtunabhängig und vermittelt speziell die Zeitinformation für die Gedächtnisabfrage. Die Identität der zweiten Uhr und der zugrunde liegende Mechanismus sowie die zugrunde liegende Kommunikation zwischen den Neuronen, bedarf weiterer Untersuchungen. KW - Learning and memory KW - Circadian rhythms KW - Odor-feeding-time memory KW - Taufliege KW - Tagesrhythmus KW - Geruchswahrnehmung KW - Konditionierung KW - Molekulargenetik Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145675 ER - TY - THES A1 - Weigel [verh. Hoffmann], Mathis Leonard T1 - Thrombozytenfunktionsanalyse als potenzielles Instrument zur Früherkennung von Sepsis T1 - Platelet function analysis as a potential tool for early sepsis diagnosis N2 - Sepsis ist ein häufiges und akut lebensbedrohliches Syndrom, das eine Organfunktionsstörung in Folge einer dysregulierten Immunantwort auf eine Infektion beschreibt. Eine frühzeitige Diagnosestellung und Therapieeinleitung sind von zentraler Bedeutung für das Überleben der Patient:innen. In einer Pilotstudie konnte unsere Forschungsgruppe mittels Durchflusszytometrie eine ausgeprägte Hyporeaktivität der Thrombozyten bei Sepsis nachweisen, die einen potenziell neuen Biomarker zur Sepsis-Früherkennung darstellt. Zur Evaluation des Ausmaßes und Entstehungszeitpunktes der detektierten Thrombozytenfunktionsstörung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzlich zu Patient:innen mit Sepsis (SOFA-Score ≥ 2; n=13) auch hospitalisierte Patient:innen mit einer Infektion ohne Sepsis (SOFA-Score < 2; n=12) rekrutiert. Beide Kohorten wurden zu zwei Zeitpunkten (t1: <24h; t2: Tag 5-7) im Krankheitsverlauf mittels Durchflusszytometrie und PFA-200 untersucht und mit einer gesunden Kontrollgruppe (n=28) verglichen. Phänotypische Auffälligkeiten der Thrombozyten bei Sepsis umfassten: (i) eine veränderte Expression verschiedener Untereinheiten des GPIb-IX-V-Rezeptorkomplexes, die auf ein verstärktes Rezeptor-Shedding hindeutet; (ii) ein ausgeprägtes Mepacrin-Beladungsdefizit, das auf eine zunehmend reduzierte Anzahl von δ-Granula entlang des Infektion-Sepsis Kontinuums hinweist; (iii) eine Reduktion endständig gebundener Sialinsäure im Sinne einer verstärkten Desialylierung. Die funktionelle Analyse der Thrombozyten bei Sepsis ergab bei durchflusszytometrischer Messung der Integrin αIIbβ3-Aktivierung (PAC-1-Bindung) eine ausgeprägte generalisierte Hyporeaktivität gegenüber multiplen Agonisten, die abgeschwächt bereits bei Infektion nachweisbar war und gemäß ROC-Analysen gut zwischen Infektion und Sepsis diskriminierte (AUC >0.80 für alle Agonisten). Im Gegensatz dazu zeigten Thrombozyten bei Sepsis und Analyse mittels PFA-200 unter Einfluss physiologischer Scherkräfte eine normale bis gar beschleunigte Aggregation. Die Reaktivitätsmessung von Thrombozyten mittels Durchflusszytometrie stellt weiterhin einen vielversprechenden Biomarker für die Sepsis-Früherkennung dar. Für weitere Schlussfolgerungen ist jedoch eine größere Kohorte erforderlich. In nachfolgenden Untersuchungen sollten zudem mechanistische Ursachen der beschriebenen phänotypischen und funktionellen Auffälligkeiten von Thrombozyten bei Infektion und Sepsis z.B. mittels Koinkubationsexperimenten untersucht werden. N2 - Sepsis is a frequent and life-threatening condition that describes organ dysfunction resulting from a dysregulated host immune response to infection. Early diagnosis and treatment are essential to improve patient survival. In a previous pilot study with sepsis patients, our research identified a severe platelet hyporeactivity using flow cytometry which could become a potential new biomarker for early sepsis diagnosis. To evaluate onset and extend of the detected platelet dysfunction in this study, we extended our patient cohort in addition to sepsis (SOFA-score ≥2; n=13) also to hospitalized patients with infection without sepsis (SOFA-score <2; n=12). Both cohorts were assessed at two time points during the disease (t1: <24h; t2: day 5-7) by flow cytometry and PFA-200 and compared with a healthy control group (n=28). Platelet phenotypic abnormalities during sepsis included: (i) altered expression of subunits of the GPIb-IX-V receptor complex, pointing to increased receptor shedding; (ii) a severe mepacrine loading deficit, indicating an increasingly reduced number of δ-granules along the infection-sepsis continuum; (iii) a reduction of terminally bound sialic acid, suggesting increased desialylation. Functional analysis of platelets in sepsis revealed a marked and generalized hyporeactivity toward multiple agonists when integrin αIIbβ3 activation (PAC-1 binding) was measured by flow cytometry, which was already to a lesser extend present in patients with infection and discriminated well between infection and sepsis according to ROC analysis (AUC >0.80 for all agonists). In contrast, platelets from septic patients showed normal to even accelerated aggregation when measured under flow condition and physiological shear forces by PFA-200. Analysis of platelet reactivity by flow cytometry remains a promising biomarker for early sepsis detection, but a larger cohort is needed for further conclusions. In subsequent studies, mechanistic causes of the described alterations in platelet phenotype and function during infection and sepsis should be investigated, e.g. by means of co-incubation experiments. KW - Sepsis KW - Thrombozyt KW - Biomarker KW - Frühdiagnostik KW - Durchflusscytometrie KW - Thrombozytenfunktionsanalyse Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358193 ER -