TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Bucher, Hannes T1 - Pre-clinical modeling of viral- and bacterial-induced exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease T1 - Prä-klinische Modellierung von viral und bakteriell induzierten Exazerbationen von Chronisch Obstruktiver Lungenerkrankung N2 - Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) exacerbations are a considerable reason for increased morbidity and mortality in patients. Infections with influenza virus (H1N1), respiratory syncytial virus (RSV) or nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are important triggers of exacerbations. To date, no treatments are available which can stop the progression of COPD. Novel approaches are urgently needed. Pre-clinical models of the disease are crucial for the development of novel therapeutic options. In order to establish pre-clinical models which mimic aspects of human COPD exacerbations, mice were exposed to cigarette smoke (CS) and additionally infected with H1N1, RSV and/or NTHi. Clinically relevant treatments such as the corticosteroids Fluticasone propionate and Dexamethasone, the phosphodiesterase-4 (PDE-4) inhibitor Roflumilast and the long-acting muscarinic receptor antagonist Tiotropium were tested in the established models. Furthermore, a novel treatment approach using antibodies (Abs) directed against IL-1α, IL-1β or IL-1R1 was examined in the established CS/H1N1 model. Levels of IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-6, KC, TNF-α, RANTES, IL-17, MCP-1, MIP 1α and MIP-1β were measured in lung homogenate. Numbers of total cells, neutrophils and macrophages were assessed in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. Hematoxylin- and eosin- (H&E-) stained lung slices were analyzed to detect pathological changes. Quantitative polymerase-chain-reaction (qPCR) was used to investigate gene expression of ICAM-1 and MUC5 A/C. The viral/bacterial load was investigated in lung homogenate or BAL fluid. In addition to the in vivo studies, the effects of the above mentioned treatments were investigated in vitro in H1N1, RSV or NTHi-infected (primary) human bronchial epithelial cells using submerged or air-liquid-interface (ALI) cell culture systems. Four pre-clinical models (CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi) were established depicting clinically relevant aspects of COPD exacerbations such as increased inflammatory cells and cytokines in the airways and impaired lung function. In the CS/H1N1 model, Tiotropium improved lung function and was superior in reducing inflammation in comparison to Fluticasone or Roflumilast. Moreover, Fluticasone increased the loss of body-weight, levels of IL-6, KC and TNF-α and worsened lung function. In CS/RSV-exposed mice Tiotropium but not Fluticasone or Roflumilast treatment reduced neutrophil numbers and IL-6 and TNF α levels in the lung. The viral load of H1N1 and RSV was significantly elevated in CS/virus-exposed mice and NCI-H292 cells after Fluticasone and Dexamethasone treatment. The results from these studies demonstrate that Tiotropium has anti-inflammatory effects on CS/virus-induced inflammation and might help to explain the observed reduction of exacerbation rates in Tiotropium-treated COPD patients. Furthermore, the findings from this work indicate that treatment with Fluticasone or Dexamethasone might not be beneficial to reduce inflammation in the airways of COPD patients and supports clinical studies that link treatment with corticosteroids to an increased risk for pneumonia. Testing of anti-IL-1α, anti-IL-1β or anti-IL-1R1 Abs in the CS/H1N1 model suggests that, in line with clinical data, antagonization of IL-1β is not sufficient to reduce pulmonary inflammation and indicates a predominant role of IL-1α in CS/virus-induced airway inflammation. In line with the in vivo findings, anti-IL-1α but not anti-IL-1β Abs reduced levels of TNF-α and IL-6 in H1N1-infected primary human bronchial epithelial ALI cell culture. Blocking the IL-1R1 provided significant inhibitory effects on inflammatory cells in vivo but was inferior compared to inhibiting both its soluble ligands IL-1α and IL-1β. Concomitant usage of Abs against IL-1α/IL-1β revealed strong effects and reduced total cells, neutrophils and macrophages. Additionally, levels of KC, IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1α and MIP-1β were significantly reduced and ICAM-1 mRNA expression was attenuated. These results suggest that combined inhibition of IL-1α/IL-1β might be beneficial to reduce inflammation and exacerbations in COPD patients. Moreover, combined targeting of both IL-1α/IL-1β might be more efficient compared to inhibition of the IL-1R1. As in the CS/virus models, corticosteroid treatment failed to reduce inflammatory cells in the CS/NTHi and CS/H1N1/NTHi models, increased the loss of body-weight and the bacterial load. Furthermore, Roflumilast administration had no significant effects on cell counts or cytokines. However, it improved compliance in the CS/NTHi model. Treatment with Azithromycin reduced the bacterial load in the CS/NTHi model and reduced numbers of total cells, neutrophils, macrophages and levels of KC and TNF-α in the CS/H1N1/NTHi model. In conclusion, the established CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi models depict clinically relevant aspects of human COPD exacerbations in mice and provide the opportunity to investigate underlying disease mechanisms and to test novel therapies. N2 - Exazerbationen von Chronisch Obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) sind ein bedeutender Grund für erhöhte Morbidität und Mortalität von Patienten. Infektionen mit Influenza Virus (H1N1), Respiratory Syncytial Virus (RSV) oder nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) gelten als wichtige Auslöser von Exazerbationen. Bis heute gibt es keine Therapien, welche die Progression von COPD verhindern können. Neue Therapieansätze werden daher dringend benötigt. Prä-klinische Modelle spielen bei der Entwicklung neuer Therapien eine entscheidende Rolle. Um Aspekte einer humanen COPD-Exazerbation abzubilden, wurden Mäuse Zigarettenrauch (CS) ausgesetzt und zusätzlich mit H1N1, RSV und/oder NTHi infiziert. Klinisch relevante Behandlungen, z.B. die Kortikosteroide Fluticasonpropionat und Dexamethason, der Phosphodiesterase 4 (PDE-4) Inhibitor Roflumilast und der muskarinische Rezeptorantagonist Tiotropium, wurden in den etablierten Modellen getestet. Zudem wurde ein neuer therapeutischer Ansatz untersucht bei dem IL-1α, IL-1β neutralisierende bzw. IL-1R1 blockierende Antikörper (Ak) zum Einsatz kamen. Die Mengen von IFN-γ, IL-1β, IL 2, IL-6, KC, TNF-α, RANTES, IL-17, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β wurden im Lungenhomogenat gemessen. Die Gesamtzellzahl und die Anzahl von Neutrophilen und Makrophagen wurden in bronchoalveolärer Lavage (BAL) Flüssigkeit bestimmt. Hematoxylin- und Eosin- (H&E-) gefärbte Lungenschnitte wurden analysiert, um pathologische Veränderungen zu detektieren. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde genutzt, um die Genexpression von ICAM-1 und MUC5 A/C zu untersuchen. Die Virus /Bakterienlast wurde in BAL Flüssigkeit oder Lungenhomogenat gemessen. Darüber hinaus wurden die Effekte der oben genannten Behandlungen in vitro in H1N1, RSV oder NTHi infizierten (primären) humanen bronchialen Epithelzellen in „submerged“ oder „air-liquid-interface (ALI)“ Zellkultur-Systemen untersucht. Vier prä-klinische Modelle (CS/H1N1, CS/RSV, CS/NTHi, CS/H1N1/NTHi) wurden etabliert, die relevante Aspekte einer Exazerbation, wie beispielsweise den Einstrom inflammatorischer Zellen, erhöhte Zytokinlevel oder verminderte Lungenfunktion abbilden. Im CS/H1N1-Modell verbesserte Tiotropium die Lungenfunktion und zeigte stärker anti-entzündliche Effekte als Fluticason oder Roflumilast. Zudem verstärkte Fluticason den Gewichtsverlust, erhöhte die Level von IL-6 und TNF-α und verschlechterte die Lungenfunktion. Im CS/RSV-Modell reduzierte Tiotropium, aber nicht Fluticason oder Roflumilast die Zahl der Neutrophilen sowie IL-6 und TNF-α Mengen. Die Menge von H1N1 und RSV war in den CS/Virus-Modellen sowie in NCI-H292 Zellen nach Fluticason- oder Dexamethason-Behandlung signifikant erhöht. Die Ergebnisse dieser Studien demonstrieren anti-inflammatorische Effekte von Tiotropium auf CS/Virus-induzierte Entzündung und könnten helfen, reduzierte Exazerbationshäufigkeiten in mit Tiotropium behandelten Patienten zu erklären. Zudem könnten die Resultate dieser Arbeit darauf hindeuten, dass die Behandlung mit Kortikosteroiden nicht geeignet ist, um Entzündung in COPD-Patienten zu reduzieren, und könnten dabei helfen, das in klinischen Studien festgestellte erhöhte Risiko von Pneumonien bei Behandlung mit Kortikosteroiden zu erklären. Im Einklang mit klinischen Daten deutet die Testung von anti-IL-1α, anti-IL-1β oder anti IL-1R1 Ak im CS/H1N1-Modell darauf hin, dass die Neutralisation von IL-1β nicht ausreicht, um die Entzündung in der Lunge zu reduzieren, und impliziert eine prädominierende Rolle von IL-1α in CS/H1N1-induzierter Atemwegsentzündung. Konform mit den in vivo Ergebnissen, reduzierten anti-IL-1α, aber nicht anti-IL-1β Ak, TNF-α und IL-6 in H1N1-infizierter primärer humaner bronchialer epithelialer ALI-Zellkultur. Die Blockade von IL-1R1 zeigte in vivo signifikante inhibitorische Effekte auf inflammatorische Zellen, die verglichen mit der Neutralisation seiner löslichen Liganden IL-1α/IL-1β allerdings unterlegen waren. Die kombinierte Neutralisation von IL-1α/IL-1β war sehr effektiv und reduzierte die Gesamtzellzahl sowie die Zahl der Neutrophilen und Makrophagen in der Lunge. Zusätzlich wurden die Level von KC, IL-6, TNF-α, MCP-1, MIP-1α und MIP-1β signifikant reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass kombinierte Inhibition von IL-1α/IL-1β geeignet sein könnte, um Entzündung und Exazerbationen in COPD-Patienten zu reduzieren. Zudem könnte IL-1α/IL-1β-Neutralisation effektiver sein als IL-1R1-Blockade. Wie in den CS/Virus-Modellen wurden inflammatorische Zellen durch Kortikosteroid-Behandlung im CS/NTHi- und CS/H1N1/NTHi-Modell nicht reduziert, verstärkten zudem den Gewichtsverlust und erhöhten die Bakterienmenge. Roflumilast zeigte keine Effekte auf Zellzahlen und Zytokine. Allerdings verbesserte die Behandlung damit die Compliance im CS/NTHi-Modell. Die Behandlung mit Azithromycin reduzierte die Bakterienmenge im CS/NTHi-Modell und reduzierte die Gesamtzellzahl und Anzahl von Neutrophilen und Makrophagen, sowie die Level von KC und TNF-α im CS/H1N1/NTHi-Modell. Zusammenfassend bilden die etablierten CS/H1N1-, CS/RSV-, CS/NTHi-, CS/H1N1/NTHi-Modelle klinisch relevante Aspekte von humanen COPD-Exazerbationen ab und ermöglichen die Erforschung von Krankheitsmechanismen und neuen Therapieansätze. KW - Obstruktive Ventilationsstörung KW - COPD KW - Exacerbation KW - Tiotropium KW - Influenza KW - NTHi KW - Preclinical KW - Model KW - Treatment KW - Exazerbation KW - Maus Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144368 ER - TY - THES A1 - Chan, Gordon T1 - The Role of Vav-1, Vav-2 and Lsc in NK T cell development and NK cell cytotoxicity N2 - The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation. N2 - Vav-1 ist ein spezifisch in hämatopoetischen Zellen exprimierter Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) für Rho-GTPasen, der die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion in Lymphocyten reguliert und essentiell für der Reifung und Aktivierung von B- und T-Zellen ist. Untersuchungen an menschlichen Zellen lassen vermuten, dass Vav1 auch für Antikörper-unabhängige, natürliche Zytotoxizität und die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytoxizität (ADCC) von „Natürlichen-Killerzellen“ (NK-Zellen) wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass Vav-1 auch in murinen NK-Zellen exprimiert ist. Analysen von Vav-1-/--Mäuse zeigen eine normale Anzahl von NK-Zellen, die wiederum ein ähnliches Expressionsprofil von typischen NK-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu wildtypischen Mäusen aufweisen. Die ADCC von Vav-1-/- NK-Zellen ist unverändert, wie auch die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung von ERK, JNK und p38. Im Gegensatz dazu zeigen Vav-1-/- NK-Zellen eine reduzierte natürliche Cytotoxizität gegenüber EL4-, C4.4.25-, RMA- und RMA/S-Zielzellen. Vav-1 ist daher nicht für die Entwicklung, sondern für den Aufbau der natürlichen Cytotoxizität von NK-Zellen von Bedeutung. Für Vav-2 wurde ebenfalls eine Rolle in NK-Zellfunktionen wahrscheinlich gemacht. Dennoch zeigen Vav-2-/- Mäuse ein normales zytotoxisches Verhalten. NK-Zellen von Vav-1/Vav-2-doppeldefizienten Tieren weisen ähnliche Defekte wie NK-Zellen von Vav-1-defizienten Tieren. Somit besitzt Vav-2 keine entscheidende Funktion für die Entwicklung und Aktivierung von NK-Zellen. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist die Anzahl der NKT-Zellen in Vav-1-/- Mäusen drastisch reduziert. Außerdem sind NKT-Zellen Vav-1-defizienter Mäuse nicht in der Lage IL-4 und INFg nach CD3-Stimulierung in vivo zu produzieren. Ein ähnlicher Verlust der NKT-Zell-Population wurde in Vav-1-/-- Vav-2-/--Mäusen beobachtet, nicht aber in Vav-2-/- Mäusen. Daher scheint nur Vav-1, nicht aber Vav-2, ein essentieller Regulator sowohl der NKT-Zell-Entwicklung als auch der NK-Zell-Cytotoxizität zu sein. Ein weiterer Rho-GEF, Lsc, ist ebenfalls spezifisch im hämatopoetischen System exprimiert. Lsc besitzt auch eine negativ-regulatorische RGS-Domäne (regulator of G-protein signaling) für die Ga12- und Ga13-Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. NK- und NKT-Zellen von Lsc-defizienten Mäusen entwickeln sich normal, weisen aber eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumor-Zellen auf. Diese Daten zeigen zum ersten mal die Beteiligung eines RGS-Rho-GEF an zytotoxischen Reaktionen und deuten auf eine negative Modulation der NK-Zell-Aktivierung durch Lsc hin. KW - Maus KW - Natürliche Killerzelle KW - Cytotoxizität KW - Vav KW - Lsc/p115 Rho GEF KW - NK cells KW - cytotoxicity KW - T cells Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3645 ER - TY - THES A1 - Daniels, Justin John Douglas T1 - Interaction of Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes with the murine host T1 - Interaktionen von Salmonella typhimurium und Listeria monocytogenes mit der Maus als Wirt N2 - Food borne pathogens that cause systemic disease must cross the intestinal barrier. Many of these pathogens, eg Salmonella typhimurium and Shigella flexneri, use M cells, found only within the follicle associated epithelium (FAE) that overlies Peyer’s patches and other lymphoid follicles, to enter the host. This study is primarily an investigation into the interaction of S. typhimurium and Listeria monocytogenes with the intestinal epithelium, representing the early stage of an infection. N2 - Alle in Nahrungsmitteln vorkommenden Pathogene, die eine systemische Infektion auslösen, müssen die Darmwand überwinden. Für die Invasion bevorzugtes Ziel vieler Lebensmittelpathogene, wie z.B. Salmonella typhimurium und Shigella flexneri, sind M-Zellen, die nur innerhalb des Follikel-assoziierten Epithels (FAE) über den Peyer’schen Plaques und anderen Lymphoid-Follikel vorkommen. In dieser Arbeit wurde in erster Linie die Interaktion von S. typhimurium und Listeria monocytogenes mit dem FAE untersucht, welche die frühe Phase einer Infektion repräsentiert. KW - Maus KW - M-Zelle KW - Salmonella typhimurium KW - Listeria monocytogenes KW - Salmonella typhimurium KW - Listeria monocytogenes KW - M-Zellen KW - Peyer'sche Plaques KW - BABLB/c KW - C57/BL6 KW - Maus KW - Salmonella typhimurium KW - Listeria monocytogenes KW - M cells KW - Peyer's Patches KW - BABLB/c KW - C57/BL6 KW - Mouse Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1073 ER - TY - THES A1 - Düchs, Matthias T1 - Effects of Toll-like receptor agonists on the pathogenesis of atopic asthma in mice T1 - Effekte von Toll-like Rezeptor Agonisten auf den Krankheitsverlauf von atopischen Asthma im Mausmodell N2 - In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account. N2 - In den letzten Jahrzehnten wurde für Asthma ein Anstieg der Neuerkrankungen und der schweren Krankheitsverläufe verzeichnet. Des Weitern kontrollieren angewandte Therapien zwar Symptome, bieten aber keine Heilung. Ein vielversprechender Ansatz, mit dem Ziel den ursächlichen Krankheitsmechanismus zu inhibieren, ist die TLR Agonisten induzierte Immunmodulation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung von immunstimulatorischen Toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten für neue Therapieansätze in allergischen Entzündungsmodellen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf verschiedene TLR Agonisten in murinen Modellen von akutem oder chronischem Asthma, sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verabreicht. Als erstes wurden in einem Modell mit akuter Entzündungsreaktion verschiedene Konzentrationen der Agonisten für TLR 2, 3, 4, 7 und 9, vor der pulmonalen Allergenexposition intratracheal appliziert. Hier verminderten TLR9 Agonist CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG) > TLR7 Agonist Resiquimod (R848) > TLR3 Agonist poly(I:C) konzentrationsabhängig die allergen-induzierte Eosinophilie in den Atemwegen. Alle TLR Agonisten erhöhten die Anzahl an Neutrophilen, am stärksten TLR4 Agonist Lipopolysaccharid (LPS) > TLR2 Agonist Lipoteichon Säure (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848. Weiterhin erhöhten, bis auf R848, alle TLR Agonisten die Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen in den Atemwegen. Die hierbei beobachteten suppressiven Effekte waren weder IFN-γ noch IL-10 abhängig und korrelierten auch nicht mit einer Erhöhung der pulmonalen regulatorischen T Zellen. Die therapeutische Gabe von TLR Agonisten nach Allergenexposition reduzierte ebenfalls die Eosinophilie sowie IL-4 in den Atemwegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die TLR Agonisten in ihrer suppressiven Wirkung stark unterscheiden, und dass ihre Wirkung zum einen von der verabreichten Konzentration und zum anderen von dem experimentellen Aufbau abhängig ist. Auffällig war, dass alle Agonisten, wenngleich in unterschiedlicher Ausprägung, eine Neutrophilie in den Atemwegen induzierten. Dies wirft die Frage auf, ob eine wiederholte pulmonale Gabe für den Menschen verträglich wäre. Ein anderer Ansatz verwendet TLR Agonisten als Adjuvanzien für die Kombination mit Allergenen in der spezifischen Immuntherapie. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TLR vermittelte Erhöhung der allergen-spezifischen TH1Antwort die Effektivität der Therapie steigern kann. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit die verschieden TLR Agonisten auf ihre Fähigkeit hin untersucht allergen-spezifische TH1 Antworten auszulösen und allergen-spezifische TH2 Antworten zu unterdrücken. Hierfür wurde Allergen zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der TLR Agonisten appliziert und anschließend die Mäuse Allergen-Aerosol ausgesetzt. Hier konnte eine starke, konzentrationsabhängige Unterdrückung der Atemwegseosinophilie, begleitet von einer Neutrophilie, bei CpG > LPS >LTA beobachten werden. Poly(I:C) und R848 zeigten keine Effekte. Auch wurde die Menge von IL-4 und IL-5 in der bronchoalveolaren Lavage durch poly(I:C), LPS, und CpG erniedrigt. Weiterhin reduzierten alle TLR Agonisten, mit der Ausnahme von poly(I:C), die Menge an allergen-spezifischem IgE im Serum. Die kutane anaphylaktische Reaktion gegen das Allergen wurde durch CpG- oder LPS-Adjuvans komplett verhindert. Die stärkste TH1 Antwort, charakterisiert durch erhöhtes IFN-γ in der Lavage und die größte Menge an allergen-spezifischem IgG2a, wurde durch CpG und poly(I:C) ausgelöst. Diese Resultate unterstützen den klinischen Ansatz CpG als erfolgsversprechenden Adjuvants-Kandidaten für die Kombinationstherapie mit Allergen in der spezifischen Immuntherapie einzusetzen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob die Aktivierung von TLRs auch den Krankheitsverlauf von schwerem chronischem Asthma beeinflussen kann. Die beiden TLR Agonisten CpG und R848 reduzierten Faktoren des Atemwegumbaus und der Entzündung effektiver als das Steroid Dexamethasone, wobei CpG die höchste Effektivität aufwies. Dieses Ergebnis unterstützt ebenfalls eine auf TLR9 Agonisten basierende Therapie als einen vielverspechenden Ansatz für die Behandlung von schwerem chronischem Asthma auch als eine potentielle Alternative zur antiinflammatorischen Therapie mit Steroiden. Zusammenfassend unterstützen die Resultate die Verwendung von TLR Agonisten für die Behandlung von Asthma. Die höchste Effektivität und Verträglichkeit ist für eine TLR Allergen Kombinationstherapie mit TLR4 oder TLR9 Agonisten in der spezifischen Immuntherapie zu erwarten. Für eine mögliche TLR Monotherapie zeigten R848 und CpG die besten Wirkungsprofile, für schwereres chronisches Asthma bevorzugt CpG. Hierbei muss jedoch stets berücksichtigt werden, dass TLR Agonisten auch selbst entzündliche Reaktionen hervorrufen können. KW - Toll-like Rezeptor KW - Ligand KW - Bronchialasthma KW - Hypersensibilität KW - Toll-like receptor KW - Asthma KW - allergy KW - mouse model KW - Maus KW - Allergie KW - Maus Modell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66369 ER - TY - THES A1 - Engelhardt, Stefan T1 - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren T1 - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann. KW - Beta-Rezeptor KW - Maus KW - Transgene Tiere KW - Herzinsuffizienz KW - Transgene Mäuse KW - beta-adrenerge Rezeptoren KW - Hypertrophie KW - Fibrose KW - Na/H-Austauscher KW - Herzinsuffizienz KW - transgenic mice KW - cardiac hypertrophy KW - fibrosis KW - Na/H-exchanger KW - heart failure Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950 ER - TY - THES A1 - Englberger, Eva T1 - Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution T1 - Genregulation in Herzen Hey-mutierter Mausembryonen und Darstellung der sub-zellulären Verteilung von Hey1 N2 - Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus. N2 - Am Embryonaltag 14,5 zeigten Herzproben von Hey2-KO-Mäusen eine deutliche Hochregulation mehrerer Gene, die auf das Fehlen von Hey2 zurückzuführen ist, da Kontroll-Tiere gezeigt haben, dass die morphologischen Veränderungen in der Herzstruktur keinen Einfluss auf die Genregulation haben. Vereinzelt wurden die regulierten Gene noch mittels in situ Hybridisierung weiter verdeutlicht. In Immunfloureszenzexperimenten wurde Hey1 im Zellkern lokalisiert. Auf Proteinebene zeigte sich allerdings auch ein Vorhandensein von Hey1 im Cytoplasma der Zellen. Die Kernlokalisaiton von Hey1 veränderte sich während des gesamten Zellzykluses nicht und wurde auch nicht durch die Co-Expression von CaMKII beeinflusst oder die Inhibition oder Stimulation anderer Signalwege in der Zelle. Hey1 scheint nicht mit den Kerntransportproteinen Importin-alpha und -beta zu interagieren, so dass weiterhin nach einem Kernimport-System für Hey1 gesucht werden muss. KW - Maus KW - Herz KW - Embryonalentwicklung KW - Genregulation KW - Herzentwicklung KW - Kerntransport KW - Hey KW - heart development KW - nuclear transport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395 ER - TY - THES A1 - Esterlechner, Jasmina T1 - Role of the DREAM complex in mouse embryonic stem cells and identification of ZO-2 as a new LIN9 interacting protein T1 - Die Rolle des DREAM-Komplexes in embryonalen Stammzellen der Maus und Identifikation von ZO-2 als neues LIN9- interagierendes Protein N2 - The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry (MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation. N2 - Der DREAM Komplex spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation im Verlauf des Zellzyklus. Es wurde gezeigt, dass die DREAM Untereinheiten LIN9 und B-MYB für die frühe Embryogenese und den in vitro Erhalt der inneren Zellmasse erforderlich sind. In der vorligenden Arbeit wurde die Auswirkung von LIN9 und B-MYB Depletierung auf embryonale Stammzellen untersucht. Es zeigt sich, dass Depletion von LIN9 und B-MYB die Zellzyklus-Verteilung von embryonalen Stammzellen beeinflusst, zur Akkumulation der Zellen in G2 und M Phase und zu erhöhter Polyploidie führt. Genomweite Expressionsstudien ergaben, dass die Verringerung von LIN9 in der Runterregulierung von mitotischen und in der Hochregulierung von differenzierungsspezifischen Genen resultiert. ChIP-on-chip Experimente ermittelten, dass LIN9 Mitosegene als direkte Ziele hat, wohingegen entwicklungslinienspezifische Marker indirekt reguliert werden. Wesentlich ist, dass LIN9 Depletion nicht die Expression der Pluripotenzgene Oct4 oder Sox2 beeinflusst und embryonale Stammzellen ihre Alkaline Phosphatase Aktivität behalten. Daraus lässt schließen, dass LIN9 essentiell für die Proliferation und genomische Stabilität von embryonalen Stammzellen ist, in dem es Gene aktiviert, die wichtige Funktionen in Mitose und Zytokinese ausüben. Der exakte Mechanismus hinter der Genaktivierung ist noch nicht geklärt, da keine DREAM Untereinheit eine katalytisch aktive Domäne aufweist. Vermutlich ist die Interaktion mit weiteren Proteinen oder Co-Faktoren für die Genaktivierung vonnöten. Diese Studie entdeckte mit in vivo Isotop-Markierung von Proteinen und Massenspektrometrie (MS) potentielle Bindungspartner und untersuchte die identifizierte Bindung mit dem Tight Junction Protein ZO-2 genauer. Diese Bindung ist zellzyklus-abhängig und ist am stärksten während der S-Phase. ZO-2 Depletion führt zu reduzierter Zellproliferation und verringerter G1-Genexpression. Da keine G2/M Gene, typische DREAM Ziele, von einer ZO-2 Depletion beeinflusst werden, ist es unwahrscheinlich, dass die ZO-2 Bindung für einen funktionellen DREAM Komplex benötigt wird. Jedoch demonstriert diese Studie, dass mit (MS)-basierender, quantitativer Proteomik DREAM interagierende Proteine identifiziert werden können. Dies ist hilfreich um die Mechanismen hinter der DREAM vermittelten Genaktivierung aufzuklären. KW - Zellzyklus KW - cellcycle KW - Stammzelle KW - Maus KW - stem cells KW - DREAM KW - Genregulation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90440 ER - TY - THES A1 - Frank, Nicolas Clemens T1 - Lokale axonale Wirkungen der CNTF-STAT3 Signalkaskade in Motoneuronen der pmn Maus - einem Mausmodel für die Amyotrophe Lateralsklerose T1 - Local Axonal Function of CNTF-STAT3 Signaling in Motoneurons of the pmn-Mouse – a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis N2 - 1. Zusammenfassung Während der Embryogenese und nach Verletzungen von Nerven regulieren neurotrophe Faktoren Signalwege für Apoptose, Differenzierung, Wachstum und Regeneration von Neuronen. In vivo Experimente an neugeborenen Nagern haben gezeigt, dass der Verlust von Motoneuronen nach peripherer Nervenläsion durch die Behandlung mit GDNF, BDNF, und CNTF reduziert werden kann In der pmn-Mausmutante, einem Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose, führt die Gabe von CNTF, nicht aber von GDNF zu einem verzögerten Krankheitsbeginn und einem verlangsamten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Auslöser der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus ist eine Mutation im Tubulin spezifischen Chaperon E (Tbce) Gen, das für eines von fünf Tubulin spezifischen Chaperonen (TBCA-TBCE) kodiert und an der Bildung von -Tubulinheterodimeren beteiligt ist. Diese Arbeit sollte dazu beitragen, die CNTF-induzierten Signalwege zu entschlüsseln, die sich lindernd auf den progredienten Verlauf der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus auswirken. Primäre pmn mutierte Motoneurone zeigen ein reduziertes Axonwachstum und eine erhöhte Anzahl axonaler Schwellungen mit einer anomalen Häufung von Mitochondrien - ein frühes Erkennungsmerkmal bei ALS-Patienten. Die Applikation von CNTF nicht aber von BDNF oder GDNF, kann in vitro die beobachteten Wachstumsdefekte und das bidirektionale axonale Transportdefizit in pmn mutierten Motoneurone verhindern. Aus älteren Untersuchungen war bekannt, dass CNTF über den dreiteiligen transmembranen Rezeptorkomplex, bestehend aus CNTFR, LIFR und gp130, Januskinasen aktiviert, die STAT3 an Tyrosin 705 phosphorylieren (pSTAT3Y705). Ich konnte beobachten, dass axonales fluoreszenzmarkiertes pSTAT3Y705 nach CNTF-Gabe nicht retrograd in den Nukleus transportiert wird. Stattdessen führt die CNTF-induzierte Phosphorylierung von STAT3 an Tyrosin 705 zu einer transkriptionsunabhängigen lokalen Reaktion im Axon. Diese pSTAT3Y705 abhängige Reaktion ist notwendig und ausreichend, um das reduzierte Axonwachstum pmn mutierter Motoneurone zu beheben. Wie die Kombination einer CNTF Behandlung mit dem shRNA vermittelten knock-down von Stathmin in pmn mutierten Motoneuronen zeigt, zielt die CNTF-STAT3 Signalkaskade auf die Stabilisierung axonaler Mikrotubuli ab und wirkt sich positiv auf die anterograde und retrograde Mobilität von axonalen Mitochondrien aus. Interessanter Weise konnte ich außerdem feststellen, dass eine akute Gabe von CNTF das mitochondriale Membranpotential in Axonen primärer pmn mutierter und wildtypischer Motoneurone erhöht und einen Anstieg von ATP auslöst. Meine Beobachtungen legen nahe, dass CNTF unerwarteter Weise auch eine transiente Phosphorylierung an STAT3 Serin 727 (pSTAT3S727) auslöst, die zur anschließenden Translokation von pSTAT3S727 in Mitochondrien führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass STAT3 mehrere lokale Ziele im Axon besitzt, nämlich axonale Mikrotubuli und Mitochondrien. N2 - 2. Summary Both during development and after injury neurotrophic factors induce signaling pathways that regulate apoptosis, differentiation, growth and regeneration of neurons. In newborn rodents, treatment with GDNF, BDNF and CNTF can reduce the loss of motoneurons after peripheral nerve lesion. In the pmn mutant mouse, a model for amyotrophic lateral sclerosis, CNTF but not GDNF delays disease onset and slows down the course of motoneurons degeneration. Pmn mutant mice, suffer from a point mutation in tubulin specific chaperon E (Tbce) gene that codes for one of five tubulin specific chaperones (TBCA-TBCE) and is necessary for proper -tubulin heterodimer formation. The work presented here was designed to study the specific signaling pathways that are used by CNTF for attenuating progression of motoneuron degeneration in pmn mutant mice. Primary motoneurons from pmn mutant mice show reduced axon growth and irregular axonal swellings with abnormal accumulation of mitochondria – an early hallmark of pathology in ALS patients. In vitro, CNTF but not BDNF or GDNF was able to rescue defective axon growth and to prevent bidirectional transport interruption. It has already been shown that CNTF acts via the tripartite transmembrane receptor complex, composed of CNTFR, LIFR and gp130 to recruit Janus kinases that subsequently phosphorylate STAT3 on tyrosine 705 (pSTAT3Y705). After application of CNTF, I observed that axonal pSTAT3Y705 fused to a fluorescent tag is not retrogradely transported to the nucleus. In contrast, CNTF induced phosphorylation of STAT3 at tyrosine 705 leads to a transcriptional independent local reaction in motor axons which is necessary and sufficient to rescue axon growth in pmn mutant motoneurons. Combining CNTF treatment with shRNA mediated knock-down of Stathmin in pmn mutant motoneurons shows that CNTF-STAT3 signaling leads to microtubule stabilization in axons as well as improving anterograde and retrograde mobility of axonal mitochondria. Interestingly, I additionally found that an acute application of CNTF increases the membrane potential of axonal mitochondria that is accompanied with a rise of ATP levels in pmn mutant and wildtype motoneurons. Unexpectedly, I found STAT3 phosphorylated on serine 727 co-localizing with mitochondria after CNTF application. These results demonstrate that multiple local targets of STAT3 exist in axons that modulate structure and function of microtubules and mitochondria. KW - Motoneuron KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - CNTF KW - STAT3 KW - axonaler Transport KW - Motoneuronenerkrankung KW - Maus KW - Ciliary neurotrophic factor KW - Amyotrophe Lateralsklerose Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121065 ER - TY - THES A1 - Fraune, Johanna T1 - The evolutionary history of the mammalian synaptonemal complex T1 - Die Evolutionsgeschichte des Synaptonemalkomplexes der Maus N2 - Der Synaptonemalkomplex (SC) ist eine hochkonservierte Proteinstruktur. Er weist eine dreiteili-ge, leiterähnliche Organisation auf und ist für die stabile Paarung der homologen Chromosomen während der Prophase der ersten meiotischen Teilung verantwortlich, die auch als Synpase be-zeichnet wird. Fehler während der Synpase führen zu Aneuploidie oder Apoptose der sich entwi-ckelnden Keimzellen. Seit 1956 ist der SC Gegenstand intensiver Forschung. Seine Existenz wurde in zahlreichen Orga-nismen von der Hefe bis zum Menschen beschrieben. Seine Struktur aus zwei parallel verlaufen-den Lateralelementen (LE), die durch eine Vielzahl von sogenannten Transversalfilamenten (TF) verbunden werden und dem Zentralen Element (CE) in der Mitte des SC ist dabei offensichtlich über die Millionen von Jahren der Evolution erhalten geblieben. Einzelne Proteinkomponenten des SC wurden jedoch nur in wenigen Modelorganismen charakterisiert, darunter Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans und Mus mus-culus. Unerwarteter Weise gelang es bei dieser Charakterisierung nicht, eine evolutionäre Ver-wandtschaft, d.h. eine Homologie zwischen den Proteinsequenzen der verschiedenen SCs nach-zuweisen. Diese Tatsache sprach gegen die grundsätzliche Annahme, dass der SC in der Evolution nur einmal entstanden sei. Diese Arbeit hat sich nun der Aufgabe gewidmet, die Diskrepanz zwischen der hochkonservierten Struktur des SC und seiner augenscheinlich nicht-homologen Proteinzusammensetzung zu lösen. Dabei beschränkt sie sich auf die Analyse des Tierreichs. Es ist die erste Studie zur Evolution des SC in Metazoa und demonstriert die Monophylie der Säuger SC Proteinkomponenten im Tierreich. Die Arbeit zeigt, dass mindestens vier von sieben SC Proteinen der Maus spätestens im letzten gemeinsamen Vorfahren der Gewebetiere (Eumetazoa) enstanden sind und auch damals Teil ei-nes ursprünglichen SC waren, wie er heute in dem Nesseltier Hydra zu finden ist. Dieser SC weist die typische Struktur auf und besitzt bereits alle notwendigen Komponenten, um die drei Domä-nen – LE, TF und CE – zu assemblieren. Darüber hinaus ergaben die einzelnen Phylogenien der verschiedenen SC Proteine der Maus, dass der SC eine sehr dynamische Evolutionsgeschichte durchlaufen hat. Zusätzliche Proteine wurden während der Entstehung der Bilateria und der Wir-beltiere in den SC integriert, während andere ursprüngliche Komponenten möglicherweise Gen-Duplikationen erfuhren bzw. besonders in der Linie der Häutungstiere verloren gingen oder sich stark veränderten. Es wird die These aufgestellt, dass die auf den ersten Blick nicht-homologen SC Proteine der Fruchtfliege und des Fadenwurms tatsächlich doch von den ursprünglichen Prote-inenkomponenten abstammen, sich aber aufgrund der rasanten Evolution der Arthropoden und der Nematoden bis zu deren Unkenntlichkeit diversifizierten. Zusätzlich stellt die Arbeit Hydra als alternatives wirbelloses Modellsystem für die Meiose- und SC-Forschung zu den üblichen Modellen D. melanogaster und C. elegans vor. Die kürzlich gewon-nenen Erkenntnisse über den Hydra SC sowie der Einsatz der Standard-Methoden in diesem Orga-nismus werden in dem abschließenden Kapitel zusammengefasst und diskutiert. N2 - The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells. Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction. This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda. The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section. KW - Synaptinemal-Komplex KW - Maus KW - Hydra KW - Evolution KW - Meiose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100043 ER - TY - THES A1 - Gehrig, Andrea T1 - Untersuchungen zu den molekularen Ursachen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis - vom Gendefekt zum Mausmodell T1 - Molecular studies of X-linked juvenile Retinoschisis - from gene defect to the mouse model N2 - Hereditäre Netzhautdegenerationen betreffen weltweit etwa 15 Millionen Menschen. Sie sind klinisch und genetisch auffällig heterogen. Bisher wurden 139 verschiedene chromosomale Genorte mit Netzhautdystrophien assoziiert, wovon inzwischen 90 Gene identifiziert werden konnten. Mit Hilfe verschiedener Klonierungsstrategien konnte in der vorgelegten Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der genetischen Ursachen einiger ausgewählter Retinopathien geleistet werden. So konnte durch die Positionsklonierung das Gen, das mit der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis (RS) assoziiert ist, identifiziert werden. Funktionelle Analysen des Genproduktes sowie die Generierung eines Mausmodells der RS geben einen Einblick in die Physiologie der Retina sowie den Pathomechanismus der Erkrankung. Die genomische Organisation des Interphotorezeptor-Matrixproteoglykans-1 (IMPG1) wurde aufgeklärt und die chromosomale Lokalisation auf 6q13-15 bestimmt. Damit kartierte das Gen in eine Region, in die die Genorte für 7 Retinopathien des Menschen kartiert wurden. Durch Kopplungs- und Mutationsanalysen konnten unsere Arbeiten ausschließen, daß IMPG1 mit North Carolina Makuladystrophie (MCDR1) oder der progressiven bifokalen chorioretinalen Atrophie (PBCRA) in Zusammenhang steht. Die Diacylglycerin Kinase-3 (DAGK3) konnte nach der Bestimmung der genomischen Organisation in die Region 3q27-28 kartiert werden. Dieser chromosomale Abschnitt deckt sich mit der chromosomalen Lokalisation der autosomal dominanten Optikusatrophie (OPA1). Auch hier konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen ein Ausschluß des Gens erfolgen. Die X-gebundene juvenile Retinoschisis ist eine häufige Ursache juveniler Makula-degenerationen und betrifft etwa 300.000 junge Männer weltweit. Charakteristische Kennzeichen der Erkrankung sind Aufspaltungen in den inneren Netzhautschichten, die zu zystischen Veränderungen der zentralen Retina führen. Ungefähr 50 % der Patienten entwickeln auch periphere Manifestationen. Durch die Arbeit unserer und anderer Forschergruppen konnte der Krankheitslokus in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert werden. Durch einen Vergleich der genomischen DNA Sequenzen mit öffentlich zugänglichen ESTs (expressed sequence tags) konnte ein retinaspezifisches Transkript identifiziert werden. Es besteht aus 6 Exonen und kodiert für ein putatives 224 Aminosäuren großes Protein, das sekretiert wird und ein hochkonserviertes Discoidindomänen-Motiv enthält. Discoidindomänen sind in Zelladhäsion oder in Zell-Zell Interaktionen involviert. Mutationsanalysen in RS-Patienten bestätigten, daß es sich bei diesem Transkript um RS1, d.h. um das krankheitsassoziierte Gen der X-gebundenen juvenilen Retinoschisis handelte. Das RS1-Protein (Retinoschisin) kommt in homo-oligomeren Komplexen, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, auf der Zelloberfläche der Photorezeptoren und der Bipolaren sowie in den synaptischen Regionen der äußeren (OPL) und innere plexiformen Schicht (IPL) vor. Um die Funktion des normalen Retinoschisins zu untersuchen und um einen Einblick in die RS-Pathogenese zu bekommen, wurde nach der Charakterisierung des orthologen murinen Gens (Rs1h) eine Retinoschisin-defiziente knock-out Maus generiert. Ophthalmologische und histologische Untersuchungen der Rs1h-/Y-Maus zeigen signifikante Parallelen zu dem RS-Erkrankungsbild des Menschen. Damit stellt die Rs1h knock-out Maus ein ideales Tiermodell für die Untersuchung des zugrundeliegenden Krankheitsmechanismusses dar. So konnten wir inzwischen zeigen, daß apoptotische Prozesse zur Degeneration der Photorezeptoren führen. Gegenwärtig werden mit diesem Tiermodell erste gentherapeutische Versuche durchgeführt. Diese Arbeiten sollen Aufschluß darüber geben, ob ein Adeno-assoziierter Virus (AAV)-Transfer des RS1 Gens in die erkrankte Retina ein möglicher Therapieansatz für RS auch beim Menschen sein könnte. N2 - The World Health Organization (WHO) estimates that worldwide approximately 15 million people are affected with hereditary retinal degenerations. Retinal dystrophies are clinically and genetically heterogeneous. To date, 90 retinal disease genes have been identified and of 139 retinal disease genes the chromosomal location is known. In this study, different strategies of disease gene cloning were utilized to elucidate the underlying genetic defects of selected retinopathies. This has led to the identification of the gene associated with X-linked juvenile retinoschisis (RS) by positional cloning. Both, functional analysis of the gene product, named retinoschisin (RS1), and the generation of a mouse model for RS provide novel insight into retinal physiology and the pathomechanism of the disease. The genomic organization of the interphotoreceptor matrix proteoglycan-1 (IMPG1) was established and its chromosomal localization was identified (6q13-15). Seven different human retinal dystrophies have previously been mapped to this region on chromosome 6. A possible genetic association between IMPG1 and two retinal dystrophies, North Carolina macular dystrophy (MCDR1) and progressive bifocal chorioretinal atrophy (PBCRA), was investigated. By means of linkage studies and mutation analysis in affected patients the involvement of IMPG1 in these two different diseases was ruled out. The genomic organization of diacylglycerol kinase-3 (DAGK3) was determined and the gene locus was mapped to chromosome 3q27-28. The autosomal dominant optic atrophy (OPA1) was independently localized to the same chromosomal region. This has prompted us to investigate the role of DAGK3 in OPA1. By mutation analysis such a correlation could be excluded. X-linked juvenile retinoschisis is a common cause of juvenile macular degeneration affecting approximately 300.000 young males worldwide. The disease is characterized by a slitting of the inner retinal layers resulting in cystic degeneration of the central retina. Half of the patients also develop peripheral manifestations. Our laboratory and others localized the RS gene to a 900 kb interval on the short arm of chromosome Xp22.2. Comparison of genomic DNA sequences with publicly available expressed sequence tags (ESTs) have identified a retina-specific transcript. This novel transcript is composed of six exons that encode a 224-amino acid protein including a 23 amino acid signal peptide. Bioinformatical analysis revealed that the putative protein consists almost exclusively of a discoidin domain wich is highly conserved from slime mold to human. Discoidin domains are implicated in cell adhesion or cell-cell interactions. On the basis of mutation analysis in patients affected with RS, we confirmed that the gene indeed is responsible for RS pathology. The RS1 protein is found at the cell surfaces of photoreceptors and bipolar cells and within the synaptic regions of the outer (OPL) and the inner plexiform layers (IPL) most likely as a homo-oligomeric complex. To clarify the function of the normal RS1 and to gain insight into RS pathogenesis a mouse model deficient of the endogenous RS1 protein was generated. For these purposes the genomic organization of the murine orthologous RS1 gene (Rs1h) was identified. Ophthalmologic and histologic analysis of Rs1h-/Y mice revealed significant parallels to the human RS phenotyp. Therefore, the knock-out mouse represents an ideal model to further study the underlying disease mechanism. Recently, we showed that apoptosis is the final pathway of photoreceptor degeneration in Rs1h-/Y mice. Most importantly this mouse model can serve as proof-of-concept for gene therapy. Towards this end we are testing adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer of RS1 into the defect murine retina. This may pave the way for a gene based future intervention in humans affected with this condition. KW - Maus KW - Retinoschisis KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - X-gebundene juvenile Retinoschisis KW - Gendefekt KW - Mausmodell KW - X-linked juvenile retinoschisis KW - gene defect KW - mouse model Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7212 ER - TY - THES A1 - Gogishvili, Tea T1 - Immunotherapy of allergic disorders in a mouse model of allergic airway inflammation T1 - Immuntherapie allergischer Erkrankungen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen N2 - Allergische Erkrankungen sind Störungen, bei denen es zu Immunfehlregulationen kommt und die bei empfänglichen Individuen zur Entstehung von Allergen spezifischen T-Helfer 2 (TH2) Immunantworten führen. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die für Soforttypallergien charakteristischen TH2 Immunantworten sowohl durch natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T Zellen (Treg) als auch durch Antigen induzierte IL-10-secreting CD4+ regulatorische T Zellen kontrolliert werden können. Weiterhin gibt es Hinweise, dass eine erfolgreiche Allergen spezifische Immuntherapie über die Induktion von IL-10 sezernierenden T reg Zellen vermittelt wird. In ersten Teil der Arbeit wird die Effizienz einer Allergen spezifischen Immuntherapie (SIT) in einem Mausmodel für allergische Atemwegsentzündung demonstriert. Als Allergieparameter wurden Allergen spezifisches IgE im Serum, verschiedene TH1 und TH2 Cytokine in der brochoalveolären Lavage Flüssigkeit und nach in vitro Restimulation in Milzzellen untersucht. Weiterhin wurden Histologien von Lungengewebe angefertigt, um das eosinophile Entzündungsinfiltrat und die Asthma typische Becherzellmetaplasie darzustellen. Weiterhin wurden durch FACS Untersuchungen regulatorische T Zellen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass im Mausmodell die intranasale Applikationsform der SIT die allergischen Symptome effizienter bekämpfen konnte, als die beim Menschen etablierte subcutane Applikationsform. Um Mechanismen zu definieren die eine SIT effizienter machen könnten wurde ein IL-4/IL13 Inhibitor (QY) als Adjuvans für die SIT benutzt. Für den Zytokininhibitor konnte gezeigt werden, dass bei einer Applikation während der allergischen Sensibilisierung die Entstehung einer TH2 Immunantwort und die Ausbildung allergischer Symptome verhindert wird. Die Applikation des Inhibitors zusammen mit einer SIT zeigte jedoch keine zusätzlichen signifikanten antiallergischen Effekte im Vergleich zur Durchführung der SIT als Monotherapie. Diese Ergebnisse deuten möglicherweise daraufhin , dass der bekannte Wechsel einer TH2 Immunantwort zu einer TH1 Antwort während der SIT nicht der Schlüsselmechanismus zu einer erfolgreichen Behandlung ist. Insbesondere weil unter der SIT auch in unserem Mausmodell die Induktion von IL-10 sezernierenden CD4+ T regulatorischen Zellen mit der Suppression der allergischen Atemwegsentzüdnung vergesellschaftet waren, so dass möglicherwiese diese Zellen für den Therapieerfolg relevant sind . Um die Rolle regulatorischer T Zellen im Allergiemodell näher zu beleuchten wurde im 2. Teil der Arbeit ein monoklonaler superagonistischer anti-CD28 Antikörper benutzt, von dem bekannt ist dass T regulatorische Zellen in vivo induziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation des Antikörpers während der allergischen Sensibilisierung die Etablierung einer TH2 Immunantwort verstärkte. Im Gegensatz dazu wurden durch die therapeutische Applikation des anti CD28 Antikörpers in einer etablierten Allergie, IL-10 sezernierende CD4+CD25+ T Zellen induziert, welches mit einer Abschwächung der gemessenen Allergieparameter einherging. N2 - Allergic disease are inflammatory disorders in which aberrant immune regulation occurs, and susceptible individuals mount allergen specific T helper 2 (Th2) responses, which drives disease pathology. Recent studies indicate that Th2 responses that are characteristic of allergic manifestations can be regulated by both naturally occurring CD4+CD25+ regulatory (Treg) cells and antigen-driven IL-10-secreting CD4+ regulatory T cells. Evidence is also emerging that successful Allergen specific immunotherapy (SIT) might work through the induction of IL-10-secreting regulatory T cells. In the first part of this work, I demonstrated the efficiency of allergen specific immunotherapy in the mouse model for allergic airway inflammation. Here I could show that intranasal administration of SIT abrogates allergic symptoms more efficiently, than the subcutaneous treatment. Furthermore, an IL-4/IL-13 (QY) inhibitor was used as an adjuvant for SIT, which has been demonstrated to have an anti-allergic potential, when administered prophylactically during allergic sensitization. However, the combination therapy with SIT and the inhibitory molecule QY did not show any significant enhancement in regards to all measured allergic parameters, when compared to monotherapy with SIT. These results provide the evidence, that shift from Th2 to Th1 cytokine profile might not be a key event in successful SIT. Subsequently, the investigation of immune mechanisms under successful SIT demonstrate that the increase of IL-10 secreting CD4+ T regulatory cells is associated with the suppression of airway inflammation in our mouse system, suggesting that these T cell subsets might be involved in the regulatory mechanisms of allergic disorders. In agreement with these findings is the second part of this work, where superagonistic a-CD28 mAb´s were used for the expansion of T regulatory cell subsets in our murine model for allergic airway inflammation. Here I could show, that the application of a-CD28 mAb during allergic sensitization, resulted in the establishment of a Th2 state, rather than a stimulation of a Treg cell population, supporting the Th2 promoting role of a-CD28 mAb together with TCR engagement. However, interesting findings were obtained by application of the superagonistic a-CD28 mAb in the challenge phase in established allergy. Conversely to the previous experiment, therapeutic administration of a-CD28 mAb lead to the generation of IL-10 secreting CD4+CD25+ T cell population in line with the induction of anti-allergic effects. Taking together the results of this study argue for the anti-inflammatory properties of T regulatory cells in allergic disease and highlights importance of these T cell subsets in the suppression of Th2 cell-driven response to allergen. Moreover, these observations suggest that the induction of IL-10 in vivo by T regulatory cells may represent a novel treatment strategy for allergic disorders. KW - Bronchialasthma KW - Allergie KW - Maus KW - Immuntherapie KW - Allergy KW - asthma KW - IL-4/IL-13 inhibitor KW - Mouse model of allergic airway inflammation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19304 ER - TY - THES A1 - Groh, Janos Michael T1 - Pathogenic impact of immune cells in mouse models of neuronal ceroid lipofuscinosis T1 - Pathogener Einfluss von Immunzellen in Mausmodellen der Neuronalen Ceroid Lipofuszinose N2 - The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are fatal neurodegenerative disorders in which the visual system is affected in early stages of disease. A typical accompanying feature is neuroinflammation, the pathogenic impact of which is presently unknown. In this study, the role of inflammatory cells in the pathogenesis was investigated in Palmitoyl-protein thioesterase 1-deficient (Ppt1-/-) and Ceroidlipofuscinosis, neuronal 3-deficient (Cln3-/-) mice, models of the infantile and juvenile forms of NCL, respectively. Focusing predominantly on the visual system, an infiltration of CD8+ cytotoxic Tlymphocytes and an activation of microglia/macrophage-like cells was observed early in disease. To analyze the pathogenic impact of lymphocytes, Ppt1-/- mice were crossbred with mice lacking lymphocytes (Rag1-/-) and axonal transport, perturbation and neuronal survival were scored. Lack of lymphocytes led to a significant amelioration of neuronal disease and reconstitution experiments revealed a crucial role of CD8+ cytotoxic T-lymphocytes. Lack of lymphocytes also caused an improved clinical phenotype and extended longevity. To investigate the impact of microglia/macrophage-like cells, Ppt1-/- and Cln3-/- mice were crossbred with mice lacking sialoadhesin (Sn-/-), a monocyte lineage-restricted cell adhesion molecule important for interactions between macrophage-like cells and lymphocytes. Similar to the lack of lymphocytes, absence of sialoadhesin significantly ameliorated the disease in Ppt1-/- and Cln3-/- mice. Taken together, both T-lymphocytes and microglia/macrophage-like cells were identified as pathogenic mediators in two distinct forms of fatal inherited neurodegenerative storage disorders. These studies expand the concept of secondary inflammation as a common pathomechanistic feature in some neurological diseases and provide novel insights that may be crucial for developing treatment strategies for different forms of NCL. N2 - Die Neuronalen Ceroid Lipofuszinosen (NCL) sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, bei denen das visuelle System frühzeitig im Krankheitsverlauf betroffen ist. Eine typische Begleiterscheinung sind Entzündungsreaktionen, deren pathogenetischer Einfluss bisher ungeklärt ist. In dieser Studie wurde die Rolle von Entzündungszellen bei der Pathogenese in Palmitoyl-protein thioestease 1-defizienten (Ppt1-/-) und Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 3-defizienten (Cln3-/-) Mäusen untersucht, den jeweiligen Modellen der Infantilen und Juvenilen Formen der NCL. Mit besonderem Augenmerk auf das visuelle System wurde früh in der Krankheit ein Aufkommen von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten und eine Aktivierung von Mikroglia/Makrophagen-ähnlichen Zellen beobachtet. Um den pathogenetischen Einfluss der Lymphozyten zu klären, wurden Ppt1-/- Mäuse mit Mäusen verkreuzt, welche keine Lymphozyten besitzen (Rag1-/-). An den generierten Doppelmutanten wurden axonaler Transport, axonale Schädigung und neuronales Überleben bestimmt. Die Abwesenheit von Lymphozyten führte zu einer signifikanten Abmilderung der neuronalen Schädigung und Rekonstitutions-Experimente zeigten, dass CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Die Abwesenheit dieser Lymphozyten führte außerdem zu einem abgemilderten klinischen Phänotyp und einem verlängerten Überleben. Um den Einfluss von Mikroglia/Makrophagen zu untersuchen wurden Ppt1-/- und Cln3-/- Mäuse mit Sialoadhesin-defizienten Mäusen (Sn-/-) verkreuzt. Sn ist ein Monozyten-spezifisches Zelladhäsionsmolekül, das wichtig für Interaktionen zwischen Makrophagen-ähnlichen Zellen und Lymphozyten ist. Ähnlich wie die Abwesenheit von Lymphozyten führte die Abwesenheit von Sialoadhesin zu einer signifikanten Abmilderung der Krankheit in Ppt1-/- und Cln3-/- Mäusen. Zusammengefasst wurden sowohl T-Lymphozyten als auch Mikroglia/Makrophagenähnliche Zellen als pathogenetische Mediatoren in zwei verschiedenen Formen von tödlich verlaufenden erblichen neurodegenerativen Speicherkrankheiten identifiziert. Diese Untersuchungen erweitern das Konzept der sekundären Entzündungsreaktion als verbreitete pathomechanistische Erscheinung in einigen neurologischen Erkrankungen und liefern neue Perspektiven für die Entwicklung von Behandlungsstrategien für verschiedene Formen der NCL. KW - Nervendegeneration KW - Maus KW - Entzündung KW - T-Lymphozyt KW - Neuronale Ceroid Lipofuszinose KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration KW - axonaler Schaden KW - T-Lymphozyten KW - neuronal ceroid lipofuscinosis KW - neuroinflammation KW - neurodegeneration KW - axonal damage KW - T-lymphocytes Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77684 ER - TY - THES A1 - Große-Wilde, Anne T1 - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R) T1 - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R) N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden. N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy. KW - Maus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Rezeptor KW - Apoptose KW - Klonierung KW - 2D-Gel-Analyse KW - konditionale Knockout-Maus KW - TRAIL KW - receptor KW - apoptosis KW - cloning KW - 2D gel analysis KW - conditional knockout mouse Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559 ER - TY - THES A1 - Göb, Eva T1 - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus T1 - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis N2 - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten. N2 - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis. KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Maus KW - Meiose KW - meiosis KW - spermiogenesis KW - nuclear envelope KW - lamina KW - LINC complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839 ER - TY - THES A1 - Hofstetter, Christine T1 - Inhibition of H3K27me-Specific Demethylase Activity During Murine ES cell Differentiation Induces DNA Damage Response T1 - Inhibierung der H3K27me-Spezifischen Demethylase Aktivität in Murin Differenzierenden ES Zellen Induziert die DNA Schadensantwort N2 - Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms. During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation. KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation. In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells. N2 - Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung. Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten. KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert. KW - Embryonale Stammzelle KW - Epigenetic KW - Maus KW - Histone KW - Demethylierung KW - DNS-Schädigung KW - Epigenetik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107023 ER - TY - THES A1 - Kampfinger, Katja T1 - Nachweis einer Mismatch-Reparatur-Defizienz in L5178Y Tk+/--3.7.2C-Mauslymphomzellen T1 - Evidence of a mismatch repair deficiency in L5178Y Tk+/--3.7.2C mouse lymphoma cells N2 - Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann. N2 - The development and approval of pharmaceuticals as well as the evaluation of xenobiotics require several test systems for the detection of genotoxicity. There is a number of established genotoxicity test systems, which are often based on cancer cell lines. In addition to mutations that are essential for genotoxicity testing, cancer cell lines may also carry mutations that might cause reactions not occurring in the primary cells of the organism. Therefore the knowledge of the genetic background of the cell line used is important for the evaluation of test results and the subsequent genotoxicity risk assessment. Among test systems that are based on cancer cells the mouse lymphoma cell line L5178Y adopts a very prominent position due to its worldwide application for genotoxicity testing. The dissertation on hand provides evidence that there are mutations in the L5178Y cell line that are related to the mismatch-repair system (MMR system). MMR participates in safeguarding the genomic integrity. In MMR-proficient cells, DNA defects that arise during replication, homologous recombination or as a result of genotoxic effects are either recognized and repaired or the genetically altered cells are eliminated by induction of apoptosis. MMR-deficient cells, however, survive despite serious DNA defects and accumulate them. The accumulation of DNA damage as result of treatment with alkylating agents had been observed in L5178Y cells while other cell lines had reacted with an induction of apoptosis. The induction of apoptosis after treatment with alkylating agents is described in the literature as a typical behaviour for MMR-deficient cells. From this the hypothesis was established, that L5178Y-cells might exhibit a MMR-deficient phenotype. This MMR-deficient phenotype was proven by selective treatment of L5178Y cells and cells with known MMR status with the alkylating agent MNNG followed by the subsequent comparison of the different reactions. The comparison was carried out by the detection of genotoxic effects using the micronucleus test and the comet assay. On the protein level there was not an indication that the observed MMR-deficiency was related to the the three most important MMR-proteins MSH2, MLH1 and MSH6: All proteins demonstrated expression levels that were comparable to the levels of the MMR-proficient control cells. On the DNA level, however, several mutations were detected by sequence analysis of the coding regions of all genes known to be involved in MMR. The most important among these mutations was an insertion mutation (964(insC)) in pms2, that caused a frameshift after 260 amino acids. By this frameshift, a stop-codon was introduced, leading to an interruption of the sequence after 313 amino acids. While the information of the N-terminal region of pms2 containing the DNA-binding domain as well as the ATPase active sites is still present, the information of the C-terminus is lost. This region is responsible for the dimerisation with the MMR-protein MLH1. Therefore, the MMR-function that is due to this complex, is missing. In conclusion, a MMR-deficiency of L5178Y cells was demonstrated. This MMR-deficiency is explained by an insertion-mutation in pms2 (964(insC)). Consideration of this MMR-deficiency enhances the meaningfulness of the evaluation of test results with L5178Y mouse lymphoma cells in risk assessment. KW - Maus KW - Zelle KW - L5178Y-Zellen KW - MMR-Reparatur KW - pms2 KW - Genotoxizität KW - Alkylantien KW - L5178Y cells KW - mismatch repair KW - pms2 KW - genotoxicity KW - alkylating agent Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26023 ER - TY - THES A1 - Leimeister, Cornelia T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems T1 - Identification and characterization of genes involved in development of the kidney and the urogenital system N2 - Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung. N2 - Studies on kidney development provide insights into general processes of embryogenesis like inductive interactions, mesenchymal condensation, mesenchymal-epithelial interactions, cell fate determination as well as differentiation and thereby into the basis of congenital malformations. Once induced by the ureteric bud, the metanephrogenic mesenchyme gives rise to the functional units of the kidney - the nephrons - and the renal stroma. These morphogenetic processes rely on complex regulatory changes in gene expression, which to date are not understood in detail. The present thesis aimed to identify known and primarily novel genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Gene expression of induced versus uninduced mesenchyme from murine kidney anlagen was compared using ddPCR together with transfilter organ culture. Several candidates were assayed for differential expression by northern blot hybridization and selected for further characterization. As one of the known genes, sFRP2 was verified to be induced within the metanephrogenic mesenchyme. In situ hybridization of whole-mount mouse embryos and paraffin sections revealed specific and dynamic expression patterns for sFRP2 as well as for the related genes sFRP1 and sFRP4 in the developing kidney and other tissues. The detailed sFRP gene expression analysis was performed to guide functional studies for this recently identified novel gene family. Preliminary investigations of the ddPCR products C0-5, J6-3 and M2-4 revealed that they are all derived from novel genes with distinct expression patterns during kidney development. While C0-5 expression dynamically switches from the ureteric bud to the nephron precursors and the collecting system, J6-3 specifies the stromal cell lineage and M2-4 is already detectable in the condensing mesenchyme with subsequent expression in epithelial derivatives. Isolation and analysis of the C0-5 cDNA resulted in the identification of a collagen-like protein in mice and humans that is located upstream of the EWS gene of the human chromosome 22q12. Additionally, a novel gene family related to hairy and the E(spl)-complex genes has been identified. Because of this relationship and a characteristic YRPW tetrapeptide they were designated as Hey genes for "hairy and E(spl) related with YRPW motif". Compared to hairy/E(spl) or the mammalian Hes proteins they show novel features of DNA-binding and protein interaction. Moreover, their expression patterns frequently correlate with those of members of the Delta-Notch signaling pathway suggesting that Hey genes may participate in this pathway in cell fate decisions and boundary formation. Analysis of Dll1 knockout mice partly confirmed this assumption for Hey1 and Hey2 during somitogenesis. This screen has shown that transfilter organ culture in combination with ddPCR is a powerful tool to identify genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Expression and sequence analysis of the novel genes implies a function during development of the kidney and other tissues that can now be studied in further detail. The collection of more than 50 additional candidates for novel genes regulated during nephrogenesis provides a rich resource for future analysis of the networks governing kidney development KW - Niere KW - Entwicklung KW - Molekulargenetik KW - Niere KW - Urogenitalsystem KW - Differential Display PCR KW - Entwicklung KW - In situ Hybridisierung KW - Somitogenese KW - Neurogenese KW - Mesenchym KW - Maus KW - Delta KW - kidney KW - urogenital system KW - differential display PCR KW - development KW - in situ hybridization KW - somitogenesis KW - neurogenesis KW - mesenchyme KW - mouse Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690 ER - TY - THES A1 - Lu, Yunzhi T1 - Kinetics of mouse and human muscle type nicotinic receptor channels T1 - Kinetik muriner und humaner nikotinischer Rezeptorkanäle vom Muskeltyp N2 - Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated. Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits. N2 - Acetylcholin (ACh) vermittelt Erregungsübertragung an neuromuskulären synaptischen Kontakten (neuromuscular junction, NMJ) von Wirbeltieren und vielen anderen Synapsen. Die postsynaptischen ACh-Rezeptoren an der NMJ sind vom nikotinischen Subtyp (nAChRs). Als Teil der am besten erforschten Kanalrezeptoren dienen sie oft als Modelle oder auch Prototypen für Rezeptoren. Trotz einer Fülle an Informationen über nAChRs des Muskeltyps ist bis heute recht wenig über artenspezifischen funktionellen Unterschiede bekannt. Diese Studie befasst sich daher mit der Untersuchung von nAChRs des Muskeltyps in erwachsenen Mäusen und Menschen. Aufzeichnungen mit sogenannten Cell-attached Patches im heterologen Expressionssystem HEK293T-Zellen lieferten Beweise dafür, dass die ACh-Affinität von rekombinanten erwachsenen Maus- und menschlichen nAChRs vom Muskeltyp unterschiedlich sind. Um diesem nachzugehen, habe ich diese Rezeptoren in Outside-out Patches mit Hilfe eines schnellen Piezogetriebenen Applikationssystems verglichen. Dieses System bietet den Vorteil, dass einzelne Membran-Patches mit Rezeptoren unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ausgesetzt werden können. Als Reaktion auf 10 und 30 µM ACh waren die normalisierten Stromamplituden (î) und Stromanstiegszeiten (tr) der menschlichen Rezeptoren signifikant höher als die der Mausrezeptoren. Die Analyse der Dosis-Wirkungskurven von î und tr sowie die Anpassung eines quantitativen zweistufigen kinetischen Modells mit zwei äquivalenten Bindestellen an die Datensätze zeigten eine zweifach höhere Assoziationsrate für ACh bei menschlichen Rezeptoren, verglichen mit der von Mausrezeptoren. Zudem wurden menschliche nAChRs in Outside-Out-Patches schneller als Mausrezeptoren durch Superfusion mit 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) blockiert, was für eine höhere Affinität auch für α-Bgtx spricht. Schließlich wiesen die menschlichen nAChRs in Outside-Out-Patches bei 3 µM ACh eine höhere Affinität als chimäre Rezeptoren aus Maus α- und menschlichen β-, γ- and ε-Untereinheiten auf. Die höhere Affinität der menschlichen Rezeptoren zu ACh und α-Bgtx im Vergleich zu Mausrezeptoren basiert somit zumindest in Teilen auf Sequenzdifferenzen ihrer α-Einheitenen. KW - nicotinic acetylcholine receptor KW - affinity KW - kinetic mechanism KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Muskelzelle KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192688 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER -