TY - THES A1 - Azzami, Klara T1 - Antibakterielle und antivirale Abwehrreaktionen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Antibacterial and antiviral defence reactions in different developmental stages of the honey bee (Apis mellifera) N2 - Das angeborene Immunsystem von Insekten besteht aus einer humoralen Komponente, einer zellulären Komponente und dem Prophenoloxidase-aktivierenden System. Fast alle Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem stammen von Arbeiten mit Modellorganismen wie z.B. Drosophila oder Anopheles gambiae. Wie genau das Immunsystem der Honigbiene (Apis mellifera) funktioniert, ist jedoch noch relativ unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Immunreaktionen aller drei Entwicklungsstadien der Honigbiene nach artifizieller Infektion mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli und Micrococcus flavus) und dem Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) untersucht und verglichen. Eine E. coli-Injektion zeigt bei Larven und adulten Arbeiterinnen nur wenig Auswirkung auf das äußere Erscheinungsbild und die Überlebensrate. In beiden Entwicklungsstadien wird die humorale Immunantwort stark induziert, erkennbar an der Expression der antimikrobiellen Peptide (AMPs) Hymenoptaecin, Defensin1 und Abaecin. Zusätzlich werden allein in Jungbienen nach bakterieller Infektion vier weitere immunspezifische Proteine exprimiert. Unter anderem eine Carboxylesterase (CE1) und das Immune-Responsive Protein 30 (IRp30). Die Expression von CE1 und IRp30 zeigt dabei den gleichen zeitlichen Verlauf wie die der AMPs. In Jungbienen kommt es zudem nach E. coli-Injektion zu einer raschen Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe, was auf eine Aktivierung der zellulären Immunantwort schließen lässt. Ältere Bienen und Winterbienen zeigen eine stärkere Immunkompetenz als Jungbienen. Selbst nicht-infizierte Winterbienen exprimieren geringe Mengen der immunspezifischen Proteine IRp30 und CE1. Die Expression von IRp30 kann dabei durch Verwundung oder Injektion von E. coli noch gesteigert werden. Eine weitere Besonderheit ist die im Vergleich zu Jungbienen raschere Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe bis hin zur vollständigen Eliminierung. Die Reaktion von Puppen auf eine bakterielle Infektion war völlig unerwartet. Nach Injektion von E. coli-Zellen kommt es innerhalb von 24 h p.i. zu einem tödlichen Kollaps, der sich in einer Graufärbung des gesamten Puppenkörpers äußert. Da keine Expression von AMPs nachzuweisen war, wird die humorale Immunantwort offensichtlich nicht induziert. Auch die zelluläre Immunantwort scheint nicht aktiviert zu werden, denn es konnte keine Abnahme an lebenden E. coli-Zellen beobachtet werden. Aufgrund dieser fehlenden Immunreaktionen vermehrt sich E. coli im Hämocoel infizierter Puppen und scheint damit deren Tod herbeizuführen. Nach viraler Infektion wurden in allen drei Entwicklungsstadien der Honigbiene gänzlich andere Reaktionen beobachtet als nach bakterieller Infektion. Bei dem verwendeten Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) handelt es sich um ein Picorna-ähnliches Virus, dessen Vermehrung in der Hämolymphe über die massive Synthese der Capsidproteine verfolgt werden kann. Eine Injektion von sehr wenigen ABPV-Partikeln ins Hämocoel hat dramatische Auswirkungen auf Larven. Nach Virusinjektion kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer raschen Virusvermehrung und schon 24 h p.i. zum Tod, häufig begleitet von einer Schwarzfärbung der gesamten Larve. Kurz vor dem Ableben kommt es neben dem Abbau hochmolekularer Speicherproteine zur Expression zahlreicher Proteine, die u.a. an der Translation oder dem Schutz vor oxidativem Stress beteiligt sind. Auf Jungbienen hat eine ABPV-Infektion keine so dramatischen Auswirkungen wie auf Larven. Sie zeigen lediglich Zeichen von Paralyse, zudem überleben sie länger bei höheren injizierten Partikelzahlen, die Virusvermehrung ist langsamer und es kommt zu keiner starken Veränderung des Hämolymph-Proteinmusters. Es konnte gezeigt werden, dass es in ABPV-infizierten Larven oder adulten Bienen zu keiner erkennbaren Aktivierung des humoralen Immunsystems in Form von exprimierten AMPs kommt. Zudem scheint die humorale Immunantwort auch nicht unterdrückt zu werden, denn nach gleichzeitiger Injektion von E. coli und ABPV kommt es neben der Expression viraler Capsidproteine auch zur Expression von AMPs. Zusätzlich konnte in Jungbienen nach Infektion mit ABPV eine zelluläre Immunantwort in Form von Nodulation ausgeschlossen werden. Ältere Bienen scheinen nicht nur mit bakteriellen Infektionen, sondern auch mit einer ABPV-Infektion besser zurechtzukommen. Bei einer Menge an ABPV-Partikeln, die in Jungbienen spätestens 72 h p.i. zum Tod führt, ist in Winterbienen eine Virusvermehrung erst ab 96 h p.i. erkennbar und diese beeinträchtigt die Überlebensrate kaum. Puppen sind einer Virusinfektion genauso schutzlos ausgeliefert wie einer Bakterieninfektion. Es kommt zwar zu keiner starken Änderung des äußeren Erscheinungsbildes, jedoch bleiben Puppen in ihrer Entwicklung komplett stehen. Das Virus muss sich daher stark vermehren, allerdings nicht überwiegend - wie bei Larven und adulten Bienen - in der Hämolymphe. N2 - The innate immune system of insects comprises of a humoral component, a cellular component and the prophenoloxidase-activating system. Almost all knowledge about the innate immune system derives from model organisms like Drosophila or Anopheles gambiae. The exact mechanisms of the innate immune system of the honey bee (Apis mellifera) have yet to be discovered. This work investigates and compares the immune reactions of all three developmental stages of the honey bee after artificial infection with Gram-negative (Escherichia coli) and the Acute bee paralysis virus (ABPV). After injection of E. coli neither a change in the outer appearance nor a significant reduction of the survival rate of larvae or adult worker bees can be observed. In both developmental stages, a strong induction of the humoral immune response visible by the expression of the antimicrobial peptides (AMPs) hymenoptaecin, defensin1 and abaecin occurs. However, bacterial challenge of young adult worker bees leads to the expression of additional immune-specific proteins: a carboxylesterase (CE1) and the immune-responsive protein (IRp30). The expressions of CE1 and IRp30 show the same time course as the expression of AMPs. Furthermore, after injection of E. coli-cells into the haemocoel of young adult worker bees a fast decrease of living bacteria in the haemolymph could be observed. Older bees show a stronger immune competence in many ways. In winter bees even non-infected individuals express constitutively low amounts of the immune-responsive proteins IRp30 and CE1. The expression of IRp30 can still be enhanced by wounding or injection of E. coli. Moreover, older bees display a drastic reduction of living bacteria in the haemolymph as compared to young adult worker bees resulting in an almost complete elimination. Pupae in contrast react surprisingly different to a bacterial challenge. Injection of living E. coli-cells leads to a deadly collapse within 24 h p.i. accompanied by a colour change of the whole pupal body from white to grey. Since no visible expression of AMPs could be detected, the humoral immune response obviously was not induced. The same appears to be true for the cellular immune response, as no decrease in living E. coli-cells was observed upon infection. Because of this lack of humoral and cellular immune reactions, E. coli can proliferate in the haemocoel of infected pupae and potentially cause their death. All three developmental stages of the honey bee show completely different reactions to a viral infection than to a bacterial challenge. The Acute bee paralysis virus (ABPV) used in this study is a picorna-like virus with a positive, single-stranded RNA-genome and a non-enveloped protein capsid. Its proliferation in the haemocoel can be monitored by a massive synthesis of capsid proteins in the haemolymph. In contrast to a bacterial challenge, injection of only a few ABPV-particles into the haemocoel has tremendous effects on larvae. Injection of viral particles leads to a strong viral multiplication within hours and to death 24 h p.i. often accompanied by a colour change of the whole larva from pale-white to black. In addition to a visible degradation of high-molecular storage proteins shortly before the larvae die, the expression of proteins involved in translation or protection against oxidative stress can be observed. Young adult worker bees do not show such a tremendous reaction as larvae to a viral infection. They just display signs of paralysis. In contrast to larvae, young adult worker bees show better survival rates for higher numbers of injected virus-particles, the viral multiplication proceeds slower and there is no strong visible change of the haemolymph protein pattern. It could be demonstrated that no expression of AMPs and therefore no detectable activation of the humoral immune system by the virus occurs. But the humoral immune reponse also does not seem to be suppressed, since a simultaneous injection of E. coli and ABPV leads to the expression of viral capsid proteins in concert with the expression of AMPs. Additionally, nodulation, a prominent cellular immune response of young adult worker bees to bacterial infection, is likewise not initiated by ABPV-infection. Older bees apparently are not only capable of better fighting a bacterial infection, but also in surviving an ABPV-infection. Injection of an amount of viral particles leading to death of young adult worker bees within 72 h p.i., only leads to just detectable amounts of virus in winter bees 96 h p.i.. At the same time, the survival rate is not more impaired than after E. coli-injection. Pupae are as susceptible to a viral infection as to bacterial challenge. Although there is no strong visible change in the outer appearance, the pupaes’ development ceases within 3 d p.i.. This is possibly due to a strong multiplication of the virus, but obviously not mainly in the haemolymph, as it can be observed in larvae and adult bees as well. KW - Biene KW - Akute Paralyse KW - Immunsystem KW - Akutes Bienen Paralyse Virus KW - angeborenes Immunsystem KW - honey bee KW - Acute bee paralysis virus KW - innate immune system Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66452 ER - TY - THES A1 - Schmull, Sebastian T1 - Charakterisierung der pathogenetisch-relevanten Rolle von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom T1 - Characterisation of the pathogenetic-relevant role of SF1 in adrenocortical carcinoma N2 - Tumore der Nebennieren stellen häufige Tumore dar, welche bei mindestens 3 % der Population über 50-Jähriger vorkommen. Im Gegensatz dazu ist das Nebennierenrindenkarzinom mit einer Inzidenz von 1-2 Einwohner pro Million ein sehr seltener Tumor. Da seine Prognose allerdings ungünstig, und diese maßgeblich davon abhängt wie fortgeschritten der Tumor bei Diagnosestellung ist, ist es wichtig, dass die richtige Diagnose frühzeitig gestellt wird. Bis heute ist kein zuverlässiger immunhistochemischer Nebennierenrindenkarzinom-spezifischer Marker etabliert um das Nebennierenrindenkarzinom von anderen retroperitonealen Tumoren zu differenzieren. Sasano et al. schlug bereits 1995 erstmalig den Transkriptionsfaktor Steroidogenic Factor 1 (SF1) als Marker zur Differenzierung von Nebennierenrinden- und Nicht-Nebennierenrindentumoren vor. Allerdings wurde die diagnostische Wertigkeit bisher nur in sehr kleinen Fallserien mit insgesamt nur 17 Nebennierenrindenkarzinomen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die SF1 Protein-Expression bei 163 Nebennierenrindenkarzinomen, 52 Nebennierenrinden-Adenomen, 12 normalen steroidogenen Geweben (6 Nebennieren und 6 Ovare), sowie 73 Nicht-Steroidtumoren immunhistochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, das SF1 bei 158 von 161 evaluierbaren Nebennierenrindenkarzinomen und bei allen Proben von normalen und gutartigen Geweben (n=64) nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war keine der 73 Nicht-Steroidgeweben SF1 positiv, so dass die diagnostische Genauigkeit extrem gut ist (Sensitivität: 98.6 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value jeweils 100 % und 97.3 %). In einem zweiten Schritt wurde untersucht ob die Protein-Expression von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom auch prognostische Bedeutung hat. Hierbei zeigte sich, dass Patienten mit Tumoren mit starker SF1 Färbung (30 %) ein deutlich schlechteres tumorstadium-adjustiertes Rezidiffreies- und Gesamt-Überleben haben als Patienten mit geringer SF1 Expression (hazard ratio: 2.45). Zusätzlich zu den immunhistochemischen Untersuchungen wurden FISH Analysen durchgeführt. Hierbei zeigte sich allerdings keine signifikante Korrelation zwischen SF1 Gendosis und der SF1 Protein-Expression, so dass zu vermuten ist, dass SF1 maßgeblich auf Transkriptions- und Translationsebene reguliert wird. In einem Versuch diese Frage zu beantworten wurden zwei mutmaßliche SF1 Interaktionspartner, FATE1 und DAX1, genauer immunhistochemisch untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass FATE1 bei 62 von 141 evaluierbaren Nebenierenrindenkarzinomen und 12 von 62 normalen und gutartigen Geweben nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu waren alle 9 Nicht-Steroidgewebe FATE1 negativ. Dies zeigt, das FATE1 nicht zur Diagnostik nutzbar ist (Sensitivität: 61 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value 100 % bzw. 14 %). Die DAX1 Analyse zeigte, dass alle 20 normalen und gutartigen Gewebe eine positive DAX1 Färbereaktion zeigten. Von 126 Nebennierenrindenkarzinomen waren 71 DAX1 positiv. Von den 8 untersuchten Nicht-Steroidgeweben waren 6 DAX1 positiv. Diese Ergebnisse belegen, dass auch DAX1 keine diagnostische Genauigkeit besitzt (Sensitivität: 56 %, Spezifität: 25 %, positive und negative predictive value 92 % bzw. 4 %). Die Untersuchung der prognostischen Fähigkeiten von FATE1 und DAX1 zeigte, dass Patienten mit Tumoren mit starker FATE1 Färbung (39 %) ein schlechteres tumorstadium-adjustiertes Gesamt- aber nicht Rezidiffreies-Überleben haben als Patienten mit niedriger FATE1 Protein-Expression (hazard ratio: 2.01). Weiterhin wurde deutlich, dass DAX1 keine deutlichen prognostischen Fähigkeiten besitzt. Zusammenfassend läßt sich aus der vorliegenden Arbeit folgern, das SF1 aktuell der beste diagnostische Marker zur Diagnose von Tumoren der Nebennierenrinde ist und damit Eingang in die histopathologische Routine-Diagnostik von Nebennierentumoren finden wird. Zusätzlich ist die SF1 Expression ein sehr guter prognostischer Marker beim Nebennierenrindenkarzinom, wobei sich die prognostische Aussage durch zusätzliche Färbung von FATE1 und DAX1 nur unwesentlich verbessern läßt. N2 - Adrenal tumors are common tumors which are present in at least 3 % in the human population over their 5th decade. However, adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare malignancy which shows an approximate anual incidence of 1-2 per million. Prognosis of ACC is generally poor and depends strongly on the tumor stage. Thus, early and correct diagnosis is important. Until now, no reliable immunohistochemical ACC-specific marker has been established for its differentiation from other retroperitoneal tumors. Already in 1995, Sasano et al. suggested the transcription factor Steroidogenic Factor 1 (SF1) as useful marker for differentiation of adrenocortical and non-adrenocortical tumors. Up to now, SF1's value as diagnostic marker for ACC was investigated only in small series of in a total of 17 samples. In our work, SF1 expression was investigated by immunohistochemistry in 163 ACC, 52 adrenocortical adenomas, 12 normal steroidogenic tissues (6 adrenal glands and 6 ovaries), as well as 73 non-steroidogenic tumors. SF1 protein expression was shown in 158 of a total of 161 evaluable ACC, as well as all normal and benign steroidogenic tissues. In contrast, no SF1 protein was detectable in the non-steroidogenic tumors. Thus, SF1 protein expression is a highly specific diagnostic tool (sensitivity: 98.6 %, specificity: 100 %, positive and negative predictive value: 100 % and 97.3 %, respectively). In a second step, SF1 protein expression was investigated as a prognostic tool in ACC. As shown by us, ACCs presenting strong SF1 immunoreactivity (30 %) showed a strong correlation with overall and recurrence-free patients survival than ACCs presenting low SF1 protein expression (hazard ratio: 2.45). Moreover, FISH analyses were performed which revealed no significant correlation of SF1 gene dosis and SF1 protein expression, suggesting a regulatory mechanism at transcriptional and translational level. To investigate the hypothesis, we investigated two putative interaction partners of SF1, namely FATE1 and DAX1 protein, by immunohistochemistry. FATE1 protein was expressed in 62 of a total of 141 evaluable ACC as well as 12 of a total of 62 normal and benign steroidogenic tissues. In contrast, all non-steroidogenic tissues were FATE1 negative (n=9). Thus, FATE1 is no valuable diagnostic tool (sensitivity: 61 %, specificity: 100 %, positive and negative predictive value: 100 % and 14 %, respectively). DAX1 immunohistochemistry showed that all normal and benign steroidogenic tissues (n=20) were DAX1 positive as well as 71 of a total of 126 ACC samples. Furthermore, 6 out of a total of 8 non-steroidogenic tissues stained DAX1 positive, showing that DAX1 protein is no diagnostic tool (sensitivity: 50 %, specificity: 25 %, positive and negative predictive value: 92 % and 4 %, respectively). Investigation of the prognostic value of FATE1 and DAX1 revealed that patients with tumors characterized by strong FATE1 immunoreactivity (39 %) had a worse outcome in overall but not recurrence-free survival than patients showing low FATE1 expression (hazard ratio: 2.01). DAX1 protein expression has no prognostic value in ACC. In summary, we showed that SF1 is currently the best available diagnostic marker for differentiation of adrenocortical tumors from other retroperitoneal tumors, and that it will be suitable for histopathological diagnostic routine. Furthermore, SF1 expression is a well-suited prognostical tool in adrenocortical carcinoma which is only marginally enhanced by subsequent staining of FATE1 and DAX1 protein. KW - Nebennierenrindenkrebs KW - Biomarker KW - Ereignisdatenanalyse KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - Immuncytochemie KW - Adrenocortical carcinoma KW - Biomarker KW - Survival analysis KW - Fluorescence in situ hybridization KW - Immunohistochemistry Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66398 ER - TY - THES A1 - Saumweber, Timo T1 - Mechanism of Learning and Plasticity in Larval Drosophila T1 - Lern- und Plastizitätsmechanismen in Drosophila Larven N2 - According to a changing environment it is crucial for animals to make experience and learn about it. Sensing, integrating and learning to associate different kinds of modalities enables animals to expect future events and to adjust behavior in the way, expected as the most profitable. Complex processes as memory formation and storage make it necessary to investigate learning and memory on different levels. In this context Drosophila melanogaster represents a powerful model organism. As the adult brain of the fly is still quite complex, I chose the third instar larva as model - the more simple the system, the easier to isolate single, fundamental principles of learning. In this thesis I addressed several kinds of questions on different mechanism of olfactory associative and synaptic plasiticity in Drosophila larvae. I focused on short-term memory throughout my thesis. First, investigating larval learning on behavioral level, I developed a one-odor paradigm for olfactory associative conditioning. This enables to estimate the learnability of single odors, reduces the complexity of the task and simplify analyses of "learning mutants". It further allows to balance learnability of odors for generalization-type experiments to describe the olfactory "coding space". Furthermore I could show that innate attractiveness and learnability can be dissociated and found finally that paired presentation of a given odor with reward increase performance, whereas unpaired presentations of these two stimuli decrease performance, indicating that larva are able to learn about the presence as well as about the absence of a reward. Second, on behavioral level, together with Thomas Niewalda and colleagues we focussed on salt processing in the context of choice, feeding and learning. Salt is required in several physiological processes, but can neither be synthesized nor stored. Various salt concentrations shift the valence from attraction to repulsion in reflexive behaviour. Interestingly, the reinforcing effect of salt in learning is shifted by more than one order of magnitude toward higher concentrations. Thus, the input pathways for gustatory behavior appear to be more sensitive than the ones supporting gustatory reinforcement, which is may be due to the dissociation of the reflexive and the reinforcing signalling pathways of salt. Third, in cooperation with Michael Schleyer we performed a series of behavioral gustatory, olfactory preference tests and larval learning experiments. Based on the available neuroanatomical and behavioral data we propose a model regarding chemosensory processing, odor-tastant memory trace formation and the 'decision' like process. It incorporates putative sites of interaction between olfactory and gustatory pathways during the establishment as well as behavioral expression of odor-tastant memory. We claim that innate olfactory behavior is responsive in nature and suggest that associative conditioned behavior is not a simple substitution like process, but driven more likely by the expectation of its outcome. Fourth, together with Birgit Michels and colleagues we investigated the cellular site and molecular mode of Synapsin, an evolutionarily conserved, presynaptic vesicular phosphoprotein and its action in larval learning. We confirmed a previously described learning impairment upon loss of Synapsin. We localized this Synapsin dependent memory trace in the mushroom bodies, a third-order "cortical" brain region, and could further show on molecular level, that Synapsin is as a downstream element of the AC-cAMP-PKA signalling cascade. This study provides a comprehensive chain of explanation from the molecular level to an associative behavioral change. Fifth, in the main part of my thesis I focused on molecular level on another synaptic protein, the Synapse associated protein of 47kDa (Sap47) and its role in larval behavior. As a member of a phylogenetically conserved gene family of hitherto unknown function. It is localized throughout the whole neuropil of larval brains and associated with presynaptic vesicles. Upon loss of Sap47 larvae exhibit normal sensory detection of the to-be-associated stimuli as well as normal motor performance and basic synaptic transmission. Interestingly, short-term plasticity is distorted and odorant–tastant associative learning ability is reduced. This defect in associative function could be rescued by restoring Sap47 expression. Therefore, this report is the first to suggest a function for Sap47 and specifically argues that Sap47 is required for synaptic as well as for behavioral plasticity in Drosophila larva. This prompts the question whether its homologs are required for synaptic and behavioral plasticity also in other species. Further in the last part of my thesis I contributed to the study of Ayse Yarali. Her central topic was the role of the White protein in punishment and relief learning in adult flies. Whereas stimuli that precede shock during training are subsequently avoided as predictors for punishment, stimuli that follow shock during training are later on approached, as they predict relief. Concerning the loss of White we report that pain-relief learning as well as punishment learning is changed. My contribution was a comparison between wild type and the white1118 mutant larvae in odor-reward learning. It turned out that a loss of White has no effect on larval odorant-tastant learning. This study, regarding painrelief learning provides the very first hints concerning the genetic determinants of this form of learning. N2 - In einer belebten, sich stetig wandelnden Umwelt ist es essenziell für Lebewesen, Informationen wahrzunehmen und Erfahrungen zu sammeln, um ihr Verhalten entsprechend zu modifizieren. Verschiedene Arten von Reizen werden wahrgenommen, integriert und gespeichert. Dies ermöglicht Tieren künftige Ereignisse vorherzusehen und ihr Verhalten entsprechend ihren Erwartungen anzupassen. Die Komplexität von Lernprozessen und Gedächtnisspeicherung macht es notwendig, diese Prozesse auf unterschiedlichen Ebenen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang hat sich Drosophila melanogaster als besonders geeigneter Modellorganismus herauskristallisiert. Trotz einer relativ geringen neuronalen Komplexität im Vergleich zu höheren Organismen, zeigt sie ein reichhaltiges Verhaltensrepertoire. Dennoch ist das Gehirn von adulten Furchtfliegen ein hoch komplexes System. Je einfacher ein System ist, umso vielversprechender ist es scheinbar, einzelne fundamentale Aspekte dieses Systems zu isolieren und zu untersuchen. In meiner Arbeit nutzte ich daher als Modelorganismus das dritte Larvenstadium der Fliege und untersuchte auf verschiedenen Ebenen unterschiedliche Mechanismen olfaktorischer, assoziativer und synaptischer Plastizität. Dabei fokussierte ich mich stets auf Kurzzeitgedächtnis. Zunächst untersuchte ich assoziatives Lernen auf Verhaltensebene. Hierfür entwickelte ich ein Ein-Duft-Lernparadigma für olfaktorische klassische Konditionierung von Drosophila Larven. Dies ermöglicht, die Lernbarkeit von einzelnen Düften zu untersuchen, reduziert die Komplexität der Aufgabenstellung für die Larven und vereinfacht die Analyse von Lernmutanten. Weiterhin erlaubt es die Lernbarkeit von Düften für Generalisierungs-experimente zu balancieren, um zu beschreiben, wie Duftidentitäten im Nervensystem kodiert werden. Ich konnte zeigen, dass die Lernbarkeit von Düften nicht unmittelbar mit der naiven Duftpräferenz korreliert. Ferner konnte in dieser Studie nachgewiesen werden, dass durch gepaarte Präsentation von Duft und Zuckerbelohnung die Präferenz im Bezug auf diesen Duft zunimmt, wohingegen ungepaarte Präsentation dieser beiden Reize zu einer Abnahme der Duftpräferenz führt. Dies weist darauf hin, dass es Larven auch möglich ist etwas über die Abwesenheit der Belohnung zu lernen. In einer zweiten Studie befasste ich mich, in Zusammenarbeit mit Thomas Niewalda, mit der Verarbeitung von Salz im Bezug auf das Wahl-, Fress- und Lernverhalten von Drosophila Larven. Salze spielen in mehreren physiologischen Prozessen eine bedeutende Rolle, können von Larven aber weder synthetisiert noch gespeichert werden. Unterschiedliche Salzkonzentrationen haben unterschiedliche Auswirkungen auf das Larvenverhalten. Während niedrige Konzentrationen von Larven bevorzugt werden, werden hohe Salzkonzentrationen vermieden. Lernexperimente zeigten, dass Salz ebenfalls dosisabhängig als positiver oder negativer Verstärker wirkt. Interessanterweise zeigt sich im Vergleich zum Wahl- und Fressverhalten, dass der Punkt, an dem Salz von einem appetitiven zu einem aversiven Stimulus wird, um mehr als eine Größenordnung in Richtung höherer Konzentrationen verschoben ist. Die Sensitivität der gustatorischen Transduktion ist somit höher als die Transduktion des Verstärkersignals. Möglicherweise liegt dies an der Dissoziation dieser beiden Transduktionswege. In der dritten Studie dieser Arbeit wurden, in Kooperation mit Michael Schleyer, eine Vielzahl an olfaktorischen und gustatorischen Präferenztests, sowie eine Reihe an Lernexperimenten durchgeführt. Basierend auf bekannten Neuroanatomiestudien und unseren Verhaltensdaten, propagieren wir ein Model für Duft- und Geschmacksprozessierung, die Etablierung von Gedächtnisspuren, sowie Entscheidungsprozessen. Sowohl mögliche Interaktionen zwischen olfaktorischen und gustatorischen Transduktionswegen, sowie der Abruf von Gedächtnisinhalten werden berücksichtigt. Wir schlagen vor, dass naives olfaktorisches Verhalten natürlicherweise reflexiv ist. Assoziativ konditioniertes Verhalten kann allerdings nicht als reiner Substitutionsprozess betrachtet werden, sondern wird besser interpretiert im Hinblick auf die Erwartung, die er auslöst, woraufhin ein bestimmtes Verhaltensprogramm gestartet wird. In Zusammenarbeit mit Birgit Michels untersuchte ich auf zellulärer Ebene die molekulare Funktion von Synapsin im assoziativen Lernen von Drosophila Larven. Synapsin gehört zu den hochkonservierten, präsynaptischen, vesikulären Phosphoproteinen. Wir konnten einen früher bereits beschriebenen Lernphänotyp von Synapsin Mutanten Larven bestätigen. Die Synapsin abhängige Gedächtnisspur konnten wir auf wenige Zellen im Pilzkörper, einer dem olfaktorischen Cortex der Vertebraten homologen Struktur, lokalisieren. Auf molekularer Ebene wurde nachgewiesen, dass Synapsin ein Zielprotein in der bekannten AC-cAMP-PKA Lernkaskade ist. Diese Studie zeigt einen Zusammenhang zwischen molekularen Mechanismen assoziativer Plastizität und einer daraus resultierenden Verhaltensänderung der Tiere. In meinem Hauptprojekt befasste ich mich auf molekularer Ebene mit einem weiteren synaptischen Protein, dem Synapsen assoziierten Protein von 47kDa (Sap47) und seiner Rolle im Verhalten von Drosophila Larven. Sap47 wird in allen neuropilen Bereichen expremiert und ist mit synaptischen Vesikeln assoziiert. Das Fehlen von Sap47 beeinflusst weder die Detektion der zu assoziierenden Reize, noch das Kriechverhalten der Larven. Auch die synaptische Übertragung, ausgelöst durch einzelne Stimulationen an der neuromuskulären Synapse, ist nicht beeinträchtigt. Interessanterweise führt das Fehlen von Sap47 sowohl zu veränderter Kurzzeit-Plastizität an dieser Synapse, sowie zu einer Einschränkung in der Bildung von Duft-Zucker-Gedächtnis. Diese Studie liefert einen ersten Hinweis auf eine Funktion von Sap47 in synaptischer und assoziativer Plastizität. Es stellt sich die Frage, ob auch in anderen Organismen die zu Drosophila Sap47-homologen Proteine notwendig für synaptische und Lernplastizität sind. Im letzten Teil meiner Dissertation war ich an einem Projekt von Ayse Yarali beteiligt. Die zentrale Fragestellung in dieser Studie war, ob eine Mutation im white Gen Bestrafungs- und/ oder Erleichterungslernen beeinflusst. Wird ein neutraler Reiz während einer Trainingsphase mit einem Elektroschock bestraft, wird dieser später konsequent vermieden, da er einen Elektroschock vorhersagt (Bestrafungslernen). Eine Umkehrung der Reihenfolge der Stimulipräsentation, sodass dem Schock stets ein neutraler Stimulus folgt, führt später, in der Testphase, zu einer positiven Reaktion auf diesen naiv neutralen Reiz (Erleichterungslernen). Ein Verlust des White Proteins in white1118 Mutanten verändert beide Arten von Gedächtnissen in adulten Fliegen. Meine Beteiligung an dieser Arbeit war ein Vergleich zwischen wildtypischen Larven und white1118 mutanten Larven in Duft-Zucker Assoziationsexperimenten. Es zeigte sich, dass der Verlust dieses Proteins auf larvale Duft-Zucker Konditionierung keinen Einfluss hat. Im Larvenlernen kann somit das Verhalten von transgenen Tieren, die zumeist eine Mutation im white Gen als Markergen tragen, interpretiert werden, ohne die Funktion des white Gens berücksichtigen zu müssen. Im Bezug auf Erleichterungslernen liefert diese Arbeit einen ersten Hinweis auf eine genetische Komponente, der entscheidend für diese Art des assoziativen Lernens ist. KW - Taufliege KW - Larve KW - Verhalten KW - Lernen KW - Geruchswahrnehmung KW - Drosophila Larve KW - Olfaktion KW - Attraktion KW - Drosophila Larva KW - Behavior KW - Learning KW - Olfaction KW - Attraction Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66354 ER - TY - THES A1 - Pahl, Mario T1 - Honeybee Cognition: Aspects of Learning, Memory and Navigation in a Social Insect T1 - Kognition bei Honigbienen: Aspekte zu Lernverhalten, Gedächtnis und Navigation bei einem sozialen Insekt N2 - Honeybees (Apis mellifera) forage on a great variety of plant species, navigate over large distances to crucial resources, and return to communicate the locations of food sources and potential new nest sites to nest mates using a symbolic dance language. In order to achieve this, honeybees have evolved a rich repertoire of adaptive behaviours, some of which were earlier believed to be restricted to vertebrates. In this thesis, I explore the mechanisms involved in honeybee learning, memory, numerical competence and navigation. The findings acquired in this thesis show that honeybees are not the simple reflex automats they were once believed to be. The level of sophistication I found in the bees’ memory, their learning ability, their time sense, their numerical competence and their navigational abilities are surprisingly similar to the results obtained in comparable experiments with vertebrates. Thus, we should reconsider the notion that a bigger brain automatically indicates higher intelligence. N2 - Honigbienen (Apis mellifera) furagieren an vielen verschiedenen Pflanzenarten, und navigieren über große Distanzen zu wichtigen Ressourcen. Die räumliche Lage von Futterquellen und potentiellen neuen Nistplätzen teilen sie ihren Nestgenossinnen mithilfe einer symbolischen Tanzsprache mit. Um all dies leisten zu können, haben sie ein reiches Repertoire von adaptiven Verhaltensweisen evolviert. Mehr und mehr Verhaltensweisen, die man nur bei Vertebraten vermutet hätte, werden auch bei der Honigbiene entdeckt. In meiner Dissertation habe ich einige der Mechanismen erforscht, die beim Lernverhalten, der Gedächtnisbildung, der numerischen Kompetenz und der Navigation eine wichtige Rolle spielen. Die Ergebnisse, die in meiner Dissertation erzielt wurden, zeigen dass Honigbienen keineswegs die einfachen, reflexgesteuerten Organismen sind, als die sie lange Zeit angesehen wurden. Die Komplexität die ich im Gedächtnis, der Lernfähigkeit, dem Zeitsinn, der numerischen Kompetenz und der Navigationsfähigkeit der Bienen gefunden habe, ist erstaunlich ähnlich zu den Ergebnissen, die in vergleichbaren Experimenten mit Vertebraten erzielt wurden. Deshalb sollten wir die allgemeine Annahme, dass ein größeres Gehirn automatisch höhere Intelligenz bedeutet, überdenken. KW - Biene KW - Visuelles Gedächtnis KW - Räumliches Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Navigation KW - Zählen KW - Kognitives Lernen KW - Kognition KW - Honigbiene KW - Gedächtnis KW - Zählen KW - Honeybee KW - Memory KW - Counting KW - Subitizing KW - Cognition Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66165 ER - TY - THES A1 - Heddergott, Niko T1 - Zellbiologische Aspekte der Motilität von Trypanosoma brucei unter Berücksichtigung der Interaktion mit der Mikroumwelt T1 - Cell biological aspects of motility of Trypanosoma brucei in consideration of the interaction with the microenvironment N2 - Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden. N2 - Trypanosomes are protozoa causing fatal diseases in livestock and man. The cells show vivid motility, driven by a single flagellum that runs along the cell body, attached to the cell surface. Even in cell culture, trypanosomes never stop moving and ablation of functional components of the flagellum is lethal for bloodstream-forms. Motility has been shown to be essential for cell division, organelle positioning and infectivity. This renders trypanosomes valuable model organisms for studying motility. But, surprisingly little is known about motility in trypanosomes, as well as in protozoa, in general. Recently, motility of trypanosomes therefore has gotten into the spotlight of interest which brought some new insights, but many essential points are still a matter of debate, for example how the flagellar beat is regulated or how it is propagated along the cell body. In this work, the effects of the micro-environment of blood-stream form trypanosomes on motility were investigated. In their natural habitat, trypanosomes find themselves in a crowded environment. This is not only the case in the blood circulatory system, but also in extra-tissue space. The high concentration of cells and extra-cellular networks might be regarded as a kind of obstacle to cellular motion. This work shows that the mode of motility of bloodstream form trypanosomes instead is adapted to the viscosity of blood. Also a mechanistic model is presented which elucidates how this adaptation works. This also explains why most trypanosomes are tumbling in low-viscous cell culture medium, lacking other cellular components. Addition of Methylcellulose at a concentration of about 0.5% (w/v) was found to be a potent substitute for blood, providing optimal conditions for trypanosome motility. Also different types of obstacles like beads and molecular networks, as well as arranged pillar microstructures were used as a tool to mimic interaction with a solid matrix. In presence of these, the swimming speed as well as the percentage of persistent swimming cells was increased. Cells inhabiting an open-ranged environment (like Euglena or Chlamydomonas) are efficiently propelled by a planar flagellar wave. Trypanosomes in contrast, had to evolutionary adapt to a crowded environment, which would infer with any extensive planar wave. The three-dimensional flagellar beat of the attached flagellum allows trypanosomes to harness any rigid matrix for effective propulsion, in all directions equally. Trypanosomes achieve this by a rotational counter-clockwise motion of their whole cell body. Another environmental aspect for trypanosome motility that had not been studied before is the influence of hydrodynamic flow, which trypanosomes are subjected to, when swimming in the blood circulatory system. For studying this, in this work, the motilty of trypanosomes was analyzed in microfluidic devices. To extend our understanding of trypanosomal motility from 2D, like in standard microscopy based live-cell imaging analysis, to 3D, a imaging technique known as holography was used, in addition. Microfluidics as well as Holography both are emerging, high-potential techniques in biology, which had not been used for the motility analysis of trypanosomes before and establishing this therefore only got possible due to interdisciplinary collaborations. In addition, a custom fully automated, software-controlled, fluorescence microscopic system was developed in this work, which is able to track and follow single cells for motility analysis in real-time without the need for user input. The motion of the flagellar beat and the cell itself was investigated at high spatio-temporal resolution using highspeed fluorescence microscopy. KW - Trypanosoma brucei KW - Motilität KW - Blutviskosität KW - Hochgeschwindigkeitsmikroskopie KW - Mikrofluidik KW - Mikroumwelt KW - Mikrostrukturen KW - Trypanosomen KW - Blut KW - Trypanosoma KW - motility KW - blood KW - microfluidics KW - microenvironment Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56791 ER - TY - THES A1 - El Hajj, Nady T1 - Epimutations in Germ-Cell and Embryo Development: Possible Consequences for Assisted Reproduction T1 - Epimutationen in der Keimzell- und Embryonalentwicklung : Mögliche Konsequenzen für die assistierte Reproduktion N2 - Assisted reproductive technologies (ART) emerged in the late 1970’s as a therapy for human infertility. Up till now more than 3 million babies have been conceived through ART, demonstrating the safety and efficiency of the technique. Published reports showed an increase in the rate of imprinting disorders (Beckwith Wiedemann Syndrome, Angelman Syndrome, etc.) in babies born after ART. What are the effects imposed through ART and should researchers reassess its safety and implications on the future offspring? Throughout this thesis, I analyzed the methylation patterns of germ cells and embryos to determine whether in vitro maturation and in vitro fertilization have a negative impact on the epigenetic patterns. Furthermore, DNA methylation was compared between sperm of infertile and presumably fertile controls in order to understand whether epigenetic disturbances lead to infertility at the first place. The occurrence of methylation aberrations in germ cells of infertile patients could be transmitted to new-borns and then cause epigenetic disorders. In order to elucidate the imprinting status within single cells, I developed a new technique based on limiting dilution where bisulfite treated DNA is distributed across several wells before amplification. This allowed methylation measurement at the single allele level as well parent of origin detection. In a total of 141 sperm samples from couples undergoing in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) including 106 with male factor or combined infertility and 28 with female infertility, I detected a significant correlation between lower quality of semen parameters (sperm count, percentage of abnormal sperm, and percentage of motile sperm) and the rate of imprinting errors. ALU repeats displayed a higher methylation in sperm DNA of patients leading to a pregnancy and live birth, compared to patients in which pregnancy was not achieved or a spontaneous abortion occurred. A discriminant analysis based on ALU methylation allowed correct classification of >70% of cases. Preliminary data from illumina methylation arrays where more than 27,000 CpGs were analyzed determined that only a single CpG site from the open reading frame C14orf93 was significantly different between the infertile and presumably fertile control group. However, further improvements on data normalization might permit detection of other differentially methylated regions. Comparison of embryos after natural conception, in vitro fertilized embryos from superovulated oocytes, and embryos achieved through fertilization of in vitro cultured oocytes revealed no dramatic effect on the imprinting patterns of Igf2r, H19, and Snrpn. Oocyte cryotop vitrification did not result in a dramatic increase of imprinting mutations in oocytes even though the rate of sporadic methylation errors in single Snrpn CpGs were higher within the in-vitrified group. Collectively, the results I will present within this thesis suggest an increase in the rate of imprinting errors within the germ cells of infertile patients, in addition to a decrease in genome wide methylation of ALU repetitive elements. I did not observe a detrimental effect on the methylation patterns of oocytes and the resulting embryos using in vitro maturation of oocytes and/or standard IVF with in vivo grown superovulated oocytes. N2 - Assistierte Reproduktionstechniken (ART) wurden in den späten 1970er Jahren als Therapie für unfruchtbare Paare mit Kinderwunsch etabliert. Bis zum heutigen Tage wurden dank ART weltweit mehr als 3 Millionen Kinder geboren, ein eindrucksvoller Beweis für die Sicherheit und Effizienz dieser Methode. Dennoch zeigen veröffentlichte Studien einen Anstieg in der Rate von Imprinting-Erkrankungen (Beckwith Wiedemann-Syndrom, Angelman-Syndrom, etc.) bei Kindern, die nach assistierter Reproduktion geboren wurden. Es stellt sich die Frage, welche Effekte durch ART ausgelöst werden können und ob eine neue Einschätzung dieser Methode bezüglich ihrer gesundheitlichen Implikationen für künftige Generationen notwendig ist. In dieser Arbeit habe ich mögliche negative Effekte von in vitro-Maturation und -Fertili-sierung auf Methylierungsmuster humaner und muriner Keimzellen, sowie Maus-Embryonen untersucht. Aberrante DNA-Methylierungsmuster in Keimzellen von infertilen Patienten könnten auf die Neugeborenen übertragen werden und epigenetische Erkrankungen zur Folge haben. Ob epigenetische Störungen im Zusammenhang mit Infertilität stehen, wurde außerdem durch den Vergleich der DNA-Methylierung von Spermien infertiler und fertiler Männer untersucht. Um den Imprintigstatus auf Einzelzellebene zu bestimmen, habe ich basierend auf „Limiting Dilution“ eine neue Methode entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Bisulfit-behandelte DNA vor der PCR-Amplifikation in mehrere Reaktionsgefässe verdünnt. Dies erlaubt die Methylierungsanalyse einzelner Allele und die Detektion elternspezifischer Methylierungsmuster. Mit insgesamt 141 Sperma-Proben von Paaren, die sich einer in vitro- Fertilisierung (IVF) oder einer Intrazytoplasmischen Spermieninjektion (ICSI) unterzogen hatten, davon 28 mit weiblicher und 106 mit männlicher oder kombinierter Unfruchtbarkeit, konnte ich einen positiven Zusammenhang zwischen der Rate an Imprinting-Fehlern und geringer Sperma-Qualität (gemessen an Standardparametern) ableiten. ALU-Sequenzen zeigten in Spermien-DNA von Patienten mit erfolgreicher Schwangerschaft und Geburt eine höhere Methylierung als von Patienten mit fehlgeschlagener Schwangerschaft oder Spontanabort. Eine auf der ALU-Methylierung basierende Diskriminanzanalyse konnte mehr als 70% aller Fälle korrekt klassifizieren. Vorläufige Daten aus Experimenten mit Illumina Methylierungs-Arrays mit einer Auflösung von mehr als 27.000 CpG-Positionen identifizierten einen signifikanten Gruppenunterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe für eine CpG-Position innerhalb des offenen Leserahmens C14orf93. Verbesserungen der Datenauswertung (Normalisierung, Testung etc.) sollten die Entdeckung weiterer differenziell methylierter Regionen erlauben. Der Vergleich von Mausembryos aus natürlicher Konzeption, aus in vitro kultivierten und fertilisierten Oozyten und aus in vitro Fertilisation nach Superovulation zeigte keine dramatischen Effekte auf die Imprinting-Muster der geprägten Gene Igf2r, H19 und Snrpn. Das gilt auch für Cryo-Top vitrifizierte Oozyten, wenn auch die Rate sporadischer Methylierungsfehler einzelner CpG-Positionen in Snrpn etwas höher war als in den Kontrollgruppen. Zusammengenommen lassen die in dieser Arbeit präsentieren Resultate auf eine Zunahme an Imprinting-Fehlern und eine genomweite Abnahme der Methylierung repetitiver ALU-Sequenzen in den Keimzellen infertiler Patienten schließen. KW - Reproduktionsmedizin KW - Epigenotypus KW - Mutation KW - assistierte Reproduktion KW - Keimzell- und Embryonalentwicklung KW - Epimutation KW - Epigenetics KW - Asisted Reproduction KW - Imprinting Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65995 ER - TY - THES A1 - Heisig, Julia T1 - Identifizierung neuer Zielgene der Hey bHLH Transkriptionsfaktoren T1 - Identification of novel target genes of Hey bHLH transcription factors N2 - Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen. N2 - During embryonic development, the Notch signaling pathway plays a central role in cell fate specification, proliferation and communication between neighboring cells. Hey basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors are targets of the Notch signaling pathway and show crucial functions in cardiovascular development. Hey2 knock out (KO) mice and Hey1/HeyL double knock out mice (DKO) exhibit incomplete formation of the septum and valves in heart development and defects in the differentiation of blood vessels. The aim of this study was to find new target genes of the Hey proteins to further clarify their function during organ development and to get more insight into the phenotypes of the Hey KO mice. Towards this goal, a combination of microarray analysis and chromatin immunoprecipitation (ChIP) was chosen to get an overview of genes directly regulated by Hey proteins in a cell culture model of HEK293 cells overexpressing doxycycline-inducible Flag-tagged Hey1 or Hey2. Microarray analysis revealed approximately 100 target genes that were downregulated up to 5-fold by both Hey1 and Hey2. Interestingly, 15 genes were upregulated more than 2-fold by Hey2. ChIP with αFlag antibody confirmed direct interaction of Hey1 and Hey2 with the proximal promotor regions of 4 downregulated target genes (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Overexpression of mutant Hey1 proteins with deletion of the DNA-binding basic domain or single amino acid exchanges in the basic domain (3 arginine to lysine), failed to downregulate Hey1 target genes. Additionally, ChIP assay demonstrated that the binding of the Hey mutants to the promotor regions of HEY1, BMP2, KLF10 or FOXC1 is abolished, suggesting an essential role for the basic domain in DNA binding and function of the Hey proteins. We then utilized ChIP-PET in conjunction with highthroughput sequencing to perform a genome-wide screen for Hey1 and Hey2 binding sites in HEK293 cells. 1453 and 4288 target genes were identified for Hey1 and Hey2, respectively, of which 1147 genes were targets of both Hey1 and Hey2. Although the binding sites were located upstream and downstream of coding sequences, or even in exons and introns, 55 % and 49 % of all binding sites for Hey1 and Hey2, respectively, were located in proximal promoter regions between -0.5 kb and the first exon. An in silico binding motif analysis suggests a repetitive GC-rich sequence for Hey binding which is probably located in CpG islands, indicating a direct regulation of the transcriptional machinery by the Hey proteins. A comparison of the target genes from microarray analysis and ChIP-PET sequencing data demonstrates a large number of downregulated genes with binding sites that are directly bound by the Hey proteins. While 60 % of Hey2 downregulated genes contain binding sites, only 20 % of upregulated genes have binding sites for Hey2, invoking a repressor function for Hey proteins. To investigate, whether the Hey proteins regulate different target genes in a cell type specific manner, embryonic stem cells (ES cells) were generated which also overexpress doxycycline-inducible Hey1 or Hey2. These ES cells could be differentiated efficiently into cardiomyocytes and thus could also be used for gene expression analysis after induction of Hey overexpression. Microarray analysis of ES cells and cardiomyocytes resulted in more up- than downregulated genes in comparison to HEK293 cells. The overlap of common regulated genes in HEK293, ES cells and cardiomyocytes was very low. Only two Hey2 target genes were regulated more than 2-fold in both HEK293 and ES cells (Hes1, Zic2). This disparity indicates a narrow cell-type specific gene regulation by Hey proteins. Gene ontology analysis of all target genes demonstrated interactions of Hey proteins with different signaling pathways (e.g. TGFβ, Id or Wnt signaling), which are all indispensable for early developmental processes. These results show that Hey proteins influence and modulate gene expression levels in different signaling pathways in a cell-type specific manner. These data provide new possibilities for future research efforts to elucidate the role of Hey proteins in early organ development. KW - Gen notch KW - Transkriptionsfaktor KW - Embryonalentwicklung KW - Kardiovaskuläres System KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatinimmunpräzipitation KW - Microarray KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatin Immunoprecipitation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65053 ER - TY - THES A1 - Schneider, Matthias T1 - Characterisation of Metalloprotease-mediated EGFR Signal Transactivation after GPCR Stimulation T1 - Charakterisierung der EGFR Signaltransaktivierung nach GPCR Stimulation N2 - In the context of metalloprotease-mediated transactivation of the epidermal growth factor receptor, different monoclonal antibodies against ADAM17 / TACE were characterized for their ability to block the sheddase. Activity of some of them was observed at doses between 2µg/mL and 10µg/mL. Kinetic analyses showed their activity starting at around 30 minutes. In cellular assays performed with the antibodies, especially upon treatment of cells with sphingosine-1-phosphate a reduction in proliferation was observed with some candidates. Moreover this study provides potential new roles for ß-Arrestins. Their involvement in the triple membrane-passing signal pathway of EGFR transactivation was shown. Furthermore, in overexpressing cellular model systems, an interaction between ADAM17 and ß-Arrestin1 could be observed. Detailed analysis discovered that phosphorylation of ß-Arrestin1 is crucial for this interaction. Additionally, the novel mechanism of UV-induced EGFR transactivation was extended to squamous cell carcinoma. The mechanism happens in a dose dependent manner and requires a metalloprotease to shed the proligand Amphiregulin. The involvement of both ADAM9 and ADAM17, being the metalloproteases responsible for this cleavage, was shown for SCC9 cells. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen ADAM17 / TACE im Kontext der Metalloprotease-vermittelten Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Proteaseaktivität zu unterdrücken. Einige von Ihnen zeigten inhibitorische Aktivität bei Konzentrationen zwischen 2µg/ml und 10µg/ml. Die Untersuchung der Zeitabhängigkeit ihrer Wirkungsweise ergab eine Aktivität ab 30 Minuten Vorinkubation. In zellulären Versuchen konnte eine Verminderung der Proliferation besonders nach Stimulation mit Sphingosin-1-Phosphat gezeigt werden. Darüber hinaus konnten möglich neue Funktionen von ß-Arrestinen gezeigt werden. Eine Beteiligung am „triple membrane-passing“ Signalwegs der Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors wurde dargestellt. Zudem wurde eine Interaktion von ß-Arrestin1 und ADAM17 in überexprimierenden Zellsystemen gezeigt. Detaillierte Analysen belegten, dass die Phosphorylierung von ß-Arrestin1 eine notwendige Voraussetzung dafür ist. Weiterhin wurde der neue Mechanismus der UV-vermittelten Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktors auf Plattenephithelkarzinom-Zellen ausgeweitet. Er findet in einer dosisabhängigen Form statt und bedarf einer Metalloprotease zum Aktivieren des Liganden Amphiregulin. Sowohl ADAM9 als auch ADAM17 wurden als die verantwortlichen Metalloproteasen in den untersuchten SCC9 Zellen ermittelt. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Metalloprotease KW - Krebs KW - EGF Rezeptor KW - Transaktivierung KW - GPCR KW - UV KW - EGFR Transactivation KW - Metalloprotease KW - GPCR KW - Cancer KW - UV Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65105 ER - TY - THES A1 - Wang, Huiqiang T1 - Enhanced Replication of Vaccinia Virus GLV-1h68 in Cancer Stem-like Cells of Human Breast Cancer Cell Preparations T1 - Verbesserte Replikation desVerbesserte Replikation des Vaccinia Virus GLV-1h68 in Präparation von Tumorstammzell-ähnlichen Zellen N2 - There is more and more evidence for the cancer stem cell hypothesis which believes that cancers are driven by a cellular subcomponent that has stem cell properties which is self-renewal, tumorigenicity and multilineage differentiation capacity. Cancer stem cells have been connected to the initiation of tumors and are even found to be responsible for relapses after apparently curative therapies have been undertaken. This hypothesis changes our conceptual approach of oncogenesis and shall have implications in breast cancer prevention, detection and treatment, especially in metastatic breast cancer for which no curative treatment exists. Given the specific stem cell features, novel therapeutic pathways can be targeted. Since the value of vaccinia virus as a vaccination virus against smallpox was discovered by E. Jenner at 18th century, it plays an important role in human medicine and molecular biology. After smallpox was successfully eradicated, vaccinia virus is mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The outstanding capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes which encode therapeutic or diagnostic proteins to be expressed when a tumor is infected. The emphasis in this study was the establishment of methods for the enrichment of human breast cancer stem-like cells from cancer cell lines and characterization of those cancer stem-like cells in vitro and in vivo. Furthermore, by using the Genelux Corporation vaccinia virus strain GLV-1h68, the isolated cancer stem-like cells can be targeted not only in vitro but also in vivo more efficiently. Side-population (SP) cells within cancers and cell lines are rare cell populations known to be enriched cancer stem-like cells. In this study, we used Hoechst 33342 staining and flow cytometry to identify SP cells from the human breast cancer cell lines MCF-7 and GI-101A as models for cancer stem-like cells. Considering the cytotoxicity of Hoechst dye and the restriction of instrument, we did not carry out further studies by this method. Utilizing in vitro and in vivo experimental systems, we showed that human breast cancer cell line GI-101A with aldehyde dehydrogenase activity (ALDH) have stemlike properties. Higher ALDH activity identifies the tumorigenic cell fraction which is capable of self-renewal and of generating tumors that could recapitulate the heterogeneity of the parental tumor. Furthermore, the cells with higher ALDH activity display significant resistance to chemotherapy and ionizing radiation, which proves their stem-like properties again. The cells which have higher ALDH activity also are more invasive compared to cells which have lower ALDH activity, which connects the cancer stem-like cells with cancer metastases. By analyzing the popular human breast cancer stem cells surface markers CD44, CD49f and CD24, it was discovered that the cells with higher ALDH activity have stronger CD44 and CD49f expression than in those cells with lower ALDH activity, which further confirms their stem-like properties. Finally, the cells with higher ALDH activity and lower ALDH activity were infected in vitro and used in virotherapy in a mouse xenograft model was performed. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 can replicate in cells with higher ALDH activity more efficiently than cells with lower ALDH activity. GLV-1h68 also can selectively target and eradicate the xenograft tumors which were derived from cells with higher ALDH activity. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key developmental program that is often activated during cancer invasion and metastases. EMT was induced in immortalized human mammary epithelial cells (HMLEs) and in GI-101A cells, which results in the acquisition of mesenchymal traits and in the expression of stem cell markers. Furthermore, the EMT-induced GI-101A cells showed resistance to chemotherapy and invasion capacity. CD44+/CD24- cells were enriched during the EMT induction. Following flow cytometry sorting by using CD44, CD24 and ESA surface marker, the sorted cells were tested in a mouse model regarding tumorigenicity. Unexpectedly, we found that CD44+/CD24+/ESA+ cells could initiate tumors more efficiently rather than CD44+/CD24-/ESA+ and other fractions in EMTinduced GI-101A cells. We also infected the CD44+/CD24+/ESA+ and CD44+/CD24- /ESA+ cells in vitro and performed virotherapy in a mouse xenograft model. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 is able to replicate in CD44+/CD24+/ESA+ cells more efficiently than in CD44+/CD24-/ESA+ cells. GLV-1h68 was also capable to selectively target and eradicate the xenograft tumors which derived from CD44+/CD24+/ESA+ cells. Moreover, CD44- cells have much lower tumorigenicity in the mouse model and CD44- cells derived-tumors are not responsive to vaccinia virotherapy. In summary, we have successfully established an in vitro and in vivo system for the identification, characterization and isolation of cancer stem-like cells from the human breast cancer cell line GI-101A by using the ALDEFLUOR assay. The vaccinia virus GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the higher ALDH activity cells and tumors derived from those cells. Although contrary to the current assumption, CD44+/CD24+/ESA+ cells in the EMT-induced GI-101A cell line showed stem-like properties and GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the CD44+/CD24+/ESA+ cells and tumors which derived from those cells. Finally, improved understanding of cancer stem cells may have tremendous relevance for how cancer should be treated. It is menacing that cancer stem cells are resistant to almost all anti-tumor approaches which have already been established for the treatment of metastatic diseases such as ionizing radiation, hormonal therapy, chemotherapy, and small molecular inhibitors. Therefore, it is promising that our results suggest that these cancer stem cells may be susceptible to treatment with oncolytic vaccinia virus. N2 - Immer mehr experimentelle Hinweise stützen die Krebsstammzell-Hypothese, wonach Krebs durch eine zelluläre Teilkomponente angetrieben wird, die Stammzell- Eigenschaften hat, das heißt die Fähigkeit sich selbst zu erneuern, Tumorigenität und die Fähigkeit sich in verschiedene Richtungen zu differenzieren. Krebsstammzellen wurden mit der Enstehung von Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht, und werden sogar für Rückfälle verantwortlich gemacht, nachdem scheinbar erfogreiche Behandlungen durchgeführt wurden. Diese Hypothese verändert unser Verständnis der Onkogenese und wird Auswirkungen auf die Brustkrebs-Prävention, -Erkennung und -Behandlung haben, vor allem in metastasierendem Brustkrebs, für den es keine kurative Behandlung gibt. Angesichts der besonderen Merkmale von Stammzellen können neue therapeutische Wege angestrebt werden. Seit sein Nutzen als Impfvirus gegen die Pocken von E. Jenner im 18. Jahrhundert entdeckt wurde, spielt das Vaccinia-Virus in der Humanmedizin und Molekularbiologie eine wichtige Rolle. Nachdem die Pocken erfolgreich ausgerottet wurden, wird das Vaccinia-Virus hauptsächlich als viraler Vektor in der Molekularbiologie und in zunehmendem Maße in der Krebstherapie verwendet. Die außerordentliche Fähigkeit, Krebszellen gezielt zu zerstören, macht es zu einem perfekten Wirkstoff für die onkolytische Virotherapie. Des Weiteren kann das Virus durch das Inserieren von Genen modifiziert werden, die für therapeutische oder diagnostische Proteine kodieren und im infizierten Tumor exprimiert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung von Methoden für die Anreicherung menschlicher Stammzell-ähnlicher Brustkrebszellen von Krebszelllinien und die Charakterisierung dieser Krebsstammzell-ähnlichen Zellen in vitro und in vivo. Darüber hinaus können mit Hilfe des Vaccinia-Virus-Stammes GLV- 1h68 von Genelux Corporation die isolierten Krebsstammzell-ähnlichen Zellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo effizienter eliminiert werden. Side-Population- (SP-) Zellen in Krebserkrankungen und Zelllinien sind seltene Zellpopulationen die dafür bekannt sind, reich an Krebsstammzell-ähnlichen Zellen zu sein. In dieser Studie verwendeten wir eine Hoechst 33342-Färbung und Durchflusszytometrie, um SP-Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie MCF- 7 zu identifizieren, als Modell für Krebsstammzell-ähnliche Zellen. In Anbetracht der Zytotoxizität des Hoechst-Farbstoffes und der Beschränkung des Instruments, wurde diese Methode nicht weiter verfolgt. Mit Hilfe von Experimenten in vitro und in vivo wurde gezeigt, dass die menschliche Brustkrebs-Zelllinie GI-101A mit Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität (ALDH) Stammzell-ähnliche Eigenschaften hat. Höhere ALDH-Aktivität identifiziert die tumorigene Zellfraktion, die zur Selbsterneuerung und zur Erzeugung von Tumoren fähig ist, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors deutlich macht. Darüber hinaus weisen Zellen mit hoher ALDH-Aktivität eine beachtliche Fähigkeit zur Resistenz gegen Chemotherapie und ionisierende Strahlung auf, was wiederum ihre Stammzell-ähnlichen Eigenschaften beweist. Ferner sind Zellen mit hoher ALDHAktivität im Vergleich zu Zellen mit niedriger ALDH-Aktivität stärker invasiv, was die Krebsstammzell-ähnlichen Zellen mit Krebsmetastasierung in Verbindung bringt. Bei der Analyse der gängigen Oberflächenmarker CD44, CD24 und CD49f in menschlichen Brustkrebs-Stammzellen beobachteten wir, dass Zellen mit hoher ALDH-Aktivität CD44 und CD49f stärker exprimieren als Zellen mit niedriger ALDHAktivität, was wiederum deren Stammzell-ähnliche Eigenschaften aufzeigt. Schließlich wurden die Zellen mit hoher und niedriger ALDH-Aktivität in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in Zellen mit höherer ALDH-Aktivität effizienter replizieren kann als in Zellen mit niedrigerer ALDH-Aktivität. GLV-1h68 kann auch selektiv Xenograft-Tumore finden und zerstören, welche von Zellen mit hoher ALDHAktivität abstammten. Der epithelial-mesenchymale Übergang (EMT) ist ein essentieller Entwicklungs- Schritt, der häufig während der Invasion und Metastasierung in Krebserkrankungen aktiviert wird. Wir induzierten EMT in immortalisierten humanen Brust-Epithelzellen (HMLEs) und GI-101A-Zellen, was im Erwerb von mesenchymalen Eigenschaften und der Expression von Stammzell-Markern resultiert. Außerdem zeigten die EMTinduzierten GI-101A-Zellen Chemoresistenz und Fähigkeit zur Invasion. CD44+CD24--Zellen waren während der EMT-Induktion angereichert. Es wurden durchflusszytometrische Sortierung mit Hilfe von CD44-, CD24- und ESAOberflächenmarkern durchgeführt, und die sortierten Zellen wurden danach auf Tumorigenität in einem Mausmodell getestet. Unerwarteterweise fanden wir, dass CD44+CD24-ESA+-Zellen effizienter Tumore initiieren konnten als CD44+CD24- ESA+-Zellen und andere Fraktionen in EMT-induzierten GI-101A-Zellen. Wir haben auch die infizierten CD44+CD24+ESA+- und CD44+CD24-ESA+-Zellen in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in CD44+CD24+ESA+-Zellen effizienter replizieren kann als CD44+CD24-ESA+-Zellen. GLV-1h68 konnte selektiv Xenograft- Tumore finden und eliminieren, die von CD44+CD24+ESA+-Zellen abstammten. Darüber hinaus haben CD44--Zellen eine sehr niedrige Tumorigenität im Mausmodell und Tumore, die von CD44--Zellen abstammen, sprechen nicht auf Vaccinia-Virotherapie an. Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein System zur Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Krebsstammzell-ähnlichen Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie GI-101A in vitro und in vivo mit Hilfe des ALDEFLUOR-Assays etabliert. Das Vaccinia-Virus GLV-1h68 konnte zielgenau Zellen mit erhöhter ALDH-Aktivität oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Obwohl, im Gegensatz zur gängigen Annahme, CD44+CD24+ESA+-Zellen in der EMT-induzierten GI-101A-Zelllinie Stammzell-ähnliche Eigenschaften zeigten, konnte GLV-1h68 zielgenau CD44+CD24+ESA+-Zellen oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Schließlich kann ein verbessertes Verständnis der Krebsstammzellen eine enorme Bedeutung dafür haben, wie Krebs behandelt werden sollte. Es ist verhängnisvoll, dass Krebsstammzellen gegen fast alle Anti-Tumor-Ansätze, die bereits für die Behandlung von Metastasen etabliert wurden, resistent sind, wie ionisierende Strahlung, Hormontherapie, Chemotherapie und kleine molekulare Inhibitoren. Gerade deshalb ist es vielversprechend, dass unsere Ergebnisse darauf hin deuten, dass diese Krebsstammzellen auf Behandlung mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus ansprechen. KW - Vaccinia Virus KW - Brustkrebs KW - Stammzelle KW - cancer stem cells KW - vaccinia virus KW - human breast cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64750 ER - TY - THES A1 - Weiß, Sabine T1 - Function of the Spir actin nucleators in intracellular vesicle transport processes T1 - Funktion der Spir Aktin Nukleatoren in intrazellulären Vesikeltransportprozessen N2 - Spir proteins are the founding members of the novel class of WH2-actin nucleators. A C-terminal modified FYVE zinc finger motif is necessary to target Spir proteins towards intracellular membranes. The function and regulation of the Spir actin organizers at vesicular membranes is almost unknown. Live cell imaging analyses performed in this study show that Spir-2 is localized at tubular vesicles. Cytoplasmic Spir-2-associated vesicles branch and form protrusions, which can make contacts to the microtubule network, where the Spir-2 vesicles stretch and slide along the microtubule filaments. The analysis of living HeLa cells expressing eGFP-tagged Spir-2, Spir-2-ΔKIND and Spir-2-ΔKW (lacking the 4 WH2 domains and the KIND domain) showed Spir-2-associated tubular structures which differ in their length and motility. Throughout the course of that study it could be shown that the tail domain of the actin motor protein myosin Vb, as a force-generating molecule, is colocalizing and co-immunoprecipitating with Spir-2-ΔKW. By using the tail domain of myosin Vb as a dominant negative mutant for myosin Vb-dependent vesicle transport processes it could be shown that Spir-2-ΔKW/MyoVb-cc-tail- associated vesicles exhibit an increased elongation. Moreover, using the microtubule depolymerizing drug nocodazole it could be shown that the elongation and the motility of Spir-2-ΔKW-associated vesicles depends on an intact microtubule cytoskeleton. Motility and morphological dynamics of Spir-2-associated vesicles is therefore dependent on actin, actin motorproteins and microtubule filaments. These results propose a model in which myosin/F-actin forces mediate vesicle branching, allowing the vesicles to move to and in between the microtubule filaments and thereby providing a new degree of freedom in vesicular motility. To determine the exact subcellular localization of Spir-2, colocalization studies were performed. It could be shown that Spir-2 shows a partial colocalization to Rab11a-positive compartments. Furthermore, Spir-2 exhibits an almost identical localization to Arf1 and the Arf1 small G protein but not Rab11a could be immunoprecipitated with Spir-2-ΔKW. This suggests, that Arf1 recruits Spir-2 to Arf1/Rab11a-positive membranes. Another important function of the Spir-2 C-terminus is the membrane targeting by the FYVE domain. By performing a protein-lipid overlay assay, it has been shown that purified GST- and 6xHis-tagged Spir-2-ΔKW bind phosphatidic acid suggesting a mechanism in which Spir-2 is recruited to phosphatidic acid-enriched membranes. To further elucidate the mechanism in which Spir-2 membrane-targeting could be regulated, interaction studies of C-terminal parts of Spir-2 revealed that the Spir-2 proteins interact directly. N2 - Spir Proteine sind die ersten beschriebenen Mitglieder der neuen Klasse der WH2-Aktin Nukleatoren. Ein C-terminaler modifizierter FYVE Zinkfinger ist notwendig um Spir Proteine an intrazelluläre Membranen zu bringen. Die Funktion und die Regulation dieser Aktin Nukleatoren an vesikulären Membranen ist bis jetzt noch nahezu unbekannt. In dieser Studie durchgeführte “Live-cell-Imaging” Experimente zeigten, dass Spir-2 an tubulären Vesikeln lokalisiert ist. Zytoplasmatische Spir-2-assoziierte Vesikel formen Ausläufer, die Kontakte zum Mikrotubuli Netzwerk bilden. Spir-2 Vesikel haben die Fähigkeit sich entlang des Mikrotubuli Zytoskeletts auszudehnen und daran entlang zu gleiten. Die Analyse von lebenden HeLa Zellen, welche eGFP-Spir-2, eGFP-Spir-2-ΔKIND und eGFP-Spir-2-ΔKW (Deletion der 4 WH2 Domänen sowie der KIND Domäne) Fusionsproteine exprimieren, zeigen Spir-2-assoziierte tubuläre Vesikel, die sich in Länge und Beweglichkeit unterscheiden. Während dieser Studie konnte außerdem gezeigt werden, dass die “tail” Domäne des Aktinmotors myosin Vb mit Spir-2-ΔKW kolokalisiert und koimmunopräzipitiert. Die Verwendung der “tail” Domäne als dominant negative Mutante für myosin Vb-abhängigen Vesikeltransport zeigte, dass Spir-2-ΔKW/MyoVb-cc-tail-assoziierte Vesikel eine stark erhöhte Elongation aufweisen. Desweiteren konnte duch die Verwendung von Nocodazol, welches spezifisch Mikrotubulifilamente depolymerisiert, gezeigt werden, dass die Elongation und die Motilität der Spir-2-ΔKW-assoziierten Vesikel von einem intakten Mikrotubuli Zytoskelett abhängig ist. Motilität und morphologische Dynamik der Spir-2-ΔKW-assoziierten Vesikel ist daher abhängig von Aktinfilamenten, Aktin Motorproteinen und Mikrotubulifilamenten. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich ein Modell erstellen, in welchem eine Myosin/F-actin induzierte Bewegung eine Verzweigung der Vesikel bewirkt. Dadurch ist eine Bewegung der Vesikel zu Mikrotubulifilamenten aber auch zwischen verschiedenen Mikrotubulifilamenten möglich, welches einen ganz neuen Freiheitsgrad in der vesikulären Bewegung eröffnet. Um die genaue zelluläre Lokalisation von Spir-2 zu analysieren wurden Kolokalisationsstudien durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Spir-2 eine partielle Kolokalisation mit Rab11a-positiven Kompartimenten zeigt. Außerdem weist Spir-2 eine nahezu identische Lokalisation zu Arf1 auf. Arf1, aber nicht Rab11a, konnte mit Spir-2-ΔKW koimmunpräzipitiert werden. Arf1 könnte daher für die Rekrutierung von Spir-2 an Arf1/Rab11a-positive Membranen ausschlaggebend sein. Eine weitere wichtige Funktion des Spir-2 C-Terminus ist die Membranlokalisation, welche durch die FYVE Domäne vermittelt wird. Mittels Protein-Lipid Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass aufgereinigte GST- bzw. 6xHis-Spir-2-ΔKW-Fusionsproteine an Phosphatidylsäure binden. Dies deutet darauf hin, dass Spir-2 spezifisch zu Phosphatidylsäure-positiven Membranen rekrutiert wird. Um die weitere Regulation der Spir-2 Membranlokalisation aufzuklären, wurden Protein-Protein-Interaktionsstudien durchgeführt, welche eine direkte Interaktion von Spir-2 Proteinen anhand ihrer C-Termini ergaben. KW - Aktin KW - Vesikeltransport KW - Intrazellulärer Transport KW - Actin KW - vesicle transport Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64589 ER - TY - THES A1 - Hauber, Melanie Erika T1 - Description and Improvement of the 'Whedo'-Aquaculture-System in Malanville (North of Benin) T1 - Beschreibung und Entwicklung des \'Whedo\'-Aquakultur-Systems in Malanville (Nord Benin) N2 - This work delves into the recently developed ‘Whedo’-aquaculture-system in the rural community of Malanville (North Benin)and aims on providing a closer insight on this – for the area--recent system including the ecological but also the sociological and economical aspects in order to develop this extensive traditional fishery to a more productive semi-intensive aquaculture system. With the retreat of the flood ‘Whedos’ usually become infested with numerous hydato-and tenagophytes, while the presence and density of the free-floating macrophytes were positively related to the nutrient content of the ‘Whedo’. Extensive plant infestation also affects water quality through the decomposition of organic material and its accumulation in thick mud layers on the pond bottom as well as through the nocturnal oxygen consumption. Unfavourable water quality, especially low dissolved oxygen as well as high conductivity and nitrite levels, was identified to be the main factor determining which fish species were able to survive the harsh conditions prevailing in the ‘Whedos’ during the dry season. With the deteriorating water quality with advancing dry season, fish diversity decreased significantly leaving only species that are highly adapted to such unfavourable conditions. The most abundant species were Clarias gariepinus, Heterotis niloticus, Oreochromis niloticus L., Hemichromis c.f. letourneauxi, Polypterus senegalus and Epiplatys spilargyreius. Besides, the investigations also concentrated on the fish diversity of the rivers Niger and Sota with the results that for three species distribution gaps could be closed and for further three species their already known distribution could be expanded. But otherwise it could also be detected that some economically important species that were abundant in the past. In regard to the ‘Whedo’-management, the investigations showed that the owners lack most of the knowledge on appropriate management strategies, e.g. the feeding and stocking regime. The exploitation period depends on the extent of the previous annual flood and the location of the ‘Whedo’ within the floodplain, but the main season is from February to April. The biomass harvested on a hectare basis separated for each of the ‘Whedos’ averaged 17 tons/ha in 2008 and 8.6 tons/ha in 2009. However, 72 percent of the total biomass of Clarias only had an average weight of 40 grams. Therefore, two separated feeding trials were conducted and in total 6 supplementary feeds were tested on Clarias gariepinus. Groundnut cake, fish trash, rice bran, blood meal and azolla meal were used in different combination and rations to formulate the experimental diets. Diet containing 19 percent blood meal resulted in the best economical benefits showing that the use of high quality feed ingredients such as groundnut cake is not recommendable because local fish prices are too low to compensate the additional feeding costs. Instead of high quality feed farmers should focus on ingredients that are free of charge and easy to process. The supplementation based on 19 percent blood meal resulted in the doubling of the net profit compared to the income based on feeding only rice bran, thus provided higher additional income, enhancing the livelihood of the fish farmers. Concluding, the ‘Whedo’-aquaculture system is still in its infancy but nevertheless is an attractive system for the rural population because of existing knowledge of post-flood wetland fisheries as well as the low investment needed for its installation. Additionally, the local fish supply will increase and hence not only contribute to a better provision of protein-rich food and reduced pressure on the wild fish stocks but might also prevent fish prices to increase in a way that the poor won’t be able anymore to afford their most important source of animal protein. But fish farmers need more knowledge on appropriate management strategies and thus should be provided with technical support to guarantee a successful development and not to discourage the owners as a consequence of avoidable failures. Furthermore, the use of supplementary feed offers a cheap and effective means to increase the biomass production and thus enhance the extensive fishery to a semi-intensive aquaculture system. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem unlängst entwickeltem ‚Whedo’-System im ländlichen Bezirk Malanville (Nordbenin)und wurde darauf ausgerichtet, nähere Erkenntnisse über die Bewirtschaftungsweise der ‚Whedos’ und deren jüngsten Entwicklungen in diesem Gebiet zu erlangen. Ein Einblick in die ökologischen, aber auch soziologischen and ökonomischen Aspekte ist die Grundlage für die Fortentwicklung dieser extensiven traditionellen Fischerei in eine ertragsreichere semi-intensive Fischzucht. Im Rahmen dieser Recherche wurden die Eigenschaften der ‚Whedos’ im Bezug auf die Art und Dauer der Überschwemmung untersucht. Mit dem Rückgang der Flut werden die Fischlöcher gewöhnlich von zahlreichen Hydato- und Tenagophyten überwuchert, wobei der Grad des Schwimmpflanzenbewuchses positiv mit dem Nährstoffgehalt des Wassers korrelierte. Die meisten Fischlöcher zeigten eine, mit fortschreitender Regenzeit abnehmende Wasserqualität. Schlechte Wasserqualität, vor allem geringe Sauerstoffkonzentrationen und hohe Salz- und Nitritgehalte, wurde als der bestimmende Faktor für das Vorkommen der Fischarten in den ‚Whedos’ während der Trockenzeit identifiziert. Die Fischdiversität nimmt mit zunehmender Verschlechterung der Wasserqualität signifikant ab und dienen nur noch Arten als Habitat, die an schlechte Wasserqualität speziell angepasst sind. Die häufigsten Arten waren Clarias gariepinus, Heterotis niloticus, Oreochromis niloticus L., Hemichromis c.f. letourneauxi, Polypterus senegalus und Epiplatys spilargyreius. Zusätzlich beschäftigte sich diese Arbeit auch mit der Fischdiversität der Flüsse Niger und Sota. In diesem Rahmen wurden für drei Fischarten Verbreitunglücken geschlossen und für drei weitere Arten deren bereits bekanntes Verbreitungsgebiet erweitert. Im Gegensatz dazu konnte jedoch auch festgestellt werden, dass ehemals stark vertretende Fischarten aus den Fängen der Fischer verschwunden sind. Der Zeitpunkt der Befischung hängt im Allgemeinen von der Flutintensität, der Lage des Fischloches innerhalb des Überflutungsgebietes und auch von den Marktpreisen ab, wobei die meisten Ernten zwischen Februar und April, kurz vor Beginn der nächsten Regenzeit im Mai, stattfanden. Der durchschnittliche Biomasseertrag, basierend auf den Werten der einzelnen ‚Whedos’ betrug 17 Tonnen im Jahre 2008 und 8,6 Tonnen im Jahre 2009. Um die Wachstumsraten der Fische zu verbessern wurden zwei unterschiedliche Fütterungsversuche durchgeführt. Erdnusspresskuchen, Fischabfälle, Reisspelzen, Blutmehl und Azolla-Mehl wurden in verschiedenen Zusammensetzungen und Anteilen als Grundlage der Futtermittel verwendet. Die Futtermittel mit einem Anteil von 10 bzw. 19 Prozent Blutmehl wurden von den Fischen während der gesamten Fütterungsperiode aktiv konsumiert und erzielten die höchsten Nettogewinne. Die Versuchsergebnisse zeigen deutlich, dass qualitativ hochwertige Materialien nicht als Ergänzungsfutter geeignet sind, da die geringen Marktpreise für Fisch die zusätzlichen Kosten nicht decken können. Anstatt qualitativ hochwertigem Ergänzungsfutter sollten die Besitzer Materialien bevorzugen, die kostenlos bzw. günstig und zudem einfach zu verarbeiten sind. Das Ergänzungsfutter mit einem Blutmehlgehalt von 19 Prozent erzielte, im Vergleich zur gewöhnlichen Fütterung mit Reisspelzen, einen zweimal höheren Nettogewinn. Das zusätzlich erwirtschaftete Nebeneinkommen könnte somit zu einem verbesserten Lebensunterhalt der Besitzer beitragen. Obwohl sich das ‚Whedo’-System noch in seinen Anfängen befindet, wird es von der ländlichen Bevölkerung aufgrund ihrer Erfahrungen bezüglich der Fischerei in den Überflutungsgebieten und der geringen Installationskosten, hoch geschätzt und weiter ausgebaut. KW - Aquakultur KW - Extensivtierhaltung KW - Clarias gariepinus KW - Benin KW - Aquakultur KW - Whedos KW - Benin KW - extensive Fischerei-Systeme KW - Clarias gariepinus KW - Aquaculture KW - Whedos KW - Benin KW - extensive fishery KW - Clarias gariepinus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57711 ER - TY - THES A1 - Pillai, Deepu T1 - Differential effects of Pigment epithelium derived factor and epidermal growth factor on Ischemia-reperfusion injury in rats - a magnetic resonance imaging study at 3 tesla T1 - Unterschiedlichen Wirkungen von PEDF und EGF auf Ischämie-Reperfusionsschaden bei Ratten - Eine Kernspintomografie studie bei 3 Tesla N2 - Stroke, after myocardial infarction and cancer is the third most common cause of death worldwide and 1/6th of all human beings will suffer at least one stroke in their lives. Furthermore, it is the leading cause for adult disability with approximately one third of patients who survive for the next 6 months are dependent on others. Because of its huge socioeconomic burden absorbing 6% of all health care budgets and with the fact that life expectancy increases globally, one can assume that stroke is already, and will continue to be, the most challenging disease. Ischemic stroke accounts for approximately 80% of all strokes and results from a thrombotic or embolic occlusion of a major cerebral artery (most often the middle cerebral artery, MCA) or its branches Following acute ischemic stroke, the most worrisome outcome is the rapidly increasing intra-cranial pressure due to the formation of space-occupying vasogenic oedema which can have lethal consequences. Permeability changes at the Blood-Brain Barrier (BBB) usually accompanies the oedematous development and their time course can provide invaluable insight into the nature of the insult, activation of compensatory mechanisms followed by long term repair. Rodent models of focal cerebral ischemia have been developed and optimized to mimic human stroke conditions and serve as indispensable tools in the field of stroke research. The presented work constituting of three separate but complete works by themselves are sequential, where, the first part was dedicated to the establishment of non-invasive small animal imaging strategies on a 3 tesla clinical magnetic resonance scanner. This facilitated the longitudinal monitoring of pathological outcomes following stroke where identical animals can serve as its own control. Tissue relaxometric estimations were carried out initially to derive the transverse (T2), longitudinal (T1) and the transverse relaxation time due to magnetic susceptibility effects (T2*) at the cortical and striatal regions of the rodent brain. Statistically significant differences in T2*-values could be found between the cortex and striatal regions of the rodent brain. The derived tissue relaxation values were considered to modify the existing imaging protocols to facilitate the study of the rodent model of ischemic stroke. The modified sequence protocols adequately characterized all the clinically relevant sequels following acute ischemic stroke, like, the altered perfusion and diffusion characteristics. Subsequent to this, serial magnetic resonance imaging was performed to investigate the temporal and spatial relationship between the biphasic nature of BBB opening and, in parallel, the oedema formation after I/R injury in rats. T2-relaxometry for oedema assessment was performed at 1 h after ischemia, immediately following reperfusion, and at 4, 24 and 48 hours post reperfusion. Post-contrast T1-weighted imaging was performed at the last three time points to assess BBB integrity. The biphasic course of BBB opening with significant reduction in BBB permeability at 24 hours after reperfusion was associated with a progressive expansion of leaky BBB volume, accompanied by a peak ipsilateral oedema formation. At 48 hours, the reduction in T2-value indicated oedema resorption accompanied by a second phase of BBB opening. In addition, at 4 hours after reperfusion, oedema formation could also be detected at the contralateral striatum which persisted to varying degrees throughout the study, indicative of widespread effects of I/R injury. The observations of this study may indicate a dynamic temporal shift in the mechanisms responsible for biphasic BBB permeability changes, with non-linear relations to oedema formation. Two growth factor peptides namely pigment epithelium derived factor (PEDF) and epidermal growth factor (EGF) with widely different trophic properties were considered for their beneficial effects, if any, in the established rodent model of I/R injury and studied up to one week employing magnetic resonance imaging. Both the selected, trophic factors demonstrated significant neuroprotection as demonstrated by a reduction in infarct volume, even though PEDF was found to be the most potent one. PEDF also demonstrated significant attenuation of oedema formation in comparison to both the control and EGF groups, even though EGF could also demonstrate oedema suppression. In the present work, we noticed that interventions with macromolecule protein/peptides by itself could mediate remote oedema at distant sites even though the significance of such an observation is not clear at present. Susceptibility (T2*) weighted tissue relaxometric estimations were considered at the infarct region to detect any metabolic changes arising out of any neuroprotection and/or cellular proliferation / neurogenesis. PEDF group demonstrated a striking reduction of the T2*-values, which is indicative of an increased metabolic activity. Moreover, all the groups (Control, EGF and PEDF) demonstrated significantly elevated T2*-values at the contralateral striatum, which is indicative of widespread metabolic suppression usually associated with a variety of traumatic brain conditions. Moreover, as expected from the properties of PEDF, it demonstrated an extended BBB permeability suppression throughout the duration of the study. This study underlines the merits of considering non-invasive imaging strategies without which it was not possible to study the required parameters in a longitudinal fashion. All the observations are adequately supported by reasonably well defined mechanisms and needs to be further verified and confirmed by an immunohistochemical study. These results also need to be complemented by a functional study to evaluate the behavioural outcome of animals following these treatments. These studies are progressing at our laboratory and the results will be duly published afterwards. N2 - Schlaganfall ist nach Herzinfarkt und Krebs die dritthäufigste Todesursache weltweit und 1/6 aller Menschen erleiden mindestens einen Schlaganfall in ihrem Leben. Wichtiger ist jedoch, dass Schlaganfallerkrankungen ist die führende Ursache für dauerhafte Behinderungen darstellen. Ungefähr ein Drittel dieser Patienten, die die ersten 6 Monate überleben sind auf die Hilfe anderer angewiesen. Die enorme Wichtigkeit des Schlaganfalls begründet sich zudem dadurch, dass schon jetzt die sozioökonomischen Kosten 6% der gesamten Gesundheitausgaben betragen und die globale Lebenserwartung weiter steigen wird. Der ischämische Hirninfarkt ist der mit 80% vorherrschende Schlaganfalltyp und resultiert aus thrombotischen und embolischen Verschlüssen der großen hirnversorgenden Arterien und deren Ästen (insbesondere der A. cerbri media). Die wichtigste Komplikation mit hoher Mortalität nach einem ischämischen Schlaganfall ist Entwicklung eines raumfordernden vasogene Ödementwicklung. Änderungen der Permeabilität der Blut-Hirn Schranke (BHS) begleitet die Ödementwicklung und Analyse der zeitlichen BHS Permeabilität können wichtige Erkenntnisse über den natürlichen Verlauf eines Hirninfarkts und die Aktivierung kompensatorischer Mechanismen, die in Reparaturvorgänge münden, liefern. Verschiedene modelle des akuten ischämischen Schlaganfalls mit Nagetieren wurden entwickelt um die Schlaganfalltherapie des Menschen weiter zu entwickeln. Sie sind momentan unersetzliche Instrumente in der Schlaganfallforschung. Die hier vorgestellte Arbeitet setzt sich auch 3 abgeschlossenen sequentiellen Teilprojekten zusammen. Das erste Teilprojekt befasst mit der Etablierung von der nicht-invasiven Kleintierbildgebung auf einem klinischen 3 Tesla Kernspintomographen. Diese Arbeit bildet die Grundlage für das in vivo Monitoring der pathologischen Veränderungen nach Schlaganfall in einem identischen Versuchstier nachverfolgt werden kann und so die eigene Kontrolle darstellt. Gewebs relaxometrische Messungen wurden initial durchgeführt um die transverse (T2), longitudinal (T1) und transverse (T2*) Relaxationszeit (aufgrund der magnetischen Suszeptibilitätseffekte) in kortikalen und striatalen Hirnregionen der Nagetiere zu bestimmen. Statistisch signifikante Unterschiede in der T2*- Werte konnte zwischen der kortikalen und Striatalen Regionen des Gehirn von Nagetieren gefunden werden. Hierdurch konnten bestehende Messprotokolle vom Menschen auf die Nagetiere optimiert und für die Untersuchungen des Schlaganfalls genutzt werden. Diese Vorarbeiten erlauben klinisch relevante Veränderungen wie eine veränderte Diffusion und Perfusion nach ischämischen Schlaganfall zu verfolgen. Basierend auf diesen Vorarbeiten wurde die örtliche und zeitliche Charakterisierung der bi-phasischen BHS-Öffnung und der Ödementwicklung nach experimenteller I/R der Ratte mittels serieller Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht. Hier diente die T2-Relaxometrie zur Ödemquantifizierung und wurde 1 Stunde nach Beginn der zerebralen Ischämie, unmittelbar nach Reperfusion und im Intervall von weiteren 4, 24 und 48 Stunden durchgeführt. Eine T1-gewichtete Sequenz wurde vor und nach Gabe von Kontrastmittel an den drei letztgenannten Zeitpunkten zeigte den bi-phasischen Verlauf der BHS-Öffnung 4 und 48 Stunden nach Reperfusion. Eine signifikante Reduktion der BHS Permeabilität 24 Stunden war zum einem mit einer Erhöhung des Gesamtvolumens der gestörten BHS und zum anderen mit Maximum der Ödementwicklung assoziiert. Darüber hinaus konnte 48 Stunden nach Reperfusion bereits eine Resorption des Ödems anhand der T2-Relaxometrie gemessen werden während die zweite Phase der bi-phasischen BHS-Öffnung auftrat. Zusätzlich trat 4 Stunden nach Reperfusion eine Ödembildung auch der nicht-ischämischen Striatum auf, welche in unterschiedlichem Maße über die Studiendauer persistierte. Dies spricht dafür, dass Ischämie und Reperfusion Effekte auf das gesamte Gehirn haben können. Zusammenfassend sprechen die Beobachtung dafür, dass der zeitlichen Entwicklung des Hirnödems verschiedene Mechanismen der erhöhten Blut-Hirn Schranken Permeabilität zu Grunde liegen. Zwei Wachstumsfaktoren, der, Pigment epithelium abstammende Wachstumsfaktor (PEDF) und der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), mit deutlich unterschiedlichen trophischen Eigenschaften wurden auf ihre positiven Effekte im etablierten Tiermodel der zerebralen I/R hin untersucht. Dabei wurden serielle MRT Untersuchungen bis hin zu einer Woche genutzt. Beide Wachstumsfaktoren führten im Model zu einer signifikanten Neuroprotektion, die sich in einer Reduktion des Infarktvolumens gegenüber einer Kontrolle mit Kochsalz zeigte. PEDF allerdings hatte gegenüber EGF eine potentere Wirkung und zeigte darüber hinaus und noch deutlicher als EGF eine signifikante Verminderung der Ödembildung. Allerdings zeigte eine Behandlung mit diesen großmolekularen Proteinen zumindest nach 24 Stunden auch eine Neigung zur Ödembildung in vom Schlaganfall nicht betroffenen Hirnarealen, deren Signifikanz allerdings noch unklar ist. T2*- gewichtete Relaxationsmessungen können dazu genutzt werden, um metabolische Veränderungen, die aus neuroprotektiven Therapieansätzen bzw. zellulärer Proliferation bzw. Neurogenese entstehen, zu quantifizieren. Hier zeigten insbesondere mit PEDF behandelte Versuchstiere eine hochsignifikante Reduktion der T2*-Werte, welche als Hinweis auf eine erhöhte metabolische Aktivität gewertet werden können. Insgesamt zeigten alle Behandlungsgruppen (Kochsalzkontrollen, EGF und PEDF) behandelte Tiere signifikant erhöhte T2*-werte auf des kontralateralen Striatums, welche auf eine weitreichende metabolische Suppression hindeuten, wie sie normalerweise bei einer Reihe von traumatischen Hirnerkrankungen gefunden werden können. Ein weiterer Befund ist, wie erwartet, die ausgedehnte Verminderung der BHS-Durchgängigkeit durch PEDF über die gesamte Dauer der Untersuchung hinweg. Diese Studie unterstreicht den Nutzen nicht-invasiver Bildgebungsstrategien, ohne die die Untersuchung der benötigten Parameter in einem longitudinalen Design nicht möglich wäre. Ausblickend müssen diese gut mittels MRT charakterisierten Prozesse durch immunhistologische und funktionelle Untersuchungen gestützt und nachfolgend publiziert werden. KW - Schlaganfall KW - Ischemie KW - NMR-Tomographie KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - MRI KW - MRI KW - Stroke KW - Ischemia KW - PEDF KW - EGF Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57341 ER - TY - THES A1 - Drescher, Jochen T1 - The Ecology and Population structure of the invasive Yelllow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes T1 - Die Ökologie und Populationsstruktur der invasiven Ameisenart Anoplolepis gracilipes N2 - The invasive Yellow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes is a widespread tropical ant species which is particularly common in anthropogenically disturbed habitats in South-East Asia and the Indopacific region. Its native range is unknown, and there is little information concerning its social structure as a potential mechanism facilitating invasion as well as its ecology in one of the putative native ranges, South-East Asia. Using mitochondrial DNA sequences, I demonstrated that the majority of the current Indopacific colonies were likely introduced from South-East Asian populations, which in turn may have been introduced much earlier from a yet unidentified native range. By conducting behavioral, genetic and chemical analyses, I found that A. gracilipes supercolonies contain closely related individuals, thus resembling enlarged versions of monogynous, polydomous colonies of other ant species. Furthermore, mutually aggressive A. gracilipes supercolonies were highly differentiated both genetically and chemically, suggesting limited or even absent gene flow between supercolonies. Intranidal mating and colony-budding are most likely the predominant, if not the exclusive mode of reproduction and dispersal strategy of A. gracilipes. Consequently, a positive feedback between genetic, chemical and behavioral traits may further enhance supercolony differentiation though genetic drift and neutral evolution. This potential scenario led to the hypothesis that absent gene flow between different A. gracilipes supercolonies may drive them towards different evolutionary pathways, possibly including speciation. Thus, I examined one potential way by which gene flow between supercolonies of an ant species without nuptial flights may be maintained, i.e. the immigration of sexuals into foreign supercolonies. The results suggest that this option of maintaining gene flow between different supercolonies is likely impaired by severe aggression of workers towards allocolonial sexuals. Moreover, breeding experiments involving males and queens from different supercolonies suggest that A. gracilipes supercolonies may already be on the verge of reproductive isolation, which might lead to the diversification of A. gracilipes into different species. Regarding the ecological consequences of its potential introduction to NE-Borneo, I could show that A. gracilipes supercolonies may affect the local ant fauna. The ant community within supercolonies was less diverse and differed in species composition from areas outside supercolonies. My data suggest that the ecological dominance of A. gracilipes within local ant communities was facilitated by monopolization of food sources within its supercolony territory, achieved by a combination of rapid recruitment, numerical dominance and pronounced interspecific aggression. A. gracilipes’ distribution is almost exclusively limited to anthropogenically altered habitat, such as residential and agricultural areas. The rate at which habitat conversion takes place in NE-Borneo will provide A. gracilipes with a rapidly increasing abundance of suitable habitats, thus potentially entailing significant population growth. An potentially increasing population size and ecological dominance, however, are not features that are limited to invasive alien species, but may also occur in native species that become ‘pests’ in an increasing abundance of anthropogenically altered habitat. Lastly, I detected several ant guests in supercolonies of A. gracilipes. I subsequently describe the relationship between one of them (the cricket Myrmecophilus pallidithorax) and its ant host. By conducting behavioral bioassays and analyses of cuticular hydrocarbon (CHC) profiles, I revealed that although M. pallidithorax is attacked and consumed by A. gracilipes whenever possible, it may evade aggression from its host by a combination of supreme agility and, possibly, chemical deception. This thesis adds to our general understanding of biological invasions by contributing species-specific data on a previously understudied invasive organism, the Yellow Crazy Ant Anoplolepis gracilipes. Introductions which may have occurred a long time ago may make it difficult to determine whether a given species is an introduced invader or a native pest species, as both may have pronounced ecological effects in native species communities. Furthermore, this thesis suggests that supercolonialism in invasive ants may not be an evolutionary dead end, but that it may possibly give rise to new species due to reproductive boundaries between supercolonies evoked by peculiar mating and dispersal strategies. N2 - Anoplolepis gracilipes ist eine in den Tropen weit verbreitete invasive Ameisenart, die in gestörten Habitaten Südostasiens und des indopazifischen Raumes häufig vorzufinden ist. Während detaillierte Informationen bezüglich ihres derzeitigen Verbreitungsgebietes vorliegen, ist ihre geographische Herkunft immer noch unbekannt. Weiterhin ist unklar, in welchem Maße die Sozialstruktur von A. gracilipes zu ihrer ökologischen Dominanz beiträgt und wie sich diese wiederum in einem potentiellen Herkunftsgebiet (Südostasien) darstellt. Mitochondriale DNA-Sequenzen legen nahe, dass die Mehrheit der im indopazifischen Raum vorkommenden Kolonien von südostasiatischen Populationen eingeführt wurde. Die südostasiatischen Kolonien entstammen möglicherweise einem bislang unbekannten Ursprungsgebiet. Verhaltenstests und genetische Analysen ergaben, dass Superkolonien von A. gracilipes aus sehr nah verwandten Individuen bestehen, womit sie monogynen, polydomen Kolonien anderer Ameisenarten ähneln. Ausserdem wiesen sowohl genetische Daten sowie Profile epikutikulärer Kohlenwasserstoffe auf eine erhebliche Differenzierung zwischen verschiedenen Superkolonien hin. Das Ausmaß der genetischen und chemischen Differenzierung deutet darauf hin, dass Genfluss zwischen Superkolonien stark reduziert oder sogar unterbrochen ist. Da die Paarung bei A. gracilipes wahrscheinlich nur im eigenen Nest stattfindet (Hochzeitsflüge wurden noch nicht beobachtet), könnte eine positive Rückkopplung zwischen Aggression, Verwandtschaftsgrad und epikutikulärer Chemie dazu führen, dass die Differenzierung zwischen Superkolonien durch eine Kombination aus genetischer Drift und neutraler Evolution weiter verstärkt wird. Superkolonien, die nicht durch Genfluss miteinander im Austausch stehen, könnten sich also konsequenterweise in unterschiedliche evolutive Richtungen entwickeln. Eine der Möglichkeiten, durch die Genfluss zwischen verschiedenen Superkolonien aufrecht erhalten werden könnte, wäre deshalb die Einwanderung reproduktiver Individuen in fremde Superkolonien. Meine Untersuchungen ergaben, dass die Migration von Männchen und Königinnen zwischen verschiedenen Superkolonien jedoch durch die Arbeiterinnen unterbunden wird, welche in erhöhtem Maße aggressiv gegenüber Geschlechtstieren anderer Superkolonien waren. Weiterhin deuteten Kreuzungsexperimente zwischen koloniefremden Männchen und Königinnen darauf hin, dass Superkolonien von A. gracilipes unter Umständen schon reproduktiv isoliert sind, welches konsequenterweise zur Diversifizierung von A. gracilipes in verschiedene Arten führen sollte. Bezüglich ihrer ökologischen Dominanz in Nordost-Borneo konnte gezeigt werden, dass A. gracilipes die lokale Ameisenfauna erheblich beeinflusst. Innerhalb der Superkolonien von A. gracilipes fanden sich sowohl weniger Ameisenarten als auch eine andere Artzusammensetzung als außerhalb. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die ökologische Dominanz von A. gracilipes maßgeblich auf der Monopolisierung von Nahrungsquellen beruht. Diese wird ermöglicht durch eine Kombination aus schneller Rekrutierung von Nestgenossinnen, zahlenmäßiger Überlegenheit und ausgeprägter interspezifischer Aggression. A. gracilipes kommt fast ausschließlich in anthropogen gestörten Habitaten wie Wohngebieten oder landwirtschaftlich genutzten Flächen vor. Die zunehmende Habitatkonversion in Nordost-Borneo führt zu einem enormen Anstieg der von A. gracilipes besiedelbaren Habitate, so dass mit einem signifikanten Populationswachstum von A. gracilipes zu rechnen sein wird. Ein schnelles Populationswachstum sowie ökologische Dominanz sind jedoch nicht allein auf invasive Arten geprägte Charakteristika, sondern können auch bei nativen Arten zu beobachten sein, welche durch zunehmende Verfügbarkeit anthropogen veränderten Habitats zu Schädlingen werden können. Abschließend wurden mehrere Arten potentieller Sozialparasiten in Nestern von A. gracilipes aufgefunden (mehrheitlich neue, unbeschriebene Arten), von denen die Grille Myrmecophilus pallidithorax eingehender untersucht wurde. Verhaltenstests und die Analyse kutikulärer Kohlenwasserstoffe zeigten, dass M. pallidithorax von ihrem Wirt angegriffen und sogar verzehrt wird. Jedoch kann sie den Aggressionen ihres Wirtes weitestgehend ausweichen dank schneller Fluchtreflexe sowie, möglicherweise, chemischer Tarnung. Die vorliegende Dissertation zeigt, dass lang zurückliegende Invasionen die Unterscheidung zwischen eingeführten oder nativen Schädlingen erschweren, da beide tiefgreifende ökologische Einflüsse auf native Artengemeinschaften haben können. Es wurde weiterhin deutlich, dass die außergewöhnliche Sozialstruktur von invasiven Ameisen wie A. gracilipes ihre ökologische Dominanz begründet. Die Bildung von Superkolonien bei invasiven Ameisen stellt zudem nicht eine evolutive Sackgasse dar, sondern kann im Gegenzug sogar zur Artbildung führen, begünstigt durch ungewöhnliche Paarungs- und Verbreitungsstrategien. KW - Demökologie KW - Ameisen KW - Invasive Art KW - Invasionsbiologie KW - Populationsstruktur KW - Anoplolepis gracilipes KW - Yellow Crazy Ant KW - Evolution KW - Fortpflanzung KW - Ameisengäste KW - Biological Invasions KW - Population structure KW - Anoplolepis gracilipes KW - Yellow Crazy Ant Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57332 ER - TY - THES A1 - Shityakov, Sergey T1 - Molecular modelling and simulation of retroviral proteins and nanobiocomposites T1 - Simulationen und Interaktionen viraler Proteine sowie von Kohlenstoffenanoröhren mit Membranen und Proteinen N2 - Molecular modelling and simulation are powerful methods in providing important in-formation on different biological systems to elucidate their structural and functional proper-ties, which cannot be determined in experiment. These methods are applied to analyse versa-tile biological systems: lipid membrane bilayers stabilized by an intercalated single wall carbon nanotube and retroviral proteins such as HIV protease and integrase. HIV-1 integrase has nuclear localization signals (NLS) which play a crucial role in nuclear import of viral preintegration complex (PIC). However, the detailed mechanisms of PIC formation and its nuclear transport are not known. Previously it was shown that NLSs bind to the cell transport machinery e.g. proteins of nuclear pore complex such as transportins. I investigated the interaction of this viral protein HIV-1 integrase with proteins of the nuclear pore complex such as transportin-SR2 (Shityakov et al., 2010). I showed that the transportin-SR2 in nuclear import is required due to its interaction with the HIV-1 integrase. I analyzed key domain interaction, and hydrogen bond formation in transportin-SR2. These results were discussed in comparison to other retroviral species such as foamy viruses to better understand this specific and efficient retroviral trafficking route. The retroviral nuclear import was next analyzed in experiments regarding the retroviral ability to infect nondividing cells. To accomplish the gene transfer task successfully, ret-roviruses must efficiently transduce different cell cultures at different phases of cell cycle. However, promising and safe foamy viral vectors used for gene transfer are unable to effi-ciently infect quiescent cells. This drawback was due to their inability to create a preintegra-tion complex (PIC) for nuclear import of retroviral DNA. On the contrary, the lentiviral vec-tors are not dependant on cell cycle. In the course of reverse transcription the polypurine tract (PPT) is believed to be crucial for PIC formation. In this thesis, I compared the transduction frequencies of PPT modified FV vectors with lentiviral vectors in nondividing and dividing alveolar basal epithelial cells from human adenocarcinoma (A549) by using molecular cloning, transfection and transduction techniques and several other methods. In contrast to lentiviral vectors, FV vectors were not able to effi-ciently transduce nondividing cell (Shityakov and Rethwilm, unpublished data). Despite the findings, which support the use of FV vectors as a safe and efficient alternative to lentiviral vectors, major limitation in terms of foamy-based retroviral vector gene transfer in quiescent cells still remains. Many attempts have been made recently to search for the potential molecules as pos-sible drug candidates to treat HIV infection for over decades now. These molecules can be retrieved from chemical libraries or can be designed on a computer screen and then synthe-sized in a laboratory. Most notably, one could use the computerized structure as a reference to determine the types of molecules that might block the enzyme. Such structure-based drug design strategies have the potential to save off years and millions of dollars compared to a more traditional trial-and-error drug development process. After the crystal structure of the HIV-encoded protease enzyme had been elucidated, computer-aided drug design played a pivotal role in the development of new compounds that inhibit this enzyme which is responsible for HIV maturation and infectivity. Promising repre-sentatives of these compounds have recently found their way to patients. Protease inhibitors show a powerful sustained suppression of HIV-1 replication, especially when used in combi-nation therapy regimens. However, these drugs are becoming less effective to more resistant HIV strains due to multiple mutations in the retroviral proteases. In computational drug design I used molecular modelling methods such as lead ex-pansion algorithm (Tripos®) to create a virtual library of compounds with different binding affinities to protease binding site. In addition, I heavily applied computer assisted combinato-rial chemistry approaches to design and optimize virtual libraries of protease inhibitors and performed in silico screening and pharmacophore-similarity scoring of these drug candidates. Further computational analyses revealed one unique compound with different protease bind-ing ability from the initial hit and its role for possible new class of protease inhibitors is dis-cussed (Shityakov and Dandekar, 2009). A number of atomistic models were developed to elucidate the nanotube behaviour in lipid bilayers. However, none of them provided useful information for CNT effect upon the lipid membrane bilayer for implementing all-atom models that will allow us to calculate the deviations of lipid molecules from CNT with atomistic precision. Unfortunately, the direct experimental investigation of nanotube behaviour in lipid bilayer remains quite a tricky prob-lem opening the door before the molecular simulation techniques. In this regard, more de-tailed multi-scale simulations are needed to clearly understand the stabilization characteristics of CNTs in hydrophobic environment. The phenomenon of an intercalated single-wall carbon nanotube in the center of lipid membrane was extensively studied and analyzed. The root mean square deviation and root mean square fluctuation functions were calculated in order to measure stability of lipid mem-branes. The results indicated that an intercalated carbon nanotube restrains the conformational freedom of adjacent lipids and hence has an impact on the membrane stabilization dynamics (Shityakov and Dandekar, 2011). On the other hand, different lipid membranes may have dissimilarities due to the differing abilities to create a bridge formation between the adherent lipid molecules. The results derived from this thesis will help to develop stable nanobiocom-posites for construction of novel biomaterials and delivery of various biomolecules for medi-cine and biology. N2 - Molekulare Modellierung und Simulationen sind leistungsstarke Methoden, um wich-tige Informationen von verschiedenen biologischen Systemen, welche nicht durch Experi-mente erschlossen werden können, darzustellen, und deren strukturelle und funktionelle Ei-genschaften aufzuklären. Diese Arbeit untersucht in Simulationen Interaktionen viraler Proteinen sowie von Kohlenstoffenanoröhren mit Membranen und Proteinen. Die HIV-1 Integrase besitzt Kernlokalisierungssignale („nuclear localization signals [NLS]“), welche eine entscheidende Rolle beim Import des viralen Präintegrationskomplexes („preintegration complex [PIC]“) in den Zellkern spielen. Die Ausbildung des PIC und sein Import in den Zellkern sind im Detail noch nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass die NLS an Moleküle des Zelltransportsystems binden, wie z.B. an Transportinkernporen. Im Rahmen meiner Arbeit untersuchte ich die Interaktionen der viralen HIV-1 Integrase mit Proteinen der Kernporen wie dem Transportin-SR2 Protein (Shityakov et al., 2010). Hierbei wurden die möglichen Interaktionen des Transportin-SR2 Protein mit der HIV-1-Integrase und die Bedeutung dieser Interaktionen mit dem Import in den Kern aufgezeigt. Zudem wur-den die Interaktionen der Schlüsseldomänen und die Ausbildung von Wasserstoffbrücken-bindungen im dem Transportin-SR2 Protein untersucht. Die Ergebnisse wurden mit Protein-komplexen andere retroviralen Spezies, wie z.B. dem humanen Spumaretrovirus („human foamy virus [HFV]“), verglichen, um diesen spezifischen und sehr effizienten retroviralen Transportweg in die Wirtszelle zu entschlüsseln. Der experimentelle Teil dieser Arbeit beschäftigte sich damit, den retroviralen Kern-import zu untersuchen, um die Fähigkeit des Retrovirus, nicht teilende Zellen zu infizieren, besser zu verstehen verstanden wird. Um dies zu bewerkstelligen, müssen Retroviren Zellkul-turen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus effizient transduzieren. Vielversprechende und sichere- HFV- Vektoren, welche in der Gentherapie eingesetzt werden könnten, sind nicht in der Lage, diese Effizienz bei ruhenden Zellen zu gewährleisten. Dies rührte daher, dass diese nicht in der Lage waren, einen PIC für den Transport der retroviralen DNA auszubilden. Lentivirale Vektoren sind dagegen nicht auf einen bestimmten Zellzyklus angewiesen. Für die reverse Transkription ist der Polypurinteil („polypurine tract [PPT]“) essentiell für die Ausbildung der PIC. In dieser Doktorarbeit vergleiche ich die Transduktionsfrequenz von PPT-modifizierten HFV-Vektoren mit denen von lentiviralen Vektoren in nichtteilenden und tei-lenden Lungenkarzinomepithelzellen. Hierbei wurden Methoden wie Klonierung, Transfektion, und Transduktion (wie auch weitere Methoden) angewendet. Im Gegensatz zu lentiviralen Vektoren konnten HFV-Vektoren sich nicht teilende Zellen in meinen Versuchen nicht effizient transduzieren (Shityakov und Rethwiln, unveröffentlicht). Trotz der Befunde, dass HFV-Vektoren sichere und effiziente Alternativen zu lentiviralen Vektoren darstellen, bestehen immer noch große Einschränkungen, diese HFV-basierten, retroviralen Vektoren für Gentherapien bei ruhenden Zellen einzusetzen. Viele Versuche wurden unternommen, um mögliche, vielversprechende Moleküle, welche als Wirkstoffe für eine HIV-Therapie eingesetzt werden könnten, zu finden. Diese Moleküle können aus chemischen Substanzbibliotheken bezogen werden oder am Computer in silico entworfen und dann synthetisiert werden. Digitalisierte Strukturen können als Refe-renzen benutzt werden, um besser herauszufinden, wie diese Moleküle Typen diverse Enzy-me blokieren könnten. Strukturbasiertes Wirkstoffdesign hat das Potential, viele Jahre und Geld an Entwicklungskosten einzusparen. Nachdem die Kristallstruktur der HIV-kodierten Proteasen aufgeklärt war, spielte das computergestützte Wirkstoffdesign eine zentrale Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen die Protease. Vielversprechende Vertreter dieser Wirkstoffklasse werden seit kurzem nun auch für die Behandlung von Patienten eingesetzt. Proteaseinhibitoren zeigen eine wir-kungsvolle und langanhaltende Inhibition der HIV-1-Replikation; besonders dann, wenn sie in Kombinationstherapien eingesetzt werden. Aber diese Wirkstoffe werden immer weniger effektiv, je resistenter die HIV-Stämme durch Mutationen in den retroviralen Proteasen wer-den. Im Rahmen meiner Arbeit mit computergestütztem Wirkstoffdesign nutzte ich Model-lierungsmethoden wie den „lead expansion algorithm“ (Tripos®) um virtuelle Wirkstoffbibli-otheken mit verschiedenen Affinitäten zur Proteasebindungsstelle zu erstellen. Zusätzlich wandte ich Verfahren der computergestützten, kombinatorischen Chemie an, um virtuelle Bibliotheken von Proteaseinhibitoren zu designen, und zu verbessern. Parallel dazu wurde eine in silico Selektion sowie eine Einteilung nach Pharmakophorähnlichkeiten für diese Kandidaten vorgenommen. Weiterführende computergestützte Analysen förderten einen ein-zigartigen Wirkstoff zu Tage, welcher neuartige Proteasebindungseigenschaften aufweist, und dessen Rolle für eine potentiell neuartige Klasse von Proteaseinhibitoren schon beschrieben wurde (Shityakov und Dandekar, 2009). Eine Reihe von Modellen mit atomarer Auflösung wurden bereits entwickelt, um das Verhalten von Nanoröhren in Lipid-Doppelschichten aufzuklären. Die Auswirkungen auf die molekular Dynamik einer einschichtigen Karbonnanoröhre, welche in das Zentrum einer Lipid-Doppelschicht eingefügt wurde, wurden intensiv studiert und analysiert. Die Normalabweichung und Fluktuationen wurden berechnet, um eine Aussage über die Stabilität der Lipid-Doppelschichten treffen zu können. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine eingefügte Karbonnanoröhre die Freiheit für Konformationsänderungen bei nahegelegenen Lipiden einschränkt und dadurch einen Einfluss auf die Membranstabilität hat (Shityakov und Dandekar, 2011). Es kann aber außer-dem sein, dass verschiedene Lipid-Doppelschichten Unterschiede in ihrer Fähigkeit, Brücken zwischen benachbarten Lipiden auszubilden, aufweisen. Viren und Karbonnanoröhren werden damit in verschiedenen dynamischen Simulati-onen untersucht, um mehr über ihre Interaktionen mit Proteinen und Membranen zu erfahren. KW - Kohlenstoff KW - Nanoröhre KW - Retroviren KW - Proteine KW - virale Proteine KW - retroviral proteins KW - nanobiocomposites Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56960 ER - TY - THES A1 - Göb, Eva T1 - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus T1 - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis N2 - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten. N2 - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis. KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Maus KW - Meiose KW - meiosis KW - spermiogenesis KW - nuclear envelope KW - lamina KW - LINC complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839 ER -