TY - THES A1 - Milenkovic, Vladimir M. T1 - Structural and functional analysis of bestrophin N2 - Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss. N2 - Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species. KW - Makuladegeneration KW - Membranproteine KW - Molekularbiologie KW - VMD2 KW - bestrophin KW - VMD2 KW - bestrophin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19372 ER - TY - THES A1 - Gogishvili, Tea T1 - Immunotherapy of allergic disorders in a mouse model of allergic airway inflammation T1 - Immuntherapie allergischer Erkrankungen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen N2 - Allergische Erkrankungen sind Störungen, bei denen es zu Immunfehlregulationen kommt und die bei empfänglichen Individuen zur Entstehung von Allergen spezifischen T-Helfer 2 (TH2) Immunantworten führen. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die für Soforttypallergien charakteristischen TH2 Immunantworten sowohl durch natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T Zellen (Treg) als auch durch Antigen induzierte IL-10-secreting CD4+ regulatorische T Zellen kontrolliert werden können. Weiterhin gibt es Hinweise, dass eine erfolgreiche Allergen spezifische Immuntherapie über die Induktion von IL-10 sezernierenden T reg Zellen vermittelt wird. In ersten Teil der Arbeit wird die Effizienz einer Allergen spezifischen Immuntherapie (SIT) in einem Mausmodel für allergische Atemwegsentzündung demonstriert. Als Allergieparameter wurden Allergen spezifisches IgE im Serum, verschiedene TH1 und TH2 Cytokine in der brochoalveolären Lavage Flüssigkeit und nach in vitro Restimulation in Milzzellen untersucht. Weiterhin wurden Histologien von Lungengewebe angefertigt, um das eosinophile Entzündungsinfiltrat und die Asthma typische Becherzellmetaplasie darzustellen. Weiterhin wurden durch FACS Untersuchungen regulatorische T Zellen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass im Mausmodell die intranasale Applikationsform der SIT die allergischen Symptome effizienter bekämpfen konnte, als die beim Menschen etablierte subcutane Applikationsform. Um Mechanismen zu definieren die eine SIT effizienter machen könnten wurde ein IL-4/IL13 Inhibitor (QY) als Adjuvans für die SIT benutzt. Für den Zytokininhibitor konnte gezeigt werden, dass bei einer Applikation während der allergischen Sensibilisierung die Entstehung einer TH2 Immunantwort und die Ausbildung allergischer Symptome verhindert wird. Die Applikation des Inhibitors zusammen mit einer SIT zeigte jedoch keine zusätzlichen signifikanten antiallergischen Effekte im Vergleich zur Durchführung der SIT als Monotherapie. Diese Ergebnisse deuten möglicherweise daraufhin , dass der bekannte Wechsel einer TH2 Immunantwort zu einer TH1 Antwort während der SIT nicht der Schlüsselmechanismus zu einer erfolgreichen Behandlung ist. Insbesondere weil unter der SIT auch in unserem Mausmodell die Induktion von IL-10 sezernierenden CD4+ T regulatorischen Zellen mit der Suppression der allergischen Atemwegsentzüdnung vergesellschaftet waren, so dass möglicherwiese diese Zellen für den Therapieerfolg relevant sind . Um die Rolle regulatorischer T Zellen im Allergiemodell näher zu beleuchten wurde im 2. Teil der Arbeit ein monoklonaler superagonistischer anti-CD28 Antikörper benutzt, von dem bekannt ist dass T regulatorische Zellen in vivo induziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation des Antikörpers während der allergischen Sensibilisierung die Etablierung einer TH2 Immunantwort verstärkte. Im Gegensatz dazu wurden durch die therapeutische Applikation des anti CD28 Antikörpers in einer etablierten Allergie, IL-10 sezernierende CD4+CD25+ T Zellen induziert, welches mit einer Abschwächung der gemessenen Allergieparameter einherging. N2 - Allergic disease are inflammatory disorders in which aberrant immune regulation occurs, and susceptible individuals mount allergen specific T helper 2 (Th2) responses, which drives disease pathology. Recent studies indicate that Th2 responses that are characteristic of allergic manifestations can be regulated by both naturally occurring CD4+CD25+ regulatory (Treg) cells and antigen-driven IL-10-secreting CD4+ regulatory T cells. Evidence is also emerging that successful Allergen specific immunotherapy (SIT) might work through the induction of IL-10-secreting regulatory T cells. In the first part of this work, I demonstrated the efficiency of allergen specific immunotherapy in the mouse model for allergic airway inflammation. Here I could show that intranasal administration of SIT abrogates allergic symptoms more efficiently, than the subcutaneous treatment. Furthermore, an IL-4/IL-13 (QY) inhibitor was used as an adjuvant for SIT, which has been demonstrated to have an anti-allergic potential, when administered prophylactically during allergic sensitization. However, the combination therapy with SIT and the inhibitory molecule QY did not show any significant enhancement in regards to all measured allergic parameters, when compared to monotherapy with SIT. These results provide the evidence, that shift from Th2 to Th1 cytokine profile might not be a key event in successful SIT. Subsequently, the investigation of immune mechanisms under successful SIT demonstrate that the increase of IL-10 secreting CD4+ T regulatory cells is associated with the suppression of airway inflammation in our mouse system, suggesting that these T cell subsets might be involved in the regulatory mechanisms of allergic disorders. In agreement with these findings is the second part of this work, where superagonistic a-CD28 mAb´s were used for the expansion of T regulatory cell subsets in our murine model for allergic airway inflammation. Here I could show, that the application of a-CD28 mAb during allergic sensitization, resulted in the establishment of a Th2 state, rather than a stimulation of a Treg cell population, supporting the Th2 promoting role of a-CD28 mAb together with TCR engagement. However, interesting findings were obtained by application of the superagonistic a-CD28 mAb in the challenge phase in established allergy. Conversely to the previous experiment, therapeutic administration of a-CD28 mAb lead to the generation of IL-10 secreting CD4+CD25+ T cell population in line with the induction of anti-allergic effects. Taking together the results of this study argue for the anti-inflammatory properties of T regulatory cells in allergic disease and highlights importance of these T cell subsets in the suppression of Th2 cell-driven response to allergen. Moreover, these observations suggest that the induction of IL-10 in vivo by T regulatory cells may represent a novel treatment strategy for allergic disorders. KW - Bronchialasthma KW - Allergie KW - Maus KW - Immuntherapie KW - Allergy KW - asthma KW - IL-4/IL-13 inhibitor KW - Mouse model of allergic airway inflammation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19304 ER - TY - THES A1 - Heisswolf, Annette T1 - The distribution of leaf beetles on multiple spatial scales : causes and consequences T1 - Die Verteilung von Blattkäfern auf verschiedenen räumlichen Skalen: Ursachen und Konsequenzen N2 - Herbivorous insects are the major link between primary producers and a multitude of animals at higher trophic levels. Elucidating the causes and consequences of their distribution patterns in the "green world" is thus essential for our understanding of numerous ecological processes on multiple spatial scales. We can ask where and why a certain herbivore can be found in the landscape, within the habitat, on which plant within the habitat and finally, where on that plant. Depending on spatial scale the distribution of herbivores is shaped by different processes (fitness considerations, physiological abilities, population dynamics, dispersal behavior, history of the landscape etc.). Scaling down from fragmented landscapes to individual host plants this thesis analyzes the distribution patterns of the strictly monophagous herbivore Cassida canaliculata Laich. (Coleoptera: Chrysomelidae), which feeds and oviposits exclusively on meadow sage, Salvia pratensis L. (Lamiales: Lamiaceae), and compares it to those of the polyphagous tansy leaf beetle Galeruca tanaceti L. (Coleoptera: Chrysomelidae), which does not oviposit on its host plants, but on dry non-host structures. The specialist Cassida canaliculata depended on all spatial scales (fragmented landscape, microhabitat and host plant individual) mainly on the distribution and quality of its single host plant species Salvia pratensis, whereas enemy-free-space - i.e. avoidance of parasitism and predation of egg clutches, larvae, and pupae - seemed to influence oviposition site choice only on the scale of the host plant individual. On this spatial scale, offspring of Cassida canaliculata had a higher chance of survival on large host plant individuals, which were also preferred for oviposition by the females. In contrast, the distribution patterns of the generalist Galeruca tanaceti was shaped by the interaction with its parasitoid regarding both microhabitat choice and egg distribution within individual host plants. On the microhabitat scale, beetles could escape from their parasitoids by ovipositing into high and dense vegetation. Regarding oviposition site choice within a host plant individual, females oviposited as high as possible in the vegetation and could thus reduce both the risk of parasitism and the probability of winter mortality. The results of my thesis show that the degree of specificity of a herbivore is of central importance for the resulting egg distribution pattern on all spatial scales. N2 - Herbivore Insekten sind das zentrale Bindeglied zwischen den Primärproduzenten und einer Vielzahl von Tieren höherer trophischer Ebenen. Daher ist es für unser Verständnis von unzähligen ökologischen Prozessen auf multiplen räumlichen Skalen essentiell, die Ursachen und Folgen ihrer Verteilungsmuster in der "grünen Welt" aufzuklären. Wir können fragen, wo und warum ein bestimmter Herbivor in der Landschaft, im Habitat, auf welcher Pflanze im Habitat und schließlich wo auf dieser Pflanze zu finden ist. In Abhängigkeit von der räumlichen Skala wird die Verteilung der Herbivoren von unterschiedlichen Prozessen (Fitness-Überlegungen, physiologische Fähigkeiten, Populationsdynamik, Dispersalverhalten, Geschichte der Landschaft etc.) geformt. Herunterskalierend von fragmentierten Landschaften zu individuellen Wirtspflanzen, habe ich in meiner Doktorarbeit die Verteilungsmuster des streng monophagen Blattkäfers Cassida canaliculata Laich. (Coleoptera: Chrysomelidae) untersucht, der ausschließlich auf Wiesensalbei, Salvia pratensis L. (Lamiales: Lamiaceae), frisst und Eier ablegt, und sie mit denen des polyphagen Rainfarnblattkäfers Galeruca tanaceti L. (Coleoptera: Chrysomelidae) verglichen, der seine Eier nicht auf Wirtspflanzen, sondern auf trockenen nicht-Wirtsstrukturen ablegt. Der Spezialist Cassida canaliculata war auf allen räumlichen Skalen (fragmentierte Landschaft, Mikrohabitat und Wirtspflanze) hauptsächlich von der Verteilung und Qualität seiner einzelnen Wirtspflanzenart Salvia pratensis abhängig, während Feind-freier Raum – d.h. die Vermeidung von Parasitierung und Prädation der Eigelege, Larven und Puppen – die Wahl des Eiablageplatzes nur bezüglich der Larvalentwicklung auf der Skala des Wirtspflanzenindividuums zu beeinflussen schien. Auf dieser räumlichen Skala hatten die Nachkommen von Cassida canaliculata eine höhere Überlebenschance auf großen Wirtspflanzenindividuen, die auch von den Weibchen zur Eiablage bevorzugt wurden. Im Gegensatz dazu wurde das Verteilungsmuster des Generalisten Galeruca tanaceti sowohl bezüglich der Wahl des Mikrohabitats als auch der Verteilung der Eigelege innerhalb individueller Pflanzen durch die Interaktionen mit seinem Eiparasitoiden geformt. Auf der Mikrohabitatebene konnten die Käfer ihren Parasitoiden dadurch entkommen, dass sie ihre Eigelege in hoher und dichter Vegetation ablegten. Bezüglich der Wahl des Eiablageplatzes innerhalb der Pflanze legten die Weibchen möglichst hoch in der Vegetation ab und konnten dadurch sowohl das Parasitierungsrisiko als auch die Wahrscheinlichkeit der Wintermortalität reduzieren. Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit zeigen, dass der Spezifizierungsgrad eines Herbivoren für das resultierende Verteilungsmuster seiner Eigelege auf allen räumlichen Skalen von zentraler Bedeutung ist. KW - Blattkäfer KW - Wirtspflanzen KW - Eiablage KW - Demökologie KW - Blattkäfer KW - räumliche Skala KW - Tier-Pflanze-Interaktion KW - Wirtspflanzenfindung KW - Eiablage KW - leaf beetle KW - spatial scale KW - plant animal interaction KW - host plant finding KW - oviposition Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18945 ER - TY - THES A1 - Riemensperger, Thomas T1 - Untersuchung prädiktiver Eigenschaften des dopaminergen Systems von Drosophila melanogaster mittels genetisch kodierter Calcium Sensoren T1 - Analysis of predictive features in the dopaminergic System of Drosophila melanogaster using genetically encoded Calcium Sensors N2 - Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren ermöglicht es, Messungen neuraler Aktivitäten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuführen. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verhältnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Auflösung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkulär permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molekül basieren, wobei das Signal auf einer veränderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivitäten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich für die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierfür wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. Während die calciumabhängigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel größer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verhältnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund für die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung führen, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem ursprünglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegenüber ändert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzkörper von essentieller Bedeutung für die Ausbildung eines olfaktorischen Gedächtnisses sind. Während das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist über die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzkörper schwach auf die Präsentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock während eines Trainings, verlängert sich die Aktivität dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, während die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Veränderungen aufweist. Während bei Säugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorgängen über dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution geändert zu haben scheint, die Fähigkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verstärkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu können, zwischen Säugern und Drosophila erhalten. N2 - The technique of optical in vivo imaging using genetically encoded fluorescent sensors in transgenic animals has paved the way for real-time monitoring of spatio-temporal activity in the brain. Among the different fluorescent probes, the calcium sensors produce signals with the highest signal to noise ratio and the best temporal resolution. Basically these sensors can be split into two groups, those based on a FRET-effect between two modified green fluorescent proteins (GFPs) and those which make use of on a circular permutation of GFP. Both types have successfully been used for measuring neuronal activity in various species. One part of the present work was to test which of these different sensor types are best suited for an in vivo situation. For this, two members of the class of circularly permutated sensors and four members of the class of FRET based sensors were tested and compaired in Drosophila. Each sensor was expressed in second and third order neurons of the olfactory pathway and the calcium activity evoked by artificial depolarisation or physiological odour stimuli was recorded. Whereas the Calcium dependent change in signal intensity is substantially higher for the circularly permutated sensors, the FRET based sensors tested in this work showed a better signal to noise ratio when movement of the brain structures under investigation could not be prevented. For this reason a FRET based sensor was chosen to measure the activity of dopaminergic neuronsin a classical conditioning paradigm. In the second part of this work the effect of pairing a neutral stimulus with a negative reinforcer (in this case an electric shock) on the activity of dopaminergic neurons was investigated. The pairing of these two stimuli can lead to classical conditioning, a simple form of learning in which the animal assigns a value (positive or negative) to the formerly neutral stimulus. Olfactory classical conditioning in Drosophila melanogaster is a prime model for the analysis of the molecular and neuronal substrate of this type of learning and memory. In particular the mushroom bodies have been shown to be essential for olfactory memory formation. While the olfactory system of insects has been extensively characterized little is known about the neurons that mediate the reinforcing stimulus. Using the technique of optical calcium imaging it was possible to show that dopaminergic projections in the region of the mushroom body lobes responded weakly to odour presentations, but strongly to the stimulation by an electric shock. After pairing for several times one of two odours presented to the fly with an electric shock (training), the activity of the dopaminergic neurons to the punished odour is significantly prolonged in a test after the training. No change is observed after the training for the control odour that was not paired with the electric shock. Whereas in mammals rewarding stimuli are mediated by dopaminergic neurons, in Drosophila this catecholamine apparently plays a role in mediating aversive reinforcement. Even though the role of dopamine seems to have changed during evolution the capability of dopaminergic neurons to predict a reinforcing stimulus appears to be conserved between Drosophila and mammals. KW - Taufliege KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Calcium KW - Calcium imaging KW - Sensoren KW - Dopamin KW - Drosophila melanogaster KW - prädiktive Eigenschaften KW - Calcium imaging KW - Sensors KW - Dopamine KW - Drosophila melanogaster KW - predictive features Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19041 ER - TY - THES A1 - Endler, Annett T1 - Regulation of reproductive division of labor in the ant Camponotus floridanus : behavioral mechanisms and pheromonal effects T1 - Regulation der reproduktiven Arbeitsteilung bei der Ameise Camponotus floridanus: Verhaltensmechanismen und Einfluss von Pheromonen N2 - A hitherto unresolved problem is how workers are prevented from reproducing in large insect societies. The queen informs about her fertility and health which ensures sufficient indirect fitness benefits for workers. In the ant Camponotus floridanus, I found such a signal located on eggs of highly fertile queens. Groups of workers were regularly provided with different sets of brood. Only in groups with queen eggs workers refrain from reproducing. Thus, the eggs seem to inform the workers about queen presence. The signal on queen eggs is presumably the same that enables workers to distinguish between queen and worker-laid eggs, latter are destroyed by workers. Queen and worker-laid eggs differ in their surface hydrocarbons in a similar way as fertile queens differ from workers in the composition of their cuticular hydrocarbons. When I transferred hydrocarbons from the queen cuticle to worker eggs the eggs were no longer destroyed, indicating that they now carry the signal. These hydrocarbons thus represent a queen signal that regulates worker reproduction in this species. But the signal is not present in all fertile queens. Founding queens with low egg-laying rates differ in the composition of cuticular hydrocarbons from queens with high productivity. Similar differences in the composition of surface hydrocarbons were present on their eggs. The queen signal develops along with an increasing fertility and age of the queen, and this is perceived by the workers. Eggs from founding queens were destroyed like worker eggs. This result shows that founding queens lack the appropriate signal. In these little colony foundations chemical communication of queen status may not be necessary to prevent workers from reproducing, since workers may benefit more from investing in colony growth and increased productivity of large colonies rather than from producing male eggs in incipient colonies. If the queen is missing or the productivity of the queen decreases, workers start laying eggs. There is some evidence from correlative studies that, under queenless conditions, worker police each other because of differences in individual odors as a sign of social status. It can be expressed as either aggressive inhibition of ovarian activity, workers with developed ovaries are attacked by nest-mates, or destruction by worker-laid eggs. I found that in C. floridanus workers, in contrast to known studies, police only by egg eating since they are able to discriminate queen- and worker-laid eggs. Workers with developed ovaries will never attacked by nest-mates. This is further supported by qualitative and quantitative differences in the cuticular hydrocarbon profile of queens and workers, whereas profiles of workers with and without developed ovaries show a high similarity. I conclude that workers discriminate worker eggs on the basis of their hydrocarbon profile, but they are not able to recognize egg-laying nest-mates. Improving our knowledge of the proximate mechanisms of the reproductive division of labor in evolutionary derived species like C. floridanus will help to understand the evolution of extreme reproductive altruism involving sterility as a characteristic feature of advanced eusocial systems. N2 - Es ist eine bisher ungelöste Frage, wie Arbeiterinnen in großen Insektenkolonien von der Reproduktion abgehalten werden. Arbeiterinnen würden einen erheblichen Fitnessvorteil erlangen, falls die Königin über ihre Fertilität und ihren Gesundheitszustand informiert. Bei der Ameise Camponotus floridanus konnte auf den Eiern hochfertiler Königinnen so ein Signal gefunden werden. Gruppen von Arbeiterinnen wurden regelmäßig mit verschiedenen Brutansätzen versorgt. Aber nur in Gruppen, welche Eier der Königin erhielten, wurden die Arbeiterinnen von der Reproduktion abgehalten. Die Eier informieren demnach über die Anwesenheit der Königin. Das Signal der Königineier ermöglicht Arbeiterinnen offensichtlich auch zwischen Eiern von Königin und Arbeiterinnen zu unterscheiden, wobei letztere zerstört werden. Königin- und Arbeiterinneneier unterscheiden sich in ihren Oberflächenkohlenwasserstoffen auf ähnliche Weise wie sich die kutikulären Kohlenwasserstoffprofile von fertilen Königinnen und Arbeiterinnen unterscheiden. Wurden Kohlenwasserstoffe von der Kutikula der Königin auf Eier von Arbeiterinnen übertragen, schützten sie diese vor der Zerstörung. Dies zeigt, dass die Eier das Signal transportieren. Die Kohlenwasserstoffe stellen ein Königinsignal dar, welches die Reproduktion der Arbeiterinnen bei C. floridanus regelt. Allerdings kommt das Signal nicht bei allen fertilen Königinnen vor. Gründungsköniginnen mit einer geringen Eiablagerate unterscheiden sich in der Zusammensetzung der Kohlenwasserstoffe von Königinnen mit einer höheren Produktivität. Ähnliche Unterschiede in der Zusammensetzung der Oberflächenkohlenwasserstoffe finden sich ebenfalls auf den jeweiligen Eiern. Das Königinsignal gewinnt an Stärke mit zunehmender Fertilität und Alter der Königin, was von den Arbeiterinnen erkannt wird. Eier von Gründungsköniginnen werden wie die Eier von Arbeiterinnen zerstört. Das Ergebnis zeigt, dass Gründungsköniginnen das betreffende Signal nicht besitzen. Um Arbeiterinnen von der Reproduktion abzuhalten, scheint es in kleinen Gründungskolonien nicht notwendig über den Zustand der Königin zu informieren. Arbeiterinnen in diesen Kolonien profitieren mehr von der Investition in das Koloniewachstum als von der Produktion von Männchen. Fehlt die Königin oder nimmt ihre Produktivität ab, dann beginnen Arbeiterinnen mit der Eiablage. Es gibt Belege aus anderen Studien, dass unter königinlosen Bedingungen Arbeiterinnen sich gegenseitig von der erfolgreichen Reproduktion abhalten (worker policing). Dabei orientieren sie sich am individuellen Geruch der Tiere je nach sozialem Status. Die Inhibierung der Ovarienaktivität erfolgt über Aggression, indem fertile Arbeiterinnen von ihren Nestgenossinnen attackiert werden, oder über die Zerstörung von Eiern. Arbeiterinnen von C. floridanus policen, im Gegensatz zu den bekannten Studien, nur durch Eifrass, da sie in der Lage sind Eier von Königin und Arbeiterinnen zu unterscheiden. Fertile Arbeiterinnen werden dagegen nie von Nestgenossinnen angegriffen. Dies wird unterstützt durch qualitative und quantitative Unterschiede im kutikulären Kohlenwasserstoffprofil zwischen Königin und Arbeiterinnen, während sich das Profil fertiler und infertiler Arbeiterinnen dagegen nicht unterscheidet. Arbeiterinnen nutzen demnach das Kohlenwasserstoffprofil um Eier zu unterscheiden, sind aber nicht in der Lage fertile Nestgenossinnen zu erkennen. Die Aufklärung der Regulationsmechanismen der reproduktiven Arbeitsteilung bei stark abgeleiteten Arten wie C. floridanus liefert einen Beitrag zum Verständnis, wieso es im Laufe der Evolution zur reproduktiven Degeneration von Arbeiterinnen gekommen ist, einem Charakteristikum hoch entwickelter eusozialer Systeme. KW - Camponotus floridanus KW - Fortpflanzung KW - Pheromon KW - soziale Insekten KW - Ameisen KW - Fertilitätssignal KW - kutikuläre Kohlenwasserstoffe KW - worker policing KW - social insects KW - ants KW - fertility signal KW - cuticular hydrocarbons KW - worker policing Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18872 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER - TY - THES A1 - Polleichtner, Johann Georg T1 - Studies of structure-function relationship of components of multidrug efflux pumps and type I secretion systems T1 - Untersuchungen des Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion von Multidrug Efflux Pumpen und Typ I Sekretionssystemen N2 - This work deals with channel-tunnel dependent multidrug efflux pumps and type I secretion systems, more concrete with the improved classification of the adaptor protein family, the characterization of the TolC-homologue protein HI1462 of Haemophilus influenzae, and the molecular characterization of the interaction between TolC and AcrA of Escherichia coli. N2 - Diese Arbeit beschäftigt sich mit Channel-Tunnel-abhängigen Multidrug Efflux Pumpen und Typ I Sekretionssystemen, genauer gesagt mit der verbesserten Klassifikation der Familie der Adapter-Proteine, der Charakterisierung des TolC-homologen Proteins HI1462 aus Haemophilus influenzae, und der molekularen Charakterisierung der Interaktion zwischen TolC und AcrA aus Escherichia coli. KW - Gram-negative Bakterien KW - Resistenz KW - Membrantransport KW - Multidrug Efflux Pumpen KW - Typ I Sekretion KW - Channel-Tunnel KW - Adapter-Protein KW - multidrug efflux pumps KW - type I secretion KW - channel-tunnel KW - adaptor protein Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18671 ER - TY - THES A1 - Ernst, Raffael T1 - Anuran communities on the cutting edge : Analysing patterns and processes in anthropogenically altered tropical forests - Studies from the Guiana Shield and West Africa T1 - Anurengemeinschaften auf Messers Schneide: Muster und Prozesse in anthropogen veränderten tropischen Wäldern - Studien vom Guiana Schild und Westafrika N2 - Summary Timber harvesting is currently the most common commercial utilisation activity in tropical forests. Assessing the effects of logging on different aspects of biodiversity and general ecosystem properties is hence of prime importance if the few remaining areas of intact tropical forest are to be protected effectively and efficiently. Tropical amphibian communities are an appropriate model system for studies on the impacts of human-induced environmental changes on the dynamics of complex biological systems. This thesis elaborates on patterns of diversity changes in tropical forest amphibian communities facing habitat alterations associated with selective logging in two globally important eco-regions (Côte d’Ivoire, Upper Guinea, West Africa and Guyana, the Guiana Shield, northern South America). The thesis is organised along two main themes. After a general introduction, a section on general methodology and an introduction to the model systems studied, the first theme moves from general patterns to underlying processes. A second theme running through both chapters carries from undisturbed systems to disturbed systems. A final section integrates findings and addresses implications for conservation management of anthropogenically altered tropical forests. Several case studies at the species- population and community level are being presented and data on the direct and indirect impacts of anthropogenic habitat alteration on respective organizational levels are provided. A key statement that is stressed on throughout the studies is the fact that common measures of diversity, such as species richness and species-diversity only inadequately reflect processes of diversity change following anthropogenic disturbance. They also fail to describe actual impacts on the dynamics of complex biological systems. It is argued that commonly used measures produce an incoherent and insufficient picture of diversity patterns and the underlying processes that shape these patterns. Thus, an understanding of higher levels of diversity, such as β-diversity and functional diversity (and hence compositional patterns) appears to be the key to effectively mitigating the impacts of human-induced disturbance on amphibian communities. It is shown that the predictability of amphibian community composition depends on the respective level of anthropogenic disturbance imposed on a particular habitat. Hence, human activities that lead to changes in the structure of a forest, such as logging, not only alter simple system descriptors, such as the number of species in a given community, but rather alter the dynamics of the entire system. In this context, functional diversity is shown to be an important aspect underlying the actual mechanism that leads to the observed change of predictability patterns. Functional differences between species, rather than number of species per se appear to be the decisive factor in sustaining desirable ecosystem states and thus in maintaining important ecosystem services. Because biological diversity appears to play a substantial role in ecosystem resilience required to safeguard essential ecosystem functions in the face of environmental change, the thesis calls for a critical revision of common diversity assessments approaches. The studies advocate the reconsideration of the uncritical use of widespread measures and descriptors of biodiversity on grounds of inconsistent patterns found throughout numerous studies, including those presented herein. N2 - Zusammenfassung Forst- und Holzwirtschaft gehört derzeit zu einer der wichtigsten kommerziellen Nutzungsformen tropischer Wälder. Der Analyse und Untersuchung von direkten und indirekten Auswirkungen von Holzeinschlag auf verschiedene Aspekte biologischer Vielfalt und genereller Ökosystemeigenschaften muß daher eine zentrale Bedeutung eingeräumt werden. Dies trifft im besonderen Maße zu, wenn die verbleibenden noch intakten Regenwaldflächen effizient und auch langfristig effektiv geschützt werden sollen. Tropische Amphibiengemeinschaften haben sich bei der Untersuchung von Auswirkungen anthropogen induzierter Habitatveränderungen auf die Dynamik komplexer biologischer Systeme als geeignetes Modellsystem erwiesen. Die hier vorliegende Arbeit befasst sich mit den Mustern der Diversität und deren Änderung in tropischen Waldamphibiengemeinschaften unter dem Einfluss anthropogener Habitatveränderungen (selektiver Holzeinschlag) in zwei geographisch distinkten Ökoregionen von globaler Bedeutung (Côte d’Ivoire, Oberguinea, West Afrika und Guyana, Guiana Schild, nördliches Südamerika). Die thematische Gliederung der Arbeit folgt zwei unterschiedlichen Organisationssträngen. Der erste Strang leitet, nach einer allgemeinen Einführung und einem Abschnitt zur Methodik und Einführung in die untersuchten Modellsysteme, über, von den generellen Mustern zu den zugrunde liegenden Prozessen. Ein zweiter führt von ungestörten Systemen zu Systemen unter Störungseinfluss. Ein abschließender Abschnitt befasst sich mit den Implikationen für Naturschutzmanagement von anthropogen veränderten tropischen Wäldern. In einer Reihe von Fallstudien auf Art-, Populations- und Gemeinschaftsniveau werden die direkten und indirekten Einflüsse anthropogener Habitatänderungen auf die jeweilige Organisationsebene erörtert. Grundtenor aller vorgestellten Untersuchungen ist die Tatsache, dass herkömmliche Diversitätsmaße, wie etwa Artenreichtum und Artendiversität die in Zusammenhang mit anthropogenen Störungen auftretenden Veränderungen von Diversitätsmustern nur unzureichend erklären. Diese Maße erscheinen ebenfalls ungeeignet für die Beschreibung des Einflusses auf die Dynamik komplexer biologischer Systeme. Herkömmlich verwendete Diversitätsindizes generieren ein inkohärentes und unzureichendes Bild tatsächlicher Diversitätsmuster und der zugrunde liegenden Prozesse, die diese Muster formen. Das Verständnis höherer Ebenen der Diversität, wie etwa β-Diversität oder funktionale Diversität (und somit Muster der Artzusammensetzung) erscheint essentiell für die Minimierung des Einflusses von anthropogen induzierten Störungen auf Amphibiengemeinschaften und könnte somit zu einer effektiven Schadensbegrenzung beitragen. In den vorgestellten Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Vorhersagbarkeit der Zusammensetzung einer gegebenen Amphibiengemeinschaft unmittelbar vom Störungsgrad des jeweiligen Systems abhängt. Menschliche Aktivitäten, die zu strukturellen Änderungen von Waldssystemen führen, wie etwa kommerzieller Holzeinschlag, führen nicht nur zu Änderungen einfacher Systemdeskriptoren, wie der Anzahl der Arten innerhalb einer Gemeinschaft, vielmehr beeinflussen sie die Dynamik des Gesamtsystems. In diesem Zusammenhang erwiesen sich funktionale Diversitätskomponenten als äußerst wichtige determinierende Faktoren für die beobachteten Vorhersagbarkeitsmuster und deren Veränderung. Funktionale Unterschiede und nicht Artenzahl per se scheinen demnach für den Erhalt zu bevorzugender Ökossystemzustände ausschlaggebend zu sein. Der Erhalt dieser funktionalen Merkmalsdiversität trägt unmittelbar zum Erhalt wichtiger ökosystemarer Leistungen bei. Da anzunehmen ist, dass biologischer Diversität eine maßgebliche Rolle in Bezug auf die Belastbarkeit und Elastizität von Ökosystemen zukommt (essentielle Eigenschaften, die das langfristige Funktionieren von Ökosystemen unter Störungseinfluss gewährleisten), unterstreichen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit die Notwendigkeit einer kritischen Revision traditioneller Ansätze der Diversitätserfassung. KW - Tropischer Regenwald KW - Westafrika KW - Lurche KW - Ökologie KW - anthropogene Störungen KW - Amphibiengemeinschaften KW - Vorhersagbarkeitsmuster KW - Naturschutz KW - Afro- Neotropen KW - anthropogenic disturbance KW - amphibian communities KW - predictabilitiy patterns KW - conservation KW - Afro- Neotropics Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18373 ER - TY - THES A1 - Cruz, Alexandre Bettencourt da T1 - Molecular and functional characterization of the swiss-cheese and olk mutants in Drosophila melanogaster : two approaches to killing neurons T1 - Molekulare und funktionelle Untersuchung der swiss-cheese und olk Mutanten in Drosophila melanogaster N2 - In this thesis two genes involved in causing neurodegenerative phenotypes in Drosophila are described. olk (omb-like), a futsch allele, is a micotubule associated protein (MAP) which is homologous to MAP1B and sws (swiss cheese) a serine esterase of yet unknown function within the nervous system. The lack of either one of these genes causes progressive neurodegeneration in two different ways. The sws mutant is characterized by general degeneration of the adult nervous system, glial hyperwrapping and neuronal apoptosis. Deletion of NTE (neuropathy target esterase), the SWS homolog in vertebrates, has been shown to cause a similar pattern of progressive neural degeneration in mice. NTE reacts with organophosphates causing axonal degeneration in humans. Inhibition of vertebrate NTE is insufficient to induce paralyzing axonal degeneration, a reaction called "aging reaction" is necessary for the disease to set in. It is hypothesized that a second "non-esterase" function of NTE is responsible for this phenomenon. The biological function of SWS within the nervous system is still unknown. To characterize the function of this protein several transgenic fly lines expressing different mutated forms of SWS were established. The controlled expression of altered SWS protein with the GAL4/UAS system allowed the analysis of isolated parts of the protein that were altered in the respective constructs. The characterization of a possible non-esterase function was of particular interest in these experiments. One previously described aberrant SWS construct lacking the first 80 amino acids (SWSΔ1-80) showed a deleterious, dominant effect when overexpressed and was used as a model for organophosphate (OP) intoxication. This construct retains part of its detrimental effect even without catalytically active serine esterase function. This strongly suggests that there is another characteristic to SWS that is not defined solely by its serine esterase activity. Experiments analyzing the lipid contents of sws mutant, wildtype (wt) and SWS overexpressing flies gave valuable insights into a possible biological function of SWS. Phosphatidylcholine, a major component of cell membranes, accumulates in sws mutants whereas it is depleted in SWS overexpressing flies. This suggests that SWS is involved in phosphatidylcholine regulation. The produced α-SWS antibody made it possible to study the intracellular localization of SWS. Images of double stainings with ER (endoplasmic reticulum) markers show that SWS is in great part localized to the ER. This is consistent with findings of SWS/ NTE localization in yeast and mouse cells. The olk mutant also shows progressive neurodegeneration but it is more localized to the olfactory system and mushroom bodies. Regarding specific cell types it seemed that specifically the projection neurons (PNs) are affected. A behavioral phenotype consisting of poor olfactory memory compared to wt is also observed even before histologically visible neurodegeneration sets in. Considering that the projection neurons connect the antennal lobes to the mushroom bodies, widely regarded as the "learning center", this impairment was expected. Three mutants where identified (olk1-3) by complementation analysis with the previously known futschN94 allele and sequencing of the coding sequence of olk1 revealed a nonsense mutation early in the protein. Consistent with the predicted function of Futsch as a microtubule associated protein (MAP), abnormalities are most likely due to a defective microtubule network and defects in axonal transport. In histological sections a modified cytoskeletal network is observed and western blots confirm a difference in the amount of tubulin present in the olk1 mutant versus the wt. The elaboration of neuronal axons and dendrites is dependent on a functional cytoskeleton. Observation of transport processes in primary neural cultures derived from olk1 mutant flies also showed a reduction of mitochondrial transport. Interaction with the fragile X mental retardation gene (dfmr1) was observed with the olk mutant. A dfmr1/ olk1 double mutant shows an ameliorated phenotype compared to the olk1 single mutant. tau, another MAP gene, was also shown to be able to partially rescue the olk1 mutant. N2 - In dieser Arbeit werden zwei neurodegenerative Mutanten in Drosophila beschrieben. Zum einen drei Allele des futsch Gens namens olk (omb-like). futsch wurde bereits als Mikrotubuli assoziertes Protein (MAP) beschrieben und ist als MAP1B Ortholog identifiziert worden. Zum anderen sws (swiss cheese), eine Serinesterase, deren Funktion im Nervensystem noch unbekannt ist. In sws mutanten Fliegen ist Vakuolisierung im gesamten Gehirn sichtbar, es handelt sich um einen generellen, progressiven, neurodegenerativen Phänotyp. Neuronale Apoptose wie auch multiple Membranhüllen um Gliazellen sind für die sws Mutanten charakteristisch. Die biologische Funktion von SWS innerhalb des Nervensystems ist bisher noch nicht geklärt. Vertebraten, die für das sws Ortholog NTE (neuropathy target esterase) mutant sind, zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie sws mutante Fliegen. Auch Vergiftung von NTE mit Organophosphaten kann zu axonaler Degeneration führen. Dabei ist jedoch die Inhibition von NTE nicht ausreichend um die Axondegeneration hervorzurufen. Eine weitere Reaktion, die sogenannte "Aging reaction" is notwendig um die paralysierende Wirkung auszulösen. Eine These besagt, dass NTE eine zweite, von der Esterasefunktion unabhängige Funktion ("Nicht-Esterase" Funktion) besitzt, die diese Wirkung auslöst. Zur Aufklärung der physiologischen Funktion von SWS wurden verschiedene transgene Fliegenlinien etabliert. Diese produzieren verschiedene, mutierte Formen des SWS Proteins, dessen Expression mit Hilfe des GAL4/ UAS Systems genau gesteuert werden kann. Diese Methode erlaubt eine eingehende Untersuchung einzelner Proteindomänen, die in den jeweiligen Konstrukten verändert waren. Insbesondere die Charakterisierung der möglichen "Nicht-Esterase" Funktion war von Interesse. Eine bereits beschriebene mutante Form des SWS Proteins, dem die ersten 80 Aminosäuren fehlen (SWSΔ1-80), zeigte einen dominanten degenerativen Effekt. Die Überexpression von SWSΔ1-80 führt, wie auch die Vergiftung mit bestimmten Organophosphaten, zur Degeneration der betroffenen Zellen und wurde deshalb als Modell für Organophosphatvergiftung herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Konstrukt auch dann einen schädlichen Effekt zeigt, wenn die katalytische Serinesterasefähigkeit durch Mutation entfernt wurde. Dies deutet die Möglichkeit an, dass SWS eine, von der Esteraseaktivität unhabhängige, Funktion ausüben kann. Ein Vergleich des Lipidgehalts von sws Mutanten mit wt und SWS überexprimierenden Fliegen gab wertvolle Hinweise auf eine mögliche biologische Funktion von SWS. Der Gehalt an Phosphatidylcholin, ein Hauptbestandteil von Zellmembranen, scheint in sws Mutanten erhöht zu sein, während es in SWS überexprimierenden Fliegen in geringeren Mengen zu finden ist. Dies weist darauf hin, dass SWS an der Phosphatidylcholinregulation beteiligt sein könnte. Der in dieser Arbeit hergestellte α-SWS Antikörper ermöglichte eine genauere intrazelluläre Lokalisation des SWS Proteins. Doppelfärbungen mit einem ER (Endoplasmatisches Retikulum) Marker zeigen, dass ein grosser Anteil von SWS im ER zu finden ist. Dies stimmt mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnisse zur Lokalisation von SWS/ NTE in Hefe- und Mauszellen überein. Die olk Mutante zeigt ebenfalls progressive Neurodegeneration, die Effekte sind jedoch lokaler, insbesondere das olfaktorische System und die Pilzkörper sind betroffen. Die Projektionsneurone (PN) degenerieren in dieser Mutante innerhalb von etwa 20 Tagen. Noch vor der histologisch sichtbaren Degeneration ist bereits ein Verhaltensphänotyp erkennbar, der sich in schlechter, olfaktorischen Lernleistung äussert. Projektionsneurone verbinden die Antennalloben und die Pilzkörper, die als "Lernzentren" gelten, daher entspricht ein Lerndefekt den Erwartungen. Die drei olk Mutanten (olk1-3) wurden durch Komplementationstests mit dem publizierten futschN94 Allel als weitere futsch Allele identifiziert. In olk1 zeigte die Sequenzierung der kodierenden Sequenz eine Mutation, die frühzeitig zu einem Stopcodon im Protein führt. Die Degenerationserscheinungen in der Mutanten sind vermutlich auf Defekte im Mikrotubulinetzwek und axonalen Transport zurück zu führen. In histologischen Gehirnschnitten sind Veränderungen im Zytoskelett zu beobachten und Western Blots deuten auf einen erhöhten Tubulingehalt in der olk1 Mutante hin. Für die Entwicklung von Axonen und Dendriten ist ein intaktes Zytoskelett unentbehrlich. Transportprozesse sind in olk1 Mutanten ebenso betroffen, insbesondere ist der mitochondriale Transport reduziert. Das fragile X mental retardation Gen (dfmr1) interagiert mit der olk Mutante, so dass eine dfmr1/ olk1 Doppelmutante einen weniger starken Phänotyp zeigt als die olk1 Mutante. tau, ein weiteres MAP Gen, besitzt ebenso die Fähigkeit den olk1 Phänotyp partiell zu suprimieren. KW - Taufliege KW - Nervendegeneration KW - Molekulargenetik KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese KW - Drosophila KW - neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17734 ER - TY - THES A1 - Hartung, Anke T1 - Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling T1 - Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Plasmamembrandomänen und deren Auswirkung auf den BMP Signalweg N2 - Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs. N2 - Endozytose von Wachstumsfaktor-Rezeptoren spielt eine entscheidende Rolle bei Aktivierung und Übertragung wie auch bei der Schwächung von Signalen. Störungen der Endozytose können schwere Krankheitsbilder hervorrufen, z.B. durch ihren Einfluss auf die Regulation der Rezeptormenge an der Zelloberfläche. BMPs sind Mitglieder der TGF-ß Superfamilie und sind involviert in die Regulation von Proliferation, Differenzierung, Chemotaxis und Apoptose. Zwei Arten von Transmembranproteinen, die Serin/Threonin-Kinase Aktivität besitzen, sind bedeutend für den BMP Signalweg – die BMP Rezeptoren BRI und BRII. Die Aktivierung von BRI und BRII erfolgt durch Ligandenbindung an präformierte Komplexe (PFCs) oder BMP2-induzierte Signalkomplexe (BISCs), die aus beiden Rezeptorarten bestehen. Wenn BMP2 an PFCs bindet, wird die Smad-Signalkaskade initiiert, wohingegen BISCs Smad-unabhängige Signale über p38 weiterleiten, was schließlich zur Produktion von alkalischer Phosphatase (ALP) führt. Das Feld der BMP Rezeptor Endozytose wurde noch nicht sehr ausführlich untersucht, genauso wenig wie die potentielle Rolle, die unterschiedliche Rezeptorlokalisierungen in verschiedenen Plasmamembran-Regionen bei der Initiierung der Signalwege, die durch PFCs bzw. BISCs aktiviert werden, spielen könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Membrandomänen sowie deren Einfluss auf die BMP Signalkaskade untersucht. Mittels Reinigung von Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus Zelllysaten und anschließender Gradientenultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass BRI und BRII mit dem caveolären Markerprotein cav-1 kofraktionieren. Darüber hinaus interagieren beide Rezeptorarten mit cav-1 und kolokalisieren auch teilweise mit cav-1 an der Plasmamembran. Obwohl diese Ergebnisse auf ein eindeutiges Vorkommen der Rezeptoren in Caveolae schließen lassen, kofraktionieren sie auch mit DRMs in Zellen, die von Natur aus keine Caveolae ausbilden, woraus man eine zusätzliche nichtcaveoläre Raft-Lokalisierung schlussfolgern kann. Des Weiteren konnte BRII mittels Immun- Elektronenmikroskopie in „clathrin-coated pits“ (CCPs) lokalisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass beide untersuchten Membranregionen die BMP Signalkaskade auf unterschiedliche Art und Weise beeinflussen. Es wurde bewiesen, dass Smad1/5 unabhängig von endozytotischen Vorgängen an der Plasmamembran phosphoryliert wird. Einerseits führte die Zerstörung von DRM-Regionen durch Cholesterindepletion zur spezifischen Inhibierung der BMP2-vermittelten ALP Produktion, ohne gleichzeitig die BMP Signalkaskade über Smads zu beeinflussen. Andererseits bewirkte eine spezifische Blockierung der Clathrin-vermittelten Endozytose eine Inhibition des BMP2-induzierten Smad-Signalwegs und auch der ALP Produktion, was auf ein Zusammenspiel von Smad-unabhängigen und Smad-abhängigen Signalwegen bei der ALP-Induzierung schließen lässt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen die Schlussfolgerung zu, dass verschiedene endozytotische Wege und Membranregionen einen bedeutenden, regulatorischen Einfluss auf die BMP Signalkaskade ausüben. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Membranlokalisierung von BMP Rezeptoren für das Einschlagen verschiedener Signalwege ausgehend von PFCs und BISCs verantwortlich ist. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Endocytose KW - BMP KW - Rezeptoren KW - Endozytose KW - Lipid Raft KW - Caveolae KW - BMP KW - receptors KW - endocytosis KW - lipid raft KW - caveolae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18360 ER - TY - THES A1 - Bock, Fiola T1 - Untersuchungen zu natürlicher und manipulierter Aufzucht von Apis mellifera : Morphologie, Kognition und Verhalten T1 - Studies of natural and manipulated breeding of Apis mellifera: Morphology, cognition and behaviour N2 - 3. Zusammenfassung Ein noch immer unvollständig verstandenes Problem sind die exakten Mechanismen der Arbeitsteilung und Koordination innerhalb von Bienenvölkern Apis mellifera. Auf der einen Seite muss die sensorische und neuronale Ausstattung jedes Individuums das Potential zur Kommunikation und Aufgabenbewältigung enthalten, zum anderen müssen jedem Bienenvolk Mechanismen zur Steuerung zur Verfügung stehen, die auch so weit in die Zukunft reichenden Notwendigkeiten wie Wintervorbereitungen zuverlässig durchführen. Die vorliegende Arbeit beleuchtet daraus ausgewählte Aspekte. Zum einen werden Aspekte der kognitiven Fähigkeiten der Einzelbienen untersucht, die im Hinblick auf ihre Rolle als sammelnde Arbeiterinnen eine wichtige Rolle spielen. Das Erkennen und Verarbeiten von Mustern spielt eine wichtige Rolle beim Auffinden von potentiellen Nahrungsquellen. Hier konnte mittels des DMTS – Paradigma ein hoher Abstraktionsgrad der Musterverarbeitung sowie eine Speicherung auch komplexer Muster gezeigt werden. Zum anderen wird die Bruttemperatur als ein Einfluss auf die Puppenentwicklung und dessen mögliche Folgen auf kognitive Fähigkeiten und Lebenshistorie untersucht. Variation der Bruttemperatur wurde in verschiedenen Zusammenhängen als starker Einfluss auf unterschiedliche Aspekte der Entwicklung gezeigt. In der vorliegenden Arbeit kann diese Bruttemperatur als möglicher Faktor der nachfolgend unterschiedlichen Ausprägung von Verhaltensmustern gezeigt werden. Dabei wird ebenso auf die Unterschiede im Verhaltensmuster von täglichen Stocktätigkeiten wie auf die resultierenden Unterschiede in der Lebensgeschichte und –spanne eingegangen, die aus unterschiedlichen Brutaufzuchtstemperaturen resultieren können. Als Aufzuchtstemperaturen werden dabei 32°C, 35°C sowie 36°C verwendet, um eine Vari ation zwischen der an anderer Stelle berichteten mittleren, der niedrigsten und der höchsten Temperatur für morphologisch vollständig entwickelte Bienen zu erreichen und die daraus resultierenden Arbeiterinnen zu untersuchen. Sowohl die Ergebnisse der Verhaltensuntersuchungen von Stockbienen wie auch der Vergleich von Lebensaktivität und –spanne zeigen dabei signifikante Unterschiede zwischen den bei unterschiedlichen Temperaturen aufgezogenen Arbeiterinnen in deren analysiertem Verhalten. N2 - One of the still incompletely understood problems is the accurate mechanisms of work division and co-ordination within bee colonies Apis mellifera. On the one side the sensory and neural equipment of each individual must contain the potential for communication and task accomplishment that is viable for the daily organisation of a honeybee hive, on the other hand reliable mechanisms for planning and fulfilling future demands like winter preparations are vitally important. This work investigates selected aspects of the underlying communication and regulation aspects of these demands. The cognitive abilities of the single worker bee regarding their role as foraging and collecting force for the beehive are examined. The process of recognizing and processing the visual cues found while foraging is examined by means of the DMTS – paradigm. A high degree of abstraction while processing the patterns as well as the memorisation of complex samples is shown. Furthermore the breeding temperature as one factor influencing pupae development and its influence on subsequent behaviour and life history of the adult workers is analysed. The available work can link differences in the brood temperature with the resulting different patterns of behaviour and life history of worker bees. The temperature levels while raising the different groups of honeybees were chosen as 32°C, 35°C and 36°C to rea ch a variation between the from other groups reported as normal, the lowest and highest breeding temperature and to examine the resulting female workers. Both the results of the behavioural observation of worker bees that are active inside the colony as well as the overall comparison of their life activity and lifespan show significant differences between these groups of bees that were raised on varying brood temperatures. KW - Biene KW - Morphologie KW - Verhalten KW - Apis mellifera KW - Morphologie KW - Kognition KW - Verhalten KW - Apis mellifera KW - Morphology KW - cognition KW - behaviour Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17801 ER - TY - THES A1 - Stegmeier, Johannes Friedrich T1 - Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli T1 - Charakterisierung von YaeT und YtfM sowie Multidrugefflux Systemen in Escherichia coli N2 - In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component N2 - In dieser Arbeit wurden die Omp85 Familienproteine YaeT und YtfM aus E. coli biochemisch und elektrophysiologisch charakterisiert, sowie bioinformatisch und strukturell analysiert. Des Weiteren wurden Bakterienstämme mit chromosomalen Deletionen der beiden zugehörigen Gene hergestellt, um die Relevanz der beiden Proteine in vivo zu untersuchen. Für Omp85 aus N. meningitdis wurde vorhergesagt, dass das Protein aus zwei strukturellen Untereinheiten besteht, einer periplasmatischen amino-terminalen Domäne, der POTRA – („polypeptide-transport-associated“ -) Domäne und einer carboxy-terminalen Domäne, die das Protein in der Außenmembran verankert. Diese Vorhersagen wurden für die Omp85 Homologen YaeT und YtfM mit Hilfe von geeigneten Mutanten bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass der carboxy-terminale Teil beider Proteine, YaeT und YtfM, auch bei Fehlen der amino-terminalen Domäne noch in der äußeren Membran zu finden ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch „Black Lipid Bilayer“ Experimente. Für beide nativen Proteine, sowie deren carboxy-terminale Mutanten, konnte der Einbau in eine künstliche Membran und Porenbildung gezeigt werden. Anders als bei herkömmlichen Porinen, die normalerweise eine sehr gut definierte Leitfähigkeit haben, musste man den beiden untersuchten Proteinen eher eine Leitfähigkeitsspanne zuordnen. Bei Messungen in 1M KCl wurden für YaeT beispielsweise Poren mit einer Leitfähigkeit von 100 bis 600 pS aufgezeichnet, wobei 400 pS der am häufigsten vorkommende Wert ist. Diese Variabilität ist bei YaeT zumindest dadurch begründbar, dass für den Einbau anderer Proteine in die äußere Membran ein flexibler Kanal mit einer möglichen lateralen Öffnung notwendig ist. Die YaeT Poren sind kationenselektiv, für YtfM wurde ein anionenselektiver Kanal nachgewiesen, welcher zusätzlich im Vergleich zu YaeT weniger pH anfällig ist. Weiterhin haben die elektrophysiologischen Experimente gezeigt, dass die Ionenselektivität und Leitfähigkeit von YaeT durch Detergenzmoleküle beeinflussbar ist. Dies lässt hydrophobe Bereiche im Kanalinnern vermuten, an denen sich die Moleküle mit ihrem unpolaren Teil anlagern und dann durch ihre polaren Köpfe die Nettoladungen im Kanalinnern verändern. Mittels Gelelektrophorese konnte für YaeT das typische Laufverhalten von Außenmembranproteinen gezeigt werden. Wenn YaeT ungekocht auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, wanderte es schneller, als wenn man es vorher auf 100°C erhitzte, was für eine kompakte Struktur spricht. Für YtfM wurde dieses Verhalten nicht festgestellt. Die Erklärung für diesen Unterschied lieferten ein Sequenzvergleich beider Proteine, sowie die strukturelle Untersuchung mittels CD- und FTIR-Spektroskopie, welche im Vergleich zu YtfM einen deutlich höheren β-Faltblatt-Anteil für den carboxy-terminalen Teil von YaeT ergaben. Da der carboxy-terminale Teil der Proteine in der Außenmembran zu finden ist und porenformende Aktivität besitzt, wurde versucht, YaeT durch seine carboxy-terminale Mutante in einem Knock-out Stamm zu ersetzen. Dies schlug jedoch fehl, was auf eine bestimmte Funktion der amino-terminalen Hälfte in vivo hindeutet. Im Vergleich zu YaeT ist YtfM kein essentielles Protein und sein Fehlen beeinflusst die Zusammensetzung und die Funktion der äußeren Membran nicht. Die chromosomale Deletion von ytfM führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Wachstumsrate. Bei den Multidrug Efflux Pumpen AcrAB/TolC und MexAB/OprM sind mittlerweile Strukturen aller drei Pumpenkomponenten bekannt, ihre Interaktionsstellen sind allerdings noch nicht bekannt. Mit einem chemischen „Cross-linker“ konnte der Zusammenbau eines hybriden Exportsystems bestehend aus der Außenmembrankomponente OprM aus Pseudomonas aeruginosa, dem Adapterprotein AcrA aus E. coli, sowie dessen zugehörigem Innenmembrantransporter AcrB, nachgewiesen werden. Der Zusammenbau ist insofern erstaunlich, da diese hybride Effluxpumpe nicht funktionell ist. Die Funktionalität dieser Effluxpumpe, nachgewiesen durch Antibiotikasensitivitätstests, konnte jedoch durch den Austausch der „Hairpin“-Domäne von AcrA durch den „Hairpin“ von MexA wieder hergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Wichtigkeit dieser Haarnadelstruktur für die funktionelle Interaktion mit der Außenmembrankomponente OprM. Interessanterweise konnte das hybride Adapterprotein eine funktionelle Effluxpumpe mit TolC als Außenmembrankomponente bilden, was für eine höhere Flexibilität von TolC im Gegensatz zu OprM bezüglich der Interaktionspartner spricht. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse wurde ein Interaktionsmodell der „Hairpin“-Domäne von AcrA bzw. MexA mit den Außenmembranproteinen TolC und OprM auf molekularer Ebene erstellt. Dieses Modell kann nun als Vorlage für zielgerichtete Mutationen dienen, um die Interaktionsstellen des Adapterproteins mit der zugehörigen Außenmembrankomponente genau zu beschreiben. KW - Escherichia coli KW - Porin KW - Omp85 KW - YaeT KW - YtfM KW - Multidrug Efflux KW - Omp85 KW - YaeT KW - YtfM KW - Multidrug Efflux Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18171 ER - TY - THES A1 - Glos, Julian T1 - Amphibian communities of the dry forest of Western Madagascar : taxonomy, ecology and conservation T1 - Amphibiengemeinschaften im westmadagassischen Trockenwald: Taxonomie, Ökologie und Naturschutz N2 - In meiner Arbeit habe ich taxonomische, gemeinschaftsökologische und autökologische Aspekte im westmadagassischen Trockenwald untersucht. Ziel dieser Arbeit war es Antworten auf die Fragen zu geben wie die einzelnen Arten die Habitate in Raum und Zeit nutzen, welchen Einfluss abiotische Parameter, Austrocknungsrisiko der Laichgewässer und Mikrohabitat haben und wie Prädatoren die Gemeinschaft und das Verhalten einzelner Arten beeinflussen. Somit trägt diese Arbeit dazu bei die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die die Zusammensetzung einer Lebensgemeinschaft bestimmen. Im Einzelnen untersuchte ich hierzu folgende Fragestellungen: Aus welchen Arten bestehen die Anurengemeinschaften des westmadagassischen Trockenwaldes, und wie lassen sich diese Arten morphologisch voneinander abgrenzen? Welche Unterschiede finden sich zwischen den Arten bezüglich ihres Paarungssystems, ihrer life-history und ihrer Habitatwahl bzw. den Anpassungen an ihr Habitat? Gibt es spezifische Kaulquappengemeinschaften, die sich anhand biotischer und abiotischer Umweltvariablen vorhersagen lassen? Unterscheiden sich die Muster der Vorhersagbarkeit von Gemeinschaften zwischen unterschiedlichen Habitattypen innerhalb eines lokalen räumlichen Skalenniveaus? Wie beeinflusst das Vorkommen von Raubfeinden die Verteilung von Kaulquappen und deren Verhalten auf der räumlichen Skalenebene einzelner Laichgewässer? Anhand welcher Umweltvariablen lässt sich die Laichplatzwahl von Anuren in diesem Habitat vorhersagen? Wie lassen sich die Ergebnisse nutzen, um Empfehlungen zum Schutz bedrohter Arten auszusprechen? In dieser Arbeit beschreibe ich eine Froschart wissenschaftlich neu. Diese Art, Scaphiophryne menabensis, ist die seltenste Froschart in ihrem Verbreitungsgebiet, und aus meiner Arbeit resultiert die dringende Empfehlung, sie in ein bestehendes Schutzkonzept für den Kirindy-Wald und seine Umgebung mit einzubeziehen. Weiterhin beschreibe ich wissenschaftlich erstmalig in dieser Arbeit fünf Kaulquappenarten und präsentiere Daten zu Ökologie, life-history und Verhalten dieser Arten. Die wissenschaftliche Beschreibung weiterer Frosch- und Kaulquappenarten ist Gegenstand noch andauernder Studien (Scaphiophryne sp., Heterixalus carbonei und H. tricolor; Revision der Kaulquappen von Scaphiophryne). Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen damit die Basis für alle weiteren ökologischen Studien an Fröschen und Kaulquappen dieses Ökosystems dar. FAZIT Die Amphibienfauna Madagaskars ist einzigartig, und sie stellt ein aufregendes Feld für ökologische Fragestellungen dar, sowohl als eigenständiges System betrachtet als auch als Modell für andere Systeme. Umso mehr verwundert es, dass bislang kaum detaillierte ökologische Studien an diesem System durchgeführt wurden. Die vorliegende Arbeit schafft zunächst mit der taxonomischen Beschreibung der vorkommenden Arten die Basis für ökologische Fragestellungen und zeigt dann auf den Ebenen sowohl der Gemeinschaft als auch einzelner Arten, wie verschiedene Umweltfaktoren die Verteilung von Anuren in Raum und Zeit beeinflussen. Es zeigt sich, dass sowohl statische Eigenschaften der Gewässer als auch dynamische Faktoren wie Raubfeinde oder das Vorhandensein anderer Kaulquappen die Verteilung der Arten auf verschiedenen räumlichen Skalenebenen sowie deren Verhalten beeinflussen. Somit tragen die Ergebnisse dieser Arbeit dazu bei, die grundlegenden Mechanismen zu verstehen, die die Zusammensetzung der Lebensgemeinschaften in diesem Ökosystem bestimmen. Nicht zuletzt ermöglichen diese Erkenntnisse, geeignete, artenorientierte Schutzkonzepte für diese in ihrer Existenz stark bedrohte Anurengemeinschaft zu entwickeln und die Effekte von Habitatzerstörung auf diese Gemeinschaft aufzuzeigen. N2 - The amphibian fauna of the Kirindy dry forest in western Madagascar Abstracts of chapter 5 and 6 Living apart together – patterns of tadpole communities in a western Madagascan dry forest Whether communities are established in a deterministic or in a stochastic manner depends to a large degree on the spatial scale considered. In this study we use a tadpole community in the dry forest of western Madagascar to show that when within-site habitat diversity is considered, communities may also differ in two community parameters (species composition and species richness) within one geographic scale. Forest ponds and riverbed ponds are two types of breeding habitat that are both used by anurans but that differ generally in their temporal availability, predation pressure, and environmental characteristics. In forest ponds, tadpole communities were very predictable by the physical properties of the ponds and by their vegetation characteristics. In contrast, the riverbed communities were not predictable. We offer two hypotheses to explain this phenomenon. This study clearly demonstrates differing patterns in community organization in two natural habitats within one site, and therefore, highlights the importance of considering local conditions and within-site habitat diversity in community studies. Modeling the habitat use of an endangered dry-forest frog from Western Madagascar A crucial factor for the successful reproduction and thus conservation of an amphibian species is the availability of suitable waters as breeding sites. In this chapter, we examine the use of breeding sites of an endangered, local endemic frog of Western Madagascar, Aglyptodactylus laticeps, over a three year period. Logistic regression was used to model the relationship between the species’ breeding habitat use and environmental variables. This model was aimed to be predictive, rather than explanatory, and only environmental variables were included that are assessable in a time and cost effective manner, and that can therefore be used as an easy-to-use management tool in applied conservation. On the local scale of the Kirindy concession, A. laticeps is restricted to forest with a relatively low degree of disturbance and closed canopy cover. The model identified three environmental variables that suffice to satisfactorily predict the use of respective breeding sites, namely leaf litter, vegetation coverage and surface water plants. Based on these results, we present recommendations for the conservation management of this frog. Furthermore, the presence or absence of this species within its natural range indicates the relative degree of environmental integrity of its habitat, and we therefore consider this species as a suitable indicator species of temporary aquatic habitats within the dry forest that are characterized by a low water permanency and high leaf litter coverage. This study demonstrates that models constructed from basic ecological knowledge of relevant species may serve as valuable management tools in applied conservation. KW - Lurche KW - Tiergesellschaft KW - Ökologie KW - Madagaskar KW - Kaulquappen KW - Gemeinschaftsökologie KW - Räuber-Beute Interaktionen KW - Habitatmodel KW - tadpoles KW - community ecology KW - predator-prey interactions KW - habitat model Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18146 ER - TY - THES A1 - Thum, Andreas Stephan T1 - Sugar reward learning in Drosophila : neuronal circuits in Drosophila associative olfactory learning T1 - Zucker-Belohnungslernen von Drosophila N2 - Genetic intervention in the fly Drosophila melanogaster has provided strong evidence that the mushroom bodies of the insect brain act as the seat of memory traces for aversive and appetitive olfactory learning (reviewed in Heisenberg, 2003). In flies, electroshock is mainly used as negative reinforcer. Unfortunately this fact complicates a comparative consideration with other inscets as most studies use sugar as positive reinforcer. For example, several lines of evidence from honeybee and moth have suggested another site, the antennal lobe, to house neuronal plasticity underlying appetitive olfactory memory (reviewed in Menzel, 2001; Daly et al., 2004). Because of this I focused my work mainly on appetitive olfactory learning. In the first part of my thesis, I used a novel genetic tool, the TARGET system (McGuire et al., 2003), which allows the temporally controlled expression of a given effector gene in a defined set of cells. Comparing effector genes which either block neurotransmission or ablate cells showed important differences, revealing that selection of the appropriate effector gene is critical for evaluating the function of neural circuits. In the second part, a new engram of olfactory memory in the Drosophila projection neurons is described by restoring Rutabaga adenlylate cyclase (rut-AC) activity specifically in these cells. Expression of wild-type rutabaga in the projection neurons fully rescued the defect in sugar reward memory, but not in aversive electric shock memory. No difference was found in the stability of the appetitive memories rescued either in projection neurons or Kenyon cells. In the third part of the thesis I tried to understand how the reinforcing signals for sugar reward are internally represented. In the bee Hammer (1993) described a single octopaminergic neuron – called VUMmx1 – that mediates the sugar stimulus in associative olfactory reward learning. Analysis of single VUM neurons in the fly (Selcho, 2006) identified a neuron with a similar morphology as the VUMmx1 neuron. As there is a mutant in Drosophila lacking the last enzymatic step in octopamine synthesis (Monastirioti et al., 1996), Tyramine beta Hydroxylase, I was able to show that local Tyramine beta Hydroxylase expression successfully rescued sugar reward learning. This allows to conclude that about 250 cells including the VUM cluster are sufficient for mediating the sugar reinforcement signal in the fly. The description of a VUMmx1 similar neuron and the involvement of the VUM cluster in mediating the octopaminergic sugar stimulus are the first steps in establishing a neuronal map for US processing in Drosophila. Based on this work several experiments are contrivable to reach this ultimate goal in the fly. Taken together, the described similiarities between Drosophila and honeybee regarding the memory organisation in MBs and PNs and the proposed internal representation of the sugar reward suggest an evolutionarily conserved mechanism for appetitive olfactory learning in insects. N2 - Arbeiten über das assoziative olfaktorische Lernen bei Drosophila, bei denen definierte Gruppen von Nerven genetisch verändert wurden, haben gezeigt, dass die Pilzkörper des Insektengehirns Gedächtnisspuren für aversives und appetitives Geruchslernen besitzen (Heisenberg, 2003). Hierzu wird bei der Fliege meistens Elektroschock als negativer Reiz bei der Pavlovschen Konditionierung benutzt. Leider erschwert dies einen Vergleich mit anderen Insekten, da in den meisten Studien Zucker als positiver Stimulus verwendet wird. Interessanterweise schlagen mehrere Arbeiten bei der Biene und der Motte zusätzlich zu den Pilzkörpern einen weiteren Bereich im Insektengehirn vor, der eine Gedächtnisspur des appetitiven Geruchslernens besitzt, die Antennalloben (Menzel, 2001; Daly et al., 2004). Aus diesen Gründen habe ich mich in meiner Arbeit intensiv mit dem appetitiven Geruchslernen beschäftigt. Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich das TARGET System verwendet (McGuire et al., 2003), welches die zeitlich kontrollierte Expression eines beliebigen Reportergens in definierten Zellen erlaubt. Ein Vergleich verschiedener Effektoren zeigte, dass Proteine, die die Neurotransmission blocken (Shits; TNT, Kir2.1), besser geeignet sind, um die Funktion neuronaler Schaltkreise in Drosophila zu untersuchen. Effektoren, die Zellen abtöten, entfalten lediglich während der Entwicklung ihre volle Aktivität und eignen sich daher, z.B. um das larvale Verhalten zu analysieren. Im zweiten Teil beschreibe ich eine neue Gedächtnisspur für das Geruchslernen in den Projektionsneuronen. Die Expression des wildtypischen rutabaga Gens ausschließlich in diesen Zellen, rettete den Defekt im Zuckerlernen, nicht aber im Elektroschocklernen. Ferner scheinen die Gedächtnisspuren des appetitven Geruchslernens im Pilzkörper und den Projektionsneuronen gleich stabil zu sein. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Frage gestellt, wie das Belohnungssignal des Zuckers im Fliegengehirn verarbeitet wird. Hammer (1993) beschrieb in der Biene ein einzelnes octopaminerges Neuron, das VUMmx1 Neuron, welches den Zuckerreiz beim assoziativen Geruchslernen vermittelt. Eine Einzelzellanalyse des VUM clusters von Drosophila zeigte ein ähnliches VUMmx1 Neuron erstmals bei der Fliege (M. Selcho, Diplomarbeit). Durch die lokale Expression der Tyramin beta Hydroxylase, das Oktopamin synthetisierende Enzym, im T-beta-H Mutanten Hintergrund, konnte gezeigt werden, dass ca. 250 Zellen (inklusive des VUM Clusters) ausreichen, das Belohnungssignal des Zuckers zu vermitteln. Beides, die Identifizierung eines VUMmx1 ähnlichen Neurons in der Fliege und die Eingrenzung der Neuronen, die das Belohnungssignal vermitteln, bilden die Basis für weitergehende Versuche. Diese erlauben es, neuronale Schaltkreise der US (Zucker)-Verarbeitung beim assoziativen olfaktorischen Lernen detailliert zu beschreiben. Insgesamt legen die übereinstimmenden Gedächtnisspuren im Pilzkörper und den Projektionsneuronen von Drosophila und der Honigbiene nahe, dass das olfaktorische Belohnungslernen einem in der Evolution konservierten Mechanismus entstammt. KW - Taufliege KW - Geruchswahrnehmung KW - Lernen KW - Neurologie KW - Zucker KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Dropsophila KW - sugar KW - learning KW - memory KW - drosophila Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17930 ER - TY - THES A1 - Zavala Góngora, Ricardo T1 - Isolierung, Charakterisierung und Funktionsanalyse von TGF-Beta-Signaltransduktionskomponenten des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis T1 - Structural and functional characterization of TGFß signaling systems in Echinococcus multilocularis N2 - Die molekularen Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion bei der durch den Zestoden Echinococcus multilocularis ausgelösten Erkrankung der alveolären Echinokokkose sind bislang ungeklärt. Zudem liegen keine Daten über Entwicklungs- und Differenzierungsmechanismen dieses Parasiten vor, die für die Entwicklung neuer Antiparasitika genutzt werden könnten. Ein bei der Evolution der Metazoen bereits frühzeitig entstandener Signaltransduktionsmechanismus zur Steuerung von Entwicklungsvorgängen ist das TGFβ/BMP-System, das aus strukturell verwandten Zytokinen der TGFβ (transforming growth factor β) bzw. BMP (bone morphogenetic protein)-Familie, oberflächenständigen Rezeptoren der TGFβ-Rezeptorfamilie (Typ I und Typ II) und intrazellulären Signaltransduktoren der Smad-Familie besteht. Außer an Entwicklungsvorgängen tierischer Organismen könnte diesem System eine wichtige Rolle bei der Wirt-Helminth-Kommunikation während Infektionsprozessen zukommen, wie in vorherigen Studien am Nematoden Brugia malayi und am Trematoden Schistosoma mansoni gezeigt werden konnte. Erste, wichtige Schritte zur Charakterisierung von TGFβ und BMP-Signalsystemen in Zestoden wurden in der vorliegenden Arbeit getan. Aufbauend auf einem vorherigen Bericht zu einem Transmembranrezeptor (EmRSK1) und einem Smad-Homologen (EmSmadA) aus Echinococcus multilocularis wurde die Liste der TGFβ/BMP Signaltransduktionsfaktoren in E. multilocularis in dieser Arbeit deutlich erweitert und erstmals umfangreiche funktionelle Studien durchgeführt. Die hier charakterisierten Faktoren umfassen zwei weitere Serin/Threonin-Kinasen der TGFβ/BMP-Rezeptorfamilie (EmRSK2, EmRSK3) sowie intrazelluläre Transduktoren der R-Smad-Subfamilie (EmSmadB, EmSmadC) und ein Homologes zur MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), genannt EmTAK1. Zudem konnte erstmals für einen parasitären Helminthen ein Zytokin der BMP-Subfamilie, EmBMP, auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen legen nahe, dass E. multilocularis sowohl ein TGFβ wie auch ein BMP-Signalsystem exprimiert. Ersteres wird sehr wahrscheinlich durch die Kinase EmRSK2 und den Smad-Faktor EmSmadC gebildet, letzteres durch EmRSK1 und EmSmadB. EmSmadA nimmt eine Sonderstellung ein, da es sowohl durch TGFβ- wie auch durch BMP-Rezeptoren aktiviert werden kann. Die genaue Rolle von EmRSK1 und EmTAK1 wäre durch weitere Untersuchungen zu klären. Signifikante funktionelle Homologien zwischen den TGFβ/BMP-Signalsystemen des Parasiten und Säugern konnten nachgewiesen werden, die sich u.a. darin äußern, dass die Echinococcus Smad-Proteine durch entsprechende Rezeptoren des Menschen aktiviert werden können. Darüber hinaus konnten jedoch auch einige deutliche Unterschiede zwischen den Systemen aus Parasit und Wirt nachgewiesen werden, die sich als Angriffspunkte zur Entwicklung von Chemotherapeutika eignen könnten. So fehlt den Smad-Faktoren EmSmadA und EmSmadC eine MH1-Domäne, die sonst unter allen R-Smads hoch konserviert ist. Zudem sind einige bislang noch nie beschriebene, strukturelle Besonderheiten der Echinococcus TGFβ/BMP-Rezeptoren zu verzeichnen. Auch die Regulation dieser Faktoren und die Kreuz-Interaktion mit weiteren intrazellulären Signalwegen (z.B. der MAP Kinase Kaskade) scheint in E. multilocularis anders zu verlaufen als bislang für Vertebraten, Insekten oder Nematoden beschrieben. Schließlich konnte, als sehr wichtiger Befund, auch nachgewiesen werden dass mindestens ein Rezeptor des Parasiten, EmRSK1, mit einem Zytokin des Wirts (BMP2) in vitro funktionell interagiert. Da BMP2 in Zellkultursystemen, die das Wachstum des Parasiten am befallenen Wirtsorgan nachstellen, einen deutlichen Effekt auf E. multilocularis ausübt, könnte die hier beschriebene EmRSK1/BMP2 – Interaktion von entscheidender Bedeutung für die Wirt-Parasit-Interaktion bei der alveolären Echinokokkose sein. N2 - Up to now, the molecular mechanisms of the interactions between host and parasite in the disease of alveolar echinococcosis, caused by the cestode Echinococcus multilocularis, are not understood. Furthermore there are not data available about the mechanisms of development and differentiation in this parasite that could be used for the design of novel antiinfectives. One of the signaling systems which emerged very early in metazoan evolution and which presumably controls developmental processes in all animals is the TGFβ signal transduction system. This system consists of various factors: structurally related cytokines of the TGFβ (transforming growth factor β) and the BMP (bone morphogenetic protein) family, surface associated receptors of the TGFβ receptor family (type I and type II) and intracellular signal transduction factors of the Smad family. In addition to their crucial role in animal development, TGFβ/BMP systems could also play an important role in the communication between host and helminths during an infection, as has been shown previous studies on the nematode Brugia malayi and the trematode Schistosoma mansoni. In this study, the initial steps towards a characterization of TGFβ/BMP signaling in the third large group of parasitic helminths, the cestodes, have been made. Adding to a previous report on a transmembrane receptor (EmRSK1) and a Smad homologue (EmSmadA) from E. multilocularis, this work significantly extends the list of known TGFβ/BMP signaling factors from Echinococcus and provides, for the first time, functional studies on these systems. The newly characterized factors comprise two further serin/threonin kinases of the TGFβ/BMP receptor family (EmRSK2, EmRSK3), two further intracellular transducing factors belonging to the subfamiliy of R-smads (EmSmadB, EmSmadC) and one homologue of the MAP-kinase-kinase-kinase TAK1 (TGFβ activated kinase 1), which was designated EmTAK1. Furthermore, and for the first time in a parasitic helminth, a cytokine of the BMP subfamily was characterized on the molecular level. Structural and functional studies suggested that E. multilocularis expresses both a TGFβ and a BMP signaling system. The kinase EmRSK2 and the Smad factor EmSmadC are most probably components of the first, EmRSK1 and EmSmadB parts of the latter system. Surprisingly, EmSmadA seems to constitute an unusual Smad since it can be activated by both TGFβ and the BMP receptors upon expression in mammalian cells. The precise roles of EmRSK3 and EmTAK1 have to be determined in future studies. In the present work, significant structural and functional homologies between the TGFβ/BMP systems of E. multilocularis and its mammalian hosts have been detected. Upon expression in human cells, the Echinococcus Smad proteins were, for example, able to functionally interact with the corresponding receptors from Homo sapiens. On the other hand, the E. multilocularis TGFβ/BMP signaling factors also displayed several biochemical differences to those of the host, which could be exploited for the development of antiparasitic drugs. One of these differences is the lack of a usually conserved MH1 domain in EmSmadA and EmSmadC. Moreover, the Echinococcus TGFβ/BMP receptors display several structural features which have not yet been detected in other members of the protein superfamily. Likewise, the regulation of TGFβ/BMP pathways in Echinococcus as well as their cross-interaction with other signaling pathways (e.g. the MAP kinase cascade) seems to differ from the situation in vertebrates, insects and nematodes. Finally, this work also provides evidence that at least one host cytokine, BMP-2, can functionally interact with a receptor of the parasite, EmRSK1. This interaction could be highly relevant for host-parasite interaction mechanisms in alveolar echinococcosis since BMP-2 also exerts clear effects on Echinococcus growth and differentiation in an in vitro cultivation system that mimicks the situation at the affected organ during an infection. KW - Fuchsbandwurm KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Echinococcus KW - TGFß KW - BMP KW - Smad KW - Zestode KW - Echinococcus KW - TGFß KW - BMP KW - Smad KW - cestode Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17755 ER - TY - THES A1 - Schauß, Astrid Claudia T1 - Charakterisierung des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1p mittels quantitativer hochauflösender Lichtmikroskopie T1 - Characterization of the mitochondrial fission protein Dnm1p using quantitative high resolution light microscopy N2 - Mitochondrien verändern dynamisch durch ein balanciertes Verhältnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schlülsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und äußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verläuft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubulären Strang an und trennt GTP-abhängig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung für die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p für die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschnürungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Größe der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zusätzlich werden auch neue hochauflösende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Größenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsstämmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, während in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gestört erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die überwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarität ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsstämmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerstörung des Aktin-Gerüstes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zusätzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer Ähnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erfüllen. N2 - Mitochondrial networks dynamically change their shape by balanced fission and fusion in response to internal and external signals. The key protein in mitochondrial fission, the dynamin-related GTPase Dnm1p, is characterised in this study. Because of their endosymbiotic origin mitochondria possess two membranes, whose separations must be coordinated. Using photoconvertable GFP, it is shown that the division of outer and inner membranes are tightly coupled in S. cerevisiae. This separation is due to the GTPase Dnm1p, but the adaptor proteins Mdv1p and Caf4p, as well as the membrane anchor Fis1p, are also involved in mitochondrial division in yeast. Dnm1p forms spirals around the mitochondrial tubes and separates them in a GTPase-dependant manner. Matrix constrictions are presumably one precondition for the formation of spirals. In this work it is shown that Dnm1p as well as Fis1p are not essential for the formation for this mitochondrial narrowing. The main focus of the work is the analysis of the distribution, orientation and size of the epitope-tagged Dnm1p clusters in yeast cells. Additionally, the influence of the other division proteins, Fis1p, Mdv1p and Caf4p, on these Dnm1p characteristics is determined. The analysis is based on both quantitative confocal images and high resolution 4Pi and STED microscopy, for better localization and determination of the cluster sizes. The results demonstrate that in wild type and Mdv1p deletion cells, the majority of clusters are associated with mitochondria, whereas the recruitment of Dnm1p-clusters is disturbed in Fis1p and Caf4p deletion cells. While just a few clusters form spirals around matrix constrictions, the overwhelming majority of clusters, which are not involved in an actual fission process, show a polar orientation towards the cell cortex in wild type and Mdv1p deletion cells. This polarity, described for the first time in this work, is abolished in Fis1 and Caf4p deletion cells, but is maintained after the destruction of the actin cytoskeleton. The results of this work point to an additional role of Dnm1p, together with Fis1p and Caf4p, in the attachment of mitochondria to the cell cortex. Furthermore it is shown that the adaptor proteins Mdv1p and Caf4p have different roles within the cell despite of their molecular similarity. KW - Hefeartige Pilze KW - Mitochondrium KW - Mikroskopie KW - Mitochondrien KW - Dynamik KW - Hefe KW - STED KW - 4Pi KW - mitochondria KW - dynamic KW - yeast KW - STED KW - 4Pi Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17566 ER - TY - THES A1 - Groh, Claudia T1 - Environmental influences on the development of the female honeybee brain Apis mellifera T1 - Der Einfluss von Umweltfaktoren auf die Entwicklung des Gehirns der weiblichen Honigbiene Apis mellifera N2 - Für die Honigbiene spielt der Geruchssinn eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation innerhalb des Sozialstaates. Kastenspezifische, auf uweltbedingten Einflüssen basierende sowie altersbedingte Unterschiede im olfaktorisch gesteuerten Verhalten liefern ein hervorragendes Modellsystem für diese Studie, um die Entwicklung und Funktion neuronaler Plastizität im olfaktorischen System zu untersuchen. Diese Studie konzentriert sich auf Unterschiede zwischen Königinnen und Arbeiterinnen, den beiden weiblichen Kasten innerhalb des Bienestaates, sowie auf umweltbedingte Plastizität. Diploide Eier, aus denen sich Königinnen und Arbeiterinnen entwickeln, sind genetisch identisch. Dennoch entwickeln sich Königinnen wesentlich schneller zum Adulttier als Arbeiterinnen, sind als Imago größer, leben wesentlich länger und zeigen andere Verhaltensweisen. Diese Unterschiede werden durch eine differentielle larvale Fütterung initiiert. Im Anschluss an das Larvenstadium und somit nach erfolgter Kastendetermination, entwickeln sich die Bienen über eine Puppenphase (verdeckelte Phase) zum Imago. Adulte Bienen klimatisieren das zentrale Brutareal auf einer mittleren Temperatur von 35°C konstant. Bienen, die bei niedrigeren Temperaturen innerhalb des physiologisch relevanten Bereichs aufwachsen, weisen Defizite im olfaktorischen Lernverhalten und in der Tanzkommunikation auf. Mögliche neuronale Korrelate für altersbedingte, temperatur- und kastenspezifische Unterschiede im olfaktorisch gesteuerten Verhalten sollten in dieser Arbeit betrachtet werden. Die strukturellen Analysen konzentrierten sich dabei auf primäre (Antennalloben) und sekundäre (Pilzkörper-Calyces)olfaktorische Verarbeitungszentren im Gehirn von sich entwickelnden und adulten Tieren beider Kasten. Synchron verdeckelte Brutzellen beider Kasten wurden unter kontrollierten Bedingungen im Inkubator herangezogen. Neuroanatomische Untersuchungen wurden an fixierten Gewebeschnitten mittels einer Doppelfluoreszenzfärbung mit Fluor-Phalloidin und anti-Synapsin Immuncytochemie durchgeführt. Diese Doppelmarkierung ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung individueller Synapsenkomplexe (Microglomeruli) im Pilzkörper-Calyx. Phalloidin bindet an verschiedene F-Aktin Isoformen und kann zum Nachweis von F-Aktin im Insektennervensystem verwendet werden. F-Aktin wird während der Entwicklung in Wachstumskegeln und in adulten Gehirnen in präsynaptischen Endigungen und dendritischen Dornen exprimiert. Präsynaptische Elemente wurden durch den Einsatz eines spezifischen Antikörpers gegen das Drosophila-Vesikeltransportprotein Synapsin I charakterisiert. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie wurde die exakte räumliche Zuordnung der Fluoreszenzsignale anhand optischer Schnitte durch die Präparate realisiert. Anhand dieser Methodik konnten erstmals über reine Volumenanalysen hinausgehende Messungen zur synaptischen Strukturplastizität im Pilzkörper-Calyx durchgeführt werden. Die Untersuchungen an Gehirnen in den verschiedenen Puppenstadien zeigten Unterschiede im Entwicklungsverlauf der Gehirne mit dem Fokus auf die Bildung antennaler Glomeruli und calycaler Microglomeruli. Unterschiede in der Gehirnentwicklung verdeutlichten die ontogenetische Plastizität des Gehirns der Honigbiene. Entsprechend der kürzeren Puppenphase der Königinnen bildeten sich sowohl antennale Glomeruli als auch alle Untereinheiten (Lippe, Collar, Basalring) des Calyx etwa drei Tage früher aus. Direkt nach dem Schlupf zeigten quantitative Analysen innerhalb der Pilzkörper-Calyces eine signifikant geringere Anzahl an Microglomeruli bei Königinnen. Diese neuronale Strukturplastizität auf verschiedenen Ebenen der olfaktorischen Informationsverarbeitung korreliert mit der kastenspezifischen Arbeitsteilung. Die Arbeit liefert Erkenntnisse über den Einfluss eines wichtigen kontrollierten Umweltparameters, der Bruttemperatur, während der Puppenphase auf die synaptische Organisation der adulten Pilzkörper-Calyces. Bereits geringe Unterschiede in der Aufzuchtstemperatur (1°C) beeinflussten signifikant die Anzahl von Microglomeruli in der Lippenregion des Calyx beider weiblicher Kasten. Die maximale Anzahl an MG entwickelte sich bei Arbeiterinnen bei 34.5°C, bei Königinnen aber bei 33.5°C. Neben dieser entwicklungsbedingten neuronalen Plastizität zeigt diese Studie eine starke altersbedingte Strukturplastizität der MG während der relativ langen Lebensdauer von Bienenköniginnen. Hervorzuheben ist, dass die Anzahl an MG in der olfaktorischen Lippenregion mit dem Alter anstieg (~55%), in der angrenzenden visuellen Collarregion jedoch abnahm (~33%). Die in der vorliegenden Arbeite erstmals gezeigte umweltbedingte Entwicklungsplastizität sowie altersbedingte synaptische Strukturplastizität in den sensorischen Eingangsregionen der Pilzkörper-Calyces könnte kasten- und altersspezifischen Anpassungen im Verhalten zugrunde liegen. N2 - Olfaction plays an important role in a variety of behaviors throughout the life of the European honeybee. Caste specific, environmentally induced and aging/experiencedependent differences in olfactory behavior represent a promising model to investigate mechanisms and consequences of phenotypic neuronal plasticity within the olfactory pathway of bees. This study focuses on the two different female phenotypes within the honeybee society, queens and workers. In this study, for the first time, structural plasticity in the honeybee brain was investigated at the synaptic level. Queens develop from fertilized eggs that are genetically not different from those that develop into workers. Adult queens are larger than workers, live much longer, and display different behaviors. Developmental trajectory is mainly determined by nutritional factors during the larval period. Within the subsequent post-capping period, brood incubation is precisely controlled, and pupae are incubated close to 35°C via thermoregulatory activity of adult workers. Behavioral studies suggest that lower rearing temperatures cause deficits in olfactory learning in adult bees. To unravel possible neuronal correlates for thermoregulatory and caste dependent influences on olfactory behavior, I examined structural plasticity of developing as well as mature olfactory synaptic neuropils. Brood cells were reared in incubators and pupal as well as adult brains were dissected for immunofluorescent staining. To label synaptic neuropils, I used an antibody to synapsin and fluophore-conjugated phalloidin which binds to filamentous (F-) actin. During development, neuronal F-actin is expressed in growing neurons, and in the mature nervous system, F-actin is most abundant in presynaptic terminals and dendritic spines. In the adult brains, this double labeling technique enables the quantification of distinct synaptic complexes microglomeruli [MG]) within olfactory and visual input regions of the mushroom bodies (MBs) prominent higher sensory integration centers. Analyses during larval-adult metamorphosis revealed that the ontogenetic plasticity in the female castes is reflected in the development of the brain. Distinct differences among the timing of the formation of primary and secondary olfactory neuropils were also revealed. These differences at different levels of the olfactory pathway in queens and workers correlate with differences in tasks performed by both female castes. In addition to caste specific differences, thermoregulation of sealed brood cells has important consequences on the synaptic organization within the MB calyces of adult workers and queens. Even small differences in rearing temperatures affected the number of MG in the olfactory calyx lip regions. In queens, the highest number of MG in the olfactory lip developed at 1°C below the temperature where the maximum of MG is found in workers (33.5 vs. 34.5°C). Apart from this developmental neuronal plasticity, this study exhibits a striking age-related plasticity of MG throughout the extended life span of queens. Interestingly, MG numbers in the olfactory lip increased with age, but decreased within the adjacent visual collar of the MB calyx. To conclude, developmental and adult plasticity of the synaptic circuitry in the sensory input regions of the MB calyx may underlie caste- and age-specific adaptations and long-term plasticity in behavior. KW - Biene KW - Neuroethologie KW - Geruchswahrnehmung KW - Gehirn KW - Ontogenie KW - Neuroethologie KW - Pilzkörper KW - Strukturplastizität KW - Mikroglomerulus KW - Honigbiene KW - soziale Insekten KW - neuroethology KW - mushroom body KW - structural plasticity KW - microglomerulus KW - honeybee KW - social insects Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17388 ER - TY - THES A1 - Thakar, Juilee T1 - Computational models for the study of responses to infections T1 - Bioinformatische Modelle zur Analyse der Immunantwort auf Infektionen N2 - In diesem Jahrhundert haben neue experimentelle Techniken und Computer-Verfahren enorme Mengen an Information erzeugt, die bereits viele biologische Rätsel enthüllt haben. Doch die Komplexität biologischer Systeme wirft immer weitere neue Fragen auf. Um ein System zu verstehen, bestand der Hauptansatz bis jetzt darin, es in Komponenten zu zerlegen, die untersucht werden können. Ein neues Paradigma verknüpft die einzelnen Informationsteile, um sie auf globaler Ebene verstehen zu können. In der vorgelegten Doktorarbeit habe ich deshalb versucht, infektiöse Krankheiten mit globalen Methoden („Systembiologie“) bioinformatisch zu untersuchen. Im ersten Teil wird der Apoptose-Signalweg analysiert. Apoptose (Programmierter Zelltod) wird bei verschiedenen Infektionen, zum Beispiel bei Viruserkrankungen, als Abwehrmaßnahme eingesetzt. Die Interaktionen zwischen Proteinen, die ‚death’ Domänen beinhalten, wurden untersucht, um folgende Fragen zu klären: i) wie wird die Spezifität der Interaktionen erzielt? –sie wird durch Adapter erreicht, ii) wie werden Proliferation/ Überlebenssignale während der Aktivierung der Apoptose eingeleitet? – wir fanden Hinweise für eine entscheidende Rolle des RIP Proteins (Rezeptor-Interagierende Serine/Threonine-Proteinkinase 1). Das Modell erlaubte uns, die Interaktions-Oberflächen von RIP vorherzusagen. Der Signalweg wurde anschließend auf globaler Ebene mit Simulationen für verschiedene Zeitpunkte analysiert, um die Evolution der Aktivatoren und Inhibitoren des Signalwegs und seine Struktur besser zu verstehen. Weiterhin wird die Signalverarbeitung für Apoptosis-Signalwege in der Maus detailliert modelliert, um den Konzentrationsverlauf der Effektor-Kaspasen vorherzusagen. Weitere experimentelle Messungen von Kaspase-3 und die Überlebenskurven von Zellen bestätigen das Modell. Der zweite Teil der Resultate konzentriert sich auf das Phagosom, eine Organelle, die eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Krankheitserregern spielt. Dies wird am Beispiel von M. tuberculosis veranschaulicht. Die Fragestellung wird wiederum in zwei Aspekten behandelt: i) Um die Prozesse, die durch M. tuberculosis inhibiert werden zu verstehen, haben wir uns auf das Phospholipid-Netzwerk konzentriert, das bei der Unterdrückung oder Aktivierung der Aktin-Polymerisation eine große Rolle spielt. Wir haben für diese Netzwerkanalyse eine Simulation für verschiedene Zeitpunkte ähnlich wie in Teil eins angewandt. ii) Es wird vermutet, dass Aktin-Polymere bei der Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom eine Rolle spielen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde ein in silico Modell von uns entwickelt. Wir fanden heraus, dass in der Anwesenheit von Aktin-Polymeren die Suchzeit für das Lysosom um das Fünffache reduziert wurde. Weiterhin wurden die Effekte der Länge der Aktin-Polymere, die Größe der Lysosomen sowie der Phagosomen und etliche andere Modellparameter analysiert. Nach der Untersuchung eines Signalwegs und einer Organelle führte der nächste Schritt zur Untersuchung eines komplexen biologischen Systems der Infektabwehr. Dies wurde am Beispiel der Wirt-Pathogen Interaktion bei Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica dargestellt. Die geringe Menge verfügbarer quantitativer Daten war der ausschlaggebende Faktor bei unserer Modellwahl. Für die dynamische Simulation wurde ein selbst entwickeltes Bool’sches Modell verwendet. Die Ergebnisse sagen wichtige Faktoren bei der Pathologie von Bordetellen hervor, besonders die Bedeutung der Th1 assoziierten Antworten und dagegen nicht der Th2 assoziierten Antworten für die Eliminierung des Pathogens. Einige der quantitativen Vorhersagen wurden durch Experimente wie die Untersuchung des Verlaufs einer Infektion in verschiedenen Mutanten und Wildtyp-Mäusen überprüft. Die begrenzte Verfügbarkeit kinetischer Daten war der kritische Faktor bei der Auswahl der computer-gestützten Modelle. Der Erfolg unserer Modelle konnte durch den Vergleich mit experimentellen Beobachtungen belegt werden. Die vergleichenden Modelle in Kapitel 6 und 9 können zur Untersuchung neuer Wirt-Pathogen Interaktionen verwendet werden. Beispielsweise führt in Kapitel 6 die Analyse von Inhibitoren und inhibitorischer Signalwege aus drei Organismen zur Identifikation wichtiger regulatorischer Zentren in komplexen Organismen und in Kapitel 9 ermöglicht die Identifikation von drei Phasen in B. bronchiseptica und der Inhibition von IFN-γ durch den Faktor TTSS die Untersuchung ähnlicher Phasen und die Inhibition von IFN-γ in B. pertussis. Eine weitere wichtige Bedeutung bekommen diese Modelle durch die mögliche Identifikation neuer, essentieller Komponenten in Wirt-Pathogen Interaktionen. In silico Modelle der Effekte von Deletionen zeigen solche Komponenten auf, die anschließend durch experimentelle Mutationen weiter untersucht werden können. N2 - In this century new experimental and computational techniques are adding an enormous amount of information, revealing many biological mysteries. The complexities of biological systems still broach new questions. Till now the main approach to understand a system has been to divide it in components that can be studied. The upcoming new paradigm is to combine the pieces of information in order to understand it at a global level. In the present thesis we have tried to study infectious diseases with such a global ‘Systems Biology’ approach. In the first part the apoptosis pathway is analyzed. Apoptosis (Programmed cell death) is used as a counter measure in different infections, for example viral infections. The interactions between death domain containing proteins are studied to address the following questions: i) How specificity is maintained - showing that it is induced through adaptors, ii) how proliferation/ survival signals are induced during activation of apoptosis – suggesting the pivotal role of RIP. The model also allowed us to detect new possible interacting surfaces. The pathway is then studied at a global level in a time step simulation to understand the evolution of the topology of activators and inhibitors of the pathway. Signal processing is further modeled in detail for the apoptosis pathway in M. musculus to predict the concentration time course of effector caspases. Further, experimental measurements of caspase-3 and viability of cells validate the model. The second part focuses on the phagosome, an organelle which plays an essential role in removal of pathogens as exemplified by M. tuberculosis. Again the problem is addressed in two main sections: i) To understanding the processes that are inhibited by M. tuberculosis; we focused on the phospholipid network applying a time step simulation in section one, which plays an important role in inhibition or activation of actin polymerization on the phagosome membrane. ii) Furthermore, actin polymers are suggested to play a role in the fusion of the phagosome with lysosome. To check this hypothesis an in silico model was developed; we find that the search time is reduced by 5 fold in the presence of actin polymers. Further the effect of length of actin polymers, dimensions of lysosome, phagosome and other model parameter is analyzed. After studying a pathway and then an organelle, the next step was to move to the system. This was exemplified by the host pathogen interactions between Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica. The limited availability of quantitative information was the crucial factor behind the choice of the model type. A Boolean model was developed which was used for a dynamic simulation. The results predict important factors playing a role in Bordetella pathology especially the importance of Th1 related responses and not Th2 related responses in the clearance of the pathogen. Some of the quantitative predictions have been counterchecked by experimental results such as the time course of infection in different mutants and wild type mice. All these computational models have been developed in presence of limited kinetic data. The success of these models has been validated by comparison with experimental observations. Comparative models studied in chapters 6 and 9 can be used to explore new host pathogen interactions. For example in chapter 6, the analysis of inhibitors and inhibitory paths in three organism leads to the identification of regulatory hotspots in complex organisms and in chapter 9 the identification of three phases in B. bronchiseptica and inhibition of IFN-γ by TTSS lead us to explore similar phases and inhibition of IFN-γ in B. pertussis. Further an important significance of these models is to identify new components playing an essential role in host-pathogen interactions. In silico deletions can point out such components which can be further analyzed by experimental mutations. KW - Bordetella pertussis KW - Infektion KW - Apoptosis KW - Signaltransduktion KW - Bioinformatik KW - Tuberkelbakterium KW - Biologische Kaskaden KW - Bordetellae KW - M. tuberculosis KW - Apoptose KW - Biological cascades KW - Bordetellae KW - M. tuberculosis KW - Apoptosis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17266 ER - TY - THES A1 - Bertram, Helge T1 - Bioinformatische Identifikation von Domänenunterschieden bei Parasit und Wirt am Beispiel der Malaria T1 - Bioinformatic identification of domain differences in parasite and host using malaria as an example N2 - Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann. N2 - The objective of this thesis is to obtain information, which may be advantageous for biotechnical and medical purposes. In order to achieve this aim it is first necessary to identify protein domains and essential regulatory RNA elements. In case of regulatory RNA elements this is accomplished by investigating Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylocuccus aureus as a model. In this case these elements are found in much promising vicinity to open reading frames coding for proteins (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Even more significant for the purpose of developing pharmaceuticals against parasites are differences of structure and sequence in protein domains (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Their identification is shown in a potential transport protein in Plasmodium falciparum. Subsequently the interaction of regulatory elements and domains in networks is considered (including experimental data). The resulting observations may lead to general conclusions concerning network reaction, as well as specific applications. Our example and field of interest are redox networks and Plasmodia causing malaria. It is not possible to cover the redox network state of a living cell using only pH measurements. Therefore small crystals of glutathione reductase are employed as a more suitable indicator, whose signal is digitally amplified (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). In order to bioinformatically modulate complex redox networks techniques of metabolic flux analysis are presented. They are also improved particularly to advance the understanding of interdependences and to facilitate the correct comprehension of such networks with as few elementary flux modes as possible. In this thesis the reduction of the number of elementary modes of large and intertwined metabolic networks succeeds with various methods. This leads to a simpler model of complex metabolic functions. For each of the methods used in this process the biochemically justified definition of external and internal metabolites constitutes the basis (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). In a more general sense methods of protein domain classification and new strategies for the control of microbial pathogens are considered. In reference to automated classification of protein domains a new system by Taylor (2002b) is compared with traditional systems, which require a varying degree of human intervention (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). In addition different methods of acquiring information on the cellular metabolic network from genomic data is discussed (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11). Furthermore a survey of the main fields of bioinformatic research in Würzburg is given (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Finally it is outlined how pathogenicity and virulence of bacteria may be made accessible to bioinformatic analysis (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). In the conclusion metabolic flux analysis is used for the identification of new strategies in the battle against Plasmodia: The comparison of metabolic pathways with glutathione and thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles and man aims at raising planned dysfunctions in the metabolism of Plasmodium or Anopheles without harming the human host. Valuable suggestions for medical applications and pharmacological targets are obtained. KW - Plasmodium falciparum KW - Domäne KW - Klassifikation KW - Bioinformatik KW - Redoxsystem KW - Glutathion-Reductase KW - Malariamücke KW - Mensch KW - Stoffwechselweg KW - Malaria KW - metabolische Fluxanalyse KW - Glutathionreduktase KW - Iron Responsive Elements KW - Proteindomänenklassifikation KW - malaria KW - metabolic fluxanalysis KW - glutathione reductase KW - iron responsive elements KW - classification of protein domains Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17188 ER - TY - THES A1 - Schütz, Wolfgang T1 - Postmeiotische Expression und funktionelle Charakterisierung von Lamin B3 in der Spermatogenese der Maus T1 - Postmeiotic expression and functional characterisation of lamin B3 in mouse spermatogenesis N2 - Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3. N2 - Lamins are members of a protein family that are the main structural elements of the nuclear envelope in eukaryotic cells. Differentiated mammalian somatic cells express lamins A, C, B1 and B2. The composition and structural organisation of the nuclear lamina in spermatogenic cells differ significantly from that of somatic cells: among the somatic lamins they only express lamin B1 but, additionally, two germ line-specific isoforms could be found, namely lamins C2 and B3. This study contains a detailed investigation of the expression pattern and localisation of lamin B3 during mouse spermatogenesis. By combining RT-PCR, immunoblotting, and immunofluorescence microscopy, it turned out, that lamin B3 is selectively expressed in postmeiotic stages during spermiogenesis. In round spermatids, lamin B3 is distributed in the nuclear periphery and, notably, also in the nucleoplasm. In the course of spermiogenesis, lamin B3 becomes redistributed as it concentrates progressively to the posterior pole of spermatid nuclei. The results show that during mammalian spermiogenesis the nuclear lamina is composed of B-type isoforms only, namely lamin B1 and the germ line-specific lamin B3. Lamin B3 is the first example of a mammalian lamin that is selectively expressed during postmeiotic stages of spermatogenesis. When ectopically expressed in culture cells, lamin B3 causes severe deformation of nuclei which adopt a hook-like configuration. Transfection experiments in COS-7 cells could prove that the observed nuclear deformations are due to the shortened rod domain of lamin B3. Cell fractionation experiments revealed that lamin B3 can be solubilised more easily than lamin B2. In addition, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) analyses of transfected COS-7 cells showed that considerable amounts of lamin B3 molecules exhibit a significantly increased mobility compared to lamin B2. The increased solubility of lamin B3 compared to lamin B2 as well as the mobility of that protein is only determined by its shortened rod domain. Taken together, these data lead to the conclusion that lamin B3 reduces the stability of the nuclear periphery, what might be an important prerequisite for some reorganisation processes during spermiogenesis to occur. Via a pull-down assay using a fusion protein containing GST and the 84 amino acid long N-terminal domain of lamin B3 a screen for interaction partners of lamin B3 was performed. With MSY2, MSY2a and MSY4 three interesting candidates were found. These proteins belong to the large family of Y-box containing proteins, which are DNA and RNA binding proteins. They are involved in storage and subsequent translation of various mRNAs, e.g. the mRNA of protamine 1 (this mechanism for regulation of gene expression is a major principle in spermatogenesis). The interaction between lamin B3 and the Y-box proteins has to be verified but it would provide an additional link between reorganisation of chromatin and the nuclear envelope as it has already been reported for other proteins of the nuclear envelope like GCL or LBR. Besides that it could be a first evidence for a specific function of the lamin B3 N-terminal domain. KW - Maus KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamin B KW - Genexpression KW - Spermatogenese KW - Kernlamina KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Lamin B3 KW - Spermiogenese KW - spermatogenesis KW - nuclear lamina KW - nuclear envelope KW - lamina KW - lamin B3 KW - spermiogenesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17110 ER -