TY  - THES
A1  - Kober, Christina
T1  - Characterization of Murine GL261 Glioma Models for Oncolytic Vaccinia Virus Therapy
T1  - Charakterisierung onkolytischer Vaccinia Virus Therapie in murinen Gliommodellen
N2  - Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system. 
It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models. 
In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected. 
Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine
In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development.
N2  - Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Die Prognose für GBM ist mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten sehr schlecht. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit stellt die onkolytische Virustherapie dar. Ein vielversprechender Kandidat ist das Vaccinia-Virus. Die große Diskrepanz zwischen der onkolytischen Effektivität in Zellkultur und den Ergebnissen im Mausmodell ist oftmals auf physiologische Komponenten im Tumor-Mikromilieu zurückzuführen. Die Zusammensetzung von Immunzellen im Mikromilieu variiert zwischen verschiedenen Krebsarten und Patienten und wird als Biomarker angewendet. Um eine erfolgreiche Virustherapie für GBM zu etablieren, wird ein umfangreiches Verständnis der Tumorbiologie, des Tumormikromilieus und des Immunsystems vorausgesetzt. 
Es wurde gezeigt, dass LIVP 1.1.1, ein attenuiertes wildtypisches VACV-Isolat, in der murinen GL261 Gliom-Zelllinie repliziert und zum Absterben der Zellen führt. Daraufhin wurde die Replikationseffizienz von LIVP 1.1.1 durch einen vergleichenden Ansatz in murinen GL261-Gliomen im Mausmodell untersucht. Es wurden immunkompetente C57BL/6-wildtypische (wt) Mäuse und immundefiziente Mausstämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund, C57BL/6 athymisch und Balb/c athymisch, verwendet. Zudem wurden unterschiedliche Tumor-Lokalisationen, subkutan und intrakranial analysiert. Ausschließlich im subkutanen Tumormodell der Balb/c athymischen Mäuse fand eine effektive Replikation der Viren statt. Eine detaillierte Charakterisierung des Mikromilieus zum Zeitpunkt der Infektion zeigte, dass die Implantation derselben Tumorzellen in unterschiedliche Mausstämme zur Entwicklung eines unterschiedlichen Tumormikromilieus und einer variierenden Zusammensetzung von Immunzellen führt. Die C57BL/6-wt-Mäuse wiesen eine starke proinflammatorische Signatur auf. Des Weiteren zeigte die Studie signifikante Unterschiede in der MHCII-Expression: Die prominenteste Expression wurde in C57BL/6-wt-Mäusen detektiert. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, wodurch die phänotypischen Veränderungen in den GL261-Zellen, verbunden mit der Hochregulierung von MHCII ausgelöst wurden und welche Konsequenzen dies für die virale Infektion dieser Zellen hat. Durch einen direkten Vergleich von C57BL/6-wt-Mäusen und C57BL/6-IFN-γ-Knockout Mäusen konnte IFN-γ als verantwortlicher Faktor im Tumormikromilieu identifiziert werden, welcher für die Reduktion des Virustiters und für die Hochregulierung von MHCII in den C57BL/6-wt-Mäusen verantwortlich ist. Der durch endogenes IFN-γ ausgelöste anti-virale Effekt war reversibel. 
Des Weiteren wurden Gründe für die Hemmung der viralen Replikation in den orthotopen Gliom-Modellen aufgeklärt. Durch immunhistochemische Analysen von Mikroglia und Astrozyten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Menge und Verteilung der Gliazellen in diesen Tumoren unabhängig von der Virus-Applikation war. Gliomzellen, Mikroglia und Astrozyten, wurden daraufhin untersucht. Im Vergleich zur starken Replikation in GL261-Zellen, ließen BV-2-Mikroglia und IMA 2.1-Astrozyten, nur eine sehr schwache Replikation von LIVP 1.1.1 zu. Ko-Kultivierungsversuche wiesen darauf hin, dass Mikroglia um die Aufnahme der Viruspartikel mit den Tumorzellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass das LIVP 1.1.1 unterschiedliche Eigenschaften des Zelltods in den Zellen auslösen kann. BV-2 wiesen verstärkte Charakteristika der Apoptose auf während in GL261-Zellen nekrotische Eigenschaften überwogen. In BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp wurde eine weitere Reduktion der viralen Infektion festgestellt. Die Infektion von IMA-2.1-Zellen war unabhängig vom induzierten M1/M2 Phänotyp. Die Applikation von BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp auf organotypische Schnittkulturen mit implantierten GL261-Tumoren resultierte in einer reduzierten Infektion der BV-2-Zellen und einer verstärkten Infektion der GL261-Zellen.
Es wurde gezeigt, dass GL261-Tumore durch den immunologischen und genetischen Hintergrund der Umgebung geprägt wurden. Es wurde ein Modell entwickelt, welches das Prinzip der personalisierten Medizin widerspiegelt. 
In einem zusätzlichen Projekt wurde, basierend auf Genexpressionsdaten und bioinformatischer Auswertung, die biologische Funktion des anti-apoptotischen Faktors AVEN hinsichtlich der onkolytischen Virustherapie mit dem VACV GLV-1h68 analysiert. Für diese Studie wurden vier humane Zelllinien untersucht. Neben einem Vergleich der Replikationseffizienz des VACV GLV-1h68 und der VACV-vermittelten Zelllyse wurde gezeigt, dass AVEN, in allen untersuchten Zellen exprimiert wird. Am Beispiel von HT-29 und 1936-MEL wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von AVEN durch siRNA zu einer Erhöhung der apoptotischen Eigenschaften und Abnahme der VACV Infektion führt. Die Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung zukünftiger genetisch veränderter VACV.
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Glioblastom
KW  - Onkolytische Vaccinia Virustherapie
KW  - Mikroglia
KW  - Astrozyten
KW  - Oncolytic Vaccinia Virus Therapy
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118556
ER  - 
TY  - THES
A1  - Memmel, Simon
T1  - Automatisierte Algorithmen zur Analyse der Migration und der strahleninduzierten DNA-Schäden humaner Glioblastomzellen nach kombinierter PI3K/mTOR/Hsp90-Inhibierung
T1  - Automated algorithms for the analysis of cell migration and radiation induced DNA-damage in human glioblastoma cells after combined PI3K/mTOR/Hsp90 inhibition
N2  - Das hohe invasive Potential und die starke Resistenz gegen Radio-/Chemotherapie von Glioblastoma multiforme (GBM) Zellen machen sie zu dem tödlichsten Tumor ihrer Art. Es ist deshalb von großem Interesse die Grundlagen, welche der Migrationsfähigkeit und DNA Reparatur zu Grunde liegen, besser zu verstehen. 
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden zwei Algorithmen zur automatischen Analyse der Migration in der Einzelzellverfolgung und im Wundheilungsassay modifiziert. Die Auswertung der Daten konnte automatisch und somit schnell, effektiv und mit geringerem Arbeitsaufwand durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser automatischen Algorithmen wurde die Migrationsfähigkeit von zwei GBM-Zelllinien (DK-MG und SNB19) untersucht. Zusätzlich wurde die konfokale Laserscanning- sowie die hochauflösende dSTORM-Fluoreszenzmikroskopie verwendet um die, der Zellbewegung zu Grunde liegende, Struktur des F Aktin und der fokalen Adhäsionskinase (FAK) aufzulösen und darzustellen. Unter Anwendung dieser genannten Methoden sind die Effekte des dualen PI3K/mTOR Inhibitors PI-103 alleine und in Kombination mit dem Hsp90 Inhibitor NVP AUY922 mit und ohne Bestrahlung auf die Bewegung untersucht worden. Es konnte festgestellt werden, dass sich beide Zelllinien deutlich in ihrem migratorischem Potential in vitro unterscheiden und zudem auch markante Unterschiede in ihrer Morphologie aufweisen. Die weniger invasiven DK MG-Zellen besitzen eine polarisierte Zellstruktur, wohingegen SNB19-Zellen sich durch multipolare ungerichtete Bewegung auszeichneten. Zudem wurde die Migration, durch PI3K/mTOR Inhibition mit PI-103 bei den DK-MG-Zellen (p53 wt, PTEN wt), sehr effektiv unterdrückt. Wohingegen sich die SNB19-Zellen (p53 mut, PTEN mut) resistent gegen diesen Inhibitor zeigten. Hsp90 Inhibition offenbarte in beiden Zelllinien einen starken inhibitorischen Effekt auf die Migration der Zellen sowie die Reorganisierung des F Aktinskelettes.
In der zweiten Hälfte dieser Arbeit wurde ein Augenmerk auf die DNA-DSB-Reparatur der GBM Zellen nach ionisierender Strahlung gelegt. Zunächst wurde eine automatische Analysesoftware „FocAn-3D“ entwickelt, mit dessen Hilfe die DNA Doppelstrangbruchreparaturkinetik untersucht werden sollte. Diese Software ermöglicht es die gesamten Zellkerne mit ihren γH2AX-Foci in 3D-cLSM-Aufnahmen zu untersuchen. Es konnte somit eine Verbesserung der Genauigkeit in der Auszählung der γH2AX-Foci erreicht werden, welche 2D beschränkter Software verwehrt bleibt. Mit FocAn-3D konnte der gesamte Verlauf der Induktions- und Abbauphase der γH2AX-Foci in DK MG- und SNB19-Zellen mit einem mathematischen Modell ausgewertet und dargestellt werden. Des Weiteren wurde die Nanometerstruktur von γH2AX- und pDNA-PKcs-Foci mittels hochauflösender dSTORM-Mikroskopie untersucht. Konventionelle Mikroskopiemethoden, begrenzt durch das Beugungslimit und einer Auflösung von ~200 nm, konnten die Nanometerstruktur (<100 nm) der Reparaturfoci bisher nicht darstellen. Mit Hilfe der beugungsunbegrenzten dSTORM-Mikroskopie war es möglich in DK MG- und SNB19-Zellen die Nanometerstruktur genannten Reparaturproteine in den Foci mit einer Auflösung von bis zu ~20 nm darzustellen. γH2AX-Foci zeigten sich als eine Verteilung aus einzelnen Untereinheiten („Nanofoci“) mit einem Durchmesser von ~45 nm. Dies lässt die Vermutung zu, dass es sich hier um die elementare Substruktur der Foci und somit der γH2AX enthaltenen Nukleosome handelt. DNA-PK-Foci wiesen hingegen eine diffusere Verteilung auf.
Die in dieser Arbeit ermittelten Unterschiede im Migrationsverhalten der Zellen rechtfertigen eine weitere präklinische Untersuchung der verwendeten Inhibitoren als potentielle Zelltherapeutika für die Behandlung von GBM. Zudem konnte sich dSTORM als machtvolles Hilfsmittel, sowohl zur Analyse der Migration zugrundeliegenden Zytoskelettstruktur und der Effekte der Hsp90 Inhibierung, als auch, der Nanostruktur der DNA-DSB-Reparaturfoci herausstellen. Es ist anzunehmen, dass beugungsunbegrenzte Mikroskopiemethoden sich als bedeutende Werkzeuge in der medizinischen und biologischen Erforschung der DNA-Reparaturmechanismen herausstellen werden. Das in dieser Arbeit entwickelte ImageJ Plugin „FocAn-3D“ bewies sich ebenfalls als ein vielversprechendes Werkzeug für die Analyse der Reparaturkinetik. Mit Hilfe von „FocAn-3D“ sollte es somit möglich sein u.a. den Einfluss gezielter Inhibition auf den zeitlichen Verlauf der Induktion und des Abbaus der DNA-Reparaturmaschinerie genauer zu studieren.
N2  - The high invasive Potential and increased resistance to radio- and chemotherapy of glioblastoma multiforme (GBM) tumor cells make it the most lethal of all primary brain tumors. It is therefore of great interest to gain a better understanding of the mechanisms facilitating the migration and DNA repair.
In the first part of this study, two algorithms for single cell tracking and wound healing assays were modified to increase effectiveness and speed of the automatic data analysis. The migratory capacity of the two GBM cell lines, DK MG and SNB19, were analyzed using these automatic algorithms. In addition, employing confocal microscopy and high resolution dSTORM imaging, the underlying F actin/FAK structure was resolved and studied. Together, these automatic algorithms enabled me to elucidate the effects of the dual PI3K/mTOR inhibitor PI 103 alone and in combination with the Hsp90 inhibitor NVP-AUY922 and/or irradiation on the migration, focal adhesions and F-actin cytoskeleton of DK-MG and SNB19 cells. Both cell lines differ markedly in their migratory capacity in vitro and display distinctive differences in their morphology. The less invasive DK-MG cells retained their polarized structure, while SNB19 cells demonstrate multipolar morphology with random migration. The PI3K/mTOR Inhibition using PI-103 suppressed migration of the PTEN wt and p53 wt DK-MG cells but not of the PTEN mut and p53 mut SNB19 cells. In contrast, Hsp90 inhibition using NVP-AUY922 exerted a strong inhibitory effect on the migration in both cell lines as well as massive morphological changes and reorganization of the F-actin cytoskeleton.
The second part of this study was designed to gain further insights in the DNA double strand break (DSB) repair of both GBM cell lines. The DNA DSB repair kinetics were analyzed using the novel software “FocAn-3D”. The software enables the 3D analysis of foci in entire nuclei using cLSM-imaging. This in turn results in increased accuracy of the foci counts, compared to approaches restricted to 2D. Using the new software approach, I was able to determine the whole γH2AX-foci induction and decay process and apply a well described mathematical model for the γH2AX-foci repair kinetics. Additionally, diffraction unlimited microscopy (dSTORM) was applied to resolve the nanometer scale of the foci forming repair proteins γH2AX and DNA-PK. Although conventional microscopy is able to reveal the repair foci as diffuse spots, the underlying protein distribution is well beyond the diffraction limit of ~200 nm. In this study, using the diffraction unlimited dSTORM microscopy with a lateral resolution of ~20 nm, it was possible to resolve the nanometer scale of both γH2AX and DNA-PK. γH2AX foci appeared not as diffuse spots, but rather as a distribution of distinct subunits (“nanofoci”). In contrast DNA-PK mostly showed a more diffuse distribution. The nanofoci diameter was about ~45 nm and it can be concluded that these clusters represent the elementary structural subunits of repair foci, the γH2AX-containing nucleosomes.
Using the newly developed or modified algorithms for the analysis of cell migration, I was able to show a cell line specific response of the PI3K/mTOR inhibition on the cell migration. This warrants further preclinical trials for its potential as an anti-migratory agent in the treatment of GBM. In addition, dSTORM emerged as a powerful tool for the analysis of the cytoskeletal structure, underlying the cells migration capacity and the effects of Hsp90 inhibition. Also, dSTORM was able to unravel the elementary nanostructure of the DSB repair foci. This means diffraction unlimited single-molecule localization nanoscopy methods will likely emerge as powerful tools for the analysis of targeted inhibition on the DSB repair mechanisms. In addition, the newly developed software “FocAn-3D” showed promising results in the analysis of Foci kinetics. Consequently, it should enable the future study of targeted inhibition and its effects on foci induction and decay processes of the DNA repair.
KW  - Glioblastom
KW  - Zellmigration
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Algorithmus
KW  - Automatisierung
KW  - PI3K/mTOR inhibierung
KW  - yH2AX-Foci
KW  - Dnaschaden
KW  - DNS-Doppelstrangbruch
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185710
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sisario, Dmitri Jonas
T1  - Bildbasierte Analyse von Säugetierzellen unter dem Einfluss von osmotischem Stress, überkritischen elektrischen Feldern und ionisierender Strahlung
T1  - Image-based analysis of mammalian cells subjected to osmotic stress, supracritical electric fields and ionizing radiation
N2  - Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die kurz nach Elektroporation eintretende hämolytische Zellbewegung von humanen Erythrozyten erstmals quantitativ untersucht, um den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Bewegung aus dem Ausstoß von unter Druck stehendem Zytosol resultierte. Durch weitere Experimente wurde die Beteiligung des Nicht-Muskel-Myosins NMIIA am Aufbau des zytosolischen Überdrucks nachgewiesen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein molekular-mechanischer bisher unbekannter NMII-basierter Mechanismus der rapiden Ghostbildung beschrieben. Diese Erkenntnis könnte biomedizinische Relevanz besitzen, da der Abbau von Erythrozyten in der Milz die Transformation zu Hb-armen Ghosts voraussetzt.
Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Hirntumor Glioblastoma multiforme (GBM), dessen Rezidiv hauptsächlich auf Strahlenresistenz und Zellinvasion zurückzuführen ist. Deshalb wurde mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) die Nanostruktur des DSB-Markers Histon γH2AX und des DNA-Reparaturfaktors DNA-PKcs in bestrahlten GBM-Zellen analysiert. Anhand von dSTORM-Rekonstruktionen wurde erstmals gezeigt, dass die beiden Proteine kaum Kolokalisation im Nanometerbereich aufweisen.
Zunehmend wird die anomale Expression von Membrantransportern aus der SLC-Familie mit der Migration von Krebszellen in Verbindung gebracht. Der finale Abschnitt befasste sich daher mit der subzellulären Lokalisierung der Transporterproteine SLC5A1 und SLC5A3 in GBM-Zellen, um ihre Beteiligung an der Zellmigration nachzuweisen. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass der Leitsaum der untersuchten GBM-Zellen deutliches SLC5A1- und SLC5A3-Signal aufwies. Basierend auf diesen Befunden wurden den Transportern unterschiedliche Aufgaben bei der zellmigrativen lokalen Volumenregulation zugeschrieben. Somit ergänzen SLC5A1 und SLC5A3 das migrationsassoziierte Krebszell-Transportom.
N2  - The unique properties of the highly specialized, enucleated mammalian erythrocytes allows them to withstand enormous mechanical stress. However, because their membrane area is limited, they display high osmotic fragility towards hypotonic shocks. In contrast, the much more complex tumor cells are not only capable of tolerating a wide range of osmotic stresses, but they frequently display considerable chemo- and even radioresistance. Because of these intriguing properties, both cell types have been the subject of intensive biophysical and biomedical research for decades.
However, despite the long history of erythrocyte research, the apparently self-propelled motion of red blood cells that occurs in the course of hemolysis is a largely unknown phenomenon. In the first part of this doctoral thesis, the electroporation-triggered hemolytic cell motion of human erythrocytes was examined quantitatively for the first time in order to elucidate the underlying mechanism of this phenomenon. Using fluorescence and videomicroscopic analyses, the two main phases of electrohemolysis were identified. The first, prehemolytic phase was characterized by an efflux of low-molecular cytosolic solutes via electropores, accompanied by transient, osmotic cell shrinkage. Once the influx of extracellular solutes predominated, swelling to the critical cell volume started, apparent from the loss of discoid morphology. The second, hemolytic phase was characterized by a sudden cell acceleration to a peak velocity of ~35 µm/s, ~1 second of rapid and linear movement, gradual volume reduction and transformation to a hemoglobin-depleted, transparent ghost. The results of this work suggest that this rapid linear motion results from a cell contraction-driven expulsion of the pressurized hemoglobin (Hb)-rich cytosol through a single hemolytic hole. ...
KW  - Erythrozyt
KW  - Glioblastom
KW  - Zellmigration
KW  - DNS-Doppelstrangbruch
KW  - Hb-Jet
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246772
ER  -