TY - THES A1 - Montalbán del Barrio, Itsaso T1 - Immunosuppressive role of adenosine produced by ectonucleotidases CD39 and CD73 in ovarian cancer, tumor associated macrophages and the host immune system T1 - Immunosuppressive Rolle von Adenosine produziert von Ectonukleotidasen CD39 und CD73 in Eierstockkrebs, Tumor assoziierten Makrophagen und den Wirtsimmunsystem N2 - Eierstockkrebs ist der Tumor mit der schlechtesten Heilungsprognose unter allen gynäkologischen Malignomen. Allein in Deutschland verursacht er über 6000 Tote pro Jahr. Patienten mit Ovarialkarzinom zeigen erst in einem sehr fortgeschrittenen Stadium charakteristische Symptome. Die einzig möglichen Behandlungsmethoden sind dann die operative Tumorentfernung und die Verabreichung von platinbasierter Chemotherapien sowie von Anthrazyklinen. Da die aktuelle 5-Jahres-Überlebensrate lediglich 20-40% beträgt, besteht ein dringender Bedarf an neuen therapeutischen Optionen. Seit herausgefunden wurde, dass immunologische Parameter das Überleben der Patienten beeinflussen, ist Immuntherapie zu einer der vielversprechendsten Behandlungsarten des Eierstockkrebs geworden. Das Ziel unserer Forschung ist die Überwindung der Immunevasion des Tumors durch ein Verhindern der immun-unterdrückenden Mechanismen des Tumors. Im Speziellen befasst sich diese Arbeit mit dem Einfluss von Adenosin, das durch die Ectonukleotidasen CD39 und CD73 in der Mikroumgebung des Tumors gebildet wird. Die CD39- und CD73-Expression der Zellen führt zu Immunosuppression da diese Ectonukleotidasen immun-stimulierendes, extrazelluläres ATP in immunsuppressives Adenosin umwandeln. Dies wurde zuerst als Effektormechanismus für regulatorische T-Zellen beschrieben, kann aber auch im Tumormikromilieu von Bedeutung sein. Mit dem Wissen, dass Tumorzellen von Eierstockkrebs-Patientinnen große Mengen der ATP-unterdrückenden Ectonukleotidasen CD39 und CD73 bilden, analysierten wir die adenosinvermittelte Unterdrückendung von Immunantwortenin der Mikroumgebung der Tumorzellen. Im Vergleich zu regulatorischen T Zellen konnten wir bei Eierstockkrebs-Zelllinien und bei aus Aszites gewonnenen Krebszellen eine 30- bis 60-fache Adenosinproduktion messen. Um diesen mutmaßlichen Immunevasions-Mechanismus zu bestätigen, untersuchten wir seine Auswirkungen auf mehrere Immunzellenpopulationen. CSFE-basierte Experimente zeigten zum Beispiel eine Hemmung der CD4+ T-Zell-Proliferation durch Adenosin, welches von Eierstockkrebs-Zellen produziert wurde. In diesem Zusammenhang haben wir auch eine in-vitro Methode entwickelt, mit der wir die Beeinflussung von Makrophagen durch Eierstockkrebszellen analysieren und modulieren konnten. Neben seiner suppressiven Wirkung übt Adenosin auch chemotaktische Effekte auf menschliche Monozyten aus und lockt wahrscheinlich myeloide Vorläuferzellen zum Tumorgewebe. Anschließend differenzieren sich menschliche Monozyten in einer von Eierstockkrebszellen geformten Mikroumgebung zu M2 Makrophagen oder tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs), die ihrerseits erhebliche Mengen der Adenosin-produzierenden Ectonukleotidasen CD39 und CD73 bilden. Während wir die Regulierung der Ectonukleotidasen-Expression untersuchten, entdeckten wir auch, dass klinisch genutzte Techniken zur Behandlung von Eierstockkrebs (zum Beispiel die Anwendung von Doxorubicin oder Bestrahlung) in vitro das CD73- und CD39-Level von Eierstockkrebs- und Immunzellen beeinflussen. In dieser Studie zeigen wir, wie dieser behandlungsbedingte Wechsel des ATP/Adenosine-Verhältnisses die Effektorfunktion verschiedener Immunzellen moduliert. Darüber hinaus untersuchen wir den potentiellen Vorteil von klinisch verfügbaren, niedermolekularen Inhibitoren für CD39 und CD73, die die Immunsuppression in der Mikroumgebung des Tumors partiell aufheben könnten, und die vor allem in Kombination mit gängigen Behandlungsschemata von großem Interesse sein könnten. N2 - Ovarian cancer (OvCa) is the tumor with the most unfavourable prognosis among all gynaecological malignancies causing more than 6000 deaths per year in Germany alone. Patients with OvCa show symptoms at very advanced stages of tumor progression when the only available treatments consist on tumor debulking surgery and administration of platinum based chemotherapeutics and anthracyclins. There is an urgent need to develop new therapeutical strategies since the actual 5 year survival rate of OvCa patients does not exceed 20-40%. Immunotherapy is a promising approach for treatment of ovarian cancer, since it has been observed that immunological parameters can influence the outcome of the patient. The aim of our research is to overcome tumor immune escape by counteracting the immunosuppressive mechanisms developed by the tumor. In particular, this work studies the influence of adenosine generated by the ectonucleotidases CD39 and CD73 in the tumor microenvironment. Cellular expression of CD39 and CD73 contributes to immunosupression as these ectonucleotidases convert immune-stimulatory extracellular ATP into immunosuppressive adenosine. This was primarily described as effector mechanism for regulatory T cells, but may also be important in the tumor microenvironment. Having found that tumor cells from OvCa-patients express high levels of ATP-depleting ectonucleotidases CD39 and CD73 we set out to investigate a potential immunosuppressive mechanism via adenosine production in the tumor microenvironment. We could measure 30-60 times higher adenosine production by OvCa cell lines and ascites-derived cancer cells as compared to physiological normal conditions. To confirm this putative immune escape mechanism we investigated its effect on several immune cell populations. CFSE-based assays, for example, showed an inhibition of CD4+ T cell proliferation by OvCA cell-derived adenosine. In this context, we have further established an in-vitro assay, where OvCa cells modulate the function of macrophages towards a M2 or tumor associated (TAM) phenotype. Together with the phenotype modulation adenosine exerts chemotactic effects on human monocytes and is thus likely to attract myeloid precursor cells towards the tumor tissue. Moreover, in a microenvironment that is shaped by OvCa cells, human monocytes differentiate into M2 macrophages or TAMs which themselves express significant levels of the adenosine-generating ectonucleotidases CD39 and CD73. Investigating the regulation of ectonucleotidase expression, we also observed that approaches clinically used to treat OvCa (namely application of doxorubicine or irradiation) influence CD73 and CD39 levels of OvCa and immune cells in vitro. In this study we show how this treatment-induced change in the ATP/adenosine ratio modulates the effector function of different immune cells. Furthermore, we investigate the potential benefit of clinically available small molecule inhibitors for CD39 and CD73 that could relieve immunosuppression in the tumor microenvironment especially in combination with common treatment regimes. KW - Eierstockkrebs KW - CD39 KW - CD73 KW - Adenosin KW - Immunsuppression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133268 ER - TY - THES A1 - Brockmann, Markus T1 - Inhibition von Aurora-A als neue Therapiestrategie gegen MYCN-amplifizierte Neuroblastome T1 - Inhibition of Aurora-A as a novel therapeutic strategy against MYCN-amplified Neuroblastoma N2 - Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen. In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung. In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen. Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle. Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden. Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen. N2 - Amplification of MYCN, encoding the transcription factor N-Myc, is one of the strongest clinical predictors of poor prognosis in neuroblastoma. As a member of the oncogenic Myc family, N-Myc activates genes that are involved in several biological processes like metabolism, cell cycle progression, cell growth and apoptosis. Deregulation of MYCN expression leads to a distinct gene expression profile and an aggressive phenotype in neuroblastoma cells. In normal neuronal progenitor cells, N-Myc is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. N-Myc degradation is controlled by two phospho-sites. During mitosis, Cyclin B/Cdk1 phosphorylates N-Myc at serine 62, which primes the protein for a second phosphorylation at threonine 58 via GSK3β. This phospho-degron provides a recognition site for Fbxw7, an F-box protein of the E3-Ligase complex SCFFbxw7, leading to destabilisation of the N-Myc protein. Mitotic degradation of the N-Myc protein allows progenitor cells to exit the cell cycle and enables terminal differentiation. Our group had previously identified AURKA as a gene that is required for cell growth in MYCN-amplified neuroblastoma cells but not essential for cells lacking MYCN. Here, we show that Aurora-A counteracts the Fbxw7-mediated degradation, and that the interaction between Aurora-A and N-Myc is cruical for N-Myc stabilization. Surprisingly, Aurora-A stabilizes the transcription factor in a kinase-independent manner. Interestingly, two Aurora-A-Inhibitors, MLN8054 and MLN8237, inhibit the kinase activity but also destabilize the N-Myc protein. These inhibitors induce an unusual conformation of the kinase domain and resulting in the dissociation of the N-Myc/Aurora-A complex. We demonstrate that the disruption of the complex promotes Fbxw7-mediated degradation of N-Myc. Inhibitor treatment in neuroblastoma cells leads to a cell cycle arrest in G1-phase. In a transgenic mouse model of MYCN-driven neuroblastoma, treatment causes downregulation of N-Myc protein levels, differentiation of the tumor cells and complete tumor regression in the majority of tumors. Consistent with the tumor reduction, treatment with MLN8054 and MLN8234 results in an extension of survival of the transgenic mice. Collectively, these results demonstrate that the Aurora-A–Inhibitors MLN8054 and MLN8237 are potential therapeutics against MYCN-amplified Neuroblastoma. KW - N-Myc KW - Neuroblastoma KW - Therapie KW - Neuroblastom KW - MYCN-amplified KW - Therapy KW - Aurora-A Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135951 ER - TY - THES A1 - Wiese, Katrin Evelyn T1 - Sensing supraphysiological levels of MYC : mechanisms of MIZ1-dependent MYC-induced Apoptosis in Mammary Epithelial Cells T1 - Mechanismen der MIZ1-abhängigen MYC-induzierten Apoptose in Brustepithelzellen N2 - Deregulated MYC expression contributes to cellular transformation as well as progression and maintenance of human tumours. Interestingly, in the absence of additional genetic alterations, potentially oncogenic levels of MYC sensitise cells to a variety of apoptotic stimuli. Hence, MYC-induced apoptosis has long been recognised as a major barrier against cancer development. However, it is largely unknown how cells discriminate physiological from supraphysiological levels of MYC in order to execute an appropriate biological response. The experiments described in this thesis demonstrate that induction of apoptosis in mammary epithelial cells depends on the repressive actions of MYC/MIZ1 complexes. Analysis of gene expression profiles and ChIP-sequencing experiments reveals that high levels of MYC are required to invade low-affinity binding sites and repress target genes of the serum response factor SRF. These genes are involved in cytoskeletal dynamics as well as cell adhesion processes and are likely needed to transmit survival signals to the AKT kinase. Restoration of SRF activity rescues MIZ1- dependent gene repression and increases AKT phosphorylation and downstream function. Collectively, these results indicate that association with MIZ1 leads to an expansion of MYC’s transcriptional response that allows sensing of oncogenic levels, which points towards a tumour-suppressive role for the MYC/MIZ1 complex in epithelial cells. N2 - Eine Deregulation der MYC Expression trägt entscheidend zur malignen Transformation und Progression humaner Tumoren bei. In Abwesenheit von zusätzlichen genetischen Läsionen machen potentiell onkogene MYC Proteinmengen Zellen jedoch anfällig für eine Reihe Apoptoseauslösender Reize. Daher kann MYC-induzierte Apoptose als bedeutende tumorsuppressive Maßnahme und wichtige Barriere gegen die Entstehung von Krebs betrachtet werden. Mechanistisch unklar ist allerdings wie genau Zellen physiologische von supraphysiologischen MYC-Mengen unterscheiden um adäquat darauf reagieren zu können. Die Experimente in dieser Dissertation zeigen, dass die repressive Eigenschaft von MYC/MIZ1 Komplexen für die Induktion von Apoptose in Brustepithelzellen essentiell ist. Die Analyse von Genexpressions- und ChIP-Sequenzier-Experimenten verdeutlicht, dass hohe Level an MYC benötigt werden um niedrig-affine Bindestellen im Genom zu besetzen und Zielgene des SRF (serum response factor ) Transkriptionsfaktors zu reprimieren. Diese Gene haben eine wichtige Funktion in Prozessen wie Zytoskelettdynamik und Zelladhäsion und sind vermutlich daran beteiligt notwendige Überlebenssignale an die Kinase AKT weiterzuleiten. Eine Wiederherstellung der SRF Aktivität revertiert die MIZ1-abhängige Repression der Zielgene und führt zu einer vermehrten AKT Phosphorylierung und Funktion. Insgesamt deuten diese Resultate auf eine tumorsuppressive Rolle des MYC/MIZ1 Komplexes in epithelialen Zellen hin, da eine Veränderung der genregulatorischen Aktivität als Folge der Assoziation mit MIZ1 dazu beiträgen könnte onkogene Mengen an MYC zu erkennen. KW - Myc KW - Apoptosis KW - Myc KW - Miz1 KW - Apoptose KW - Repression KW - ChIP-sequencing KW - Repression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132532 ER - TY - THES A1 - Heidinger, Ina M. M. T1 - Beyond metapopulation theory: Determinants of the dispersal capacity of bush crickets and grasshoppers T1 - Bestimmende Faktoren der Ausbreitungsfähigkeit von Heuschrecken N2 - Habitat fragmentation and destruction due to anthropogenic land use are the major causes of the increasing extinction risk of many species and have a detrimental impact on animal populations in numerous ways. The long-term survival and stability of spatially structured populations in fragmented landscapes largely depends on the colonisation of habitat patches and the exchange of individuals and genes between patches. The degree of inter-patch dispersal, in turn, depends on the dispersal ability of a species (i.e. the combination of physiological and morphological factors that facilitate dispersal) and the landscape structure (i.e. the nature of the landscape matrix or the spatial configuration of habitat patches). As fragmentation of landscapes is increasing and the number of species is continuously declining, a thorough understanding of the causes and consequences of dispersal is essential for managing natural populations and developing effective conservation strategies. In the context of animal dispersal, movement behaviour is intensively investigated with capture-mark-recapture studies. For the analysis of such experiments, the influence of marking technique, handling and translocation of marked animals on movement pattern is of crucial importance since it may mask the effects of the main research question. Chapter 2 of this thesis presents a capture-mark-recapture study investigating the effect of translocation on the movement behaviour of the blue-winged grasshopper Oedipoda caerulescens. Transferring individuals of this grasshopper species to suitable but unfamilliar sites has a significant influence on their movement behaviour. Translocated individuals moved longer distances, showed smaller daily turning angles, and thus their movements were more directed than those of resident individuals. The effect of translocation was most pronounced on the first day of the experiment, but may persist for longer. On average, daily moved distances of translocated individuals were about 50 % longer than that of resident individuals because they have been transferred to an unfamiliar habitat patch. Depending on experiment duration, this leads to considerable differences in net displacement between translocated and resident individuals. In summary, the results presented in chapter 2 clearly point out that translocation effects should not be disregarded in future studies on arthropod movement, respectively dispersal. Studies not controlling for possible translocation effects may result in false predictions of dispersal behaviour, habitat detection capability or habitat preferences. Beside direct field observations via capture-mark-recapture methods, genetic markers can be used to investigate animal dispersal. Chapter 3 presents data on the genetic structure of populations of Metrioptera bicolor, a wing-dimorphic bush cricket, in a spatially structured landscape with patches of suitable habitat distributed within a diverse matrix of different habitat types. Using microsatellite markers, the effects of geographic distance and different matrix types on the genetic differentiation among 24 local populations was assessed. The results of this study clearly indicate that for M. bicolor the isolation of local populations severely depends on the type of surrounding matrix. The presence of forest and a river running through the study area was positively correlated with the extent of genetic differentiation between populations. This indicates that both matrix types severely impede gene flow and the exchange of individuals between local populations of this bush cricket. In addition, for a subsample of populations which were separated only by arable land or settlements, a significant positive correlation between pairwise genetic and geographic distances exists. For the complete data set, this correlation could not be found. This is most probably due to the adverse effect of forest and river on gene flow which dominates the effect of geographic distance in the limited set of patches investigated in this study. The analyses in chapter 3 clearly emphasize the differential resistance of different habitat types on dispersal and the importance of a more detailed view on matrix ‘quality’ in metapopulation studies. Studies that focus on the specific dispersal resistance of different matrix types may provide much more detailed information on the dispersal capacity of species than a mere analysis of isolation by distance. Such information is needed to improve landscape oriented models for species conservation. In addition to direct effects on realised dispersal (see chapter 3), landscape structure on its own is known to act as an evolutionary selection agent because it determines the costs and benefits of dispersal. Both morphological and behavioural traits of individuals and the degree to which a certain genotype responds to environmental variation have heritable components, and are therefore expected to be able to respond to selection pressures. Chapter 4 analyses the influence of patch size, patch connectivity (isolation of populations) and sand dynamics (stability of habitat) on thorax- and wing length as proxies for dispersal ability of O. caerulescens in coastal grey dunes. This study revealed clear and sex-specific effects of landscape dynamics and patch configuration on dispersal-related morphology. Males of this grasshopper species were smaller and had shorter wings if patches were larger and less connected. In addition, both sexes were larger in habitat patches with high sand dynamics compared to those in patches with lower dynamics. The investments in wing length were only larger in connected populations when sand dynamics were low, indicating that both landscape and patch-related environmental factors are of importance. These results are congruent with theoretical predictions on the evolution of dispersal in metapopulations. They add to the evidence that dispersal-related morphology varies and is selected upon in recently structured populations even at small spatial scales. Dispersal involves different individual fitness costs like increased predation risk, energy expenditure, costs of developing dispersal-related traits, failure to find new suitable habitat as well as reproductive costs. Therefore, the decision to disperse should not be random but depend on the developmental stage or the physiological condition of an individual just as on actual environmental conditions (context-dependent dispersal, e.g. sex- and wing morph-biased dispersal). Biased dispersal is often investigated by comparing the morphology, physiology and behaviour of females and males or sedentary and dispersive individuals. Studies of biased dispersal in terms of capture-mark-recapture experiments, investigating real dispersal and not routine movements, and genetic proofs of biased dispersal are still rare for certain taxa, especially for orthopterans. However, information on biased dispersal is of great importance as for example, undetected biased dispersal may lead to false conclusions from genetic data. In chapter 5 of this thesis, a combined approach of morphological and genetic analyses was used to investigate biased dispersal of M. bicolor. The presented results not only show that macropterous individuals are predestined for dispersal due to their morphology, the genetic data also indicate that macropters are more dispersive than micropters. Furthermore, even within the group of macropterous individuals, males are supposed to be more dispersive than females. To get an idea of the flight ability of M. bicolor, the morphological data were compared with that of Locusta migratoria and Schistocerca gregaria, which are proved to be very good flyers. Based on the morphological data presented here, one can assume a good flight ability for macropters of M. bicolor, although flying individuals of this species are seldom observed in natural populations. N2 - Zahlreiche Tierarten sind mehr und mehr vom Aussterben bedroht. Hauptursachen dafür sind die Zerstörung und Fragmentierung von Lebensraum durch den Menschen. Mit der anthropogenen Landnutzung sind vielfältige, negative Auswirkungen auf die betroffenen Tierpopulationen verbunden. Das langfristige Überleben und die Stabilität von räumlich strukturierten Populationen in fragmentierten Landschaften hängen dabei wesentlich von der Besiedlung von Habitatflächen, sowie dem Individuenaustausch und dem damit verbundenen genetischen Austausch zwischen einzelnen Populationen ab. Das Ausmaß der Ausbreitung von Individuen zwischen einzelnen Habitatflächen wird dabei (i) durch die Ausbreitungsfähigkeit der betreffenden Tierart, als die Kombination physiologischer und morphologischer Faktoren, welche die Ausbreitung eines Individuums begünstigen, und (ii) von der Struktur der Landschaft, wie z.B. dem Matrix-Typ oder die räumliche Anordnung von Habitatflächen, bestimmt. Da die Fragmentierung von Lebensräumen und die Anzahl bedrohter Tierarten stetig zunehmen, ist ein umfassendes Verständnis der Ursachen und Konsequenzen der Ausbreitung essenziel für das Management natürlicher Populationen sowie für die Entwicklung effektiver Schutzmaßnahmen. Eine gängige und sehr häufig angewandte Methode, Ausbreitung zu untersuchen, sind Fang-Wiederfang-Studien zum Laufverhalten einzelner Individuen. Dabei wird grundsätzlich davon ausgegangen, dass das Markieren und das Versetzen der Tiere keinerlei Einfluss auf deren Verhalten haben. Für die Analyse und Interpretation solcher Experimente ist es entscheidend, diesen Einfluss ausschließen zu können, da er die Effekte, die eigentlich untersucht werden sollen, überlagern kann. Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit ist eine Fang-Wiederfang-Studie, die diese Annahme und damit den Einfluss des Versetzens auf das Laufverhalten der Blauflügelige Ödlandschrecke (Oedipoda caerulescens) untersucht. Wie sich zeigte, hat das Versetzen von Individuen auf eine geeignete, jedoch fremde Habitatfläche einen signifikanten Einfluss auf das Laufverhalten der versetzten Tiere. Versetzte Individuen legten größere Strecken zurück und zeigten ein geradlinigeres Bewegungsmuster als die Tiere, die genau an ihrem Fundort im „Heimathabitat“ wieder freigelassen wurden. Dieser Effekt war am ersten Tag nach der Freilassung der Versuchstiere am deutlichsten ausgeprägt, kann jedoch auch noch darüber hinaus anhalten. Die zurückgelegten Tagesstrecken der versetzten Individuen, die in eine ihnen unbekannte Habitatfläche verbracht wurden, waren im Durchschnitt 50 % länger, als die der nichtversetzten Tiere. In Abhängigkeit von der Dauer eines Experiments führt dies zu erheblichen Unterschieden hinsichtlich der Nettostrecken, die insgesamt von versetzten und nicht versetzten Tieren zurückgelegt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in Kapitel 2 präsentierten Ergebnisse deutlich zeigen, dass in zukünftigen Untersuchungen des Laufverhaltens von Arthropoden bzw. deren Ausbreitung, der Effekt des Versetzens berücksichtigt werden muss. Studien, die diesen Einfluss ignorieren, können zu falschen Vorhersagen bezüglich des Ausbreitungsverhaltens, der Fähigkeit geeignetes Habitat zu detektieren oder der Habitatpräferenzen einer Art führen. Neben direkter Beobachtung mittels Fang-Wiederfang-Methoden kommen auch genetische Methoden zur Anwendung, um das Ausbreitungsverhalten von Tieren zu untersuchen. Kapitel 3 beinhaltet Daten zur genetischen Struktur von Populationen der Zweifarbigen Beißschrecke (Metrioptera bicolor), einer Heuschreckenart mit ausgeprägtem Flügeldimorphismus. Die Untersuchung fand in einer räumlich strukturierten Landschaft statt, in der geeignete Habitatflächen verteilt in einer diversen Matrix von unterschiedlichen nicht-geeigneten Habitattypen vorliegen. Mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern wurde der Einfluss der geographischen Distanz und unterschiedlicher Matrixtypen auf die genetische Differenzierung von 24 lokalen Populationen von M. bicolor untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass der Isolationsgrad lokaler Populationen dieser Heuschreckenart wesentlich von der umgebenden Matrix abhängt. Wie sich zeigte, werden der Individuenaustausch und der damit verbundenen Genfluss zwischen den untersuchten Populationen wesentlich durch Wald und einen Fluss eingeschränkt, da das Vorhandensein dieser beiden Matrixtypen positiv mit dem Grad der genetischen Differenzierung zwischen den Populationen korrelierte. Zudem zeigte sich für eine Teilauswahl von Populationen, welche nur durch landwirtschaftlich genutzte Flächen und Siedlungen voneinander getrennt sind, eine signifikant positive Korrelation zwischen der paarweise berechneten genetischen und der geographischen Distanz zwischen zwei Populationen. Dies bedeutet eine größere Differenzierung der Populationen je weiter sie voneinander entfernt sind. Für den vollständigen Datensatz mit allen untersuchten Populationen, konnte dieser Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Am wahrscheinlichsten ist dies darauf zurück zu führen, dass der nachteilige Effekt von Wald und Fluss auf den Genfluss den Effekt der geographischen Distanz überlagert. Die Analysen in Kapitel 3 machen deutlich, dass sich verschiedene Matrixtypen unterschiedlich auf die Ausbreitung einer Art auswirken, und unterstreichen wie wichtig eine eingehende Betrachtung der Matrixqualität für Metapopulationsstudien ist. Studien mit Fokus auf den unterschiedlichen Einfluss verschiedener Matrixtypen können wesentlich genauere Informationen zur Ausbreitungsfähigkeit einer Art liefern, als eine alleinige Analyse des isolierenden Effekts der räumlichen Trennung von Populationen. Gerade solche Informationen sind essentiell und nötig, um landschaftsorientierte Modelle für den Artenschutz verbessern zu können. Zusätzlich zu dem unmittelbaren Einfluss der Struktur der Landschaft auf die realisierte Ausbreitung von Individuen (siehe Kapitel 3), kann Landschaft auch als evolutionärer Selektionsfaktor agieren, da sie Kosten und Nutzen der Ausbreitung bestimmt. Ein entsprechender Selektionsdruck sollte sich sowohl auf morphologische Merkmale und Verhaltensmerkmale eines Individuums als auch auf das Ausmaß, mit dem ein bestimmter Genotyp auf Variationen der Umwelt reagiert, auswirken. Kapitel 4 untersucht den Einfluss der Größe und der Isolation einer Habitatfläche, sowie der Habitatstabilität (in Form der Sanddynamik) auf die Thorax- und Flügellänge, als Maße für die Ausbreitungsfähigkeit, der Blauflügeligen Ödlandschrecke in einem Küstengebiet. Die vorliegende Studie zeigte deutliche, geschlechtsspezifische Effekte der Sanddynamik und der räumlichen Anordnung der Habitatflächen zueinander auf die untersuchten morphologischen Merkmalen. Mit zunehmender Flächengröße und abnehmender Habitatkonnektivität, waren die Männchen von O. caerulescens kleiner und hatten zudem kürzere Flügel. Männchen und Weibchen von instabilen Habitatflächen (gekennzeichnet durch eine hohe Sanddynamik) waren größer als die Individuen von stabileren Habitatflächen (geringerer Sanddynamik). Insgesamt machen die vorliegenden Ergebnisse deutlich, dass sowohl landschaftsbezogene als auch habitatflächenbezogene Umweltfaktoren für die individuelle Investition in ausreitungsrelevante, morphologische Merkmale von Bedeutung sind. Diese Ergebnisse stimmen mit den Vorhersagen theoretischer Modelle zur Evolution der Ausbreitung in Metapopulationen überein und liefern einen weiteren Nachweis dafür, dass ausbreitungsrelevante, morphologische Merkmale variieren und in kürzlich strukturierten Populationen einer Selektion unterliegen. Die Ausbreitung eines Individuums ist mit unterschiedlichen Fitnesskosten verbunden. Dazu zählen zum Beispiel: Ein erhöhtes Predationsrisiko, energetische Kosten, das Risiko kein geeignetes Habitat zu finden, Kosten die mit der Ausbildung von ausbreitungsrelevanten Merkmalen verbunden sind, sowie Reproduktionskosten. Die Entscheidung, ob sich ein Individuum ausbreitet, sollte daher nicht zufällig erfolgen, sondern von dessen Entwicklungsstadium oder dessen physiologischer Konstitution, sowie von aktuellen Umweltbedingungen abhängen. Man spricht von einer kontextbezogene Ausbreitung, die zum Beispiel vom Geschlecht oder der Flügelmorphe eines Individuums abhängt. Ein Ungleichgewicht in der Ausbreitung verschiedener Geschlechter oder Morphen wird als biased dispersal bezeichnet. Für die Untersuchung von biased dispersal werden häufig Weibchen und Männchen oder sesshafte und sich ausbreitende Individuen einer Art morphologisch, physiologisch oder hinsichtlich ihres Verhaltens miteinander verglichen. Für einige Taxa, insbesondere Heuschrecken, liegen bislang nur wenige Studien zum biased dispersal in Form von Fang-Wiederfang-Experimenten (die auch wirklich Ausbreitung und keine Routinebewegungen einzelner Individuen untersuchen) oder genetischen Analysen vor. Allerdings sind gerade Informationen hierzu von großer Bedeutung, da zum Beispiel ein unentdecktes biased dispersal dazu führen kann, dass falsche Schlüsse aus den Ergebnissen genetischer Untersuchungen gezogen werden. Kapitel 5 der vorliegenden Dissertation untersucht das Auftreten von biased dispersal der Zweifarbigen Beißschrecke unter Verwendung eines kombinierten Ansatzes morphologischer und genetischer Analysen. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen nicht nur, dass makroptere Individuen aufgrund ihrer Morphologie prädestiniert für die Ausbreitung sind. Auch die genetischen Daten deuten an, dass sich makroptere Tiere stärker ausbreiten als mikroptere Tiere. Darüber hinaus besitzen innerhalb der Gruppe der makropteren Individuen Männchen eine bessere Ausbreitungsfähigkeit als Weibchen. Um die Flugfähigkeit von M. bicolor beurteilen zu können, wurden die morphologischen Daten der vorliegenden Untersuchung mit den Ergebnissen von Studien über Locusta migratoria and Schistocerca gregaria verglichen. Beide Arten sind für ihr sehr gutes Flugvermögen bekannt. Darauf basierend ist für maktoptere Individuen von M. bicolor eine gute Flugfähigkeit anzunehmen, wenn auch in natürlichen Populationen fliegende Tiere dieser Art nur selten beobachtet werden. KW - Heuschrecken <Überfamilie> KW - capture-mark-recapture KW - patch connectivity KW - sand dynamics KW - populations genetics KW - biased dispersal KW - Populationsgenetik KW - Demökologie KW - Habitat KW - Ausbreitung KW - dispersal KW - orthoptera Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135068 ER - TY - THES A1 - Scholl, Christina T1 - Cellular and molecular mechanisms contributing to behavioral transitions and learning in the honeybee T1 - Zelluläre und molekulare Mechanismen, die zu Verhaltensänderungen und Lernen in der Honigbiene beitragen N2 - The honeybee Apis mellifera is a social insect well known for its complex behavior and the ability to learn tasks associated with central place foraging, such as visual navigation or to learn and remember odor-reward associations. Although its brain is smaller than 1mm² with only 8.2 x 105 neurons compared to ~ 20 x 109 in humans, bees still show amazing social, cognitive and learning skills. They express an age – related division of labor with nurse bees staying inside the hive and performing tasks like caring for the brood or cleaning, and foragers who collect food and water outside the hive. This challenges foragers with new responsibilities like sophisticated navigation skills to find and remember food sources, drastic changes in the sensory environment and to communicate new information to other bees. Associated with this plasticity of the behavior, the brain and especially the mushroom bodies (MBs) - sensory integration and association centers involved in learning and memory formation – undergo massive structural and functional neuronal alterations. Related to this background my thesis on one hand focuses on neuronal plasticity and underlying molecular mechanisms in the MBs that accompany the nurse – forager transition. In the first part I investigated an endogenous and an internal factor that may contribute to the nurse - forager phenotype plasticity and the correlating changes in neuronal network in the MBs: sensory exposure (light) and juvenile hormone (JH). Young bees were precociously exposed to light and subsequently synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the MBs or respectively hemolymph juvenile hormone (JH) levels were quantified. The results show that light input indeed triggered a significant decrease in MG density, and mass spectrometry JH detection revealed an increase in JH titer. Interestingly light stimulation in young bees (presumably nurse bees) triggered changes in MG density and JH levels comparable to natural foragers. This indicates that both sensory stimuli as well as the endocrine system may play a part in preparing bees for the behavioral transition to foraging. Considering a connection between the JH levels and synaptic remodeling I used gene knockdown to disturb JH pathways and artificially increase the JH level. Even though the knockdown was successful, the results show that MG densities remained unchanged, showing no direct effect of JH on synaptic restructuring. To find a potential mediator of structural synaptic plasticity I focused on the calcium-calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in the second part of my thesis. CaMKII is a protein known to be involved in neuronal and behavioral plasticity and also plays an important part in structural plasticity reorganizing synapses. Therefore it is an interesting candidate for molecular mechanisms underlying MG reorganization in the MBs in the honeybee. Corresponding to the high abundance of CaMKII in the learning center in vertebrates (hippocampus), CaMKII was shown to be enriched in the MBs of the honeybee. Here I first investigated the function of CaMKII in learning and memory formation as from vertebrate work CaMKII is known to be associated with the strengthening of synaptic connections inducing long term potentiation and memory formation. The experimental approach included manipulating CaMKII function using 2 different inhibitors and a specific siRNA to create a CaMKII knockdown phenotype. Afterwards bees were subjected to classical olfactory conditioning which is known to induce stable long-term memory. All bees showed normal learning curves and an intact memory acquisition, short-term and mid-term memory (1 hour retention). However, in all cases long-term memory formation was significantly disrupted (24 and 72 hour retention). These results suggests the necessity of functional CaMKII in the MBs for the induction of both early and late phases of long-term memory in honeybees. The neuronal and molecular bases underlying long-term memory and the resulting plasticity in behavior is key to understanding higher brain function and phenotype plasticity. In this context CaMKII may be an important mediator inducing structural synaptic and neuronal changes in the MB synaptic network. N2 - Die Honigbiene Apis mellifera ist ein soziales Insekt, das bekannt ist für sein komplexes Verhalten und seine Fähigkeiten, Aufgaben in Bezug auf zentrales Sammelverhalten, zum Beispiel visuelle Navigation oder die Assoziation Duft – Belohnung, zu lernen, ist. Obwohl das Bienengehirn kleiner als 1mm² ist und im Vergleich zum dem des Menschen mit ~ 20 x 109 Neuronen nur 8.2 x 105 Neurone besitzt, verfügen Bienen trotzdem über beeindruckende soziale, kognitive und Lernfähigkeiten. Sie praktizieren eine altersabhängige Arbeitsteilung mit Ammen, die im Stock bleiben und Aufgaben wie das Versorgen der Brut übernehmen, und Sammlerinnen, die außerhalb des Stockes Futter und Wasser suchen. Dies fordert die Sammlerinnen zu neuen Aufgaben heraus, zum Beispiel hochentwickelte Navigation, drastischen Änderungen der sensorischen Umwelt, Lernen neuer Assoziationen und die Vermittlung der neuen Informationen an andere Bienen. Diese phänotypische Plastizität geht mit stark strukturellen und funktionell neuronalen Veränderungen im Gehirn und vor allem in den Pilzkörpern – sensorische Integrierungszentren, die an Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sind – einher. Passend dazu liegt ein Schwerpunkt meiner Arbeit darauf, die neuronale Plastizität und die molekularen Mechanismen im Pilzkörper, die mit der Wandlung der Amme hin zur Sammlerin zusammen hängen, zu untersuchen. Im ersten Teil werden ein endogener und ein interner Faktor, die zum Ammen - Sammlerinnen Übergang und den damit einhergehenden Änderungen im neuronalen Netzwerk beitragen könnten, untersucht: sensorische Input (Licht) und Juvenilhormon (JH). Junge Bienen wurden frühzeitig dem Licht ausgesetzt und anschließend synaptische Komplexe (Mikroglomeruli, MG) in den Pilzkörpern beziehungsweise JH aus der Hämolymphe quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss des Lichts tatsächlich eine plastische Verringerung der MG-Dichte auslöst und massenspektrometrische Messungen eine Zunahme an der JH-Menge in der Hämolymphe zeigen. Interessanterweise führt die Stimulation der jungen Ammen mit Licht zu Änderungen in der MG-Dichte und zu JH-Mengen, die vergleichbar sind mit den Werten bei natürlichen Sammlerinnen sind. Dies weist darauf hin, dass sowohl sensorische Stimuli als auch das Hormonsystem einen Beitrag zu der Vorbereitung der Bienen auf die bevorstehende Verhaltensänderung leisten. Um eine Verbindung zwischen der JH-Menge und synaptischen Umstrukturierungen in Betracht zu ziehen, habe ich einen Gen-Knockdown eingesetzt, um JH-Signalwege zu manipulieren und dadurch die JH-Menge künstlich zu erhöhen. Obwohl der Knockdown erfolgreich war, zeigen die Ergebnisse keinen direkten Zusammenhang zwischen der JH-Menge und einer synaptischer Umgestaltung. Um einen möglichen Vermittler von struktureller Plastizität zu finden, habe ich den Fokus im zweiten Teil meiner Arbeit auf die Calcium-Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II (CaMKII) gerichtet. CaMKII ist ein Protein, das für seine Rolle sowohl in neuronaler und Verhaltensplastizität als auch in struktureller Plastizität bekannt ist. Daher ist es ein interessanter Kandidat, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die bei der MG-Umstrukturierung in den Pilzkörpern beteiligt sind. In Übereinstimmung mit dem hohen Vorkommen der CaMKII in Lernzentren in Vertebraten (Hippocampus) kommt CaMKII auch in hohem Maß in den Pilzkörpern der Biene vor. In dieser Arbeit habe ich zuerst die Funktion der CaMKII in Lernvorgängen und bei der Gedächtnisbildung untersucht, da bekannt ist, dass CaMKIII mit verstärkten synaptischen Verbindungen, die Langzeitpotenzierung und Gedächtnisbildung auslösen, in Zusammenhang gebracht wird. Der experimentelle Ansatz beinhaltet die Manipulation der CaMKII mit zwei verschiedenen Inhibitoren und einer spezifische siRNA, um einen CaMKII-Knockdown-Phänotyp zu erzeugen. Alle Substanzen wurden über den medialen Ocellartrakt injiziert, um zu gewährleisten, dass sie den Pilzkörper erreichen. Anschließend wurde eine klassische olfaktorische Konditionierung durchgeführt, die ein stabiles Langzeitgedächtnis induziert. Alle Bienen zeigten ein normales Lernverhalten, Kurzzeitgedächtnis und Mittelzeitgedächtnis (eine Stunde Speicherung) waren intakt. Jedoch war in allen Fällen das Langzeitgedächtnis beschädigt (24 und 72 Stunden Speicherung). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaMKII in den Pilzkörpern essentiell für das Auslösen von frühen und späten Formen des Langzeitgedächtnisses der Biene ist. Die neuronalen und molekularen Grundlagen des Langzeitgedächtnis sind der Schlüssel, um höhere Gehirnfunktionen und phänotypische Plastizität zu verstehen. CaMKII könnte ein wichtiger Vermittler sein, um strukturelle und neuronale synaptische Änderungen im Netzwerk des Pilzkörpers auszulösen. KW - Biene KW - honeybee KW - learning and memory KW - division of labor KW - Lernen KW - Molekularbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115527 ER - TY - THES A1 - Kuhn [geb. Bach], Julia Elisa T1 - Design und Etablierung von Next Generation Sequencing-Methoden zur Diagnostik verschiedener Erbkrankheiten T1 - Design and establishment of next-generation sequencing methods for diagnostics of different hereditary diseases N2 - Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen. In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut. In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet. In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung. Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte. Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert. Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen. In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider. N2 - Several enrichment and sequencing technologies of the second (and third) generation have been developed in the past decade, were rapidly refined and are already considered as new state of the art method in several fields of molecular genetic research and diagnostics. Con-sidered as high-throughput technologies, these next-generation sequencing methods (NGS) allow the parallel analysis of several samples and regions of interests up to whole genomes in decreasing time and thus permitted research projects with novel dimensions in human genetics. This doctoral thesis was performed at the molecular genetic laboratory at the Department of Human Genetics in Würzburg. In five projects, NGS approaches of variable scale and for different hereditary diseases were designed, established and applied in research and routine diagnostics. Different methods for target enrichment and NGS analysis were tested and evaluated concerning their efficiency. The results of NGS and subsequent verification ex-periments were documented in seven publications forming the basis of this dissertation. In project 1 - 3, the Access Array system (Fluidigm) was used for target enrichment and the GS Junior (Roche) for sequence generation. COL4A6 has been identified as novel candidate gene for non-syndromic hereditary hearing loss in project 1. A small NGS approach was established to screen this gene in approx. 100 patients with hearing loss in order to search for additional carriers of COL4A6 mutations. The results of this and further experiments confirmed the causality of the COL4A6 mutation found in the index patient with severe X-linked hearing loss. Project 2 aimed at finding a convenient NGS method for the analysis of the large RYR1 gene. A first approach with the Access Array system and the GS Junior lead to the identifi-cation of a (potential) pathogenic mutation in 39 out of 87 patients with malignant hyper-thermia and / or central core disease, but with high failure rates. RYR1 and 63 further genes were then analyzed in a second approach (target enrichment with SureSelect custom design, Agilent; sequence analysis on a HiSeq, Illumina) providing considerably improved results and the identification of four mutations in five patients. Two small panels for muscular diseases were established in project 3. A panel for three genes associated with limb-girdle muscular dystrophies were even successfully applied in accredited routine diagnostics. A novel mutation in the BAG3 gene could be identified using the second panel established for eight candidate genes of myofibrillar myopathies (MFMs). The exome of a patient with MFM was analyzed in project 4 after target enrichment with the SureSelect system (Agilent) and sequence analysis on a HiSeq (Illumina). A novel in-heritance pattern of myotilinopathy was identified after analysis and evaluation of the de-tected variants. Several experiments confirmed the causality of the mutation in the myotilin gene. In project 5, the whole genomic sequence of the F8 gene was analyzed for deep intronic mutations in haemophilic patients (target enrichment with SureSelect custom design, Ag-ilent; sequence analysis on a MiSeq, Illumina). In each of the patients at least one conspicu-ous variant was identified probably leading to alternative splicing. Three mutations were known by publications and for another one causality could be proven by an in vitro splicing assay. The results of this doctoral thesis show that the available methods for target enrichment and sequence analysis of specific targets of the human genome can be combined in a reasonable and efficient way considering the number and size of the targeted genes and probes. During the course of this doctoral thesis, NGS technologies have been further developed in a rapid way. For most applications, PCR-based technologies for target enrichment have been dis-placed by hybridization-based methods. Of the originally three competing techniques of high-throughput sequencing the “sequencing-by-synthesis” method (Illumina) has become the widely accepted standard. This development is reflected in the data generated in this doctoral thesis. KW - Diagnostik KW - DNA-Sequenz KW - Erbkrankheit KW - Next Generation Sequencing KW - Mutation KW - Humangenetik Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116854 ER - TY - THES A1 - Czakai, Kristin Bernadette T1 - Interaktionen des humanpathogenen Pilzes Aspergillus fumigatus mit dem angeborenen Immunsystem und Thrombozyten T1 - Interaction of the human pathogenic mold Aspergillus fumigatus with the innate immune system and platelets N2 - Pilze sind in unserer Umwelt allgegenwärtig und besiedeln im Fall von Candida albicans (C. albicans) sogar bei über 50% der Menschen die Schleimhäute, während Sporen von Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) täglich über die Atmung in die Lunge des Menschen gelangen. Dennoch sind Erkrankungen, die durch diese zwei Pilze ausgelöst werden, bei gesunden Menschen selten. Ist jedoch das Immunsystem beeinträchtigt, können diese Pilze zu systemischen und damit lebensbedrohlichen Erkrankungen wie der invasiven Aspergillose und der systemischen Candidiasis führen. Für eine Verbesserung der Behandlung solcher Infektionen ist das genaue Verständnis der Immunabwehrmechanismen entscheidend. Da A. fumigatus über die Lunge in den Körper gelangt, wurden in dieser Arbeit die häufigsten Immunzellen der Lunge, die Makrophagen, und deren Immunantwort auf A. fumigatus untersucht. Parallel hierzu wurden dendritische Zellen (DCs) verwendet, die als Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem wirken. Ein besonderes Augenmerk wurde hierbei auf A. fumigatus induzierte Genexpressionsänderungen und deren Regulationsmechanismen gelegt. Dabei wurden kurze, regulatorische RNAs, die sogenannten miRNAs, untersucht, die eine wichtige Rolle in der post-transkriptionalen Genregulation spielen. Bislang ist nur wenig über die miRNA-abhängigen Genregulationen in DCs, die auf eine Infektion mit A. fumigatus oder C. albicans reagieren, bekannt. Um alle durch A. fumigatus und C. albicans regulierten miRNAs zu identifizieren, wurden DCs mit A. fumigatus und C. albicans ko-kultiviert und anschließend eine Komplettsequenzierung der kurzen RNAs durchgeführt. Die Pilz-spezifische Induktion der miRNA-Regulation wurde zudem mit der miRNA-Regulation durch den bakteriellen Zellwandbestandteil Lipopolysaccharid verglichen. Durch die Stimulation mit Keimschläuchen von A. fumigatus wurden die miRNAs miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p und miR-9-5p in DCs induziert. Diese wurden ebenfalls durch C. albicans induziert, zudem noch die miRNAs miR-147a und miR-147b. Spezifisch für A. fumigatus war die Regulation der miR-129-2-3p. Neben dem miRNA-Profiling wurde auch das mRNA-Transkriptom über Microarrays analysiert und dadurch 18 potentielle Zielgene der Pilz-induzierten miRNAs identifiziert. Neben den Elementen der Translationsregulation wurden auch die Transkriptionsfaktoren untersucht. Als einziger unter den 60 regulierten Transkriptionsfaktoren zeigte KLF4 eine veränderte Expressionsrichtung in DCs, die mit Pilzen oder LPS behandelt waren. Während die Stimulation mit LPS die Expression von KLF4 induzierte, wurde es durch die Pilze A. fumigatus und C. albicans reprimiert. In einer Untersuchung der unterschiedlichen A. fumigatus-Rezeptoren, wurde deren Einfluss auf die KLF4-Regulation gezeigt. Während TLR4-Liganden KLF4 induzierten, führten Liganden, die an die Rezeptoren TLR2/TLR1 und Dectin-1 binden, zu einer Reduktion von KLF4. Nach einem erfolgreich etablierten KLF4-knock-down mittels RNA-Interferenz wurden KLF4-Zielgene untersucht. Während kein bzw. nur ein geringer Effekt auf die Genexpression von CCL2, RANTES, CXCL10 und TNF beobachtet wurde, sorgte der KLF4 knock-down für eine hoch signifikante Reduktion der IL6-Genexpression in LPS-stimulierten DCs. Um die KLF4-Regulation weiter zu untersuchen, wurde zudem eine weitere Zellpopulation des angeborenen Immunsystems, die Makrophagen, verwendet. Auch hier wurde die Immunantwort gegen A. fumigatus analysiert. Zudem wurde die Rolle der Thrombozyten als Immunmediatoren betrachtet. Zuerst wurde ein Zytokinprofil des plättchenreichen Plasmas (PRP), das mit A. fumigatus stimuliert wurde, erstellt. In diesem konnte nur RANTES in hoher Konzentration nachgewiesen werden. Daraufhin wurde der Einfluss von PRP auf die Reifung von DCs, die Phagozytosefähigkeit von Makrophagen und DCs sowie der Einfluss von DCs und Makrophagen auf die metabolische Aktivität von A. fumigatus in An- und Abwesenheit von plättchenreichem Plasma untersucht. Es konnte eine gering verstärkte Reifung der DCs durch PRP gezeigt werden. Isolierte Thrombozyten konnten die Phagozytose von DCs steigern, während Makrophagen durch PRP verstärkt Konidien phagozytierten. In einem genomweiten Transkriptomprofiling wurde die Immunantwort von DCs und Makrophagen verglichen. Zudem wurde untersucht, wie PRP die Immunantwort dieser Immunzellen beeinflusst. Es wurden 2 bzw. 24 Gene identifiziert, die signifikant in A. fumigatus-stimulierten DCs und Makrophagen reguliert waren. Hierbei wurde gezeigt, dass KLF4 durch die Zugabe von PRP herabreguliert wurde. Das zuvor beschriebene Zielgen IL6 wurde durch PRP in A. fumigatus-stimulierten DCs gegenüber stimulierten DCs ohne PRP deutlich reduziert, wodurch sich eine immunmodulatorische Fähigkeit des PRP zeigte. Die Induktion von IL-6, weiteren Zytokinen und der Reifemarker durch A. fumigatus in DCs wurden zudem in einem Booleschen Modell simuliert. Dieses Modell soll in Zukunft Vorhersagen über experimentelle Ergebnisse und dadurch eine optimale Versuchsvorbereitung ermöglichen. N2 - Fungi are ubiquitously distributed and around 50% of human mucosae are colonized by Candida albicans. Spores of Aspergillus fumigatus, called conidia, reach the human lung by inhalation of normal air. Still, fungi normally do not cause severe diseases in healthy individuals. Immunosuppression, however, predisposes to systematic and therefore life-threatening infection like invasive aspergillosis and systemic candidiasis. The treatment of those infections can only be improved by a detailed insight in immune defense mechanisms. The most prominent cell type in the lung, the location where A. fumigatus conidia can germinate and grow into tissue, are macrophages. Furthermore, the immune response of DCs that bridge innate and adaptive immunity was compared to macrophages. The main focus was on A. fumigatus induced changes in gene expression and their regulatory mechanisms. Especially the regulation of small, regulatory RNAs, called miRNAs, that are important in the post-transcriptional regulation of gene expression, was examined. So far, little is known about miRNA regulations in DCs, confronted with A. fumigatus or C. albicans. Therefore a complete sequencing of small RNAs was performed to discover all regulated miRNAs. The fungi-induced regulation was compared to DCs, stimulated with the bacterial cell membrane component lipopolysaccharide (LPS). An A. fumigatus and C. albicans dependent regulation of miR-132-3p/5p, miR-155-5p, miR129-2-3p, miR-129-5p, miR-212-3p/5p and miR-9-5p was observed. In C. albicans simulated DCs miR-147a and miR-147b were additionally regulated, whereas miR-129-2-3p was specifically regulated by A. fumigatus. Furthermore a genome wide transcriptome profiling was performed and 18 potential miRNA targets were identified. Beside post-transcriptional regulators of gene expression, an analysis of transcriptional regulators, called transcription factors, was conducted. The transcription factor KLF4 was identified as the only of all 60 differentially regulated transcription factors that was oppositely regulated comparing fungi and LPS. KLF4 was induced by LPS, but strongly down-regulated by A. fumigatus and C. albicans stimulation. Specific Toll-like receptor 4 activation by LPS and ultra-pure LPS induced KLF4. However, ligands to TLR2/TLR1 and Dectin-1 significantly reduced KLF4 mRNA and protein. A KLF4 knock-down by RNA interference was established to analyze KLF4 target genes. Little or no effect was observed on the expression of CCL2, RANTES, CXCL10 and TNF. However, KLF4 knock down induced a significant reduction of IL6 gene expression and IL-6 release by LPS treated DCs. To further examine the KLF4 regulation another cell type of the innate immune system, called macrophages, was used. The A. fumigatus-induced immune response of macrophages was compared to DCs. Furthermore, the role of platelets as immune mediators was examined. At first, a cytokine profile of untreated and A. fumigatus stimulated platelet-rich plasma was performed. RANTES was identified as the only detectable cytokine. Then the influence of PRP on DC maturation, DC and macrophages phagocytosis as well as the metabolic activity of A. fumigatus was determined. Only a weak, but still significant, influence of PRP on DCs maturation induced by A. fumigatus was observed. In the analysis of phagocytosis of A. fumigatus conidia, DCs and macrophages were reacting differently to the addition of PRP and isolated platelets. Isolated platelets were able to enhance the phagocytosis of DCs. On the other hand, PRP and plasma without platelets increased phagocytosis of macrophages. In a genome wide approach the immune response of DCs and macrophages was compared and additionally examined, if PRP alters the DC and macrophage gene expression. PRP induced a significant regulation of 2 and 24 genes of A. fumigatus treated DCs and macrophages. Furthermore, an influence of PRP on the KLF4 expression was monitored. The previously described KLF4 target gene IL6 was significantly down-regulated in PRP and A. fumigatus stimulated DCs and macrophages, compared to A. fumigatus stimulated cells. In conclusion, PRP has only a weak but detectable influence on cell function and gene expression. Furthermore a Boolean model was established to analyze the influence of A. fumigatus stimulation on the cytokine release, especially of IL-6, IL-1B and TNF, and the induction of maturation markers. This model will be used for predictions and optimizations of experimental settings. KW - Aspergillus fumigatus KW - Immunsystem KW - Thrombozyt KW - angeborenes Immunsystem Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117496 ER - TY - THES A1 - Ramos Tirado, Mario T1 - Stammzellbasierte Behandlungsstrategien zur Stimmlippenaugmentation und laryngealen Defektrekonstruktion T1 - Stem cell-based treatment strategies for laryngoplasty and reconstruction of laryngeal defects N2 - Der Kehlkopf ist ein stimmerzeugendes knorpelhaltiges Organ und spielt eine wichtige Rolle in der Atemfunktion und beim aspirationsfreien Schluckakt. Funktionsstörungen des Kehlkopfs wie Stimmbandlähmungen werden durch Schädigungen des Kehlkopfnervs nach operativen Eingriffen und Halsverletzungen hervorgerufen. Des Weiteren führen durch Traumen, Teil- und komplette Resektionen verursachte Substanzdefekte des Kehlkopfs zu Funktionsverlusten. Die hierfür notwendigen und komplexen Rekonstruktionen werden durch das schlechte Regenerationspotential von Knorpelgewebe eingeschränkt und können nur bedingt durch synthetische Ersatzmaterialen oder körpereigenes Ersatzgewebe bewerkstelligt werden. Ist es möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares Knorpelersatzgewebe herzustellen, welches zur dauerhaften Wiederherstellung der Kehlkopffunktionen eingesetzt werden kann? Die zusätzliche Markierung von Stammzellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln (VSOP) als Zellmarker bietet die Möglichkeit der Detektion und der Verfolgung der Zellen mittels nicht-invasiver Nachweismethoden nach deren Implantation. Ist die Verwendung dieser Nanopartikel ohne negative Folgen für die Stammzellen möglich und sind diese für den Einsatz in der Laryngologie geeignet? Fettgewebsstammzellen (ASC) wurden aus humanem Liposuktionsmaterial und Kaninchen-Nackenfett isoliert und expandiert. Die Zellen wurden in Hydrogelkombinationen aus Kollagen Typ-I, Agarose, Fibrin und Hyaluronsäure eingebettet und mit den chondrogenen Wachstumsfaktoren TGF-β3, BMP-6 und IGF-I über 14 Tage differenziert. Anschließend wurden diese Zell-Hydrogelkonstrukte bezüglich Morphologie, extrazellulärer Matrixanreicherung und knorpelspezifischer Genexpression histologisch, immunhistochemisch und molekularbiologisch analysiert. In einem weiteren Schritt wurden die Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in natives Knorpelgewebe sowie die Defektdeckung in einem in vitro- und einem in vivo-Knorpeldefektmodell mit vor- und nicht-vordifferenzierten Zell-Hydrogelkonstrukten untersucht. Die Analyse möglicher zyto- und genotoxischer Effekte von VSOP sowie des Einflusses der Markierung von ASC mit VSOP auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential erfolgte nach der Markierung der Zellen mit unterschiedlichen VSOP-Konzentrationen. Außerdem wurden VSOP-markierte ASC in Kaninchenstimmlippen injiziert und die Nachweisbarkeit dieser Zellen im Injektionsareal histologisch und mittels Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht. Nach 14-tägiger chondrogener Differenzierung wurde in den Zell-Hydrogelkonstrukten eine knorpelähnliche Morphologie, die Anreicherung knorpelspezifischer Matrixproteine und die Expression chondrogener Markergene nachgewiesen. Die Kombination der chondrogenen Wachstumsfaktoren zeigte keinen verstärkenden Einfluss auf die Chondrogenese von ASC. Hydrogele aus Kollagen Typ I und Hyaluronsäure wiesen die stärkste extrazelluläre Matrixanreicherung auf. Bei den agarosefreien Hydrogelen war eine ausgeprägte Gelschrumpfung auffällig. In den beiden Knorpeldefektmodellen konnte weder eine Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in den Nativknorpel noch eine vollständige Defektdeckung nachgewiesen werden. Nach der Markierung von ASC mit VSOP zeigte sich bei der höchsten Konzentration von 1,5 mM eine genotoxische Wirkung. Zytotoxische Effekte sowie Einflüsse der Markierung auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential von ASC waren nicht nachweisbar. VSOP-markierte ASC konnten nach deren Injektion in Kaninchenstimmlippen im Injektionsareal nur vereinzelt mittels MRT und histologisch nachgewiesen werden. Es ist möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares knorpelähnliches Gewebe herzustellen. Dabei begünstigen agarosefreie Trägermaterialien die chondrogene Differenzierung von ASC. Diese könnte durch die jeweilige Erhöhung der Zelldichte und Wachstumsfaktorkonzentrationen sowie die Verlängerung der Induktionszeit verstärkt werden. Eine mögliche klinische Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe in der Laryngologie ist jedoch durch deren Schrumpfung wie auch mangelnde Integration und Defektdeckung noch weit entfernt. Aufgrund ihrer genotoxischen Wirkung kann eine Verwendung von VSOP als Zellmarker auch unterhalb von 1,5 mM ohne negative Folgen für den Organismus nicht sicher ausgeschlossen werden. Der inhomogene Gewebekontrast im Kehlkopf, die schlechte Auflösung im MRT und die geringe Größe von VSOP erschweren die Nachweisbarkeit und Verfolgung markierter Zellen mittels MRT. Daher sind andere nicht-invasive Nachweismethoden für die Verwendung von VSOP im Kehlkopf zu evaluieren. Der möglichen Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe und VSOP in der rekonstruktiven Laryngologie muss eine erfolgreiche Optimierung und ausführliche positive Validierung in klinischen Tests vorausgehen. N2 - The larynx is a voice-producing and cartilage-containing organ that plays an important role in the respiratory function and aspiration-free swallowing. Dysfunctions of the larynx, such as vocal cord paralysis, are caused by damage to the laryngeal nerve after surgery and neck injuries. Furthermore, tissue defects caused by trauma and partial or complete resection of the larynx lead to loss of functions. The required and complex reconstructions are limited by the poor regeneration potential of cartilage, and can only be partially accomplished by synthetic graft materials or autologous replacement tissue. Is it possible to generate implantable cartilage replacement tissues that can be used for permanent restoration of laryngeal functions out of autologous stem cells and biocompatible scaffolds by the means of tissue engineering? The supplementary labeling of stem cells with very small superparamagnetic iron oxide nanoparticles (VSOP) as cell markers offers the possibility to identify and trace the cells after their implantation using non-invasive detection methods. Can VSOP be used without negative consequences for the stem cells, and are these nanoparticles suitable for application in laryngology? Adipose tissue-derived stem cells (ASC) were isolated from human liposuction material and rabbit nuchal fat. After expansion, the cells were embedded in hydrogel combinations of collagen type I, agarose, fibrin and hyaluronic acid and then differentiated with the chondrogenic growth factors TGF-β3, BMP-6, and IGF-I for 14 days. Subsequently, these cell-seeded hydrogel constructs were analyzed histologically, immunohistochemically and molecular biologically regarding morphology, extracellular matrix accumulation and cartilage-specific gene expression. In a further step, the integration of pre- and non predifferentiated cell-seeded hydrogel constructs into native cartilage tissue and defect coverage were examined in cartilage defect models in vitro and in vivo. The analysis of potential cytotoxic and genotoxic effects of VSOP, as well as the influence of the nanoparticles on proliferation, migration, and multilineage potential of ASC, was performed after labeling the cells with different VSOP concentrations. In addition, VSOP-labeled ASC were injected into rabbit vocal folds and the detectability of these cells in the injection area was examined histologically and by magnetic resonance imaging (MRI). A cartilage-like morphology, the accumulation of cartilage-specific matrix proteins and the expression of chondrogenic marker genes, was observed in the cell-seeded hydrogel constructs after 14 days of chondrogenic differentiation. The combination of the chondrogenic growth factors had no reinforcing effect on the chondrogenesis of ASC. Hydrogels of collagen type I and hyaluronic acid showed the strongest extracellular matrix accumulation. A pronounced shrinkage was observed with agarose-free hydrogels. In the cartilage defect models neither an integration of the cell-seeded hydrogel constructs into the native cartilage nor a complete defect coverage were detected. The labeling of ASC with the highest VSOP concentration of 1.5 mM induced genotoxic effects. Cytotoxic effects and influences of labeling with VSOP on proliferation, migration and multilineage potential of ASC could not be observed. After their injection into rabbit vocal folds VSOP-labeled ASC were only sporadically detected histologically and by MRI in the injection area. It is possible to generate implantable cartilage-like tissues out of autologous stem cells and biocompatible scaffolds by the means of tissue engineering. Here, agarose-free scaffolds promote the chondrogenic differentiation of ASC. This may be enhanced by increasing the cell density and growth factor concentrations as well as extending the induction time. Because of their shrinkage and the lack of integration and defect coverage, a possible clinical application of these cartilage-like tissues in laryngology is still far away. Due to the genotoxic effects of 1.5 mM VSOP, the use of these nanoparticles as cell markers without negative consequences for the organism cannot be ruled out with certainty at lower concentrations. The inhomogeneous tissue contrast in the larynx, a poor resolution in MRI and the small size of VSOP make labeled cells difficult to detect and trace in the larynx by MRI. Therefore, other non-invasive detection methods for the use of VSOP in the larynx have to be evaluated. The potential application of these cartilage-like tissues and VSOP in reconstructive laryngology must be preceded by successful optimization and extensive positive validation in clinical trials. KW - Tissue Engineering KW - Hydrogele KW - Hydrogel KW - Fettgewebsstammzellen KW - Eisenoxidnanopartikel KW - Stammzelle KW - Kehlkopf Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117528 ER - TY - THES A1 - Zhu, Ana Cheng T1 - Metagenomic analysis of genetic variation in human gut microbial species T1 - Metagenomische Analysen der genetischen Variationen in menschlichen Darmbakterien N2 - Microbial species (bacteria and archaea) in the gut are important for human health in various ways. Not only does the species composition vary considerably within the human population, but each individual also appears to have its own strains of a given species. While it is known from studies of bacterial pan-genomes, that genetic variation between strains can differ considerably, such as in Escherichia coli, the extent of genetic variation of strains for abundant gut species has not been surveyed in a natural habitat. This is mainly due to the fact that most of these species cannot be cultured in the laboratory. Genetic variation can range from microscale genomic rearrangements such as small nucleotide polymorphism (SNP) to macroscale large genomic rearrangements like structural variations. Metagenomics offers an alternative solution to study genetic variation in prokaryotes, as it involves DNA sequencing of the whole community directly from the environment. However, most metagenomic studies to date only focus on variation in gene abundance and hence are not able to characterize genetic variation (in terms of presence or absence of SNPs and genes) of gut microbial strains of individuals. The aim of my doctorate studies was therefore to study the extent of genetic variation in the genomic sequence of gut prokaryotic species and its phenotypic effects based on: (1) the impact of SNP variation in gut bacterial species, by focusing on genes under selective pressure and (2) the gene content variation (as a proxy for structural variation) and their effect on microbial species and the phenotypic traits of their human host. In the first part of my doctorate studies, I was involved in a project in which we created a catalogue of 10.3 million SNPs in gut prokaryotic species, based on metagenomes. I used this to perform the first SNP-based comparative study of prokaryotic species evolution in a natural habitat. Here, I found that strains of gut microbial species in different individuals evolve at more similar rates than the strains within an individual. In addition, I found that gene evolution can be uncoupled from the evolution of its originating species, and that this could be related to selective pressure such as diet, exemplified by galactokinase gene (galK). Despite the individuality (i.e. uniqueness of each individual within the studied metagenomic dataset) in the SNP profile of the gut microbiota that we found, for most cases it is not possible to link SNPs with phenotypic differences. For this reason I also used gene content as a proxy to study structural variation in metagenomes. In the second part of my doctorate studies, I developed a methodology to characterize the variability of gene content in gut bacterial species, using metagenomes. My approach is based on gene deletions, and was applied to abundant species (demonstrated using a set of 11 species). The method is sufficiently robust as it captures a similar range of gene content variability as has been detected in completely sequenced genomes. Using this procedure I found individuals differ by an average of 13% in their gene content of gut bacterial strains within the same species. Interestingly no two individuals shared the same gene content across bacterial species. However, this variation corresponds to a lower limit, as it is only accounts for gene deletion and not insertions. This large variation in the gene content of gut strain was found to affect important functions, such as polysaccharide utilization loci (PULs) and capsular polysaccharide synthesis (CPS), which are related with digestion of dietary fibers. In summary, I have shown that metagenomics based approaches can be robust in characterizing genetic variation in gut bacterial species. I also illustrated, using examples both for SNPs and gene content (galK, PULs and CPS), that this genetic variation can be used to predict the phenotypic characteristics of the microbial species, as well as predicting the phenotype of their human host (for example, their capacity to digest different food components). Overall, the results of my thesis highlight the importance of characterizing the strains in the gut microbiome analogous to the emerging variability and importance of human genomics. N2 - Mikrobielle Arten (Bakterien und Archaeen) im menschlichen Darm sind wichtige Begleiter für unsere Gesundheit. Jedoch gibt es nicht nur starke Unterschiede zwischen individuellen Wirten in der Artenzusammensetzung des Darmmikrobioms, sondern es scheint sogar Individuen-spezifische Bakterienstämme zu geben. Analysen von Bakterien wie z.B. Escherichia coli haben schon früh gezeigt, dass die Genome von Bakterienstämmen derselben Art große Unterschiede aufzeigen können; jedoch wurden diese Unterschiede bisher noch nicht in einer natürlichen Umgebung gezeigt. Genetische Variation kann viele Ausprägungen haben und reicht von kleinen Veränderungen wie „small nucleotide polymorphism“ (SNP) zu makroskopischen Veränderung, wie z.B. chromosomalen Restrukturierungen. All diese genetischen Variationen wurden bis jetzt nicht in der natürlichen Umgebung der Bakterien studiert, vorallem bedingt durch fehlende Methoden um die meisten dieser Bakterien um Labor zu kultivieren. Metagenomische Studien können hier helfen, da sie unabhängig von Kultivierungen jegliche DNS aus einer natürlichen Bakteriengemeinschaft untersuchen. Jedoch wurde dies in den meisten bisher veröffentlichten metagenomischen Studien nicht ausgenutzt da diese hauptsächlich auf die Anzahl der gefunden Gene ausgerichtet waren. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, die genetische Variation in Darmbakterien zu beschreiben und phenotypische Veränderungen zu untersuchen. Dies habe ich umgesetzt durch die Erforschung (1) der SNP-Varianz in Darmbakterien, mit besonderem Augenmerk auf Gene, die unter einem selektivem Druck stehen und (2) der Variationen in der Genzusammensetzung eines Genomes (als eine Annäherung an strukturelle Variationen) und welchen Effekt dies auf Mikrobenarten und Wirtsphenotypen hat. Im ersten Kapitel meiner Doktorarbeit beschreibe ich meine Arbeit in einem Projekt unserer Gruppe, in dem wir basierend auf metagenomischen Daten 10 Millionen SNPs in menschlichen Darmbakterien beschrieben haben. Diesen Datensatz habe ich verwendet um die erste SNP-basierte, vergleichende Studie der Bakterienevolution in einem natürlichen Habitat zu realisieren. Ich entdeckte, dass Bakterienstämme unabhängig vom Wirt ähnliche evolutionäre Raten haben. Genauer gesagt, die evolutionäre Rate für eine Art ist stabiler zwischen Wirten, als die von verschiedenen Spezies innerhalb eines Wirtes. Ausserdem fand ich heraus, dass die Evolution von einzelnen Genen unabhängig vom restlichen Genom einer Spezies ist. Dies könnte durch einen Selektionsdruck wie z.B. die Ernährung des Wirtes ausgelöst werden, was ich am Beispiel des Galactokinasegenes (galK) gezeigt habe. Obwohl wir zeigen konnten, dass das SNP-Profil der Darmbakterien spezifisch für den jeweiligen Wirt ist, konnten wir keine Assoziation zwischen SNPs und Wirtsphänotypen finden. Auch aus diesem Grund habe ich mich in meiner weiteren Arbeit verstärkt auf makroskopische Genomvariationen konzentriert. Im zweiten Teil meiner Doktoarbeit entwickelte ich eine neue Methode, um Variationen in der genomische Zusammensetzung von einzelnen Bakterienarten zu beschreiben, wieder basierend auf metagenomischen Daten. Hierbei fokussiere ich mich insbesondere auf Gene, die in unseren metagenomischen Daten im Verglich zum Referengenom fehlen und wende dies auf die 11 dominantesten Bakterienspezies an. Diese neue Methode ist robust, da die gefundene Genomvarianz in unseren metagenomischen Daten übereinstimmt mit Daten aus komplett sequenzierten Genomen. So konnte ich herausfinden, dass im Durchschnitt 13% der Gene einer Bakterienart zwischen einzelen Wirten varieren. Besonders interessant ist hier, dass wir keine zwei Wirte gefunden haben, die für eine Bakterienart genau diesselben Gene haben. Jedoch ist die erwarte Varianz aller Wahrscheinlichkeit nach noch größer, da ich mit dieser Methode nur fehlende Gene beschreiben kann, aber nicht neu hinzugekommende. Diese Varianz kann auch wichtige bakterielle Funktionen betreffen, z.B. Gene für „polysaccharide utilization loci“ (PULs) und „capsular polysaccharide synthesis“ (CPS), welche wichtig sind um Ballaststoffe in der Nahrung zu verwerten. Zusammenfassend konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass metagenomische Methoden robust genug sind um die genetische Varianz von Darmbakterien zu beschreiben. Ausserdem konnte ich zeigen, dass die beschriebene Varianz benutzt werden kann, um phenotypische Veränderungen von Bakterien vorherzusagen (demonstriert für die galK, PULs and CPS-Gene). Dies wiederrum könnte benutzt werden um Vorhersagen für den Wirt über z.B. seine Ernährung zu machen. Meine Doktorarbeit zeigt wie wichtig es ist, einzelne Bakterienstämme zu charakterisieren, ganz analog zu der Bedeutsamkeit der genetischen Varianz des menschlichen Genomes. KW - metagenomic KW - Darmflora KW - Metagenom Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113890 ER - TY - THES A1 - Konrad, Tillmann T1 - Governance of Protected Areas in West Africa - The case of the W-Arly-Pendjari (WAP) Complex in Benin and Burkina Faso T1 - Governance von Schutzgebieten in Westafrika - Eine Fallstudie zum W-Arly-Pendjari (WAP) Komplex in Benin und Burkina Faso N2 - Protected areas are the central strategy for preserving biodiversity in the face of overexploitation and global change. To ensure their long-term survival, however, these areas may not be regarded as last havens of wilderness, but as complex social-ecological systems. Modern approaches of protected area (PA) management support this view by balancing conservation and development issues in a sustainable way and adapted to the local context. However, success of these strategies in achieving their aims so far remains limited. This study therefore aimed at analysing processes and outcomes of PA co-management approaches implemented in a large transfrontier conservation area in West Africa. The W-Arly-Pendjari (WAP) complex spans over more than 30.000 square km in Benin, Burkina Faso and Niger and is composed of approximately 20 subunits. Due to national legal and administrative variety as well as a high diversity of local (project) implementation approaches, the general setting resembled a quasi-experimental design facilitating comparative studies. A mix of quantitative (e.g. survey of 549 households) and qualitative (e.g. expert interviews, literature review) methods was used to evaluate the institutional and organisational differences of PA management approaches implemented in the different parts of WAP belonging to Benin and Burkina Faso. I included an analysis of contextual factors (e.g. land-cover-change) and ecological data, but concentrated on the role of local resource users within the co-management arrangements and the effectiveness of governance regimes to deliver positive socio-economic outputs. Exploring the question whether promotion of development in PA surroundings indeed stipulates conservation success (and vice versa) remained challenging: the lack of sound ecological data, a general mismatch of spatial scale in existing data sets, as well as the high complexity of realities on the ground made me refrain from using simplified proxy indicators and (statistical) modelling approaches. I found that the Sudano-Sahelian context is a very difficult one for the implementation of effective participation approaches in the short-term. Political, demographic, socio-economic as well as ecological factors generated a very dynamic situation characterized by limited financial and natural resources as well as weak institutional and organisational settings. Arenas of interaction were often marked rather by a high degree of distrust and competition than by cooperation among actors. Amid all rhetoric, participation in most cases was hence limited to the transfer of (sparse) information, regulated resource access and financial funds. Options for participation of local resource users in decision-making arenas were generally scarce. Underlying processes were dominated by opacity and often low accountability of actors on all levels. Negative, but also positive affection of local residents by PA existence and management hence was high. Governance regimes of the complex performed very differently with regard to their ability of effectively empowering local village participatory bodies (vpb), generating and distributing benefits to individuals and village communities as well as providing mechanisms of conflict resolution. People around Pendjari enjoyed a relative wealth of high value benefits, while negative impacts caused by human-wildlife conflicts were widespread around the complex. Autochthonous farmers usually were better integrated in incentive schemes than were newcomers or herders. While there was functional separation of actors’ roles in all parts of WAP, these roles differed significantly between blocks. Existence and functioning of village participatory bodies ameliorated the situation for local resource users fundamentally, as they acted as cut-points between different networks (governmental hierarchies, private concessionaires and local resource users). Vpbs in the Pendjari region proved to be most advanced in their capacity to push resource users’ claims in action arenas on the micro-level. Via their union, these associations also managed to impact arenas on the meso- and the macro scale. Project interventions often had catalyst functions to empower local resource users and their vbps. However, they also contributed to social imbalance and intra-organisational competition. My results represent a snapshot of an ongoing process to establish effective co-governance regimes in the WAP-area. Though I identified a large scope of shortcomings, there were also very promising initiatives underway. This work is therefore meant to foster future research and further positive development by giving guidance scholars and decision-makers form the local to the global level alike. N2 - Schutzgebiete spielen eine zentrale Rolle für den Schutz von Biodiversiät vor anthropogener Übernutzung und negativen Auswirkungen anderer Global-Change-Prozessen. Damit sie diese Funktion auch langfristig erfüllen können, dürfen diese Gebiete nicht als letzte Wildnisregionen verklärt, sondern müssen als komplexe sozio-ökologische Systeme wahrgenommen werden. Moderne Managementansätze tragen dieser Sichtweise Rechnung, indem sie Schutzmaßnahmen und Entwicklungsansätze miteinander verbinden. Diese Lösungen zielen auf Nachhaltigkeit ab und sind – im Idealfall – an den lokalen Kontext angepasst. Der Erfolg dieser Strategie bleibt in der Praxis jedoch hinter den Erwartungen zurück. Die vorliegende Studie analysiert die Implementierung und Effektivität von Ko-Management-Ansätzen in einem großen grenzübergreifenden Schutzgebietskomplex in Westafrika. Dieses Gebiet erstreckt sich über 30.000 km2 in den Ländern Burkina Faso, Benin und Niger und setzt sich aus ca. 20 Subkomponenten zusammen. Benannt wurde der Komplex nach seinen drei Kerngebieten (W-Arly-Pendjari (WAP)). Aufgrund der unterschiedlichen juristischen und administrativen Rahmenbedingungen zwischen den beiden Ländern sowie der Vielzahl an lokalen Implementierungsansätzen, ähneln die Voraussetzungen einem quasi-experimentellem Design und bieten sich für eine vergleichende Studie an. Mit Hilfe verschiedener quantitativer (z.B. Befragung von 549 Haushalten) und qualitativer (z.B. Experteninterviews) Methoden wurden die institutionellen und organisatorischen Voraussetzungen für Schutzgebietsmanagement in Benin und Burkina Faso erfasst und die implementierten Governance-Ansätze evaluiert. Neben der Analyse verschiedener Kontextfaktoren (z.B. zu Landnutzung) und ökologischer Daten (z.B. zu Populationsentwicklungen von großen Säugetierarten), lag die Rolle lokaler Ressourcennutzer in den Ko-Management-Systemen im Fokus. Die zentrale Fragestellung konzentrierte sich auf die Effektivität der unterschiedlichen Governance-Regime, positive sozio-ökonomische Ergebnisse zu erzielen und die zu Grunde liegenden Interaktionen der beteiligten Akteure zu identifizieren. Die Frage, ob die gezielte Entwicklungsförderung von Gemeinden im unmittelbaren Umfeld von Schutzgebieten tatsächlich auch zu erhöhtem Naturschutzerfolg führt, musste weitestgehend offen bleiben: das Fehlen von zuverlässigen ökologischen Daten, unterschiedliche räumliche Skalenniveaus in den vorhandenen Datensätzen, sowie die hohe Komplexität der Bedingungen vor Ort ließen keine (statistisch) belastbare Auswertung zu. Die Kontextanalyse zeigte, dass Westafrika ein sehr schwieriges Umfeld für die schnelle Implementierung von Partizipationsansätzen darstellt. Die Region ist gekennzeichnet durch hohe Dynamik und Variabilität in ihren politischen, demographischen, sozio-ökonomischen und ökologischen Rahmenbedingungen. Das Management von sozio-ökologischen Systemen leidet daher massiv unter der Limitierung an natürlichen und finanziellen Ressourcen sowie schwachen organisatorischen und institutionellen Strukturen. Interaktionen zwischen den einzelnen Akteuren waren stärker von Misstrauen und Konkurrenz als von Kooperation geprägt. Entgegen des von einigen Akteuren nach außen vermittelten Bildes, war die Partizipation lokaler Ressourcennutzer limitiert auf die Weitergabe von (unvollständigen) Informationen, sowie dem regulierten Zugang zu natürlichen Ressourcen und begrenzten finanziellen Mitteln. Die Möglichkeit, an Prozessen zur Problemlösung und Entscheidungsfindung mitzuwirken war nur partiell und räumlich eingeschränkt gegeben. Die zu Grunde liegenden Prozesse waren gekennzeichnet von Intransparenz und geringer Verantwortlichkeit der Akteure auf allen Ebenen. Die Anwohner waren daher häufig in hohem Maß von negativen Auswirkungen der Schutzgebiete betroffen. Die Governance-Strukturen in verschiedenen Teilen des Komplexes variierten stark in ihrem Vermögen, lokale Partizipationsorgane aufzubauen und in aktuelle Management-Prozesse einzubinden, Vorteile für lokale Ressourcennutzer und Gemeinden zu generieren und gerecht zu verteilen, sowie effektive Mechanismen zur Konfliktbewältigung zu etablieren. Insbesondere die Anrainer des Biosphärenreservats Pendjari genossen eine relative Vielzahl qualitativ hochwertiger Vorteile; negative Auswirkungen der Schutzgebiete durch Mensch-Tier-Konflikte waren hingegen in allen Subkomponenten des Komplexes weit verbreitet und blieben weitestgehend unadressiert. Autochthone Ackerbauern waren generell besser in die Anreizsysteme des Parkmanagements eingebunden als neu hinzugezogene Ressourcennutzer oder Viehhirten. Die funktionellen Rollen der einzelnen Akteursgruppen waren zwar in allen Teilen des Komplexes stark differenziert, unterschieden sich aber signifikant zwischen den Subkomponenten. Die Existenz aktiver und vernetzter Partizipationsorgane auf lokaler Ebene, verbesserte die Lage von Ressourcennutzern fundamental, da sie als Schnittstellen zwischen den verschiedenen Netzwerken (staatlichen Hierarchien, privaten Marktakteuren und sozialen Netzwerken auf Gemeinschaftsebene) agieren und Kompromisse vermitteln konnten. Partizipationsorgane in der Pendjari-Region waren auf Grund ihres vergleichweise hohen Organisationsgrades am effektivsten in der Lage, die Interessen lokaler Ressourcennutzer in den entsprechenden Arenen auf der Mikro-Ebene zu vertreten. Über den Zusammenschluss aller lokalen Partizipationsorgane in Form einer Union konnten sie auch Arenen auf der Meso- und Makroebene beeinflussen. Von externen Geldgebern gesteuerte Projekte erfüllten häufig eine katalytische Funktion, lokale Ressourcennutzer und ihre Partizipationsorgane für ihre Rolle als Ko-Manager anzuleiten. Sie verursachten aber auch soziales Ungleichgewicht und erhöhte Konkurrenz zwischen den Akteursgruppen auf lokaler Ebene. Die vorgelegten Ergebnisse stellen lediglich eine Momentaufnahme des Prozesses dar, effektive Ko-Management- Ansätze in der WAP-Region aufzubauen. Zwar wurde eine große Anzahl an Schwächen identifiziert, gleichermaßen gab es aber auch vielversprechende Ansätze für die Zukunft. Die Arbeit ist als Grundlage für die weiterführende Forschung und Entwicklung dieser positiven Ansätze gedacht. Sie adressiert daher die Wissenschaftsgemeinde ebenso wie die Entscheider von der lokalen bis zur globalen Ebene. KW - Geschützte Natur KW - Protected Area KW - West Africa KW - W Arly Pendjari WAP KW - Participation KW - Westafrika KW - Governance Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115331 ER - TY - THES A1 - Winkler, Ann-Cathrin Nicole T1 - Identification of human host cell factors involved in \(Staphylococcus\) \(aureus\) 6850 infection T1 - Identifizierung von humanen Wirtszellfaktoren die eine Rolle bei der \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infektion spielen N2 - Staphylococcus aureus is both a human commensal and a pathogen. 20%-30% of all individuals are permanently or occasionally carriers of S. aureus without any symptoms. In contrast to this, S. aureus can cause life-threatening diseases e.g. endocarditis, osteomyelitis or sepsis. Here, the increase in antibiotic resistances makes it more and more difficult to treat these infections and hence the number of fatalities rises constantly. Since the pharmaceutical industry has no fundamentally new antibiotics in their pipeline, it is essential to better understand the interplay between S. aureus and the human host cell in order to find new, innovative treatment options. In this study, a RNA interference based whole genome pool screen was performed to identify human proteins, which play a role during S. aureus infections. Since 1,600 invasion and 2,271 cell death linked factors were enriched at least 2 fold, the big challenge was to filter out the important ones. Here, a STRING pathway analysis proved to be the best option. Subsequently, the identified hits were validated with the help of inhibitors and a second, individualised small interfering RNA-based screen. In the course of this work two important steps were identified, that are critical for host cell death: the first is bacterial invasion, the second phagosomal escape. The second step is obligatory for intracellular bacterial replication and subsequent host cell death. Invasion in turn is determining for all following events. Accordingly, the effect of the identified factors towards these two crucial steps was determined. Under screening conditions, escape was indirectly measured via intracellular replication. Three inhibitors (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) could be identified for the invasion process. In addition, siRNAs targeted against 16 different genes (including CAPN2, CAPN4 and PIK3CG), could significantly reduce bacterial invasion. Seven siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) were able to inhibit intracellular replication significantly. Further studies showed that the IP3 receptor inhibitor 2-APB, the calpain inhibitor calpeptin and the proteasome inhibitor MG-132 are able to prevent phagosomal escape and as a consequence intracellular replication and host cell death. In this context the role of calpains, calcium, the proteasome and the mitochondrial membrane potential was further investigated in cell culture. Here, an antagonistic behaviour of calpain 1 and 2 during bacterial invasion was observed. Intracellular calcium signalling plays a major role, since its inhibition protects host cells from death. Beside this, the loss of mitochondrial membrane potential is characteristic for S. aureus infection but not responsible for host cell death. The reduction of membrane potential can be significantly diminished by the inhibition of the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger. All together, this work shows that human host cells massively contribute to different steps in S. aureus infection rather than being simply killed by bacterial pore-forming toxins. Various individual host cell factors were identified, which contribute either to invasion or to phagosomal escape and therefore to S. aureus induced cytotoxicity. Finally, several inhibitors of S. aureus infection were identified. One of them, 2-APB, was already tested in a sepsis mouse model and reduced bacterial load of kidneys. Thus, this study shows valuable evidence for novel treatment options against S. aureus infections, based on the manipulation of host cell signalling cascades. N2 - Staphylococcus aureus kann sowohl ein Bestandteil der natürlichen Hautflora als auch ein Krankheitserreger sein. 20%-30% aller Menschen werden, permanent oder zeitweise, von S. aureus besiedelt, ohne Krankheitssymptome aufzuweisen. Im Gegensatz dazu kann S. aureus lebensbedrohliche Krankheiten wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Sepsis verursachen. Diese Infektionen können immer schlechter behandelt werden, da immer mehr Stämme Resistenzen gegen die vorhandenen Antibiotika aufweisen. Dies führt zu einer steigenden Anzahl an Todesfällen, die auf Staphylokokkeninfektionen zurückzuführen sind. Da die Pharmaindustrie keine grundlegend neuen Antibiotika kurz vor der Marktreife hat, ist ein besseres Verständnis für das Wechselspiel zwischen Staphylokokken und ihren menschlichen Wirtszellen unbedingt notwendig, um neue, innovative Behandlungsmöglichkeiten finden zu können. Dafür wurde in dieser Arbeit ein genomweiter RNA-interferenz basierter Screen durchgeführt. Es sollten so die Proteine identifiziert werden, die eine Rolle bei der Staphylokokkeninfektion spielen. Da 1.600 invasionsrelevante und 2.271 zelltodrelevante Faktoren mindestens 2-fach angereichert waren, musste ein Weg gefunden werden die wichtigen Faktoren herauszufiltern. Eine STRING-Pathwayanalyse stellte sich als die beste Methode hierfür heraus. In einem zweiten Schritt wurden die so identifizierten Faktoren mit Inhibitoren oder einzelnen siRNAs ein weiteres Mal herunterreguliert, um ihre tatsächlichen Auswirkungen auf den Infektionsverlauf zu untersuchen. Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dem S. aureus induzierten Wirtszelltod mindestens zwei wichtige Schritte vorausgehen müssen. Erstens die Invasion der Wirtszelle und zweitens der Ausbruch aus dem Phagosom. Nur so können sich im dritten Schritt die Bakterien intrazellulär vermehren und die Zelle töten. Daher wurde der Einfluss der identifizierten Faktoren auf diese beiden entscheidenden Prozesse untersucht. Der Ausbruch wurde unter Screenkonditionen indirekt über die intrazelluläre Vermehrung bestimmt. Es konnten drei Inhibitoren (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) identifiziert werden, die die bakterielle Invasion vermindern. Darüber hinaus wurden 16 Proteine (unter anderem CAPN2, CAPN4 und PIK3CG) gefunden, deren Herunterregulation durch siRNAs, eine signifikant reduzierte Invasion zur Folge hatten. Sieben siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) waren in der Lage die intrazelluläre Vermehrung signifikant zu verringern. In nachfolgenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass der IP3-Rezeptorinhibitor 2-APB, der Calpaininhibitor Calpeptin und der Proteasominhibitor MG-132 den Ausbruch aus dem Phagosom, sowie die darauffolgenden Ereignisse (intrazelluläre Vermehrung und Wirtszelltod) inhibieren können. In diesem Zusammenhang wurden die Einflüsse von Calpainen, Calcium, dem Proteasom sowie dem mitochondrialen Membranpotentialverlust im Zellkulturmodell im Detail weiter untersucht. So konnte eine gegensätzliche Rolle von Calpain 1 und 2 bei der S. aureus Invasion festgestellt werden. Die intrazelluläre calciumabhängige Signalweiterleitung spielt eine bedeutende Rolle bei der S. aureus Infektion, da ihre Inhibition eine normale Infektion verhindert. Das mitochondriale Membranpotential (MMP) sinkt während einer S. aureus infektion, ist aber nicht für den Zelltod verantwortlich. Das Sinken des MMPs kann mit einem Inhibitor, der den mitochondrialen Na+/Ca2+ Austausch verhindert, signifikant reduziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die menschliche Wirtszelle selbst relevant zu den verschiedenen Schritten der Staphylokokkeninfektion beiträgt, und nicht einfach, wie häufig angenommen, von porenbildenden bakteriellen Toxinen zerstört wird. Entsprechend konnten einzelne Wirtszellproteine identifiziert werden, die entweder zur bakteriellen Invasion oder zum phagosomalen Ausbruch und somit zum induzierten Wirtszelltod beitragen. Überdies konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren, die diese Wirtszellproteine hemmen, die Wirtszellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor einer S. aureus Infektion schützen können. Folglich liefert diese Arbeit wertvolle Hinweise für neue Behandlungsmöglichkeiten von S. aureus Infektionen, die auf der Manipulation von Wirtszellsignalkaskaden beruhen. KW - Staphylococcus aureus KW - Wirtszelle KW - RNS-Interferenz KW - Host cell death KW - RNAi KW - 2-APB KW - intracellular replication KW - calpain KW - Human Host KW - Inhibitor Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114300 ER - TY - THES A1 - Schneider, Gudrun T1 - Effects of adjacent habitats and landscape composition on biodiversity in semi-natural grasslands and biological pest control in oilseed rape fields T1 - Effekte von Nachbarhabitaten und der Landschaftkomposition auf die Biodiversität in halb-natürlichen Grasländern und auf die biologische Schädlicngskontrolle in Rapsfeldern N2 - 1) Modern European agricultural landscapes form a patchy mosaic of highly fragmented natural and semi-natural habitat remnants embedded in a matrix of intensively managed agricultural land. In those landscapes many organism frequently cross habitat borders including the crop – non-crop boundary, hereby connecting the biotic interactions of multiple habitat types. Therefore biodiversity and ecosystem functions within habitats are expected to depend on adjacent habitat types and the surrounding landscape matrix. In this thesis the biodiversity of non-crop habitats, and ecosystem services and disservices in crop habitats were studied in the human-dominated agricultural landscape in the district Lower Franconia, Bavaria, Germany. First we examined the effect of adjacent habitat type on species composition, diversity and ecosystem functions in semi-natural calcareous grasslands, a biodiversity-rich habitat of high conservation value (chapter 2 and 3). Second we studied the effect of habitat composition in the landscape on herbivory, biological pest control and yield in oilseed rape fields (chapter 4). 2) We examined the effect of adjacent habitat type on the diversity of carabid beetles in 20 calcareous grasslands using pitfall traps. Half of the grasslands were adjacent to a coniferous forest and half to a cereal crop field. We found different species compositions of carabid beetles depending on adjacent habitat type. In addition calcareous grasslands adjacent to crop fields harboured a higher species richness and activity density but a lower evenness of carabid beetles than calcareous grasslands adjacent to forests. These differences can be explained by the spillover of carabid beetles from the adjacent habitats. After crop harvest carabid beetle activity density in crop fields decreased while in parallel the activity density in the calcareous grasslands adjacent to the crop fields increased, indicating an unidirectional carabid beetle spillover. Our results underline that type and management of adjacent habitats affect community composition and diversity in calcareous grasslands. Therefore nature conservation measures, which focused on the improvement of local habitat quality so far, additionally need to consider adjacent habitat type. 3) In addition to carabid beetle communities we also surveyed predation rates of ground-dwelling predators on the same calcareous grasslands in two study periods (June and late August). As ground-dwelling predators of forests or crop fields can move into adjacent calcareous grasslands we expected different predation rates depending on adjacent habitat type. We exposed in total 32.000 lady bird eggs as prey items on the calcareous grasslands in distances of 5 and 20m from the habitat border. We found higher predation rates on calcareous grasslands adjacent to forests than on calcareous grasslands adjacent to crop fields, but only on cool days. On warm days a very high extent (often 100%) of the exposed prey items were consumed adjacent to both habitat types, which did not allow the detection of possible differences between the adjacent habitat types. Predation rates differed not between the two study periods or the two distances to the habitat edge. The higher predation rates adjacent to forests can be explained by the spillover of ground-dwelling predators from forests into calcareous grasslands. Our results show, that spillover into semi-natural habitats affects ecosystem functioning in addition to species composition and diversity. 4) In chapter 4 of this thesis we examined the effect of spatiotemporal changes in crop cover on pest - natural enemy interactions and crop yields. During two study years we surveyed the abundance of adult and larval pollen beetles, parasitism of pollen beetle larvae by a hymenopteran parasitoid and oilseed rape yields of 36 oilseed rape fields. The surrounding landscape of the fields (1 km radius) differed in the oilseed rape proportion and in the inter-annual change in the oilseed rape proportion since the previous year. We found a dilution effect, i.e. a decreasing abundance with increasing oilseed rape proportions, for pollen beetle larvae and parasitoids in both study years and for adult pollen beetles in one study year. Oilseed rape yields increased with increasing oilseed rape proportions. Inter-annual changes in oilseed rape proportions led to inter-annual crowding and dilution effects for pollen beetles, but had no effect on parasitism or yield. Our results indicate the potential to reduce pest loads and increase yields in intensively managed oilseed rape fields by a coordinated management of the spatiotemporal oilseed rape cover in the landscape. 5) In summary, we showed in this thesis that the biodiversity and functioning of crop and non-crop habitats within agricultural landscapes is affected by the spillover of organisms and thus by the habitat composition in the close surrounding and in the broader landscape context. Spillover affects also ecosystem services and disservices and therefore crop productivity. Thereby the spatial and temporal variation of specific crop types in the landscape can be of particular importance for crop yields. Thus a coordinated landscape wide management can help to optimize both biodiversity conservation and the delivery of ecosystem services and thus crop yields. Future studies integrating landscape effects across several ecosystem functions, multiple taxonomic groups and different crop types are necessary to develop definite landscape management schemes. N2 - 1) Heutige europäische Agrarlandschaften bestehen aus einem Mosaik stark fragmentierter natürlicher und halbnatürlicher Habitate, die in eine Matrix aus intensiv bewirtschafteten Agrarflächen eingebettet sind. In solchen Landschaften überqueren Organismen häufig Habitatgrenzen, einschließlich der Grenze zwischen Agrar- und Nichtagrarhabitaten. Dabei verknüpfen sie die biotischen Interaktionen der verschiedenen Habitate miteinander. Deshalb ist zu erwarten, dass die Diversität und die Ökosystemfunktionen in Habitaten auch von den Nachbarhabitaten und der umgebenden Landschaft beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Diversität halbnatürlicher Habitate sowie die Ökosystemdienstleistungen in Agrarhabitaten im Bezirk Unterfranken in Bayern, Deutschland. Zum einen untersuchten wir den Einfluss von zwei verschiedenen Nachbarhabitattypen auf die Artenzusammensetzung, die Diversität und die Ökosystemfunktionen in halbnatürlichen Kalkmagerrasen, einem sehr artenreichen Habitat mit hohem Naturschutzwert (Kapitel 2 und 3). Zum anderen untersuchten wir den Einfluss der Habitatzusammensetzung in der Landschaft auf die Herbivorie, die biologische Schädlingskontrolle und den Ertrag in Rapsfeldern (Kapitel 4). 2) Mit Hilfe von Barberfallen untersuchten wir den Einfluss von zwei benachbarten Habitattypen auf die Diversität von Laufkäfern in 20 Kalkmagerrasen. Die Hälfte der Kalkmagerrasen grenzte an einen Nadelwald, die andere Hälfte an einen Getreideacker. Wir fanden unterschiedliche Artenzusammensetzungen der Laufkäfer in Abhängigkeit vom Nachbarhabitat. Außerdem fanden wir auf den Kalkmagerrasen neben Getreideäckern einen höheren Artenreichtum und eine höhere Aktivitätsdichte sowie eine geringere Evenness der Laufkäfer als auf den Kalkmagerrasen neben Nadelwäldern. Diese Unterschiede können durch den spillover von Laufkäfern aus den zwei unterschiedlichen Nachbarhabitaten erklärt werden. Nach der Getreideernte sank die Aktivitätsdichte der Laufkäfer auf den Getreideäckern und stieg parallel in den benachbarten Kalkmagerrasen an. Das weist auf einen einseitig gerichteten Spillover der Laufkäfer vom Acker auf die Kalkmagerrasen nach der Getreideernte hin. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl der Habitattyp als auch das Management benachbarter Habitate die Artenzusammensetzung und die Diversität auf Kalkmagerrasen beeinflusst. Daher sollten Naturschutzmaßnahmen, welche sich bisher nur auf die Verbesserung der lokalen Habitatqualität konzentrierten, zusätzlich den Habitattyp und das Management benachbarter Habitate berücksichtigen. 3) Neben der Zusammensetzung der Laufkäfergemeinschaften untersuchten wir auf den gleichen Kalkmagerrasen die Prädationsraten von auf dem Boden lebenden Prädatoren in zwei Untersuchungszeiträumen (Juni und Ende August). Da Prädatoren benachbarter Wälder oder Äcker auch in Kalkmagerrasen eindringen können, erwarteten wir unterschiedliche Prädationsraten in Abhängigkeit vom Nachbarhabitat. Wir brachten insgesamt 32.000 Marienkäfereier als Beute auf den Kalkmagerrasen aus. Die Eier wurden in Distanzen von 5 m und 20 m zur Habitatgrenze exponiert. Wir fanden höhere Prädationsraten auf den Kalkmagerrasen neben Wäldern als auf denen neben Äckern, allerdings nur an kühlen Tagen. An warmen Tagen wurden die exponierten Eier neben beiden Nachbarhabitaten zu sehr hohen Anteilen (oft zu 100%) konsumiert, was es nicht ermöglichte potentielle Unterschiede zwischen den beiden Nachbarhabitattypen zu ermitteln. Wir fanden keine Unterschiede in den Prädationsraten zwischen den beiden Untersuchungszeiträumen oder zwischen den zwei Distanzen zur Habitatgrenze. Die höheren Prädationsraten auf Kalkmagerrasen neben Wäldern an kühlen Tagen können durch den spillover von am Boden lebenden Prädatoren aus den Wäldern in die Kalkmagerrasen erklärt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Spillover in halbnatürliche Habitate neben der Zusammensetzung der Lebensgemeinschaft auch Ökosystemfunktionen beeinflussen kann. 4) In Kapitel 4 dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von räumlichen und zeitlichen Änderungen in der Rapsanbaufläche auf die Interaktionen zwischen Schädlingen und natürlichen Gegenspielern sowie auf Erträge. Dazu untersuchten wir in zwei Jahren auf insgesamt 36 Rapsfeldern die Abundanz adulter und larvaler Rapsglanzkäfer, Parasitierungsraten von Rapsglanzkäferlarven durch eine Schlupfwespe und Rapserträge. Die Landschaften im 1km Radius um die Rapsfelder unterschieden sich im Rapsanteil und in der Änderung des Rapsanteils seit dem Vorjahr. Wir fanden Verdünnungseffekte, d.h. eine sinkende Abundanz mit zunehmendem Rapsanteil, für Rapsglanzkäferlarven und Parasitoide in beiden Untersuchungsjahren und für adulte Rapsglanzkäfer in einem Untersuchungsjahr. Rapserträge stiegen mit höheren Rapsanteilen in der Landschaft. Eine Vergrößerung des Rapsanteils seit dem Vorjahr führte zu einer Verdünnung der Rapsglanzkäferpopulationen auf der vergrößerten Rapsfläche und eine Verringerung des Rapsanteils zur Konzentration auf der verkleinerten Rapsfläche. Die zeitliche Änderung des Rapsanteils hatte aber keinen Einfluss auf die Parasitierungsrate oder den Ertrag. Unsere Ergebnisse unterstreichen das Potential durch Management der räumlichen und zeitlichen Verteilung der Rapsanbaufläche Schädlingsdichten verringern und Rapserträge erhöhen zu können. 5) Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Biodiversität und die Funktionen von Agrar- und Nichtagrarhabitaten in Agrarlandschaften durch den Spillover von Organismen und folglich durch die Habitatzusammensetzung in der unmittelbaren und weiteren Umgebung bestimmt werden. Spillover beeinflusst dabei auch Ökosystemdienstleistungen und daher die Produktivität in der Landwirtschaft. Die räumliche und zeitliche Variation der Anbaufläche einzelner Anbaufrüchte hat dabei eine besondere Bedeutung für landwirtschaftliche Erträge. Daher kann ein koordiniertes Landschaftsmanagement helfen, sowohl die Biodiversität in der Landschaft als auch die Produktivität von Agrarhabitaten zu optimieren. Um konkrete Landschaftsmanagementpläne entwickeln zu können, sind weitere Studien, die gleichzeitig mehrere Ökosystemfunktionen, verschiedene taxonomische Gruppen und unterschiedliche Anbaufrüchte untersuchen, nötig. KW - Landschaftsökologie KW - spillover KW - biological pest control KW - oilseed rape KW - calcareous grassland KW - crop harvest KW - community composition KW - landscape ecology KW - ecosystem services KW - Magerrasen KW - Rapsanbau KW - Laufkäfer Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113549 ER - TY - THES A1 - Meir [geb. Rother], Juliane T1 - Influence of oncolytic vaccinia viruses on metastases of human and murine tumors T1 - Einfluss von onkolytischen Vaccinia Viren auf Metastasen von humanen und murinen Tumoren N2 - Cancer is one of the leading causes of death. 90% of all deaths are caused by the effects of metastases. It is of major importance to successfully treat the primary tumor and metastases. Tumors and metastases often differ in their properties and therefore, treatment is not always successful. In contrast, those therapeutic agents can even promote formation and growth of metastases. Hence, it is indispensable to find treatment options for metastatic disease. One promising candidate represents the oncolytic virus therapy with vaccinia viruses. The aim of this work was to analyze two cell lines regarding their metastatic abilities and to investigate whether oncolytic vaccinia viruses are useful therapy options. The cell lines used were the human cervical cancer cell line C33A implanted into immune-compromised mice and the murine melanoma cell line B16F10, implanted into immune-competent mice. The initial point of the investigations was the observation of enlarged lumbar und renal lymph nodes in C33A tumor-bearing mice 35 days post implantation of C33A cells subcutaneously into immune-compromised nude mice. Subsequently, the presence of human cells in enlarged lymph nodes was demonstrated by RT-PCR. To facilitate the monitoring of cancer cell spreading, the gene encoding for RFP was inserted into the genome of C33A cells. In cell culture experiments, it was possible to demonstrate that this insertion did not negatively affect the susceptibility of the cells to virus infection, replication and virus-mediated cell lysis. The analysis of the metastatic process in a xenografted mouse model revealed the continuous progression of lumbar (LN) and renal (RN) lymph node metastasis after C33A-RFP tumor cell implantation. The lymph node volume and the amount of RFP-positive LNs and RNs was increasing from week to week in accordance with the gain of the primary tumor volume. Moreover, the metastatic spread of cancer cells in lymph vessels between lumbar and renal lymph nodes was visualized. Additionally, the haematogenous way of cancer cell migration was demonstrated by RFP positive cancer cells in blood vessels. The haematogenous route of spreading was confirmed by detecting micrometastases in lungs of tumor bearing mice. The next step was to investigate whether the recombinant oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 is a suitable candidate to cure the primary tumor and metastases. Therefore, GLV-1h68 was systemically injected into C33A-RFP tumor bearing mice 21 days after tumor cell implantation. It was demonstrated that the volume of the primary tumor was drastically reduced, and the volume and the amount of RFP positive lumbar and renal lymph nodes were significantly decreasing compared to the untreated control group. Subsequently, this process was analyzed further by investigating the colonization pattern in the C33A-RFP model. It was shown that first the primary tumor was colonized with highest detectable virus levels, followed by LN and RN lymph nodes. Histological analyses revealed the proliferative status of tumor cells in the tumor and lymph nodes, the amount of different immune cell populations and the vascular permeability in primary tumors and lymph nodes having an influence on the colonization pattern of the virus. Whereby, the vascular permeability seems to have a crucial impact on the preferential colonization of tumors compared to lymph node metastases in this tumor model. C33A turned out to be a useful model to study the formation and therapy of metastases. However, a metastatic model in which the influence of the immune system on tumors and especially on tumor therapy can be analyzed would be preferable. Therefore, the aim of the second part was to establish a syngeneic metastatic mouse model. Accordingly, the murine melanoma cell line B16F10 was analyzed in immunocompetent mice. First, the highly attenuated GLV 1h68 virus was compared to its parental strain LIVP 1.1.1 concerning infection, replication and cell lysis efficacy in cell culture. LIVP 1.1.1 was more efficient than GLV-1h68 and was subsequently used for following mouse studies. Comparative studies were performed, comparing two different implantation sites of the tumor cells, subcutaneously and footpad, and two different mouse strains, FoxN1 nude and C57BL/6 mice. Implantation into the footpad led to a higher metastatic burden in lymph nodes compared to the subcutaneous implantation site. Finally, the model of choice was the implantation of B16F10 into the footpad of immune-competent C57BL/6 mice. Furthermore, it was inevitable to deliver the virus as efficient as possible to the tumor and metastases. Comparison of two different injection routes, intravenously and intratumorally, revealed, that the optimal injection route was intratumorally. In summary, the murine B16F10 model is a promising model to study the effects of the immune system on vaccinia virus mediated therapy of primary tumors and metastases. N2 - Weltweit ist Krebs eine der häufigsten Todesursachen des Menschen. Allerdings wird angenommen, dass ca. 90 % dieser Todesfälle nicht auf den Primärtumor zurückzuführen sind, sondern durch den direkten und indirekten Einfluss von Metastasen verursacht werden. Deshalb ist es wichtig, eine Therapieform zu wählen, die sowohl den Primärtumor als auch Metastasen bekämpft. Bei den derzeit eingesetzten Behandlungsmethoden für Metastasen handelt es sich weitestgehend um die gleichen Therapieformen die auch zur Bekämpfung des Primärtumors eingesetzt werden. Allerdings unterscheiden sich Primärtumor und Metastasen häufig in ihren Eigenschaften, weshalb die Therapie oft keinen Erfolg bei Metastasen zeigt und im schlimmsten Fall sogar deren Neubildung und Wachstum fördern kann. Deswegen ist es von immenser Bedeutung, neue Therapieformen zu entwickeln, die speziell auch auf die Wirksamkeit gegen Metastasen zugeschnitten sind. Eine vielversprechende Möglichkeit hierfür stellt die onkolytische Virustherapie dar. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, zwei verschiedene Tumorzelllinien hinsichtlich ihrer metastatischen Fähigkeiten zu untersuchen und anschließend zu überprüfen, ob onkolytische Vaccinia Viren zur Therapie dieser Metastasen beitragen können. Bei den hierfür untersuchten Zelllinien handelte es sich um die menschliche Zervixkarzinomzelllinie C33A, implantiert in immunsupprimierte Mäuse und um die murine Melanomzelllinie B16F10, implantiert in immunkompetente Mäuse. Ausgangspunkt der Untersuchungen im ersten Teil der Arbeit, bildete die Beobachtung, dass nach der subkutanen Implantation von C33A-Zellen in die abdominale Flanke von immunsupprimierten Nacktmäusen die lumbalen und renalen Lymphknoten der tumortragenden Mäuse vergrößert waren. Die Untersuchung dieser vergrößerten Lymphknoten mittels RT-PCR, unter zu Hilfenahme von spezifischen Primern für humanes β-Aktin, wies tatsächlich humane Zellen in allen lumbalen und der Hälfte der renalen Lymphknoten nach. Darum sollte im nächsten Schritt das metastatische Verhalten dieser Zellen genauer untersucht werden. Hierfür wurde mittels lentiviraler Transduktion, das für das rotfluoreszierende Protein kodierende Gen in C33A-Zellen integriert. In Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass die Insertion sich nicht negativ auf die Infektion, Replikation und Zelllyse der Viren auswirkte. Anschließende Mausexperimente zeigten den Verlauf der Metastasierung der lumbalen und renalen Lymphknoten. Sowohl das Volumen als auch die Anzahl an RFP positiven Lymphknoten nahm nach Implantation von Woche zu Woche zu und korrelierte mit der Zunahme des Primärtumorvolumens. Darüber hinaus konnte die Migration der Tumorzellen in Lymphgefäßen zwischen dem lumbalen und renalem Lymphknotenpaar mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Zusätzlich konnte die Metastasierung über die Blutbahn nachgewiesen werden, da sich RFP positive Zellen in dem Blutgefäß neben dem Lymphgefäß, das die lumbalen und renalen Lymphknoten miteinander verbindet, befanden. Die hämatogene Verbreitung wurde auch dadurch bestätigt, dass in den Lungen der tumortragenden Mäuse Mikrometastasen detektiert werden konnten. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob das rekombinante Vaccinia Virus GLV-1h68 in der Lage ist, nicht nur den primären Tumor zu bekämpfen, sondern auch Metastasen. Dafür wurde tumortragenden Mäusen systemisch eine einzelne Dosis GLV-1h68 21 Tage nach Tumorzellimplantation injiziert. Daraufhin reduzierte sich nicht nur das Volumen des Primärtumors innerhalb von weiteren 21 Tagen auf die Ausgangsgröße, sondern auch das Volumen und die Anzahl der RFP positiven lumbalen und renalen Lymphknoten nahm ab, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Analyse der Kolonisierungsdynamik von Primärtumor und Metastasen durch GLV 1h68 zeigte, dass zuerst der Primärtumor kolonisiert wurde, gefolgt von LN und RN. Des Weiteren war der virale Titer in Tumoren zu jedem Zeitpunkt höher als in den metastasierten Lymphknoten. Histologische Untersuchungen des tumorösen Gewebes zeigten, dass der proliferative Status der Tumorzellen, die Menge verschiedener Immunzellpopulationen und die vaskuläre Permeabilität einen Einfluss auf die Kolonisierung durch GLV-1h68 haben. Dabei wird angenommen, dass vor allem die vaskuläre Permeabilität den größten Einfluss auf die Kolonisierungsreihenfolge hat. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass C33A ein hilfreiches Model ist, um die Bildung von Metastasen sowie die onkolytische Virustherapie dieser in einem immunsupprimierten Model zu untersuchen. Aus klinischer Sicht allerdings wäre es wünschenswert, ein Model zu haben, in dem auch der Einfluss des Immunsystems auf die Tumortherapie untersucht werden kann. Deswegen war das Ziel im zweiten Teil der Arbeit die murine Melanomazelllinie B16F10 im immunkompetenten Mausmodell als metastatisches System zu etablieren. Als erstes wurde in Zellkulturexperimenten überprüft, wie geeignet GLV-1h68 ist, um die murinen Zellen zu infizieren, in ihnen zu replizieren und sie anschließend zu lysieren und mit dem parentalen Virus LIVP 1.1.1 verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass LIVP 1.1.1 effizienter und geeigneter ist als GLV-1h68. Deswegen wurde in weiteren Versuchen das parentale Virus LIVP 1.1.1 verwendet. Bevor diese Experimente durchgeführt wurden, wurden Studien durchgeführt, bei denen 2 verschiedene Implantationsstellen, subkutan und in die Fußsohle, und 2 verschiedene Mausstämme, FoxN1 nude und C57BL/6, verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass nach Implantation in die Fußsohle mehr Lymphknotenmetastasen entstanden als nach subkutaner Implantation. Im weiteren Verlauf wurde die Implantation von B16F10 Zellen in die Fußsohle von C57BL/6 Mäusen bevorzugt, um eine verlässliches Metastasenmodel zu generieren. Im Folgenden wurden zwei verschiedene Injektionswege untersucht, intravenös und intratumoral, wobei sich die intratumoral Injektion als geeigneter erwies, um effizient so viel Virus wie möglich in Tumore und Metastasen zu bringen. Generell handelt es sich hierbei um ein geeignetes Model, um die Wirkungen des Immunsystems auf Vaccinia Virus vermittelte Therapie von Primärtumor und Lymphknotenmetastasen zu untersuchen. KW - Krebs KW - Metastase KW - Vaccinia-Virus KW - onkolytische Virustherapie KW - oncolytic virus therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118530 ER - TY - THES A1 - Kober, Christina T1 - Characterization of Murine GL261 Glioma Models for Oncolytic Vaccinia Virus Therapy T1 - Charakterisierung onkolytischer Vaccinia Virus Therapie in murinen Gliommodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system. It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models. In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected. Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Die Prognose für GBM ist mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten sehr schlecht. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit stellt die onkolytische Virustherapie dar. Ein vielversprechender Kandidat ist das Vaccinia-Virus. Die große Diskrepanz zwischen der onkolytischen Effektivität in Zellkultur und den Ergebnissen im Mausmodell ist oftmals auf physiologische Komponenten im Tumor-Mikromilieu zurückzuführen. Die Zusammensetzung von Immunzellen im Mikromilieu variiert zwischen verschiedenen Krebsarten und Patienten und wird als Biomarker angewendet. Um eine erfolgreiche Virustherapie für GBM zu etablieren, wird ein umfangreiches Verständnis der Tumorbiologie, des Tumormikromilieus und des Immunsystems vorausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass LIVP 1.1.1, ein attenuiertes wildtypisches VACV-Isolat, in der murinen GL261 Gliom-Zelllinie repliziert und zum Absterben der Zellen führt. Daraufhin wurde die Replikationseffizienz von LIVP 1.1.1 durch einen vergleichenden Ansatz in murinen GL261-Gliomen im Mausmodell untersucht. Es wurden immunkompetente C57BL/6-wildtypische (wt) Mäuse und immundefiziente Mausstämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund, C57BL/6 athymisch und Balb/c athymisch, verwendet. Zudem wurden unterschiedliche Tumor-Lokalisationen, subkutan und intrakranial analysiert. Ausschließlich im subkutanen Tumormodell der Balb/c athymischen Mäuse fand eine effektive Replikation der Viren statt. Eine detaillierte Charakterisierung des Mikromilieus zum Zeitpunkt der Infektion zeigte, dass die Implantation derselben Tumorzellen in unterschiedliche Mausstämme zur Entwicklung eines unterschiedlichen Tumormikromilieus und einer variierenden Zusammensetzung von Immunzellen führt. Die C57BL/6-wt-Mäuse wiesen eine starke proinflammatorische Signatur auf. Des Weiteren zeigte die Studie signifikante Unterschiede in der MHCII-Expression: Die prominenteste Expression wurde in C57BL/6-wt-Mäusen detektiert. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, wodurch die phänotypischen Veränderungen in den GL261-Zellen, verbunden mit der Hochregulierung von MHCII ausgelöst wurden und welche Konsequenzen dies für die virale Infektion dieser Zellen hat. Durch einen direkten Vergleich von C57BL/6-wt-Mäusen und C57BL/6-IFN-γ-Knockout Mäusen konnte IFN-γ als verantwortlicher Faktor im Tumormikromilieu identifiziert werden, welcher für die Reduktion des Virustiters und für die Hochregulierung von MHCII in den C57BL/6-wt-Mäusen verantwortlich ist. Der durch endogenes IFN-γ ausgelöste anti-virale Effekt war reversibel. Des Weiteren wurden Gründe für die Hemmung der viralen Replikation in den orthotopen Gliom-Modellen aufgeklärt. Durch immunhistochemische Analysen von Mikroglia und Astrozyten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Menge und Verteilung der Gliazellen in diesen Tumoren unabhängig von der Virus-Applikation war. Gliomzellen, Mikroglia und Astrozyten, wurden daraufhin untersucht. Im Vergleich zur starken Replikation in GL261-Zellen, ließen BV-2-Mikroglia und IMA 2.1-Astrozyten, nur eine sehr schwache Replikation von LIVP 1.1.1 zu. Ko-Kultivierungsversuche wiesen darauf hin, dass Mikroglia um die Aufnahme der Viruspartikel mit den Tumorzellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass das LIVP 1.1.1 unterschiedliche Eigenschaften des Zelltods in den Zellen auslösen kann. BV-2 wiesen verstärkte Charakteristika der Apoptose auf während in GL261-Zellen nekrotische Eigenschaften überwogen. In BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp wurde eine weitere Reduktion der viralen Infektion festgestellt. Die Infektion von IMA-2.1-Zellen war unabhängig vom induzierten M1/M2 Phänotyp. Die Applikation von BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp auf organotypische Schnittkulturen mit implantierten GL261-Tumoren resultierte in einer reduzierten Infektion der BV-2-Zellen und einer verstärkten Infektion der GL261-Zellen. Es wurde gezeigt, dass GL261-Tumore durch den immunologischen und genetischen Hintergrund der Umgebung geprägt wurden. Es wurde ein Modell entwickelt, welches das Prinzip der personalisierten Medizin widerspiegelt. In einem zusätzlichen Projekt wurde, basierend auf Genexpressionsdaten und bioinformatischer Auswertung, die biologische Funktion des anti-apoptotischen Faktors AVEN hinsichtlich der onkolytischen Virustherapie mit dem VACV GLV-1h68 analysiert. Für diese Studie wurden vier humane Zelllinien untersucht. Neben einem Vergleich der Replikationseffizienz des VACV GLV-1h68 und der VACV-vermittelten Zelllyse wurde gezeigt, dass AVEN, in allen untersuchten Zellen exprimiert wird. Am Beispiel von HT-29 und 1936-MEL wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von AVEN durch siRNA zu einer Erhöhung der apoptotischen Eigenschaften und Abnahme der VACV Infektion führt. Die Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung zukünftiger genetisch veränderter VACV. KW - Krebs KW - Vaccinia-Virus KW - Glioblastom KW - Onkolytische Vaccinia Virustherapie KW - Mikroglia KW - Astrozyten KW - Oncolytic Vaccinia Virus Therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118556 ER - TY - THES A1 - Graver, Shannon T1 - Molecular and cellular cross talk between angiogenic, immune and DNA mismatch repair pathways T1 - Molekulare und zellulare Interaktion zwischen Angiogenese, DNA Fehlerreparatur (Mismatch Repair) und Immunologischen Signalwegen N2 - VEGF is a main driver of tumor angiogenesis, playing an important role not only in the formation of new blood vessels, but also acts as a factor for cell migration, proliferation, survival and apoptosis. Angiogenesis is a universal function shared by most solid tumors and its inhibition was thought to have the potential to work across a broad patient population. Clinical evidence has shown that inhibiting pathological angiogenesis only works in a subset of patients and the identification of those patients is an important step towards personalized cancer care. The first approved antiangiogenic therapy was bevacizumab (Avastin®), a monoclonal antibody targeting VEGF in solid tumors including CRC, BC, NSCLC, RCC and others. In addition to endothelial cells, VEGF receptors are present on a number of different cell types including tumor cells, monocytes and macrophages. The work presented in this thesis looked at the in vitro cellular changes in tumor cells and leukocytes in response to the inhibition of VEGF signaling with the use of bevacizumab. In the initial experiments, VEGF was induced by hypoxia in tumor cells to evaluate changes in survival, proliferation, migration and changes in gene or protein expression. There was a minimal direct response of VEGF inhibition in tumor cells that could be attributed to bevacizumab treatment, with minor variations in some of the cell lines screened but no uniform or specific response noted. MMR deficiency often results in microsatellite instability (MSI) in tumors, as opposed to microsatellite stable (MSS) tumors, and accounts for up to 15% of colorectal carcinomas (CRCs). It has been suggested in clinical data that MMR deficient tumors responded better to bevacizumab regimens, therefore further research used isogenic paired CRC tumor cell lines (MMR deficient and proficient). Furthermore, a DNA damaging agent was added to the treatment regimen, the topoisomerase inhibitor SN-38 (the active metabolite of irinotecan). Inhibiting VEGF using bevacizumab significantly inhibited the ability of MMR deficient tumor cells to form anchor dependent colonies, however conversely, bevacizumab treatment before damaging cells with SN-38, showed a significant increase in colony numbers. Moreover, VEGF inhibition by bevacizumab pretreatment also significantly increased the mutation fraction in MMR deficient cells as measured by transiently transfecting a dinucleotide repeat construct, suggesting VEGF signaling may have an intrinsic role in MMR deficient cells. A number of pathways were analyzed in addition to changes in gene expression profiles resulting in the identification of JNK as a possible VEGF targeted pathway. JUN expression was also reduced in these conditions reinforcing this hypothesis, however the intricate molecular mechanisms remain to be elucidated. In order to remain focused on the clinical application of the findings, it was noted that some cytokines were differentially regulated by bevacizumab between MMR proficient and deficient cells. Treatment regimens employed in vitro attempted to mimic the clinical setting by inducing DNA damage, then allowing cells to recover with or without VEGF using bevacizumab treatment. Inflammatory cytokines, CCL7 and CCL8, were found to have higher expression in the MMR deficient cell line with bevacizumab after DNA damage, therefore the cross talk via tumor derived factors to myeloid cells was analyzed. Gene expression changes in monocytes induced by tumor conditioned media showed CCL18 to be a bevacizumab regulated gene by MMR deficient cells and less so in MMR proficient cells. CCL18 has been described as a prognostic marker in gastric, colorectal and ovarian cancers, however the significance is dependent on tumor type. CCL18 primarily exerts its function on the adaptive immune system to trigger a TH2 response in T cells, but is also described to increase non-specific phagocytosis. The results of this study did show an increase in the phagocytic activity of macrophages in the presence of bevacizumab that was significantly more apparent in MMR deficient cells. Furthermore, after DNA damage MMR deficient cells treated with bevacizumab released a cytokine mix that induced monocyte migration in a bevacizumab dependent manner, showing a functional response with the combination of MMR deficiency and bevacizumab. In summary, the work in this thesis has shown evidence of immune cell modulation that is specific to MMR deficient tumor cells that may translate into a marker for the administration of bevacizumab in a clinical setting. VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. N2 - VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. KW - Angiogenesis KW - Immune KW - DNA Mismatch repair KW - Vascular endothelial Growth Factor KW - Inhibition KW - Angiogenese KW - Mismatch KW - DNS-Reparatur KW - Phagozytose Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108302 ER - TY - THES A1 - Kuhtz, Juliane T1 - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität T1 - Epimutations of human germ cells and infertility N2 - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. N2 - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring. KW - Epigenetik KW - Sterilität KW - Epimutationen KW - geprägte Gene KW - humane Keimzellen KW - Infertilität Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248 ER - TY - THES A1 - Stangler, Eva T1 - Effects of habitat fragmentation on trap-nesting bees, wasps and their natural enemies in small secondary rainforest fragments in Costa Rica T1 - Die Auswirkungen von Habitatfragmentierung auf nisthilfenbewohnende Bienen, Wespen und deren Gegenspieler in kleinen Sekundärwaldfragmenten in Costa Rica N2 - Summary (English) I. Human induced global change threatens biodiversity and trophic interactions. Fragmentation is considered as one of the major threats to biodiversity and can cause reduced species richness, population declines, loss of genetic diversity and disruption of trophic interactions such as predation and parasitism. However forest fragmentation effects can be eclectic due to species specific traits. Specialist species with narrower niches or at higher trophic levels may be in danger of extinction whereas generalist species with less specific habitat requirements may even profit from fragmentation. In the tropics, known as “the” terrestrial biodiversity hotspots, even biodiversity inventories are often lacking, especially in forest canopies. Ongoing deforestation and resulting fragmentation in tropical regions are expected to heavily affect ecosystem functions by changes in biodiversity, community compositions and disruption of trophic interactions. It is even less unknown in what extent different global change drivers for example climate change and fragmentation interact. It is unlikely that deforestation will end, so that small secondary forest fragments will be important habitat elements that must be investigated to optimize their potential contribution to biodiversity conservation. This dissertation aimed to disentangle the effects of forest fragmentation on trap-nesting bee and wasp communities in small secondary forest fragments addressing the following main questions: 1) Are there interactive effects between microclimate and fragmentation on the abundance of bees and wasps, their mortality - and parasitism rates (Chapter II)? 2) How does fragmentation affect bee biodiversity from canopy to the understory with considerations of single species patterns (Chapter III)? 3) How is fragmentation affecting diversity and community composition of different trophic levels between understory and canopy with emphasis on the host-antagonist relation? (Chapter IV). II. A variety of global change drivers affect biodiversity and trophic interactions. The combined effects of habitat fragmentation and climate change are poorly understood and with ongoing deforestation and agricultural intensification secondary rainforest fragments might contribute to biodiversity conservation and mitigation of climate warming. This chapter investigated the interactive effects of habitat fragmentation and microclimate on the abundance and biotic interactions of trap-nesting bees and wasps in secondary forest fragments in the Northeastern lowlands of Costa Rica. Habitat area did not affect hymenopteran abundance, parasitism and mortality rates, but tree location- from the forest border to the forest center- influenced all variables. Interactive effects were found such as in the higher mortality rates at interior locations in larger fragments. Mean temperature at edge and interior locations led to significant effects on all tested variables and interactive effects between temperature and tree locations were found. Abundances at interior locations were significantly higher with increasing temperatures. Mortality rates at interior location increased at lower mean temperatures, whereas higher temperatures at edges marginally increased mortality rates. Our results indicate, that edge effects, mediated by altered microclimatic conditions, significantly change biotic interactions of trap-nesting hymenopterans in small secondary fragments. III. This chapter focusses on the vertical distribution of bees, their parasitism and mortality rates as well as single species patterns in relation to fragment size and edge effects in secondary rainforest remnants. No size effects on bee abundance, bee diversity and on parasitism- and mortality rates were found. Bees were least abundant at the intermediate height and were most abundant in the understory; whereas the highest diversity was found in the canopy. Tree location had no effect on bee abundance, but on bee diversity since most species were found in the forest interior. The cuckoo bees Aglaomelissa duckei and Coelioxys sp. 1 only partly followed the patterns of their hosts, two Centris species. Edge effects greatly influenced the bee community, so that the amount of edge habitat in secondary forest fragments will influence the conservation value for bees. IV. In this section the effects of habitat fragmentation on biodiversity, on community structure of hosts and natural enemies as well as the relation of hosts and antagonists were investigated from the understory to the canopy. The results stress the importance to monitor biodiversity, community composition and trophic interactions from the understory to the canopy. The higher trophic level of the antagonists was found to be more sensitive to fragment size compared to their hosts. Again edge effects were found to be the dominant driver since both host and antagonist richness, as well as community compositions were strongly affected. Ongoing fragmentation and increased amount of edge habitat could favor few abundant disturbance-adapted species over the rare and more diverse forest-adapted species. A positive-density dependent parasitism rate was demonstrated, as well as an increase of the parasitism rate not only with antagonist abundance but also diversity. Small secondary forest fragments surely can contribute to the conservation of biodiversity and trophic interactions, but increase of edge habitat will have negative consequences on above-ground nesting Hymenoptera, so that important interactions such as pollination, predation and parasitism could be disrupted. Therefore small forest fragments could contribute to biodiversity conservation but will not be able to compensate for the loss of large areas of primary forests. V. This dissertation contributes to the understanding of habitat area - and edge effects as well as the interaction of those with microclimatic conditions in small secondary rainforest fragments. As study system trap nests inhabited by solitary above-ground nesting bees, wasps and their natural enemies were chosen because they allow to study trophic interactions along their whole vertical distribution from the understory to the canopy. The effect of fragment size was rather weak, however, larger sizes affected the diversity of natural enemies positively, proofing the hypothesis that higher trophic levels react more sensitive to habitat loss. Edge effects heavily affected the abundance, diversity and community composition of hosts and their natural enemies as well as parasitism and mortality rates. Increased edge conditions resulting from ongoing fragmentation and deforestation will therefore negatively affect bees, wasps and their trophic interactions with natural enemies. Those changes affect important processes such as pollination, predation and parasitism, which could result in changes of ecosystem functioning. This study showed the importance to include all strata in biodiversity monitoring since height did matter for the trap-nesting communities. Diversity was shown to be higher in the canopy and community composition did change significantly. To conclude we could show that secondary forest fragments can sustain a trap-nesting bee and wasp community, but the amount of interior habitat is highly important for the conservation of forest-adapted species. Probably the conservation of large primary forest in combination with a high habitat connectivity, for example with small secondary forest fragments, will help to sustain biodiversity and ecosystem functioning better than the mere presence of small forest fragments. N2 - Zusammenfassung (German) I. Die weltweite Umweltveränderung, die durch den Menschen verursacht wird, gefährdet die Artenvielfalt und die trophischen Wechselbeziehungen zwischen Organismen. Fragmentierung gilt als eine der Hauptbedrohungen für die Biodiversität und kann weitreichende Konsequenzen haben wie zum Beispiel verminderte Artenvielfalt, Rückgang von Populationen, Verlust von genetischer Diversität und auch die Unterbrechung von trophischen Interaktionen, z.B. Prädation und Parasitierung. In Waldökosystemen können Fragmentierungsauswirkungen vielfältig sein. Spezialisierte Arten mit engen natürlichen Nischen, die zum Beispiel in höheren trophischen Ebenen zu finden sind, könnten vom Aussterben bedroht sein, während generalisierte Arten mit weniger spezifischen Habitatansprüchen sogar profitieren könnten. In den Tropen, „den“ terrestrischen Biodiversitäts-Hotspots, fehlen oft sogar grundlegende Bestandsaufnahmen von Flora und Fauna, insbesondere für die Kronen der Regenwälder. Die fortschreitende Abholzung in tropischen Regionen und die dadurch verursachte Fragmentierung wird die Funktion des Ökosystems durch Veränderung der Artenvielfalt, der Zusammensetzung von Artengemeinschaften und der Unterbrechung von trophischen Interaktionen in hohem Maße beeinflussen. Besonders das Zusammenwirken von verschiedenen Facetten des globalen Umweltwandels, z. B. Klimawandel und Fragmentierung, ist nahezu unbekannt. Da es unwahrscheinlich ist, dass die Abholzung von Regenwäldern eingestellt wird, ist es äußerst wichtig den Wert von kleinen Sekundärwaldfragmenten für den Schutz der Artenvielfalt zu untersuchen. Diese Dissertation trägt dazu bei verschiedene Aspekte der Fragmentierung auf die Artengemeinschaft von nisthilfenbewohnenden Hymenopteren in kleinen Sekundärwaldfragmenten zu untersuchen und behandelt dabei die folgenden zentralen Fragen: 1) Wirken Fragmentierung und mikroklimatische Bedingungen interaktiv auf die Abundanz von Bienen und Wespen sowie deren Mortalitäts- und Parasitierungsraten (2. Kapitel)? 2) Wie beeinflusst Fragmentierung die Artenvielfalt von Bienen vom Unterholz bis zur Krone und wie reagieren einzelne Arten darauf (3. Kapitel)? 3) Wie beeinflusst Fragmentierung die Biodiversität und die Artengemeinschaften verschiedener trophischer Ebenen vom Unterholz bis zum Kronendach unter besonderer Berücksichtigung der Wirts-Antagonist-Beziehung (4. Kapitel)? II. Eine Reihe von Faktoren des weltweiten Umweltwandels beeinflusst die Artenvielfalt und trophische Interaktionen. Die Auswirkungen von Fragmentierung und Klimawandel, die sich gegenseitig beeinflussen könnten, sind nahezu unverstanden. Außerdem könnten Sekundärwaldfragmente zum Erhalt der Artenvielfalt und der Abschwächung der Auswirkungen des Klimawandels sowie der anhaltenden Abholzung und der Intensivierung der Landwirtschaft dienen. Dieser Abschnitt untersucht mögliche Wechselwirkungen zwischen Fragmentierung und Temperatur auf die Abundanz und trophische Interaktionen von nisthilfenbewohnenden Bienen und Wespen in kleinen Sekundärwaldfragmenten im Nordosten Costa Ricas. Die Fragmentgröße hatte keinen Einfluss auf die Abundanz, die Parasitierungs- und Mortalitätsraten der Hymenopteren, während der Baumstandort- vom Waldrand zur Waldmitte immensen Einfluss auf alle untersuchten Variablen hatte. In größeren Fragmenten war die Mortalitätsrate innerhalb des Waldes verglichen mit kleineren Fragmenten höher. Die mittlere Temperatur beeinflusste alle untersuchten Variablen und hatte je nach Standort des Baumes unterschiedliche Auswirkungen. Die Abundanzen im Waldinneren stiegen signifikant mit höheren Temperaturen an. Die Mortalitätsraten im Waldinneren nahmen mit niedrigeren Temperaturen zu, während höhere Temperaturen am Waldrand zu höheren Mortalitätsraten führten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Randeffekte, die auch durch Temperaturunterschiede zustande kommen, biotische Interaktionen von nisthilfenbewohnenden Bienen und Wespen in kleinen Sekundärwaldfragmenten ändern. III. Dieses Kapitel konzentriert sich auf den Einfluss der Fragmentgröße und der Randeffekte auf Bienen und deren Parasitierungs- und Mortalitätsraten vom Unterholz bis zu den Kronendächern in kleinen Sekundärwaldfragmenten. Dabei wurden auch die Muster von einzelnen Arten näher untersucht. Die Fragmentgröße hatte keinen Einfluss auf die Bienenabundanz, die Artenvielfalt oder die Parasitierungs- und Mortalitätsraten. Die höchste Bienenabundanz wies das Unterholz auf, während die höchste Diversität im Kronendach gefunden wurde. Der Gradient vom Waldrand bis zur Waldmitte hatte keinen Einfluss auf die Bienenabundanz, wohingegen die Diversität zum Waldinnern hin anstieg. Die Kuckucksbienen Aglaomelissa duckei und Coelioxys sp. 1 folgten nur zum Teil den Mustern ihrer Wirte, zwei Centris Arten. Randeffekte hatten großen Einfluss auf die Bienengemeinschaften, so dass der Anteil von Waldrändern bzw. die Form der Sekundärwaldfragmente über den Nutzen für die Erhaltung der Bienenvielfalt bestimmt. IV. In diesem Kapitel wurden die Fragmentierungsauswirkungen auf die Biodiversität, die Gemeinschaftszusammensetzung von Wirten und ihrer natürlichen Feinde als auch die Beziehung zwischen den Wirten und ihren natürlichen Feinden vom Unterholz bis zum Kronendach untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass es äußerst wichtig ist die Biodiversität, die Zusammensetzung der Artengemeinschaft als auch die trophischen Interaktionen in den verschiedenen Straten des Regenwaldes zu untersuchen. Die natürlichen Feinde, die auf einer höheren trophischen Ebene stehen, reagierten empfindlicher auf die Größe der Fragmente. Randeffekte waren der einflussreichste Faktor, weil die Diversität der Wirte und der natürlichen Feinde, sowie deren Artengemeinschaften stark beeinflusst wurden. Fortschreitende Fragmentierung und der damit einhergehende erhöhte Flächenanteil des Randhabitats könnte daher wenige häufige Arten bevorzugen, die gestörtes Habitat tolerieren können, wohingegen die seltenere aber artenreichere Gemeinschaft, die das Waldinnere bevorzugt, benachteiligt wird. Es konnte außerdem eine positiv-dichteabhängige Parasitierungsrate sowie ein positiver Zusammenhang zwischen der Abundanz und Diversität von natürlichen Feinden und der Parasitierungsrate gezeigt werden. Kleine Sekundärwaldfragmente können sicherlich helfen die Artenvielfalt und die trophischen Interaktionen zu erhalten, aber die Erhöhung des Anteils von Randhabitat wird nachteilige Folgen für solitäre Hymenopteren haben. Dies kann zur Unterbrechung von wichtigen Interaktionen wie Bestäubung, Prädation und Parasitierung führen. Kleine Sekundärwaldfragmente können daher zwar hilfreich zur Erhaltung der Biodiversität sein, aber niemals große Primärwaldflächen, die von unschätzbarem Wert sind, ersetzen. V. Die vorliegende Doktorarbeit trägt zum Verständnis der Auswirkungen der Habitatgröße und von Randeffekten als auch deren Wechselwirkungen mit mikroklimatischen Bedingungen in kleinen Sekundärwaldfragmenten bei. Benutzt wurden Nisthilfen, die von solitären Bienen, Wespen und ihren natürlichen Feinden besiedelt werden, da hierdurch auch trophische Interaktionen vom Unterholz bis zum Kronendach aufgenommen werden können. Die Fragmentgröße hatte keine weitreichenden Auswirkungen. Größere Fragmente wiesen allerdings eine höhere Vielfalt von natürlichen Feinden auf, was die Hypothese der höheren Empfindlichkeit von höheren trophischen Ebenen bestätigt. Randeffekte hingegen haben sowohl die Bienen und Wespen als Wirte als auch deren natürliche Feinde in ihrer Häufigkeit, Artenvielfalt und Artenzusammensetzung in hohem Maße beeinflusst. Eine Erhöhung des Anteils von Randhabitaten, die mit fortschreitender Abholzung und Fragmentierung einhergeht, wird daher einen negativen Einfluss auf diese Hymenopteren haben, was sogar die Funktion des Ökosystems beeinflussen könnte, da dadurch auch wichtige Interaktionen, zum Beispiel Bestäubung, Prädation und Parasitierung beeinträchtigt werden. Außerdem konnte diese Doktorarbeit zeigen, dass es unbedingt notwendig ist die Fauna des gesamten Regenwaldes unter Berücksichtigung aller Straten aufzunehmen. Die Artenvielfalt in der Kronenschicht war höher und auch die Zusammensetzung der Artengemeinschaften war signifikant verschieden zwischen dem Unterholz und den Kronendächern. Diese Doktorarbeit zeigt, dass kleine Sekundärwaldfragmente zwar Lebensraum und Ressourcen für eine Gemeinschaft von solitären Bienen, Wespen und deren natürlichen Gegenspielern bieten kann, dass jedoch die Form und damit der Anteil von Innenhabitat ausschlaggebend für den Erhalt von spezialisierten Waldarten ist. Der Erhalt von großen Flächen von Primärwald ist daher unabdingbar, jedoch könnten Sekundärwaldfragmente zur Erhöhung der Vernetzung beitragen, um so ein stabiles, artenreiches und einzigartiges Waldökosystem zu erhalten, was allein durch kleine Sekundärwaldfragmente nicht möglich sein wird. KW - Costa Rica KW - Sekundärwald KW - natural enemies KW - secondary rainforest fragments KW - Hymenoptera KW - Bienen KW - Wespen KW - Nisthilfe KW - Fragmentierung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108254 ER -