TY - JOUR A1 - Vendelova, Emilia A1 - de Lima, Jeferson Camargo A1 - Lorenzatto, Karina Rodrigues A1 - Monteiro, Karina Mariante A1 - Mueller, Thomas A1 - Veepaschit, Jyotishman A1 - Grimm, Clemens A1 - Brehm, Klaus A1 - Hrčková, Gabriela A1 - Lutz, Manfred B. A1 - Ferreira, Henrique B. A1 - Nono, Justin Komguep T1 - Proteomic Analysis of Excretory-Secretory Products of Mesocestoides corti Metacestodes Reveals Potential Suppressors of Dendritic Cell Functions JF - PLoS Neglected Tropical Diseases N2 - Accumulating evidences have assigned a central role to parasite-derived proteins in immunomodulation. Here, we report on the proteomic identification and characterization of immunomodulatory excretory-secretory (ES) products from the metacestode larva (tetrathyridium) of the tapeworm Mesocestoides corti (syn. M. vogae). We demonstrate that ES products but not larval homogenates inhibit the stimuli-driven release of the pro-inflammatory, Th1-inducing cytokine IL-12p70 by murine bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs). Within the ES fraction, we biochemically narrowed down the immunosuppressive activity to glycoproteins since active components were lipid-free, but sensitive to heat- and carbohydrate-treatment. Finally, using bioassay-guided chromatographic analyses assisted by comparative proteomics of active and inactive fractions of the ES products, we defined a comprehensive list of candidate proteins released by M. corti tetrathyridia as potential suppressors of DC functions. Our study provides a comprehensive library of somatic and ES products and highlight some candidate parasite factors that might drive the subversion of DC functions to facilitate the persistence of M. corti tetrathyridia in their hosts. KW - proteomic analysis KW - excretory-secretory KW - Mesocestoides corti Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166742 VL - 10 IS - 10 ER - TY - JOUR A1 - Velours, J. A1 - Esparza, M. A1 - Hoppe, J. A1 - Sebald, Walter A1 - Guerin, B. T1 - Amino acid sequence of a new mitochondrially synthesized proteolipid of the ATP synthase of Saccharomyces cerevisiae N2 - The purification and the amino acid sequence of a proteolipid translated on ribosomes in yeast mitochondria is reported. This protein, which is a subunit of the A TP synthase, was purified by extraction with chloroform/methanol (2/1) and subsequent chromatography on phosphocellulose and reverse phase h.p.l.c. A mol. wt. of 5500 was estimated by chromatography on Bio-Gel P-30 in 8011/o fonnie acid. The complete amino acid sequence of this protein was determined by automated solid phase Edman degradation of the whole protein and of fragments obtained after cleavage with cyanogen bromide. The sequence analysis indicates a length of 48 amino acid residues. The calculated mol. wt. of 5870 corresponds to the value found by gel chromatography. This polypeptide contains three basic residues and no negatively charged side chain. The three basic residues are clustered at the C terminus. The primary structure of this protein is in full agreement with the predicted amino acid sequence of the putative polypeptide encoded by the mitochondrial aap1 gene recently discovered in Saccharomyces cerevisiae. Moreover, this protein shows 5011/o homology with the amino acid sequence of a putative polypeptide encoded by an unidentified reading frame also discovered near the mitochondrial ATPase subunit 6 genein Aspergillus nidulans. KW - Biochemie KW - ATP synthase KW - mitochondrially translated KW - proteolipid KW - sequence subunit Y1 - 1984 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-62695 ER - TY - JOUR A1 - Vellmer, Tim A1 - Hartleb, Laura A1 - Fradera Sola, Albert A1 - Kramer, Susanne A1 - Meyer-Natus, Elisabeth A1 - Butter, Falk A1 - Janzen, Christian J. T1 - A novel SNF2 ATPase complex in Trypanosoma brucei with a role in H2A.Z-mediated chromatin remodelling JF - PLoS Pathogens N2 - A cascade of histone acetylation events with subsequent incorporation of a histone H2A variant plays an essential part in transcription regulation in various model organisms. A key player in this cascade is the chromatin remodelling complex SWR1, which replaces the canonical histone H2A with its variant H2A.Z. Transcriptional regulation of polycistronic transcription units in the unicellular parasite Trypanosoma brucei has been shown to be highly dependent on acetylation of H2A.Z, which is mediated by the histone-acetyltransferase HAT2. The chromatin remodelling complex which mediates H2A.Z incorporation is not known and an SWR1 orthologue in trypanosomes has not yet been reported. In this study, we identified and characterised an SWR1-like remodeller complex in T. brucei that is responsible for Pol II-dependent transcriptional regulation. Bioinformatic analysis of potential SNF2 DEAD/Box helicases, the key component of SWR1 complexes, identified a 1211 amino acids-long protein that exhibits key structural characteristics of the SWR1 subfamily. Systematic protein-protein interaction analysis revealed the existence of a novel complex exhibiting key features of an SWR1-like chromatin remodeller. RNAi-mediated depletion of the ATPase subunit of this complex resulted in a significant reduction of H2A.Z incorporation at transcription start sites and a subsequent decrease of steady-state mRNA levels. Furthermore, depletion of SWR1 and RNA-polymerase II (Pol II) caused massive chromatin condensation. The potential function of several proteins associated with the SWR1-like complex and with HAT2, the key factor of H2A.Z incorporation, is discussed. KW - Trypanosoma KW - chromatin KW - histones KW - RNA interference KW - Trypanosoma brucei gambiense KW - luciferase KW - transcriptional control KW - nucleosomes Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301372 VL - 18 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Vellmer, Tim T1 - New insights into the histone variant H2A.Z incorporation pathway in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Neue Erkenntnisse zum Einbau der Histonvariante H2A.Z in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The histone variant H2A.Z is a key player in transcription regulation in eukaryotes. Histone acetylations by the NuA4/TIP60 complex are required to enable proper incorporation of the histone variant and to promote the recruitment of other complexes and proteins required for transcription initiation. The second key player in H2A.Z-mediated transcription is the chromatin remodelling complex SWR1, which replaces the canonical histone H2A with its variant. By the time this project started little was known about H2A.Z in the unicellular parasite Trypanosoma brucei. Like in other eukaryotes H2A.Z was exclusively found in the transcription start sites of the polycistronic transcription units where it keeps the chromatin in an open conformation to enable RNA-polymerase II-mediated transcription. Previous studies showed the variant colocalizing with an acetylation of lysine on histone H4 and a methylation of lysine 4 on histone H3. Data indicated that HAT2 is linked to H2A.Z since it is required for acetylation of lyinse 10 on histone H4. A SWR1-like complex and a complex homologous to the NuA4/TIP60 could not be identified yet. This study aimed at identifying a SWR1-like remodelling complex in T. brucei and at identifying a protein complex orthologous to NuA4/TIP60 as well as at answering the question whether HAT2 is part of this complex or not. To this end, I performed multiple mass spectrometry-coupled co-Immunoprecipitation assays with potential subunits of a SWR1 complex, HAT2 and a putative homolog of a NuA4/TIP60 subunit. In the course of these experiments, I was able to identify the TbSWR1 complex. Subsequent cell fractionation and chromatin immunoprecipitation-coupled sequencing analysis experiments confirmed, that this complex is responsible for the incorporation of the histone variant H2A.Z in T. brucei. In addition to this chromatin remodelling complex, I was also able to identify two histone acetyltransferase complexes assembled around HAT1 and HAT2. In the course of my study data were published by the research group of Nicolai Siegel that identified the histone acetyltransferase HAT2 as being responsible for histone H4 acetylation, in preparation to promote H2A.Z incorporation. The data also indicated that HAT1 is responsible for acetylation of H2A.Z. According to the literature, this acetylation is required for proper transcription initiation. Experimental data generated in this study indicated, that H2A.Z and therefore TbSWR1 is involved in the DNA double strand break response of T. brucei. The identification of the specific complex composition of all three complexes provided some hints about how they could interact with each other in the course of transcription regulation and the DNA double strand break response. A proximity labelling approach performed with one of the subunits of the TbSWR1 complex identified multiple transcription factors, PTM writers and proteins potentially involved in chromatin maintenance. Overall, this work will provide some interesting insights about the composition of the complexes involved in H2A.Z incorporation in T. brucei. Furthermore, it is providing valuable information to set up experiments that could shed some light on RNA-polymerase II-mediated transcription and chromatin remodelling in T. brucei in particular and Kinetoplastids in general. N2 - Die Histonvariante H2A.Z ist ein Schlüsselelement bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten. Histonacetylierungen die vom NuA4/Tip60 Komplex prozessiert werden, sind für den korrekten Einbau der Variante unerlässlich. Darüber hinaus erlauben diese posttranslationellen Modifikationen die Rekrutierung weiterer Proteine und Komplexe die für die Transkription notwendig sind. Ein weiteres Schlüsselelement der mittels H2A.Z regulierten Transkription ist der Komplex zur Umstrukturierung des Chromatins SWR1, welcher das kanonische Histon H2A gegen seine Variante austauscht. Zu Beginn dieses Projektes war der Wissenstand bezüglich der Histonvariante H2A.Z in dem einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei limitiert. Wie in anderen eukaryotischen Organismen wurde die Variante ausschließlich an den Startpunkten der polyzistronischen Transkriptionseinheiten gefunden, an denen es für die Öffnung des Chromatins verantwortlich ist und so die Transkription mittels RNAPolymerase II ermöglicht. Vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Variante mit einer Acetylierung des Lysins 10 im Histon H4 und einer Methylierung des Lysins 4 im Histon H3 co-lokalisiert. Einige Daten lieferten den Hinwies, dass die Histon-Acetyltransferase HAT2 mit H2A.Z in Zusammenhang steht, da diese die Acetylierung des Lysins 10 im Hinston H4 prozessiert. Komplexe die in ihrer Funktion dem SWR1 oder dem NuA4/TIP60 Komplex entsprechen, konnten bisher noch nicht gefunden werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab Komplexe zu identifizieren, die in ihrer Funktion dem SWR1 sowie dem NuA4/TIP60 Komplex entsprechen. Zudem soll die Frage geklärt werden ob HAT2 Teil eines möglichen NuA4/TIP60 Komplexes ist. In diesem Zusammenhang habe ich mehrere Massenspektrometrie gekoppelte Co-Immunopräzipitationen mit potenziellen Untereinheiten eines SWR1 Komplexes sowie HAT2 und einem Protein welches otholog zu einer NuA4/TIP60 Untereinheit ist, durchgeführt. Im Verlauf dieser Experimente konnte der SWR1 Komplex in T. brucei (TbSWR1) identifiziert werden. Anschließende Zellfraktionierungen sowie Chromatin Immunopräzipitationen gekoppelte Sequenzanalysen konnten bestätigen, dass der identifizierte Komplex für den Einbau der Histonvariante H2A.Z zuständig ist. Darüber hinaus konnten neben diesem Komplex noch zwei weitere Komplexe identifiziert werden, die jeweils die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 als Kernkomponenten enthalten. Im Verlauf meiner Arbeit wurden von der Arbeitsgruppe von Nicolai Siegel Daten publiziert die zeigten, dass die Histonacetyltransferase HAT2, in Vorbereitung auf den Einbau von H2A.Z, für die Acetylierung des Histons H4 verantwortlich ist. Im Gegenzug ist HAT1 für die Acetylierung von H2A.Z notwendig, welche wiederum für die korrekte Initiation der Transkription benötigt wird. Damit entspricht die Funktion der Acetylierung von H2A.Z in T. brucei der in der Literatur beschriebenen Funktion. Experimentelle Daten die im Verlauf dieser Arbeit generiert wurden, lieferten einen Hinweis darauf, dass H2A.Z auch an der Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen beteiligt ist. Die Aufschlüsselung der spezifischen Zusammensetzung aller drei Komplexe gab einige Hinweise darauf, wie sie sowohl während der Transkriptionsregulation als auch der Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen miteinander interagieren. Im Zuge einer molekularen Umgebungskartierung, die mit einer der Untereinheiten des TbSWR1 Komplexes durchgeführt wurde, konnten mehrere Transkriptionsfaktoren und Enzyme zur Histonmodifizierung identifiziert werden. Dabei wurden auch einige Proteine identifiziert, welche möglicherweise mit der Umformung des Chromatins in Zusammenhang stehen. Abschließend ist festzuhalten, dass diese Arbeit einige äußerst interessante Einsichten über die Zusammensetzung der Komplexe, die am H2A.Z Einbau in T. brucei beteiligt sind, liefern konnte. Darüber hinaus stellt sie einige wertvolle Informationen zur Verfügung. Diese könnten zur gezielten Planung von Experimenten genutzt werden, um mehr über RNA-Polymerase II vermittelte Transkription und Chromatin Umstrukturierung in T. brucei im speziellen und in Kinetoplastiden im Allgemeinen zu erfahren. KW - Chromatinremodelling KW - Histone KW - Transkription KW - Chromatinremodeling KW - Histones KW - Variants KW - Complexes Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257960 ER - TY - JOUR A1 - Vaze, Koustubh M. A1 - Helfrich-Förster, Charlotte T1 - Drosophila ezoana uses an hour-glass or highly damped circadian clock for measuring night length and inducing diapause JF - Physiological Entomology N2 - Insects inhabiting the temperate zones measure seasonal changes in day or night length to enter the overwintering diapause. Diapause induction occurs after the duration of the night exceeds a critical night length (CNL). Our understanding of the time measurement mechanisms is continuously evolving subsequent to Bünning’s proposal that circadian systems play the clock role in photoperiodic time measurement (Bünning, 1936). Initially, the photoperiodic clocks were considered to be either based on circadian oscillators or on simple hour-glasses, depending on ‘positive’ or ‘negative’ responses in Nanda–Hamner and Bünsow experiments (Nanda & Hammer, 1958; Bünsow, 1960). However, there are also species whose responses can be regarded as neither ‘positive’, nor as ‘negative’, such as the Northern Drosophila species Drosophila ezoana, which is investigated in the present study. In addition, modelling efforts show that the ‘positive’ and ‘negative’ Nanda–Hamner responses can also be provoked by circadian oscillators that are damped to different degrees: animals with highly sustained circadian clocks will respond ‘positive’ and those with heavily damped circadian clocks will respond ‘negative’. In the present study, an experimental assay is proposed that characterizes the photoperiodic oscillators by determining the effects of non-24-h light/dark cycles (T-cycles) on critical night length. It is predicted that there is (i) a change in the critical night length as a function of T-cycle period in sustained-oscillator-based clocks and (ii) a fxed night-length measurement (i.e. no change in critical night length) in damped-oscillator-based clocks. Drosophila ezoana flies show a critical night length of approximately 7 h irrespective of T-cycle period, suggesting a damped-oscillator-based photoperiodic clock. The conclusion is strengthened by activity recordings revealing that the activity rhythm of D. ezoana flies also dampens in constant darkness. KW - photoperiodic time mesurement KW - wyeomyia smithii KW - protophormia terraenovae KW - immunoreactive neurons KW - geographical variation KW - reproductive diapause KW - rhythmic components KW - locomotor activity KW - circadian clock KW - damped-oscillator-model of photoperiodic clock KW - diapause KW - Drosophila KW - hour-glass KW - pitcher-plant mosquito KW - bug riptortus-pedestris KW - Nanda-Hamner KW - photoperiodism Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204278 VL - 41 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Varagnolo, Linda T1 - PRC2 inhibition counteracts the culture-associated loss of engraftment potential of human cord blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells T1 - Die Inhibition des PRC2 wirkt dem Kultur-bedingten Verlust des Repopulationspotenzials in humanen hämatopoetischen Stammzellen/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut entgegen N2 - Cord blood hematopoietic stem cells (CB-HSCs) are an outstanding source for the treatment of a variety of malignant and non-malignant disorders. However, the low amount of cells collected per donor is often insufficient for treatment of adult patients. In order to make sufficient numbers of CB-HSCs available for adults, expansion is required. Different approaches were described for HSC expansion, however these approaches are impeded by the loss of engrafting potential during ex vivo culture. Little is known about the underlying molecular mechanisms. Epigenetic mechanisms play essential roles in controlling stem cell potential and fate decisions and epigenetic strategies are considered for HSC expansion. Therefore, this study aimed to characterize global and local epigenotypes during the expansion of human CB-CD34+, a well established CB progenitor cell type, to better understand the molecular mechanisms leading to the culture-associated loss of engrafting potential. Human CB-CD34+ cells were cultured using 2 different cytokine cocktails: the STF cocktail containing SCF, TPO, FGF-1 and the STFIA cocktail, which combines STF with Angiopoietin-like 5 (Angptl5) and Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2). The latter expands CB-HSCs ex vivo. Subsequently, the NOD-scid gamma (NSG) mouse model was used to study the engraftment potential of expanded cells. Engraftment potential achieved by fresh CB-CD34+ cells was maintained when CB-CD34+ cells were expanded under STFIA but not under STF conditions. To explore global chromatin changes in freshly isolated and expanded CB-CD34+ cells, levels of the activating H3K4me3 and the repressive H3K27me3 histone marks were determined by chromatin flow cytometry and Western blot analyses. For analysis of genome-wide chromatin changes following ex vivo expansion, transcriptome profiling by microarray and chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing (ChIP-seq) were performed. Additionally, local chromatin transitions were monitored by ChIP analyses on promoter regions of developmental and self-renewal factors. On a global level, freshly isolated CD34+ and CD34- cells differed in H3K4me3 and H3K27me3 levels. After 7 days of expansion, CD34+ and CD34- cells adopted similar levels of active and repressive marks. Expanding the cells without IGFBP2 and Angptl5 led to a higher global H3K27me3 level. ChIP-seq analyses revealed a cytokine cocktail-dependent redistribution of H3K27me3 profiles. Chemical inhibition of the H3K27 methyltransferase EZH2 counteracted the culture-associated loss of NSG engraftment potential. Collectively, the data presented in this study revealed that by adding epigeneticly active compounds in the culture media we observed changes on a chromatin level which counteracted the loss of engraftment potential. H3K27me3 rather than H3K4me3 may be critical to establish a specific engraftment supporting transcriptional program. Furthermore, I identified a critical function for the Polycomb repressive complex 2-component EZH2 in the loss of engraftment potential during the in vitro expansion of HPSCs. Taken together this thesis provides a better molecular understanding of chromatin changes upon expansion of CB-HSPCs and opens up new perspectives for epigenetic ex vivo expansion strategies. N2 - Hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut (CB-HSCs) sind eine bedeutende Quelle für die Behandlung einer Vielzahl maligner und nicht-maligner Erkrankungen. Allerdings ist die geringe Anzahl an Stammzellen, die von einem Spender gewonnen werden kann, meist nicht ausreichend für die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems erwachsener Patienten. Um eine ausreichende Menge an CB-HSCs zu gewinnen, ist eine Expansion der Zellen erforderlich. Verschiedene Ansätze zur ex vivo Expansion von HSCs wurden beschrieben, allerdings waren diese Ansätze durch den Verlust des Repopulationspotentials während der ex vivo Kultivierung nicht umsetzbar. Über die zugrundeliegenden Mechanismen ist wenig bekannt. Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle in der Kontrolle von Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen. Aus diesem Grund werden epigenetische Strategien zur HSC-Expansion in Betracht gezogen. Das Ziel dieser Studie war, globale und lokale Epigenotypen während der Expansion humaner CB-CD34+-Zellen (CB-Vorläuferzellen) zu charakterisieren. Diese Studien sollten zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, welche zum Kultivierungs-assoziierten Verlust des Repopulationspotentials führen. Humane CB-CD34+-Zellen wurden in zwei verschiedene Zytokin-Cocktails kultiviert: Der sogenannte STF-Cocktail, welcher SCF, TPO und FGF-1 enthält und der STFIA-Cocktail, welcher STF mit Angptl5 und IGFBP2 kombiniert. Aus der Literatur war zu Beginn dieser Doktorarbeit war bekannt, dass CB-HSCs ex vivo in STFIA, nicht aber in STF expandiert werden können. In Übereinstimmung mit diesem Befund zeigen die hier vorgestellten heterologen Transplantationsexperimente, dass das Repopulationspotential frischer CB-CD34+-Zellen nur erhalten blieb, wenn die Zellen unter STFIA, jedoch nicht, wenn sie unter STF-Bedingungen expandiert waren. Um die globalen Chromatinveränderungen frisch isolierter und expandierter Zellen zu untersuchen, wurden die Level der aktivierenden Histonmodifikation H3K4me3 und der repressiven H3K27me3-Modifikation durch Chromatin-Durchflusszytometrie und Western Blot Analyse bestimmt. Zur Analyse der genomweiten Chromatinveränderungen nach ex vivo Expansion wurden Transkriptomprofile durch Mikroarray und Chromatin-Immunpräzipitation, in Kombination mit Deep-Sequencing (ChiP-Seq) durchgeführt. Zusätzlich wurden lokale Chromatinveränderungen durch ChiP-Analysen an Promotorregionen von Entwicklungs- und Selbsterneuerungs-Faktoren analysiert. Auf globaler Ebene unterschieden sich frisch isolierte CD34+ und CD34- Zellen in ihren H3K4me3 und H3K27me3 Leveln. Nach siebentägiger Expansion nahmen CD34+ und CD34- Zellen ähnliche Level aktiver und repressiver Markierungen an. Die Expansion der Zellen ohne IGFBP2 und Angptl5 führte zu höheren globalen H3K27me3 Leveln. ChiP-seq Analysen zeigten eine Zytokin-Cocktail-abhängige Neuverteilung von H3K27me3 Mustern. Die chemische Inhibition der H3K27me-Transferase EZH2 wirkte dem Kultivierungs-assoziierten Verlust des NSG Repopulationspotentials entgegen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass durch die Zugabe von spezifischen Zytokinen in das Kulturmedium Veränderungen auf Chromatinebene verbunden sind, die dem kultivierungs-assoziierten Verlust des Repopulationspotentials entgegen wirken. Diese Daten zeigen weiterhin, dass die durch die PRC2 Komponente EZH2 vermittelte H3K27me3, nicht jedoch die H3K4me3 Histonmodifikation ein kritischer Faktor für die Etablierung eines die Repopulation fördernden Transkriptionsprogrammes ist. Somit dient diese Arbeit einem besseren molekularen Verständnis der Chromatinveränderungen während der Expansion von CB-HSPCs und eröffnet eine Perspektive für neue epigenetische ex vivo Expansionsstrategien. KW - Epigenetik KW - Hämatopoese KW - PRC2 KW - Cord blood-derived hematopoietic stem and progenitor cells KW - Hematopoietic stem cell ex-vivo expansion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108073 ER - TY - JOUR A1 - Vansynghel, Justine A1 - Ocampo-Ariza, Carolina A1 - Maas, Bea A1 - Martin, Emily A. A1 - Thomas, Evert A1 - Hanf-Dressler, Tara A1 - Schumacher, Nils-Christian A1 - Ulloque-Samatelo, Carlos A1 - Tscharntke, Teja A1 - Steffan-Dewenter, Ingolf T1 - Cacao flower visitation: Low pollen deposition, low fruit set and dominance of herbivores JF - Ecological Solutions and Evidence N2 - 1. Pollination services of cacao are crucial for global chocolate production, yet remain critically understudied, particularly in regions of origin of the species. Notably, uncertainties remain concerning the identity of cacao pollinators, the influence of landscape (forest distance) and management (shade cover) on flower visitation and the role of pollen deposition in limiting fruit set. 2. Here, we aimed to improve understanding of cacao pollination by studying limiting factors of fruit set in Peru, part of the centre of origin of cacao. Flower visitors were sampled with sticky insect glue in 20 cacao agroforests in two biogeographically distinct regions of Peru, across gradients of shade cover and forest distance. Further, we assessed pollen quantities and compared fruit set between naturally and manually pollinated flowers. 3. The most abundant flower visitors were aphids, ants and thrips in the north and thrips, midges and parasitoid wasps in the south of Peru. We present some evidence of increasing visitation rates from medium to high shade (40%–95% canopy closure) in the dry north, and opposite patterns in the semi-humid south, during the wet season. 4. Natural pollination resulted in remarkably low fruit set rates (2%), and very low pollen deposition. After hand pollination, fruit set more than tripled (7%), but was still low. 5. The diversity and high relative abundances of herbivore flower visitors limit our ability to draw conclusions on the functional role of different flower visitors. The remarkably low fruit set of naturally and even hand pollinated flowers indicates that other unaddressed factors limit cacao fruit production. Such factors could be, amongst others, a lack of effective pollinators, genetic incompatibility or resource limitation. Revealing efficient pollinator species and other causes of low fruit set rates is therefore key to establish location-specific management strategies and develop high yielding native cacao agroforestry systems in regions of origin of cacao KW - agroforestry KW - cocoa KW - flower visitors KW - forest proximity KW - hand pollination KW - pollen KW - pollination services KW - shade cover Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312722 SN - 2688-8319 VL - 3 IS - 2 ER - TY - THES A1 - Vansynghel, Justine T1 - Pollination and pest control along gradients of shade cover and forest distance in Peruvian cacao agroforestry landscapes T1 - Bestäubung und Schädlingsbekämpfung entlang von Beschattungs- und Waldentfernungsgradienten in peruanischen Kakao-Agroforstlandschaften N2 - Chapter I – Introduction Global trade of beans of the cacao tree (Theobroma cacao), of which chocolate is produced, contributes to the livelihoods of millions of smallholder farmers. The understorey tree is native to South America but is nowadays cultivated in many tropical regions. In Peru, a South American country with a particularly high cacao diversity, it is common to find the tree cultivated alongside non-crop trees that provide shade, in so-called agroforestry systems. Because of the small scale and low management intensity of such systems, agroforestry is one of the most wildlife-friendly land-use types, harbouring the potential for species conservation. Studying wildlife-friendly land-use is of special importance for species conservation in biodiversity-rich tropical regions such as Peru, where agricultural expansion and intensification are threatening biodiversity. Moreover, there is a growing body of evidence that shows co-occurrence of high biodiversity levels and high yield in wildlife-friendly cacao farming. Yet studies are restricted to non-native cacao countries, and since patterns might be different among continents, it is important to improve knowledge on wildlife-friendly agroforestry in native countries. Because studies of wildlife-friendly cultivation processes are still largely lacking for South America, we set out to study multiple aspects of cacao productivity in agroforests in Peru, part of cacao´s region of origin. The natural pollination process of cacao, which is critically understudied, was investigated by trapping flower visitors and studying pollen deposition from macrophotographs (Chapter II). Next, we excluded birds, bats, ants and flying insects and squirrels from cacao trees in a full-factorial field experiment and quantified these animals´ contribution to cacao fruit set, fruit loss and yield (Chapter III). Lastly, we aimed to assess whether fruit quantity and quality of native cacao increases through manually supplementing pollen (Chapter II and IV), and whether microclimatic conditions and the genetic background of the studied varieties limit fruit set (Chapter IV). Chapter II – Cacao flower visitation: Low pollen deposition, low fruit set and dominance of herbivores Given the importance of cacao pollination for the global chocolate production, it is remarkable that fruit set limitations are still understudied. Knowledge on flower visitation and the effect of landscape context and local management are lacking, especially in the crop’s region of origin. Moreover, the role of pollen deposition in limiting fruit set as well as the benefits of hand pollination in native cacao are unknown. In this chapter, we aimed to close the current knowledge gaps on cacao pollination biology and sampled flower visitors in 20 Peruvian agroforests with native cacao, along gradients of shade cover and forest distance. We also assessed pollen quantities and compared fruit set between manually and naturally pollinated flowers. We found that herbivores were the most abundant flower visitors in both northern and southern Peru, but we could not conclude which insects are effective cacao pollinators. Fruit set was remarkably low (2%) but improved to 7% due to pollen supplementation. Other factors such as a lack of effective pollinators, genetic pollen incompatibility or resource unavailability could be causing fruit set limitations. We conclude that revealing those causes and the effective pollinators of cacao will be key to improve pollination services in cacao. Chapter III – Quantifying services and disservices provided by insects and vertebrates in cacao agroforestry landscapes Pollination and pest control, two ecosystem services that support cacao yield, are provided by insects and vertebrates. However, animals also generate disservices, and their combined contribution is still unclear. Therefore, we excluded flying insects, ants, birds and bats, and as a side effect also squirrels from cacao trees and we assessed fruit set, fruit loss and final yield. Local management and landscape context can influence animal occurrence in cacao agroforestry landscapes; therefore, shade cover and forest distance were included in the analyses. Flying insects benefitted cacao fruit set, with largest gains in agroforests with intermediate shade cover. Birds and bats were also associated with improved fruit set rates and with a 114% increase in yield, potentially due to pest control services provided by these animals. The role of ants was complicated: these insects had a positive effect on yield, but only close to forest. We also evidenced disservices generated by ants and squirrels, causing 7% and 10% of harvest loss, respectively. Even though the benefits provided by animals outweighed the disservices, trade-offs between services and disservices still should be integrated in cacao agroforestry management. Chapter IV – Cross-pollination improves fruit set and yield quality of Peruvian native cacao Because yields of the cacao tree are restricted by pollination, hand pollination has been proposed to improve yield quantity and potentially, also quality. However, low self- and cross-compatibility of native cacao, and abiotic conditions could cancel out hand pollination benefits. Yet, the impact of genetic constraints and abiotic conditions on fruit set have not been assessed in native cacao so far. To increase our understanding of the factors that limit fruit set in native cacao, we compared manual self- and cross-pollination with five native genotypes selected for their sensorial quality and simultaneously tested for effects of soil water content, temperature, and relative air humidity. We also compared quality traits between manually and naturally pollinated fruits. Success rates of self-pollination were low (0.5%), but increased three- to eightfold due to cross-pollination, depending on the genotype of the pollen donor. Fruit set was also affected by the interaction between relative air humidity and temperature, and we found heavier and more premium seeds in fruits resulting from manual than natural pollination. Together, these findings show that reproductive traits of native cacao are constrained by genetic compatibility and abiotic conditions. We argue that because of the high costs of hand pollination, natural cross-pollination with native pollen donors should be promoted so that quality improvements can result in optimal economic gains for smallholder farmers. Chapter V – Discussion In this thesis, we demonstrated that the presence of flying insects, ants and vertebrates, local and landscape management practices, and pollen supplementation interactively affected cacao yield, at different stages of the development from flower to fruit. First, we showed that fruit set improved by intermediate shade levels and flower visitation by flying insects. Because the effective cacao pollinators remain unknown, we recommend shade cover management to safeguard fruit set rates. The importance of integrating trade-offs in wildlife-friendly management was highlighted by lower harvest losses due to ants and squirrels than the yield benefits provided by birds and bats. The maintenance of forest in the landscape might further promote occurrence of beneficial animals, because in proximity to forest, ants were positively associated with cacao yields. Therefore, an integrated wildlife-friendly farming approach in which shade cover is managed and forest is maintained or restored to optimize ecosystem service provision, while minimizing fruit loss, might benefit yields of native cacao. Finally, manual cross-pollination with native genotypes could be recommended, due to improved yield quantity and quality. However, large costs associated with hand pollination might cancel out these benefits. Instead, we argue that in an integrated management, natural cross-pollination should be promoted by employing compatible genotypes in order to improve yield quantity and quality of native cacao. N2 - Kapitel I – Einleitung Der weltweite Handel mit den Bohnen des Kakaobaums (Theobroma cacao) trägt zum Lebensunterhalt von Millionen von Kleinbauern bei. Der Unterholzbaum, aus dessen Bohnen Schokolade hergestellt wird, ist in Südamerika beheimatet, wird aber heute in vielen tropischen Regionen angebaut. In Peru, einem der Länder mit einer besonders hohen Kakaovielfalt, wird der Baum häufig zusammen mit schattenspendenden Bäumen in so genannten Agroforstsystemen angebaut. Aufgrund der Kleinräumigkeit und der geringen Bewirtschaftungsintensität solcher Systeme ist die Agroforstwirtschaft eine der wildtierfreundlichsten Landnutzungsformen, die ein großes Potenzial für den Artenschutz bietet. Die Erforschung wildtierfreundlicher Landnutzungsformen ist besonders wichtig für den Artenschutz in artenreichen tropischen Regionen wie Peru, in denen die Ausweitung und Intensivierung der Landwirtschaft die biologische Vielfalt bedroht. Darüber hinaus gibt es immer mehr Belege dafür, dass eine hohe Artenvielfalt mit hohen Erträgen im wildtierfreundlichen Kakaoanbau einhergeht. Die Studien beschränken sich jedoch auf nicht ursprüngliche Kakaoländer, und da die Muster auf den verschiedenen Kontinenten unterschiedlich sein könnten, ist es wichtig, das Wissen über wildtierfreundliche Agroforstwirtschaft in den Ursprungsländern zu verbessern. Da Studien über wildtierfreundliche Anbauprozesse in Südamerika noch weitgehend fehlen, haben wir uns vorgenommen, verschiedene Aspekte der Kakaoproduktivität in Agroforstbetrieben in Peru, einem Teil der Ursprungsregion des Kakaos, zu untersuchen. Der natürliche Bestäubungsprozess von Kakao, der wenig erforscht ist, wurde durch das Einfangen von Blütenbesuchern und die Untersuchung der Pollenablage anhand von Makrofotografien untersucht (Kapitel II). Als Nächstes haben wir gemeinsam Vögel, Fledermäuse, Ameisen und Fluginsekten und Eichhörnchen vom Zugang zu Kakaobäumen ausgeschlossen und den Beitrag dieser Tiere zum Fruchtansatz, Fruchtverlust und Ertrag von Kakao quantifiziert (Kapitel III). Schließlich wollten wir feststellen, ob sich die Fruchtmenge und -qualität des heimischen Kakaos durch die händische Zugabe von Pollen erhöht (Kapitel II und IV) und ob der genetische Hintergrund der untersuchten Sorten und die mikroklimatischen Bedingungen den Fruchtansatz limitieren (Kapitel IV). Kapitel II – Besuch der Kakaoblüten: Geringer Polleneintrag, geringer Fruchtansatz und Dominanz von Pflanzenfressern Angesichts der Bedeutung der Kakaobestäubung für die weltweite Schokoladenproduktion ist es bemerkenswert, dass der Fruchtansatz noch immer nicht ausreichend erforscht ist. Insbesondere in der Herkunftsregion der Pflanze fehlt es an Wissen über die Blütenbesucher und die Auswirkungen von Landschaft und Bewirtschaftung. Darüber hinaus sind die Rolle des Polleneintrags bei der Limitierung des Fruchtansatzes sowie die Vorteile der Handbestäubung bei einheimischem Kakao unbekannt. In diesem Kapitel wollten wir die derzeitigen Wissenslücken über die Bestäubungsbiologie von Kakao schließen und haben in 20 peruanischen Agroforsten mit einheimischem Kakao bei unterschiedlicher Beschattung und Waldentfernung Proben von Blütenbesuchern genommen. Wir untersuchten auch die Pollenmenge und verglichen den Fruchtansatz zwischen händisch und natürlich bestäubten Blüten. Wir stellten fest, dass Pflanzenfresser sowohl im Norden als auch im Süden Perus die häufigsten Blütenbesucher waren, konnten aber nicht feststellen, welche Insekten effektive Kakaobestäuber sind. Der Fruchtansatz war bemerkenswert niedrig (2 %), verbesserte sich aber durch die Pollenergänzung auf 7 %. Andere Faktoren wie ein Mangel an wirksamen Bestäubern, genetische Polleninkompatibilität oder die Nichtverfügbarkeit von Ressourcen könnten die Ursache für den geringen Fruchtansatz sein. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Aufdeckung dieser Ursachen und der effektiven Bestäuber des Kakaos der Schlüssel zur Verbesserung der Bestäubungsleistungen im Kakao sein wird. Kapitel III – Quantifizierung der von Insekten und Wirbeltieren in agroforstwirtschaftlichen Kakaolandschaften erbrachten Ökosystemdienstleistungen und Gegenleistungen Bestäubung und Schädlingsbekämpfung, zwei Ökosystemleistungen, die den Kakaoertrag unterstützen, werden von Insekten und Wirbeltieren erbracht. Allerdings erbringen die Tiere auch andere Leistungen und ihr kombinierter Beitrag ist noch unklar. Daher haben wir Fluginsekten, Ameisen, Vögel und Fledermäuse und als Nebeneffekt auch Eichhörnchen vom Zugang zu den Kakaobäumen ausgeschlossen und den Fruchtansatz, den Fruchtverlust und den endgültigen Ertrag bewertet. Die Bewirtschaftung auf lokaler und Landschaftsebene kann das Vorkommen von Tieren in Kakao-Agroforstlandschaften erhöht werden; daher wurden auch die Beschattung und die Entfernung zum nächsten Wald in die Analysen einbezogen. Fluginsekten begünstigten den Fruchtansatz von Kakao, wobei die größten Zugewinne in Agroforsten mit mittlerer Beschattung zu verzeichnen waren. Vögel und Fledermäuse wurden ebenfalls mit verbesserten Fruchtansatzraten und einer 114%igen Ertragssteigerung in Verbindung gebracht, was möglicherweise auf die Schädlingsbekämpfung durch diese Tiere zurückzuführen ist. Die Rolle der Ameisen war kompliziert: Diese Insekten wirkten sich positiv auf den Ertrag aus, aber nur in Waldnähe. Wir haben auch negative Auswirkungen von Ameisen und Eichhörnchen festgestellt, die 7% bzw. 10 % der Ernteverluste verursachten. Auch wenn die Vorteile der Tiere die Nachteile überwiegen, sollte ein Ausgleich zwischen den Vor- und Nachteilen in die agroforstliche Bewirtschaftung von Kakao integriert werden. Kapitel IV – Kreuzbestäubung verbessert den Fruchtansatz und die Ertragsqualität von einheimischem peruanischem Kakao Da die Erträge des Kakaobaums durch die Bestäubung eingeschränkt werden, wurde die Handbestäubung vorgeschlagen, um die Ertragsmenge und möglicherweise auch die Qualität zu verbessern. Die geringe Selbst- und Kreuzkompatibilität der einheimischen Kakaosorten und die abiotischen Bedingungen könnten jedoch die Vorteile der Handbestäubung einschränken. Die Auswirkungen genetischer Limitierungen und abiotischer Bedingungen auf den Fruchtansatz wurden bei einheimischem Kakao bisher noch nicht untersucht. Um die Faktoren besser zu verstehen, die den Fruchtansatz bei einheimischem Kakao einschränken, verglichen wir die händische Selbst- und Kreuzbestäubung mit fünf einheimischen Genotypen, die aufgrund ihrer aromatischen Qualität ausgewählt wurden, und untersuchten gleichzeitig die Auswirkungen von Bodenwassergehalt, Temperatur und relativer Luftfeuchtigkeit. Außerdem verglichen wir die Qualitätsmerkmale zwischen händisch und natürlich bestäubten Früchten. Die Erfolgsrate der Selbstbestäubung war gering (0,5 %), stieg jedoch durch Kreuzbestäubung um das Drei- bis Achtfache, je nach Genotyp des Pollenspenders. Der Fruchtansatz wurde auch durch die Wechselwirkung zwischen relativer Luftfeuchtigkeit und Temperatur beeinflusst, und wir fanden schwerere und hochwertigere Samen in Früchten, die durch manuelle Bestäubung entstanden waren, als in den natürlich bestäubten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Fortpflanzungseigenschaften des einheimischen Kakaos durch genetische Kompatibilität und abiotische Bedingungen eingeschränkt werden. Wir argumentieren, dass aufgrund der hohen Kosten der Handbestäubung die natürliche Kreuzbestäubung mit heimischen Pollenspendern gefördert werden sollte, damit Qualitätsverbesserungen zu optimalen wirtschaftlichen Gewinnen für die Kleinbauern führen können. Kapitel V – Diskussion In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass die Anwesenheit von Fluginsekten, Ameisen und Wirbeltieren, die Bewirtschaftungspraktiken auf lokaler und Landschaftsebene sowie die Pollenergänzung den Kakaoertrag in verschiedenen Entwicklungsstadien von der Blüte bis zur Frucht interaktiv beeinflussen. Zunächst haben wir gezeigt, dass sich der Fruchtansatz durch eine mittlere Beschattung und den Blütenbesuch durch Fluginsekten verbessert. Da die effektiven Bestäuber des Kakaos noch nicht bekannt sind, empfehlen wir, die Beschattung so zu gestalten, dass der Fruchtansatz gesichert ist. Wie wichtig es ist, bei einer wildtierfreundlichen Bewirtschaftung Kompromisse einzugehen, zeigt sich daran, dass die Ernteverluste durch Ameisen und Eichhörnchen geringer sind als die Ertragsvorteile durch Vögel und Fledermäuse. Die Erhaltung des Waldes in der Landschaft könnte das Vorkommen von Nützlingen weiter fördern, da Ameisen in der Nähe von Wäldern positiv mit den Kakaoerträgen verbunden waren. Daher könnte ein integrativer, wildtierfreundlicher Anbauplan, bei dem die Beschattung und der Waldabstand so gesteuert werden, dass die Bereitstellung von Ökosystemleistungen optimiert und gleichzeitig der Verlust von Früchten minimiert wird, den Erträgen des heimischen Kakaos zugutekommen. Schließlich könnte die händische Kreuzbestäubung mit einheimischen Genotypen aufgrund der verbesserten Ertragsmenge und -qualität empfohlen werden. Die hohen Kosten der händischen Bestäubung könnten diese Vorteile jedoch zunichtemachen. Stattdessen sollte im Rahmen einer integrativen Bewirtschaftung die natürliche Kreuzbestäubung durch den Einsatz kompatibler Genotypen gefördert werden, um die Quantität und Qualität der Erträge von einheimischem Kakao zu verbessern. KW - Kakao KW - Bestäubung KW - Schädlingsbekämpfung KW - Landschaftspflege KW - landwirtschaftlicher Betrieb KW - landscape management KW - wildlife-friendly farming KW - local farm management Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281574 ER - TY - JOUR A1 - van Heyningen, V. A1 - Bickmore, W. A. A1 - Seawright, A. A1 - Fletcher, J. M. A1 - Maule, J. A1 - Fekete, G. A1 - Gessler, Manfred A1 - Bruns, G. A. A1 - Huerre-Jeanpierre, C. A1 - Junien, C. T1 - Role for the Wilms tumor gene in genital development? N2 - No abstract available KW - Biochemie Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-59238 ER - TY - JOUR A1 - Van den Hove, Daniel A1 - Jakob, Sissi Brigitte A1 - Schraut, Karla-Gerlinde A1 - Kenis, Gunter A1 - Schmitt, Angelika Gertrud A1 - Kneitz, Susanne A1 - Scholz, Claus-Jürgen A1 - Wiescholleck, Valentina A1 - Ortega, Gabriela A1 - Prickaerts, Jos A1 - Steinbusch, Harry A1 - Lesch, Klaus-Peter T1 - Differential Effects of Prenatal Stress in 5-Htt Deficient Mice: Towards Molecular Mechanisms of Gene x Environment Interactions N2 - Prenatal stress (PS) has been shown to influence the development of the fetal brain and to increase the risk for the development of psychiatric disorders in later life. Furthermore, the variation of human serotonin transporter (5-HTT, SLC6A4) gene was suggested to exert a modulating effect on the association between early life stress and the risk for depression. In the present study, we used a 5-Htt6PS paradigm to investigate whether the effects of PS are dependent on the 5-Htt genotype. For this purpose, the effects of PS on cognition, anxiety- and depression-related behavior were examined using a maternal restraint stress paradigm of PS in C57BL6 wild-type (WT) and heterozygous 5-Htt deficient (5-Htt +/2) mice. Additionally, in female offspring, a genome-wide hippocampal gene expression profiling was performed using the Affymetrix GeneChipH Mouse Genome 430 2.0 Array. 5-Htt +/2 offspring showed enhanced memory performance and signs of reduced anxiety as compared to WT offspring. In contrast, exposure of 5-Htt +/2 mice to PS was associated with increased depressive-like behavior, an effect that tended to be more pronounced in female offspring. Further, 5-Htt genotype, PS and their interaction differentially affected the expression of numerous genes and related pathways within the female hippocampus. Specifically, MAPK and neurotrophin signaling were regulated by both the 5-Htt +/2 genotype and PS exposure, whereas cytokine and Wnt signaling were affected in a 5-Htt genotype6PS manner, indicating a gene6environment interaction at the molecular level. In conclusion, our data suggest that although the 5-Htt +/2 genotype shows clear adaptive capacity, 5-Htt +/2 mice –particularly females– at the same time appear to be more vulnerable to developmental stress exposure when compared to WT offspring. Moreover, hippocampal gene expression profiles suggest that distinct molecular mechanisms mediate the behavioral effects of the 5-Htt genotype, PS exposure, and their interaction. KW - Medizin Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75795 ER - TY - JOUR A1 - van de Peppel, L. J. J. A1 - Aanen, D. K. A1 - Biedermann, P. H. W. T1 - Low intraspecific genetic diversity indicates asexuality and vertical transmission in the fungal cultivars of ambrosia beetles JF - Fungal Ecology N2 - Ambrosia beetles farm ascomycetous fungi in tunnels within wood. These ambrosia fungi are regarded asexual, although population genetic proof is missing. Here we explored the intraspecific genetic diversity of Ambrosiella grosmanniae and Ambrosiella hartigii (Ascomycota: Microascales), the mutualists of the beetles Xylosandrus germanus and Anisandrus dispar. By sequencing five markers (ITS, LSU, TEF1α, RPB2, β-tubulin) from several fungal strains, we show that X. germanus cultivates the same two clones of A. grosmanniae in the USA and in Europe, whereas A. dispar is associated with a single A. hartigii clone across Europe. This low genetic diversity is consistent with predominantly asexual vertical transmission of Ambrosiella cultivars between beetle generations. This clonal agriculture is a remarkable case of convergence with fungus-farming ants, given that both groups have a completely different ecology and evolutionary history. KW - clonal fungiculture KW - ambrosia fungus KW - Ambrosiella KW - vertical transmission KW - symbiosis KW - Xylosandrus KW - Anisandrus KW - asexuality KW - genetic diversity Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-232161 VL - 32 ER - TY - JOUR A1 - Vainshtein, Yevhen A1 - Sanchez, Mayka A1 - Brazma, Alvis A1 - Hentze, Matthias W. A1 - Dandekar, Thomas A1 - Muckenthaler, Martina U. T1 - The IronChip evaluation package: a package of perl modules for robust analysis of custom microarrays N2 - Background: Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Results: The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls. Conclusions: ICEP is a stand-alone Windows application to obtain optimal data quality from custom-designed microarrays and is freely available here (see “Additional Files” section) and at: http://www.alice-dsl.net/evgeniy. vainshtein/ICEP/ KW - Microarray KW - ICEP KW - IronChip Evaluation Package Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67869 ER - TY - THES A1 - Vainshtein, Yevhen T1 - Applying microarray‐based techniques to study gene expression patterns: a bio‐computational approach T1 - Anwendung von Mikroarrayanalysen um Genexpressionsmuster zu untersuchen: Ein bioinformatischer Ansatz N2 - The regulation and maintenance of iron homeostasis is critical to human health. As a constituent of hemoglobin, iron is essential for oxygen transport and significant iron deficiency leads to anemia. Eukaryotic cells require iron for survival and proliferation. Iron is part of hemoproteins, iron-sulfur (Fe-S) proteins, and other proteins with functional groups that require iron as a cofactor. At the cellular level, iron uptake, utilization, storage, and export are regulated at different molecular levels (transcriptional, mRNA stability, translational, and posttranslational). Iron regulatory proteins (IRPs) 1 and 2 post-transcriptionally control mammalian iron homeostasis by binding to iron-responsive elements (IREs), conserved RNA stem-loop structures located in the 5’- or 3‘- untranslated regions of genes involved in iron metabolism (e.g. FTH1, FTL, and TFRC). To identify novel IRE-containing mRNAs, we integrated biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches. Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Methods In this project response to the iron treatment was examined under different conditions using bioinformatical methods. This would improve our understanding of an iron regulatory network. For these purposes we used microarray gene expression data. To identify novel IRE-containing mRNAs biochemical, biocomputational, and microarray-based experimental approaches were integrated. IRP/IRE messenger ribonucleoproteins were immunoselected and their mRNA composition was analysed using an IronChip microarray enriched for genes predicted computationally to contain IRE-like motifs. Analysis of IronChip microarray data requires specialized tool which can use all advantages of a customized microarray platform. Novel decision-tree based algorithm was implemented using Perl in IronChip Evaluation Package (ICEP). Results IRE-like motifs were identified from genomic nucleic acid databases by an algorithm combining primary nucleic acid sequence and RNA structural criteria. Depending on the choice of constraining criteria, such computational screens tend to generate a large number of false positives. To refine the search and reduce the number of false positive hits, additional constraints were introduced. The refined screen yielded 15 IRE-like motifs. A second approach made use of a reported list of 230 IRE-like sequences obtained from screening UTR databases. We selected 6 out of these 230 entries based on the ability of the lower IRE stem to form at least 6 out of 7 bp. Corresponding ESTs were spotted onto the human or mouse versions of the IronChip and the results were analysed using ICEP. Our data show that the immunoselection/microarray strategy is a feasible approach for screening bioinformatically predicted IRE genes and the detection of novel IRE-containing mRNAs. In addition, we identified a novel IRE-containing gene CDC14A (Sanchez M, et al. 2006). The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip, but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls (Vainshtein Y, et al., 2010). N2 - Die Regulierung und Aufrechterhaltung der Eisen-Homeostase ist bedeutend für die menschliche Gesundheit. Als Bestandteil des Hämoglobins ist es wichtig für den Transport von Sauerstoff, ein Mangel führt zu Blutarmut. Eukaryotische Zellen benötigen Eisen zum Überleben und zum Proliferieren. Eisen ist am Aufbau von Hämo- und Eisenschwefelproteinen (Fe-S) beteiligt und kann als Kofaktor dienen. Die Aufnahme, Nutzung, Speicherung und der Export von Eisen ist zellulär auf verschiedenen molekularen Ebenen reguliert (Transkription, mRNA-Level, Translation, Protein-Level). Die iron regulatory proteins (IRPs) 1 und 2 kontrollieren die Eisen-Homeostase in Säugetieren posttranslational durch die Bindung an Iron-responsive elements (IREs). IREs sind konservierte RNA stem-loop Strukturen in den 5' oder 3' untranslatierten Bereichen von Genen, die im Eisenmetabolismus involviert sind (z.B. FTH1, FTL und TFRC). In dieser Arbeit wurden biochemische und bioinformatische Methoden mit Microarray-Experimenten kombiniert, um neue mRNAs mit IREs zu identifizieren. Genexpressionsstudien verbessern unser Verständnis über die komplexen Zusammenhänge in genregulatorischen Netzwerken. Das komplexe Design von Microarrays, deren Produktion und Manipulation sind dabei die limitierenden Faktoren bezüglich der Datenqualität. Die Verwendung von angepassten DNA Microarrays verbessert häufig die Datenqualität, falls entsprechende Analysemöglichkeiten für diese Arrays existieren. Methoden Um unser Verständnis von eisenregulierten Netzwerken zu verbessern, wurde im Rahmen dieses Projektes die Auswirkung einer Behandlung mit Eisen bzw. von Knockout Mutation unter verschiedenen Bedingungen mittels bioinformatischer Methoden untersucht. Hierfür nutzen wir Expressionsdaten aus Microarray-Experimenten. Durch die Verknüpfung von biochemischen, bioinformatischen und Microarray Ansätzen können neue Proteine mit IREs identifiziert werden. IRP/IRE messenger Ribonucleoproteine wurden immunpräzipitiert. Die Zusammensetzung der enthaltenen mRNAs wurde mittels einem IronChip Microarray analysiert: Für diesen Chip wurden bioinformatisch Gene vorhergesagt, die IRE-like Motive aufweisen. Der Chip wurde mit solchen Oligonucleotiden beschichtet und durch Hybridisierung überprüft, ob die präzipitierten mRNA sich hieran binden. Die Analyse der erhaltenen Daten erfordert ein spezialisiertes Werkzeug um von allen Vorteilen der angepassten Microarrays zu profitieren. Ein neuer Entscheidungsbaum-basierter Algorithmus wurde in Perl im IronChip Evaluation Package (ICEP) implementiert. Ergebnisse Aus großen Sequenz-Datenbanken wurden IRE-like Motive identifiziert. Dazu kombiniert der Algorithmus, insbesondere RNA-Primärsequenz und RNA-Strukturdaten. Solche Datenbankanalysen tendieren dazu, eine große Anzahl falsch positiver Treffer zu generieren. Daher wurden zusätzliche Bedingungen formuliert, um die Suche zu verfeinern und die Anzahl an falsch positiven Treffer zu reduzieren. Die angepassten Suchkriterien ergaben 15 IRE-like Motive. In einem weiteren Ansatz verwendeten wir eine Liste von 230 IRE-like Sequenzen aus UTR-Datenbanken. Daraus wurden 6 Sequenzen ausgewählt, die auch im unteren Teil stabil sind (untere Helix über 6 bp stabil). Die korrespondierenden Expressed Sequence Tags (ESTs) wurden auf die humane oder murine Version des IronChips aufgetragen. Die Microarray Ergebnisse wurden mit dem ICEP Programm ausgewertet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Immunpräzipitation mit anschließender Microarrayanalyse ein nützlicher Ansatz ist, um bioinformatisch vorhergesagte IRE-Gene zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht uns dieser Ansatz die Detektion neuer mRNAs, die IREs enthalten, wie das von uns gefundene Gen CDC14A (Sanchez et al., 2006). ICEP ist ein optimiertes Programmpaket aus Perl Programmen (Vainshtein et al., BMC Bioinformatics, 2010). Es ermöglicht die einfache Auswertung von Microarray Daten mit dem Fokus auf selbst entwickelten Microarray Designs. ICEP diente für die statistische und bioinformatische Analyse von selbst entwickelten IronChips, kann aber auch leicht an die Analyse von oligonucleotidbasierten oder cDNA Microarrays adaptiert werden. ICEP nutzt einen Entscheidungsbaum-basierten Algorithmus um die Qualität zu bewerten und führt eine robuste Analyse basierend auf Chipeigenschaften, wie mehrfachen Wiederholungen, Signal/Rausch Verhältnis, Hintergrund und Negativkontrollen durch. KW - Microarray KW - Genexpression KW - Bioinformatik KW - geneexpression KW - microarrays KW - IronChip KW - ICEP Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51967 ER - TY - JOUR A1 - Uttinger, Konstantin L. A1 - Riedmeier, Maria A1 - Reibetanz, Joachim A1 - Meyer, Thomas A1 - Germer, Christoph Thomas A1 - Fassnacht, Martin A1 - Wiegering, Armin A1 - Wiegering, Verena T1 - Adrenalectomies in children and adolescents in Germany – a diagnose related groups based analysis from 2009-2017 JF - Frontiers in Endocrinology N2 - Background Adrenalectomies are rare procedures especially in childhood. So far, no large cohort study on this topic has been published with data on to age distribution, operative procedures, hospital volume and operative outcome. Methods This is a retrospective analysis of anonymized nationwide hospital billing data (DRG data, 2009-2017). All adrenal surgeries (defined by OPS codes) of patients between the age 0 and 21 years in Germany were included. Results A total of 523 patient records were identified. The mean age was 8.6 ± 7.7 years and 262 patients were female (50.1%). The majority of patients were between 0 and 5 years old (52% overall), while 11.1% were between 6 and 11 and 38.8% older than 12 years. The most common diagnoses were malignant neoplasms of the adrenal gland (56%, mostly neuroblastoma) with the majority being younger than 5 years. Benign neoplasms in the adrenal gland (D350) account for 29% of all cases with the majority of affected patients being 12 years or older. 15% were not defined regarding tumor behavior. Overall complication rate was 27% with a clear higher complication rate in resection for malignant neoplasia of the adrenal gland. Bleeding occurrence and transfusions are the main complications, followed by the necessary of relaparotomy. There was an uneven patient distribution between hospital tertiles (low volume, medium and high volume tertile). While 164 patients received surgery in 85 different “low volume” hospitals (0.2 cases per hospital per year), 205 patients received surgery in 8 different “high volume” hospitals (2.8 cases per hospital per year; p<0.001). Patients in high volume centers were significant younger, had more extended resections and more often malignant neoplasia. In multivariable analysis younger age, extended resections and open procedures were independent predictors for occurrence of postoperative complications. Conclusion Overall complication rate of adrenalectomies in the pediatric population in Germany is low, demonstrating good therapeutic quality. Our analysis revealed a very uneven distribution of patient volume among hospitals. KW - pediatric KW - neuroblastoma – diagnosis KW - therapy KW - adrenocortical adenocarcinoma KW - outcome KW - volume KW - adrenalectomia Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-282280 SN - 1664-2392 VL - 13 ER - TY - JOUR A1 - Urban, Lara A1 - Remmele, Christian W. A1 - Dittrich, Marcus A1 - Schwarz, Roland F. A1 - Müller, Tobias T1 - covRNA: discovering covariate associations in large-scale gene expression data JF - BMC Reserach Notes N2 - Objective The biological interpretation of gene expression measurements is a challenging task. While ordination methods are routinely used to identify clusters of samples or co-expressed genes, these methods do not take sample or gene annotations into account. We aim to provide a tool that allows users of all backgrounds to assess and visualize the intrinsic correlation structure of complex annotated gene expression data and discover the covariates that jointly affect expression patterns. Results The Bioconductor package covRNA provides a convenient and fast interface for testing and visualizing complex relationships between sample and gene covariates mediated by gene expression data in an entirely unsupervised setting. The relationships between sample and gene covariates are tested by statistical permutation tests and visualized by ordination. The methods are inspired by the fourthcorner and RLQ analyses used in ecological research for the analysis of species abundance data, that we modified to make them suitable for the distributional characteristics of both, RNA-Seq read counts and microarray intensities, and to provide a high-performance parallelized implementation for the analysis of large-scale gene expression data on multi-core computational systems. CovRNA provides additional modules for unsupervised gene filtering and plotting functions to ensure a smooth and coherent analysis workflow. KW - Multivariate analysis KW - Fourthcorner analysis KW - RLQ analysis KW - Transcriptomics KW - High-throughput data KW - Visualization KW - Ordination methods KW - RNA-Seq analysis KW - Microarray analysis Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229258 VL - 13 ER - TY - JOUR A1 - Uppaluri, Sravanti A1 - Nagler, Jan A1 - Stellamanns, Eric A1 - Heddergott, Niko A1 - Herminghaus, Stephan A1 - Pfohl, Thomas A1 - Engstler, Markus T1 - Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional JF - PLoS Computational Biology N2 - Microorganisms, particularly parasites, have developed sophisticated swimming mechanisms to cope with a varied range of environments. African Trypanosomes, causative agents of fatal illness in humans and animals, use an insect vector (the Tsetse fly) to infect mammals, involving many developmental changes in which cell motility is of prime importance. Our studies reveal that differences in cell body shape are correlated with a diverse range of cell behaviors contributing to the directional motion of the cell. Straighter cells swim more directionally while cells that exhibit little net displacement appear to be more bent. Initiation of cell division, beginning with the emergence of a second flagellum at the base, correlates to directional persistence. Cell trajectory and rapid body fluctuation correlation analysis uncovers two characteristic relaxation times: a short relaxation time due to strong body distortions in the range of 20 to 80 ms and a longer time associated with the persistence in average swimming direction in the order of 15 seconds. Different motility modes, possibly resulting from varying body stiffness, could be of consequence for host invasion during distinct infective stages. KW - African Trypanosomes KW - Cell Motility KW - Random-Walk KW - Brucei KW - Components KW - Flagellum KW - Biology KW - Motion KW - Chemotaxis KW - Movement Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140814 VL - 7 IS - 6 ER - TY - JOUR A1 - Uphus, Lars A1 - Lüpke, Marvin A1 - Yuan, Ye A1 - Benjamin, Caryl A1 - Englmeier, Jana A1 - Fricke, Ute A1 - Ganuza, Cristina A1 - Schwindl, Michael A1 - Uhler, Johannes A1 - Menzel, Annette T1 - Climate effects on vertical forest phenology of Fagus sylvatica L., sensed by Sentinel-2, time lapse camera, and visual ground observations JF - Remote Sensing N2 - Contemporary climate change leads to earlier spring phenological events in Europe. In forests, in which overstory strongly regulates the microclimate beneath, it is not clear if further change equally shifts the timing of leaf unfolding for the over- and understory of main deciduous forest species, such as Fagus sylvatica L. (European beech). Furthermore, it is not known yet how this vertical phenological (mis)match — the phenological difference between overstory and understory — affects the remotely sensed satellite signal. To investigate this, we disentangled the start of season (SOS) of overstory F.sylvatica foliage from understory F. sylvatica foliage in forests, within nine quadrants of 5.8 × 5.8 km, stratified over a temperature gradient of 2.5 °C in Bavaria, southeast Germany, in the spring seasons of 2019 and 2020 using time lapse cameras and visual ground observations. We explained SOS dates and vertical phenological (mis)match by canopy temperature and compared these to Sentinel-2 derived SOS in response to canopy temperature. We found that overstory SOS advanced with higher mean April canopy temperature (visual ground observations: −2.86 days per °C; cameras: −2.57 days per °C). However, understory SOS was not significantly affected by canopy temperature. This led to an increase of vertical phenological mismatch with increased canopy temperature (visual ground observations: +3.90 days per °C; cameras: +2.52 days per °C). These results matched Sentinel-2-derived SOS responses, as pixels of higher canopy height advanced more by increased canopy temperature than pixels of lower canopy height. The results may indicate that, with further climate change, spring phenology of F. sylvatica overstory will advance more than F. sylvatica understory, leading to increased vertical phenological mismatch in temperate deciduous forests. This may have major ecological effects, but also methodological consequences for the field of remote sensing, as what the signal senses highly depends on the pixel mean canopy height and the vertical (mis)match. KW - overstory KW - understory KW - Sentinel-2 KW - time lapse cameras KW - vertical mismatch KW - phenological escape KW - climate change KW - European beech Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248419 SN - 2072-4292 VL - 13 IS - 19 ER - TY - THES A1 - Ulrich, Tanja T1 - Function of Lin9 in vivo and MAP3K4-p38 signaling regulates p53 mediated cell cycle arrest after defective mitosis T1 - Funktion von Lin9 in vivo und MAP3K4-p38 Signalweg reguliert einen p53-vermittelten Zellzyklus-Arrest nach fehlerhafte Mitose N2 - Eine genaue Kontrolle des Verlaufs durch die Mitose ist entscheidend für die Gewährleistung genomischer Stabilität und für die Vermeidung von Aneuploidy. Der DREAM Komplex ist ein wichtiger Regulator der Expression von mitotischen Genen. Die Depletion der DREAM-Untereinheit Lin9, führt zu einer verminderten Expression von G2/M Genen und beeinträchtigt die Proliferation. In konditionellen knockout Mauszellen (MEFs) verursacht das Ausschalten von Lin9 Defekte in Mitose und Zytokinese und löst vorzeitige Seneszenz aus, um eine weitere Zellproliferation zu verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der seneszente Phänotyp in Lin9 knockout MEFs unabhängig von den beiden Tumorsuppressor-Signalwegen p53-p21 und p16-pRB induziert wird. Untersuchungen mit dem konditionellen Lin9 knockout Mausmodell verdeutlichten die wichtige Funktion von Lin9 in der Regulierung der mitotischen Genexpression und der Proliferation in vivo. Das Fehlen von Lin9 führte zu einer verringerten Proliferation in den Krypten des Dünndarms und verursachte eine Atrophie des Darmepithels und einen schnell eintretenden Tod der Tiere. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Signalwege untersucht, die nach fehlerhafter Zytokinese zu einem p53 vermittelten G1-Arrest führen. Hierfür wurde ein chemischer Inhibitor der mitotischen Kinase Aurora B verwendet. Mit Hilfe eines Hochdurchsatz siRNA Screens wurde die MAP Kinase MAP3K4 als Aktivator des p53 Signalwegs identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass MAP3K4 die Stresskinase p38b aktiviert, um den p53 vermittelten Zellzyklusarrest in tetraploiden Zellen auszulösen. Dabei wurde p38b nach Hemmung von Aurora B für die transkriptionelle Aktivierung des p53 Zielgens p21 benötigt. Im Gegenteil dazu erfolgte die Phosphorylierung, Stabilisierung und die Rekrutierung von p53 an den p21 Promoter unabhängig von p38. Die teilweise Hemmung von Aurora B zeigte, dass fehlerhafte Segregation von Chromosomen auch den MAP3K4-p38-p53 Signalweg aktiviert und lässt darauf schließen, dass subtile Defekte in der Mitose ausreichen diesen Stress-Signalweg zu induzieren. Obwohl p38 für den G1 Zellzyklusarrest nach mitotischen Schäden erforderlich war, führte die gleichzeitige Inhibierung von p38 und Aurora B über einen längeren Zeitraum zu einer verringerten Proliferation, vermutlich aufgrund verstärkter Apoptose. Es ist anzunehmen, dass der MAP3K4-p38-p53 Signalweg generell nach Defekten in der Mitose oder Zytokinese aktiviert wird um Zellen in G1 zu arretieren und um chromosomale Instabilität zu vermeiden. N2 - Precise control of progression through mitosis is essential to maintain genomic stability and to prevent aneuploidy. The DREAM complex is an important regulator of mitotic gene expression. Depletion of Lin9, one core-subunit of DREAM, leads to reduced expression of G2/M genes and impaired proliferation. In conditional mouse knockout cells (MEFs) Lin9 deletion causes defects in mitosis and cytokinesis and cells undergo premature senescence in order to prevent further proliferation. In this work it could be shown that the senescence phenotype in Lin9 knockout MEFs is independently mediated by the two tumor suppressor pathways p53-p21 and p16-pRB. Studies using the conditional Lin9 knockout mouse model demonstrated an important function of Lin9 in the regulation of mitotic gene expression and proliferation in vivo. Deletion of Lin9 caused reduced proliferation in the intestinal crypts resulting in atrophy of the intestinal epithelium and in rapid death of the animals. In the second part of this work, the pathways leading to p53 mediated G1 arrest after failed cytokinesis were analyzed by using a chemical inhibitor of the mitotic kinase Aurora B. In a high throughput siRNA screen the MAP kinase MAP3K4 was identified as an upstream activator of p53. It could be shown that MAP3K4 activates the downstream stress kinase p38b to induce the p53 mediated cell cycle arrest of tetraploid cells. p38b was required for the transcriptional activation of the p53 target gene p21 in response to Aurora B inhibition. In contrast, phosphorylation, stabilization and recruitment of p53 to the p21 promoter occured independently of p38 signaling. Partial inhibition of Aurora B demonstrated that chromosome missegregation also activates the MAP3K4-p38-p53 pathway, suggesting that subtle defects in mitosis are sufficient for inducing this stress signaling pathway. Although p38 was required for the G1 cell cycle arrest after mitotic failures, long-term co-inhibition of p38 and Aurora B resulted in reduced proliferation probably due to increased apoptosis. Presumably, MAP3K4-p38-p53 signaling is a common pathway that is activated after errors in mitosis or cytokinesis to arrest cells in G1 and to prevent chromosomal instability. KW - Mitose KW - MAP-Kinase KW - Protein p53 KW - Aneuploidie KW - Lin9 KW - defective Mitosis KW - MAP3K4 KW - p53 KW - aneuploidy KW - fehlerhafte Mitose Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73975 ER - TY - THES A1 - Ullrich, Melanie T1 - Identification of SPRED2 as a Novel Regulator of Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis Activity and of Body Homeostasis T1 - SPRED2 - Ein neuer Regulator der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrindenachse und der Hormonbalance N2 - SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype. The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1. Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage. Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis. To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress. N2 - SPRED-Proteine sind Inhibitoren des hochkonservierten und in allen Geweben verbreiteten Ras/ERK/MAPK-Signalwegs, welcher Proliferation, Differenzierung und das Wachstum von Zellen reguliert. Um physiologische Konsequenzen der SPRED2-Defizienz im lebenden Modellorganismus aufzuklären, haben wir SPRED2-KO-Mäuse mithilfe der „gene trap“-Methode generiert. Eine erste Studie zur phänotypischen Charakterisierung mit KO-Mäusen bis zu einem Alter von fünf Monaten identifizierte SPRED2 als Regulator der Chondrozytendifferenzierung und des Knochenwachstums. So bewirkt der Verlust der SPRED2-Proteinfunktion eine erhöhte FGFR-vermittelte ERK-Aktivität, was wiederum einen Hypochondroplasie-ähnlichen Minderwuchs verursacht. Allerdings offenbarten Langzeitbeobachtungen älterer KO-Mäuse einen im Allgemeinen sehr schlechten Gesundheitszustand und weitere facettenreiche Symptome, darunter exzessives Putzverhalten mit schweren, selbst zugefügten Wunden, einen abnorm hohen täglichen Wasserkonsum, klare morphologische Anzeichen einer Nierenschädigung und eine reduzierte Überlebenswahrscheinlichkeit durch plötzlichen Tod. Ziel dieser Studie war es, basierend auf unseren Beobachtungen, einen Auslöser für diesen komplexen und vielseitigen Phänotyp zu finden. Die beobachtete Nierendegeneration in unseren SPRED2-KO-Mäusen war auf eine Hydronephrose zurückzuführen, welche durch schwere Atrophie des Nierengewebes und Apoptose von Nierentubuluszellen gekennzeichnet war. Aufgrund des Nierenschadens haben wir Trinkverhalten und gängige Serumparameter analysiert. Trotz der Polydipsie, die sich durch eine nahezu verdoppelte tägliche Wasseraufnahme manifestierte, konnten signifikant erhöhte Na+- und Cl--Werte und die daraus resultierende Hyperosmolalität im Serum der SPRED2-KOs nicht kompensiert werden. Weil Salz- und Wasserhaushalt zum größten Teil unter der hormonellen Kontrolle von Aldosteron und ADH stehen, haben wir beide Hormonspiegel untersucht. Während die ADH-Werte im Serum von WT- und KO-Mäusen vergleichbar waren, insbesondere nach experimentellem Wasserentzug und einem extremen Verlust von Körperflüssigkeit, waren die Serumspiegel von Aldosteron in den SPRED2-KO-Mäusen verdoppelt. Die systematische Untersuchung übergeordneter regulatorischer Hormonachsen ergab, dass sich der Hyperaldosteronismus unabhängig von einer erhöhten Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems entwickelte, da die Serum-Ang II-Spiegel in den SPRED2-KOs etwa um die Hälfte reduziert waren. Die Expression der Aldosteronsynthase in der Nebenniere war jedoch wesentlich erhöht. Für Kortikosteron, das wie Aldosteron von der Nebennierenrinde freigesetzt wird, konnten wir ebenfalls mehr als doppelt so hohe Werte im Serum der KO-Tiere detektieren. Die Aldosteron-Produktion steht, ähnlich wie bei Kortikosteron, zumindest teilweise unter der Kontrolle des hypophysären Hormons ACTH, dessen Sekretion wiederum übergeordnet durch die Freisetzung von CRH aus dem Hypothalamus geregelt wird. Tatsächlich war die Stresshormon-Sekretion entlang dieser gesamten Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse erhöht, da Serum-ACTH, das mittlere, hypophysäre Hormon, und hypothalamisches CRH, der übergeordnete hormonelle Induktor der HPA-Achse, in den SPRED2-KOs auch um 30% erhöht waren. Zusätzlich waren die ERK-Aktivität ebenso wie die CRH-mRNA-Spiegel im paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus in unseren SPRED2-KO-Mäusen deutlich höher. In vitro Studien mit der Hypothalamus-Zelllinie mHypoE-44 zeigten weiterhin, dass sowohl SPRED1 als auch SPRED2 die Aktivität des CRH-Promotors, die CRH-Sekretion und die Ets-Faktor-abhängige CRH-Transkription reduzieren können. Passend dazu enthält die CRH-Promotorregion zahlreiche verschiedene Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren der Ets-Familie, speziell für Ets1. Somit zeigt diese Studie zum ersten Mal, dass die durch SPRED2-vermittelte Hemmung der Ras/ERK/MAPK-Signalkaskade mittels Unterdrückung der ERK-Aktivität zu einer Herunterregulation der Ets1-Faktor-abhängigen Transkription führt, was eine Hemmung der CRH-Promotoraktivität, der CRH-Transkription und der CRH-Freisetzung aus dem Hypothalamus zur Folge hat. Die daraus resultierende Hyperaktivität der gesamten HPA-Achse in unseren SPRED2-KO-Mäusen spiegelt eine erhöhte endogene Stress-Reaktion wider und äußert sich durch übermäßiges Putzverhalten und durch selbst zugefügte Hautläsionen auf der einen Seite; auf der anderen Seite erklärt dies, in Kombination mit der erhöhten Aldosteronsynthase-Expression, den Hyperaldosteronismus und das damit verbundene Ungleichgewicht in Salz- und Wasserhaushalt. Weiterhin tragen sowohl Hyperaldosteronismus als auch Polydipsie sehr wahrscheinlich zu den beobachteten Nierenschädigungen bei. Zusammengefasst ist diese Studie ein erster Hinweis, dass SPRED2 wesentlich an der adäquaten Regulation der HPA-Achsen-Aktivität beteiligt ist und essentiell ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper. Um die Folgen von SPRED2-Defizienz in Mäusen und vor allem im Menschen weiter aufzuklären und zu vergleichen, erforschen wir in zwei Folgeprojekten die Funktion von SPRED2 speziell im Gehirn und im Herzen und führen parallel ein genetisches Screening zur Identifikation von funktionellen SPRED2-Mutationen im Menschen durch. KW - Renin-Angiotensin-System KW - Spred-Proteine KW - MAP-Kinase KW - Hypophysen-Zwischenhirn-System KW - Knockout KW - SPRED2 KW - ERK KW - MAP Kinase Signaling KW - HPA Axis KW - Renin Angiotensin System KW - Knockout mouse KW - Spred Protein KW - Hypothalamisch-hypophysäre Achse KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System KW - MAP-Kinase KW - Gen-Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107355 ER - TY - THES A1 - Ulbrich, Jannes T1 - Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen T1 - The integration and biochemical characterization of ectopic BMP receptors in cell membranes N2 - BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt. N2 - BMPs elicit their cellular functions via recruitment and activation of specific receptor serin/threonine receptor kinases. The precise mechanisms leading to receptor activation and the composition of a functional signal transducing complex on the cell surface has been investigated intensively over the last decades. The dimeric nature of all BMPs, the promiscuity of both, the ligands and the receptors and the different receptor conformations on the cell surface (PFC, BISC) hamper the experimental accessibility of this protein family. To study the membrane anchorage's influence of the receptors on their affinity towards single ligands, different methods were evaluated that enabled us to couple the receptor ectodomains in a quantitative manner to plasma membranes. The BMP receptor ectodomains were, among other techniques, lipidated in a lysine specific way or coupled as hexahistidine fusion proteins to membrane integrated chelating lipids. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Transforming Growth Factor KW - Transforming Growth Factor beta KW - BMPs KW - BMP Rezeptoren KW - Proteinmodifikationen KW - Protein Lipidierungen KW - NTA Lipide KW - BMP KW - BMP receptos KW - protein modifications KW - protein lipidations KW - NTA lipids Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462 ER -