TY - THES A1 - Salzmann, Steffen T1 - Regulation der TNF-Rezeptor Signaltransduktion durch das Zytokin TWEAK T1 - Regulation of the TNF-receptor signaltransduction through the cytokine TWEAK N2 - Das pleiotrope Zytokin TNF (tumor necrosis factor) kann an den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) und den TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) binden und mit deren Hilfe seine biologischen Funktionen über verschiedene Signalwege, wie z.B. NFB- und MAPK-Aktivierung bzw. Apop¬toseinduktion, vermitteln. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des TNFR2 zur proteasomalen Degradation des Adaterproteins TRAF2 führt und dadurch die TNFR1-induzierte Apoptose verstärkt wird. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), das ebenfalls der TNF-Ligandenfamilie angehört und die Interaktion mit dessen Rezeptor Fn14 (fibroblast growth factor-inducible 14), der wie der TNFR2 zur Untergruppe der TRAF-bindenden Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie gehört, zeigten in verschiedenen Arbeiten auch eine TRAF2-degradierende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dies auch im Falle des TWEAK/Fn14-Systems mit einem verstärkenden Effekt auf die TNFR1-vermittelte Apoptose einhergeht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TWEAK zusätzlich auch die TNFR1-induzierte Nekrose verstärkt, die den Zelltod durch andere Mechanismen als bei der Apoptose induziert. Von anderen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass lösliches TWEAK (sTWEAK) und membranständiges TWEAK (mTWEAK) bezüglich der TRAF2-Depletion wirkungs¬gleich sind. Da der apoptotische Fn14-TNFR1-„crosstalk“ auf der Depletion von TRAF2-Komplexen beruht wurden auch keine signifikanten Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK in Bezug auf die Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose beobachtet. Interessanter¬weise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit jedoch, dass sTWEAK den klassischen NFB-Signalweg gar nicht bzw. nur schwach aktiviert, wohingegen mTWEAK diesen stark induziert. Bei der Aktivierung des alternativen NFB-Signalweges hingegen ließen sich keine Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK erkennen. Die Aktivierung eines Signalweges wird also durch die Oligomerisierung des Liganden nicht moduliert, demgegenüber aber erwies sich die Aktivierung eines anderen Signalweges als stark abhängig von der Liganden-Oligomerisierung. Vor dem Hintergrund, dass das Adapterprotein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) Heterotrimere mit TRAF2 bildet, wurde weiterhin untersucht, ob dieses Molekül einen Einfluss auf die Aktivität der TWEAK-induzierten Signalwege hat. Tatsächlich zeigte sich in TRAF1-exprimie¬renden Zellen eine Verstärkung der TWEAK-induzierten Aktivierung des klassischen NFB-Signalweges Zukünftige Studien müssen nun aufklären, inwieweit die hier gefundenen Mecha-nismen das Zusammenspiel von TNF und TWEAK in vivo bestimmen. N2 - The pleiotropic cytokine TNF (tumor necrosis factor) binds to two receptors, TNF-receptor 1 (TNFR1) and TNF-receptor 2 (TNFR2). TNF elicits its biological functions through different signaling pathways, e.g. NFB- and MAPK-activation and induction of apoptosis. Previous studies revealed that activation of TNFR2 leads to protea¬somal degradation of the adaptor protein TRAF2 and enhanced TNFR1-induced apoptosis. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), a member of the TNF-ligand family and Fn14 which belongs like TNFR2 to the TRAF-binding subgroup of the TNF-receptor family, showed also a TRAF2-degrading effect. In the present thesis it is shown that this is also associated with an enhancement of TNFR1-mediated apoptosis. Furthermore, it was shown that TWEAK also amplifies TNFR1-induced necrosis, a form of cell death that is induced independently and by different mechanisms than apoptosis. In earlier studies in our group it was found that soluble TWEAK (sTWEAK) and membrane bound TWEAK (mTWEAK) have the same TRAF2-depleting effect. Because the apoptotic crosstalk of Fn14 and TNFR1 bases on the depletion of TRAF2-containing complexes, there were no significant differences observed between sTWEAK and mTWEAK concerning the enhancement of TNFR1-induced apoptosis. Interestingly, it was shown in this thesis that sTWEAK can activate the classical NFB pathway not or just weak, whereas mTWEAK can do this very efficiently. However there were no differences between sTWEAK and mTWEAK in the activa¬tion of the alternative NFB pathway. Thus the activation of one type of signaling pathway is therefore not modulated through ligand oligomerisation, but in contrast the activation of another pathway turned out to be strongly dependent of ligand oligomerisation. It is known that the adaptor protein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) builds heterotrimers with TRAF2. It was furthermore investiga-ted, whether this molecule has an influence on the activity of TWEAK-induced pathways. Actually there was increased activity in TWEAK-mediated classical NFB signaling observed in TRAF1-expressing cells. Further studies have to clarify to which extend the here found mechanisms affect the TNF-TWEAK interplay in vivo. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - TNF KW - TWEAK Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52525 ER - TY - THES A1 - Deuchert, Thomas T1 - Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase T1 - Development of a experimental system for the investigation of the subcellular localisation of alpha-methylacyl-CoA racemase N2 - Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellulärenLokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase (AMACR) (Methode der retroviralen Transfektion von transformierten, embryonalen Mausfibroblasten) N2 - Development of a experimental system for the investigation of the subcellular localisation of alpha-methylacyl-CoA racemase (amacr) (retroviral transfection of mouse fibroblasts) KW - Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase KW - Peroxisom KW - AMACR KW - Racemase KW - Transfektion KW - localisation KW - amacr KW - racemase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46495 ER - TY - THES A1 - Gruber, Franz Andreas T1 - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster T1 - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden. N2 - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference. KW - Taufliege KW - Futterentzug KW - Klassische Konditionierung KW - Konditionierung KW - Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Osmolarität KW - Drosophila melanogaster KW - zuckerkonditioniertes Verhalten KW - klassische Konditionierung KW - Futterentzug KW - Drosophila melanogaster KW - sugar-conditioned behaviour KW - classical conditioning KW - food deprivation KW - starvation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802 ER - TY - THES A1 - Derrer, Bianca T1 - Charakterisierung der Vitamin B6 Synthese und des Shikimatsyntheseweges im Malariaerreger Plasmodium ssp. T1 - Characterisation of vitamin B6 synthesis and shikimate pathway in the malaria causing agents Plasmodium ssp. N2 - Malaria ist eine schwerwiegende Krankheit, die jährlich über eine Million Menschen tötet. Die zunehmende Resistenzbildung gegenüber den verwendeten Medikamenten macht die Entwicklung neuer Antimalariamittel dringend notwendig. Daher sind die Vitamin B6 Synthese und der Shikimatweg von besonderem Interesse, da diese beiden Synthesewege nur im Parasiten und nicht im Menschen vorkommen. Unter der Voraussetzung, dass diese essentiell für den Parasiten sind, böten sie ideale Ansatzpunkte zur Entwicklung neuer Antimalariamittel. Voraus gegangene Studien haben gezeigt, dass Plasmodium falciparum in der Lage ist, PLP de novo mittels eines bifunktionalen Enzymkomplex, bestehend aus den Proteinen Pdx1 und Pdx2, zu synthetisieren. Pdx1 stellt dabei die eigentliche Synthase dar, während Pdx2 als Glutaminase-Partner das benötigte Ammoniumion für den heterocyclen Ring bereitstellt. Zusätzlich dazu verfügt der Parasit auch über einen salvage pathway um PLP zu „recyclen“, in dem der Pyridoxalkinase PdxK eine Schlüsselfunktion zufällt. Knockout Studien der pdx1 im Mausmalariasystem P. berghei haben gezeigt, dass PbPdx1 für eine optimale Entwicklung der Blutstadien benötigt wird, nicht jedoch für deren Überleben. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Effekte eines pbpdxK(-) Knockouts in demselben System untersucht. Es konnte eine monoklonale Knockoutlinie generiert werden, was zeigte, dass PbPdxK nicht essentiell für das Überleben des Parasiten in den Blutstadien ist. Die Entwicklung während des Blutstadiums war von dem pbpdxK(-) Knockout nicht betroffen. Allerdings zeigte sich im Moskitostadium eine drastische Reduktion der Sporozoitenzahl sowohl in den Mitteldärmen als auch in den Speicheldrüsen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass PbPdxK essentiell für das Überleben der Sporozoiten ist. Daneben wurde versucht, die Gene pfpdx1, pfpdx2 sowie pfpdxK in P. falciparum 3D7 durch Verwendung der single cross over Strategie auszuschalten. Es konnte jedoch für keines der genannten Konstrukte eine Integration in die jeweiligen Genloci anhand von PCR-Analysen nachgewiesen werden. Ebenso scheiterte der Versuch, durch Rekombination eines komplementären Genabschnitts die Funktion des Gens zu rekonstituieren. Daher bleibt es unklar, ob pfpdx1, pfpdx2 und pfpdxK durch Knockout Strategien auszuschalten sind oder nur für Genmanipulationen nicht zugänglich sind. Die Kultivierung von P. falciparum 3D7 Parasiten in Vitamin B6 depletiertem Medium hatte keinen Effekt auf deren Wachstum. Eine anschließende Analyse der Proteinextrakte zeigte eine erhöhte Expression der PfPdxK, während sich das Expressionslevel der PfPdx1 nicht veränderte. Es scheint, dass der Parasit in der Lage ist Vitamin B6 Mangel durch vermehrte Nutzung des salvage pathways vollständig zu kompensieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass der C-Terminus der Pdx1 in die Aktivität des PLP Synthasekomplexes involviert ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten der PfPdx1 konstruiert und dabei bis zu 30 Aminosäuren entfernt. Diese Analysen ergaben, dass der C-Terminus vier verschiedene Funktionen besitzt: das Assembly der Pdx1 Untereinheiten zum Dodekamer, die Bindung des Pentosesubstrats Ribose 5-Phosphat, die Bildung des Intermediats I320 und schließlich die PLP Synthese. Diese unterschiedlichen Funktionen wurden durch verschiedene Deletionsvarianten identifiziert. Darüber hinaus waren alle Deletionsvarianten in der Lage, die Glutaminase Pdx2 zu aktivieren, was zeigt, dass das Dodekamer nicht Vorraussetzung für die Glutaminaseaktivität ist. Aufgrund der geringen PLP Syntheseaktivität in vitro wurde vermutet, dass der PfPdx1/PfPdx2 Komplex durch einen zusätzlichen Faktor aktiviert wird. Daher wurde versucht, mittels Yeast 2-Hybrid, basierend auf einer PCR-amplifizierten P. falciparum 3D7 cDNA-Bibliothek als bait und PfPdx1 als prey, einen Interaktionspartner zu identifizieren. Mehrere Klone wurden gewonnen, die alle einen Bereich des Mal13P1.540, einem putativen Hsp70 Proteins, enthielten. Jedoch scheiterten alle Versuche, die Protein-Protein-Interaktion mit rekombinant exprimierten Protein zu bestätigen. Ebenso war es nicht möglich, das vollständige Mal13P1.540 rekombinant zu exprimieren sowie dessen Lokalisation in vivo zu bestimmen. Daher bleibt die Interaktion von PfPdx1 und Mal13P1.540 ungeklärt. Neben der Vitamin B6 Biosynthese konnten auch einige Gene des Shikimatweges in Plasmodium identifiziert werden. In P. berghei konnten der C-terminale Teil der 3-Dehydroquinatsynthase (2) sowie die Shikimatkinase (5) und die 5-Enoylpyruvylshikimat 3-Phosphatsynthase (6) in einem open reading frame (ORF) identifiziert werden, der dieselbe genetische Organisation aufweisen wie der Arom-Komplex der Hefen. Mit Hilfe eines Komplementationsassay wurde die Funktionalität dieses ORFs überprüft. Dazu wurden S. cerevisiae BY4741Δaro1, ein Hefestamm ohne funktionalen Arom-Komplex, mit dem Pb2_6_5_ABC Fragment transformiert. Die so transformierten Hefen waren nicht in der Lage, auf Mangelplatten ohne aromatische Aminosäuren zu wachsen, was zeigte, dass das Pb2_6_5_ABC Konstrukt den BY4741Δaro1 Phänotyp nicht komplementieren konnte. Der Versuch, mit Hilfe des Baculovirussytems rekombiant exprimiertes Protein zu erhalten, verlief erfolglos. Ebenso war es nicht möglich, Teile des Proteins für Immunisierungen zu exprimieren. Daher bleibt die Funktionalität des Pb2_6_5_ABC Konstruktes ungeklärt. N2 - Malaria is a serious burden of mankind causing over one million deaths a year. In view of the raising number of resistances to common drugs there is an urgent need for the development of new antimalarial drugs. In this respect, the vitamin B6 biosynthesis and the shikimate pathway are of particular interest, since these synthesis pathways are only present in the malarial parasites and not in their human host. Given their essentiality for the parasite, they would represent ideal targets for antimalarial drug development. Previous studies revealed that Plasmodium falciparum is able to produce PLP de novo through a bifunctional enzyme complex composed of the proteins Pdx1 and Pdx2, of which Pdx1 is the actual synthase and Pdx2 the glutaminase partner providing the nitrogen for the ring system. In addition, the parasites possess a salvage pathway for PLP, of which pyridoxal kinase, PdxK, is a key player. Knockout studies of the pdx1 in the rodent malaria system P. berghei showed, that pbpdx1 is required for the optimal development of parasite blood stages but is not essential for parasite survival. Here, I investigated the effect of a pbpdxK(-) knockout in the same system. A monoclonal knockout strain was obtained, indicating that PbPdxK is not essential for the survival of the parasite. Blood stages were not affected by the knockout. However, in the mosquito stages pbpdxK(-) showed a tremendous reduction of sporozoites numbers in the midgut and in the salivary glands, indicating that PbPdxK is essential for the survival of sporozoites. It was then also tried to knockout pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK in the P. falciparum 3D7 strain by using the single cross over strategy. However, no integration of the constructs in the corresponding gene locus could be detected by a PCR approach. Also an approach to complement the loss of endogenous gene function by generating a functional gene copy upon recombination failed. Thus, it remains unclear if pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK can be knocked out or are inaccessible for gene targeting in P. falciparum. Cultivation of P. falciparum 3D7 parasites in medium deficient of vitamin B6 showed no effect on the growth rate of the parasites. Analysis of protein extracts of these parasites revealed an upregulation of PfPdxK expression, whereas the level of PfPdx1 remained stable. Thus it seems that the parasite is fully able to compensate vitamin B6 malnutrition by the increased usage of the salvage pathway. Previous studies on the activity of the PLP synthase complex indicated that the C-terminal end of Pdx1 is involved in PLP formation. Therefore several C-terminal deletion mutants of PfPdx1 were constructed, removing up to 30 amino acids. These analyses revealed that the C-terminus has four distinct functionalities: assembly of the Pdx1 monomers, binding of the pentose substrate (ribose 5-phosphate), formation of the reaction intermediate I320, and finally PLP synthesis. Deletions of distinct C-terminal regions distinguish between these individual functions. All variants were able to activate the glutaminase PfPdx2, indicating that the dodecameric structure is not a prerequisite for Pdx2 activation. Due to the low PLP synthase activity in vitro it was assumed that the PfPdx1/PfPdx2 complex maybe activated by an additional protein. Hence a yeast 2-hybrid assay was performed, using PfPdx1 as prey and a PCR-amplified cDNA-library of P. falciparum 3D7 as bait. Several clones were detected on high stringency plates, containing all a region of Mal13P1.540, a putative Hsp70 protein. Trials to confirm protein-protein interaction with recombinantly produced proteins failed as well as protein expression of full length Mal13P1.540. It was also not possible to determine the localisation of Mal13P1.540 in vivo. Thus, an interaction of PfPdx1 with Mal13P1.540 could so far not be verified. Besides the vitamin B6 biosynthesis, some genes of the shikimate pathway were identified in Plasmodium. In P. berghei, the C-terminal part of the dehydroquinatesynthase (2) as well as the shikimate kinase (5) and 5-enoylpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase (6) were found in a single open reading frame having the same organisation as the arom-complex of yeast. To proof the functionality of these genes a complementation assay with S. cerevisiae BY4741Δaro1 with the Pb2_6_5_ABC construct, comprising the above mentioned genes, was performed. However, transformded yeast strains were not able to grow on minimal media without aromatic amino acids, indicating that they were not able to produce chorismate. Recombinant expression of this constructs in the baculovirussystem did not yield any detectable protein. Expression of parts of this protein for immunisation was also not successful. Hence, the functionality of this protein remains to be established. KW - Plasmodium falciparum KW - Shikimisäure KW - Vitamin B6 KW - Biosynthese KW - Shikimatsynthese KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria KW - vitamin B6 synthesis KW - shikimate pathway KW - malaria Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51456 ER - TY - THES A1 - Jauch, Mandy T1 - Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen T1 - The serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) of Drosophila melanogaster and its role in the formation of active zones of synapses N2 - Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf. N2 - Synapses as sites of communication between neurons contain specialized regions termed active zones (AZs) which are composed of a highly complex network of proteins comprising the exocytotic machinery for neurotransmitter release and vesicle recycling. In Drosophila the Bruchpilot (BRP) protein is an important building block of the T-shaped ribbons („T-bars“) at presynaptic active zones. By screening for mutations affecting the tissue distribution of Bruchpilot, a P-transposon insertion in the Srpk gene at the position 79D has been identified (Srpk79D, CG11489). This gene codes for a kinase which shows high homology to the mammalian family of serine/arginine protein kinases (SRPKs). Members of this family have an evolutionarily highly conserved bipartite kinase domain in common which is separated by a non-conserved spacer sequence. SRPKs phosphorylate SR proteins, an evolutionarily highly conserved family of serine/arginine-rich splicing factors that control the processes of constitutive and alternative splicing. Mutation of the Srpk79D gene caused by the P-element insertion (Srpk79DP1) or by a deletion in the gene (Srpk79DVN null mutant) leads to conspicuous accumulations of BRP in larval and adult axons. This thesis shows that these BRP accumulations at the ultrastructural level correspond to extensive axonal agglomerates of electron-dense ribbons surrounded by clear vesicles. Using immuno electron microscopy, these accumulation were characterized as BRP immuno-reactive structures. To prevent the assembly of BRP containing agglomerates in axons and to maintain intact brain function the SRPK79D seems to be expressed only at low levels because the endogenous kinase was not detectable using various antibodies. It was shown in other thesis that the expression of the PB, PC or PF isoform of the four possible SRPK79D variants resulting from two alternative transcription start sites in exon one and three, respectively, and alternative splicing of exon seven is sufficient to rescue the phenotype of BRP accumulation in the Srpk79DVN null-mutant background. Cloning of the cDNA for the SRPK79D-PE isoform into a UAS vector has been started in order to characterize the ability of this isoform to rescue the BRP-phenotype. It seems as if the formation of axonal BRP agglomerates is not due to BRP overexpression in the affected neurons as was shown by reduced expression of the BRP protein in the Srpk79DVN null-mutant background which still leads to BRP agglomerates. The overall amount of Bruchpilot protein in adult heads of the Srpk79DVN null mutant is not clearly altered compared to wild type. No clear alteration was observed between Srpk79DVN null-mutant and wild-type flies comparing the expression of different presynaptic proteins like Synapsin, Synapse-associated protein of 47 kDa (Sap47), and Cysteine string protein (CSP). The experiment does not point towards altered splicing of the corresponding pre-mRNAs. Each of the seven known SR proteins of Drosophila is a potential target protein of the SRPK79D. Pan-neuronal knock-down experiments for the three SR proteins SC35, X16/9G8, and B52/SRp55 investigated in this thesis by RNA interference did not show an effect on the tissue distribution of BRP. It was shown that the Srpk79DVN null mutation has no additive effect on the knock-down of the BRP protein regarding the flight ability of the respective animals because the double mutants showed similar values of non-flyers as each of the single mutants with either null mutation of the Srpk79D gene or knock-down of BRP. Presumably, Bruchpilot and the SR protein kinase 79D are part of the same signaling pathway. Performing double fluorescence stainings with antibodies against BRP and the CAPA peptides it was shown that Bruchpilot is also present in the median and transverse nerve system (MeN/TVN) of Drosophila containing the neurohaemal organs. These organs are responsible for storage and release of neuropeptide hormones. In contrast to the larval segmental and intersegmental nerves of the Srpk79DVN null mutant which show characteristic BRP agglomerates, mutation of the Srpk79D gene does not affect the distribution of BRP in the axons of the Va neurons which form the MeN/TVN system. The staining pattern of BRP in these nerves does not show clear alterations in the Srpk79DVN null mutant compared to wild type. The finding that BRP is present in the median and transverse nerve system opens the field for speculation of a role for the Bruchpilot protein not only in the neurotransmitter exocytosis but also in the release of neuropeptides. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - Synapse KW - Genexpression KW - Aktive Zone KW - Serin/Arginin Proteinkinase KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Drosophila KW - Synapse KW - Motorische Endplatte KW - Nervenzelle KW - Neurotransmitter KW - active zone KW - serine/arginine protein kinase KW - SRPK KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974 ER - TY - THES A1 - Müller, Judith T1 - Die Rolle der HectH9/Mcl1-Interaktion in der Myc-induzierten Apoptose und Auswirkungen der Myc V394D-Mutation auf die von c-Myc gesteuerten Tumorgenese in einem transgenen Mausmodell T1 - Role of the HectH9/Mcl1 interaction in Myc-induced apoptosis and Impact of the Myc V394D mutation in c-Myc-driven murine lymphomagenesis N2 - Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist. N2 - Apoptosis and senescence are two distinct mechanisms that are induced by oncogenes to limit their oncogenic potential during tumorigenesis. Their appearance seems to be dependent on the specific oncogene. For a long time it is known that the oncogene Myc is a strong inducer of apoptosis. Latest results revealed, that Myc is also able to induce senescence, to prevent transformed cells from proliferating. Within the framework of my PhD I concentrated on both tumor suppressive mechanisms in two independent particular projects. Increased expression and activity of Myc enhances cell proliferation and thereby induces DNA double strand breaks. This damage activates a DNA damage response which leads to Atm/Atr mediated phosphorylation of H2A.X. A further target of the kinases Atm and Atr is HectH9 which ubiquitinates the mitochondrial protein Mcl1 in a DNA damage dependent manner. The ubiquitination of Mcl1 labels this protein for proteasomal degradation. In unstressed cells Mcl1 is located in the mitochondrial membrane where it interacts with proapoptotic members of the Bcl2 family inhibiting their activity. The reduction of Mcl1 protein is essential for the activation of proapoptotic proteins at the mitochondrium allowing release of cytochrome c as initial step in apoptosis. Myc mediated tumorigenesis is limited by using a mutant form of Myc as driving oncogene. This mutation inhibits interaction of Myc to its binding partner Miz1. The interaction of Myc and Miz1 is required to repress target genes like p21Cip1 and p15Ink4b. In vivo experiments demonstrate that Myc and Miz1 need to bind to each other to bypass TGFbeta-dependent senescence. This process is dependent on elevated levels of Myc consequently reduction to physiological levels of the protein induces apoptosis and senescence in a TGFbetadependent mannerIn addition, there is evidence that Myc is directly involved in the repression of Tgfbeta. In contrast to established models of repression by the Myc/Miz1 complex, it was shown, that Myc is recruited to and binds target DNA independently of Miz1. Therefore, I suggest that interaction of both proteins is essential only at the step of transcriptional initiation. KW - Myc KW - Apoptosis KW - DNS-Schädigung KW - Transforming Growth Factor beta KW - T-Zell-Lymphom KW - Seneszenz KW - Ubiquitinierung KW - Miz1 KW - p15Ink4b KW - senescence KW - ubiquitination KW - Miz1 KW - p15Ink4b Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55789 ER - TY - THES A1 - Ulbrich, Jannes T1 - Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen T1 - The integration and biochemical characterization of ectopic BMP receptors in cell membranes N2 - BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt. N2 - BMPs elicit their cellular functions via recruitment and activation of specific receptor serin/threonine receptor kinases. The precise mechanisms leading to receptor activation and the composition of a functional signal transducing complex on the cell surface has been investigated intensively over the last decades. The dimeric nature of all BMPs, the promiscuity of both, the ligands and the receptors and the different receptor conformations on the cell surface (PFC, BISC) hamper the experimental accessibility of this protein family. To study the membrane anchorage's influence of the receptors on their affinity towards single ligands, different methods were evaluated that enabled us to couple the receptor ectodomains in a quantitative manner to plasma membranes. The BMP receptor ectodomains were, among other techniques, lipidated in a lysine specific way or coupled as hexahistidine fusion proteins to membrane integrated chelating lipids. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Transforming Growth Factor KW - Transforming Growth Factor beta KW - BMPs KW - BMP Rezeptoren KW - Proteinmodifikationen KW - Protein Lipidierungen KW - NTA Lipide KW - BMP KW - BMP receptos KW - protein modifications KW - protein lipidations KW - NTA lipids Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462 ER - TY - THES A1 - Reiß, Cora T1 - Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilität und Tumorgenese im Mausmodell T1 - Impact of defects of the mismatch repair protein MLH1 (Mut L Homolog 1) on fertility and tumogenesis in mice N2 - Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert. N2 - Mutations in the human DNA mismatch repair (MMR) gene Mlh1 are associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome, HNPCC) and a significant proportion of sporadic colorectal cancer. Furthermore, MMR defects have also been observed in sporadic and hereditary lymphoid malignancies. In cells the inactivation of MLH1 results in the accumulation of somatic mutations in the genome and an increased resistance to the genotoxic effects of a variety of DNA damaging agents. Mice carrying a null allele for the MMR gene Mlh1 show a strong tumor predisposition phenotype. They are preferentially prone to the development of lymphomas of B- and T-cell origin and to a lesser extent gastrointestinal tumors. Additionally Mlh1-/- mice are characterized by a meiotic phenotype leading to male and female sterility. To study the effect of Mlh1 missense mutations on cancer susceptibility, we generated a mouse line carrying the recurrent MLH1G67R mutation that is located in one of the ATP-binding domains of MLH1. Although the MLH1G67R mutation resulted in DNA repair deficiency in homozygous mutant mice, it did not affect the MMR-mediated cellular response to DNA damage, including the apoptotic response of epithelial cells in the intestinal mucosa to cisplatin, which was defective in Mlh1-/- mice but remained normal in Mlh1G67R/G67R mice. Similar to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice displayed a strong cancer predisposition phenotype. However, in contrast to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice developed significantly fewer intestinal tumors, indicating that Mlh1 missense mutations can affect MMR tumor suppressor functions in a tissue-specific manner. In addition, Mlh1G67R/G67R mice were sterile because of the inability of the mutant Mlh1G67R protein to interact with meiotic chromosomes at pachynema, demonstrating that the ATPase activity of MLH1 is essential for fertility in mammals. These studies demonstrate that the Mlh1G67R mutation differentially affects the biological functions associated with MLH1 with distinct phenotypic effects. To study the role of MLH1 for lymphomagenesis in more detail, we generated a new mouse model carrying a conditional Mlh1 allele (Mlh1flox/flox). Mating of these mice with EIIa-Cre recombinase transgenic mice allowed the constitutive inactivation of MLH1 and the resulting Mlh1Δex4/Δex4 mouse line displays complete MMR deficiency and a cancer predisposition phenotype similar to Mlh1-/- mice. For T-cell specific MMR inactivation we combined the Mlh1flox/flox allele with the Lck-Cre Transgene. In the resulting Mlh1TΔex4/TΔex4 mice, MLH1 inactivation is limited to double positive and single positive thymocytes and naïve peripheral Tcells. The development of T-cell lymphomas in Mlh1TΔex4/TΔex4 mice is significantly reduced compared to Mlh1-/- mice implicating that MMR functions either at very early stages during Tcell development or even earlier in lymphoid precursor cells to suppress lymphomagenesis. KW - Colonkrebs KW - Genmutation KW - DNS-Reparatur KW - MLH1 KW - HNPCC KW - Mutation KW - Mausmodell KW - Tumor KW - MLH1 KW - HNPCC KW - mutation KW - mousemodell Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626 ER - TY - THES A1 - Fischer, Matthias T1 - Der Einfluß der Ribosomale S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur T1 - Der Einfluß der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur N2 - In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein. N2 - In this thesis the function of the Ribosomal S6 Kinase 2 (RSK2) on the neuronal level should be investigated. Due to the phenotypes of flies and mice with mutations in the respective gene or of Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) patients there existed only rough speculations. An aim was to make a contribution to the elucidaton of the pathophysiology of the CLS. In this thesis it could be shown by experiments in vivo as well as in vitro in different model systems, that RSK2 has a negative influence on neurite- and synapse growth. In cultivated motoneurons the KO of RSK2 increased the length of axons and the overexpression of a constitutive acitve RSK2-construct reduced axon length. In PC12 cells expression of constitutive active RSK2-constructs reduced neurite-length and expression of a kinase-dead RSK2-construct increased neurite-length. In vivo the size of the neuromuscular synapse of RSK2-KO mice and the bouton number at the Drosophila neuromuscular junction was increased. The RSK2-Protein could be found in mouse motoneurons and, if overexpressed, in boutons at the Drosophila neuromuscular junction. These results show for the first time, which function RSK2 has on the neuronal level. With respect to the mechanism, how RSK2 influences neurite growth, there was evidence, that RSK2 does this by inhibition of the MAPK ERK1/2. The latter has been described in literature before. Arguments for this are the findings, that ERKphosphorylation in mouse motoneurons and in embryonal spinal cord of the RSK2 mouse mutant is increased and that the axon-growth defect can be rescued by inhibition of MEK/ERK. Besides this, ERK-phosphorylation at the neuosmuscular endplate of RSK2-KO mice is increased. Moreover, genetic epistasis experiments in Drosophila show, that RSK inhibits bouton numbers via ERK/RL. So, Drosophila RSK seems to resemble, according to its function, the vertebrate RSK2-isoform. A further important result is the observation, that RSK2 has no effect on survival of motoneurons in the presence of neurotrophic factors. Possibly redundant functions of RSK family members are responsible for this. A so far unexplained finding is the reduced frequency of spontaneous depolarisations with concomitant Ca2+ Influx in cultured RSK2-KO Motoneurons. The amount and density of Ca2+ channels and active zone proteins was not dependent on the presence of the RSK2-Protein in motoneurons. In the hippocampus the RSK2-Protein could be found presynaptically in mossy-fiber boutons in the CA3 region. Moreover, it is localized in pyramidal cells, but not in the pyramidal cell dendrites in the CA3 region. With respect to the impact of these findings on the understanding of the CLS pathology, it is, according to the results of this thesis, probably not caused by reduced survival of neurons, but by disinhibited axon and synapse growth. This may account roughly for peripheral as well as central defects, because synapses in the central nervous system and at the muscle are very similar with respect to the molecular organization for example of vesicles, the active zone or transmitter release. Furthermore, a change in synaptic plasticity for example at the mossy-fiber pyramidal cell synapse in the CA3 region of the hippocampus could lead to the cognitive and mnestic deficits in CLS patients. The finding that activated ERK plays a role in the observed effects can guide the way for new therapeutic strategies. KW - Ribosom KW - Kinasen KW - Axon KW - Wachstum KW - RSK2 KW - Motoneuron Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48341 ER - TY - THES A1 - Hokema, Anna T1 - Beeinflussung der Genexpression verschiedener Gene durch Xmrk in Pigmentzelltumoren bei Oryzias latipes T1 - The effect of Xmrk on the gene expression of various genes in pigment cell tumors in oryzias latipes N2 - Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. N2 - Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Hauttumor KW - Genexpression KW - Real time quantitative PCR KW - Onkogen KW - Xmrk KW - Xmrk Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75616 ER - TY - THES A1 - Philippi, Nicole T1 - Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen T1 - Modeling of signaling pathways in different biological systems N2 - Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten. N2 - Apoptosis of liver cells is dependent on external signals such as components of the extracellular matrix and cell-cell-contacts, which are processed by a variety of numerous nodes of which several are examined here for their system effects. Despite different input interferences and presumably also due to natural selecti- on, the system nevertheless appears to be optimized to adopt a small number of clear and distinguishable states, and the various inputs and crosstalk mechanisms only optimize the best choice between them. For the model described within this work, two nonapoptotic and two apoptotic states are found, although the degree of activation at a node can differ widely until the absolute system state is altered (Philippi et al., BMC Systems Biology, 2009) [1]. The model is still a simplification of the complete cellular network and its different states, and operates independently of detailed kinetic data and parameters for individual nodes. Nevertheless, it allows modeling the readout of apoptosis after FasL stimulation with qualitative agreement and includes crosstalks from collagen/integrin signa- ling, the effect of genetic deletion of Bid and the consequences of viral infection. The second part of this work deals with other applications using this method. Semi-quantitative models are used for hormonal signaling in plants, viral infec- tions and intra-cellular communication. The simulated results fit to the experi- mental data provided. KW - Systembiologie KW - Modellierung KW - Bioinformatik KW - Apoptose KW - Systems Biology KW - Modeling KW - Bioinformatics KW - Apoptosis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690 ER - TY - THES A1 - Heisig, Julia T1 - Identifizierung neuer Zielgene der Hey bHLH Transkriptionsfaktoren T1 - Identification of novel target genes of Hey bHLH transcription factors N2 - Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen. N2 - During embryonic development, the Notch signaling pathway plays a central role in cell fate specification, proliferation and communication between neighboring cells. Hey basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors are targets of the Notch signaling pathway and show crucial functions in cardiovascular development. Hey2 knock out (KO) mice and Hey1/HeyL double knock out mice (DKO) exhibit incomplete formation of the septum and valves in heart development and defects in the differentiation of blood vessels. The aim of this study was to find new target genes of the Hey proteins to further clarify their function during organ development and to get more insight into the phenotypes of the Hey KO mice. Towards this goal, a combination of microarray analysis and chromatin immunoprecipitation (ChIP) was chosen to get an overview of genes directly regulated by Hey proteins in a cell culture model of HEK293 cells overexpressing doxycycline-inducible Flag-tagged Hey1 or Hey2. Microarray analysis revealed approximately 100 target genes that were downregulated up to 5-fold by both Hey1 and Hey2. Interestingly, 15 genes were upregulated more than 2-fold by Hey2. ChIP with αFlag antibody confirmed direct interaction of Hey1 and Hey2 with the proximal promotor regions of 4 downregulated target genes (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Overexpression of mutant Hey1 proteins with deletion of the DNA-binding basic domain or single amino acid exchanges in the basic domain (3 arginine to lysine), failed to downregulate Hey1 target genes. Additionally, ChIP assay demonstrated that the binding of the Hey mutants to the promotor regions of HEY1, BMP2, KLF10 or FOXC1 is abolished, suggesting an essential role for the basic domain in DNA binding and function of the Hey proteins. We then utilized ChIP-PET in conjunction with highthroughput sequencing to perform a genome-wide screen for Hey1 and Hey2 binding sites in HEK293 cells. 1453 and 4288 target genes were identified for Hey1 and Hey2, respectively, of which 1147 genes were targets of both Hey1 and Hey2. Although the binding sites were located upstream and downstream of coding sequences, or even in exons and introns, 55 % and 49 % of all binding sites for Hey1 and Hey2, respectively, were located in proximal promoter regions between -0.5 kb and the first exon. An in silico binding motif analysis suggests a repetitive GC-rich sequence for Hey binding which is probably located in CpG islands, indicating a direct regulation of the transcriptional machinery by the Hey proteins. A comparison of the target genes from microarray analysis and ChIP-PET sequencing data demonstrates a large number of downregulated genes with binding sites that are directly bound by the Hey proteins. While 60 % of Hey2 downregulated genes contain binding sites, only 20 % of upregulated genes have binding sites for Hey2, invoking a repressor function for Hey proteins. To investigate, whether the Hey proteins regulate different target genes in a cell type specific manner, embryonic stem cells (ES cells) were generated which also overexpress doxycycline-inducible Hey1 or Hey2. These ES cells could be differentiated efficiently into cardiomyocytes and thus could also be used for gene expression analysis after induction of Hey overexpression. Microarray analysis of ES cells and cardiomyocytes resulted in more up- than downregulated genes in comparison to HEK293 cells. The overlap of common regulated genes in HEK293, ES cells and cardiomyocytes was very low. Only two Hey2 target genes were regulated more than 2-fold in both HEK293 and ES cells (Hes1, Zic2). This disparity indicates a narrow cell-type specific gene regulation by Hey proteins. Gene ontology analysis of all target genes demonstrated interactions of Hey proteins with different signaling pathways (e.g. TGFβ, Id or Wnt signaling), which are all indispensable for early developmental processes. These results show that Hey proteins influence and modulate gene expression levels in different signaling pathways in a cell-type specific manner. These data provide new possibilities for future research efforts to elucidate the role of Hey proteins in early organ development. KW - Gen notch KW - Transkriptionsfaktor KW - Embryonalentwicklung KW - Kardiovaskuläres System KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatinimmunpräzipitation KW - Microarray KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatin Immunoprecipitation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65053 ER - TY - THES A1 - Dippacher, Sonja T1 - Morphologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Bedeutung der Serin-Threonin-Proteinkinase SRPK79D in Drosophila melanogaster T1 - Morphological and molecular biological investigations on the role of serine threonine kinase SRPK779D in Drosophila melanogaster N2 - Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker. N2 - Intact signal transmission in an animal’s nervous system requires a properly localized and functional synapse between two neurons or between neuron and muscle. This dissertation is part of the investigation of a Drosophila melanogaster mutant which displays alterations in the distribution of a synaptic active zone protein. An important result of the present study is the documentation of an ectopic formation of active zone structural elements in this mutant. Analyses carried out in the laboratories of E. Buchner and S. Sigrist contributed to the characterization of the protein Bruchpilot (BRP), a constituent of the T-bar, the characteristic presynaptic ribbon in Drosophila. Searching for interaction partners of BRP, a serine-arginine-protein specific kinase was identified that apparently regulates T-bar assembly (Nieratschker et al., 2009). There are four kinase isoforms. Knocking out two of these isoforms (SRPK79D-RB and -RE) results in accumulations of BRP-immunoreactive aggregates in the larval ventral nerves (Nieratschker, 2008). Further studies were designed to identify the function and molecular signalling pathways of the kinase SRPK79D. One objective of the present experiments was to produce purified PB-protein in order to enable affinity-purification of an antibody against this isoform of the kinase for subsequent specific immunohistochemical localization analyses. Although production of the antigen was successful, the amount of protein produced was too low to allow efficient affinity purification. An attempt to show the expression pattern of the kinase in Drosophila embryos with in-situ hybridization resulted in production of a SRPK79D specific RNAprobe, however, the probe sensitivity was not high enough to yield conclusive results for mRNA localization. Ultrastructural analyses of the BRP-ir aggregates in the larval ventral nerves, on the other hand, yielded definite and conclusive results. These aggregates corresponded to extensive intraaxonal electron-dense, ribbon-like structures surrounded by vesicles. These electron-dense structures were differently shaped and resembled accumulations of regularly shaped, clotted or dysmorphic T-bars, which in subsequent immuno-electronmicroscopic analyses carried out by another investigator were proven to contain BRP (Nieratschker et al., 2009). An important result of the present study was the observation that similar intraaxonal aggregates were occasionally also present in wild type nerves, however, the aggregates found in the mutants were significantly more frequent and of significantly larger size than those observed in wild-type larvae. Moreover, double-immunostaining using BRP-antibodies recognizing specifically the C- and the N-terminal part of the protein, respectively, provided evidence that the complete BRP protein is localized in the aggregates. Since electron microscopy had showed that numerous vesicles were associated with the electron dense aggregates, we tested whether the vesicular glutamate transporter (DVGlut), a marker protein for synaptic vesicles of motoneurons in Drosophila, could be localized in BRP-ir aggregates. While colocalization of BRP and DVGlut was observed at the presynaptic active zones, no colocalization of the synaptic vesicle marker was observed in the BRP-ir aggregates in the larval nerves. In conclusion, the results provide evidence that the kinase SRPK79D is required for the prevention of ectopic formation of BRP-containing ribbon-like structures in larval ventral nerves. These structures include vesicles resembling synaptic vesicles, which however do not display immunoreactivity for a typical synaptic vesicle marker protein. KW - Bruchpilot KW - BRP KW - Serin-Threonin-Kinase KW - SR-Protein Kinase KW - aktive Zone KW - Cytomatrix der aktiven Zone KW - Elektronenmikroskopie KW - Ultrastruktur KW - Bruchpilot KW - SR-Protein Kinase KW - aktive Zone KW - Cytomatrix der aktiven Zone KW - Ultrastruktur KW - Bruchpilot KW - synaptic active zone cytomatrix KW - SR protein kinase KW - ultrastructure KW - electron microscopy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70937 ER - TY - THES A1 - Schülein, Christina T1 - Die Regulation von Fbw7 durch PI3K-abhängige Phosphorylierung und Charakterisierung eines konditionalen Usp28-Knockout-Mausmodells T1 - Regulation of Fbw7 by PI3K-dependent phosphorylation and Characterization of a Usp28 conditional knockout mouse N2 - Das Proto-Onkoprotein Myc ist an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl humaner Tumore entscheidend beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde Serin 227 in Fbw7 als Ziel für eine PI3K-abhängige Phosphorylierung identifiziert. Diese Phosphorylierung führt zur Stabilisierung von Fbw7 und steigert die Fähigkeit von Fbw7, Substratproteine zu ubiquitinieren und abzubauen. Um die Bedeutung von Usp28 in der Myc-induzierten Tumorentstehung und in der normalen Gewebehomöostase zu untersuchen, wurde ein konditionales Knockout-Mausmodell für Usp28 charakterisiert. Mäuse mit einer Keimbahndeletion von Usp28 sind lebensfähig, fertil und phänotypisch unauffällig. Weder in Organen der Usp28-negativen Tiere, noch in entsprechenden murinen embryonalen Fibroblasten kann eine Destabilisierung von Myc festgestellt werden. Allerdings zeigen Fibroblasten mit heterozygotem Usp28-Verlust einen Proliferationsdefekt und in Eμ-Myc-Lymphomen dieses Genotyps werden tendenziell niedrigere Myc-Proteinmengen gefunden. Das tumorfreie Überleben ist bei den Eμ-Myc; Usp28 +/- Tieren verlängert. N2 - The proto-oncoprotein Myc is involved in the genesis and maintenance of a large fraction of human tumors. In this work, I identified serine 227 in Fbw7 as a target for PI3K-dependent phosphorylation. The phosphorylation leads to stabilization of Fbw7 and enhances its ability to promote ubiquitination and degradation of its substrates. To investigate the role of Usp28 in Myc-dependent tumorigenesis and in tissue homeostasis I characterized a Usp28 conditional knockout mouse model. Mice with a germline deletion of Usp28 are viable, fertile and phenotypically normal. No decrease in Myc protein levels could be detected in organs or embryonic fibroblasts of Usp28- knockout mice. Surprisingly, embryonic fibroblasts with a heterozygous Usp28 deletion showed a proliferative defect and Eμ-Myc lymphomas of this genotype showed a tendency to reduced Myc protein levels, corresponding to a longer tumorfree survival of these animals. KW - Myc KW - Phosphorylierung KW - Ubiquitinierung KW - Fbw7 KW - Usp28 KW - Deubiquitinierung KW - Knockout-Maus KW - PI3K KW - Fbw7 KW - Usp28 KW - deubiquitination KW - knockout mouse KW - PI3K Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70963 ER - TY - THES A1 - Vogel, Benjamin T1 - Organisation von Chromatin durch HMGA1 Proteine T1 - Organisation of chromatin through HMGA1 proteins N2 - HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts. N2 - HMGA1 proteins are small basic non-histone proteins characterized by three DNA binding domains, the AT-hooks, which bind to the minor groove of DNA. As differentially expressed architectural chromatin proteins, they perform important functions in the regulation of DNA dependent processes and in development. Aberrant expression leads to developmental defects and cancer. In this thesis the influence of HMGA1 proteins on chromatin organization is investigated. Initially C2C12 myogenic precursor cells were studied, which can be differentiated to myotubes. Previously it had been shown that down-regulation of HMGA1 proteins is crucial for the initiation of myogenic differentiation. Constant over-expression of HMGA1a-eGFP prevents myogenic differentiation by influencing the expression of myogenic genes and by the establishment of a stable chromatin structure. Here it was shown that the differential HMGA1 expression does not only influence the expression of myogenic specific genes but also affects total chromatin composition. This was shown by reduced and aberrant expression of chromatin proteins such as histone H1, HMGB1, HMGN1 and HP1 proteins. Recently it was demonstrated that HMGA1 together with ORC proteins function in origin definition in eukaryotic cells. ORC proteins were also identified as components of heterochromatin and direct interaction partners of HP1α. Here, it was shown by co-immunoprecipitation, pull-down assays, siRNA and displacement experiments that HMGA1 proteins can interact with ORC proteins directly and that they can cooperate with HP1α in heterochromatin. It could be shown that HP1α indeed does not directly interact with HMGA1 but together with ORC proteins is relevant for heterochromatin maintenance. Thus HMGA1 proteins turned out to be important stabilizers of heterochromatin. Until recently it was thought that HMGA1 proteins bind DNA collinearly. In principle the three independent DNA binding AT-hooks of HMGA1 also suggest a concomitant binding to neighboring DNA strands, which could lead to a three dimensional stabilization of DNA. This assumption was affirmed by the occurrence of chromatin aggregates in HMGA1a-eGFP overexpressing cells, which was analyzed by confocal and high resolution (dSTORM) microscopy. By using a newly developed DNA cross-linking assay, which allows the analysis of a DNA crosslinking capability of a protein, it was proven that HMGA1 proteins can bind two individual DNA fibers simultaneously. Furthermore a novel domain in HMGA1 proteins was discovered which is significantly involved in the DNA cross-linking. Electron microscopic analyses confirmed that HMGA1 proteins can specifically generate crossings and loops in DNA molecules. These results support the assumption that HMGA1 proteins can create a DNA scaffold that has influence on cell typical chromatin organization and possibly also affects DNA dependent processes. To what extent HMGA1 induced DNA cross-linking plays a role in vivo, for example in the organization of chromocenters of C2C12 cells or in cancer cells, where HMGA1 proteins are over-expressed, will need to be elucidated in further experiments In summary, this work shows, that HMGA1 proteins influence chromatin structure and composition by affecting the expression of chromatin proteins, by interacting with other architectural chromatin proteins or by producing a higher organization of chromatin on its own. KW - Chromatin KW - HMG-Proteine KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65295 ER - TY - THES A1 - Wende, Elisabeth Sophie T1 - Untersuchungen zur Rolle der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk bei der Migration melanozytärer Zellen T1 - A role for the melanoma-inducing receptor tyrosine kinase Xmrk in the migration of melanocytic cells N2 - Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen. N2 - Malignant melanoma is a tumor of the skin with increasing incidence and high mortality rates. As the biomolecular events underlying melanoma development are poorly understood, specific therapeutics for this disease are few. The Xiphophorus system is suitable for studying melanoma development. In this model, presence of the RTK Xmrk is sufficient to initiate melanoma formation by activating proliferative and anti-apoptotic pathways and interfering with differentiation. This work demonstrates that Xmrk is also able to induce migration of the melanocytic cell line Melan a-Hm. Cells transformed by Xmrk migrate in amoeboid fashion, independently of MAPK or PI3K pathways. However, kinases FAK and Fyn are involved in Melan a-Hm migration, possibly as a signal-integrating protein complex similar to the role that has been described for FAK and Src in various systems. The results from this work serve to extend the Xiphophorus model to other aspects of melanoma development and may help to better understand the molecular basis of melanoma. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - Melanom KW - Zellmigration KW - Src-Proteine KW - Xiphophorus KW - fokale Adhäsionskinase (FAK) Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70945 ER - TY - THES A1 - Schramm, Sabine T1 - SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner T1 - SYCE3, a novel synaptonemal complex protein:Expression, functional analysis and binding partners N2 - Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1. N2 - The synaptonemal complex is an evolutionary highly conserved structure. It assembles specifically during prophase I of meiosis and is essential for the segregation of homologous chromosomes and thus represents a major determinant of the genetic diversity of sexually reproducing organisms. The synaptonemal complex is a proteinacious, ladder-like structure. The ladder beams are termed lateral elements and are composed of the meiosis-specific proteins SYCP2 and SYCP3 which are associated with the chromatin of the homologs. The rungs are made up of transverse filaments mainly consisting of the meiosis-specific protein SYCP1. SYCP1 forms parallel homodimers that are anchored via their C-termini to the lateral elements and interact in a head-to-head fashion with an opposing SYCP1 homodimer. For stabilizing this interaction additional proteins are essential. These are components of the so-called central element of the synaptonemal complex: while SYCE1 stabilizes the N-terminal association of opposing SYCP1 homodimers, the two other central element specific proteins SYCE2 and Tex12 connect adjoined SYCP1 filaments and thus elongate the SYCP1 network along the homologs. This process is termed synapsis and is a key feature of meiosis. Errors occurring during this process frequently lead to aneuploidy of the resulting gametes or cause meiotic arrest and infertility. Within the scope of this study a novel protein of the murine synaptonemal complex, we named SYCE3, was characterized. SYCE3 is exclusively expressed during male and female meiosis and is a component of the central element. Its expression pattern resembles that of SYCP1 and SYCE1 and it is able to interact with both of these proteins. Additionally, an interaction between SYCE3 and SYCE2 could be verified. In the context of this dissertation it was found that loading of SYCE3 to the chromosomal axis requires SYCP1. In contrast, chromosome loading of SYCE3 was independent of lateral element assembly and of the presence of the other central element specific proteins, SYCE1, SYCE2 and Tex12. The second thematic complex addressed in this thesis was the relevance of SYCE3 for synapsis and homologous recombination. To this end a Syce3-/- mouse was generated. Syce3-/- mice are infertile and both testes and ovaries are characterized by a significant reduction in size compared to wild-type littermates. Furthermore, depletion of SYCE3 had no influence on the assembly of axial elements and in males alignment of homologs was not affected. However, Syce3-/- oocytes and spermatocytes were unable to initiate synapsis between homologous chromosomes. In addition, homologous recombination was analyzed in the scope of this study and the obtained data strongly points to a central role of SYCE3 during this process: while early (DNA double-strand breaks) and intermediate (transition nodules) recombination events could take place in the absence of SYCE3, structures indicating late recombination events (recombination nodules) and sites of homologous recombination (crossovers) failed to develop. Taken together, this thesis clearly demonstrates that the novel synaptonemal complex protein SYCE3 is essential for fertility in mice. Deletion of Syce3 blocks initiation of synapsis and formation of crossovers. During synaptonemal complex assembly, SYCE3 acts downstream of SYCP1, but upstream of other central element proteins (SYCE1, SYCE2 and Tex12). KW - Meiose KW - Molekularbiologie KW - Fertilität KW - Synaptonemalkomplex KW - Meiosis KW - Synaptonemal complex KW - fertility Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70903 ER - TY - THES A1 - Göb, Eva T1 - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus T1 - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis N2 - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten. N2 - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis. KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Maus KW - Meiose KW - meiosis KW - spermiogenesis KW - nuclear envelope KW - lamina KW - LINC complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839 ER - TY - THES A1 - Keidel, Kristina T1 - Charakterisierung des Hfq-Regulons in Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica T1 - Characterisation of the Hfq regulon in Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica N2 - Bordetellen sind Gram-negative Kokkobazillen, die phylogenetisch zu den β-Proteobakterien zählen und in der Familie der Alcaligenaceae eingeordnet sind. Der bedeutendste Vertreter der Gattung, die nach heutigem Kenntnisstand neun Arten umfasst, ist Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens. Der Keim ist obligat humanpathogen und besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren, um die Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln und zu zerstören, wodurch es zu dem charakteristischen Krankheitsverlauf kommt. Neben B. pertussis werden noch B. bronchiseptica und B. parapertussis dem sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zugeteilt. Alle Vertreter des B. bronchiseptica-Clusters sind in der Lage, bei verschiedenen Wirtsspezies respiratorische Erkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad auszulösen. Dabei weist B. bronchiseptica ein breiteres Wirtsspektrum auf und kann Atemwegserkrankungen in einer Vielzahl von Säugetieren auslösen, wohingegen B. parapertussis vornehmlich Schafe und Menschen infiziert und bei letzteren eine schwächere Form des Keuchhustens bewirkt. Das Hfq-Protein wurde ursprünglich als Wirtsfaktor identifiziert, welcher für die Replikation des RNA-Phagen Qβ in Escherichia coli benötigt wird (host factor for Qβ oder HF-1). Es ist in Struktur und Funktion homolog zu den Sm-Proteinen aus Eukaryoten, die am Splicing von mRNAs involviert sind. Die Beteiligung des Hfq-Proteins an regulatorischen Vorgängen, die durch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) vermittelt werden, wurde erstmals in einer Studie zum Mechanismus der rpoS-Regulation durch die kleine regulatorische RNA OxyS ersichtlich. Seitdem konnte für eine Vielzahl an sRNAs gezeigt werden, dass sie an Hfq gebunden vorliegen und die Hilfe des Proteins bei der post-transkriptionellen Kontrolle ihrer Ziel-mRNAs benötigen. In dieser Hinsicht übernimmt Hfq die Rolle eines RNA-Chaperons, indem es trans-kodierte sRNAs stabilisiert und die Basenpaarung mit ihren Ziel-mRNAs fördert. Dabei beeinflusst die Bindung der sRNA-Regulatoren an ihre Ziel-mRNAs deren Translation, sowohl aktivierend als auch inhibierend. Bislang wurden Hfq-Homologe in der Hälfte aller sequenzierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienarten gefunden. Eine BLAST-Analyse ergab, dass B. pertussis und B. bronchiseptica Homologe zum Hfq-Protein aufweisen und diese in der veröffentlichten Genomsequenz bereits als Hfq-Protein annotiert sind. Fokus dieser Arbeit war weitestgehend, die Funktion des Hfq-Proteins in B. pertussis und vergleichend in B. bronchiseptica zu charakterisieren. Mittels Primer Extension-Analyse konnte zunächst der Startpunkt des hfq-Transkripts in B. pertussis und B. bronchiseptica unter logarithmischen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Dieser Startpunkt war zudem unter stationären Wachstumsbedingungen und nach Hitzestress aktiv, was in Diskrepanz zur Beobachtung in E. coli steht. Ferner konnte festgestellt werden, dass die hfq-Transkription nach Induktion verschiedener Stressformen in beiden Organismen erhöht war. Nach Generierung der jeweiligen Δhfq-Mutanten in beiden Organismen wurden diese charakterisiert. Die B. pertussis Δhfq-Mutante zeigte ein deutliches Wachstumsdefizit gegenüber dem Wildtyp, im Gegensatz zu B. bronchiseptica Δhfq, die sich im Wachstum wie der Wildtyp verhielt. Beide Mutanten zeigten sich sensitiver gegenüber H2O2-Stress als der Wildtyp, nicht jedoch gegenüber weiteren oxidativen Stressbedingungen oder Membranstress induzierenden Substanzen. Die Δhfq-Mutante in B. pertussis war zudem in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt, was jedoch nicht für B. bronchiseptica Δhfq galt. Da Hfq an sRNA-mRNA-Interaktionen, welche die Translation der mRNAs beeinflussen, beteiligt ist, sollte über 2D-Gelelektrophorese das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica bestimmt werden. Auffällig war, dass viele periplasmatische Transport-bindeproteine von der Δhfq-Mutation betroffen waren. Es zeigten sich aber auch Stoffwechselenzyme und wichtige Housekeeping-Faktoren, wie z. B. der Elongationsfaktor EF-Tu und das Chaperon GroEL, in der Δhfq-Mutante dereguliert. Generell scheint das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica nur einen kleinen Teil des gesamten Proteoms auszumachen. Zudem ist das Hfq-regulierte Proteom variabel zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen, aber auch zwischen den beiden Organismen trotz der engen Verwandtschaft. Die Expression ausgewählter Virulenzfaktoren zeigte keinen Unterschied zwischen Δhfq-Mutante und B. pertussis-Wildtyp. N2 - Bordetellae are Gram-negative coccobacilli phylogenetically belonging to the β-group of proteobacteria and therein to the family of Alcaligenaceae. The most prominent member of the genus comprising nine species so far is Bordetella pertussis, the etiological agent of whooping cough. This organism is an obligatory human pathogen and expresses a variety of virulence factors in order to colonize and destroy the epithelial cells of the respiratory tract causing the characteristic symptoms of the disease. In addition to B. pertussis, B. bronchiseptica and B. parapertussis are assigned to the so-called B. bronchiseptica-cluster. All members of the B. bronchiseptica-cluster have the ability to cause respiratory symptoms with varying severity. B. bronchiseptica exhibits a broad host range causing respiratory symptoms in a variety of mammals, whereas B. parapertussis infects sheep and humans causing a milder form of whooping cough in the latter. The Hfq protein was originally identified as a host factor necessary for the replication of the RNA-phage Qβ in Escherichia coli (host factor for Qβ or HF-1). It is functionally and structurally homologous to Sm-proteins involved in splicing of mRNAs in eukaryotes. The involvement of Hfq in regulatory processes caused by small non-coding RNAs (sRNAs) was first recognized in a study on the mechanism of rpoS-regulation by the small regulatory RNA OxyS. Since then a variety of sRNAs were shown to be bound to Hfq and require its help for post-transcriptional control of their target-mRNAs. In this regard, Hfq functions as an RNA-chaperone by stabilizing trans-encoded sRNAs and their basepairing to target-mRNAs. Binding of the sRNA-regulators to their target-mRNAs thereby either activates or inhibits their translation. To date Hfq homologues were identified in half of all sequenced Gram-positive and Gram-negative bacterial species. BLAST analysis revealed that B. pertussis and B. bronchiseptica possess an Hfq homologue which has already been annotated as such in the published genome sequence. The main focus of this work was to characterize the function of the Hfq protein in B. pertussis as well as in B. bronchiseptica. By primer extension analysis we could identify the start of the hfq-transcript in B. pertussis and B. bronchiseptica under logarithmic growth conditions. This transcriptional start site was also active under stationary growth conditions and after heat shock which is discrepant from the observations in E. coli. Furthermore, it could be shown that the hfq-transcription was elevated in both B. pertussis and B. bronchiseptica under various stress conditions. Δhfq-mutants were established and characterized in both organisms. The Δhfq-mutant of B. pertussis exhibited a pronounced growth deficit in comparison to the wildtype whereas the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica showed the same growth properties as the wildtype. Both Δhfq-mutants expressed a higher sensitivity to stress caused by H2O2 compared to the wildtype. However, there was no increased sensitivity of the Δhfq-mutants to other oxidative stress agents or membrane stress inducing agents. Furthermore, the Δhfq-mutant of B. pertussis but not the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica was impaired in its ability to form biofilms. Since Hfq is involved in sRNA-mRNA-interactions affecting the efficient translation of mRNAs, the Hfq-regulated proteome of B. pertussis and B. bronchiseptica was determined by 2D-gelelectrophoresis. Strikingly, a variety of periplasmic binding proteins involved in transport were affected by the Δhfq-mutation. In addition, enzymes of various metabolic pathways and important housekeeping factors, such as elongation factor EF-Tu and the protein chaperone GroEL, were deregulated in the Δhfq-mutant. The Hfq-regulated proteome comprises generally only a small part of the complete proteome in B. pertussis and B. bronchiseptica. Furthermore, this Hfq-regulated proteome differs between certain growth conditions as well as between the two closely related organisms. No difference could be observed in the expression of selected virulence factors between B. pertussis Δhfq and wildtype. KW - Bordetella pertussis KW - Bordetella bronchiseptica KW - Regulon KW - Hfq KW - Bordetella pertussis KW - Bordetella bronchiseptica KW - regulon KW - Hfq Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66677 ER - TY - THES A1 - Heddergott, Niko T1 - Zellbiologische Aspekte der Motilität von Trypanosoma brucei unter Berücksichtigung der Interaktion mit der Mikroumwelt T1 - Cell biological aspects of motility of Trypanosoma brucei in consideration of the interaction with the microenvironment N2 - Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden. N2 - Trypanosomes are protozoa causing fatal diseases in livestock and man. The cells show vivid motility, driven by a single flagellum that runs along the cell body, attached to the cell surface. Even in cell culture, trypanosomes never stop moving and ablation of functional components of the flagellum is lethal for bloodstream-forms. Motility has been shown to be essential for cell division, organelle positioning and infectivity. This renders trypanosomes valuable model organisms for studying motility. But, surprisingly little is known about motility in trypanosomes, as well as in protozoa, in general. Recently, motility of trypanosomes therefore has gotten into the spotlight of interest which brought some new insights, but many essential points are still a matter of debate, for example how the flagellar beat is regulated or how it is propagated along the cell body. In this work, the effects of the micro-environment of blood-stream form trypanosomes on motility were investigated. In their natural habitat, trypanosomes find themselves in a crowded environment. This is not only the case in the blood circulatory system, but also in extra-tissue space. The high concentration of cells and extra-cellular networks might be regarded as a kind of obstacle to cellular motion. This work shows that the mode of motility of bloodstream form trypanosomes instead is adapted to the viscosity of blood. Also a mechanistic model is presented which elucidates how this adaptation works. This also explains why most trypanosomes are tumbling in low-viscous cell culture medium, lacking other cellular components. Addition of Methylcellulose at a concentration of about 0.5% (w/v) was found to be a potent substitute for blood, providing optimal conditions for trypanosome motility. Also different types of obstacles like beads and molecular networks, as well as arranged pillar microstructures were used as a tool to mimic interaction with a solid matrix. In presence of these, the swimming speed as well as the percentage of persistent swimming cells was increased. Cells inhabiting an open-ranged environment (like Euglena or Chlamydomonas) are efficiently propelled by a planar flagellar wave. Trypanosomes in contrast, had to evolutionary adapt to a crowded environment, which would infer with any extensive planar wave. The three-dimensional flagellar beat of the attached flagellum allows trypanosomes to harness any rigid matrix for effective propulsion, in all directions equally. Trypanosomes achieve this by a rotational counter-clockwise motion of their whole cell body. Another environmental aspect for trypanosome motility that had not been studied before is the influence of hydrodynamic flow, which trypanosomes are subjected to, when swimming in the blood circulatory system. For studying this, in this work, the motilty of trypanosomes was analyzed in microfluidic devices. To extend our understanding of trypanosomal motility from 2D, like in standard microscopy based live-cell imaging analysis, to 3D, a imaging technique known as holography was used, in addition. Microfluidics as well as Holography both are emerging, high-potential techniques in biology, which had not been used for the motility analysis of trypanosomes before and establishing this therefore only got possible due to interdisciplinary collaborations. In addition, a custom fully automated, software-controlled, fluorescence microscopic system was developed in this work, which is able to track and follow single cells for motility analysis in real-time without the need for user input. The motion of the flagellar beat and the cell itself was investigated at high spatio-temporal resolution using highspeed fluorescence microscopy. KW - Trypanosoma brucei KW - Motilität KW - Blutviskosität KW - Hochgeschwindigkeitsmikroskopie KW - Mikrofluidik KW - Mikroumwelt KW - Mikrostrukturen KW - Trypanosomen KW - Blut KW - Trypanosoma KW - motility KW - blood KW - microfluidics KW - microenvironment Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56791 ER -