TY - THES A1 - Thelen, David T1 - Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz T1 - Construction of a gene regulatory network to simulate the formation of dental hard tissue N2 - In this dissertation, the author describes the creation of a basic bioinformatic model of human enamel maturation. Supported by the interactions found in the KEGG Pathway database, we were able to establish a gene regulatory network (GRN) that focuses primarily on the signal transduction pathways apoptosis, cell cycle, hedgehog signaling pathway, MAP kinase pathway, mTOR signaling pathway, Notch signaling pathway, TGF-β signaling pathway and Wnt signaling pathway. We extended this through further verified interactions and implicated the tooth-specific genes AMELX, AMELY, AMBN, ENAM and DSPP. In the subsequent simulation of the network by the simulation tool Jimena, six stable states could be identified. These are examined in more detail and juxtaposed with results of a GEO dataset. The long-term goal is to draw conclusions about the odontogenesis of humans through consistent optimization of the bioinformatics network. N2 - In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen. KW - Universität Würzburg. Lehrstuhl für Bioinformatik KW - Boolesches Netz KW - Zahnentwicklung KW - Amelogenese KW - Genregulation KW - genregulatorisches Netzwerk Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204068 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Henriette T1 - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression. N2 - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Entwicklung KW - Parasit KW - VSG KW - antigenic variation KW - monoallelic expression KW - stumpy development KW - differentiation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902 ER - TY - JOUR A1 - Sarukhanyan, Edita A1 - Shityakov, Sergey A1 - Dandekar, Thomas T1 - Rational drug design of Axl tyrosine kinase type I inhibitors as promising candidates against cancer JF - Frontiers in Chemistry N2 - The high level of Axl tyrosine kinase expression in various cancer cell lines makes it an attractive target for the development of anti-cancer drugs. In this study, we carried out several sets of in silico screening for the ATP-competitive Axl kinase inhibitors based on different molecular docking protocols. The best drug-like candidates were identified, after parental structure modifications, by their highest affinity to the target protein. We found that our newly designed compound R5, a derivative of the R428 patented analog, is the most promising inhibitor of the Axl kinase according to the three molecular docking algorithms applied in the study. The molecular docking results are in agreement with the molecular dynamics simulations using the MM-PBSA/GBSA implicit solvation models, which confirm the high affinity of R5 toward the protein receptor. Additionally, the selectivity test against other kinases also reveals a high affinity of R5 toward ABL1 and Tyro3 kinases, emphasizing its promising potential for the treatment of malignant tumors. KW - Axl tyrosine kinase KW - anti-cancer drug-like molecules KW - rational drug design KW - molecular docking KW - molecular dynamics Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199505 SN - 2296-2646 VL - 7 IS - 920 ER - TY - THES A1 - Michel, Konstanze T1 - Die kardiale Bedeutung des Hormons C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) und dessen Guanylylcyclase B (GC-B) Rezeptor T1 - The cardiac role of the C-type natriuretic peptide (CNP) and its guanylyl cyclase B (GC-B) receptor N2 - In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht. In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie. Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen. N2 - Here we investigated cardiac effects of c-type natriuretic peptide (CNP) in wildtype mice (study 1) and in a newly generated mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of the guanylyl cyclase B (GC-B) receptor (study 2). In study 1 the effects of exogenous, synthetic CNP were investigated in wildtype mice (C57Bl6 background) after heart failure induced by pressure overload. Therefore, additionally to transverse aortic constriction (TAC) CNP (50 ng/kg/min) was administered via osmotic minipumps for 14 days. TAC provoked progressive heart hypertrophy. The TAC-induced hypertrophy was accompanied by enlarged cardiomyocyte areas and increased left ventricular mRNA levels of BNP. CNP significantly reduced cardiomyocyte areas and mRNA levels of BNP. Also, the TAC-induced left ventricular dilatation was almost prevented through synthetic CNP. These cardiac protective effects of CNP were accompanied by increased phosphorylation of the sarcomeric protein titin. Titin plays a critical role in maintaining the sarcomere structure and elasticity and thereby influences myocyte contraction and especially relaxation. The left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were significantly increased after TAC. The increased left-ventricular (end-diastolic and end-systolic) volumes after TAC are maybe provoked by an increased cardiomyocyte stiffness. The acute rise in IL-6 mRNA levels after TAC may favour these change, since Kruger et al postulate a relationship between passive cardiomyocyte stiffness and IL-6 expression. These changes were prevented by exogeneous CNP. Presumably, the CNP induced phosphorylation of titin on Serin 4080 within its elastic domain improves the cardiomyocyte relaxation and therefore the left-ventricular diastolic function. Because of these observations, we investigated in study 2, whether endogenous CNP as a paracrine hormone can affect TAC-induced hypertrophy and contractile function of cardiomyocytes. Therefore, we generated a new genetic mouse model with a cardiomyocyte specific deletion of the GC-B receptor (CM GC-B KO). Since previous studies in our group demonstrated that cardiac baseline expression levels of CNP are very low, but they markedly increased 3 days after TAC and decline to baseline levels 14 days after TAC, CM GC-B KO mice and control littermates were investigated at both timepoints after TAC. TAC resulted in increased cardiac afterload after 3 days, and more after 2 weeks, which was similar in both genotypes. Pressure overload provoked a progressive and significant cardiac hypertrophy, shown by the increased heart weight/body weight ratios, and were confirmed by histology. More severe myocyte hypertrophy was shown 3 days after TAC in CM GC-B KO mice, compared with control mice. Left ventricular contractile functions were also investigated by invasive catheterization in anesthetized mice. Notably, while in control mice subjected to TAC the LV ejection fraction was only mildly decreased, the KO mice reacted with a very marked and early decrease of the ejection fraction at three days after TAC, which tend to improve later on. Even more, the left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were markedly increased in the KO mice 3 days after TAC, indicating left ventricular dilatation. Again, this acute dilatation seems to reverse or improve at later stages. Such changes were not observed in control mice. To clarify possible downstream signalling pathways mediating these protective effects of CNP, we investigated titin-phosphorylation and IL-6 expression after 3 days of TAC. The acute increased IL-6 mRNA expression correlates well with the diminished phosphorylation of titin (serin 4080) in CM GC-B KO mice. Also, the increased NOX4 expression 3 days after TAC, could be one of the reasons of the early dilatation in KO mice. The diminished phosphorylation of STAT3 in CM GC-B KO mice may induce apoptosis by transcription of Bcl or Bax genes. Also, the increased mRNA expression of Cxcl-1 and IL-6 after 3 days of TAC can lead to more inflammation the hearts of the KO mice. In summary, these results show, that the CNP/GC-B/cGMP pathway can prevent cardiac dilatation in early stages. The phosphorylation of titin and the inhibition of the pro-inflammatory cytokines can contribute to this protective effects of CNP in the heart. KW - Herzinsuffizienz KW - Peptide KW - Kardiomyopathie KW - C-Typ natriuretisches Peptid KW - Guanylylcyclase B Rezeptor KW - kardiale Hypertrophie KW - c-type natriuretic peptide KW - guanylyl cyclase B receptor KW - cardiac hypertrophy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200211 ER - TY - JOUR A1 - Baur, Florentin A1 - Nietzer, Sarah L. A1 - Kunz, Meik A1 - Saal, Fabian A1 - Jeromin, Julian A1 - Matschos, Stephanie A1 - Linnebacher, Michael A1 - Walles, Heike A1 - Dandekar, Thomas A1 - Dandekar, Gudrun T1 - Connecting cancer pathways to tumor engines: a stratification tool for colorectal cancer combining human in vitro tissue models with boolean in silico models JF - Cancers N2 - To improve and focus preclinical testing, we combine tumor models based on a decellularized tissue matrix with bioinformatics to stratify tumors according to stage-specific mutations that are linked to central cancer pathways. We generated tissue models with BRAF-mutant colorectal cancer (CRC) cells (HROC24 and HROC87) and compared treatment responses to two-dimensional (2D) cultures and xenografts. As the BRAF inhibitor vemurafenib is—in contrast to melanoma—not effective in CRC, we combined it with the EGFR inhibitor gefitinib. In general, our 3D models showed higher chemoresistance and in contrast to 2D a more active HGFR after gefitinib and combination-therapy. In xenograft models murine HGF could not activate the human HGFR, stressing the importance of the human microenvironment. In order to stratify patient groups for targeted treatment options in CRC, an in silico topology with different stages including mutations and changes in common signaling pathways was developed. We applied the established topology for in silico simulations to predict new therapeutic options for BRAF-mutated CRC patients in advanced stages. Our in silico tool connects genome information with a deeper understanding of tumor engines in clinically relevant signaling networks which goes beyond the consideration of single drivers to improve CRC patient stratification. KW - in silico simulation KW - 3D tissue models KW - colorectal cancer KW - BRAF mutation KW - targeted therapy KW - stratification Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193798 SN - 2072-6694 VL - 12 IS - 1 ER - TY - THES A1 - Klepsch, Maximilian Andreas T1 - Small RNA-binding complexes in Chlamydia trachomatis identified by Next-Generation Sequencing techniques T1 - Identifizierung von kleinen RNA-bindenden Komplexen in Chlamydia trachomatis mittels Hochdurchsatz- Sequenziertechniken N2 - Chlamydia infect millions worldwide and cause infertility and blinding trachoma. Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) is an obligate intracellular gram-negative pathogen with a significantly reduced genome. This bacterium shares a unique biphasic lifecycle in which it alternates between the infectious, metabolically inert elementary bodies (EB) and the non-infections, metabolically active replicative reticular bodies (RB). One of the challenges of working with Chlamydia is its difficult genetic accessibility. In the present work, the high-throughput method TagRNA-seq was used to differentially label transcriptional start sites (TSS) and processing sites (PSS) to gain new insights into the transcriptional landscape of C. trachomatis in a coverage that has never been achieved before. Altogether, 679 TSSs and 1067 PSSs were detected indicating its high transcriptional activity and the need for transcriptional regulation. Furthermore, the analysis of the data revealed potentially new non-coding ribonucleic acids (ncRNA) and a map of transcriptional processing events. Using the upstream sequences, the previously identified σ66 binding motif was detected. In addition, Grad-seq for C. trachomatis was established to obtain a global interactome of the RNAs and proteins of this intracellular organism. The Grad-Seq data suggest that many of the newly annotated RNAs from the TagRNA-seq approach are present in complexes. Although Chlamydia lack the known RNA-binding proteins (RBPs), e.g. Hfq and ProQ, observations in this work reveal the presence of a previously unknown RBP. Interestingly, in the gradient analysis it was found that the σ66 factor forms a complex with the RNA polymerase (RNAP). On the other hand, the σ28 factor is unbound. This is in line with results from previous studies showing that most of the genes are under control of σ66. The ncRNA IhtA is known to function via direct base pairing to its target RNA of HctB, and by doing so is influencing the chromatin condensation in Chlamydia. This study confirmed that lhtA is in no complex. On the other hand, the ncRNA ctrR0332 was found to interact with the SNF2 protein ctl0077, a putative helicase. Both molecules co-sedimented in the gradient and were intact after an aptamer-based RNA pull-down. The SWI2/SNF2 class of proteins are nucleosome remodeling complexes. The prokaryotic RapA from E. coli functions as transcription regulator by stimulating the RNAP recycling. This view might imply that the small ncRNA (sRNA) ctrR0332 is part of the global regulation network in C. trachomatis controlling the transition between EBs and RBs via interaction with the SNF2 protein ctl0077. The present work is the first study describing a global interactome of RNAs and proteins in C. trachomatis providing the basis for future interaction studies in the field of this pathogen. N2 - Chlamydien verursachen jährlich Millionen Neuinfektionen weltweit und können zu Spätschäden wie Unfruchtbarkeit und Erblindung führen. Chlamydien sind obligat intrazelluläre, gram-negative Pathogene mit einem stark reduzierten Genom. Sie besitzen einen einzigartigen biphasischen Lebenszyklus, bei dem der Erreger zwischen den metabolisch inaktiven, infektiösen Elementarkörperchen (EBs) und den nicht infektiösen, metabolisch aktiven und replikativen Retikularkörperchen (RBs) alterniert. Eine Problemantik beim Arbeiten mit Chlamydien ist die Schwierigkeit der gezielten genetischen Manipulation des Pathogens. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hochdurchsatz-Sequenziermethode TagRNA-Seq genutzt, um die transkriptionelle Organisation von Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) zu analysieren und besser zu verstehen. Transkriptionelle Start Stellen (TSS) und Prozessierungsstellen (PSS) werden dabei unterschiedlich markiert, sodass eine zuverlässigere und genauere Auflösung erreicht wird als bisher durch in anderen Studien verwendete Methoden. Insgesamt konnten so 679 TSSs und 1067 PSSs detektiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Transkriptom von C. trachomatis weitaus aktiver ist als bisher angenommen und eine Regulation auf transkriptioneller Ebene bedarf. Die Methode erlaubte zudem die Identifizierung von potenziell neuen nicht-kodierende RNAs sowie die Kartierung von transkriptionellen Prozessierungsereignissen. Unter Verwendung der 5’-upstreamliegenden Sequenzen konnte außerdem das in anderen Bakterien bereits bekannte σ66-Bindemotiv detektiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem die Methode Grad-Seq in C. trachomatis etabliert, um ein globales Interaktom für RNAs (engl. ribonucleic acid) und Proteine des intrazellulären Organismus zu erstellen. Für viele der im TagRNA-Seq Ansatz identifizierten und neu annotierten RNAs konnte so eine Komplexbildung beobachtet werden. Dies deutet auf das Vorhandensein eines bislang unbekanntes RNA-Bindeprotein (RBP) hin, da Chlamydien keines der bekannten RBPs, z.B. Hfq oder ProQ, besitzen. Die Gradienten-Analyse ergab, dass der σ66-Faktor in einem Komplex mit der RNA-Polymerase (RNAP) vorliegt und dass der σ28-Faktor ungebunden ist. Diese Beobachtung entspricht den Ergebnissen vorheriger Studien, die zeigten das die meisten Gene durch σ66 kontrolliert werden. Die Daten bestätigen außerdem, dass IhtA, eine ncRNA (engl. non-coding ribonucleic acid), die über direkte Basenpaarbindung mit ihrem Ziel-RNA von hctB interagiert, nicht in einem Komplex vorliegt. Für die ncRNA ctrR0332 hingegen konnte das SNF2-Protein ctl0077 als Interaktionspartner identifiziert werden. Beide Moleküle co-sedimentieren im Gradienten und konnten mittels eines Aptamer-basierenden RNA Pull-Downs in intakter Form isoliert werden. Die Klasse der SWI2/SNF2-Proteine gehört zu den Nukleosomen-Remodeling-Komplexen. In Prokaryoten konnte für das in E. coli vorkommende RapA, welches ebenfalls zu den SWI2/SNF2-Proteinen zählt, die Funktion eines Transkriptionsregulators nachgewiesen werden, indem die RNAP-Wiederverwertung stimuliert wird. Dies könnte bedeuten, dass die ncRNA ctrR0332 ebenfalls Teil eines globalen Regulationsnetzwerks ist, welches durch Interaktion mit dem SNF2-Protein ctl0077 die Transition zwischen dem RB- und EB-Stadium reguliert. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein globales Interaktom von RNAs und Proteinen in C. trachomatis erstellt werden, welches als Grundlage für zukünftige Interaktionsstudien des Pathogens genutzt werden kann. KW - High throughput screening KW - Small RNA KW - Chlamydia trachomatis Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199741 ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Kurz, Andreas T1 - Correlative live and fixed cell superresolution microscopy T1 - Korrelative hochauflösende Mikroskopie an lebenden und fixierten Zellen N2 - Over the last decade life sciences have made an enormous leap forward. The development of complex analytical instruments, in particular in fluorescence microscopy, has played a decisive role in this. Scientist can now rely on a wide range of imaging techniques that offer different advantages in terms of optical resolution, recording speed or living cell compatibility. With the help of these modern microscopy techniques, multi-protein complexes can be resolved, membrane receptors can be counted, cellular pathways analysed or the internalisation of receptors can be tracked. However, there is currently no universal technique for comprehensive experiment execution that includes dynamic process capture and super resolution imaging on the same target object. In this work, I built a microscope that combines two complementary imaging techniques and enables correlative experiments in living and fixed cells. With an image scanning based laser spot confocal microscope, fast dynamics in several colors with low photodamage of the cells can be recorded. This novel system also has an improved resolution of 170 nm and was thoroughly characterized in this work. The complementary technique is based on single molecule localization microscopy, which can achieve a structural resolution down to 20-30 nm. Furthermore I implemented a microfluidic pump that allows direct interaction with the sample placed on the microscope. Numerous processes such as living cell staining, living cell fixation, immunostaining and buffer exchange can be observed and performed directly on the same cell. Thus, dynamic processes of a cell can be frozen and the structures of interest can be stained and analysed with high-resolution microscopy. Furthermore, I have equipped the detection path of the single molecule technique with an adaptive optical element. With the help of a deformable mirror, imaging functions can be shaped and information on the 3D position of the individual molecules can be extracted. N2 - Im letzten Jahrzehnt hat der Bereich der Lebenswissenschaften einen enormen Sprung nach vorne gemacht. Maßgeblich dafür waren die Entwicklung von komplexen Analysegeräten insbesondere in der Fluoreszenz Mikroskopie. Die Anwender können nun auf eine Vielzahl von Bildgebungstechniken zurückgreifen die unterschiedliche Vorzüge hinsichtlich optischer Auflösung, Aufnahmegeschwindigkeit oder Lebend Zell Kompatibilität bieten. Mithilfe dieser modernen Mikroskopietechniken lassen sich beispielsweise Multiproteinkomplexe auflösen, Membranrezeptoren zählen, zelluläre Signalwege analysieren oder die Internalisierung von Rezeptoren verfolgen. Für eine umfassende Experimentdurchführung, die Erfassung dynamischer Prozesse sowie superhochauflösende Bildgebung an ein und demselben Zielobjekt beinhalten, gibt es derzeit keine einheitliche Technik. In dieser Arbeit habe ich ein Mikroskop aufgebaut, das zwei komplementäre Bildgebungstechniken vereint und korrelative Experimente von lebend zu fixierten Zellen ermöglicht. Mit einem Image Scanning basierten Konfokal Mikroskop können schnelle Dynamiken in mehreren Farben mit geringer Photoschädigung der Zellen aufgenommen werden. Dieses neuartige System weist zudem eine Auflösungsverbesserung von 170 nm auf und wurde im Rahmen der Arbeit ausführlich charakterisiert. Die komplementäre Technik basiert auf der Einzel-Molekül Lokalisations Mikroskopie, mit der sich eine strukturelle Auflösung von bis zu 20 nm erreichen lässt. Desweiteren habe ich eine Mikrofluidpumpe implementiert, die eine direkte Interaktion mit der auf dem Mikroskop platzierten Probe erlaubt. Zahlreiche Prozesse wie Lebend-Zell Färbung, Lebend-Zell Fixierung, Immuno-Färbung und Puffertausch können damit direkt an der gleichen Zelle beobachtet und durchgeführt werden. So können dynamische Prozesse einer Zelle sozusagen eingefroren werden und die Strukturen von Interesse gefärbt und mit höchstauflösender Mikroskopie analysiert werden. Desweiteren habe ich den Detektionspfad der Einzel-Molekül Technik mit einem adaptiven optischen Element ausgestattet. Mithilfe eines deformierbaren Spiegels lässt sich so Abbildungsfunktion formen und Information zur 3D Position der einzelnen Moleküle gewinnen. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Adaptive Optik KW - Image-Scanning Microscope KW - Correlative microscopy KW - Adaptive Optics Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199455 ER - TY - THES A1 - Beliu, Gerti T1 - Bioorthogonale Tetrazin-Farbstoffe für die Lebendzell-Markierung und hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie T1 - Bioorthogonal tetrazine-dyes for live-cell labeling and super-resolution fluorescence microscopy N2 - Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen. Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio- ¬molekülen unter physiologischen Bedingungen. Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran- ¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff- Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine. Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert werden. Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin- Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden. N2 - The genetic code describes the encoding and decoding of genetic infor-mation for the universal principle of protein biosynthesis from individual amino acids. By expanding the genetic code, unnatural amino acids (uAA) with unique biophysical properties can be introduced site-specifically into pro-teins and enable the selective manipulation of proteins. The click reaction of the unnatural amino acid TCO*-lysine and tetrazine has an extraordinary reaction kinetic (≥800 M-1s-1) enabling the specific and bioorthogonal labeling of biomolecules under physiological conditions. The main focus of this work was the labeling of membrane receptors by click chemistry in living cells and the investigation of the interaction of 22 known and novel tetrazine dye conjugates. In addition, the applicability of bioorthogonal click reactions for high-resolution fluorescence microscopy was investigated. For this purpose, the unnatural amino acid TCO*-lysine was introduced site-specifically via genetic code expansion into proteins from the class of iono-tropic glutamate receptors (iGluR), TNF receptors or microtubule- associated proteins (MAP), thereby enabling fluorescence labeling with tetrazine dyes. The direct chemical coupling of TCO to ligands such as phalloidin and docetaxel, which can specifically bind the actin cytoskeleton or microtubule filaments, allowed click staining of fixed and living cells without genetic modifications of the target proteins. Furthermore, the spectroscopic properties of 22 tetrazine dyes spanning the entire visible wavelength range were investigated. A hallmark of the click reaction using tetrazine dyes is their fluorogenicity. Thus, the tetrazine not only functions as a reactive group during the click reaction with alkenes, but also leads to fluorescence quenching in many tetrazine-dye conjugates. While FRET-based quenching processes dominate in green-absorbing dyes, photoinduced electron transfer (PET) from excited dye to tetrazine has been identified as the main quenching mechanism in red-absorbing oxazine and rhodamine derivatives. The efficient and specific labeling of all investigated tetrazine dyes facilitates the visualization of actin filaments, microtubules and membrane receptors by conventional fluorescence microscopy as well as by super-resolution microscopy techniques, e.g. dSTORM, also at single molecule level. The different cell permeability of tetrazine dyes can be used advantageously for the specific intra- and extracellular labeling of proteins in fixed and living cells. KW - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie KW - Tetrazin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189628 ER - TY - THES A1 - Becker, Mira Caroline T1 - Principles of olfactory-visual integration to form a common percept in honeybees T1 - Prinzipien der olfaktorisch-visuellen Integration des Lernverhaltens der Honigbienen N2 - The honeybee is a well studied and important organism in neuroethology. The possibility to train them with a classical conditioning paradigm and their miniature brain provide a perfect requisite to investigate the neuronal principles of learning and memory. Honeybees use visual and olfactory cues to detect flowers during their foraging trips. Hence, the reward association of a nectar source is a multi-modal construct, which has at least two major components - olfactory and visual cues. It is still an open question, how both sensory components are converged in the mushroom body, which represent the multi-modal integration centre of the honeybee brain. The main goal of this study, is to investigate the processing of multiple modalities and how a reward association is formed. This includes, how and wether both sensory modalities interfere during learning. Thus, in this study stimulation with UV, blue and green light was used to evoke distinct photoreceptor activities in the compound eye. Furthermore, three different odours (Geraniol, Citronellol and Farnesol) were used. These stimuli were tested in three different experimental series. The first experiment involved classical differential conditioning of the single modalities - odour and colour. Honeybees showed high learning performances in differentiating olfactory stimuli and also reliable responses for visual conditioning. Furthermore, a temporal discrepancy in the stimulus length for best learning in the olfatcoty and visual cues was found. In the second series, it was tested how multi-modal compounds are perceived. This includes, unique cues (configural processing) or the sum of the single components of a compound (elemen- tal processing). This was tested by combining single odour components with monochromatic light in a positive (PP) and negative patterning (NP) experiment. During PP, the olfactory- visual compound was rewarded, whereas the single components were unrewarded. In contrast, during NP the single components were reinforced, but the compound was not. In addition, the ability to distinguish between two different light stimuli presented as a part of an olfactory-visual compound with the same odour component during acquisition was tested. In a memory test, the light stimuli were presented again as a compound and in addition as the single components. The results revealed that bees used elemental processing with compounds containing green and blue light. In contrast, when UV light was presented the bees used configural processing. Finally, a third experiment was conducted at the neuronal level. Multi-unit recordings were established to provide a suitable method to analyse extrinsic neurons at the mushroom body output region, the so called ventral lobe of the pedunculus. Here, three different odours (Geran- iol, Farnesol and Citronellol), two colours (green and blue) and two combined stimuli (colour + odour) were chosen as stimuli, to search for possible variations in processing stimuli with different modalities. Two units could be detected that responded mainly to visual stimuli. N2 - Die Honigbiene ist ein gut untersuchter und wichtiger Organismus für die neuroethologische Forschung. Die Möglichkeit sie auf klassische Weise zu Konditionieren und ihr relativ kleines Gehirn macht sie zum idealen Untersuchungs-Gegenstand um die neuronalen Prinzipien des Lernens und der Gedächtnisbildung zu erforschen. Während des Furagierens nutzen Honigbi- enen beides: visuelle und olfaktorische Merkmale der Futterplanzen. Daher ist die Belohnungs- Assoziation mit der Nektar-Belohnung ein multi-modales Konstrukt, welches aus mindestens zwei Hauptkomponenten, den olfaktorischen und den visuellen Reizen, besteht. In dieser Arbeit soll untersucht werden, wie olfaktorische und visuelle Reize verarbeitet wer- den und wie sie im Pilzkörper, dem multi-modalen Integrationszentrum des Bienengehirnes, konvergieren. Wie beide sensorischen Modalitäten integriert werden um eine gemeingültige Belohnungs-Assoziation zu bilden, ist immer noch eine offene Frage. Weiterhin ist unklar ob und wie sie miteinander interferieren. Die hier dargestellten Studien nutzen Stimulationen mit UV, blauem und grünem Licht um unterschiedliche Photorezeptor Aktivitäten im Komplexauge auszulösen. Des Weiteren wurden drei verschiedene Duftkomponenten (Geraniol, Citronellol und Farnesol) verwendet. Diese Stimuli wurden in drei verschiedenen Experiment-Reihen gestestet. Das erste Experiment umfasste die klassische differentielle Konditionierung der Einzelmodalitäten (Duft und Farbe). Honigbienen zeigten eine hohe Lernfähigkeit bei der Unterscheidung zweier olfaktorischer Reize sowie eine solide Lern-Leistung während der Konditionierung mit Licht. Im zweiten Experiment wurde getestet, ob ein zusammengesetzter Reiz aus beiden Modalitäten als Summe der einzelnen Elemente (elementare Verarbeitung) oder als unikaler Reiz (konfigu- rale Verarbeitung) wahrgenommen wird. Hierbei wurde monochromatisches Licht und einzelne Duftkomponenten in positive patterning- (PP) und negative patterning-Experimenten (NP) getestet. Beim PP, wurde der zusammengesetzte Reiz belohnt, wohingegen die Einzelkom- ponenten unbelohnt blieben. Dagegen wurden beim NP nur die Einzelkomponenten belohnt, aber nicht ihre Kombination. Außerdem wurde der Frage nachgegangen, ob die Fähigkeit zur Differenzierung unterschiedlich ist, wenn zwei verschiedene Lichtreize teil einer olfaktorisch- visuellen Kombination sind, oder nicht. Interessanterweise zeigten die Verhaltensleistungen einen prominenten Fall von konfiguraler Verarbeitung, allerdings nur wenn UV-Licht ein El- ement der olfaktorisch-visuellen Zusammensetzung war. Die Ergebnisse der Experimente mit blauem oder grünem Licht hingegen, unterstützen die Theorie einer elementaren Verarbeitung. Abschließend wurde mittels elektrophysiologischer multi-unit-Aufnahmen eine passende Meth- ode etabliert, um die extrinsischen Neurone des Pilzkörpersausganges zu analysieren. Hierbei wurden drei verschiedene Düfte und zwei Farben sowie zwei Kombinationen aus Farbe und Duft getestet, um mögliche Variationen der multimodalen Reiz-Verarbeitung zu untersuchen. Zwei neuronale Einheiten (units) wurden gefunden, welche hauptsächlich auf Lichtreize antworteten. KW - honeybees KW - learning and behaviour KW - multi-modal stimuli Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199190 ER - TY - THES A1 - Lu, Yunzhi T1 - Kinetics of mouse and human muscle type nicotinic receptor channels T1 - Kinetik muriner und humaner nikotinischer Rezeptorkanäle vom Muskeltyp N2 - Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated. Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits. N2 - Acetylcholin (ACh) vermittelt Erregungsübertragung an neuromuskulären synaptischen Kontakten (neuromuscular junction, NMJ) von Wirbeltieren und vielen anderen Synapsen. Die postsynaptischen ACh-Rezeptoren an der NMJ sind vom nikotinischen Subtyp (nAChRs). Als Teil der am besten erforschten Kanalrezeptoren dienen sie oft als Modelle oder auch Prototypen für Rezeptoren. Trotz einer Fülle an Informationen über nAChRs des Muskeltyps ist bis heute recht wenig über artenspezifischen funktionellen Unterschiede bekannt. Diese Studie befasst sich daher mit der Untersuchung von nAChRs des Muskeltyps in erwachsenen Mäusen und Menschen. Aufzeichnungen mit sogenannten Cell-attached Patches im heterologen Expressionssystem HEK293T-Zellen lieferten Beweise dafür, dass die ACh-Affinität von rekombinanten erwachsenen Maus- und menschlichen nAChRs vom Muskeltyp unterschiedlich sind. Um diesem nachzugehen, habe ich diese Rezeptoren in Outside-out Patches mit Hilfe eines schnellen Piezogetriebenen Applikationssystems verglichen. Dieses System bietet den Vorteil, dass einzelne Membran-Patches mit Rezeptoren unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ausgesetzt werden können. Als Reaktion auf 10 und 30 µM ACh waren die normalisierten Stromamplituden (î) und Stromanstiegszeiten (tr) der menschlichen Rezeptoren signifikant höher als die der Mausrezeptoren. Die Analyse der Dosis-Wirkungskurven von î und tr sowie die Anpassung eines quantitativen zweistufigen kinetischen Modells mit zwei äquivalenten Bindestellen an die Datensätze zeigten eine zweifach höhere Assoziationsrate für ACh bei menschlichen Rezeptoren, verglichen mit der von Mausrezeptoren. Zudem wurden menschliche nAChRs in Outside-Out-Patches schneller als Mausrezeptoren durch Superfusion mit 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) blockiert, was für eine höhere Affinität auch für α-Bgtx spricht. Schließlich wiesen die menschlichen nAChRs in Outside-Out-Patches bei 3 µM ACh eine höhere Affinität als chimäre Rezeptoren aus Maus α- und menschlichen β-, γ- and ε-Untereinheiten auf. Die höhere Affinität der menschlichen Rezeptoren zu ACh und α-Bgtx im Vergleich zu Mausrezeptoren basiert somit zumindest in Teilen auf Sequenzdifferenzen ihrer α-Einheitenen. KW - nicotinic acetylcholine receptor KW - affinity KW - kinetic mechanism KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Muskelzelle KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192688 ER -