TY - THES A1 - Bonn, Maria Roswitha T1 - Zielstrukturen des serotonergen Systems in der laterobasalen Amygdala : Untersuchungen an Ratten und einem Mausmodell für emotionale Dysregulation T1 - Targets of the serotonergic system in the laterobasal amygdala : investigations in rats and a mouse model for emotional dysregulation N2 - Die Amygdala ist ein Kernkomplex, der dicht von serotonergen Afferenzen innerviert wird. Sowohl bei Tieren als auch beim Menschen spielen Interaktionen zwischen dem serotonergen System und der Amygdala bei der Verarbeitung von Reizen, die mit Angst oder Stress assoziiert sind, eine zentrale Rolle. Genetische Variationen im serotonergen System und/oder dauerhafter Stress können dazu führen, dass diese Verarbeitungsprozesse fehlerhaft ablaufen, wodurch Verhaltensanormalitäten bzw. die Entstehung psychiatrischer Erkrankungen begünstigt werden. Die Zielneurone der serotonergen Transmission in der Amygdala, die molekularen Mechanismen möglicher Interaktionen und strukturelle Konsequenzen der Störungen dieser Interaktionen sind jedoch bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht vollständig bekannt. Daher bestand ein Ziel der vorliegenden Arbeit darin, den Einfluss eines Ungleichgewichts im serotonergen System (5-Htt KO) sowie von wiederholtem, sozialem Stress auf die neuronale Morphologie der Amygdala zu analysieren und Zielneurone serotonerger Afferenzen zu identifizieren und zu charakterisieren, um die neuronalen Netzwerke der Emotionsverarbeitung besser verstehen zu können. Um vom 5-Htt–Genotyp abhängige und stressbedingte neuromorphologische Veränderungen zu untersuchen, wurden dreidimensionale Rekonstruktionen von Neuronen der laterobasalen Amygdala von männlichen, adulten Wildtyp (WT)- und 5-Htt KO-Mäusen angefertigt und bezüglich verschiedener morphologischer Parameter ausgewertet. An den Pyramidenzellen wurden nur geringfügige Veränderungen der dendritischen Komplexität, jedoch, im Vergleich zu WT-Mäusen, eine wesentliche Erhöhung der Dornendichte an spezifischen dendritischen Kompartimenten bei gestressten WT-Mäusen, sowie nicht gestressten und gestressten 5-Htt KO-Mäusen nachgewiesen. Im Vergleich zu nicht gestressten WT–Mäusen war die dendritische Dornendichte aller anderen Gruppen gleichermaßen erhöht. Die Sternzelle, zeigten bezüglich der untersuchten Parameter keine morphologischen Veränderungen auf. Eine besondere Subpopulation der Interneurone stellen die NeuropeptidY (NPY)–Neurone der laterobasalen Amygdala dar, da sie in diesen Nuclei anxiolytisch wirken. Es gibt nur wenige Anhaltspunkte darüber, durch welche Systeme NPY–Neurone moduliert werden. Da sowohl NPY–Neurone in der laterobasalen Amygdala als auch das serotonerge System an angstregulierenden Prozessen beteiligt sind, sollte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob es sich bei diesen Neuronen um Zielstrukturen des serotonergen Systems handelt. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Analysen wurden synaptische Kontakte zwischen serotonergen Afferenzen und NPY-immunreaktiven Neuronen in der laterobasalen Amygdala von Ratten verifiziert. Da der funktionelle Einfluss der serotonergen Innervation auf diese Zielneurone von deren Serotoninrezeptor (5-HTR)-Ausstattung abhängt, wurden Koexpressionsanalysen von NPY mRNA mit den mRNAs verschiedener 5-HTR durchgeführt. Die Analysen ergaben, dass NPY mRNA–reaktive Neurone in der laterobasalen Amygdala 5-HT1A und 5-HT2C, jedoch nicht 5-HT3 mRNA koexprimieren. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Resultate liefern neue Erkenntnisse über den Einfluss des serotonergen Systems auf die laterobasale Amygdala von Mäusen und Ratten. Bei den Veränderungen der dendritischen Dornendichte nach sozialen Stresserfahrungen könnte es sich um neuroadaptive bzw. kompensatorische Mechanismen der Pyramidenzellen handeln, die WT-Mäusen eine Anpassung an sich ändernde, negative Umweltbedingungen ermöglicht. Die erhöhte Dornendichte könnte dabei die Ausbildung eines „emotionalen Gedächtnisses“ repräsentieren, das eine flexible Verhaltensantwort auf ein erneutes Auftauchen von Gefahr erlaubt. Eine solche Modulation der Erregbarkeit der laterobasalen Amygdala könnte beispielsweise über eine situationsentsprechende Hemmung des Outputs der Pyramidenzellen durch differentiell aktive inhibitorische Netzwerke erfolgen. Eine differentielle Aktivierung kann z. B. über unterschiedliche Rezeptorausstattungen, wie es in der Subpopulation der NPY–Neurone in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen wurde, erfolgen. Das erhöhte angstähnliche Verhalten der 5-Htt KO-Mäuse nach wiederholtem Stress könnte mit der Unfähigkeit zusammenhängen, in entsprechenden Situationen durch Neubildung von Dornen zu reagieren, da die Dornendichte bei diesen Tieren schon unter stressarmen Umweltbedingungen ihr Maximum erreicht hat. Sowohl Fehlfunktionen der neuronalen Plastizität als auch mögliche Fehlfunktionen der differentiellen Inhibierung der Pyramidenzellen durch Interneurone, die durch genetische Variationen und/oder Stress bedingt sein können, könnten eine „offene Tür“ repräsentieren, die zu manifesten Auffälligkeiten im Verhalten bei Tieren führt bzw. auch zur Entstehung bestimmter psychiatrischer Erkrankungen beim Menschen beiträgt. N2 - The amygdala is a heterogenous nuclear complex, which belongs to the limbic system and recieves a dense serotonergic innervation. In animals and in humans, interactions between the serotonergic system and the amygdala play a key role in emotional stimulus processing, especially for anxiety- and stress–related stimuli. Genetic variations within the serotonergic system and/or chronic stress can cause dysregulation of these mechanisms, which promote abnormal behavior and development of psychiatric disorders, respectively. Up to now, the target neurons of serotonergic neurotransmission in the amygdala, the molecular mechanisms of possible interactions and morphological consequences of dysregulation of these interactions are not investigated completely, yet. Thus, one aim of this thesis was to analyze the impact of an imbalance within the serotonergic system (serotonin transporter knock out, 5-Htt KO) and repeated social stress on neuronal morphology in the amygdala and to identify and characterize target neurons of serotonergic afferents. This will help to get a better understanding of the neuronal networks associated with emotional stimulus processing. To investigate 5-Htt genotype–dependent and stress–related neuromorphological changes, three-dimensional reconstructions of pyramidal cells and stellate interneurons of the laterobasal amygdala of male, adult wildtype (WT) and 5-HttKO mice were carried out and different morpholgical parameter were analyzed. Pyramidal cells displayed only subtle changes in dendritic complexity but a significant increase in spine density on specific dendritic compartments in stressed WT mice and naïve and stressed 5-HttKO mice, compared to naïve WT mice. In all groups, the increase in spine density was, compared to WT mice, similar. Stellate interneurons lacked detectable genotype–dependent and stress–related morphological differences. NeuropeptideY (NPY) neurons represent a unique and special interneuronal subpopulation in the laterobasal amygdala due to their anxiolytic effects in these nuclei. There is much information about the molecular effects of NPY via specific receptors and how NPY can regulate emotion–related states, especially anxiety–like behavior. However, only few indications are available, by which systems NPY neurons are modulated themselves. Since both NPY neurons in the laterobasal amygdala and the serotonergic system are involved in anxiety–regulating processes, the task of the second part of the present thesis was to investigate if these neurons were targets of the serotonergic system. Applying light and electron microscopic methods, perisomatic synaptic contacts between serotonergic afferents and NPY-immunoreactive neurons were identified in the laterobasal amygdala of rats. As the functional impact of the serotonergic innervation significantly depends on the serotonin receptor (5-HTR) equipment of the target neurons, coexpression of NPY mRNA and different 5-HTR mRNAs was studied. For this purpose, a novel variation of in situ hybridization, which allows specific coexpression analyses of NPY mRNA with low-abundant mRNAs, was developed and established. The results show that NPY mRNA–reactive neurons in the laterobasal amygdala coexpress 5-HT1A and 5-HT2C, but lack 5-HT3 mRNA. In the present thesis, detailed, new data on the impact of the serotonergic system on the laterobasal amygdala of mice and rats were obtained. The changes in dendritic spine density after repeated stress could represent neuroadaptive or compensatory mechanisms of these neurons, which enable WT mice to adapt to negative environmental changes. The increase in dendritic spine density could stand for the formation of an “emotional memory“ facilitating quick and flexible behavioral reactions upon re-appearing danger. This modulation of the laterobasal amygdala´s excitability could occur, for instance, via a specific inhibition of pyramidal output by differentially activated inhibitory networks. Such a differential activation can result from a variable receptor equipment, as shown for NPY neurons in the laterobasal amygdala in the present thesis. The increased anxiety–like behavior of 5-HttKO mice after repeated social stress could be due to the unability of these mice to further increase spine density in corresponding situations, since spine density already reached the maximum level in a low-stress environment. Both dysfunction of neuronal plasticity and possible dysfunction of the differential inhibition of pyramidal cells via interneurons presumably caused by genetic variations and/or stressful life events could represent an “open door“ facilitating abnormal behavior in animals or development of certain psychiatric disorders in humans. KW - Angst KW - Neuropeptid Y KW - Stress KW - Corpus amygdaloideum KW - Serotonerge Nervenzelle KW - Amygdala KW - serotonerges System KW - Anxiety KW - stress KW - amygdala KW - serotonergic system KW - neuropeptide Y Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69494 ER - TY - THES A1 - Jentzsch, Claudia T1 - Identifizierung und Charakterisierung funktionell relevanter kardialer Faktoren T1 - Identification and characterization of functionally relevant cardiac factors N2 - Die chronische Herzinsuffizienz stellt nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen weltweit dar. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht möglich die pathophysiologischen Prozesse aufzuhalten. Es wird nach neuen Strategien gesucht, hier therapeutisch eingreifen zu können. Kleine nicht-kodierende RNAs, sogenannte microRNAs (miRNAs), wurden als wichtige Faktoren bei verschiedenen Herzkrankheiten beschrieben. Die Mehrzahl der bisherigen Studien fokussierte sich dabei auf die am stärksten deregulierten miRNAs im erkrankten Herz. In einer automatisierten Analyse im 96 Well-Format untersuchten wir 230 miRNAs auf ihr Potential, in das Größenwachstum von primären Kardiomyozyten einzugreifen. Aus den miRNAs mit den größten Effekten selektierten wir diejenigen, die eine hohe endogene Expression aufwiesen, und unterzogen sie einem Validierungsprozess. Hier konnten wir die Effekte aller pro- (miR-22, miR-30c, miR-30d, miR-212, miR-365) und anti-hypertrophen (miR-27a, miR-27b, miR-133a) miRNAs bestätigen. Die Mehrzahl dieser miRNAs wurde hiermit erstmalig beschrieben, dass sie eine wichtige Rolle beim Größenwachstum von Kardiomyozyten spielen. Sie wären daher interessante Kandidaten für detaillierte funktionelle Studien mit dem Ziel ihr therapeutisches Potential zu evaluieren. In einem früheren genetischen Screen zur Identifizierung von kardialen, sezernierten Faktoren wurde der Protease Inhibitor 16 (PI16) entdeckt, der sich im insuffizienten Herz durch eine starke Akkumulation auszeichnet. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war es, eine Mauslinie zu generieren, in der PI16 global oder konditionell mit Hilfe des Cre/LoxP-Systems ausgeschaltet werden kann. Nach Elektroporation des Pi16floxneo Targeting Vektors in embryonale Stammzellen und Blastozysteninjektion erhielten wir eine Mauslinie, die Träger der zielgerichteten Modifikation des Pi16 Allels war. Mit der globalen genetischen Deletion des LoxP-flankierten Abschnitts von Exon 3 bis 4 konnten wir die Expression des Pi16 Gens komplett unterbinden. Die PI16 Defizienz führte weder im Herz noch in anderen Organen per se zu pathologischen Veränderungen. Zudem war unbekannt, dass PI16 in der gesunden Maus in der kardialen Fibroblastenfraktion enthalten sowie in den Zilien der Epididymis und der Trachea und im Lumen der Schilddrüse lokalisiert ist. Im insuffizienten Herz bestätigten wir eine Akkumulation von PI16, die sich vor allem auf die fibrotischen Bereiche beschränkte. Das lässt Grund zur Annahme, dass die kardiale Funktion von PI16 erst dann offensichtlich wird, wenn man die defizienten Mäuse zukünftig entsprechenden Stressmodellen aussetzt. Das wird zu einem umfassenden Verständnis der kardialen Funktion von PI16 und dessen Potential als therapeutisches Zielmolekül führen. N2 - Chronic heart failure is one of the main causes of death worldwide. Although the pathophysiological processes have been intensely studied within the past they are still detrimental. New therapeutic interventions have to be identified to interfere with these processes. Small non-coding RNAs, so-called microRNAs (miRNAs), have been described to be important factors in several cardiac diseases. The majority of these studies focussed on miRNAs that are deregulated under disease conditions. In an unbiased screening approach we investigated 230 miRNAs for their potential to either promote or inhibit hypertrophy of primary cardiomyocytes. Using an automated system and a 96 well format we identified several miRNAs with strong effects on hypertrophic growth. From these we selected five pro- (miR-22, miR-30c, miR-30d, miR-212, miR-365) and three anti-hypertrophic (miR-27a, miR-27b, miR-133a) miRNAs for validation experiments, all of which displayed strong expression. All of these selected miRNAs could be confirmed in independent validation experiments with the majority not yet been described to be involved in cardiomyocyte hypertrophy. Detailed analysis of these candidate miRNAs will provide insights into the understanding of cardiac hypertrophy and their therapeutic potential for treatment of cardiac disease. In a previous study that used a genetic yeast screen to identify cardiac secreted factors we had identified Protease Inhibitor 16 (PI16) that is strongly accumulating in failing myocardium. In the second part of this work we generated a mouse line where PI16 expression can be deleted globally or conditionally using the Cre/LoxP recombination system. After electroporation of the Pi16floxneo targeting vector in embryonic stem cells and successful injection into murine blastocysts we gained a mouse line that carried the targeted modification of the Pi16 allele. Upon global deletion of the floxed region from Exon 3 to 4 we could completely delete PI16 expression. PI16 deficiency per se led to a phenoytpe neither in the heart nor in other organs of these mice. Furthermore it was unknown that PI16 localizes to cardiac fibroblasts, the cilia of the epididymis and trachea as well as to the lumen of the thyroid gland in healthy tissue. In the failing heart we could confirm accumulation of PI16 preferentially in fibrotic areas. Therefore we assume that PI16s function could only become obvious as soon as one applies respective cardiac stress models. Applying such models will contribute to a broader understanding of the function of PI16 and its potential as a therapeutic target molecule. KW - miRNS KW - Herzhypertrophie KW - Sezernierte Faktoren KW - miRNA KW - cardiac hypertrophy KW - secreted factors Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66699 ER - TY - THES A1 - Hintzsche, Henning T1 - Gentoxizität nichtionisierender Strahlung - Auswirkungen von Mobilfunk- und Terahertzstrahlung auf das Genom T1 - Genotoxicity of non-ionizing radiation - Effects of mobile phone and terahertz radiation on the genome N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob nichtionisierende elektromagnetische Strahlung verschiedener Frequenzbereiche Genomschaden hervorrufen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Biomonitoring-Studie zu dieser Thematik konzipiert und durchgeführt. Es wurden 131 Probanden detailliert zu ihrer Mobilfunknutzung befragt. Anschließend wurden Mundschleimhautzellen entnommen und für eine mikroskopische Untersuchung aufbereitet und angefärbt. In den Zellen wurden Mikrokerne und andere Kernanomalien quantifiziert. Es zeigte sich keine Erhöhung der Mikrokernfrequenz in Abhängigkeit von der Dauer der Mobiltelefonnutzung. Auch die anderen abgefragten Parameter hatten keinen Einfluss auf die Höhe des Genomschadens. Als Positivkontrollen wurden vier Patienten, die eine lokale Strahlentherapie (ionisierende Strahlung) erhielten, eingeschlossen. Hier zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Mikrokernfrequenz. Um festzustellen, ob die Mikrokerninduktion erst bei höheren Leistungsflussdichten als denen, die beim Mobilfunk verwendet werden, auftritt, wurden in-vitro-Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Zelllinien einer Strahlung von 900 MHz ausgesetzt wurden. Nach Exposition und einer Postinkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und die Mikrokernfrequenz bestimmt. Neben den Leistungen wurden hier auch die Expositionszeiten und die Postinkubationsperioden variiert. In keinem Fall konnte eine Erhöhung der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Insgesamt konnte ein Einfluss elektromagnetischer Strahlung auf das Genom weder am Menschen im Rahmen einer Biomonitoring-Studie noch an verschiedenen Zelllinien im Rahmen von in-vitro-Versuchen festgestellt werden. Terahertzstrahlung ist elektromagnetische Strahlung im Bereich von 0,1 bis 10 THz, d. h. sie liegt zwischen Mikrowellen und Infrarotlicht. Derzeit wird sie hauptsächlich für spektroskopische Untersuchungen und zur Qualitätskontrolle im Herstellungs-prozess verschiedener Produkte verwendet. Anwendungen in der Sicherheitstechnik (z. B. Ganzkörperscanner) und in der Medizintechnik (z. B. Bildgebung) stehen kurz vor der Markteinführung bzw. sind bereits etabliert. Diese Anwendungen bringen eine Exposition der betroffenen Menschen mit sich. Außerdem wird an weiteren Techniken wie etwa der Datenübertragung gearbeitet. Die Wirkungen auf biologische Systeme sind im Gegensatz zum Mobilfunkbereich bisher nur unzureichend untersucht. Da bisher keine vollständigen Literaturübersichten vorlagen, wurde eine umfassende Literaturrecherche durchgeführt. Ziel war es, alle bisher durchgeführten Studien zu diesem Thema aufzulisten. Um diese Datenbasis zu verbreitern wurden in-vitro-Versuche bei verschiedenen Frequenzen durchgeführt. Als Strahlungsquellen wurden eine Frequenzvervielfacherkaskade (0,106 THz), ein Rückwärtswellen-Oszillator (0,380 THz) und ein Ferninfrarot-Laser (2,520 THz) eingesetzt. Die Strahlung wurde in einen modifizierten Inkubator geführt, so dass die Expositionen bei definierter Temperatur und konstantem CO2-Gehalt durchgeführt werden konnten. Da Terahertzstrahlung durch Wasser sehr stark absorbiert wird, sind bei einer Exposition des Menschen primär die obersten Hautschichten betroffen. Aus diesem Grund wurden primäre Hautfibroblasten und HaCaT-Zellen, eine Keratinozyten-Zelllinie, als biologische Systeme verwendet. Die Zellen wurden für unterschiedliche Zeitperioden mit verschiedenen Leistungsflussdichten exponiert. Anschließend wurden die Zellen für den Comet Assay aufbereitet und analysiert. Der Comet Assay ist eine Methode zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA. Weiterhin wurden die Zellen nach einer Postinkubationsperiode für den Mikrokerntest aufbereitet. Neben unbehandelten Kontrollen und Sham-Expositionen wurden auch Positivkontrollen durchgeführt. Es konnte keine Erhöhung der Anzahl der DNA-Strangbrüche bzw. der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Da bekannt war, dass im Mobilfunkbereich unter bestimmten Bedingungen Störungen der Mitose, nicht aber Erhöhungen der Mikrokernfrequenz, auftreten, wurden Mitosestörungen nach Exposition bei 0,106 THz untersucht. Hierzu wurden AL-Zellen für 30 Minuten exponiert und anschließend ohne Postinkubation direkt fixiert. Analysiert wurden Störungen in allen Phasen der Mitose. Es zeigte sich, dass die Frequenz der Störungen in der Pro- und Metaphase unverändert blieb. Die Störungen in der Ana- und Telophase nahmen dagegen mit steigender Leistungsflussdichte zu. Insgesamt konnte im Terahertzbereich unter den gewählten Expositionsbedingungen kein DNA-Schaden beobachtet werden. Bei 0,106 THz konnten Mitosestörungen als Folge der Exposition gezeigt werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Mitosestörungen und DNA-Schäden, insbesondere der Mikrokerninduktion, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden und bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen. N2 - The aim of the present study was to investigate whether non-ionizing radiation of different frequencies can cause genomic damage. Within the course of the present work, a biomonitoring study was designed and performed. 131 participants were interviewed and asked for their mobile phone use customs. Subsequently buccal mucosa cells were retrieved, prepared and stained for microscopy analysis. Micronuclei and other nuclear anomalies indicating genomic damage were quantified. No increase in micronucleus frequency depending on mobile phone use or other retrieved parameters were observed. Four patients receiving radiation therapy (ionizing radiation) were included as positive controls. A clear increase in micronucleus frequency was observed here. To determine whether micronucleus induction only occurs at higher power densities, in vitro investigations with different cell lines exposed to 900 MHz radiation were carried out. After exposition and post-incubation, cells were fixed and the micronucleus frequency was determined. Besides power density also exposition times and post-incubation periods were varied. In no case an increase in micronucleus frequency could be observed. 7. Summary 108 All in all, no influence of electromagnetic radiation on the genome could be observed, neither on humans in the biomonitoring study nor on cell lines in the in vitro study. Terahertz radiation is electromagnetic radiation in the range from 0.1 to 10 THz, i. e. between microwaves and infrared light. Currently it is used in spectroscopy and for quality control procedures in manufacturing processes. Application in security technology (e. g. full body scanners) and medical technology (e. g. medical imaging) have recently been established or are about to enter the market. These applications also involve exposure of humans. Furthermore, other technologies such as data transfer are being developed. So far the effects on biological systems of this frequency range are investigated only insufficiently. A thorough literature search was conducted because no comprehensive literature review was available. The aim was to completely list all available studies on this topic. To enlarge this data basis, in vitro studies at different frequencies were conducted. Radiation sources were a frequency multiplier chain (0.106 THz), a backward wave oscillator (0.380 THz) and a far infrared laser (2.520 THz). The radiation beam was led into a modified incubator in order to perform expositions under controlled temperature and CO2 concentration conditions. Terahertz radiation is strongly absorbed by water, thus in case of exposure of humans the skin will be affected primarily. This is the reason why primary dermal fibroblasts and HaCaT cells, a keratinocyte cell line, were used as biological systems. The cells were exposed to different power densities for different time periods. Subsequently cells were prepared and analyzed using the comet assay which quantifies DNA single and double strand breaks. Also, after a post-incubation period cells were prepared for the micronucleus test. Besides untreated controls and sham expositions also positive controls were 7. Summary 109 performed. No induction of DNA damage, neither as strand breaks nor as micronucleus frequency elevation, was observed. Because it was known that under certain experimental conditions mitotic disturbances but not micronucleus formation occur after exposition to mobile phone radiation, these mitotic disturbances were analyzed after terahertz exposition. AL cells were exposed for 30 minutes with 0.106 THz and fixed directly after the exposition. All phases of mitosis were analyzed, but it turned out that primarily ana- and telophase were affected. These disturbances increased with increasing power density. All in all, no DNA damage could be observed under the applied experimental conditions. After exposition to 0.106 THz mitotic disturbances occurred in AL cells. The link between these mitotic disturbances and the DNA damage, particularly the micronucleus formation, could not be resolved completely and remains subject of further investigations. KW - Mutagenität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Terahertzbereich KW - Mobiles Endgerät KW - Gentoxizität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Terahertzstrahlung KW - Mobilfunkstrahlung KW - Angewandte Toxikologie KW - genotoxicity KW - non-ionizing radiation KW - terahertz radiation KW - mobil phone radiation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57684 ER - TY - THES A1 - Gassert, Evelyn T1 - Die Bedeutung von Ceramiden für die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung T1 - Impact of ceramide accumulation on T lymphocyte cytoskeletal reorganisation,immune synapse formation and activation N2 - Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zelluläre Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden für die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adhärenz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeinträchtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilität ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberflächenmolekülen und intrazellulärer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gestört. Überdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabhängige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandomänen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalität der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeinträchtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschränkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfläche mit DCs zu translozieren. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen möglichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeinträchtigen. N2 - Ceramides are sphingolipids regulating various signalling pathways mainly associated with the induction of apoptosis and cell cycle arrest. Besides their established role in these processes several lines of evidence suggest that ceramides also regulate cytoskeletal dynamics in non-hematopoietic cells, but their role in T lymphocyte function has not yet been addressed. In this study we show that accumulation of membrane ceramides affects several processes required for accurate T cell function. Treatment of T cells with bSMase or exogenously added ceramides interfered with T cell adhesion to FN and ICAM-1 as well as T cell polarisation, chemotaxis and motility in response to SDF-1. In line with the impairment to morphologically polarise, relocation of surface receptors as well as intracellular signalling molecules was also impaired upon ceramide treatment of T cells. Moreover, increase in cellular ceramide levels interfered with cellular signalling pathways as revealed by reduced phosphorylation levels of Akt and ERM proteins. T cell activation requires the formation of an IS with DCs. In this study we could show, that ceramides, although excluded from the DC/T cell interface, do not interfere with conjugate frequency or synapse organisation, since a normal distribution of CD3 and the MTOC was observed. Nevertheless, ceramide generation interfered with the translocation of Orai1 and Stim1 to the interface and in line with this observation a reduced calcium-influx in T cells was detected upon bSMase exposure. In addition to the decrease in cytosolic calcium levels ceramides also reduced the ability of T cells to proliferate in response to CD3/CD28 stimulation. Therefore the induction of ceramides by certain pathogens, including MV, might be a possible mechanism to interfere with essential processes required for T cell activation. KW - Ceramide KW - T-Lymphozyt KW - T-Zell-Aktivierung KW - Zytoskelettreorganisation KW - immunologische Synapse KW - Masernvirus KW - ceramide KW - T cell activation KW - cytoskeletal reorganisation KW - immunological synapse KW - measles virus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123 ER - TY - THES A1 - Götz, Andreas T1 - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus T1 - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism N2 - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus. N2 - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells. KW - Escherichia coli KW - Intrazellulärraum KW - Salmonella typhimurium KW - Vermehrung KW - Kohlenstoffstoffwechsel KW - Salmonella KW - Salmonella enterica KW - Salmonella typhimurium KW - Salmonellose KW - Escherichia coli KW - Shigella KW - Infektion KW - Bakterielle Infektion KW - sifA KW - enteroinvasive KW - CaCo-2 cell KW - 13C-isotopologue profiling KW - microinjection Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292 ER - TY - THES A1 - Heinze, Britta T1 - Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen Pneumoviren in einem in vivo Modell T1 - Characterization of the innate immune response against pneumoviruses in an in vivo model N2 - In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte. N2 - In this thesis the PVM mouse model was used to unveil the role of type I and type III interferone response for the pathogenesis of pneumoviral infection. First, recombinant PVM dNS-mutants with single or combined deletions of the NS-genes were generated and replication efficiency characterization was analyzed in interferon-competent cells as well as in interferon-incompetent cells. A major point was to elucidate the NS-proteins of PVM as interferon antagonists. In interferon-competent cells the replication of rPVM dNS-mutants were significantly attenuated. These attenuation of all three rPVM dNS-mutants was almost completely reversed when interferon-incompetent cells were infected. Induction of type I and type III interferons was determined in different cell types after infection with rPVM dNS-mutants with differences in intensity of interferon induction. Thus, NS1- and NS2-proteins were clearly identified as interferon antagonists. To analyze the protective capacity of type I and type III interferons with respect to replication and pathology of PVM, mice lacking functional receptors for either or both interferons were infected with rPVM or the respective dNS-mutants. The results indicated that both type I and type III interferons which one restricted replication and pathology of PVM, with the former playing the greater role. Interestingly, the replication and virulence of wild-type PVM were completely unaffected by the presence or absence of functional receptors to type I and type III interferon, indicating that both systems are strongly suppressed during infection. However, pretreatment of mice with type I interferon were protective against lethal rPVM challenge, whereas pretreatment with type III interferon delayed but did not prevent death. Finally, the PVM-NS-proteins appeared to delay apoptosis independently of its IFN-antagonistic activity that may contribute to the limited pathogenicity of the viruses in type I/type III receptor deficient mice. In the last part type I interferon producing cells in a pneumoviral infection in vivo should be identified. It was documented that type I interferon producing cells are virusinfected cells as well as uninfected cells. Surprisingly, in vitro only few cells produced type I interferon during rPVM-GFP7 dNS1dNS2 infection. Because the commercially available interferon antibodies are not qualified for intracellular tissue staining it was not possible to identify in vivo the interferon producing cells, but by inventing a new method it was possible to verify the binding of type I interferon to the cell surface receptor of ciliated epithelial cells, alveolar macrophages and presumably Clara cells and type I and type II pneumocytes. KW - Interferon KW - RS-Virus KW - Immunreaktion KW - Lungenentzündung KW - Apoptosis KW - Tiermodell KW - Toll-like-Rezeptoren KW - PVM KW - Nichtstrukturproteine KW - IFNAR KW - Interferonrezeptor KW - PVM KW - interferon KW - IFNAR KW - receptor KW - apoptosis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56454 ER - TY - THES A1 - Puschmann, Anne-Katrin T1 - Migräne, Stress und Emotionen - Psychophysiologische und neuroimmunologische Faktoren T1 - Migraine, stress and emotions - psychophysiological and neuroimmunological correlates N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Reaktionen von Migränepatientinnen mit episodischer (EM) und häufiger Migräne (HM) auf verschiedene Aspekte des Triggerfaktors „Negativer Affekt“ wie Stress und negative Emotionen. Die Ergebnisse der beiden Gruppen wurden mit denen gesunder Kontrollpersonen verglichen (KG). Zur Ermittlung des Aufmerksamkeitsverhaltens gegenüber emotionalen Reizen wurden zwei Emotionale Stroop Tests (EST) durchgeführt. Erwartet wurde ein Aufmerksamkeitsbias der Patientinnen hinsichtlich negativer emotionaler Reize. Im EST 1 wurden allgemeine affektive Wörter der Valenzen positiv, neutral und negativ verwendet. Die Probandinnen sollten auf die Wortfarbe mit Tastendruck reagieren und den Wortinhalt ignorieren. Im EST 2 wurden emotionale Gesichtsausdrücke (ärgerlich, freundlich, neutral) als Reize verwendet. Dabei sollte die Rahmenfarbe der Bilder per Tastendruck bestimmt werden und der Inhalt ignoriert werden. Zur Auswertung wurden Emotionale Stroop Interferenzen (ESI) zum Vergleich Reaktionszeitdifferenzen negativ-neutral und negativ-positiv berechnet. Der erwartete Aufmerksamkeitsbias der HM für negative emotionale Reize wurde dabei nicht gefunden. Dafür zeigten im EST 2 die KG einen Aufmerksamkeitsbias für ärgerliche Gesichter. Ein signifikanter Gruppenunterschied in EST 2 mit sehr niedrigen, im Vergleich negativ-positiv sogar negativen ESI der HM ließ auf ein Vermeidungsverhalten dieser Gruppe ärgerlichen Gesichtern gegenüber schließen. Dieses wurde als Vermeidung negativer sozialer Reize interpretiert und zum gelernten, möglicherweise dysfunktionalen Vermeidungsverhalten von Migränepatienten potentiellen Triggersituationen gegenüber in Bezug gesetzt. Weiterhin wurden die Probandinnen mit dem „Paradigma der Öffentlichen Rede“ psychosozialem Stress ausgesetzt, indem sie vor einer Videokamera unter Beobachtung eine Rede halten sowie eine Kopfrechenaufgabe lösen sollten. Vorher und nachher wurden insgesamt vier Speichelproben zur Bestimmung des Stresshormons Kortisol genommen. Zudem wurden die Druckschmerzschwellen vor und nach dem Experimentalteil gemessen. Die erwartete Kortisolreaktion als Antwort auf die psychosoziale Stressaufgabe blieb aus. Ursache dafür kann die Stichprobenzusammensetzung mit 98% Frauen sein, deren Kortisolreaktion auf Stress durch hormonelle Schwankungen im Experiment nur unzuverlässig stimulierbar ist. Bei der Berechnung der Gesamtkortisolausschüttung über die Zeit zeigte sich im Gegensatz zu dem erwarteten erhöhten Kortisolspiegel der Migränepatientinnen ein linearer Abfall des Spiegels von KG, über EM zu HM, mit den niedrigsten Werten der HM. Diese Ergebnisse könnten auf Veränderungen der Hypophysen-Nebennieren (HHN)-Achse im Sinne eines Hypokortisolismus bei Migränepatientinnen widerspiegeln, der weiterer Klärung bedarf, z.B. durch die Bestimmung eines Kortisoltagesprofils bei Patientinnen. Eine veränderte Funktion der HHN-Achse könnte außerdem zu einer inadäquaten Reaktion auf Stresssituationen beitragen. Die bei Patientinnen ausbleibende Veränderung der Druckschmerzschwelle in Reaktion auf Stress lässt ebenfalls auf eine ungenügende Stressreaktion der Patientinnen schließen. Am Ende der Untersuchung, nach einer Entspannungsphase von 50 Minuten, wurde den Probandinnen Blut abgenommen, in dem die mRNA- und Proteinkonzentrationen ausgewählter pro- und antiinflammatorischer Zytokine bestimmt wurden. Die Analyse der Zytokinkonzentrationen mit Luminex ergab für die Proteindaten aufgrund zu geringer verwertbarer Daten kein interpretierbares Bild. Die mittels Real Time Quantitativer PCR erhaltenen mRNA-Konzentrationen spiegelten die Schmerzfreiheit der Patienten wieder, mit im Vergleich zu KG verringerten proinflammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1beta, IL-2, IL-6) und dem ebenfalls verringerten antiinflammatorischen Zytokin IL-10, sowie dem deutlich erhöhten antiinflammatorischen IL-4. Die im Vergleich zur KG überregulierten Zytokine im schmerzfreien Intervall weisen auf veränderte Regulierungsmechanismen des Immunsystems für die Schmerzmediatoren Zytokine hin. Weitere Schmerzmediatoren könnten ebenfalls verändert sein, was weiterer Klärung in nachfolgenden Studien bedarf. Alles in allem konnten verschiedene Veränderungen in den psychologischen und endokrinen Reaktionen der Migränepatientinnen auf Bestandteile des Triggers „Negativer Affekt“ sowie in der Schmerzregulierung gefunden werden, wobei die Veränderungen bei Patientinnen mit Häufiger Migräne stärker auftraten. Dies weist auf eine mögliche Rolle der einzelnen untersuchten Komponenten bei der Migränechronifizierung hin, was in weiteren Studien vertiefend untersucht werden sollte. N2 - The aim of the study was the assessment of the reactions of migraine patients with episodic or frequent migraine concerning several aspects of the psychological migraine trigger „Negative Affect“, such as stress and negative emotions. The results of the two groups were compared to those of healthy controls. To assess an attentional bias towards emotional cues two Emotional Stroop Tasks (EST) were conducted. The attentional bias towards negative emotional cues was expected to be present in migraine patients. In EST 1 general affective words (negative, neutral, positive) were used as stimuli. The task was to indicate word colour while ignoring word content. In EST 2 emotional faces (angry, neutral, happy) were used. Here, the colour of the frame had to be recognized. For analyses emotionals stroop interference indizes (ESI) were calculated to compare the reaction time differences for negative vs neutral and negative vs positive stimuli, respectively. The expected attentional bias of FM for negative emotional stimuli was not found. But, in EST 2 the controls showed this bias for angry faces. A significant group difference in EST 2 with very low, even negative ESI when comparing negative vs. positive, indicated avoidance behavior away from angry faces. This was interpreted as avoidance behaviour away from negative social stimuli, which is possibly part of the learned avoidance behavior for trigger situations migraine patients learn during their disease history. Furthermore, subjects conducted a public speech paradigm as a psychosocial stress task. Before and after the task saliva probes were collected to obtain salivary cortisol. The expected cortisol increase in response to psychosocial stress did not occur. One possible reason for the absence of the cortisol reaction is the sample of 98% women. It is known, that a stress response with an increase in salivary cortisol is difficult to obtain in women due to the hormonal cycle. The analysis of the overall cortisol secretion revealed an unexpected result: the migraine groups had lower overall cortisol than the controls, with FM displaying the lowest levels. This result could be an indicator for alterations of the HPA-Axis in terms of a hypocortisolism which requires further investigations. For example a diurnal cortisol profile of patients should be assessed. Alterations in HPA-Axis functioning could furthermore contribute to an inadequate stress reaction of migraine patients and therefore increase their vulnerability in experiencing migraine attacks in response to stressful situations. The absence of the expected changes in pressure pain thresholds in patients also points towards alterations in migraineurs´ stress response. After a relaxation period of 50 minutes after the experimental phase blood was taken from the subjects to assess alterations in pro- and antiinflammatory cytokine levels. Due to methodological problems no conclusive protein data could be obtained. The mRNA analysis revealed decreased proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-1beta, IL-2, IL-6), decreased antiinflammatory cytokine IL-10 and increased antiinflammatory cytokine IL-4. These data reflect the pain free state of the migraine subjects. Compared to the controls the cytokines of the migraineurs seem to be overregulated which points to a dysregulation of the immune system. All in all several alterations in psychological and endocrine reactions to parts of the trigger “Negative Affect” and also in pain regulation could be found in migraine patients. These alterations were stronger in patients with frequent migraine indicating a role in migraine chronification. Further studies should investigate the influence of these components more profoundly. KW - Migräne KW - Stress KW - Gefühl KW - Physiologie KW - Kopfschmerz KW - Cytokine KW - Hydrocortison KW - Aufmerksamkeit KW - Stroop-Verfahren KW - Emotionen KW - Migraine KW - stress KW - emotions KW - stroop task KW - cytokines Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55985 ER - TY - THES A1 - Rupp, Ingrid T1 - Die Gametogenese des humanpathogenen Malariaerregers Plasmodium falciparum - eine Charakterisierung von daran beteiligten Proteasen sowie die Beschreibung und Funktionsanalyse von dabei auftretenden interzellulären Gametenfilamenten T1 - Gametogenesis of the human malaria pathogen Plasmodium falciparum - the characterization of involved proteases and a description and functional analysis of gamete intercellular filaments N2 - Malaria stellt mit einer Mortalität von über einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit für den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegenüber den verfügbaren Medikamenten erhöhen mehr denn je den Druck, neue Therapiemöglichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechmücke würde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers führen. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzuklären und neue Angriffspunkte für Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der männlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien benötigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivität von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-ähnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-ähnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen für den erfolgreichen Abschluss der männlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zusätzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 näher untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte für Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci für Rekombinationsereignisse zugänglich sind. Die Ergebnisse der übrigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 für Rekombinationsereignisse unzugänglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien für PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre mögliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubulären Zellausläufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausläufer der parasitären Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abständen von beulenartigen Auswölbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausläufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die Fähigkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adhärieren. Die Filamente waren bereits fünf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 % der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfläche verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechmücke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese für diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechmücke auftreten. Möglicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden. N2 - Malaria remains the deadliest among the tropical diseases with a death toll rate of more than one million people annually. Increasing resistance of the causative organism Plasmodium spec. against available drugs heightens the need for the development of new antimalarial drugs and a vaccine. The sexual reproduction phase of this pathogen has garnered increasing attention because of the potential to prevent the transmission of the parasite from human to mosquito by blocking fertilization and following essential processes in the vertebrate host. Therefore, the identification of molecular interactions during fertilization processes is essential to elucidate the sexual replication phase in order to develop new transmission blocking strategies. The genome of P. falciparum encodes for 92 putative proteases among them only few are partly characterized, although they are considered as excellent drug targets. The data herein defines the involvement of proteases belonging to various protease classes in the exflagellation of male gametes in P. falciparum. It was shown that this essential process of male gametogenesis can be blocked by use of different protease inhibitors. The data suggests an involvement of two or more serine proteases, falcipain-like cysteine proteases, non-thermolysin-like zinc metalloproteases and aspartic proteases in microgametocyte exflagellation. Furthermore, the described data defined the localization of the cysteine protease and falcipain-blocking inhibitor bADA. This inhibitor was shown to be localized in the cytosol of trophozoites, schizonts, gametocytes at all stages of maturity and macrogametes. Additionally, the present thesis achieved first evidence about six specifically selected and largely uncharacterized proteases calpain, DPAP2, GPI8, metacaspase 2, plasmepsin 6 and PfSub3. RT-PCR-Analyses were conducted to demonstrate the existence of transcript and consequently genetically active gene loci for mixed asexual parasites and for most of the gametocyte, gamete and zygote stages. The transformation of asexual parasites with metacaspase-2- and PfSub3-knockout-constructs led to the conclusion that these proteases are non-essential during the asexual replication cycle and their gene loci are accessible to homologous recombination. Additional transformation experiments indicated both that calpain is indispensable in the asexual replication cycle and that the gene locus for Plasmepsin 6 might be inaccessible for homologous recombination. The protein expression analysis for PfSub3 was carried out by using western blot and immunofluorescence assays. The analysis suggests that this serine protease is expressed in asexual parasites as well as in non-activated and activated gametocytes. Based on the data described herein, both the morphologic description of newly discovered filaments of gametes emerging during gametogenesis and the assignment of their putative function was possible. Using immunofluorescence analysis, scanning electron microscopy and live imaging analysis of gametes it was shown that these tubular filaments are about 200 nm in diameter and exhibit a length of up to 180 µm. Furthermore, it was demonstrated that they are close-ended, actin-associated and cytoplasm-containing cell extensions of the parasite’s plasma membrane with a branched or straight appearance. The surface of filaments was associated with bulge-like structures and appeared in scanning electron microscopy partly as a beaded structure. Additionally, it was demonstrated that the sexual stage surface proteins Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 and PfCCp4 are connected with these cell extensions, whereby the lack of single proteins did not result in a complete blockade of filament formation. The most typical feature of the filaments was described: to connect several macrogametes and even gametocytes within a cell cluster. It was defined that up to nine filaments emerged from the surface of macrogametes, which were able to adhere to non-infected erythrocytes as well as to parasite-infected erythrocytes. Analysis of their formation revealed that the filaments are formed within five minutes after gametocyte activation and are able to persist on the surface of gametes for a time period of up to 12 hours. During gametogenesis, 33 to more than 70 % of macrogametes exhibited the described filaments. It was possible to demonstrate the active retraction of a filament formed by a macrogamete as well as the generation of a filament in the mosquito midgut. Due to these findings a putative function was assigned. Thus, it can be suggested that the filaments likely form during gametogenesis in the mosquito midgut due to their adhesive properties in order to locate and collect other sexual stages. It might be possible that the filaments are used as a tool of vital gametes to enhance fertilization in the vertebrate host. KW - Plasmodium falciparum KW - Gametogenese KW - Proteasen KW - Serinprotease KW - Aspartatprotease KW - Metalloprotease KW - Proteaseinhibitor KW - Nanotubes KW - Zellfilamente KW - Malaria tropica KW - Malaria KW - Cysteinproteasen KW - serine protease KW - aspartic protease KW - metallo protease KW - protease inhibitor KW - nanotubes KW - cell filaments Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47830 ER - TY - THES A1 - Nuber, Susanne T1 - ß-Arrestin/Rezeptor-Interaktionen - Ein endogenes "Werkzeug" ligandenspezifischer Signaltransduktion T1 - ß-Arrestin/receptor-interactions - An endogenous "tool" of ligand-specific signal transduction N2 - Die Bedeutung der β-Arrestine als multifunktionelle Adapterproteine GPCR-vermittelter Signaltransduktion hat in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. In der vorliegenden Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der molekularen Basis und der Ligandenabhängigkeit sowohl der β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion als auch β-Arrestin- (un-)abhängiger Signaltransduktionsmechanismen. Im ersten Teil wurde der Einfluß potentieller Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des β2AR bzw. im C-Terminus und der TM3 des P2Y1R auf die agonisteninduzierte β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, Internalisierung und Desensibilisierung untersucht. Durch Mutationsanalysen konnten Ser 352/Thr 358 im distalen C-Terminus des P2Y1R als Schlüsselstellen der β-Arrestin-Translokation und Internalisierung identifiziert werden, während ein oder mehrere Phosphorylierungsstellen im proximalen P2Y1R C-Terminus die molekulare Grundlage der Rezeptordesensibilisierung darstellen. Darüber hinaus machte die Anwendung verschiedener PKC- oder CaMK-Inhibitoren sowie der Einsatz des PKC-Aktivators PMA deutlich, dass die P2Y1R-Desensibilisierung und β-Arrestin-Translokation durch unterschiedliche Kinasen kontrolliert werden. Zudem konnte mit Hilfe der FRET-Technik gezeigt werden, dass die Phosphorylierungsstellen zwischen den Positionen 355 und 364 im proximalen β2AR C-Terminus essentielle Bereiche der β-Arrestin-Translokation darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Agonisten am β2-adrenergen Rezeptor bzw. dem P2Y2R auf ihre Fähigkeit hin untersucht verschiedene mit dem jeweiligen Rezeptor verknüpfte G-Protein- bzw. β-Arrestin-Funktionen in unterschiedlichem Ausmaß zu aktivieren („biased agonism“). Da eine solche ligandenselektive Aktivierung rezeptorvermittelter Signalwege bis dato nur mit synthetischen Liganden detailliert untersucht wurde, galt das besondere Interesse der Analyse der durch die endogenen Substanzen induzierten Signalmuster. Die Betrachtung der Noradrenalin- bzw. Adrenalin-induzierten β-Arrestin/Rezeptor-Interaktion, β-Arrestin2-Translokation, Rezeptorinternalisierung, G-Protein-Aktivierung sowie cAMP-Produktion am β2AR machte deutlich, dass es sich beim Phänomen des „biased agonism“ um einen endogenen Mechanismus handelt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch zur Tokolyse eingesetzte β2AR-Agonisten spezifische Signalmuster induzieren. Die Beobachtung, dass UTP und ATP sowohl unterschiedliche β-Arrestin1/2-Translokationsals auch ERK-Aktivierungsmuster am P2Y2R induzieren bestärkte das Konzept des „biased agonism“ als endogenes Phänomen. Das ligandenabhängige β-Arrestin-Translokationsverhalten des P2Y2R ließ zudem die agonistenbedingte Zuteilung des Rezeptors zu den „Klasse A“ oder „Klasse B“ Rezeptoren zu. Die detaillierte Untersuchung agonisteninduzierter Rezeptor/Effektor-Interaktionen und Signalmuster dürfte helfen die Anwendung klinisch relevanter Substanzen zu optimieren. N2 - In recent years, the significance of β-arrestins as multifunctional adapter proteins of GPCR mediated signal transduction has steadily been increasing. In this thesis the main focus is to research the molecular basis and the ligand dependence of the β-arrestin recruitment as well as β-arrestin-(in-)dependent signal transduction mechanisms. In the first part, the influence of potential phosphorylation sites in the C-terminus of the β2AR or the C-terminus and the TM3 of the P2Y1R, respectively, on the agonist-induced β-arrestin2/receptor-interaction, receptor internalization and desensitization was examined. Using mutation analysis, Ser 352 and Thr 358 were identified as key points of the β-arrestin2 translocation and receptor internalization in the distal C-terminus of the P2Y1R. In contrast, one or more phosphorylation sites in the proximal P2Y1R C-terminus represent the molecular basis of receptor desensitization. In addition, the use of different PKC- or CaMK inhibitors and the application of the PKC activator PMA made it clear that the P2Y1R desensitization and β-arrestin translocation are controlled by different kinases. Using the FRET technique we were able to show that the phosphorylation sites between position 355 and 364 in the proximal C-terminus of the β2AR represent essential areas of the β-arrestin2 translocation. In the second part of the study at hand, agonists of the β2AR or the P2Y2R were examined with respect to their ability to activate distinct receptor associated G-protein or β-arrestin functions to varying degrees (“biased agonism”). Since this kind of ligandselective activation of receptor-mediated signaling pathways has only been studied in detail with synthetic ligands to this day, special interest in the analysis of the signaling pattern induced by the endogenous substances was taken. The analysis of norepinephrine- or epinephrine-induced β-arrestin/receptor interaction, β-arrestin translocation, receptor internalization, G-protein activation and cAMP production at the β2AR made clear that “biased agonism” is an endogenous phenomenon. Moreover, it has also been shown that β2AR agonists used for tocolysis induced a specific signaling pattern. The observation that UTP and ATP both induce different β-arrestin translocation as well as ERK activation patterns at the P2Y2R confirmed the concept of “biased agonism” as an endogenous phenomenon. The ligand dependent β-arrestin behavior of the P2Y2R also allowed the allocation of the receptor to the “class A” or “class B” receptors depending on the agonist used for stimulation. The detailed testing of agonist induced receptor/effector interactions and signaling pattern could help to optimize the application of clinically relevant substances. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Adaptorproteine KW - Beta-Rezeptor KW - Noradrenalin KW - Adrenalin KW - Purinozeptor KW - ADP KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Konfokale Mikroskopie KW - biased agonism KW - functional selectivity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53188 ER - TY - THES A1 - Börner, Juliane T1 - Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor für das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie T1 - Characterization of the phosphorylation sites of Guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, by mass spectrometry application N2 - Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekundären Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erhöht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-überexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Domäne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten übereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem stärker ausgeprägt war als bei der ANP-abhängigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivität und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivität des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle trägt zum Verständnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zusätzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen möglich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben können. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP), via its guanylyl cyclase A (GC-A) receptor and intracellular guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate production, is critically involved in the regulation of blood pressure. In patients with chronic heart failure, the plasma levels of ANP are increased, but the cardiovascular actions are severely blunted, indicating a receptor or postreceptor defect. Studies on metabolically labelled GC-A-overexpressing cells have indicated that GC-A is extensively phosphorylated, and that ANP induced homologous desensitisation of GC-A correlates with receptor dephosphorylation, a mechanism which might contribute to a loss of function in vivo. In this study, tandem MS analysis of the GC-A receptor, expressed in the human embryonic kidney cell line HEK 293, revealed that the intracellular domain of the receptor is phosphorylated at multiple residues: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 and Thr513. MS quantification based on multiple reaction monitoring demonstrated that ANP-provoked homologous desensitisation was accompanied by a complex pattern of receptor phosphorylation and dephosphorylation. The population of completely phosphorylated GC-A was diminished which is in agreement with published data. However, the phosphorylation of GC-A at Ser487 was selectively enhanced after exposure to ANP. In contrast, the Angiotensin II-provoked heterologous desensitisation resulted in a complete reduction of phosphorylation, which was even more intensive than after ANP-dependend desensitisation. The functional relevance of the newly identified phosphorylation site at serin 487 was analysed by site-directed mutagenesis. The substitution of Ser487 by alanine which mimics dephosphorylation resulted in a receptor which could be activated and desensitised like the GC-A wild-type receptor. However, the substitution by glutamate (which mimics phosphorylation) blunted the activation of the GC-A receptor by ANP, but prevented further desensitisation. These data corroborate previous studies suggesting that the responsiveness of GC-A to ANP is regulated by phosphorylation. However, in addition to the dephosphorylation of the previously postulated sites (Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510), homologous desensitisation seems to involve the phosphorylation of GC-A at Ser487. Identification and characterisation of this phosphorylation site therefore contribute to the understanding of homologous desensitisation. Additionally, some of the detected phosphorylated residues were detected in cells endogenously expressing the GC-A receptor. Therefore future analyses of the mechanisms which are involved in the activation and desensitisation under pathophysiological conditions might be possible. KW - Guanylatcyclase KW - Phosphorylierung KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Massenspektrometrie KW - Guanylyl cyclase A KW - phosphorylation sites KW - atrial natriuretic peptide KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914 ER - TY - THES A1 - von Hayn, Kathrin T1 - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten T1 - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells N2 - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden. N2 - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 μM free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells. KW - Glatte Muskulatur KW - Cyclo-AMP KW - Calcium KW - Calcium KW - cAMP KW - vaskuläre glatte Muskelzellen KW - FRET KW - calcium KW - cAMP KW - vascular smooth muscle cells KW - FRET Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1 T1 - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1 N2 - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR. N2 - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2. KW - Parathormon KW - Proteolyse KW - Endokrinologie KW - Calcium KW - Rezeptor KW - Retinales S-Antigen KW - GPCR KW - Matrix-Metalloprotease KW - NHERF KW - Signaltransduktion KW - G-Protein KW - GPCR KW - Matrix-Metalloproteinase KW - NHERF KW - signal transduction KW - G-protein Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288 ER - TY - THES A1 - Werthmann, Ruth T1 - Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abhängigen Änderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen T1 - Real-time monitoring of thrombin-dependent changes of the cAMP concentration in living endothelial cells N2 - Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes. N2 - Endothelial cells form a semi permeable barrier between blood and interstitial tissues. The permeability of this barrier is mainly regulated by the second messengers Ca2+ and cAMP. While Ca2+ increases the permeability by inducing cell contraction, cAMP increases the adherence of the cells and, thereby, supports the barrier function. The Ca2+-elevating agent thrombin was demonstrated to increase endothelial permeability and to decrease cAMP levels. The aim of this thesis was to investigate thrombin-induced changes of the cAMP concentration in real time in living endothelial cells via fluorescence resonance energy transfer (FRET). Therefore, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were transfected with the FRET-based cAMP sensor Epac1-camps. Binding of cAMP to the binding domain of Epac1-camps induces a conformational change of the sensor that results in a decrease of FRET. With help of this sensor, changes in cAMP concentration can be monitored with high temporal resolution. First, the influence of thrombin on cAMP levels was investigated after elevating cAMP levels by stimulation of β-adrenergic receptors. Thrombin led to a Ca2+-dependent decrease of cAMP levels by approximately 30 %. The decrease of cAMP levels was delayed compared to the thrombin-induced Ca2+ signal. This decrease was also transient and reached a minimum value 30 s after thrombin stimulation. A siRNA-mediated downregulation of the Ca2+-inhibited adenylyl cyclase 6 (AC6) completely abolished the thrombin-induced decrease of cAMP concentration. This provided the first direct evidence that the Ca2+-mediated inhibition of AC6 accounts for the thrombin-induced decrease in cAMP levels. In the absence of a β-adrenergic-mediated increase of cAMP concentration, thrombin led to a slow increase in cAMP concentration that lasted for several minutes. This increase in cAMP concentration was caused by the Ca2+-dependent activation of phospholipase A2 (PLA2). PLA2 releases arachidonic acid, which represents the substrate for prostaglandin synthesis. It was confirmed by pharmacological interference of cyclooxygenases and prostacyclin receptors that the synthesis of prostacyclin and subsequent stimulation of Gs-protein-coupled prostacyclin receptors caused the thrombin-induced increase in cAMP concentration. The real time monitoring of changes in cAMP concentration in endothelial cells within the vascular system is highly important as the physiology of endothelial cells in vivo is strongly influenced by factors contained in the surrounding blood or tissue. Therefore, a further aim of this thesis was the generation of transgenic mice expressing the FRET-based sensor Epac1-camps specifically in endothelial cells. Using a Cre-recombinase/loxP-approach transgenic mice were generated that specifically expressed Epac1-camps in endothelial cells, and the functionality of the transgenic sensor was proven in isolated pulmonary endothelial cells. Real time monitoring of thrombin-induced changes of cAMP concentration in endothelial cells revealed a temporally complex crosstalk between Ca2+ and cAMP signals that will affect endothelial barrier function. The transgenic expression of Epac1-camps opens the door for the investigation of thrombin-induced changes of cAMP levels and of endothelial permeability within intact vessels. KW - Cyclo-AMP KW - Endothelzelle KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombin KW - cyclo-AMP KW - endothelial cells KW - fluorescence resonance energy transfer KW - thrombin Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066 ER - TY - THES A1 - Dorsch, Sandra T1 - Rezeptor-Rezeptor-Interaktion ß-adrenerger Rezeptoren T1 - Receptor-Receptor Interaction of ß-adrenergic Receptors N2 - Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden. N2 - Many membrane receptors exist as disulfide-bond dimers. In these cases dimerization is methodological clearly and easily provable. However, for most G-protein coupled receptors the postulated existence of di- or oligomerization nor their function is definitely demonstrated. Mostly, methods like co-immunoprecipitation and resonance energy transfer techniques like BRET and FRET were used to investigate protein-protein interactions. Despite their high sensitivity these methods have some limits and reveal sometimes distinct results regarding the occurrence of a protein-protein interaction depending on experimental approach and use of different controls. Neither the stability of the interaction nor the fraction of interacting proteins are determinable using resonance energy transfer assays. Furthermore the size of complexes is not or only technically difficult determinable. Therefore in this work a novel independent approach was developed to allow a more detailed investigation of receptor-receptor interactions in living cells. This method based on fluorescence recovery after photobleaching microscopy allows to determine the mobility of proteins. In order to measure homo-interactions between proteins two protein fractions with different mobility have to be distinguishable. Therefore one receptor fraction was extracellularly tagged with YFP and specifically immobilized using polyclonal antibodies against YFP. The other receptor fraction was intracellularly labeled with CFP or Cerulean and therefore not recognized by the extracellular antibodies. In this way using dual-color FRAP potential interactions between immobilized extracellularly-tagged receptors and intracellularly-tagged receptors were detectable due to a change of mobility of the latter. This method was validated using monomeric (CD86) and covalent dimeric (CD28) receptors. A specific immobilization of extracellularly-tagged proteins was achievable only by using polyclonal but not monoclonal antibodies against YFP. Intracellularly tagged proteins were not influenced in their mobility by extracellular antibodies. After immobilization of the extracellularly-labeled CD86 the coexpressed intracellularly-tagged CD86-CFP was still fully mobile. Furthermore the monomeric CD86 showed a relative CFP–YFP expression ratio independent mobility. This result led to the conclusion that extra- and intracellularly labeled CD86 did not interact with each other and exist as a monomer. The mobility of the covalent dimer CD28 however was depending on the relative CFP-YFP expression ratio and was in good agreement with theoretically expected values for a dimer. The application of the dual-color FRAP approach for the investigation of interactions between ß1- and ß2-adrenergic receptors showed differences between both receptor subtypes. ß1-AR exhibited a specific transient interaction, however ß2-AR existed as stable higher order oligomers. The transient interaction between ß1-AR and the stable higher order oligomerization of ß2-AR were not only observed in HEK 293T cells but also in neonatal rat cardiac myocytes and at 37°C. Furthermore the activation state of the respective receptor had no influence on the extent of the interaction. Between ß1- and ß2-AR only a weak and unstable hetero-interaction was observed using the dual-color FRAP approach. In order to control if a direct interaction between the adrenergic receptors is occurring the BRET method was applied. Using BRET a direct interaction between ß2-AR was observed, but it was not possible to distinguish between dimers and higher order oligomers. For ß1-AR a specific energy transfer occurred at higher YFP-Rluc expression ratios. At lower expression ratios the signal was in the unspecific range. Also the investigation of hetero-interactions between ß1- and ß2-AR revealed no clear conclusion about a specific interaction between both receptor subtypes. KW - Dimerisierung KW - FRAP KW - GPCR KW - ß-adrenerge Rezeptoren KW - BRET KW - FRAP KW - GPCR KW - ß-adrenergic Receptors KW - BRET Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39712 ER -