TY - THES A1 - Reimann, Hauke T1 - Schicksal von Mikrokernen bzw. mikrokernhaltigen Zellen und Bedeutung von Mikrokernen als Biomarker T1 - Fate of micronuclei and micronucleated cells along with relevance of micronuclei as biomarker N2 - Mikrokerne sind als wichtiger Biomarker in der Gentoxizitätsforschung seit langer Zeit etabliert und ihre Bildung ist mechanistisch gut verstanden, wohingegen das Mikrokernschicksal und die genaue Funktion von Mikrokernen in der Kanzerogenese unzureichend erforscht sind. Um das Schicksal von Mikrokernen und mikrokernhaltigen Zellen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, wurden HeLa-Zellen, die mit einem GFP-markierten Histon H2B transfiziert worden sind, mittels Lebendzellmikroskopie nach Behandlung mit verschiedenen gentoxischen Agenzien für 96 h untersucht. Parameter wie die Mitose- oder Zelltodrate wurden dabei ebenso wie das Schicksal der Mikrokerne dokumentiert. Während Persistenz und Reinkorporation von Mikrokernen häufig beobachtet wurden, waren Degradation und Auswurf von Mikrokernen selten bis gar nicht zu sehen. Auch konnte ein Teil der mikrokernhaltigen Zellen über mehrere Zellteilungen persistieren und proliferieren, wodurch die in Mikrokernen manifestierte chromosomale Instabilität unverändert bleiben kann. Ein eindeutiger Substanzeinfluss auf das Mikrokernschicksal konnte nicht ausgemacht werden. Extrusion sollte weiterhin durch Behandlung mit Hydroxyurea oder Cytochalasin B in Kombination mit gentoxischer Behandlung induziert werden, es wurde jedoch kein Effekt auf die Extrusionsrate beobachtet. Degradation wurde mittels γH2AX-Antikörperfärbung und transduziertem dsRed-markierten Autophagiemarker LC3B in HeLa-H2B-GFP-Zellen untersucht. Trotz erhöhter DNA-Degradation in Mikrokernen wurde nur selten eine Ko-Lokalisierung mit LC3B beobachtet. Dafür gab es in HeLa-H2B-GFP-Zellen, die zusätzlich mit dsRed markierten Kernmembranmarker Lamin B1 transduziert worden sind, Anzeichen für eine eingeschränkte Mikrokernmembranintegrität. Weiterhin wurden Zytokinese-Block Mikrokerntests nach Behandlung mit Thebain mit und ohne metabolische Aktivierung sowie Celecoxib und Celecoxibderivaten durchgeführt. Hierbei wurde nach Thebainbehandlung nur ohne metabolische Aktivierung und bei Anwesenheit von Zytotoxizität mehr Mikrokerne gefunden, während nach Behandlung mit Celecoxib und Celecoxibderivaten kein Anstieg beobachtet wurde. Zusätzlich wurde der Einfluss durch neurodegenerative Veränderungen auf Mundschleimhautzellen in zwei großen Kohorten untersucht, wobei keine Effekte auf die Häufigkeit von Mikrokernen oder mikrokernhaltigen Zellen zugeordnet werden konnten, während es teilweise bei Parametern, die auf Zytotoxizität hindeuten, zu Veränderungen kam. Es konnte insgesamt gezeigt werden, dass Mikrokerne und mikrokernhaltige Zellen zusätzlich zu ihrer Funktion als Biomarker über wenigstens mehrere Zellteilungen bestehen bleiben können. Auf diese Weise können sie z. B. über Chromothripsis zu einer beschleunigten Kanzerogenese führen, was zu einer schlechten Prognose für Krebspatienten führen kann. N2 - Micronuclei have been established as biomarkers long ago in genotoxicity research and although formation is mechanistically well understood, the fate of micronuclei as well as micronuclei function in carcinogenesis are poorly investigated. To explore the long-term fate of micronuclei and micronucleated cells, HeLa cells transfected with GFP-tagged histone H2B were examined via live cell imaging after treatment with various genotoxic agents for 96 h. Parameters like mitosis or cell death rate as well as the development of micronuclei were analysed. While persistence and reincorporation of micronuclei were frequently observed, degradation and extrusion of micronuclei were found only rarely or never. A subset of micronucleated cells could persist and proliferate over multiple cell divisions, so that micronuclei as manifestation of chromosomal instability also persisted. No clear substance-related effect on micronucleus fate could be determined. Extrusion of micronuclei was furthermore investigated after treatment with hydroxyurea or after combination treatment with cytochalasin B and a genotoxic agent, but no effect on the extrusion rate was observed. Degradation of micronuclei was investigated in detail by γH2AX antibody staining and transduction of dsRed-tagged autophagy marker LC3B in HeLa-H2B- GFP-cells. Although enrichment of DNA degradation in micronuclei were identified, co-localisation with LC3B was observed only rarely. In HeLa-H2B-GFP-cells transduced with dsRed-tagged nuclear membrane marker lamin B1, evidence for impaired nuclear membrane integrity was found. In addition, cytokinesis-block micronucleus tests after treatment with thebaine with and without metabolic activation as well as celecoxib and celecoxib derivatives were conducted. After thebaine treatment, increased micronucleus frequency was only observed without metabolic activation and together with cytotoxicity, while treatment with celecoxib and celecoxib derivatives caused no effect on micronucleus frequency. Effects of neurodegenerative disease on DMA damage in buccal cells of two large cohorts were furthermore investigated, but no effect on the frequency of micronuclei and micronucleated cells was observed, while parameters indicating cytotoxicity showed alterations. All in all, it could be demonstrated, that micronuclei and micronucleated cells, apart from their role as biomarker, can persist for multiple cell divisions. This way, cancerogenesis can be accelerated e.g. via chromothripsis, potentially leading to poor prognosis for cancer patients. KW - Kleinkern KW - Mutagenität KW - Thebain KW - Celecoxib KW - Kognitive Beeinträchtigung KW - Mundschleimhautzellen KW - Lebendzellmikroskopie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-240109 ER - TY - THES A1 - Auth, Charlotte Sophie T1 - Die Auswirkungen von Tph2-Defizienz und negativen frühen Umwelterfahrungen auf Angstverhalten in weiblichen Mäusen T1 - Differential anxiety-related behaviour and brain activation in Tph2-deficient female mice exposed to adverse early environment N2 - Angsterkrankungen gehören zu den am weitesten verbreiteten psychischen Erkrankungen und stellen eine beträchtliche soziale und wirtschaftliche Herausforderung für unsere Gesellschaft dar. Aversive frühe Erfahrungen sind ein bekannter Risikofaktor für die Entwicklung verschiedener psychischer Erkrankungen, insbesondere Angststörungen. Während der frühen Entwicklung findet die Programmierung der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden- (HHN)-Achse, die die Ausschüttung des Stresshormons Cortisol in Menschen bzw. Corticosteron in Mäusen steuert, statt. Wenn Individuen in dieser kritischen Phase Stress ausgesetzt sind, wird die regelrechte Ausbildung der HHN-Achse gestört, was zu dysregulierten Verhaltensantworten auf Stressreize im späteren Leben führen kann. Das Serotonin (5-HT)-System als eines der ausgedehntesten Neurotransmittersysteme ist an der Vermittlung der Effekte von früher Stressexposition auf angstähnliche Verhaltensweisen beteiligt. Das Ziel dieser Studie ist es, die Interaktion zwischen genetischer Prädisposition und negativen Einflüssen in frühen Entwicklungsstadien auf die Ausbildung von Angstverhalten im Erwachsenenalter näher zu beleuchten. In dieser Studie wurden Tryptophanhydroxylase 2 (Tph2)-defiziente weibliche Mäuse als Modell für ein lebenslanges konstitutives 5-HT Synthesedefizit im zentralen Nervensystem verwendet. Nachkommen dieser Mauslinie wurden im frühen Lebensalter Maternaler Separation (MS), d.h. einem mütterlichen Trennungsparadigma, unterzogen und im Erwachsenenalter im „Open field“ (OF) oder in der „Dark-light box“ (DLB) getestet. Im Anschluss an die Verhaltensexperimente wurde die neuronale Aktivierung immunhistochemisch durch Darstellung des frühzeitig auftretenden Genprodukts c-Fos bestimmt. In der DLB zeigten homozygot Tph2-defiziente Mäuse eine verringerte motorische Aktivität im hellen Kompartiment, und dieser Effekt konnte durch MS normalisiert werden. Zusätzlich verstärkte MS bei diesem Genotyp das Auftreten von fluchtartigen Sprüngen. Im OF hat MS fluchtartige Verhaltensweisen in homo- und heterozygoten Tph2-defizienten Mäusen befördert. Beide Verhaltenstests führten zu spezifischen neuronalen Aktivierungsmustern, die mithilfe von c-Fos- Immunhistochemie ausgewertet wurden. Die Durchführung des DLB-Tests führte in Abhängigkeit vom Vorhandensein von Tph2 zur Aktivierung des paraventrikulären Kerns des Hypothalamus (PVN) und der basolateralen Amygdala (BL), wohingegen die Exposition gegenüber dem OF-Test zu einer Aktivierung der lateralen Amygdala (La) in Tieren, die einem mütterlichen Trennungsparadigma unterzogen wurden, sowie einer Aktivierung des ventrolateralen (VLPAG) und dorsolateralen (DLPAG) periaquäduktalen Höhlengraus in Abhängigkeit von Tph2 und MS führte. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass MS aktive Verhaltensantworten auf aversive Reize in Abhängigkeit vom Vorhandensein von 5-HT im Gehirn fördert. Diese Effekte könnten durch die spezifische Aktivierung von mit Angstverhalten in Zusammenhang stehenden Gehirnregionen während der Verhaltensexperimente vermittelt werden. N2 - In a previous phase 1 study, it was observed that CBF can be increased by intermittent controlled hypercapnia in the days after aneurysm rupture in patients with poor to very poor SAB. After resetting mechanical ventilation to baseline parameters, CBF showed a slow and asymptotic return to baseline values without a negative rebound effect. This observation suggests that a longer duration of hypercapnia may prolong the CBF-increasing effect. This study was designed as a dose-optimization study to identify the time point at which CBF reaches a maximum and under the assumption that after this maximum, buffering mechanisms in blood and CSF could lead to adaptation mechanisms that result in a negative rebound effect after cessation of the hypercapnic challenge. An optimal duration of hypercapnia of 45 minutes was noted. KW - Angst KW - Maus KW - Serotonin KW - Stress KW - Entwicklung KW - Angstverhalten KW - Early-Life Stress KW - Mausmodell KW - Serotonindefizienz Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239488 ER - TY - THES A1 - Bothe, Sebastian Helmut T1 - Fragmentbasiertes Design von p97-Liganden: Identifizierung von Startstrukturen zur Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren für die SHP-Bindestelle der AAA+ ATPase p97 T1 - Fragment-based design of p97-ligands: Identification of starting points for the development of protein-protein-interaction inhibitors targeting the SHP-binding site of the AAA+ ATPase p97 N2 - Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist und eine Schlüsselrolle in der Protein-Homöostase spielt. Die funktionale Diversität von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Domäne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein könnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Domäne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor wäre nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern hätte auch einen besonderen Nutzen für die Entschlüsselung molekularer und zellulärer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz für die Identifizierung von chemischen Startstrukturen für die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Domäne gewählt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergestützte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, Röntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Darüber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgeführten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen für die experimentelle Validierung ausgewählt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden bestätigt werden. In einem parallel durchgeführten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Domäne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay bestätigt. Fünf dieser Verbindungen zeigten Affinitäten mit KD-Werten kleiner 500μMund günstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinität des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Domäne bestätigt werden. Zur Identifizierung möglicher Bindestellen dieser fünf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Domäne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit mögliche Ankerpunkte für die Weiterentwicklung dar. Für zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels Röntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten bestätigt werden. Die erhaltene Röntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Domäne zeigt. N2 - The AAA+ATPase p97 is an essential protein involved in numerous cellular pro-cesses and plays a key role in multiple aspects of protein homeostasis. Its functio-nal diversity is mediated through the interaction with a large number of distinctcofactors binding to the N-domain of p97. Due to its significant role in regulatinga variety of physiological responses, p97 has emerged as a potential therapeu-tic target. A small molecule inhibiting the cofactor binding would be importantto dissect the molecular and cellular functions of p97 cofactors, thus helping tounravel their specific role in controlling p97 activity. Such compounds may alsoopen routes to new cancer therapies.In this work, a fragment-based approach was pursued for the identification ofchemical starting points for the development of a protein-protein interaction in-hibitor addressing the SHP binding site. Therefore, computer-assisted methods,such as virtual screenings and molecular dynamics simulations, as well as bio-physical techniques including biolayer interferometry, X-ray crystallography, andligand-based NMR techniques, were applied.The computer-based design started with an analysis of the known p97 crystalstructures in complex with the SHP motifs of cofactors UFD1 and Derlin-1. In ad-dition, molecular dynamics simulations were used to analyze the water proper-ties within the SHP binding site. Based on these results, pharmacophore modelswere developed and utilized in the subsequent virtual screening and dockingprocess. With the help of molecular dynamics simulations, ten compounds wereselected for experimental validation. Two of these were confirmed as ligands inSTD-NMR and biolayer interferometry experiments.In parallel, a biophysical fragment screening of over 650 compounds was perfor-med using the biolayer interferometry method. This led to the identification of22 compounds binding to the N-domain. Fifteen of these fragments were con-firmed in an orthogonal STD-NMR assay. Five compounds showed affinities withKDvalues below 500 μM and favourable ligand efficiencies for further optimiza-tion. Furthermore, the binding kinetics and affinity of xanthohumol, a naturalproduct reported in the literature as a p97 inhibitor, were determined and bin-ding to the N-domain was confirmed. xToidentify possible binding sites of these five fragments, mixed solvent mole-cular dynamics simulations were performed. These revealed that all compoundsaddress the SHP binding site in the N-domain. The regions coincide with hotspots of the cofactor binding and, thus, represent potential anchor points for aprotein-protein interaction inhibitor. For two fragments, the postulated bindingsites were confirmed by X-ray crystallography and STD-NMR measurements onp97 alanine mutants, respectively. The X-ray structure obtained is the first p97structure showing a fragment bound to the N-domain. KW - Arzneimitteldesign KW - Fragmentscreening KW - p97 KW - Biolayerinterferometrie KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Kofaktorbindung KW - fragment screening KW - p97 KW - biolayerinterferometry KW - protein-protein-interaction KW - cofactorbinding KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Wirkstoffdesign Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239112 ER - TY - THES A1 - Konrad, Charlotte T1 - Biochemische Charakterisierung von cAMP-Gradienten – Einfluss von Phosphodiesterasen T1 - Biochemical Characterization of cAMP Gradients – Influence of Phosphodiesterases N2 - Cyclisches Adenosinmonophosphat ist ein ubiquitärer zweiter Botenstoff zahlreicher Signalwege im menschlichen Körper. Auf eine Vielzahl verschiedenster extrazellulärer Signale folgt jedoch eine Erhöhung desselben intrazellulären Botenstoffs - cAMP. Nichtsdestotrotz schafft es die Zelle, Signalspezifität aufrecht zu erhalten. Ein anerkanntes, wenn auch bisher unverstandenes Modell, um dieses zu ermöglichen, ist das Prinzip der Kompartimentierung. Die Zelle besitzt demnach Areale verschieden hoher cAMP-Konzentrationen, welche lokal begrenzt einzelne Signalkaskaden beeinflussen und somit eine differenzierte Signalübertragung ermöglichen. Eine mögliche Ursache für die Ausbildung solcher Bereiche geringerer cAMP- Konzentrationen (hier als Domänen bezeichnet), ist die hydrolytische Aktivität von Phosphodiesterasen (PDEs), welche als einzige Enzyme die Fähigkeiten besitzen, cAMP zu degradieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss der cAMP-Hydrolyse verschiedener PDEs auf die Größe dieser Domänen evaluiert und mit denen der PDE4A1 verglichen, welche bereits durch unsere Arbeitsgruppe aufgrund ihrer Größe als Nanodomänen definiert wurden. Der Fokus wird dabei auf den Einfluss von kinetischen Eigenschaften der Phosphodiesterasen gelegt. So werden eine PDE mit hoher Umsatzgeschwindigkeit (PDE2A3) und eine PDE mit hoher Substrataffinität (PDE8A1) verglichen. Mithilfe sogenannter Linker, Abstandshaltern definierter Länge, werden zusätzlich die Nanodomänen ausgemessen, um einen direkten Zusammenhang zwischen Größe und kinetischer Eigenschaft anzugeben. Die Zusammenschau der Ergebnisse zeigt, dass die maximale Umsatzgeschwindigkeit der Phosphodiesterasen direkt mit der Größe der Nanodomänen korreliert. Durch den unmittelbaren Vergleich der gesamten PDE mit ihrer katalytischen Domäne wird zusätzlich der Einfluss von regulatorischen Domänen evaluiert. Es wird gezeigt, dass diese cAMP-Gradienten modulieren können. Bei der PDE2A3 geschieht die Modulation u.a. durch Stimulation mit cGMP, welche höchstwahrscheinlich dosisabhängig ist und somit graduell verläuft. Hiermit präsentieren sich die Domänen als dynamische Bereiche, d.h. sie können in ihrer Ausprägung reguliert werden. In dieser Arbeit wird die Hypothese bestätigt, dass Phosphodiesterasen eine wichtige Rolle in der Kompartimentierung von cAMP spielen, die Gruppe jedoch inhomogener ist, als bislang angenommen. Die Gradienten-Bildung lässt sich nicht bei jeder Phosphodiesterase darstellen (PDE8A1). Einige Phosphodiesterasen (PDE2A3) jedoch bilden Kompartimente, die durch externe Stimuli in ihrer Größe reguliert werden können. Die Arbeit legt den Grundstein zur breiteren Charakterisierung des spezifischen Einflusses weiterer PDEs auf cAMP-Kompartimentierung, welches nicht nur das Verständnis der Kompartimentierungs-Strategien voranbringt, sondern auch essentiell für das Verständnis der Pathophysiologie zahlreicher Krankheitsbilder, aber auch für das Verständnis bereits angewandter aber auch potentiell neuer Medikamente ist. N2 - Cyclic AMP is a ubiquitous second messenger, which is involved in a huge variety of signaling pathways. Nevertheless, thinking about signaling specificity, it is unclear how numerous diverse signals are all translated via the same second messenger. However, to ensure downstream specificity there is one accepted model - the compartmentalization of cAMP. Different levels of cAMP therefore lead to signaling islets or areas, which ensure a more diverse downstream signaling. One example, which guarantees areas with lower cAMP concentration, is the local hydrolysis of cAMP due to phosphodiesterases’ hydrolytic activity. In this thesis the ability of different phosphodiesterases to build cAMP gradients is compared to the ability of the PDE4 to build cAMP domains in the scale of nanometers, which was already shown by our group. To discriminate influence factors of the formation of those nanodomains, the focus was set on distinct PDEs’ kinetic properties. Therefore, a PDE with a high velocity (PDE2A3) for cAMP hydrolysis is compared to the PDE with the highest known affinity (PDE8A1) to cAMP. Furthermore, with the tools provided by our group, linkers, which are “nanorulers” of distinct size, were used to directly measure the radius of those domains. It is revealed, that the size of the nanodomains directly correlates with the hydrolysis velocity. Furthermore, by comparison of full length PDE with its catalytic domain, it is shown, that their regulatory domains can modulate the ability of phosphodiesterases to create cAMP gradients. In PDE2A3, modulation of cAMP gradients was observed upon cGMP stimulation, which probably occurs in a concentration-dependent matter. Thus, cAMP domains seem to be dynamic areas, i.e. they can be regulated in their size. It is postulated, that phosphodiesterases are one important force for creating compartments, but the family of PDEs itself is inhomogeneous. Not every PDE can build detectable compartments (PDE8A1), but others can build compartments, which are regulated through external stimuli (PDE2A3). The thesis builds the foundation for additional characterization of the other PDE families, which would provide further insight in strategies of cAMP compartmentalization. Moreover, the knowledge of distinct functions of PDEs on cAMP compartments is crucial for the understanding of the pathophysiology of several diseases and the understanding of present and future pharmacological therapies. KW - Cyclo-AMP KW - Phosphodiesterase KW - cAMP KW - PDE Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205728 ER - TY - THES A1 - Malsch, Carolin T1 - Charakterisierung von Punkt- und Intervallschätzern des gemittelt sequenziellen Populations-assoziierten Risikoanteils in der Epidemiologie kardiovaskulärer Erkrankungen T1 - Characterization of Point and Interval Estimators for Average Sequential Population Attributable Fraction in Cardiovascular Disease Epidemiology N2 - Zielsetzung Die Entwicklung von Präventionsstrategien zur Senkung der Morbidität und Mortalität aufgrund von kardiovaskulären Erkrankungen (KVE) in der Bevölkerung stellt eine Hauptaufgabe der Epidemiologie und Public Health Forschung dar. In den vergangenen 20 Jahren rückte die Hochrisikoprävention im Zuge der Weiterentwicklung der Scoringsysteme für das KVE Hochrisiko-Screening in den Fokus der Leitlinien zur KVE Prävention. Jedoch sind die größten Erfolge aus einer komplementären Strategie aus Hochrisiko- und Populationsprävention mit Priorität auf der Reduktion der Exposition von Risikofaktoren für KVE in der gesamten Population zu erwarten. Die Grundvoraussetzung für die Entwicklung effizienter, populationsweiter Präventionsprogramme ist das Verständnis einerseits der Rolle von Risikofaktoren bei der Krankheitsentstehung und andererseits der Bedeutung der Risikofaktoren auf Populationsebene. Der Populations-assoziierte Risikoanteil (PAF) ist das bevorzugte statistische Maß zur Quantifizierung des Effekts von Risikofaktoren auf Populationsebene, da er neben der Effektstärke eines Risikofaktors auch dessen Prävalenz berücksichtigt. In der Praxis erfolgt die Berechnung des PAF in multifaktoriellen Situationen mithilfe von Adjustierungsansätzen oder Partialisierungsansätzen. Partialisierungsansätze, zu denen auch der gemittelt sequenzielle PAF (gsPAF) gehört, erfüllen die Additivitätseigenschaft. Insbesondere der gsPAF kommt daher in der praktischen Anwendung zunehmend häufiger zum Einsatz. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung des gsPAF am Beispiel der Epidemiologie von KVE. Methoden In Projekt 1 erfolgt die theoretische Abgrenzung des gsPAF von anderen Adjustierungs- und Partialisierungsverfahren in Bezug auf Intention, Definition, Modellvoraussetzungen und -annahmen und Interpretation. Diese verschiedenen Konzepte werden in einer einheitlichen mathematischen Symbolik dargestellt, um das Verständnis zu erleichtern und Abweichungen in den Definitionen hervorzuheben. Anschließend wird in Projekt 2 der praktische Vergleich von modellbasierten Punktschätzern vorgenommen. Im Rahmen der Sekundäranalyse der ProsCIS-Studie über den Populationseinfluss von Risikofaktoren auf schlechtes Outcome nach Schlaganfall werden dem gsPAF ein additiver und ein multiplikativer Adjustierungsansatz gegenübergestellt und die Schätzergebnisse hinsichtlich Übereinstimmung der Größenordnung und Rangfolgen analysiert. In Projekt 3 werden im Rahmen einer Simulationsstudie nach dem proof-of-concept-Prinzip die asymptotischen Eigenschaften existierender modellfreier und modellbasierter Schätzer des gsPAF in Verbindung mit resamplingbasierten Konfidenzschätzern in einer Situation mit einem binären Outcome und drei binären Risikofaktoren unter insgesamt 296 Modellsituationen charakterisiert. Dabei wird die Abhängigkeit von der Stichprobengröße, der Prävalenz des Outcomes, der Prävalenz und Effektstärke der Risikofaktoren, der stochastischen Abhängigkeit der Risikofaktoren und ihrer Effekte auf das Outcome, der Vollständigkeit des statistischen Modells sowie des Outcome-Mechanismus untersucht. Abschließend erfolgt in Projekt 4 die Demonstration der gsPAF-Schätzung exemplarisch im Rahmen der Sekundäranalyse des deutschen Arms der EUROASPIRE IV-Studie. Hier wird der Einfluss von Baselinefaktoren auf das Auftreten rekurrenter kardiovaskulärer Ereignisse nach erstmaliger Hospitalisierung auf Populationsebene modelliert. Die Ergebnisse werden anschließend einer umfassenden Methodenkritik unterzogen. Dazu wird die Modellanpassung der Regressionsmodelle überprüft, die Performanz der gsPAF-Schätzung mit Hilfe der zuvor entwickelten Simulationsstudie evaluiert, eine exemplarische Stichprobenumfangsplanung durchgeführt sowie die Angemessenheit der Modellannahmen des gsPAF diskutiert. Ergebnisse %Die Möglichkeiten der statistischen Modellierung von PAF sind nahezu unbegrenzt. Projekt 1: Adjustierungs- und Partialisierungsmethoden beantworten verschiedene Fragestellungen. Dies resultiert aus dem unterschiedlichen Umgang beider Methoden mit Subgruppen, die bezüglich mehrerer Risikofaktoren gleichzeitig exponiert sind, und führt infolgedessen auch zu unterschiedlichen Interpretationen. Der PAF beschreibt den Anteil an der Ereigniswahrscheinlichkeit, der mit dem Vorliegen eines Risikofaktors assoziiert ist. Für den gsPAF muss zusätzlich betont werden, dass der Effekt in Subgruppen mit mehreren Risikofaktoren auf additive Weise zerlegt und der Anteil des Zusammenwirkens der beteiligten Risikofaktoren (Surplus) zu gleichen Anteilen den Risikofaktoren zugewiesen wird. Dahinter steckt die Annahme, dass dieser Teil nur durch das Zusammenwirken überhaupt entstehen konnte, wofür beide Risikofaktoren gleichermaßen verantwortlich gemacht werden. Im Gegensatz zu Adjustierungsmethoden erfüllen Partialisierungsmethoden zwar die Additivitätseigenschaft, gehen jedoch gleichzeitig mit spezifischen Modellannahmen einher, die Kenntnisse über die kausalen Verläufe der Risikofaktoren voraussetzen. Im Falle des gsPAF ist dies die Annahme, dass unter den betrachteten Risikofaktoren keine hierarchischen Abhängigkeiten herrschen. Die theoretische Basis des gsPAF ist derzeit nur für dichotome Outcomes umfangreich erarbeitet und deckt hier alle Ansprüche für den Praxiseinsatz ab: Modellfreie und modellbasierte Punktschätzer, zugehörige Varianzschätzer mit und ohne Berücksichtigung von Störgrößen und Konfidenzschätzer stehen zur Verfügung. Mathematische Eigenschaften wie Symmetrie, Dummyeigenschaft, Additivität und (internen) marginalen Rationalität des gsPAF und anderer Partialisierungsansätze wurden erörtert. Die verfügbare Software stellt derzeit nur Ausschnitte des Methodenspektrums zur Schätzung des gsPAF bereit und ist deshalb für den Einsatz in der empirischen Forschung zu KVE nur begrenzt nützlich. Eine erfolgreiche und effiziente Recherche zum gsPAF wird durch die uneinheitliche Verwendung der Fachtermini ''partieller'' und ''gemittelt sequenzieller'' PAF erschwert. Projekt 2: Der Vergleich von Ergebnissen aus einem Adjustierungsansatz mit Ergebnissen aus einem Partialisierungsansatz ist über den kombinierten PAF möglich, da der unterschiedliche Umgang mit Subgruppen, die bezüglich mehrerer Risikofaktoren gleichzeitig exponiert sind, nicht zum Tragen kommt, solange nur der kombinierte Risikofaktor im statistischen Modell berücksichtigt wird. Anhand des Datenbeispiels der ProsCIS-Studie wurde für diesen Parameter keine Abweichung der Ergebnisse des multiplikativen Ansatzes (Faktor 1,0) und nur eine geringe Abweichung des additiven Ansatzes (Faktor 1,1) vom gsPAF beobachtet. Die Größenordnungen der Schätzwerte einzelner Risikofaktoren sowie deren Summe sind zwischen Adjustierungs- und Partialisierungsmethoden nicht vergleichbar. Die Ergebnisse aus dem multiplikativen Regressionsmodell weichen bis zu einem Faktor von 1,3 von den Schätzwerten des gsPAF ab. Die Abweichungen aus dem additiven Regressionsmodell gehen deutlich darüber hinaus. Der gsPAF liefert nahezu additive Schätzergebnisse, während die Summe der risikofaktorspezifischen Schätzwerte aus den beiden Adjustierungsmethoden den kombinierten PAF übersteigt. Im Gegensatz zu vorangegangenen Studien wird die Rangfolge der Risikofaktoren im Datenbeispiel nicht wesentlich von der Schätzmethode beeinflusst. Projekt 3: Die Simulationsstudie charakterisiert die modellfreien und modellbasierten Punktschätzer des gsPAF und belegt deren Konsistenz und (asymptotische) Erwartungstreue, sofern das statistische Modell korrekt spezifiziert ist. Es zeigt sich, dass in kleinen Stichproben oder bei kleinen Ereigniswahrscheinlichkeiten der modellbasierte Schätzer erwartungstreu und damit dem modellfreien Schätzer überlegen ist. Die Berechnungszeit des modellbasierten Schätzers steigt jedoch superlinear mit steigender Stichprobengröße und mit steigender Anzahl von Variablen im Regressionsmodell an. Resamplingbasierte Methoden wie Bootstrap Normal, Perzentil und Jackknife eignen sich für die Schätzung von Konfidenzintervallen des gsPAF. Auch hier ist ein superlinearer Anstieg der Berechnungszeit insbesondere in Verbindung mit dem modellbasierten Schätzer mit steigender Stichprobengröße und mit steigender Anzahl der Risikofaktoren im statistischen Modell zu beobachten. Biologische Interaktionen von Risikofaktoren im Outcome-Mechanismus verändern die Wahrscheinlichkeit für Ereignisse in Subgruppen mit mehreren Risikofaktoren weg von einem stochastisch unabhängigen und hin zu einem stochastisch abhängigen Szenario. Diese Ereigniswahrscheinlichkeiten werden durch die Anpassung der Parameter im binär-logistischen Regressionsmodell angenähert. Modelle ohne Interaktionsterme repräsentieren aus statistischer Sicht immer einen Outcome-Mechanismus mit stochastischer Abhängigkeit. Interaktionsterme sind nur dann als biologische Interaktionen zu interpretieren, wenn der biologische Outcome-Mechanismus korrekt durch die logistische Regressionsfunktion beschrieben wird. Anderenfalls dienen die Interaktionsterme nur der Modellanpassung und spiegeln nicht die An- oder Abwesenheit biologischer Interaktionen wider. Die Vernachlässigung von relevanten Interaktionstermen führt zu ernstzunehmenden Verzerrungen der Modellparameter und infolgedessen zu stark verzerrten gsPAF-Schätzungen. Dies ist jedoch durch eine gewissenhafte Überprüfung der Modellanpassung während der Auswertung vermeidbar. Grundsätzlich liefert die modellbasierte Schätzung des gsPAF mit allen Interaktionstermen immer unverzerrte Ergebnisse. Die benötigte Stichprobengröße für eine aussagekräftige Schätzung des gsPAF übersteigt die für relative Maße und steigt mit der Anzahl zu betrachtender Variablen im Modell und mit sinkender Prävalenz des Outcomes an. Während für den PAF steigende Effektgrößen der Risikofaktoren die benötigte Stichprobengröße verkleinern, wurde in der Simulationsstudie ein umgekehrter Zusammenhang für den gsPAF beobachtet. Projekt 4: Die in den Projekten 1 und 3 gewonnenen Erkenntnisse wurden im Rahmen der Datenanalyse der EUROASPIRE IV-Studie am Praxisbeispiel untersucht und diskutiert. Das Regressionsmodell ohne Interaktionsterme lieferte verzerrte gsPAF-Schätzungen, was durch die Berücksichtigung von Interaktionstermen korrigiert werden konnte. Die resamplingbasierten Konfidenzintervalle überdeckten große Teile des Wertebereiches des gsPAF und liefern somit keine nützlichen Informationen für die epidemiologische Interpretation der Studienergebnisse. Die Validierung der gsPAF-Schätzungen mit Hilfe der Simulationsstudie machte auf die mangelnde Performanz der Punkt- und Konfidenzintervalle aufgrund der verhältnismäßig kleinen Stichprobengröße für die betrachtete Anzahl der Risikofaktoren aufmerksam. Die benötigte Stichprobengröße für eine performante Schätzung des gsPAF in einer Datensituation wie in der EUROASPIRE IV-Studie beobachtet wurde mit Hilfe der Simulationsstudie ermittelt. Dabei wurde deutlich, dass etwa das Zehnfache der vorliegenden Stichprobengröße benötigt würde, um den modellfreien Schätzer des gsPAF zusammen mit resamplingbasierten Konfidenzintervallen mit einer ausreichenden Performanz schätzen zu können. Da unter den in EUROASPIRE IV betrachteten Risikofaktoren hierarchische Abhängigkeiten vorliegen könnten, sind die Voraussetzungen für die Schätzung des gsPAF nicht erfüllt. Anstelle des gsPAF könnte im vorliegenden Beispiel ein adjustierter Schätzer zum Einsatz kommen, oder, sofern genügend Informationen über die kausalen Zusammenhänge unter den Risikofaktoren vorliegen, auch sequenzielle oder proportionale Partialisierungsansätze. Die durchgeführte Methodenkritik in Projekt 4 ermöglicht es, weitere Schritte zur Steigerung der Aussagekraft der Studienergebnisse zu unternehmen, beispielsweise durch die Wahl geeigneter statistischer Methoden und die Erhöhung des Stichprobenumfangs. Schlussfolgerungen Die Grundvoraussetzungen für die Gewinnung qualitativ hochwertiger Daten sind bekanntermaßen die Wahl eines der Forschungsfrage angemessenen Studiendesigns sowie die sorgfältige Studienplanung. Aufgrund der hohen Anzahl der Risikofaktoren und Störgrößen für kardiovaskuläre Erkrankungen sowie der Komplexität ihrer kausalen Verläufe erfordern Beobachtungsstudien zu KVE große Stichproben, um eine unverzerrte und valide Schätzung der Effekte von Risikofaktoren zu ermöglichen. Doch die gewonnenen Erkenntnisse eignen sich nur dann für Schlussfolgerungen im epidemiologischen und Public Health Kontext dann, wenn auch die statistische Analyse der Studiendaten mit einer ebenso hohen Qualität erfolgt. Eine qualitativ hochwertige Datenanalyse zeichnet sich aus durch (1) die Auswahl der statistischen Methoden passend zur Forschungsfrage, (2) die Berücksichtigung aktueller methodischer Forschungsergebnisse, (3) die sorgfältige Überprüfung der Modellannahmen und Modellanpassung, (4) die Sicherstellung und Überprüfung einer guten Performanz der Punkt- und Konfidenzschätzer und (5) die realistische Interpretation der Ergebnisse unter Berücksichtigung der Modellvoraussetzungen und -annahmen. Ein gewissenhafter Umgang mit den statistischen Methoden ist erforderlich, um belastbare Schlussfolgerungen aus Beobachtungsstudien ziehen zu können. Dies gilt insbesondere im Kontext von Sekundärdatenanalysen, die einen beträchtlichen Anteil der Publikationen darstellen. Simulationsstudien sind ein schlagkräftiges Werkzeug für die Validierung der verwendeten statistischen Methoden und ermöglichen die Einschätzung des Informationsgehaltes von Analyseergebnissen. Sie sind ausgesprochen flexibel und lassen sich an beliebige Datensituationen anpassen. Das macht sie zu einem unverzichtbaren Qualitätskriterium für die Publikation empirischer Studien. Jeder Validierungsschritt trägt wesentlich zu einer verbesserten Qualität der Publikationen bei. Damit entsteht eine solide Basis, um die kausalen Verläufe der Risikofaktoren aufzudecken und die Entwicklung von Präventionsprogrammen zur Verbesserung des Gesundheitsstatus in der Population durch Reduktion der Morbidität und Mortalität von KVE voranzubringen. N2 - Aims The development of prevention programs to reduce morbidity and mortality from cardiovascular diseases (CVD) in the population is a fundamental principle in epidemiology and public health research. During the last two decades, the development and advances of high-risk screening scores led to an increased emphasis on high-risk approaches in guidelines for CVD prevention. However, best results in reducing morbidity and mortality from CVD in the population are expected from a complementary strategy including both, high-risk and population-wide prevention, with priority on reducing the exposure of CVD risk factors in the population. The prerequisite for the development of efficient population-wide prevention programs is a precise understanding of the risk factors' roles in the disease mechanism and their overall impact on the population. Population-attributable fraction (PAF) is the preferred statistical measure to quantify the overall effect of one or more risk factors from the population perspective, since it takes the risk factor’s effect size as well as its prevalence into account. In multifactorial situations, PAF can be calculated via adjustment or partialization approaches. The average sequential PAF (gsPAF) belongs to the latter group and shares the property of additivity. This measure is increasingly used in practical applications of CVD research recently. This dissertation aims to characterize the gsPAF in an exemplary way for application in CVD research. Methods In project 1, gsPAF is compared to other adjustment and partialization methods from a theoretical point of view with focus on intention, definition, model requirements and assumptions and interpretation. A unified mathematical formalism is chosen to facilitate the understanding of similarities and discrepancies between the concepts. The practical comparison of model-based point estimators is conducted in project 2 by analyzing the population impact of risk factors for death and functional dependency one year after stroke in the course of a secondary data analysis of the ProsCIS study. Three model-based estimators, namely the gsPAF, the adjusted PAF from a multiplicative and the adjusted PAF from an additive regression model, are analyzed regarding consistency of magnitudes and the ranking of estimates. In project 3, a simulation study following the proof-of-concept principle reveals the asymptotic properties of non model-based and model-based gsPAF estimators in conjunction with resampling-based confidence intervals in a situation with a binary outcome and three binary risk factors under 296 different model situations. Dependency of the estimators with respect to sample size, prevalence of outcome, prevalence and effect size of risk factors, interactions between risk factors and combined effects on outcome, completeness of statistical models and outcome mechanism is analyzed. Non model-based and model-based gsPAF estimators are used in project 4 in the course of a secondary analysis of data from the German subgroup of the EUROASPIRE IV-study to investigate the population impact of risk factors on recurrent cardiovascular events after first-ever hospitalization. Subsequently, a comprehensive assessment of methodology is conducted, including (a) examination of model fit and performance considerations under the given data condition using the simulation study, (b) illustrative sample size calculation and (c) discussion of suitability of model requirements and assumptions in order to ensure a valid estimation and interpretation of study results. Results Project 1: Adjustment and partialization methods provide answers to different questions. This results from their divergent strategies of handling subgroups with multiple exposures and consequently leads to different interpretations. PAF can be interpreted as the amount of outcome probability, that is associated with the presence of a risk factor in the population. In the interpretation of gsPAF estimates it must be stressed that the effect in subgroups with multiple exposures is partitioned in an additive manner and the resulting summand related to the joint effect (called ''surplus'') is evenly apportioned and assigned to the involved risk factors. This mechanism covers the implicit assumption, that existence of the surplus is caused by the joint action of the risk factors, which holds both factors equally accountable. In contrast to adjustment methods, partialization methods fulfill the property of additivity. However, this happens in exchange for further model assumptions which require understanding of the causal relationships of the risk factors. In the case of gsPAF, the assumption is that there are no mutual hierarchical dependencies among the risk factors. The soundness of such assumptions about the underlying biological mechanisms must be reviewed critically. The theoretical basis of gsPAF is developed extensively for binary outcomes and meets the various demands of practical applications: non model-based and model-based point estimators, corresponding variance estimators with or without adjustment for confounders, and confidence estimators are available and the mathematical properties of the gsPAF are elucidated. Yet, available software packages cover only parts of these various methodological options and are therefore of limited value for application in CVD research. An efficient enquiry of gsPAF literature is hampered by the heterogeneous use of the technical terms ''average sequential'' and ''partial'' PAF. Project 2: Estimation results from adjustment and partialization methods can be compared with regard to the combined PAF, since the diverging strategies of handling subgroups with multiple exposures has no impact as long as only one risk factors, namely the combined risk factor, is considered. The results from the secondary analysis of the ProsCIS-study show no discrepancy of combined PAF between gsPAF and the adjusted PAF based on a multiplicative regression model (factor 1.0) and only a small deviation for the adjusted PAF based on an additive regression model (factor 1.1). Worthy of note is, however, the incomparability of magnitudes and ordering of risk factor specific estimates. Estimates of gsPAF are surpassed from adjusted PAF based on multiplicative regression by factor 1.3 and from adjusted PAF based on a additive regression by even higher factors. While gsPAF yields fairly additive results, both adjustment methods do not. In contrast to previous results, no notable alteration of the risk factors' ordering was observed in the ProsCIS-study with regard to the model choice of PAF. Project 3: The simulation study characterizes non model-based and model-based estimators of the gsPAF and proves both, consistency and asymptotic unbiasedness, given that the statistical model is correctly specified with respect to interaction terms and completeness of variables in the model. The model-based estimator is unbiased even in small samples and in situations with small outcome prevalences and outperforms the non model-based estimator. However, computational time of the model-based estimator increases with increasing sample size and number of variables in the model. Resampling-based methods such as Bootstrap with normality assumption and percentile as well as Jackknife are suited for confidence interval estimation. Here, the computational time especially in conjunction with the model-based estimator shows a superlinear increase with increasing sample size. Sufficient sample sizes for performant estimations of gsPAF exceed those for relative effect measures such as risk and odds ratio and increase with increasing number of variables and decreasing prevalence of outcome. While sample sizes for PAF decrease with increasing prevalence and effect size of a risk factor, a reverse relation was observed for gsPAF, stressing the need for further investigations using a stretch-methods simulation study that also takes the asymptotic variance formula and resulting confidence intervals into account. Biological interactions cause the outcome probability in subgroups with multiple risk factors to shift from the expected probability under stochastic independence towards stochastic dependence. These outcome probabilities are targeted with binary-logistic regression analysis by estimating the regression coefficients. Binary-logistic regression models without interaction terms, however, represent an outcome mechanism that corresponds to stochastic dependency. This means, interaction terms do not necessarily reflect the presence or absence of biological interactions. In fact, interaction terms in the regression model represent biological interactions only if the outcome mechanism is properly described by the logistic regression function. Ignoring relevant interaction terms when fitting a model causes a poor estimation of regression parameters and yields severely biased gsPAF estimates. This can be avoided by examining the consistency of the stratum-specific outcome probabilities in the data set with the predicted probabilities from the fitted regression model. In addition, using a regression model with full interaction pattern when estimating gsPAF guarantees unbiased estimates. Project 4: The findings from projects 1 and 3 were considered during the analysis of the EUROASPIRE IV-study. The regression model without interaction terms led to biased regression parameters and gsPAF estimates, which was corrected by introducing interaction terms. Resampling-based confidence intervals covered large parts of the range of gsPAF and failed to provide useful information.Validation of the gsPAF estimates using a simulation study revealed an insufficient performance of point and confidence interval estimators due to the relatively small sample size for the chosen number of risk factors. The required sample size for a performant estimation of the gsPAF in a data situation as observed in the EUROASPIRE IV study was calculated using the simulation study. It was shown, that the actual sample size multiplied by approximately factor ten would be sufficient to estimate the non model-based gsPAF and resampling-based confidence intervals with a satisfying performance. Due to the fact, that hierarchical dependencies of the risk factors could be possible, the model requirements for gsPAF estimation are not fulfilled. Instead of gsPAF, the adjusted PAF seems to be a better choice. Also sequential or proportional PAF could be more suitable, if sufficient information about the causal relationships between the risk factors is available. These findings provide opportunity to take further steps for improving the data situation and analysis, for example by pooling data sets from comparable studies and choosing more appropriate statistical methods. Conclusions The prerequisites for a good quality of the study data are known to be an appropriate study design and a prudent study planning and implementation process. Due to the high number and complex causal pathways of risk factors and confounders, observational studies on CVD require large sample sizes to ensure unbiased and high performant estimates. However, findings that are valuable for interpretation and conclusions in the epidemiological and public health context also depend on an equally high-standard data analytics process. A high-quality data analysis is characterized by (1) the application of statistical methods suitable to the research question, (2) the consideration of recent methodological advancements, (3) a careful examination of model assumptions and model fitting, (4) the verification of reasonable performance of point and interval estimators and (5) a realistic interpretation of results while accurately considering model requirements and assumptions. A decent validation of study results indicates the conscientiousness and diligence that is necessary when using statistical methods to draw conclusions from observational data, in particular in the context of secondary data analysis. Simulation studies are a powerful tool for validation of statistical methods and allow judging the informative value of the obtained results. They are utmost flexible and can be adapted to a wide range of data situations, what makes them to an indispensable quality criterion for the publication of empirical study results. Every validation step contributes to an improvement of the quality of publications. This provides a sound basis for unraveling the causal pathways of risk factors and developing prevention programs to improve the health status in the population by reducing morbidity and mortality from CVD. KW - population attributable fraction KW - attributable risk KW - attributable fraction Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238161 ER - TY - THES A1 - Wurst, Catherina T1 - Eingeschränktes Furchtlernen bei ängstlich und nicht-ängstlich depressiven Patienten T1 - Impaired fear learning in anxious and non-anxious depression N2 - Depressionen und Angststörungen sind die beiden häufigsten psychischen Erkrankungen. Für Angststörungen wurde in zahlreichen Untersuchungen die Bedeutung veränderter Muster in den basalen emotional-assoziativen Lernprozessen für die Ätiologie und Aufrechterhaltung der Erkrankung gezeigt. Hierzu zählen eine verstärkte Akquisitionsreaktion auf den konditionierten Stimulus, Defizite in der Inhibition der Furchtreaktion auf den Sicherheit signalisierenden Stimulus, Übergeneralisierung und Beeinträchtigungen in der Extinktion konditionierter Reaktionen. Aufgrund der hohen Prävalenzen einer Komorbidität mit Depressionen rückte in den letzten Jahren zunehmend die Untersuchung der genannten Prozesse bei Depressionen in den Fokus. Hierfür konnten bisher keine einheitlichen Ergebnisse gezeigt werden. Weiterhin wird der Subtyp der ängstlichen Depression einerseits mit hohen Prävalenzen beschrieben, andererseits zeigen Untersuchungen eine schlechtere Prognose, stärkere Einschränkungen in der Funktionalität und ein schlechteres Ansprechen auf die Therapie im Vergleich zu depressiven Patienten ohne hohes Ängstlichkeitsniveau. In dieser Arbeit wurden die Akquisition, Generalisierung und Extinktion in einem differentiellen Konditionierungsparadigma bei schwer depressiven ängstlichen und nicht ängstlich-depressiven Patienten sowie einer gesunden Kontrollgruppe untersucht. Ängstliche und nicht ängstlich-depressive Patienten zeigten ein beeinträchtigtes Sicherheitslernen in der Akquisition und Beeinträchtigungen in der Extinktion der konditionierten Furcht. Es ergaben sich keine Unterschiede hinsichtlich der Stärke der Generalisierung zwischen Patienten und den gesunden Kontrollen und es konnten keine differenzierenden Muster zwischen den ängstlich- und den nicht ängstlich-depressiven Patienten gezeigt werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse auf Veränderungen im Furchtlernen bei Patienten mit Depressionen hin. Es konnten keine Belege für unterschiedliche Mechanismen im Furchtlernen von ängstlich- und nicht ängstlich-depressiven Patienten gefunden werden. Unsere Ergebnisse stützen somit die Klassifikation der ängstlichen Depression als Subtyp der Depression. Weiterhin weisen die Ergebnisse der beeinträchtigten Extinktion bei Patienten mit Depressionen darauf hin, dass Expositionselemente, welche bei der Therapie von Angststörungen als Verfahren der Wahl eingesetzt werden, auch bei der Behandlung von Depressionen integriert werden sollten, um so den Therapieerfolg zu verbessern. N2 - Depression and anxiety disorders are the two most frequent mental disorders. Numerous studies have shown the importance of altered patterns in basic emotional-associative learning processes for etiology and maintenance of anxiety disorders. These alterations include an increased fear response to the conditioned stimulus in acquisition, deficits in the inhibition of fear response to the safety stimulus, over-generalization, and an impaired extinction of conditioned responses. Due to the high prevalence of co-morbidity with depression, in recent years the focus has increasingly extended to the investigation of these processes in depression. To date, no consistent results have been obtained in this field. The subtype of anxious depression is described with high prevalence. Furthermore, studies have shown a worse prognosis, stronger restrictions in functionality and a worse response to therapy compared to depressive patients without a high level of anxiety on the other. In this thesis, acquisition, generalization and extinction in a differential conditioning paradigm in severely depressed patients with anxiety and non-anxious depressed patients as well as in a healthy control group were investigated. Anxious and non-anxious depressed patients showed impaired safety learning in acquisition and impaired extinction of conditioned fear. There were no differences in the strength of generalization between patients and healthy controls and no differentiating patterns between anxious and non-anxious depressed patients could be shown. In summary, the results of this study indicate alterations of fear learning in patients with depression. No evidence could be found for different mechanisms in fear learning of anxious and non-anxious depressed patients. Thus, our results support the classification of anxious depression as a subtype of major depression. Furthermore, the results of impaired extinction in patients with depression indicate that exposure elements, which are applied in the treatment of anxiety disorders as the method of choice, should also be integrated in the treatment of depression in order to improve therapeutic effect. KW - Depression KW - Konditionierung KW - Angststörung KW - Furcht KW - Extinktion KW - Psychotherapie KW - Ängstliche Depression KW - Furchtkonditionierung KW - Furchtgeneralisierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205034 ER - TY - THES A1 - Brunhuber, Bettina Stefanie T1 - Modifikation konditionierter Furchtreaktionen durch transkranielle Gleichstromstimulation T1 - Modification of conditioned fear response via transcranial direct current stimulation N2 - In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine anodale tDCS über der Elektrodenposition AF3 und der Kathode über dem kontralateralen Mastoid Extinktionslernen modulieren kann. Auf Basis aktueller Forschungsergebnisse wurden die Hypothesen aufgestellt, dass im Vergleich von real stimulierter zu sham stimulierter Gruppe ein Unterschied in der Hautleitfähigkeitsrekation, dem Arousalrating und dem Valenzrating der Versuchsteilnehmenden im Vergleich von CS+ und CS- und im zeitlichen Verlauf von Akquisition zu Extinktion gezeigt werden kann. Um dies zu prüfen wurde eine randomisiert doppelt-verblindete Studie mit insgesamt 86 Probanden durchgeführt, von denen nach Überprüfen einer suffizienten Furchtkonditionierungsreaktion nach der Akquisitionsphase noch 46 Teilnehmer eingeschlossen wurden. Diese wurden auf zwei tDCS Gruppen im Sinne von realer Stimulation und sham Stimulation verblindet und zufällig aufgeteilt. Alle Teilnehmer durchliefen ein eintägiges Furchtkonditionierungsparadigma mit drei Phasen: Habituation, Akquisition und Extinktion. Während allen Phasen wurde die Hautleitfähigkeitsreaktion gemessen und die Probanden wurden gebeten die ihnen präsentierten Stimuli hinsichtlich deren Valenz und Arousal einzuschätzen. Die tDCS fand in einer zehnminütigen Pause vor der Extinktion und während destdcs Extinktionsdurchlaufs statt. In den Ergebnissen zeigt sich kein differenzieller Effekt der tDCS. In den erhobenen Hautleitfähigkeitsdaten zeigt sich in der frühen Extinktionsphase eine verringerte Hautleitfähigkeit in der verum stimulierten tDCS Gruppe unabhängig davon, ob ein CS+ oder ein CS- zu sehen war. Dies deutet auf eine generell verminderte Aufregung bei realer tDCS hin. In den Bewertungen bezüglich Arousal und Valenz findet sich ebenfalls kein Effekt der tDCS. In den Bewertungen zeigt sich jedoch die erfolgreiche Konditionierung und deren Extinktion. Nachfolgend stellt sich die Frage, ob zukünftig Paradigmen mit einem zweitägigen Design bevorzugt werden sollten, da diese realen Bedingungen näherkommen und teilweise auch Effekte der tDCS gezeigt haben. Abschließend lässt sich die große Rolle des vmPFC in der Verarbeitung von aversiven Reizen darstellen und betonen, welch großes Potential in einer Beeinflussung der Aktivität des vmPFC liegt, das zukünftig genauer untersucht werden muss. N2 - In the present work the question was examined whether anodal tDCS over the electrode position AF3 with the dependent cathode over the contralateral mastoid can modulate extinction learning. Based on current research results, we hypothesised that in comparison of real stimulated to sham-stimulated group, a difference in skin conductivity response, arousal rating and valence rating of the participants in comparison of CS+ and CS- and in the time course from acquisition to extinction can be shown. In order to test these hypotheses, a randomized, double-blind study was carried out with a total of 86 subjects, of whom 46 participants were included after checking a sufficient fear conditioning reaction after the acquisition phase. These were blinded to the two tDCS groups in the sense of real stimulation and sham stimulation and randomly divided. All participants went through a one-day fear conditioning paradigm with the three phases habituation, acquisition and extinction. The skin conductivity response was measured during all phases and the subjects were asked to assess the stimuli presented to them with regard to their valence and arousal. The tDCS took place in a ten minute pause interval before the extinction and during the entire extinction phase. The results show no differential effect of tDCS. The skin conductivity data collected showed a reduced skin conductivity in the verum-stimulated tDCS group in the early extinction phase, regardless of whether a CS + or a CS- was seen. This indicates generally reduced excitement with real tDCS. There is also no effect of tDCS in the evaluations regarding arousal and valence. Although the ratings clearly show the successful conditioning and then its extinction. This raises the question of whether paradigms with a two-day design should be preferred in the future, since these come closer to real conditions and have also shown some effects of tDCS. In conclusion, the major role of the vmPFC in the processing of aversive stimuli can be highlighted and the great potential that lies in influencing the activity of the vmPFC, which must be examined more closely in the future. KW - Furchtkonditionierung KW - Exposition KW - tdcs KW - Expositionslernen KW - Angststörung KW - fear conditioning KW - anxiety disorders KW - exposition training Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237562 ER - TY - THES A1 - Stadler, David T1 - Studien zur Inflammation und neuronalem Schaden in genetischen Modellen von progredienter Multipler Sklerose T1 - Studies in inflammation and neuronal damage in genetic models of progressive multiple sclerosis N2 - Multiple Sklerose ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die zu motorischen, sensiblen und vegetativen Einschränkungen führt. Häufig beginnt die Erkrankung mit einem schubförmigen Verlauf, dem eine progrediente Verschlechterung folgt. Trotzdem leiden ca. 15% der Patienten bereits von Beginn an, an einer primär progressiven Variante der MS, die bereits mit der progredienten Phase beginnt. Bis jetzt ist die Pathophysiologie nicht vollständig verstanden. Lange Zeit dachte man, dass MS primär eine reine Autoimmun-Erkrankung darstellt, aber in den letzten Jahren ergab sich die Frage, ob es vor allem in den progressiven Formen, eine zytodegenerative Komponente gibt, auf die eine sekundäre Inflammation folgt. Eine mögliche Ursache stellen hier Mutationen des PLP 1 Gens dar, die normalerweise mit leukodystrophischen Erkrankungen assoziiert sind. Es gab zwei Fallberichte, in denen von Patienten berichtet wurde, die unterschiedliche Mutationen in diesem Gen hatten und den klinischen Phänotyp einer MS zeigten. Diese Arbeit sollte nun die Auswirkungen der Mutationen, beziehungsweise einer Nullmutation des PLP 1 Gens in 18- und zum Teil 12-Monate alten Mausmutanten untersuchen. Hier konnten Myelin-Veränderungen und axonaler Schaden in immunhistochemischen Untersuchungen sowie mittels Elektronenmikroskopie und optischer Kohärenztomographie gezeigt werden. Weiter konnte eine Neuroinflammation und damit einhergehend eine zunehmende Anzahl CD8+ T-Zellen sowie einer erhöhten Anzahl an Mikroglia/Makrophagen gefunden werden. Dies ging mit vergleichsweise reduzierten Leistungen der Mutanten bei der motorischen Rotarod-Analyse einher. Interessanterweise wurde weniger neuraler Schaden in den heterozygoten Varianten gefunden, obwohl das Ausmaß der Entzündung gleichblieb. Dies könnte für eine zielgerichtete immunvermittelte Schädigung der Oligodendrozyten sprechen, die zu neuronalem Schaden führt. So konnte gezeigt werden, dass es durch Punktmutationen in einem Myelinprotein-codierendem Gen zu einer sekundären Entzündung kommen kann, die mit dem klinischen Phänotyp einer progressiven MS einhergeht. Weiter sind diese Mausmodelle ein Beispiel für eine genetische Erkrankung des ZNS, in denen die Klinik maßgeblich durch die begleitende Inflammation und nicht allein durch den genetischen Schaden verursacht wird. N2 - Multiple sclerosis (MS) is one of the most common neurological diseases, leading to motor, sensory and vegetative impairment. Frequently, the disease begins as a relapsing remitting form, which is followed by a progressive stage. Nevertheless about 15% of the patients suffer under a primary progressive multiple sclerosis, which starts with the progressive stage. Until now the pathophysiology is not completely understood. For a long time, multiple sclerosis was thought to be an autoimmune disease, but in the last years the question arose if the underlying cause, especially in the progressive forms (PMS), could be a cytodegenerative component, followed by secondary inflammation. A possible candidate here could be point mutations in the PLP 1 gene, which are usually associated with leukodystrophic disorders. There were two case reports about patients carrying distinct point mutations in this gene, leading to the clinical phenotype of multiple sclerosis. This thesis examines 18- and in part 12-month-old mice, carrying these point mutations or having a Plp 1 null mutation. Here myelin alterations and axonal damage in immunohistochemical stainings could be shown, as well as in the optical coherence tomography and electron microscopy. Furthermore, the occurrence of neuroinflammation comprising recruitment of microglia/macrophages and CD8 positive T-cells could be demonstrated. Also, typical clinical symptoms in the Rotarod test were found. Interestingly, there was less neural damage found in heterozygous females than in homozygous mutant mice, while the extent of inflammation was the same. This could indicate a targeted immune-mediated injury of oligodendrocytes leading to neuronal damage. In summary, this thesis shows that a point mutation of a gene coding for a myelin protein of oligodendrocytes can lead to secondary neuroinflammation and a neurological phenotype comparable to PMS. In addition, the generated mouse models are an example for genetic diseases of the CNS, in which the clinical outcome could be driven by inflammation and not only by the primary gene mutation. KW - Multiple Sklerose KW - Maus KW - Genetik KW - Immunsystem KW - Glia KW - Sekundäre Inflammation KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration KW - Mikroglia KW - Mausmodell Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-236923 ER - TY - THES A1 - Bittorf, Patrick T1 - Entwicklung, Herstellung und präklinisches Studienprogramm für ein Arzneimittel für neuartige Therapien zur Behandlung der schweren Form der Hämophilie A T1 - Development, manufacturing and preclinical study program for an Advanced Therapy Medicinal Product for the treatment of severe hemophilia A N2 - Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden... N2 - The mandatory non-clinical study scheme prior to the first administration of a cell-based gene therapy medicinal product (GTMP) to human subjects includes and requires investigation of the biodistribution, comprising mobilization, persistence, and clearance, of the GTMP in a relevant animal model. Therefore, a qPCR-based method to determine the amount of human DNA in mouse DNA was developed and validated according to the guidelines of the European Medicines Agency and the International Council for Harmonisation. Furthermore, a preclinical worst-case scenario study was performed, in which this method was applied to investigate the biodistribution of 2x106 intravenously administered, genetically modified blood outgrowth endothelial cells from hemophilia A patients after 24 hours and seven days. The isolation, genetic modification and expansion of cells should be performed according to the guidelines on Good Manufacturing Practice. Here, the selection and application of appropriate and necessary raw materials is important. Likewise, the performance of a defined quality control program is mandatory and cells should only be applied within non-clinical studies if they passed all acceptance criteria. The validation of the qPCR method demonstrated high accuracy, precision, and linearity for the concentration interval of 1:1x103 to 1:1x106 human to mouse genomes. The application of this method in the biodistribution study resulted in the detection of human genomes in four out of the eight investigated organs after 24 hours. After seven days, no human DNA was detected in the eight organs analyzed. This biodistribution study provides mandatory data on the toxicokinetic safety profile of an actual cell-based medicinal product candidate. This is a prerequisite for designing and performing the subsequent toxicity studies necessary to ensure patient safety and permit moving the medicinal product towards a first-in-human clinical trial. KW - Arzneimittel KW - QPCR KW - GMP KW - Validierung KW - Hämophilie A KW - Neuartige Arzneimittel KW - Präklinische Studien KW - Biodistribution KW - Arzneimittelzulassung KW - Advanced Therapy Medicinal Products (ATMP) KW - Preclinical studies KW - Biodistribution KW - Marketing authorisation of pharmaceuticals Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-231858 ER - TY - THES A1 - Ickrath, Katrin Marie T1 - DNA-Stabilität und -Regenerationsfähigkeit von humanen Nasenschleimhautzellen in Kulturmodellen T1 - DNA stability and regeneration capacity of human nasal mucosa in tissue systems N2 - Kulturmodelle des respiratorischen Epithels werden zur Klärung multipler Fragestellungen, zum Beispiel der Untersuchung seltener respiratorischer Erkrankungen, wie der primären Ziliendyskinesie (PCD) herangezogen. Hierbei könnten in Zukunft Kulturmodelle integraler Bestandteil des Diagnosealgorithmus werden. Die Isolierung und Kultivierung von Primärzellen des menschlichen Respirationstrakts ist dabei wesentlich komplexer als die Nutzung etablierter Zelllinien. Jedoch ermöglicht die Verwendung der Primärzellkulturen eine exaktere Darstellung des mehrreihigen Flimmerepithels der oberen Atemwege. Die Gewinnung der Primärzellen kann mechanisch mit zusätzlichem enzymatischen Verdau, oder durch sequentielles Auswachsen der Zellen erfolgen. Angewendet werden sowohl Epithelzell-Monokulturen wie auch Cokulturen mit Fibroblasten. Die Nutzung des Air-Liquid Interface in Transwell Systemen ermöglicht in beiden Kulturen die Differenzierung zu einem Kinozilien tragenden Flimmerepithel. Hierbei ist nicht endgültig geklärt, welches Modell die in vivo Gegebenheiten besser darstellt und welche Vorteile diese haben. Außerdem liegen bislang keine Daten über die Zellstabilität und -regenerationsfähigkeit nach genotoxischer Behandlung sowie Informationen über chromosomale Veränderungen während des Zellkultivierungsprozesses über mehrere Passagen vor. Derartige Informationen sind allerdings für die Etablierung eines Kulturmodells der oberen Atemwege von essentieller Bedeutung. Das Ziel der Arbeit war die Untersuchung der DNA-Stabilität und -Regenerationsfähigkeit über drei Passagen nach genotoxischer Behandlung, vergleichend für beide Kulturmodelle sowie die Überprüfung der chromosomalen Stabilität innerhalb des Kultivierungsprozesses und der Funktionsfähigkeit beider Zellkulturen. Zu diesem Zweck wurde eine toxikologische Versuchsreihe von jeweils 10 Spendern für beide Kulturmodelle, Mono- bzw. Cokultur im Air-Liquid Interface über drei Passagen durchgeführt. Hierbei wurde die Grundschädigung, die Schädigung nach einstündiger Behandlung mit 300μl des Alkylanz Methylmethansulfonat (MMS) und nach einer 24-stündigen Regenerationszeit mit dem Comet Assay überprüft. Zur Untersuchung der chromosomalen Stabilität innerhalb des Kulturprozesses wurden parallel Chromosomenaberrationstests an unbehandelten Zellen über drei Passagen durchgeführt. Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der Zellen wurde ein Interleukin-8 (IL-8) ELISA für 10 Versuchsansätze in der jeweils ersten Passage beider Kulturen verwendet. Hierbei wurde die IL-8-Konzentration im Überstand der unbehandelten Zellkulturen sowie nach 1μg/ml bzw. 10μg/ml Lipopolysaccarid(LPS)- Exposition untersucht. Für die Cokultur wurden sowohl beide Zelltypen gemeinsam als auch die Epithelzellen bzw. die Fibroblasten getrennt betrachtet. In beiden Modellen wurden zusätzlich rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen zur Untersuchung der ziliären Strukturen durchgeführt. Zur Überprüfung der Fibroblastenkontamination in der Monokultur wurden als einmaliger Versuchsablauf Vimentin- Färbungen über drei Passagen angewendet. Mit dem Comet Assay konnte in beiden Modellen eine gute Regeneration der DNA-Integrität nach MMS-induzierter DNA-Schädigung über alle Passagen nachgewiesen werden. Als einmaliger Versuchsansatz wurde das Enzym Methylpuringlykosylase (MPG) als Teil der Basenexzisionsreparatur nachgewiesen. Es ergaben sich Unterschiede in der Kultivierbarkeit der Zellen: die Monokultur zeigte eine gute Zellkultivierbarkeit bis zur dritten Passage. Es konnte jedoch mit der Vimentinfärbung eine Fibroblastenkontamination von Beginn an sowie eine Zunahme mit Höhe der Passage nachgewiesen werden. Es handelt sich hierbei demnach nicht um eine Reinkultur respiratorischer Epithelzellen. Die Cokultur ermöglicht getrennte Epithelzell- bzw. Fibroblastenkulturen, jedoch keine gute Kultivierbarkeit bis in höhere Passage. Methodisch konnte die prinzipielle Funktionsfähigkeit des Chromosomenaberrationstests an primären Nasenschleimhautzellen erstmals für eine große Stichprobenanzahl gezeigt werden. In den durchgeführten Chromosomenaberrationstests konnte eine gewisse Grundschädigung über alle Passagen nachgewiesen werden, jedoch sollten weitere Tests erfolgen, um diese Tendenz zu verifizieren. Die funktionelle Integrität wurde mit dem IL-8 ELISA nach LPS-Exposition sowie durch den Nachweis ziliärer Strukturen im REM exemplarisch bestätigt. Die erhobenen Daten liefern zusammengefasst wichtige Informationen über die Zellstabilität und -regenerationsfähigkeit der bislang verwendeten Kulturmodelle. Insbesondere Informationen über chromosomale Veränderungen sollten in Zukunft genauer betrachtet werden. Von großem Interesse wäre außerdem die Überprüfung derartige Zelleigenschaften in Zellkulturen von PCD erkrankten Spendern. N2 - Cell culture models of human nasal mucosa are widely used to clarify a broad variety of scientific questions. Particularly the research of orphan disease, like Primary Ciliary Dyskinesia (PCD), may represent a possible field of application. In the future, these models may play a major role in diagnostic algorithms of PCD. The process of isolating and cultivating primary cells is way more complex than using established cell lines. However, it allows a more precise description in analogies to in vivo conditions in the human respiratory tract. Primary cells could be extracted by mechanic and enzymatic isolation or by sequential outgrow. Epithelial cells can be cultivated in monocultures or with fibroblasts in cocultures. Using air-liquid interface conditions in Transwell systems enable the differentiation to ciliated respiratory epithelium. It is not yet clarified which model represents in vivo situation in a better way and what kind of advantages they have. Data about stability and regenerative capacity after DNA-damaging treatment, as well as information about chromosomal alterations during the multi-passages cultivating process, is sparse. This information has a high importance to establish a culture model for primary cells of the respiratory epithelium. This work aimed to explore the DNA-stability and regeneration capacity over three passages after genotoxic treatment compared for both culture models. Moreover, the chromosome stability during cultivating process and the functional activity should be verified. For this purpose, a series of toxicological experiments was conducted. For both models, primary cells of 10 different donors were cultivated over three passages. The comet assay was applied to analyze the baseline DNA-damage, the damage after one hour of treatment with 300l of the alkylating agent Methylmethanesulfonate (MMS) and the residual damage after a regeneration period of 24 hours. Moreover, the chromosomal stability throughout the cultivating process was verified by using chromosomal aberration tests for the untreated cells. An Interleukin-8 (IL-8) ELISA was conducted in ten experiments of each model during the first passage to assess an efficient cellular function. Hence, we examined the concentration of IL-8 in supernatant of the untreated cell cultures, as well as after exposure with 1g/ml and 10g/ml of Lipopolysaccaride (LPS). Within the coculture, we examined both cell types jointly and separately for epithelial cells and fibroblast cells. We performed Scanning Electron Microscope (SEM) images of both models to detect kinocilia. To detect the fibroblast contamination in the monoculture, vimentin staining was performed for three passages in a single test. The results of the comet assay revealed a good regenerative capacity of DNA-integrity after MMS-induced DNA-damage in both models for all passages. The enzyme Methylpurineglykosylase (MPG), which is part of the Base excision repair (BER) could be detected in a single test. Differences were seen within the cultivability of both methods. The monoculture showed a good cultivability for all passages. However, the vimentin staining proved a contamination with fibroblasts from the very first passage. Furthermore, an increase of the fibroblast amount in the higher passages was observed. This leads to the conclusion, that the monoculture model is not a pure culture of respiratory epithelium. Instead, the coculture enables a separate culture of fibroblasts and epithelial cells. Nevertheless, the coculture showed a worse cultivability. Applicability of the chromosomal aberration test for nasal mucosa cells could be proved for the first time in a large number of samples. Although the chromosomal aberration test showed a certain baseline damage over all passages, further tests should be done to verify the tendency. Furthermore, aspects of cell functionality were evaluated. The results of the IL-8 ELISA proved the functional activity in both methods. Further, the SEM images exemplary verified kinocilia differentiation. In summary, our findings deliver important information about the stability and regenerative capacity of the used cell culture models. Especially, data of chromosomal modifications should be examined in the near future. Furthermore, it would be of great interest to examine these cell characteristics within cell cultures of PCD donors. KW - Primärelement KW - in vitro Kulturmodelle KW - Primärzellen KW - Nasenschleimhaut Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-230438 ER - TY - THES A1 - Geiger, Ute T1 - Erfassung der intraoperativen Ankopplungseffizienz mittels evozierten Potentialen bei mit Mittelohrimplantat versorgten Patienten T1 - Determining the intraoperative coupling efficiency using evoked potentials in middle ear implant patients N2 - Patienten mit leicht bis hochgradigen Schallleitungs-, Schallempfindungs- und kombinierten Schwerhörigkeiten werden routinemäßig nach erfolglosem Hörgerätetrageversuch mit aktiven Mittelohrimplantaten versorgt. Aktive Mittelohrimplantate können an verschiedene Strukturen des Mittelohrs angekoppelt werden. Der Ort der Ankopplung ist abhängig vom Hörverlust und der individuellen Physiologie des Mittelohres. Die Hörverbesserung ist dabei stark von der Kopplungseffizienz des Implantatwandlers an die Mittelohrstruktur abhängig. Aktuell gibt es keine zufriedenstellende Möglichkeit die Kopplungseffizienz intraoperativ zu bestimmen. Daher wird eine objektive Methode eingeführt, um intraoperativ auditorische Hirnstammantworten (BERAs) bei Stimulation über das Implantat abzuleiten. Die Vibrant Soundbrigde® (VSB) wird dabei mit einem Drahtlosüberträger (miniTEK, Signia GmbH, Erlangen) und der Carina®-Aktuator über ein Audiokabel mit der BERA-Anlage verbunden. Die BERA-Anlage überträgt die Stimuli direkt an das Implantat, welches an die Mittelohrstruktur angekoppelt ist. Die BERA-Antworten werden bei der VSB durch einen optimierten VSB-CE-Chirp und beim Carina®-System durch den Standard CE-Chirp evoziert, beginnend bei Pegeln oberhalb der Knochenleitungshörschwelle bis unter die Registrierungsschwelle. Diese Methode kann die intraoperative Integrität des Implantats sowie die Kopplungseffizienz bestimmen, um eine Aussage über den zu erwartenden Hörerfolg treffen zu können. Darüber hinaus kann die versorgte Hörschwelle verwendet werden, um die Anpassung bei Kindern oder schwierigen Fällen zu unterstützen und um eine Hörverschlechterung über die Zeit zu erfassen. Zusammenfassend, konnte eine Methode zur Bestimmung der intraoperativen Kopplungseffizienz während der Implantation von VSBs und Carinas® etabliert werden. Darüber hinaus werden intraoperative BERA-Daten von 30 VSB- und 10-Carina®-Patienten sowie deren Hörergebnisse gezeigt. N2 - Patients with mild to severe air conduction, bone conduction or combined hearing loss are treated routinely with active middle ear implants after unsuccessful hearing aid trials. Active middle ear implants are surgically coupled to different structures of the middle ear, depending on the hearing loss and the individual physiology of the middle ear. Hearing improvement is highly dependent on the coupling of the implants transducer and the middle ear structure. Currently, there is no sufficient method to determine the coupling efficiency intraoperatively. For this application a objective method was introduced to allow intraoperatively measured auditory brainstem responses (ABRs), while stimulating the patient via the implant. For this purpose the Vibrant Soundbrigde® (VSB) was coupled with a wireless streamer (miniTEK, Signia GmbH, Erlangen) or the Carina® actuator was connected via Audiocable to an ABR device. The ABR device transmits the stimuli direct to the implant, which is coupled to the middle ear structure. The ABRs are evoked by chirpsounds, using the optimized VSB-CE-Chirps (VSB) or standard CE-Chirp (Carina®) starting from levels above bone conduction thresholds to levels below threshold. These method can measure the intraoperative integrity of the implant and the coupling efficiency to avoid insufficient hearing outcomes. Furthermore, the determination of aided thresholds could be used to help fitting in children and difficult cases and could determine hearing degradation over time. Overall, a method to determine the coupling effiency intraoperatively during VSB and Carina® implantation surgeries could be established. Furthermore, intraoperative ABRdata from 30 VSB and 10 Carina® implantations and the outcomes of these patients are described. KW - Mittelohrimplantat KW - evozierte Potentiale KW - intraoperative Ankopplungseffizienz Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-201068 ER - TY - THES A1 - Ipek, Rojda T1 - Einfluss der murinen Anti-CD52-Antikörper-Therapie auf die Neurodegeneration in der chronischen MP4-induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis als Mausmodell der Multiplen Sklerose T1 - Effect of murine anti-CD52 antibody therapy on neurodegeneration in chronic MP4-induced experimental autoimmune encephalomyelitis as a mouse model for multiple sclerosis N2 - Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) und stellt die häufigste Ursache frühzeitiger Behinderung junger Erwachsener dar. Kennzeichnend sind multifokale ZNS-Läsionen, die durch Inflammation, Demyelinisierung und Axonschäden geprägt sind und zu multiplen neurologischen Defiziten führen. Derzeit ist es mithilfe der verlaufsmodifizierenden Therapie möglich, die Immunantwort abzuschwächen und damit die Krankheitsprogression zu verzögern. Geheilt werden kann die Erkrankung jedoch bislang nicht. Dabei ist nicht hinreichend geklärt, ob die neuen Therapieoptionen über die Immunmodulation/-suppression hinaus einen anhaltenden Schutz vor der langfristigen Neurodegeneration bieten. Basierend auf den vielversprechenden Ergebnissen klinischer Studien zur Therapie der schubförmig-remittierenden MS mit dem Anti-CD52-Antikörper Alemtuzumab, der zu einer Depletion CD52-exprimierender Immunzellen führt, wurden diesbezüglich Analysen in MS-Tiermodellen durchgeführt. Da die Untersuchung der zugrunde liegenden Patho- und Effektormechanismen am Menschen kaum möglich ist, ist die MS-Forschung für ein tiefergehendes Verständnis auf Tiermodelle angewiesen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist hierbei das am weitesten verbreitete Modell der MS, wofür vor allem der C57BL/6 (B6) -Mausstamm verwendet wird, da auf diesem Hintergrund die meisten genmodifizierten Mäuse gezüchtet werden. Jene tierexperimentellen Studien, in denen ein muriner Anti-CD52-Antikörper im frühen Krankheitsstadium der EAE (Auftreten erster paralytischer Symptome) verabreicht wurde, erbrachten den Hinweis einer neuroprotektiven und scheinbar regenerativen Wirkung des Antikörpers. Über einen neuroprotektiven Effekt von Alemtuzumab im schwer behandelbaren chronisch-progredienten Stadium der MS ist jedoch wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit ist die erste detaillierte Untersuchung zum Einfluss des murinen Anti-CD52-Antikörpers auf die Demyelinisierung, den Axonschaden und die Hirnatrophie in der MP4-induzierten EAE der B6-Maus im chronischen Verlauf der Erkrankung (ab stabilem Plateau der klinischen Symptomatik). MP4 ist ein Myelinfusionsprotein aus MBP (Myelin-Basisches-Protein) und PLP (Proteolipidprotein), welches in B6-Mäusen durch aktive Immunisierung eine EAE induziert, die chronisch verläuft und als eines von wenigen Modellen neben der T-Zell-Abhängigkeit die an Bedeutung zunehmende B-Zell-Komponente der MS darstellt. Histopathologisch finden sich in der chronischen MP4-induzierten EAE eine ausgeprägte Rückenmarks- und Kleinhirnschädigung, die vor allem im Kleinhirn durch eine B-Zell-Aggregation charakterisiert ist. Nachdem die MP4-immunisierten Mäuse im chronischen Stadium der EAE an fünf aufeinanderfolgenden Tagen mit 10 mg/kg Körpergewicht murinem Anti-CD52-spezifischem IgG2a-Isotypantikörper bzw. murinem unspezifischem IgG2a-Isotyp-Kontroll-Antikörper behandelt worden waren, wurde die Lymphozytendepletion im peripheren Blut durchflusszytometrisch ermittelt und deren Einfluss auf MP4-spezifische Antikörper anhand eines indirekten Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) untersucht. Als Marker für Axonschäden wurde im Serum vorhandenes phosphoryliertes Neurofilament-Heavy (pNF-H) mithilfe eines indirekten Sandwich-ELISAs quantitativ bestimmt. Rückenmark und Kleinhirn wurden ultrastrukturell auf Veränderungen der Myelinisierung (mittels g-Ratio: Axondurchmesser geteilt durch Gesamtdurchmesser der Nervenfaser) und auf Axonpathologien (verringerter Abstand benachbarter Neurofilamente, axolytische Axone, axonaler Verlust) untersucht. Die Hirnatrophie wurde MRT-basiert gemessen und der klinische Verlauf täglich evaluiert. Durch die Anti-CD52-Antikörperbehandlung wurde die T- und B-Zellzahl zwar drastisch vermindert, die MP4-spezifische Antikörperproduktion blieb davon jedoch unbeeinträchtigt. Ein günstiger Effekt auf die De- und Remyelinisierung war nicht festzustellen. Das Hirnvolumen und die klinische Präsentation der Mäuse blieben ebenfalls unverändert. Während kein Unterschied der pNF-H-Konzentration zu erkennen war, konnte ultrastrukturell jedoch ein geringerer Axonschaden nachgewiesen werden. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass der Anti-CD52-Antikörper im chronischen Verlauf der EAE/MS wenig Einfluss auf die neurodegenerativen Prozesse nimmt und die Regeneration nicht fördern kann. Die Ursache liegt vermutlich in der Undurchlässigkeit der Bluthirnschranke für Antikörper sowie dem limitierten Verständnis der Antikörperwirkung im ZNS. Die vorliegende Studie regt somit zur Etablierung von ZNS-wirksamen Antikörpern an und unterstreicht die Bedeutung der Entwicklung von selektiveren neuroprotektiven und remyelinisierungsfördernden Behandlungsansätzen, die eine wertvolle Ergänzung zur verlaufsmodifizierenden Therapie darstellen könnten. N2 - Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disorder of the central nervous system (CNS) and the most frequent cause of early disabilities in young adults. Multifocal CNS lesions are typical for the disease and characterized by inflammation, demyelination and axonal pathology that lead to multiple neurological deficits. Currently disease modifying therapies (DMTs) make it possible to reduce the immune response and to delay the progression of the disease, but there is still no cure for MS. However, it is not fully understood whether these new treatment options provide long-lasting protection against neurodegeneration beyond immune modulation/-suppression. Based on promising data from clinical studies of the anti-CD52 antibody alemtuzumab for the treatment of relapsing-remitting MS that leads to depletion of CD52-expressing lymphocytes, investigations on this question were performed in animal models for MS. Since studies of the underlying pathomechanisms and effector functions are difficult to carry out in humans, MS research is still dependent on animal models to gain deeper understanding. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely distributed model for MS, for which the C57BL/6 (B6) mouse strain is commonly used, since most gene-modified mice are bred on this background. The animal experiments that applied a murine anti-CD52 antibody at early disease stage of EAE (first appearance of paralytic symptoms) indicated a neuroprotective and apparent regenerative effect of the antibody. Indeed, little is known about a neuroprotective effect of alemtuzumab when given at the chronic progressive phase of MS which is still difficult to treat. The present study is the first detailed investigation on the impact of the murine anti-CD52 antibody on demyelination, axonal damage and brain atrophy in MP4-induced EAE in B6 mice during the chronic stage of the disease (starting at stable plateau of clinical symptoms). MP4 is a myelin fusion protein of MBP (myelin basic protein) and PLP (proteolipid protein) that induces chronic EAE in B6 mice via active immunization. MP4-induced EAE is one of the few models that reflects the B cell component in addition to the T cell-mediated features of MS. Its chronic stage is characterized by severe spinal cord and cerebellar pathology with B cell aggregation especially in the cerebellum. After MP4-induced mice were treated at the chronic stage of EAE either with 10 mg/kg body weight murine anti-CD52 specific IgG2a isotype antibody or murine unspecific IgG2a isotype control antibody for five consecutive days, flow cytometric analysis of lymphocyte depletion was performed on peripheral blood and its effect on MP4-specific antibodies was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The level of released phosphorylated neurofilament-heavy (pNF-H) in the serum as a marker for axonal damage was measured by indirect Sandwich-ELISA. Change of myelination (by using the g-ratio: axon diameter divided by nerve fiber diameter) and axonal pathology (decreased nearest neighbour neurofilament distance, axolytic axons, axonal loss) was evaluated in spinal cord and cerebellum by electron microscopy. Brain atrophy was measured based on MRI and clinical course was daily evaluated. The treatment with the anti-CD52 antibody drastically reduced the number of T cells and B cells, while the titers of MP4-specific antibodies remained unaffected. There was no effect on de- and remyelination. Furthermore, brain volume and clinical disease severity remained unaltered. While there was no difference in pNF-H concentration, on the ultrastructural level the number of damaged axons was decreased. In sum, these data reveal that the anti-CD52 antibody has a low impact on neurodegenerative processes and none on regeneration in the chronic stage of EAE/MS. This is probably due to the impermeability of the blood-brain barrier for antibodies and the limited understanding of the effects of antibody treatment in the CNS. Thus, this study points towards the need for effective antibody treatment in the CNS as well as for more selective neuroprotective and remyelination promoting therapeutic strategies that could complement the existing DMTs. KW - Multiple Sklerose KW - Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis KW - Neurodegeneration KW - Anti-CD52-Antikörper Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-225766 ER - TY - THES A1 - Lodes, Nina Theresa T1 - Tissue Engineering für seltene Erkrankungen mit Störungen des mukoziliären Transports T1 - Tissue engineering for rare diseases with impaired mucociliary transport N2 - Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann. N2 - Cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia (PCD) are two rare diseases which,among others, impair the mucociliary transport. CF is one of the most common in-herited metabolic diseases with patients suffering from a defect in theCystic FibrosisTransmembrane Conductor Regulator(CFTR) gene, which is characterized by the pro-duction of highly viscous secretions in mucin-producing organs such as the gastrointestinaltract and lungs. Patients suffering from PCD have defects in currently approximately 38known and PCD-associated genes resulting in structural defects of the ciliary appara-tus and thus in dysfunctional cilia. Since neither CF nor PCD have any chance of beingcured so far, the main focus is on alleviating the symptoms. The basic goal is the long-term preservation of lung function and the prevention of microbial infections. Previousmodel systems for exploring possible therapeutic options have been animal models thatcan never completely represent the human phenotype due to species diversity. Humanintestinal organoid cultures are considered as a promising test system for cystic fibro-sis. However, since respiratory symptoms are mainly responsible for patient mortality,CF respiratory models provide better test systems for future therapeutics. Respiratoryorganoid cultures have been used to study CFTR functionality, but do not completelyrepresent thein vivosituation. In order to develop new therapeutic strategies, patient-specific 3Din vitrotest systems for the human respiratory tract expressing functionalkinocilia are required, which can be used in particular with regard to personalized medi-cine.In the present thesis, a new method for obtaining cells from nasal mucosal brush biop-sies was established, that guarantees a standardised supply of human primary materi-al. In order to generate a disease-specific cell line, such as a PCD cell line, using theCRISPR/Cas9 system, a respiratory cell line that fully represents thein vivosituation isrequired. Hence, four different respiratory epithelial cell lines (HBEC3-KT, Calu-3, VA10and Cl-huAEC) were investigated with regard to their mucociliary phenotype, wherebyonly the cell line HBEC3-KT differentiated into ciliated cells. However, these showed ki-nocilia only on approx. 5 % of the model’s surface, thus the human respiratory mucosacould not be completely modelled and HBEC3-KT cell line is no suitable cell line for geneediting experiments.Tissue engineering made it possible to build 3Din vitrotest systems based on two differentmatrices, the biological SIS (small intestine submucosa) and synthetic PET (polyethyleneterephthalate) membranes. 3D airway test systems were generated using human primarynasal and tracheobronchial epithelial cells. In addition to histological investigations and the characterization of specific markers of the respiratory system by immunofluorescence,the ultrastructure of the models was analyzed with a special focus on ciliary structures.In order to gain insight into the ciliary functionality and thus to achieve a highin vivocorrelation, the method of high-speed video microscopy was established within the scopeof this work at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, which allowsthe analysis of ciliary beat frequency as well as mucociliary transport. The influence ofisotonic saline solution and salbutamol, aβ2-adrenergic agonist mainly used as broncho-dilator in asthma patients, on ciliary beat frequency was also analyzed. It could be shownthat both substances increased the ciliary beat of the primary respiratory mucosa models.In order to generate test systems for the two rare diseases CF and PCD, epithelial cellsof the affected patients were first examined by non-invasive Raman spectroscopy for apotential biomarker that could be used in diagnostic approaches. However, no biomarkerfor CF or PCD could be detected, with PCD cells showing a low separation to non-PCDcells. Subsequently, 3D test systems based on patient cells were developed. The phenotypeof the CF models was verified by immunohistological staining and analysis of impairedmucociliary transport. Ultrastructural ciliary defects could be identified by ultrastructuralanalysis of cilia cross sections in three donor-specific PCD models. Additionally, ciliaryfunctionality could not be detected using high speed video microscopy analysis.In summary, this work succeeded in establishing a new method for the complete characte-rization of 3D airway test systems, which allows the analysis of ciliary beating frequencyand mucociliary transport. It has been shown for the first time that tissue engineering canbe used to generate a personalized disease model for PCD using a decellularized poricinejejunum as a scaffold. Both, PCD and CF disease models could in future be regarded astest systems for potential therapeutics. KW - In-vitro-Kultur KW - Tissue Engineering KW - Gewebekultur KW - Individualisierte Medizin KW - Respiratorisches System KW - Primäre Ziliendyskinesie KW - airways KW - primary ciliary dyskinesia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200178 ER - TY - THES A1 - Kirchner, Juliane T1 - Die Veränderungen der Tight Junction-Proteine der Blut-Rückenmarkschranke in einem neuropathischen Schmerzmodell bei Ratten T1 - Tight junction proteins in the blood-spinal cord barrier in neuropathic pain N2 - Neuropathische Schmerzen treten in der klinischen Praxis häufig auf und beeinträchtigen in hohem Maße die Lebensqualität der Patienten. Bedingt durch eine Schädigung somatosensorischer Nervenstrukturen im peripheren oder zentralen Nervensystem ist der Schmerz meist durch eine Allodynie, Hyperalgesie oder einschießende Schmerzen charakterisiert. Diese Symptome lassen sich durch gängige Schmerzmittel kaum lindern. In jüngerer Zeit rückte die Blut-Rückenmarkschranke immer mehr in den Fokus verschiedener Untersuchungen, da auch einige nicht-schmerzhafte Erkrankungen (z.B. Multiple Sklerose und Amyotrophe Lateralsklerose) zur Veränderung dieser Barriere mit folgender Permeabilitätserhöhung durch reduzierte Tight Junction-Protein-Expression führen. Die Blut- Rückenmarkschranke dichtet Gefäße des Rückenmarks ab und verhindert das Eindringen toxischer oder proanalgetischer Mediatoren in das zentrale Nervensystem. Dafür ist die Funktion der Tight Junction-Proteine zur Aufrechterhaltung dieser Barriere essentiell. Dennoch konnte die Rolle der Blut-Rückenmarkschranke bei Neuropathie noch nicht vollständig erörtert werden. Die Untersuchungen meiner Arbeitsgruppe konnten bereits zeigen, dass eine lockere Ligatur des N. ischiadicus bei Ratten (CCI; chronic constriction injury) zur Entwicklung einer thermischen und mechanischen Hyperalgesie sowie eingeschränkten motorischen Funktionen führt. Zudem konnte eine Störung der Blut-Rückenmarkschranke nach einer CCI nachgewiesen werden, da es Tracern unterschiedlicher molekularer Größe möglich war das Rückenmark zu penetrieren. Daher sollte im Rahmen dieser Dissertation untersucht werden, inwieweit es zu einer Veränderung unterschiedlicher Tight Junction-Proteine nach peripherer Nervenverletzung (CCI) kommt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass eine CCI zu einer Herabregulation der mRNA-Expression von Claudin-1, Claudin-19, Tricellulin und Occludin im Rückenmark führt, wobei diese Veränderungen insbesondere 7 und 14 d nach der CCI auftraten. Die membranäre Expression dieser Proteine im Rückenmark blieb bis auf Occludin unverändert, das 7 d nach der CCI signifikant reduziert war. Am deutlichsten waren jedoch Claudin-5 und ZO-1 verändert. Folglich vermindert eine CCI signifikant die Claudin-5-mRNA sowie die Immunreaktivität in isolierten Kapillaren des Rückenmarks. Das Ankerprotein ZO-1 war sogar auf allen Ebenen, also in der Genals auch Proteinexpression, und darüber hinaus in den Rückenmarkskapillaren signifikant reduziert. Die Interpretation dieser Ergebnisse legt nahe, dass ZO-1, und zum Teil auch Claudin-5, für die gestörte Blut-Rückenmarkschranke verantwortlich sind und die anderen untersuchten Proteine vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Die Bedeutung der Tight Junction-Proteine in der Blut-Rückenmarkschranke konnte somit weiter untermauert werden. In zukünftigen Untersuchungen wäre es wichtig den Signalweg, der zur Veränderung der Tight Junction-Proteine führt sowie die subzelluläre Lokalisation zu untersuchen, um Möglichkeiten zum Wiederverschluss der Barriere zu finden. Somit könnten Therapien zur Aufrechterhaltung der Blut- Rückenmarkhomöostase den neuropathischen Schmerz unter Umständen kausal, und nicht nur symptomatisch, behandelbar machen. N2 - Chronic neuropathic pain is common in clinical practice and it greatly impairs the quality of life of patients. Due to a lesion or disease of the peripheral or central nervous system neuropathic pain is characterized by allodynia, hyperalgesia and spontaneous pain. The treatment of neuropathic pain remains a challenge since conventional pain treatment is not effective in alleviating most types of neuropathic pain. Lately a lot of research has focussed on the function of the blood-spinal cord barrier (BSCB) since some non-painful diseases (e.g. multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis) compromise the barrier and lead to reduced tight junction protein expression. The BSCB prevents leakage of molecules such as pronociceptive and toxic mediators into the spinal cord. Tight junction proteins are essential in maintaining this barrier by restricting the paracellular diffusion pathway. Nevertheless, the pathophysiology of neuropathic pain is not completely understood. Recently, this scientific work group observed that rats with a loose ligation of the sciatic nerve (CCI) developed thermal and mechanical hypersensitivity and reduced motor performance. The BSCB became permeable for small and large tracers indicating a breakdown of the barrier. This study was therefore designed to explore selected tight junction proteins after nerve injury using CCI. The mRNA expression of claudin-1, claudin-19, tricellulin and occludin was significantly reduced at 7 and 14 days after CCI. No alteration in protein expression was observed at any chosen time point except for occludin which was significantly decreased 7 days after CCI. In addition, CCI leads to a reduction of tight junction proteins most pronounced for claudin-5 an ZO-1. Claudin-5 mRNA expression and immunoreactivity in spinal cord capillaries is significantly reduced after CCI. The anchor protein ZO-1 is even downregulated at mRNA and protein levels in the whole lumbar spinal cord as well as in the spinal cord capillaries. In conclusion, this research shows that ZO-1 and in part claudin-5 are necessary for maintaining the BSCB while other tight junction proteins possibly play a minor role for the tightness of the barrier. These results further emphasize the importance of tight junction proteins in the BSCB. In future research the signaling pathway and regulation of these tight junction proteins should be explored as barrier sealing could be a possibility for pain relief in the future. KW - Tight junction KW - Neuralgie KW - Blut-Rückenmarkschranke KW - Neuropathischer Schmerz Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-222634 ER - TY - THES A1 - Müller-Scholden, Lara T1 - Einfluss spezifischer kardiovaskulärer Risikofaktoren und ihrer Kombination auf die Karotis-Intima-Media-Dicke und Erstellung von Normwerten – Ergebnisse der STAAB Kohortenstudie T1 - Impact of particular Cardiovascular Risk Factors and their combination on Carotid-Intima-Media-Thickness (CIMT) and Development of Reference Values among Healthy Adults – Findings from the STAAB cohort study N2 - Primary prevention in cardiovascular diseases is becoming more and more important as they are still the number one cause of morbidity and mortality in industrialized countries. Many cardiovascular events may even occur in clinically asymptomatic patients. The atherosclerosis as underlying pathogenesis is increasingly well understood and risk factors with a harmful influence are identified. However, by measuring the carotid-intima-media-thickness (CIMT) via B-mode ultrasound there is a widely accepted, safe, noninvasive, sensitive and reproducible technique to assess subclinical vascular diseases. The CIMT is established as a surrogate marker for atherosclerosis and its increase is associated with the presence of cardiovascular risk factors. The basic prerequisite for further risk stratification, according to the level of arteriosclerosis represented by the CIMT, is to define gender-, age- and region-specific reference values. The latest version of the international guidelines for cardiovascular risk prediction do no longer recommend the use of CIMT for cardiovascular risk prediction in the general population. This may be attributed to the fact, that the experts refer to studies in which only the measurement of a single segment was considered. Thus the aim of the present study was to assess a potential segment-specific impact of particular cardiovascular risk factors on the CIMT. Furthermore the goal was to evaluate the relevance of the existing models for risk prediction and to discuss the current recommendations for the use of CIMT. Additionally, reference values were developed from data of a representative group of the general population of Würzburg and the reproducibility of the data collection was examined. Subjects derived from the population-based STAAB (Characteristics and Course of Heart Failure Stages A-B and Determinants of Progression) cohort study, that included people of the general population of Würzburg aged 30 to 79 years [12]. CIMT was measured on the far wall of both sides in three different predefined locations: common carotid artery (CCA), bulb, and internal carotid artery (ICA). Diabetes, dyslipidemia, hypertension, smoking and obesity were considered as risk factors. In multivariable logistic regression analysis, odds ratios of risk factors per location were estimated for the endpoint of individual age- and sex-adjusted 75th percentile of CIMT. These thresholds were derived from the standard values of the general population. An apparently healthy subpopulation was formed to generate these reference values, which consists only of people that did not exhibit any of the above mentioned risk factors or manifest cardiovascular diseases. 2492 subjects were included in the analysis. Segment-specific CIMT was highest in the bulb, followed by CCA, and lowest in the ICA. The reproducibility between the investigators was overall weaker than in comparable studies, therefore a potential improvement of the training protocol for inexperienced persons was assumed. Moreover, the results of the reproducibility analysis illustrate the need for a standardized, internationally recognized protocol for the training of CIMT investigators and an exact measurement protocol. The reference values of the apparently healthy population were consistent with values from other authors collected in a comparable way and formed the basis for further investigations. CIMT increases with age and independently with the number of risk factors. Dyslipidemia, hypertension, and smoking were associated with higher CIMT, but diabetes and obesity were not (OR (95% CI) between 1.28 (0.98 - 1.65), ACC, and 1.86 (1.53 - 2.27), bulb). We observed no segment-specific association between the three different locations and risk factors, except for a possible interaction between smoking and ICA. As no segment-specific association between cardiovascular risk factors and CIMT became evident, one simple measurement of one location may suffice to assess the cardiovascular risk of an individual. In addition, the identified risk factors are reflected in the current models for risk prediction and prevention, so that the added value of the use of CIMT in the general population loses importance. N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen sind unverändert die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in den Industrienationen [1]. Die Risikoprädiktion und -prävention dieser Erkrankungen ist von großer Bedeutung, unter anderem deswegen weil primäre Ereignisse bei bis dato asymptomatischen Personen auftreten können [2]. Die zugrundeliegende Pathogenese, die Arteriosklerose, ist immer besser erforscht und zugleich sind Risikofaktoren identifiziert, die einen schädlichen Einfluss haben [3, 4]. Durch die Messung der Karotis-Intima-Media-Dicke (Carotid-Intima-Media-Thickness, CIMT) mittels B-Mode Ultraschall steht eine weit verbreitete, sichere und anerkannte Methode zur Verfügung, mit der bereits subklinische Formen der Arteriosklerose erfasst werden können [5]. Die CIMT ist als Surrogatparameter für eine generalisierte Arteriosklerose im gesamten Gefäßsystem etabliert und ihre Zunahme wird mit dem Vorliegen von kardiovaskulären Risikofaktoren assoziiert [6-8]. In der Risikoprädiktion mit Hilfe der CIMT bilden geschlechts-, alters- und regionalspezifische Normwerte die Basis [5]. Die aktuellen internationalen Leitlinien empfehlen in ihren neusten Fassungen, nicht mehr die CIMT zur kardiovaskulären Risikoprädiktion in der Allgemeinbevölkerung einzusetzen [1, 9]. Die Experten berufen sich auf Studien, in denen lediglich ein singuläres Messsegment betrachtet wurde [1, 9-11]. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Einfluss spezifischer kardiovaskulärer Risikofaktoren auf die verschiedenen Segmente der A. carotis zu erfassen und – davon ausgehend – den Stellenwert der vorhandenen Modelle zur Risikoprädiktion zu evaluieren. Des Weiteren wurden Normwerte aus einer repräsentativen Gruppe der Würzburger Allgemeinbevölkerung gebildet und die Reproduzierbarkeit der Ultraschalluntersuchung im Bereich der Halsschlagader überprüft. Den Berechnungen liegen Daten der STAAB-Kohortenstudie (Häufigkeit und Einflussfaktoren auf frühe STAdien A und B der Herzinsuffizienz in der Bevölkerung) zugrunde, einer große Bevölkerungsstudie, die seit 2015 Daten der Würzburger Bevölkerung erhebt [12]. Es wurden Probanden zwischen mit einem Alter zwischen 30 und 79 Jahren eingeschlossen. Die CIMT wurde auf beiden Seiten des Halses auf der schallkopffernen Seite an drei vorab definierten Lokalisationen des Gefäßes, der A. carotis communis (ACC), dem Bulbus und der A. carotis interna (ACI), vermessen. Es wurden die fünf Risikofaktoren Diabetes mellitus, Dyslipidämie, Hypertonie, Rauchen und Übergewicht berücksichtigt. Mittels einer logistischen Regression wurde der spezifische Einfluss dieser Faktoren auf die individuelle, alters- und geschlechtsbasierte 75. Perzentile der CIMT in den einzelnen Lokalisationen betrachtet. Diese Grenzwerte stammten aus den eigens erstellten Normwerten für die Allgemeinbevölkerung. Es wurde eine „gesunde“ Subpopulation zur Erstellung dieser Normwerte gebildet, die keine der oben genannten Risikofaktoren sowie keine manifesten kardiovaskulären Erkrankungen aufwiesen. Die Auswertung umfasste die Daten von insgesamt 2492 Probanden. Die segmentspezifische CIMT war am größten im Bereich Bulbus, gefolgt von der ACC und der ACI. Männer hatten höhere Wanddickenwerte und mehr Risikofaktoren als Frauen. Die Reproduzierbarkeit zwischen den einzelnen Untersuchern war insgesamt moderat bis stark. Im Vergleich zu anderen Studien zeigte sich jedoch insgesamt eine schwächere Übereinstimmung, so dass von einer potentiellen Verbesserung des Schulungsprotokolls für unerfahrene Personen ausgegangen wird. Die Ergebnisse der Reproduzierbarkeitsanalyse verdeutlichen den Bedarf eines standardisierten, international anerkannten Protokolls zur Schulung von Untersuchern der CIMT und eines exakten Messprotokolls [5, 13]. Die erhobenen Normwerte der „Gesunden“ zeigten eine Konsistenz mit verschiedenen, auf vergleichbare Weise erhobenen Werten und bildeten die Basis für die weiteren Untersuchungen. Die CIMT nahm mit dem Alter und – unabhängig davon – ebenfalls mit der Anzahl an Risikofaktoren zu. Die Faktoren Dyslipidämie, Rauchen und Hypertonie hatten einen statistisch signifikanten Einfluss für das Überschreiten des Grenzwertes der 75. Perzentile (OR (95 % KI) zwischen 1,28 (0,98 – 1,65), ACC, und 1,86 (1,53 – 2,27), Bulbus) [14]. Die Faktoren Diabetes mellitus und Übergewicht zeigten im verwendeten Modell keinen Effekt auf die CIMT. Insgesamt konnte, bis auf eine mögliche Interaktion zwischen dem Risikofaktor Rauchen und der ACI, kein segmentspezifischer Effekt beobachtet werden [14]. Daraus resultierend wurde die Hypothese aufgestellt, dass zur Erfassung des kardiovaskulären Risikos einer Person die Messung eines singulären Segments möglicherweise ausreicht [14]. Dies stärkt die neusten Empfehlungen der Leitlinien, die sich auf Studien berufen, welche eben nur ein Segment betrachteten. Die identifizierten Risikofaktoren spiegeln sich darüber hinaus in den gängigen Modellen zur Risikoprädiktion und -prävention wider. Demnach gerät der Einsatz der CIMT zur Bestimmung des individuellen Risikos von Personen der Allgemeinbevölkerung in den Hintergrund [15]. KW - Arteriosklerose KW - Karotis-Intima-Media-Dicke KW - Risikofaktoren Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-220292 ER - TY - THES A1 - Weiß, Neele T1 - Bedeutung des MEK5/ERK5-Signalwegs in der zielgerichteten Melanomtherapie T1 - Function of the MEK5/ERK5-Pathway in the targeted Therapy of Melanoma N2 - In dieser Dissertation wird der MEK5/ERK5- Signalweg als möglicher Angriffspunkt in der zielgerichteten Melanomtherapie identifiziert. Die Adressierung von ERK5 bietet eine Alternative, um einer Resistenzentwicklung gegenüber Inhibitoren des MAPK- Signalwegs entgegenzuwirken. Das maligne Melanom ist ein hochaggressiver Tumor mit steigender Inzidenz. Zunehmende Sonnenstunden im Rahmen des Klimawandels mit erhöhter Belastung der Haut durch UV-Strahlung werden die Problematik des malignen Melanoms für den Menschen in den nächsten Jahren weiter zunehmen lassen. Die Aktivierung des MEK5/ERK5- Signalwegs scheint eine Reaktion von Tumorzellen auf Therapiestress zu sein. Diese Aktivierung liefert den Melanomzellen einen Überlebensvorteil und verhindert ein langfristiges Therapieansprechen. ERK5 beeinflusst den Zellzyklus von Melanomzellen und ist somit möglicherweise von wichtiger Bedeutung in der Tumorgenese des malignen Melanoms. Patienten mit NRAS- Mutation profitieren auffallend weniger von einer gezielten MEKi-Therapie als solche mit BRAF Mutation. Für ersteres Patientenkollektiv steht aktuell lediglich die Immuntherapie zur Verfügung, wodurch oft nur ein kurzes, progressionsfreies Intervall erreicht werden kann und die Patienten häufig unter schweren Nebenwirkungen leiden. Grund für die problematische Behandlung könnte das häufige Auftreten einer basalen ERK5- Aktivierung in NRAS- mutierten Melanomen sein. Diese Arbeit liefert eine positive Prognose über den Nutzen einer ERK5- Inhibition als Erweiterung des Therapieschemas. Diese These gilt auch für Melanompatienten mit einer BRAF- Mutation. Patienten, die an einem malignen Melanom erkrankt sind, weisen zu 80% eine Mutation in einem dieser beschriebenen Onkogene auf. Die Arbeit lässt darauf schließen, dass eine ERK5- Inhibition in der Therapie von beiden Gruppen erfolgreich sein könnte und somit das Leben nahezu aller Melanompatienten betrifft. N2 - In this thesis, targeting the MEK5/ERK5- pathway is identified as a possible treatment option for maligant melanoma in order to prevent the development of resistances against inhibitors of the MAPK- pathway. The malignant melanoma is a highly aggressive tumor with an increasing incidence. A rising amount of sun exposure due to climate change will lead to increasing skin damage among the population and thus the malignant melanoma may emerge as an important medical problem throughout the following decade. The activation of the MEK5/ERK5 pathway seems to be a cellular response to therapeutic stress. It therefore results in sustained proliferation and survival in melanoma cells and prevents an efficiant therapy in the longterm. ERK5 has influence on the cell cycle progression of melanoma cells and could be of utmost importance for the tumorigenesis in malignant melanoma. Patients suffering from NRAS- mutant melanoma benefit remarkably less from MAPK-pathway targeting regimens than those with BRAF- mutation. In these cases immunotharpy remains as the only valuable treatment option yet barely achieving a short progression free survival with severe side effects. The obstacle of effective therapy could be the frequently found occurrence of a basal ERK5- activity especially observed in NRAS- mutant melanoma cells. Our data imply that MEKi/ERK5i co-treatment could provide a new therapeutic approach as an adjunct to targeted therapy of malignant melanoma improving its overall effectiveness. This discovery does not only apply for NRAS- mutant melanoma but also for patients with BRAF- mutation. In 80% of malignant melanoma the driver mutation can be found in one of these two oncogenes suggesting the majoryty of melanoma patients might benefit from MEK5/ERK5- Inhibition. KW - Melanom KW - MAP-Kinase KW - MEK5/ERK5 KW - Therapieresistenz Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219073 ER - TY - THES A1 - Yurdadogan, Tino T1 - Endorganschaden und Gefäßalter bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit T1 - End organ damage and vascular age in patients with coronary artery disease N2 - Die nicht-invasive Gefäßdiagnostik stellt einen wichtigen Pfeiler in der Prävention von Herz-Kreislauferkrankungen dar. Während lange Zeit die sonographische Messung der cIMT, als morphologisches Korrelat der Gefäßalterung, als Goldstandard galt, ist in den letzten Jahren in Gestalt der Pulswellenanalyse/PWV-Messung eine Technik weiterentwickelt worden, die, als funktionelles Korrelat der Gefäßalterung, aufgrund der leichteren Durchführbarkeit und geringerer Untersucherabhängigkeit und Kosten vielversprechend ist. So erlaubt die Messung der Pulswelle mittels gewöhnlicher Blutdruckmanschetten, genau wie die cIMT, die Berechnung des individuellen Gefäßalters und die Diagnostik für das Vorliegen eines Endorganschadens der Blutgefäße. Um die Messergebnisse der beiden Untersuchungen miteinander zu vergleichen, wurden beide in der EUROASPIRE-IV Studie an Patienten mit koronarer Herzkrankheit durchgeführt. Die Auswertung der Messergebnisse der mit dem Vascular Explorer durchgeführten Pulswellenanalyse/PWV-Messung ergab überraschenderweise, dass die Mehrheit der herzkranken Patienten weder eine vaskuläre Voralterung noch einen Endorganschaden der Blutgefäße aufweisen. Im Falle der cIMT-Messung war Gegenteiliges der Fall, was trotz der medikamentösen Therapie der Patienten so zu erwarten war. Weiterhin zeigte sich lediglich eine geringe Korrelation zwischen den Messergebnissen beider Untersuchungen. Die Determinanten der einzelnen Messwerte aus cIMT und Pulswellenanalyse/PWV-Messung waren deckungsgleich mit den in der Literatur beschriebenen Faktoren, wenn auch viele der sonst signifikanten Regressoren das Signifikanzniveau in unserer Auswertung nicht unterschritten. Eine Limitation der funktionellen Gefäßdiagnostik liegt derzeit darin, dass die Messergebnisse stark von dem verwendeten Messgerät abhängen. Es liegen noch zu wenig Vergleichsstudien vor, um die Messergebnisse, speziell von neueren Geräten wie dem Vascular Explorer, auf andere zu übertragen. Bei der Berechnung des Gefäßalters sollten daher optimalerweise gerätespezifische Normwerte vorliegen, was beim Vascular Explorer nicht der Fall ist. Gleiches gilt für die Verwendung des PWVcf-Grenzwerts für die Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße. Analog hat auch die Messung der cIMT gewisse Einschränkungen. So wäre eine weitere Standardisierung der Messorte (A. carotis communis vs Bulbus vs A. carotis interna), zwischen denen sich die durchschnittliche cIMT erheblich unterscheidet, sowie der Messparameter (Minimal- vs Maximal- vs Mittelwert) wünschenswert. Die universelle Anwendung eines cIMT-Grenzwerts zur Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße ist daher kritisch zu sehen. Dies zeigt sich auch darin, dass in den neuesten Leitlinien der bislang geltende Grenzwert angezweifelt und kein aktuell gültiger Grenzwert mehr genannt wird. Wir interpretieren unsere Ergebnisse dahingehend, dass unsere Messung der cIMT die zu erwartende pathologische Gefäßalterung bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit besser widerspiegelt als die Messung der Pulswelle mit dem Vascular Explorer. Welche der beiden Untersuchungen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeit überlegen ist, muss im Rahmen von Längsschnittstudien geklärt werden. N2 - Non-invasive vascular diagnostics play an important role in the prevention of cardiovascular diseases. For a long time, sonographic measurement of the cIMT was considered the gold standard. Yet, by continually developing the PWA/PWV measurement, a promising technique is available, that is easy to handle and has better inter-examiner reproducibility at lower costs. Just like the cIMT examination, recording and analysing the pulse wave via blood pressure cuffs allows the determination of the individual vascular age and to diagnose end organ damage of the arteries. In order to compare the results of both examinations, they were performed during the EUROASPIRE IV-study in patients with coronary artery disease. Despite being under medication, we expected to find early vascular aging in most patients. Surprisingly, according to the results of the PWA/PWV measurement with the Vascular Explorer device, most of the study population neither showed early vascular aging nor met the criteria for end organ damage of the arteries. cIMT measurements delivered the opposite results. Moreover, we found only poor correlation between the measured values of both examinations. Regression analysis yielded determinants of cIMT and PWA/PWV measurement, which were largely congruent with those described in literature. The most apparent weakness of evaluating the vascular status by means of PWA/PWV measurement lies in the poor inter-device comparability. Due to a lack of comparative studies with large sample sizes, measured values of different devices are currently not transferable. Nonetheless, reference values used for vascular age determination with the Vascular Explorer are available in a study using a different device. Furthermore, the PWV threshold for diagnosing end organ damage is applied regardless of the technique/device used for measurement, although an adjustment is urgently needed. Similarly, the cIMT measurement has certain limitations as efforts can still be made to better standardise examination protocols (e.g. sites of measurement (Common Carotid Artery vs Bulb vs Internal Carotid artery), obtained values (minimum vs maximum vs mean)). The formerly valid cIMT threshold is currently being called into question by the latest guidelines, as there is evidence of its underestimation. Ultimately, cIMT measurement better reflects the expected early vascular aging in patients with coronary artery disease than PWA/PWV measurement with the Vascular Explorer. However, longitudinal studies are necessary to further evaluate the prognostic value of both examinations. KW - Arteriosklerose KW - Pulswelle KW - Koronare Herzkrankheit KW - Endorganschaden KW - Gefäßalter KW - Carotis Intima Media Dicke Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218469 ER - TY - THES A1 - Frömbling, Greta Eliza T1 - Verstärkung der Wirkung von TTFields auf Glioblastomzellen durch Inhibition des mitotischen Spindelkontrollpunktes T1 - Augmentation of the effects of TTFields on glioblastoma cells by mitotic checkpoint inhibition N2 - TTFields sind eine Therapieoption des GBM, welche als alternierende elektrische Felder den Aufbau des mitotischen Spindelapparates stören. Gleichzeitig überwacht der SAC, mit seiner Schlüsselkomponente der Kinase MPS1, eine korrekte Anheftung der Spindelfasern an die Kinetochore der Chromosomen. Eine Inhibition des SAC durch den Inhibitor MPS1-IN-3 in Kombination mit Vincristin führt zu einem synergistischen Effekt auf das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Aus diesen Erkenntnissen folgerten wir die Hypothese, dass eine SAC-Inhibition die Wirkung von TTFields verstärken könnte. Um dies zu testen, wurden Zellen der Zelllinien U87 und GaMG über 72h mit TTFields, MPS1-IN-3 oder einer Kombination aus den beiden behandelt. Anschließend wurden die Zellen gezählt, es wurde eine Analyse des Zellzyklus vorgenommen und apoptotische Zellen wurden via TUNEL-Assay detektiert. Die Kombinationsbehandlung aus TTFields und MPS1-IN-3 führte zu einer Reduktion der Zellzahl (U87: -54,3% vs. TTFields, p=0,0046; -52,9% vs. MPS1-IN-3, p=0,0026; GaMG: -74,3% vs. TTFields, p=0,0373; -84% vs. MPS1-IN-3, p<0,00001). Nur 28,1% mehr Zellen als ausgesät waren bei der Zelllinie U87 zu finden (TTFields: 179,1%; MPS1-IN-3: 168,3%), während es bei GaMG-Zellen sogar 62% weniger Zellen als ausgesät waren. Im Zellzyklus zeigte sich eine Abnahme der Zellen von der G1-Phase (U87: -59,9% vs. TTFields, p=0,0007; -42,1% vs. IN-3, p=0,0426; GaMG: -45,1% vs. TTFields, p=0,0276; -51,6% vs. IN-3, p=0,0020), während es zu einem massiven Anstieg von toten Zellen kam (U87: 2,9fach vs. TTFields, p=0,0022; 2,2fach vs. IN-3, p=0,0046; GaMG: 5,6fach vs. TTFields, p=0,0078; 7,8fach vs. IN-3, p=0,0005). Diese Zellen ließen sich im TUNEL-Assay als durch Apoptose zu Grunde gegangene Zellen weiter identifizieren (U87: 5,4fach vs. TTFields, p=0,0489; 6,2fach vs. IN-3, p=0,0278; GaMG: 8,9fach vs. IN-3, p=0,0110). Diese Ergebnisse sind erste und wichtige Hinweise für eine Verstärkung der Wirkung von TTFields durch eine Inhibition des SAC und liefern eine gute Grundlage für weitere Forschung zur Verbesserung der Therapie des GBM. N2 - TTFields are -in addition to the standard therapy- approved for GBM therapy. TTFields are alternating electric fields at a low intensity, which cause disruption of the mitotic spindle fibers. Whether spindle fibers are properly attached to the kinetochores is surveilled by the SAC. An inhibition of the kinase MPS1, a key component of the SAC, in combination with Vincristine treatment, results in a synergistic effect on GBM growth in vitro an in vivo (Tannous, Kerami et al. 2013). We hypothesized that a combination of inhibition of SAC in combination with TTFields increases TTFields efficacy. Cells of the cell lines U87 and GaMG were treated either with TTFields alone, the inhibitor MPS1-IN-3 alone or in combination of both. After 72h cells were counted, an analysis of the cell cycle was performed and apoptotic cells were detected by using a TUNEL-Assay. The combined treatment of TTFields and inhibition of SAC led to a significant decrease of cells (U87: -54.3% vs. TTFields, p=0.0046; -52.9% vs. MPS1- IN-3, p=0.0026; GaMG: -74.3% vs. TTFields, p=0.0373; -84% vs. MPS1-IN-3, p<0.00001). U87 cells proliferated only by 28.1% compared to the cells seeded at the beginning, while cells of the GaMG cell line diminished by 62% compared to the number of cells seeded (TTFields: 179.1%; MPS1-IN-3: 168.3%). The cell cycle analysis showed -among other effects- a reduction of the cells in phase G1 (U87: - 59.9% vs. TTFields, p=0.0007; -42.1% vs. IN-3, p=0.0426; GaMG: -45.1% vs. TTFields, p=0.0276; -51.6% vs. IN-3, p=0.0020), and an increase of dead cells (U87: 2.9x vs. TTFields, p=0.0022; 2.2x vs. IN-3, p=0.0046; GaMG: 5.6x vs. TTFields, p=0.0078; 7.8x vs. IN-3, p=0.0005). Those dead cells were identified by the TUNEL- Assay as cells, which had undergone apoptosis (U87: 5.4x vs. TTFields, p=0.0489; 6.2x vs. IN-3, p=0.0278; GaMG: 8.9x vs. IN-3, p=0.0110). These results strengthen the hypothesis that TTFields’ efficacy is increased by a combined treatment with an inhibition of the SAC and provide a basis for further research to improve GBM therapy. KW - Tumortherapiefeld KW - TTF KW - Tumor Treating Fields KW - TT-Fields KW - Glioblastomtherapie KW - therapy of glioblastoma Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216863 ER - TY - THES A1 - Wallstabe, Julia T1 - Induktion von GvHD-artigen Gewebeschäden an humanen artifiziellen Hautmodellen T1 - Induction of GvHD-like tissue damage in human artificial skin models N2 - Graft-versus-Host Disease (GvHD) stellt einen häufigen, den Gesamterfolg einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation limitierenden Faktor dar. Bei dieser Komplikation attackieren vor allem alloreaktive T-Lymphozyten des Stammzellspenders gesunde Körperzellen des Patienten. Infolgedessen kommt es zu Gewebeschäden in den Zielorganen Haut, Leber und Darm. Die Behandlung der GvHD erfordert eine effektive Immunsuppression, was wiederum Graft-versusTumor-Effekte kompromittiert und den Rückfall der malignen Grunderkrankung bedingen kann. Viele Patienten sprechen aus bisher ungeklärten Gründen nicht auf die klassische immunsuppressive Therapie mit Steroiden oder second-line Therapien an. Neue zelluläre Therapien zur Behandlung der refraktären GvHD sind auf dem Vormarsch, bedürfen aber einer weiterführenden klinischen Testung, auch um die exakten Wirkungsmechanismen zu verstehen. Idealerweise könnten neue Testsysteme das GvHD-Potential von allogenen Stammzellpräparaten oder aber das immunsuppressive Potential von neuen GvHD-Therapien vorhersagen, bevor diese in klinischen Studien eingesetzt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein erstes, in multiplen Replikaten einsetzbares, humanes organotypisches Gewebemodell zur Simulation einer GvHD-Reaktion am Beispiel der Haut zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden artifizielle humane Hautmodelle unter statischen (KollagenHautmodelle) und dynamischen Kulturbedingungen (vaskularisierte Hautmodelle) generiert. Die Injektion unstimulierter PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cells) führte zu keinen histomorphologischen Veränderungen in den KollagenHautmodellen. Im Gegensatz dazu hatte die Injektion vorstimulierter allogener PBMCs eine Zerstörung der epidermalen Strukturen der Kollagen-Hautmodelle zur Folge, welche vergleichbar waren mit Gewebeschäden bei einer akuten GvHD der Haut. Dieselben Schädigungen der Epidermis wurden durch die Injektion von Mediumüberständen vorstimulierter PBMCs in die Kollagen-Hautmodelle erreicht. Im Kulturmedium der Kollagen-Hautmodelle wurden hohe Konzentrationen von Interleukin 2 und 17, Interferon gamma sowie Tumornekrosefaktor alpha gemessen, wodurch auf die Beteiligung von Zytokinen an der inflammatorischen Reaktion geschlossen werden konnte. Auch im komplexeren vaskularisierten Hautmodell verursachte die Injektion vorstimulierter PBMCs histomorphologische Veränderungen entsprechend einer akuten Haut-GvHD sowie einen zeitabhängigen Anstieg proinflammatorischer Zytokine. Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Induktion einer starken Inflammations- und Immunreaktion in artifiziellen humanen Hautmodellen, welche histomorphologisch eine GvHD imitiert, möglich ist. Dieses Modell könnte als Grundlage für die Entwicklung eines klinisch relevanten Testsystems zur Bestimmung des GvHD-Restpotentials oder zur Festlegung der immunsuppressiven Kapazität innovativer Zellpräparate dienen. Somit könnten humane artifizielle GvHDModelle in klinischen Studien eingesetzt werden und die Erfahrungen aus Tiermodellen ergänzen sowie erste in vitro Ergebnisse im humanen System liefern, welche dann mit dem tatsächlichen klinischen Resultat verglichen werden könnten. N2 - Graft-versus-Host Disease (GvHD) remains the most important limiting factor for the success of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. This major complication is caused by alloreactive donor T-lymphocytes that attack healthy tissues of the recipient leading to severe tissue damage within the target organs skin, liver and gut. Treatment of GvHD requires effective immunosuppression, which in turn impairs Graft-versus-Tumor activity and enhances the risk for relapse of the malignant disease. However, for still unknown reasons many patients do not respond to standard immunosuppressive therapy with steroids or to second-line therapies. Development of novel cellular therapies that gain more and more clinical relevance due to their high anti-tumor potency lead to a strong demand for advanced test platforms to further investigate their underlying functional mechanisms and exclude off-tumor effects against healthy tissues. Ideally, new test systems could be used for the prediction of the GvHD potential of allogeneic stem cell products or for prediction of an immunosuppressive potential of novel GvHD therapies before entering clinical studies. The aim of this study was to establish a GvHD test system based on human organotypic skin models allowing the simulation of GvHD reactions in the skin in multiple replicates. To this end, artificial human skin models were generated under static (collagen skin model) and dynamic culture conditions (vascularized skin model). Injection of unstimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) did not cause histomorphological changes in collagen skin models. In contrast, injection of prestimulated PBMCs resulted in disruption of the epidermis of collagen skin models mimicking acute skin GvHD. The same disruption of the epidermal layer was observed using cell culture supernatants of prestimulated PBMCs, suggesting the involvement of proinflammatory cytokines. Indeed, measurement of cytokine levels in culture supernatants revealed an increase of interleukin 2 and 17, interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. In addition, injection of prestimulated PBMCs into more complex vascularized skin models also caused disruption of the epidermal layer and an increase of proinflammatory cytokine levels in a time dependent manner. Taken together, these findings demonstrate that it is possible to induce a strong immune reaction and inflammatory tissue damage in artificial human skin models mimicking histomorphological patterns of acute skin GvHD. Therefore, this model could contribute to the development of a clinically relevant GvHD test platform for prediction of the GvHD potential or immunosuppressive capacity of innovative cell products. Thus, artificial human GvHD models may be employed in clinical studies in order to gain first in vitro results in a human system and to extend information from animal models, which can then be compared to the actual clinical outcome. KW - Graft-versus-host-disease KW - Tissue Engineering KW - inflammatorische Gewebeschäden KW - artifizielle Hautmodelle Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153966 ER - TY - THES A1 - Stonawski, Saskia T1 - Emotionale Informationsverarbeitungsprozesse als Prädiktoren und Korrelate des Therapieoutcomes bei Patienten mit Depression T1 - Emotional information processing as a predictor and correlate of therapy outcome in depression N2 - Depressionen gehören zu den häufigsten psychischen Erkrankungen. Neben Symptomen wie Niedergeschlagenheit, Interessenlosigkeit oder Schlafstörungen sind Depressionen auch durch Defizite in kognitiven Funktionen, wie z.B. Aufmerksamkeitsprozessen oder der Wahrnehmung, und eine negativ verzerrte Informationsverarbeitung gekennzeichnet. Aufgrund der hohen Prävalenz, der starken psychosozialen Funktionseinschränkungen durch depressive Erkrankungen und deren rezidivierenden Charakter besteht die Notwendigkeit, die therapeutischen Interventionen zur Behandlung affektiver Störungen zu verbessern, dadurch die Krankheitsphase der Patienten zu verkürzen und letztendlich auch die Kosten für das Gesundheitssystem zu reduzieren. In diesem Zusammenhang werden in den letzten Jahren verstärkt mögliche Prädiktoren und Korrelate des Therapieerfolgs untersucht. Hierfür könnten negativ verzerrte Informationsverarbeitungsprozesse und Defizite in kognitiven Funktionen objektive Marker darstellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Covariation Bias, der als Überschätzung des Zusammenhangs zwischen einem krankheitsrelevanten Stimulus und einer aversiven Konsequenz definiert wird, in einem Querschnittsdesign bei schwer depressiven Patienten zu Behandlungsbeginn im Vergleich zu einer Gruppe von Patienten nach einer sechswöchigen Behandlung sowie einer gesunden Kontrollgruppe untersucht. Diese kognitive Verzerrung war bei Patienten mit schwererer Symptomatik unabhängig vom Behandlungszeitpunkt stärker ausgeprägt. Zudem prädizierte der Covariation Bias zu Behandlungsbeginn das Therapieoutcome nach sechs Behandlungswochen dahingehend, dass Patienten mit einer stärkeren kognitiven Verzerrung ein schlechteres Ansprechen auf die Therapie zeigten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Emotional Processing Paradigma, das aus Aufgaben zur Emotionserkennung und zur Aufmerksamkeitslenkung besteht, zum ersten Mal bei schwer depressiven Patienten im intraindividuellen Verlauf der Behandlung eingesetzt und in Zusammenhang mit dem Therapieerfolg gestellt. Neben Hinweisen darauf, dass Patienten, bei denen sich in den ersten Behandlungswochen unter anderem die Salienz negativer Emotionen verringerte, mit höherer Wahrscheinlichkeit remittierten, zeigten sich vor allem zeitlich stabile Unterschiede im Sinne einer Trait-Variablen zwischen Patienten, die auf die initiale Therapie ansprachen, und Patienten, die keine bedeutsame Verbesserung erfuhren, in den globalen kognitiven Funktionen: Patienten, bei denen es zu keiner klinisch relevanten Verbesserung durch die Therapie kam, wiesen stärkere Defizite auf. Zusammengenommen weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf ein stabiles Muster von Defiziten in globalen kognitiven Funktionen bei Patienten mit Depressionen hin. Diese Abweichungen liegen jedoch nicht bei allen schwer depressiven Patienten gleichermaßen vor. Bei Patienten mit Defiziten scheint das Therapieoutcome schlechter zu sein. Somit könnten diese Prozesse der Informationsverarbeitung und kognitive Defizite auf neuropsychologischer Ebene Prädiktoren und Korrelate des Therapieoutcomes darstellen. Im Sinne der personalisierten Medizin könnte in Zukunft die Diagnostik um die Parameter der Informationsverarbeitungsprozesse ergänzt werden und so die Prognose des Therapieerfolgs verbessert und die Behandlung der Patienten individualisiert werden. N2 - Depressive disorders are among the most frequent mental disorders. In addition to symptoms such as depressed mood, diminished interest or insomnia, depression is characterized by deficits in cognitive functions, e.g. attention or perception, and a negative biased information processing. Due to the high prevalence, severe impairments in social and occupational functioning and the recurring character of the disorder, there is a growing necessity of improving therapeutic interventions of affective disorders, in order to shorten time of suffering and to reduce costs in the health care system. In this context, potential predictors and correlates of therapy outcome were studied in recent years. Negative biases in information processing and cognitive deficits might represent objective markers. In the first part of this thesis, the covariation bias, defined as an overestimation of the relationship between disease-relevant stimulus and an aversive consequence, was investigated in patients with a severe depressive episode at admission, patients after a six-weeks antidepressant treatment and healthy controls in a between-group design. This type of cognitive bias was more pronounced in patients with a more severe symptomatic independent of course of treatment. Moreover, covariation bias at admission predicted therapy outcome after six weeks of treatment: Patients with a stronger bias showed an impaired treatment response. In the second part of this thesis, the emotional processing paradigm, which consists of emotion recognition and attentional vigilance tasks, was studied in severe depressive patients, and their intraindividual course of treatment and parameters were linked to therapy outcome. In addition to evidence that patients with a reduced salience of negative emotions after the first weeks of treatment remit with a higher probability, there were temporally stable differences in global cognitive functions between patients who responded to initial treatment and patients who did not improve: Patients without a clinically relevant improvement showed more severe deficits. In summary, the present findings suggest a stable pattern of global cognitive deficits in patients with depression. However, these deviations are not equally present in all patients with a severe depressive episode. In patients with deficits, therapy outcome seems to be impaired. Thus, information processing and cognitive deficits might constitute predictors and correlates of therapy outcome on neuropsychological level. In terms of personalized medicine, information processing parameters might thus complement the diagnostic process and individualize therapeutic interventions. KW - Depression KW - Informationsverarbeitung KW - Emotionale Informationsverarbeitung KW - Prädiktoren und Korrelate KW - Therapieoutcome KW - emotional information processing KW - predictors and correlates KW - therapy outcome KW - Prognose KW - Remission Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188691 ER -