TY - THES A1 - Helmel, Jacqueline Larissa T1 - Untersuchung der Expressionslevel des Gens NR3C1 bei ängstlich-depressiven Personen in Zusammenhang mit der Funktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse und Berücksichtigung von Kindheitstraumatisierungen T1 - Investigation of the expression level of the NR3C1 gene in anxious-depressive individuals in connection with the function of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and consideration of childhood traumatization N2 - Die ängstliche Depression stellt einen Subtypus der Depression dar, der noch nicht ausreichend erforscht ist und somit eine Herausforderung im klinischen Alltag darstellt. Laut der bisherigen Literatur sind genetische Unterschiede sowie Kindheitstraumatisierungen an der Pathophysiologie von Depressionen beteiligt und mitverantwortlich für die Ausprägung des Subtypus ängstliche Depression. In dieser Untersuchung wurde erforscht, ob es unterschiedliche Genexpressionslevel des Gens NR3C1 zwischen ängstlich-depressiven und nicht-ängstlich-depressiven Personen gibt. Zusätzlich wurde geprüft, ob Kindheitstraumatisierungen einen weiteren Einfluss auf die Genexpression der beiden Subtypen der Depression haben. Es zeigte sich, dass ängstlich-depressive Personen in Woche 1 bis 4 höhere HAM-D-Summenwerte erzielten, mit zusätzlichen Kindheitstraumatisierungen wurden die höchsten HAM-D-Werte festgestellt. Diese Gruppe hatte gehäuft Kindheitstraumata im Fragebogen angegeben, die Traumata Emotionale Misshandlung und Körperliche Vernachlässigung kamen signifikant häufiger vor. Anhand dieser durchgeführten Studie konnten zusammengefasst werden, dass sich die Genexpressionslevel von NR3C1 zwischen den beiden Subtypen als unterschiedlich erwies. Zusätzlich scheinen die beiden Kindheitstraumata Emotionale Misshandlung und Körperliche Vernachlässigung einen weiteren Einfluss auf die Genexpression von NR3C1 zu haben. Die unterschiedliche Genexpression von NR3C1 deutet auf verschiedene Funktionsweisen des GR zwischen den Subtypen hin. Dies könnte für die Verlaufsbeurteilung und Therapieansätze der Erkrankung von Bedeutung sein. Die häufiger vorkommenden Kindheitstraumatisierungen bei ängstlich-depressiven Personen können als ein pathophysiologischer Baustein für die Entstehung der ängstlichen Depression gesehen werden. Daher ist es umso wichtiger, das Überprüfen von erlebten Kindheitstraumata bei initialer Befragung in den klinischen Alltag mitaufzunehmen. Da auch der Depressionsschweregrad durch Kindheitstraumatisierungen in dieser Studie zunahm, ergeben sich daraus mögliche Konsequenzen für die therapeutische Planung. N2 - Anxious depression is a subtype of depression that has not yet been sufficiently researched and therefore represents a challenge in everyday clinical practice. According to previous literature, genetic differences and childhood trauma are involved in the pathophysiology of depression and are partly responsible for the development of the anxious depression subtype. This study investigated whether there are different gene expression levels of the NR3C1 gene between anxious-depressive and non-anxious-depressive individuals. In addition, it was examined whether childhood traumatization has a further influence on the gene expression of the two subtypes of depression. It was found that anxious-depressive individuals achieved higher HAM-D sum values in weeks 1 to 4, and the highest HAM-D values were found with additional childhood traumatization. This group had reported more childhood traumas in the questionnaire, and the traumas emotional abuse and physical neglect were significantly more frequent. On the basis of this study, it could be summarized that the gene expression levels of NR3C1 proved to be different between the two subtypes. In addition, the two childhood traumas of emotional abuse and physical neglect appear to have a further influence on the gene expression of NR3C1. The different gene expression of NR3C1 indicates different functioning of the GR between the subtypes. This could be important for the assessment of the course of the disease and therapeutic approaches. The more frequent childhood traumatization in anxious-depressive individuals can be seen as a pathophysiological building block for the development of anxious depression. It is therefore all the more important to include a review of experienced childhood trauma in the initial interview in everyday clinical practice. As the severity of depression also increased as a result of childhood trauma in this study, this has possible consequences for therapeutic planning. KW - Ängstliche Depression KW - Depression KW - Neuroendokrines System KW - Glucocorticosteroidrezeptor KW - Genexpression KW - NR3C1 KW - modifizierter Dexamethason-Suppressions-Test Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348652 ER - TY - THES A1 - Amelingmeier, Florian T1 - Identifizierung und Untersuchung TOP-mRNA - bindender Faktoren T1 - Identification and examination of TOP mRNA binding factors N2 - Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie benötigt und daher mittels vielfältiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierfür stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche hauptsächlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5’-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv ermöglicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. Nährstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird. Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation ermöglicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erwägung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP – Sequenzen identifiziert werden, welche sich für Strukturanalysen eignen würden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde über verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert. Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. Während gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7–Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte für Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK – Interaktion ausüben, welcher in weiteren Studien berücksichtigt werden sollte. N2 - In the nucleus of eucaryotic cells, genes are transcribed into mRNA which are heavily processed and exported into the cytoplasm. There they are translated into proteins, a process requiring large amounts of energy so this process is strongly regulated. One example is the class of TOP RNAs consisting mainly of transcripts encoding for proteins involved in translation. Some well-known examples include the proteins of the large and small ribosomal subunits. TOP RNAs share a common motif at the start of their 5’ UTR comprising a sequence entirely made of Pyrimidines immediately following the cap. This motif common to all TOP RNAs enables translational control of this class of RNAs in a timely coordinated manner. In this way, during conditions of stress like nutrient starvation, translation of TOP RNAs can be inhibited to save energy. The search for a regulator which binds to the TOP motif and enables coordinated regulation started long ago. In principle the regulator could activate or inhibit translation. Different proteins have been considered to be the regulator so far. In this thesis the protein TIAR was identified as TOP interacting factor using mass spectrometry. Its binding properties regarding the TOP motif have been evaluated using EMSA. RNA and proteins of different organisms were evaluated to identify minimal binding partner constructs for further structural analysis. Using different sequential purification approaches, the 14-3-3ε protein was also identified as TOP binding factor. Furthermore, the TOP binding proteins LARP1 and LARP7 and their target RNA sequences have been evaluated in regard to their binding properties. It could be shown that LARP1 has an inhibiting effect on translation of TOP RNAs. Using EMSA, minimal binding constructs of LARP7 and 7SK could be established which can be considered for further structural analysis. Also, it could be shown that certain substances like tRNA and Arginine influence the interaction of LARP7 and 7SK, an observation which should be considered in further experiments. KW - Proteinbiosynthese KW - Messenger-RNS KW - Genexpression KW - Translationskontrolle KW - Terminal Oligopyrimidine Tract KW - Translationsinitiation KW - TIAR KW - TOP mRNA Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289231 ER - TY - THES A1 - Eckel, Nils T1 - Die microRNA-Expression des klarzelligen Nierenzellkarzinoms T1 - The microRNA expression of clear cell renal cell carcinoma N2 - Die Arbeit befasst sich mit der experimentellen Untersuchung der MicroRNA-Expression in klarzelligen Nierenzellkarzinomen. Dabei konnte gezeigt werden, dass Tumoren gegenüber normalem Nierengewebe über ein spezifisches Expressionsprofil verfügt. Unter den differententiell exprimierten MicroRNAs fand sich auch miR-21. Aufgrund der durch sie regulierten Gene konnte gezeigt werden, dass ein möglicher Zusammenhang zwischen der Expression von miR-21 und der Genese der klarzelligen Nierenzellkarzinoms besteht. N2 - This work deals with the experimental investigation of microRNA expression in clear cell renal cell carcinoma. It was shown that tumors have a specific expression profile compared to normal kidney tissue. Among the differentially expressed microRNAs, miR-21 was found. Based on the genes regulated by it, it was shown that there is a possible connection between the expression of miR-21 and the genesis of clear cell renal cell carcinoma. KW - miRNS KW - Nierenkrebs KW - Genexpression KW - Expressionsprofil KW - Nierenzellkarzinom KW - miR-21 KW - real cell cancer KW - expression profile KW - microRNA Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-245604 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Dominik T1 - Genexpressionsanalysen der tumor-/metastasierungsassoziierten Proteine ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 und TTK in neuroglialen Hirntumoren T1 - Gene expression analyses of tumor and metastasis associated proteins ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 and TTK in neuroglial brain tumors N2 - Hirntumoren werden nach histologischen und molekulargenetischen Gesichtspunkten unterteilt. Neben dem Krankheitsverlauf unterscheiden sich LGA auch genetisch von GBM. Wie die mRNA der Proteine ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 und TTK in LGA exprimiert ist bzw. sich im Verlauf verändert, war in dieser Form noch nicht in einem Patientenpanel untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war es, die mRNA-Expressionsraten zu bestimmen sowie Korrelationen und Kointegrationen mit klinischen Daten zu analysieren. Außerdem wurden Besonderheiten der Verteilung innerhalb des Patientenpanels beschrieben. Quantitative-PCR-Analysen wurden durchgeführt. Die Expressionswerte wurden auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH normalisiert. Die resultierenden ∆CTm - bzw. ∆∆CT-Werte sowie die klinischen Patientendaten waren Basis für Kointegrations-, Korrelations-, Expressions-, Ähnlichkeits- und Verlaufsanalysen. KiSS1 schien generell kaum oder nicht in der Vielzahl der Tumoren exprimiert zu sein, Aussagen zur klinischen Korrelation erwiesen sich als schwierig. Für RPS27 konnten tendenziell niedrigere Werte in den Verlaufstumoren im Vergleich zu den LGA gefunden werden. Auch für BRMS1 war in der Mehrzahl der Fälle die mRNA der Vorläufertumoren in Relation zu den Rezidiven stärker exprimiert. ATF5 korrelierte nach Kendall RE und PFS (-0,324; p=0,077) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA, für TTK nach Kendall OS und RE (-0,444; p=0,097) im Gesamtpanel und nach Pearson auch RE und PFS (-0,43; p=0,096) in der Gruppe der IDH1-mutierten LGA. N2 - Brain tumors can be classified histologically and by their molecular characteristics. Besides progression of disease low grade astrocytoma (LGA) differ from Glioblastoma (GBM) patients in their genetic characteristics. In a brain tumor patient panel we analyzed mRNA-expressions of the proteins ATF5, KiSS1, RPS27, BRMS1 and TTK in LGA as well as in relapses by showing expression rates and using correlation, similarity, progression and cointegration analyses. Besides clinical information (progression free survival (PFS) overall survival (OS) and age at first diagnose (AED)) we used real time PCR data (normalized relative Expression (RE) compared to the household gene GAPDH; ∆CTm – and ∆∆CT-value). Conclusions: KiSS1-mRNA generally was hardly or not expressed in the majority of samples. RPS27 and BRMS1 showed lower mRNA expression rates in relapse tumors than in LGA. In the subgroup of IDH1-mutated LGA a negative correlation could be found for ATF5 between RE and PFS (Kendall: -0,324; p=0,077). TTK showed a negative correlation between OS and RE in the entire group (-0,444; p=0,097) and a negative correlation between RE and PFS in a subgroup of IDH1-mutated LGA (-0,43; p=0,096). KW - Genexpression KW - ATF5 KW - KiSS1 KW - RPS27 KW - BRMS1 KW - TTK KW - Low grade Astrocytoma KW - LGA Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-222873 ER - TY - THES A1 - Hirschmann, Anna T1 - microRNA-Genexpressionsprofile in Blut-, Haut- und Nervenproben von Patienten mit Polyneuropathien T1 - microRNA gene expression profiles in blood, skin and nerve samples of patients with polyneuropathy N2 - Die Polyneuropathie (PNP) ist die häufigste Störung des peripheren Nervensystems bei Erwachsenen. Die Suche nach der Ursache bleibt in vielen Fällen erfolglos, ist aber unverzichtbar, da die Therapiewahl von der Ätiologie der Erkrankung abhängt. Geeignete Biomarker könnten die Differentialdiagnose unter Umständen erleichtern. microRNAs (miRNAs) sind in dieser Hinsicht vielversprechend, da in vielen Studien bei Nervende- und regenerationsprozessen sowie in neuropathischen Schmerzmodellen eine Dysregulation beschrieben wurde. In dieser Studie wurde die Expression zweier miRNAs, miR-103a und miR-let-7d, sowie eines Zielmoleküls der miR-103a, des Kalziumkanals Cav1,2, in einer großen Kohorte von PNP-Patienten unterschiedlicher Ätiologie in Blut, Haut- und Nervenbiopsien untersucht. Insgesamt wurden 116 Patienten und 22 Kontroll-probanden in die Studie eingeschlossen. Nach der Isolation von RNA aus weißen Blutzellen (WBC), Haut- und Nervenbiopsien folgte die Expressionsbestimmung mittels qRT-PCR. Während sich jeweils Unterschiede zwischen PNP-Patienten und Kontrollen und zwischen Patienten mit entzündlicher und solchen mit nicht-entzündlicher PNP zeigten, wurden keine Unterschiede in der Expression zwischen den ätiologischen Subgruppen oder zwischen Patienten mit schmerzhafter und schmerzloser PNP festgestellt. In den Nervenbiopsien der Patientenkohorte ergab sich eine inverse Korrelation der miR-103a und ihrem Zielgen Cacna1c, die darauf hinweisen könnte, dass Cacna1c von der miR-103a negativ reguliert wird. Da in unserer Patientenkohorte keine Unterschiede zwischen den PNP-Subgruppen auftraten, scheint der Einsatz der miR-103a und miR-let-7d als diagnostische Biomarker zur ätiologischen Einordnung einer PNP nicht gerechtfertigt. Dennoch deuten unsere Ergebnisse auf eine mögliche Rolle der untersuchten miRNAs bei Entstehung und Verlauf von PNP hin. Für ein tieferes pathophysiologisches Verständnis der miRNAs vor allem bei entzündlichen Neuropathien, könnte die Untersuchung von weiteren miRNAs und Zielgenen Aufschluss geben. N2 - Polyneuropathies (PNP) are the most frequent disorder of the peripheral nervous system in adults. Since the choice of therapy depends on it, the etiological diagnostic is essential but often remains without results so far. The differential diagnosis could be facilitated by a suitable biomarker. In this respect, microRNA (miRNA) are promising because their dysregulation has been described in processes of nerve degeneration and regeneration as well as in neuropathic pain models. This study investigated the expression of two miRNA, miR-103a and miR-let-7d, and the calcium channel Cav1.2, a target of miR-103a, in a large cohort of PNP patients with different etiology in blood, skin and nerve samples. Altogether, 116 patients and 22 controls have been included in the study. Expressional analysis via qRT-PCR succeeded the isolation of RNA out of white blood cells (WBC), skin and nerve biopsies. Differences have been found between PNP patients and controls and between patients with inflammatory and non-inflammatory PNP. No differences have been recorded between the etiological subgroups or between painful and painless PNP. miR-103a and its target Cacna1c correlated inversely in nerve which could be an indication for Cacna1c being negatively regulated by miR-103a. miR-103a and miR-let-7d do not seem to be appropriate diagnostic biomarkers for the etiological classification of PNP as there have not been found any differences between the PNP subgroups. Nevertheless, our results suggest that miRNA may play a part in the development and the progression of PNP. The investigation of further miRNA and targets could provide insight into a deeper pathophysiological understanding of miRNA, especially in inflammatory neuropathies. KW - miRNS KW - Polyneuropathie KW - Genexpression KW - microRNA KW - miRNA KW - PNP KW - Neuropathischer Schmerz KW - neuropathic pain KW - gene expression Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217010 ER - TY - THES A1 - Hausmann, Michael T1 - Analyse der Genexpression verschiedener Kandidatengene und der Methylierung im Xiphophorus Melanom T1 - Analysing Gene Expression of Candidate Genes and Methylation in Xiphophorus Melanoma N2 - Das Melanom ist eine der aggressivsten Formen von malignen Tumoren beim Menschen. Bei Fischen der Gattung Xiphophorus kommt es zur spontanen Tumorformation, welche auch durch zwischenartliche Kreuzung herbeiführbar ist. Hybride mit angeborenem Melanom stellen ein nützliches Tiermodell zur Untersuchung der genetischen Grundlage der Tumorentwicklung dar. Ihre Tumorigenese hängt mit der pigmentzellspezifischen Überexpression der durch eine Mutation aktivierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk zusammen. In reinrassigen Fischen wird die onkogene Funktion des xmrk durch den Genlocus R, welcher molekular noch nicht identifiziert wurde, unterdrückt. Zusammen mit der Überexpression von xmrk konnten mittels einer RNA-Seq Analyse weitere Gene gefunden werden, welche differenziell in den Proben von malignen und benignen Geweben des Xiphophorus exprimiert werden. Des Weiteren ist bekannt, dass die Methylierung des xmrk Promotors Einfluss auf die Expression des Genes hat. Um die Daten der durch RNA-Seq gefundenen Kandidatengene zu validieren, wurde deren Expression in malignen und benignen Geweben der Flossen und des Rumpfes mittels qPCR quantifiziert. Zusätzlich dazu wurde die Expression einiger humaner Orthologe dieser Gene in Proben aus humanen Melanomzelllinien gemessen. Mir war es möglich zu zeigen, dass mit Ausnahme von cdkn2ab, mitfb und xirp2b alle Kandidatengene signifikant unterschiedlich in mindestens einem Vergleich von benignem und malignem Gewebe exprimiert waren. Das mit xmrk verglichen gegensätzliche Expressionsmuster von pdcd4a macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten als vom R-Locus codierten Tumorsuppressorgen. In den humanen Melanomzelllinien konnte ausschließlich von PDGFRB keine erhöhte Expression in irgendeiner Probe nachgewiesen werden. Während die Expression von PDCD4, C-MYC und MITF in mindestens drei der vier Zelllinien mittelstark erhöht war, ließ sich bei KIT eine enorm gesteigerte Überexpression in Zellen der Linie Hermes3a nachweisen. Da drei der fünf analysierten Gene und ihre Orthologen ähnliche Expressionsmuster in Proben des Xiphophorus und der humanen Melanomzelllinien zeigen, deuten diese Ergebnisse auf die Nützlichkeit des Tiermodells zur Identifizierung entscheidender Gene und Signalwege im malignen Melanom hin. Ein zweites Ziel der Arbeit war das Erlangen tieferer Einblicke in die Methylierung des Xiphophorus Melanoms auf einer globalen und promotor- spezifischen Ebene. Um die Hypothese einer Reduzierung der globalen Methylierung zu testen, führte ich eine kolorimetrische Quantifizierung der 5-mC DNA in Kontroll- und Tumorgeweben aus. Diese Vorgehensweise zeigte zum ersten Mal eine signifikante Verminderung der methylierten globalen DNA in den benignen Läsionen und malignen Melanomen der Flossen verglichen mit dem Kontrollgewebe. Um herauszufinden, on diese Demethylierung direkt mit der Überexpression des xmrk verbunden ist, analysierte ich als nächstes die Methylierung eines CpG Dinukleotids des xmrk Promotors mithilfe von methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen. Obwohl nur in den Proben des exophytischen Tumorwachstums als Krebsgewebe eine verringerte Methylierung des CpG Dinukleotids verglichen mit den Kontrollen nachgewiesen werden konnte, zeigte sich die Stelle in Zellen der Xiphophorus Melanomzelllinie PSM komplett unmethyliert. Diese Ergebnisse deuten stark daraufhin, dass eine differenzierte Methylierung das onkogene Potential dieser Zellen bewirkt. Um die Effekte veränderter globaler und promotor-spezifischer Methylierung auf die Tumorigenese besser zu verstehen, sind weitere Untersuchungen nötig. N2 - Melanoma is among the most aggressive forms of malignant tumors in humans. In fish of the genus Xiphophorus melanoma tumor formation happens spontaneously in nature and can also be induced by interspecific crossing. Hybrid fish with hereditary melanoma are an established animal model for the study of the genetic origin of tumor development. Their tumorigenesis is linked to the overexpression of the mutationally activated receptor tyrosine kinase Xmrk in pigment cells. In purebred fish the molecularly still unrevealed locus R is suppressing the oncogenic function of xmrk. Along with the overexpression of xmrk a RNA-Seq analysis revealed even more differentially expressed genes in the tissues of malignant melanoma in Xiphophorus compared to benign tissues. Furthermore, there has already been gained evidence that the methylation status of the xmrk promotor has effects on its overexpression. To validate the RNA-Seq data of the candidate genes, gene expression in malignant and benign tissues of the fins and trunk was quantified using qPCR. Additionally, the expression of some human orthologues of these genes was also analyzed in samples of human melanoma cell lines. I was able to demonstrate that with the exception of cdkn2ab, mitfb and xirp2b all candidate genes are significantly differentially expressed in at least one set of tissues varying in dignity. The opposite expression pattern of pdcd4a compared to xmrk makes it a promising candidate as the at the R locus encoded tumor suppressor gene. In the human melanoma cell lines only the expression of PDGFRB wasn't increased in any of the samples. While the expression of PDCD4, C-MYC and MITF was moderately higher in at least three of the four cell lines, KIT was shown to be hugely overexpressed in Hermes3a. As three of the five analyzed genes and its orthologues show a similar expression pattern in samples of the Xiphophorus and the human melanoma cell lines, these findings point out the usefulness of the animal model to find new genes and pathways within the malignant melanoma. A second aim of the thesis was to gain a deeper insight into to methylation regulation in the Xiphophorus melanoma on a global and a promoter-specific level. To test the hypothesis that global methylation is reduced in the melanoma cells, I performed a colorimetric quantification of 5-mC DNA in control and tumor tissues. This approach showed for the first time a significantly decreased amount of global DNA in the benign and malignant samples deriving from the fins compared to control tissues. To find out if this demethylation is directly linked to the overexpression of xmrk, I analyzed the methylation of CpG site in the xmrk promotor using methylation sensitive restriciton endonucleases. Interestingly in the samples of the Xiphophorus melanoma cell line PSM the CpG site wasn't methylated at all. Although only the samples of the exophytic tumor growth as a tumoric tissue were less methylated than the control, the cells of the Xiphophorus melanoma cell line PSM were completely unmethylated. These results imply that differential methylation triggers the oncogenic potential of these cells. To improve the understanding of the effects global and promoter-specific methylation has on tumorigenesis, further studies are necessary. KW - Xiphophorus Melanom KW - Genexpression KW - Epigenetik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205258 ER - TY - THES A1 - Langjahr [verh. Held], Melissa T1 - Systemische Expression von Zytokinen bei schmerzhaften und schmerzlosen Polyneuropathien T1 - Systemic expression of cytokines in painful and painless polyneuropathies N2 - Die Pathophysiologie der PNP wie auch die Entstehung der oft assoziierten neuropathischen Schmerzen ist unklar. Gleichzeitig gibt es bislang keine geeigneten Biomarker, die die oft komplizierte Differentialdiagnose vereinfachen können. Einige Tiermodelle und klinische Studien lieferten bereits Hinweise auf die entscheidende Rolle pro- und anti-inflammatorischer Zytokine in diesen Prozessen. Ziel unserer Studie war es, die systemische Genexpression pro- und anti-inflammatorischer Zytokine in einer großen Kohorte von Patienten mit PNP verschiedener Ätiologie zu charakterisieren. Insgesamt konnten 111 PNP-Patienten und 38 gesunde Kontrollpersonen prospektiv rekrutiert werden. Nach Isolation von PBMC aus Blutproben von 97 Patienten wurde die Genexpression der pro-inflammatorischen Zytokine TNF, IL1, IL2, IL6, IL8 und der anti-inflammatorischen Zytokine IL4 und IL10 mittels qRT-PCR bestimmt. Bei 47 Patienten und 12 Kontrollen wurde zudem die IL6-, IL-8- und TNF-Zytokinproduktion von PBMC in vitro nach Stimulation durch LPS mittels ELISA untersucht. Hauptbefund war ein pro-inflammatorisches Zytokinprofil der PNP-Patienten mit höherer Genexpression von IL1, IL2, IL8 und TNF im Vergleich zu den gesunden Kontrollen. Im Falle der entzündlichen Neuropathien konnte zudem eine niedrigere Genexpression von IL10 im Vergleich zu Gesunden nachgewiesen werden. Sowohl schmerzhafte als auch schmerzlose Verlaufsformen wiesen ein pro-inflammatorisches Zytokingenexpressionsprofil im Vergleich zu Gesunden auf, das bei schmerzhaften PNP deutlich mehr beteiligte pro-inflammatorische Zytokine umfasste; relevante Unterschiede zwischen den PNP-Patienten mit und ohne Schmerz sowie der diagnostischen Subgruppen fanden sich nicht. Eine niedrigere Stimulationsschwelle der PBMC lag bei PNP-Patienten im Vergleich zu Gesunden nicht vor. Insgesamt erscheint die Rolle einzelner Zytokine als systemische Biomarker für die Differenzierung verschiedener PNP-Formen bzw. bezüglich neuropathischen Schmerzes aufgrund einer niedrigen Spezifität deutlich eingeschränkt. Dennoch sprechen unsere Ergebnisse für eine mögliche Rolle eines pro-inflammatorischen Milieus bei der Entstehung bzw. des Verlaufes verschiedener entzündlicher und nicht-entzündlicher Neuropathien und neuropathischen Schmerzes. N2 - Distinct cytokine expression patterns have been reported in biomaterial of patients with polyneuropathies (PNP). We investigated gene expression profiles of pro- and anti-inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with neuropathies of different etiologies. We prospectively studied 111 patients with neuropathies and compared data between diagnostic subgroups and healthy controls. Gene expression of a panel of pro- and anti-inflammatory cytokines was analyzed (interleukin-1 [IL-1], IL-2, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha [TNF], IL-4 and IL-10) in PBMC samples of 97 patients and 38 healthy controls. Furthermore, protein levels of IL-6, IL-8, and TNF were measured in supernatant of PBMC stimulated with lipopolysaccharide (LPS). PNP were associated with higher PBMC gene expression of IL-1 (p<0.05), IL-2 (p<0.05), IL-8 (p<0.001), and TNF (p<0.01) compared to healthy controls. Inflammatory neuropathies were associated with higher gene expression of IL-8 (p<0.001) and TNF (p<0.05) and lower gene expression of IL-10 (p<0.05) compared to healthy controls. More pro-inflammatory cytokines were elevated in painful neuropathy (IL-1, IL-2 [p<0.05], IL-8 [p<0.001] and TNF [p<0.05]) than in painless neuropathy (IL-8 [p<0.01] and TNF [p<0.01]) compared to healthy controls. Disease duration positively correlated with IL-6 gene expression (p<0.01). Supernatant protein levels of IL-6, IL-8, and TNF did not differ between groups. Conclusion: Systemic gene expression of pro-inflammatory cytokines is increased in patients with neuropathies and may be influenced by the presence of neuropathic pain. KW - Polyneuropathie KW - Cytokine KW - Genexpression KW - peripheral neuropathy KW - neuropathic pain KW - cytokine KW - gene expression KW - peripheral blood mononuclear cells KW - Neuropathischer Schmerz KW - Zytokine KW - Periphere mononukleäre Zellen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154445 ER - TY - THES A1 - Bedenk, Kristina T1 - Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Genexpressionsmaschinerie des Vaccinia Virus T1 - The biochemical and structural characterization of the gene expression machinery of the Vaccinia virus N2 - Die Familie der Pockenviren zeichnet sich durch ein komplexes DNA Genom aus und hat großes medizinisches Potential. Am eindrucksvollsten ist dies für das Vaccinia-Virus (VACV) belegt, welches nicht nur als Pocken-Impfstoff eingesetzt wird, sondern auch als onkolytisches Virus in der Tumorbiologie. VACV hat einen außergewöhnlichen Replikationszyklus, welcher ausschließlich im Zytoplasma der Wirtszelle stattfindet. Somit ist die gesamte virale Genexpressionsmaschinerie völlig unabhängig von kernvermittelten Reaktionen des Wirts und somit auch aus Sicht der Grundlagenforschung von größtem Interesse. Die Schlüsselkomponente der viralen Genexpression ist die makromolekulare DNA-abhängige RNA Polymerase (vvRPO), deren Untereinheiten allesamt Virus-kodiert sind. Zwar wurden in den letzten Jahren Protokolle zur biochemischen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO etabliert, ein detailliertes Wissen über deren Zusammenlagerung in vivo und die räumlichen und zeitlichen Interaktionen mit den Transkriptions- bzw. Prozessierungsfaktoren sind aber weitgehend unbekannt. Diese Arbeit umfasst Untersuchungen zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung der vvRPO und seiner assoziierten Faktoren. Grundlage hierfür war die Etablierung eines Reinigungsprotokolls mithilfe eines neu konstruierten rekombinanten VACV (GLV-1h439). Diese Strategie erlaubte es hoch-molekulare native vvRPO Komplexe zu isolieren. Ein transkriptions-inaktiver Komplex (Komplex I) mit einer kalkulierten Masse von 575 kDa bestand aus den acht Untereinheiten des vvRPO Holoenzyms und den Polymerase-assoziierten Faktoren RAP94 und D6. Ein zweiter, transkriptionell aktiver Komplex (Komplex II) mit einer Masse von 803 kDa enthielt, neben dem Holoenzym der vvRPO, noch weitere Faktoren, die primär die Erkennung der DNA-Matrize und die Prozessierung der naszierenden RNA vermitteln. Hierbei handelt es sich um RAP94, das virale Capping Enzym bestehend aus den zwei Untereinheiten D1 und D12, A7 und dem Terminationsfaktor NPH I. Interessanterweise enthielt dieser Komplex zusätzlich mit E11 eine bislang unbekannte weitere Protein-Komponente, sowie tRNAGln und tRNAArg. Der isolierte Kompelx II ist daher ein Ribonukleoprotein (RNP). Die Verfügbarkeit von hoch-reinen vvRPO Komplexen erlaubte es erstmals deren strukturelle Architektur zu untersuchen. Hierfür wurden drei experimentelle Ansätze, die klassische Röntgenstrukturanalyse, die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Quervernetzungssstudien miteinander kombiniert. Die Strukturen der Komplexe I und II haben eine Auflösung von 11-12 Å, wobei auffällig war, dass beide eine markante strukturelle Ähnlichkeit zur eukaryotischen RNA Polymerase II aufwiesen. Darüber hinaus gelang es zusätzliche Bereiche im Komplex II zu definieren, welche die Polymerase-assoziierten Prozessierungsfaktoren beherbergen. Zudem konnte die atomare Struktur von E11, mittels Röntgenstrukturanalyse bei einer Auflösung von 1,9 Å, gelöst werden. Das E11 Protein besitzt ein neuartiges Faltungsmuster und weist einen intensiven Dimerisierungskontakt auf, welcher sich über vier ß-Faltblätter ausbildet. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen die Grundlage für ein detailliertes Verständnis der räumlichen Organisation der viralen Transkriptonsmaschinerie. Darüber hinaus werden sie funktionelle Studien ermöglichen, welche die Rolle der einzelnen Proteine, sowie der tRNAs bei der mRNA Synthese klären helfen. N2 - Poxviruses comprise a diverse family of complex DNA-genome viruses with great medical potenial. This is exemplified by vaccinia virus, which not only served as a vaccine against smallpox but is also used as a promising tool in viral anti-cancer therapies. A key feature that distinguishes the poxvirus family from other DNA viruses is their replication cycle, which is confined to the cytoplasm. This results in a high level of independence from the host cell, which supports transcription and replication events only in the nucleus. Accordingly, virus specific, rather than host cell enzymes mediate most processes including DNA replication and mRNA synthesis. The key component of viral gene expression is the DNA-dependent RNA polymerase (vvRPO), which constitutes the virus-encoded macromolecular machine ensuring viral mRNA synthesis. Although this enzyme has been studied in some details in the past years, neither its mode of assembly in vivo nor its spatio-temporal association with transcription and processing factors has been understood in detail. In this thesis I present work that focuses on the structural and functional characterization of vvRPO and its associated factors. To gain insights into the structure and the assembly of the VACV transcription system we established an efficient purification protocol by generating recombinant virus strains expressing tagged subunits of vvRPO (GLV-1h439). These recombinant virus strains enabled the isolation of high molecular weight vvRPO complexes. Complex I, which was transcriptionally inactive in vitro displayed a calculated mass of about 575 kDa, consisted of eight subunits of the vvRPO holoenzym and two additional polymerase-associated factors termed RAP94 and D6. A second, transcriptionally active complex (complex II) with a mass of 803 kDa, was related to the first one. It consisted apart from the factors of the holoenzyme already found in complex I additional factors that mediate primarily binding of the polymerase to its DNA template and the processing of nascent RNA. These factors comprise the viral capping enzyme (D1, D12), A7 and the termination factor NPH I. Interestingly, complex II contained in addition the viral protein E11, thus far not connected to viral transcription als well as tRNAGln, tRNAArg). Complex II is hence a ribonucleoprotein (RNP). The availability of highly pure vvRPO complexes allowed for the first time to investigate their structure. To this end, three experimental approaches, the classic X-ray crystallography, cryo-electron microscopy (cryo-EM) and chemical crosslinking were combined. Structures of both polymerase complexes were obtained at a resolution of 11-12 Å and revealed a striking structural similarity to eukaryotic RNA polymerase II. Moreover, it was possible to allocate positions in the structure of complex II that are likely to harbour the polymerase-associated processing factors. In addition we were able to solve atomic structure of E11 by X-ray crystallography at a resolution of 1.9 Å. Interestingly, the structure of E11 showed a novel folding pattern that forms a dimer, which is mostly composed of four ß-sheets. These studies provide the basis for a detailed investigation of the architecture of the viral transcriptional machinery. Furthermore, the pave the way for functional studies aimed at elucidating the function of individual proteins and tRNA in the generation of viral mRNA. KW - Vaccinia-Virus KW - Vaccinia-Virus KW - Genexpressionsmaschinerie KW - RNA-Polymerase KW - Struktur KW - Genexpression Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135538 ER - TY - THES A1 - Schaaf, Lisa T1 - Der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe T1 - The role of drug transporters in the pulmunary absorbtion of inhaled drugs N2 - Arzneistofftransporter ermöglichen endogenen und exogenen Molekülen die Überwindung von Zellmembranen und tragen dadurch zur Aufnahme, Verteilung und Elimination von Arzneistoffen bei. Inhalativ applizierte Wirkstoffe, wie Vertreter aus der Gruppe der Beta-2-Sympathomimetika oder Anticholinergika, zählen zu den Substraten wichtiger, pulmonal exprimierter Arzneistofftransporter. Trotz intensivierter Forschung auf dem Gebiet der Transporter-Expression ist diese im humanen Lungengewebe bisher wenig untersucht und deren pharmakokinetische Auswirkungen auf pulmonal verabreichte Arzneistoffe sind kaum bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalierter Arzneistoffe untersucht und Erkenntnisse über deren Expressions-Profil im humanen Lungengewebe gewonnen werden. Pharmakokinetische Parameter des inhalativen Anticholinergikums Ipratropiumbromid wurden an einem ex vivo Modell der humanen Lunge untersucht. Nach vorheriger Applikation des kompetitiven OCTN1/2-Inhibitors L-Carnitin wurde keine signifikante Reduktion der absorbierten Wirkstoffmenge detektiert. Damit zeigten sich die beiden organischen Kationen/Carnitin-Transporter OCTN1 und OCTN2, anders als bisher vermutet, nicht als primär an der Absorption von Ipratropiumbromid beteiligte Transporter. Infolgedessen wurde die Beteiligung weiterer Transporter hypothetisiert. Erstmals wurden die am humanen Lungen-Perfusions-Modell gewonnenen pharmakokinetischen Daten zur pulmonalen Absorption in direkter Beziehung zur mRNA- und Protein-Expression von Arzneistofftransportern in den jeweiligen individuellen Gewebeproben betrachtet. Die pulmonale Genexpression des Multidrug Resistance-Related Protein MRP5 wies eine signifikante negative Korrelation mit der Area under the curve (AUC0 – 60 min) von Ipratropiumbromid auf (r = -0,699; p < 0,05), was die Beteiligung von MRP5 an den Umverteilungsprozessen von Ipratropiumbromid in der humanen Lunge nahelegte. Auf Protein-Ebene wurde eine positive Korrelation zwischen der Expression des organischen Kationentransporters OCT3 und der AUC0 – 60 min von Ipratropiumbromid ermittelt (r = 0,7499,p < 0,05), woraus sich eine potentielle Beteiligung von OCT3 an der Aufnahme von Ipratropiumbromid aus dem luminalen Lungenbereich ableiten ließ. Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden Untersuchungen mit stabil transfizierten HEK293-Zellen durchgeführt. Sowohl der organische Kationentransporter OCT1 als auch OCT3 trugen dabei signifikant zu einer erhöhten zellulären Aufnahme der beiden Tritium-markierten Bronchodilatatoren Ipratropiumbromid und Salbutamol bei. Damit wurde für OCT3 zum ersten Mal eine Beteiligung an der zellulären Aufnahme dieser beiden Arzneistoffe nachgewiesen. Im Kontext der Gendermedizin sind geschlechtsspezifische Unterschiede in der Transporter-Expression von großem Interesse. Inwiefern die drei Sexualsteroidhormone Estradiol, Progesteron und Testosteron einen regulatorischen Effekt auf die mRNA-Expression von Membrantransportern haben, wurde erstmals durch in vitro Inkubationsversuche in physiologischen Hormonkonzentrationen mit der humanen Bronchialepithelzelllinie Calu-3 geprüft. Mittels intensiv optimierter und sorgfältig validierter RT-qPCR-Analytik konnten vor allem nach Inkubation mit weiblichen Sexualhormonen verglichen zu keiner Hormon-Zugabe statistisch signifikante Expressions-Unterschiede detektiert werden: Nach Behandlung mit Estradiol zeigten der Oligopeptid-Transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) und OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) eine geringere Genexpression, das Multidrug Resistance-Related Protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) sowie OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) waren nach Zugabe von Estradiol kombiniert mit Progesteron höher exprimiert als ohne Hormon-Zusatz. Da Estradiol überdies als Inhibitor des OCT1- und OCT3-vermittelten Transports gilt, wurde die Auswirkung des Hormons, unter anderem in physiologischer Konzentration, auf die Aufnahme von Tritium-markierten Ipratropiumbromid in stabil transfizierte HEK293-Zellen untersucht, wobei tatsächlich eine reduzierte zelluläre Ipratropiumbromid-Aufnahme beobachtet wurde. Somit könnte auch in vivo eine geschlechtsspezifische Inhibition der beiden Transporter stattfinden, wodurch deren Substrate einer geschlechtsspezifisch variierenden Pharmakokinetik unterliegen könnten. Darüber hinaus wurde in rund 80 humanen Lungengewebsproben die Genexpression von Arzneistofftransportern hinsichtlich geschlechts- und altersspezifischer Unterschiede überprüft. In unter 50-jährigen Männern war das Multidrug-Resistance Protein MDR1 signifikant höher exprimiert verglichen zu Männern von 50 - 60 Jahren. OCT1 war in Patienten von 50 - 60 Jahren signifikant geringer exprimiert als in über 60-Jährigen. Daneben lieferte die Analyse aller Gewebeproben das Genexpressions-Profil von Arzneistofftransportern im humanen Lungengewebe, wobei OCT3 das höchste und OCT2 das geringste mRNA-Expressions-Niveau unter den untersuchten Transportern aufwies. Eine wesentliche Beteiligung von OCT3 an Transportvorgängen im humanen Lungengewebe erschien damit wahrscheinlich. Resümierend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Einflusses von Arzneistofftransportern auf die pulmonale Absorption inhalativ verabreichter Arzneistoffe geleistet werden. Dabei konnte OCT3 erstmals als maßgeblich an der zellulären Aufnahme von Ipratropiumbromid beteiligter Transporter in der humanen Lunge identifiziert werden, womit einerseits die Beteiligung von Arzneistofftransportern an pharmakokinetischen Prozessen in vivo und andererseits die Bedeutung von Arzneistofftransportern für die inhalative Arzneimitteltherapie deutlich wurde. N2 - Drug transporters facilitate the transport of endogenous and exogenous compounds across cell membranes. Therefore they contribute to the absorption, distribution and elimination of drugs. Pulmonary administered drugs, such as members of the drug class of betamimetics or anticholinergics, are known substrates of relevant pulmonary expressed drug transporters. Despite intensified research in the field of transporter expression few data are available about their expression in the human lung and the pharmacokinetic implications on pulmonary administered drugs. The aim of this thesis was to investigate the impact of drug transporters on the absorption of inhaled drugs and to gain insights into their expression profiles in human lung tissue. Pharmacokinetic properties of the inhaled anticholinergic ipratropium bromide were explored using an ex vivo model of the human lung. After preceding application of the competitive OCTN1/2-inhibitor L-carnitine no significant decrease of the amount of absorbed active ingredient was detected. This contradicted previous assumptions regarding the contribution of the organic cation/carnitine transporters OCTN1 and OCTN2 to the absorption of ipratropium bromide. Consequently the involvement of additional transporters was hypothesized. For the first time pharmacokinetic data of the pulmonary absorption obtained by employing the human lung perfusion model were correlated with the mRNA and protein expression of drug transporters in respective individual tissue samples. The pulmonary gene expression of the multidrug resistance–related protein MRP5 showed a significant negative correlation with the area under the curve (AUC0 – 60 min) of ipratropium bromide (r = -0,699; p < 0,05). This might indicate that MRP5 contributes to the redistribution processes of ipratropium bromide in the human lung. A positive correlation between the protein expression of the organic cation transporter OCT3 and the AUC0 – 60 min of ipratropium bromide was detected (r = 0,7499, p < 0,05) suggesting a potential involvement of OCT3 in the absorption of ipratropium bromide in the luminal lung area. Uptake assays using stably transfected HEK293 cells were performed to substantiate this hypothesis. Both organic cation transporters, OCT1 and OCT3, contributed significantly to an increased cellular uptake of the tritium labeled bronchodilators ipratropium bromide and salbutamol. Thus, the contribution of OCT3 to the cellular uptake of both pharmaceutical substances was demonstrated for the first time. Gender-specific differences of drug transporter expression are of major interest in the context of gender medicine. In vitro incubation studies with the human bronchial epithelial cell line Calu-3 for the first time elucidated whether physiological concentrations of the three sex steroid hormones estradiol, progesterone and testosterone exert a regulatory effect upon the mRNA expression of membrane transporters. By thoroughly optimized and carefully validated RT-qPCR analytics statistically significant differences in gene expression were detected primarily after incubation with female sex hormones compared to no hormone exposure: After incubation with estradiol the peptide transporter PEPT2 (80,8 ± 15,6 %) and OCTN2 (82,8 ± 4,2 %) showed decreased expression whereas the multidrug resistance–related protein MRP1 (111,6 ± 9,1 %) as well as OCTN1 (112,9 ± 10,1 %) were upregulated after addition of both estradiol and progesterone compared to no treatment. Since estradiol is also a known inhibitor of the transport mediated by OCT1 and OCT3 its impact on the uptake of tritium labeled ipratropium bromide was investigated in stably transfected HEK293 cells. Indeed, a reduced cellular uptake of ipratropium bromide was observed after incubation with estradiol, also at physiological concentrations. Therefore, a gender-specific inhibition of both transporters in vivo is conceivable and could result in gender-specific pharmacokinetic characteristics for substrates of these transporters. Moreover, the gene expression of drug transporters in approximate 80 lung tissue samples was examined regarding gender and age related differences. The multidrug resistance protein MDR1 was significantly higher expressed in men younger than 50 years compared to 50 - 60 year old men. OCT1 was significantly less expressed in 50 - 60 years old patients compared to patients older than 60 years. Furthermore, the gene expression profile of drug transporters in the human lung was analyzed. In all tissue samples OCT3 showed the highest mRNA expression level whereas OCT2 was least expressed amongst the investigated transporters. This suggested a substantial involvement of OCT3 in transport processes in human lung tissue. In conclusion, the present research contributed to the elucidation of the role of drug transporters in the pulmonary absorption of inhaled drugs. For the first time OCT3 was identified to be substantially involved in the cellular absorption of ipratropium bromide in human lungs. Hence, the data supported the involvement of drug transporters in pharmacokinetic processes in vivo and emphasized the importance of drug transporters for inhaled pharmacotherapy. KW - Lunge KW - ABC-Transporter KW - Organischer Kationentransporter KW - Pharmakokinetik KW - Genexpression KW - Arzneistofftransporter KW - Lungengewebe KW - Lungenperfusionsmodell KW - Ipratropiumbromid Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151534 ER - TY - THES A1 - Endres, Marcel Matthias T1 - LASP1 reguliert die Genexpression und Sekretion von Matrix-Metalloproteasen in Brustkrebszellen T1 - LASP1 regulates the gene expression as well as the secretion of matrix-metalloproteases in breast cancer cells N2 - Migration und Tumorzellinvasion erfordern die vorhergehende Degradation der umliegenden Extrazellulärmartrix (EZM). Dieser Umbauprozess erfolgt primär durch proteolytische Endopeptidasen, sog. Matrix-Metalloproteasen (MMPs). Damit diese ihre funktionelle Aktivität ausüben können, müssen sie zunächst rekrutiert und mit Hilfe podosomaler bzw. invadopodialer Strukturen in die EZM sezerniert werden. Das LIM und SH3 Domänen Protein 1 (LASP1), ein neu in Podosomen von Makrophagen identifiziertes regulatorisches Gerüstprotein, beeinflusst, neben Größe, Anzahl und Beständigkeit von Podosomen, in hohem Maße die Matrixdegradationskapazität der Zelle. Auch in invasiven Brustkrebszellen wurde eine Lokalisation von LASP1 an Invadopodien, den Podosomen-äquivalenten Strukturen, detektiert. Das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die funktionelle Charakterisierung von LASP1 in Invadopodien. Unter Etablierung eines Matrix-Degradations-Assays konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von LASP1 auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, die zuvor schon für Makrophagen gezeigte Matrixdegradation nachhaltig beeinträchtig. Durch Analyse und Verifikation von zugänglichen Mikroarraydaten mittels qRT-PCR und Western Blot konnte ferner belegt werden, dass LASP1 in den Brustkrebszellen die Genexpression und Proteintranslation von MMP1, -3 und -9 positiv moduliert und somit das gesamt-invasive Potential der Zelle steigert. Darüber hinaus deuten Zymogramme und die Analyse des konditionierten Mediums darauf hin, dass LASP1 als Strukturprotein die vesikuläre Sekretion der inaktiven Zymogene (proMMPs) in die EZM fördert. Demzufolge modifiziert LASP1 während der Krebsprogression die zelluläre Mikroumgebung zugunsten einer erhöhten Metastasierungsrate. Die neu identifizierte regulatorische Funktion von LASP1 auf die Transkription sowie Sekretion von Matrix-Metalloproteasen erklärt die in früheren Arbeiten beobachtete Korrelation zwischen einer erhöhten LASP1 Konzentration im Gewebe und dem vermehrten Auftreten von Metastasen, und damit einhergehend, schlechteren Überleben der Patientinnen. N2 - The process of migration and tumor invasion requires the degradation of the surrounding extracellular matrix by proteolytic endopeptidases, called matrix-metalloproteases (MMPs). Therefore, cells form protrusive invadopodia or podosomes that recruit and secret MMPs to degrade the basement membrane. The LIM and SH3 protein 1 (LASP1) was recently identified as a new scaffolding protein in podosomes of macrophages. Knockdown of LASP1 affected size, number and lifetime of the podosomes and moreover, inhibited matrix degradation capacity. The main objective of the presented dissertation was to characterize the function of LASP1 in invadopodia of cancer cells. By establishing a matrix-degradation-assay, we demonstrated that down-regulation of LASP1 impaired matrix-degradation in MDA-MB-231 breast cancer cells, an effect earlier observed in macrophages. By analyzing and verifying accessible microarray data sets we observed regulation of MMPs by LASP1. qRT-PCR and Western Blot experiments confirmed that LASP1 positively modulates gene expression and translation of MMP1, -3 and -9, and thereof enhances cellular invasion. Furthermore, zymography and analysis of the conditioned medium revealed cytosolic LASP1 promotion of MMP vesicle secretion into the extracellular matrix, thus altering the microenvironment during cancer progression. In summary, the newly identified role of LASP1 in regulating matrix degradation by affecting MMP transcription and secretion elucidated the migratory potential observed in former studies that described upregulation of LASP1 in metastatic cancer cells. KW - Brustkrebs KW - Genexpression KW - Sekretion KW - Metalloproteasen KW - LASP1 (LIM und SH3 Protein 1) KW - LASP1 (LIM and SH3 Protein 1) KW - MMP (Matrix-Metalloproteasen) KW - MMP (Matrix-Metalloproteases) KW - Matrix-Metalloproteasen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136733 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Wurster, Sebastian T1 - Die Bedeutung von LIN9 für die Regulation der Genexpression, die genomische Stabilität und die Tumorsuppression T1 - The significance of LIN9 for gene regulation, genomic stability and tumor suppression N2 - Pocket proteins and E2F transcription factors regulate the expression of cell cycle associated genes and play a central role in the coordination of cell division, differentiation, and apoptosis. Disorders of these pathways contribute to the development of various human tumor entities. Despite intensive research in the field of cell cycle regulation many details are not yet understood. The LIN complex (LINC / DREAM) is a recently discovered human multiprotein complex, which dynamically interacts with pocket proteins and E2F transcription factors. An essential component of the LIN complex is the LIN9 protein. In order to obtain a better insight into the function of this protein in cell cycle regulation and tumorigenesis, a conditional Lin9 knockout mouse model was established in our laboratory. The primary objective of this study was the phenotypic characterization of embryonic fibroblasts (MEFs) from these mice. Shortly after inactivation of Lin9 cell proliferation was massively impaired. Multiple types of mitotic defects such as structural abnormalities of the spindle apparatus, aberrant nuclei, failed nuclear segregation and cytokinesis failure have been observed in Lin9-depleted cells leading to a dramatic increase in polyploid and aneuploid cells. Ultimately these serious aberrations result in premature cellular senescence. If the senescence of Lin9-deficient cells is overcome by the Large T antigen the cells can adhere to the loss of Lin9, but show severe genomic instability and grow anchorage-independently in soft-agar as a sign of oncogenic transformation. In the second part of the thesis the gene expression of Lin9-deficient cells was assessed by quantitative real time PCR analyses to determine, whether the mitotic abnormalities are caused by transcriptional defects. Here a significant reduction of mitotic gene expression was observed in Lin9-depleted cells. Additionally chromatin immunoprecipitation experiments were performed to clarify the underlying molecular mechanisms. Compared to control cells epigenetic alterations at the promoters of mitotic target genes with regard to activating histone modifications were found in Lin9-deficient MEFs. In the last section of this study, the effects of Lin9 heterozygosity were analyzed. Lin9 heterozygous MEFs showed normal proliferation, although expression of different mitotic genes was slightly reduced. It appeared, however, that the mitotic spindle checkpoint of Lin9 heterozygous MEFs is weakened and thus over several cell generations an increase in polyploid cells was observed. Soft-agar assays showed that Lin9 heterozygosity contributes to oncogenic transformation. Taken together, these results document a crucial role of LIN9 in the regulation of cell cycle-associated gene expression. LIN9 is an essential factor for cell proliferation on one hand, while at the same time it functions as a tumor suppressor. N2 - Pocket-Proteine und E2F-Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen und spielen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Störungen dieser Signalwege tragen zur Entstehung zahlreicher Tumorentitäten beim Menschen bei. Trotz der intensiven Untersuchung der Zellzyklusregulation sind viele Details noch unverstanden. Der LIN-Komplex (LINC / DREAM) ist ein kürzlich entdeckter humaner Multiprotein-komplex, welcher dynamisch mit Pocket-Proteinen und E2F-Transkriptionsfaktoren interagiert. Eine essentielle Komponente des LIN-Komplexes ist das LIN9-Protein. Um die Funktion dieses Proteins bei der Zellzyklusregulation und Tumorentstehung genauer untersuchen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe ein konditionelles Lin9-Knockout-Mausmodell etabliert. Primäres Ziel der Arbeit war es, den Phänotyp embryonaler Fibroblasten (MEFs) aus diesen Mäusen zu charakterisieren. Bereits kurz nach Inaktivierung von Lin9 konnte ein stark verlangsamtes Zellwachstums beobachtet werden. In Lin9-depletierten MEFs wurden multiple mitotische Defekte detektiert, die u. a. strukturelle Auffälligkeiten des Spindelapparates, aberrante Zellkerne, Störungen der Chromosomensegregation sowie zytokinetische Defekte umfassen und in einer dramatischen Zunahme polyploider und aneuploider Zellen resultieren. Im Langzeitverlauf führen diese erheblichen Aberrationen zu einer vorzeitigen zellulären Seneszenz. Wird diese durch das Large T-Protoonkogen durchbrochen, können sich MEFs an den Verlust von Lin9 adaptieren, zeigen dann jedoch eine hochgradige genomische Instabilität und Substrat-unabhängiges Wachstum im Weichagar als Zeichen onkogener Transformation. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression in Lin9-defizienten MEFs mittels quantitativer Real Time-PCR untersucht um zu klären, ob die beschriebenen Defekte auf Veränderungen der transkriptionellen Aktivität zurück-zuführen sind. Dabei wurde eine erhebliche Reduktion der Expressionslevel mitotischer Gene nach Verlust von Lin9 beobachtet. Des Weiteren wurden zur Klärung der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden dabei in Lin9-defizienten Zellen signifikante epigenetische Veränderungen bezüglich aktivierender Histon-Modifikationen an den Promotoren mitotischer Lin9-Zielgene festgestellt. Im letzten Abschnitt der Arbeit sollten die Auswirkungen des heterozygoten Verlustes von Lin9 analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass Lin9-haploinsuffiziente Zellen normal proliferieren, obwohl die Expression verschiedener G2/M-Gene leicht vermindert war. Es wurde jedoch eine Schwächung des mitotischen Spindelkontrollpunktes und in der Folge über mehrere Zellgenerationen eine Zunahme polyploider Zellen beobachtet. Mit Weichagar-Assays konnte gezeigt werden, dass bereits der heterozygote Verlust des Lin9-Gens zur onkogenen Transformation beiträgt. Zusammengenommen dokumentieren diese Studien, dass LIN9 eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen spielt und sowohl einen essentiellen Faktor für die Zellproliferation darstellt als auch durch die Gewährleistung genomischer Stabilität tumorsuppressive Eigenschaften aufweist. KW - Zellzyklus KW - Genexpression KW - Mitose KW - Knock-Out KW - LIN9 KW - Mausmodell KW - konditioneller Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114967 ER - TY - THES A1 - Wiemer, Laura Elisa T1 - In-vitro-Untersuchungen zur molekularen Wirkung von Mitotane beim Nebennierenrindenkarzinom T1 - In-vitro studies to elucidate the moclecuar actions of Mitotane in adrenocortical carcinoma N2 - Das Nebennierenrindenkarzinom ist eine hochmaligne Erkrankung und hat eine schlechte Prognose. Mitotane ist bis heute die einzige hierfür zugelassene Therapie. Um die molekularen Mechanismen der Mitotanetherapie besser zu verstehen, wurde die Nebennierenkarzinom-Zelllinie NCI-H295 mit unterschiedlichen Konzentrationen von Mitotane inkubiert und die Wirkung auf mehreren Ebenen untersucht. Dabei kam der Untersuchung der Steroidogenese und apoptotischer Vorgänge ein besonderer Fokus zu. In den Hormonanalysen via Immunoassay zeigte sich eine zeit- und konzentrationsabhängige Hemmung der adrenalen Steroidsekretion. So kam es unter 24-stündiger Inkubation mit 100µM Mitotane zu einer Reduktion der Cortisolsekretion um 89%. Diese Hormonsuppression geht einher mit einer Herabregulation von steroidogenen Enzymen in den durchgeführten Microarray-basierten Genexpressionsanalysen. So konnte gezeigt werden, dass vor allem Steroidbiosynthese-Enzyme der Zona fasciculata und reticularis betroffen sind. Als weitere wichtige Gene im Zusammenhang mit der Beeinflussung des Steroidhaushalts unter Mitotanetherapie konnten SQLE, LDLR, SCD, SREBF1 und ABCG1 identifiziert werden. Gleichzeitig konnte durch Durchflusszytometrie und Zelltod-ELISA die proapoptotische Wirkung von Mitotane gezeigt werden (FACS: 100µM Mitotane, 24 Stunden; Zunahme der Apoptose um den Faktor 2,13). Dies bestätigte sich beispielsweise auch in der Überexpression des Apoptosegens BAX in der Real-Time-PCR. Weiterhin zeigte der RNA-Microarray eine starke Expressionszunahme bei Genen, die mit dem programmierten Zelltod zusammenhängen wie GDF15, DUSP4, TRIB3 und CHOP. Ausgehend von den klinischen Effekten und bestätigt durch die oben genannten in vitro Ergebnisse bewirkt Mitotane auch molekular folgende Änderungen in Nebennierenrindenzellen: Hemmung der Steroidogenese und Induktion von Apotose. Es stellt sich damit die Frage, ob diese Mechanismen parallel und separat voneinander ablaufen oder ob es einen gemeinsamen Nenner gibt. Interessanterweise ergab die Analyse der Genexpressionsdaten, dass viele der proapoptotischen Gene mit dem sogenannten ER-Stress zusammenhängen. Einerseits könnte Mitotane durch direkte Inhibition der Hormonsekretion wirken, andererseits könnte ER-Stress durch Mitotane-induzierte-Bildung toxischer Lipide, wie Cholesterol, ausgelöst werden. Um den genauen Wirkmechanismus endgültig zu klären, werden weitere Experimente benötigt. Mitotane-induzierter ER-Stress liefert einen vollständig neuen Blickwinkel auf die molekulare Wirkweise von Mitotane auf Nebennierenrindenkarzinomzellen. Gerade da die Mediatoren des ER-Stresses gut definiert und ER-Stress spezifisch sind, könnten sie sinnvolle Ziele in der Therapie darstellen. Die Beobachtung, dass Mitotane ER-Stress hervorruft, könnte in Zukunft somit zur Entwicklung wirksamerer und spezifischerer Therapien des Nebennierenrindenkarzinoms führen und so die infauste Prognose dieser malignen Krankheit verbessern. N2 - In-vitro studies to elucidate the moclecuar actions of Mitotane in adrenocortical carcinoma KW - Nebenniere KW - Mitotane Nebennierenkarzinom KW - Genexpression KW - Mikroarray KW - Zellkultur Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94526 ER - TY - THES A1 - Batram, Christopher T1 - Die Kontrolle der monoallelen Expression, antigenen Variation und Entwicklung in Trypanosoma brucei T1 - The control of monoallelic expression, antigenic variation and development of Trypanosoma brucei N2 - Die ausschließliche Expression von nur einem Gen aus einer großen Genfamilie ist ein weit verbreitetes Phänomen, das als monoallele Expression bezeichnet wird. In dem Blutparasiten Trypanosoma brucei stellt die Expression eines einzigen variablen Oberflächenglykoproteins (VSG) aus einem Repertoire von über 1000 verschiedenen Genen die Grundlage für die Immunevasion dar. Durch einen periodischen Wechsel der VSG Expression (Antigene Variation) bleibt der Parasit vom Immunsystem des Wirtes unerkannt. Die VSG Gene werden aus telomerischen Blutstromform Expressionsstellen (BES) transkribiert, von denen nur eine zu einem bestimmten Zeitpunkt aktiv ist. Die Kontrolle der monoallelen VSG Expression ist somit einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von T. brucei. Ziel dieser Arbeit war es, die Vorgänge eines transkriptionellen Wechsels zwischen zwei BESs zu beschreiben. Das Ausschalten des aktiven VSGs durch RNA-Interferenz hatte zuvor gezeigt, dass dies nicht zu einer erhöhten Wechselrate führt. Es wurde daher untersucht, welche Auswirkungen das Anschalten einer zweiten BES auf die monoallele Expression hat. Da es bisher keine Möglichkeit gibt, eine inaktive BES gezielt zu aktivieren, wurde ein artifizielles System gewählt, das die gezielte induzierbare Expression eines Gens ermöglicht. Die BESs unterscheiden sich in der Anzahl und Zusammensetzung der Expressionsstellen-assoziierte-Gene (ESAGs), jedoch besitzt jede BES ein telomernahes VSG. Somit wird, bei einer BES Aktivierung, in jedem Fall ein neues VSG exprimiert. Durch die induzierbare Expression eines zweiten VSGs wurde so das Anschalten einer neuen BES simuliert. Mithilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass das VSG selbst für die Kontrolle der monoallelen Expression verantwortlich ist. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs führte zu einer graduellen Inaktivierung der BES. Infolge dessen verlangsamte sich der Zellzyklus und die Zellen verblieben bis zu fünf Tage in einem ruhenden Zustand. Genauere Analysen dieses Zustandes zeigten, dass es sich hierbei um ein bisher unbekanntes, reversibles Zwischenstadium zwischen proliferierenden sogenannten Long Slender und arretierten sogenannten Short Stumpy Formen handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit führten zu einem neuen Modell, das die Kontrolle der monoallelen VSG Expression mit der Entwicklung der Trypanosomen mechanistisch verbindet. N2 - The exclusive expression of only one gene from a gene family is a common phenomenon, known as monoallelic expression. The blood parasite Trypanosoma brucei evades the host immune system by expressing only one variant surface glycoprotein (VSG) from a repertoire of hundreds of different VSG genes. By periodically switching VSG expression (antigenic variation) the parasites evade the host antibody response. The VSG genes are transcribed from specialized telomeric bloodstream form expression sites (BESs), of which only one is active at any given time. Thus, monoallelic VSG expression is one of T. brucei's most important virulence factors. The aim of this work was to describe the processes occuring while transcription switches from one BES to another. The depletion of the active VSG by RNA interference (RNAi) was shown previously to have no effect on switching frequency. It was therefore investigated here, which influence the activation of a new BES would have on monoallelic expression. So far, it has not been possible to specifically activate a silent BES. Therefore, an artificial system was chosen which allows for inducible expression of a particular gene. The BESs differ in number and composition of expression site associated genes (ESAGs), but all contain a telomeric VSG gene. Thus, activation of a new BES will inevitably lead to expression of a second VSG. To simulate - in the most straightforward manner - the activation of a new BES, a second VSG was inducibly expressed. Using this system, it was shown that the VSG itself controls its own monoallelic expression. The ectopic overexpression of a second VSG led to a gradual inactivation of the BES. This, in turn, led to a prolonged cell division cycle and the cells remained in a dormant stage for up to 5 days. Further analyzes of this stage revealed a new, reversible intermediate stage between proliferating long slender and arrested short stumpy forms. The results of this work led to a new model that mechanistically links the control of monoallelic VSG expression and development in trypanosomes. KW - Trypanosoma brucei KW - VSG KW - antigene Variation KW - monoallele Expression KW - Genexpression Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90037 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Ingo T1 - Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien T1 - Artificial gene expression in human mitochondria N2 - Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen. N2 - Mitochondrial dysfunctions play an important role in a variety of neuromuscular and neurodegenerative diseases. As the proteins of the respiratory chain complexes are encoded by the mitochondrial DNA as well as the nuclear genome, mutations in both could trigger solely the diseases. Up to now, changes of the mitochondrial DNA could not be corrected, hence, therapies were designed to decrease symptoms in patients. In this context, the limiting factor to cure these disease relies on the DNA transport into the mitochondria. The aim of this work was to insert exogenous DNA into the mitochondria of human cultured cells by physical transfection methods. A variety of different vectors was constructed to express the mitochondrially adapted green fluorescent mtEGFP within mitochondria. The ability of these constructs to be expressed and processed was proved by in vitro assays using a mitochrondrial extract. In the transfection experiments using the gene gun, we succeeded for the first time to introduce exogenous plasmid DNA into human mitochondria. The mtEGFP expressed by the transfected vectors could definitely be localized to the mitochondria of the cells. Transfections using magnetic particles as mediator could not be used, because the particles exhibit an autofluorescence which prevents a detection of the mtEGFP expression. An essential prerequisite for the transfection of mitochondria by mechanical methods like microinjection is the reversible induction of megamitochondria, since they could not be penetrated as small regular organelles. Acidification of the culture medium with sodium acetate or acetic acid led to mitochondria exhibiting almost the size of the nucleus, thus giving ideal conditions for microinjection. In the applied microinjection experiments using the mitochondrial expression vectors, cells displayed mitochondria with distinct green fluorescence. In summary, human mitochondria were transfected successfully for the first time with mitochondrial expression vectors. This is a fundamental step in the development of new therapies targeting mitochondrial myopathies. However, the transfection methods have to be optimized to achieve higher transfection efficiencies. KW - Mitochondrium KW - Heterologe Genexpression KW - Mitochondrien KW - mitochondria KW - gene expression KW - Transfektion KW - Mensch KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202 ER - TY - THES A1 - Hock, Matthias T1 - Analyse der NFATc1-Genexpression durch eGFP-BAC-Reportermäuse T1 - Analysis of NFATc1 gene expression using eGFP-BAC reporter mice N2 - In Lymphozyten wird nach Antigenaktivierung die Expression des Nfatc1-Gens durch Aktivierung des P1-Promoters stark induziert. Dagegen ist die, durch den Promoter P2 vermittelte Expression ebenso wie die der anderen NFAT Faktoren c2 und c3 konstitutiv. Die Akkumulation der dabei gebildeten Isoform NFATc1/αA ist sowohl für Effektorfunktionen wie die Zytokinproduktion sowie die Proliferation und das Überleben der aktivierten Zellen wichtig (Chuvpilo et al., 2002). Um die Expression des Nfatc1-Gens auf Einzelzellebene messen zu können, wurden BAC (bacterial artificial chromosom) transgene Mauslinien generiert, die einen 210kb großen Bereich des Nfatc1-Gens der Maus enthalten. In diesen Lokus wurde ein eGFP-Reportergen innerhalb des allen Isoformen gemeinsamen, dritten Exons integriert. In dieser Arbeit wird durch semiquantitative RT-PCR-Experimente von Gesamt-Milzzellen und TLymphozyten gezeigt, dass in den B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen die Expression der eGFP-cDNA analog zum endogenen Nfatc1-Lokus der Kontrolle der beiden Promotoren P1 und P2 unterliegt. In Western Blot Experimenten wird in diesen Zellen mittels eines NFATc1α-spezifischen Antikörpers eine induzierbare und CsA-sensitive α-GFP-Isoform - vergleichbar mit der endogenen NFATc1α-Isoform - nachgewiesen. Gleichzeitig zeigen NFATc1-Antikörper das konstitutiv exprimierte GFPβ-Protein. Die Korrelation der Expression von NFATc1 und GFP auf mRNA- und Proteinebene machen in B6/NFATc1-eGFP-BAC-Reportermäusen das GFP-Protein somit zu einem sensitiven und spezifischen Marker der NFATc1-Aktivität. In FACS-Analysen gibt der Anstieg der GFP-Fluoreszenzintensität bei Stimulation von Gesamt- Milzzellen bzw. T-Lymphozyten um bis auf das Dreifache die Induktion von NFATc1 wider. Unter dem Einfluss von CsA verbleibt die GFPFluoreszenzintensität auf dem Niveau unstimulierter Zellen. Die GFPFluoreszenz korreliert darüber hinaus bei Primärstimulation mit der Expression des IL-2-Gens, dessen Promotor mit 5 NFAT-Bindestellen den Prototyp eines NFATc1-Targets darstellt (Serfling et al., 1989). Die Analyse der Koexpression von NFATc1 und GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt in allen stimulierten, GFP-positiven CD4+-Lymphozyten die nukleäre Lokalisation von 75 NFATc1, vor allem von NFATc1α. Die Analyse des GFP-Phänotyps in alloreaktiven T-Zellen zeigt bei Abstoßungsreaktionen in vitro („Mixed Lymphocyte Reactions“) eine selektive Zunahme der Fluoreszenz dieser Zellen um bis auf das Vierfache, was die Rolle von NFATc1 für die Effektorfunktion aktivierter T-Lymphozyten verdeutlicht. GFP und das endogene NFATc1 werden bei Stimulation konventioneller T-Zellen (Tcons, CD4+CD25-FoxP3-) stark exprimiert, während natürliche regulatorische T-Zellen (nTregs, CD4+CD25+FoxP3+) konstant geringe NFATc1- und GFP-Konzentrationen zeigen. In induzierten regulatorischen T-Lymphozyten (iTregs) supprimiert TGF- β konzentrationsabhängig die GFP-Fluoreszenz bis auf das Niveau unstimulierter Lymphozyten. Während in nTregs die Suppression des Nfatc1- Gens im wesentlichen durch FoxP3 erfolgt (Torgerson et al., 2009), scheint dies in iTregs vor allem über den TGF-β Signalweg vermittelt zu werden. Die Analyse der GFP-Expression in den verschiedenen Stadien der TZellentwicklung zeigt weiterhin deutliche Unterschiede in der Aktivität des Nfatc1-Gens. Dies wird durch die starke Aktivität des BAC-Genlokus in CD4- CD8- DN Thymozyten, welche eine sechsfach höhere GFP-Expression aufweisen als CD4+CD8+ DP Zellen, deutlich. N2 - Activation of lymphocytes causes a high level of Nfatc1 due to P1-promoter induction, whereas the P2-promoter leads to an constitutive expression of NFATc2/c3. NFATc1/αA is essential for effector-function, proliferation and survival of activated cells (Chuvpilo et al., 2002). Here we show that the eGFP-cDNA integrated in a NFATc1-eGFP-BAC-construct is under control of both promoters (P1, P2) and correlates with the NFATc1-Expression on mRNA and protein-levels. In FACS-analysis there is an increase in eGFP-fluorescence intensity, which is highly CsA-sensitive. In natural and induced Tregs we observed a low level of eGFP-expression correlating with concentration of TGF-β. CD4-CD8- DN cells show the highest eGFP-Expression in thymocytes. KW - NFATc1 KW - Genexpression KW - eGFP KW - BAC-Konstrukt KW - NFATc1 KW - Genexpression KW - eGFP KW - BAC-Konstrukt KW - NFATc1 KW - gene expression KW - eGFP KW - BAC-construct Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-80596 ER - TY - THES A1 - Larisch, Christina T1 - Laser Mikrodissektion als Tool für gewebespezifische Expressionsanalysen in Pflanzen: Methodik und Anwendung T1 - Laser Microdissection as a tool for tissue specific expression analyses in plants: method and application N2 - Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool für Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 % reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualität und Quantität der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene führt, verzichtet und eine deutlich größere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 % der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Blütenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Auslösung der SAR führen, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Blütenstiele v. a. der Jasmonsäureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorgänge im Phloem deutlich besser aufgelöst werden können, da die Untersuchungen an kompletten Blütenstielen deutliche Abweichungen gegenüber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugehörigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. Über auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es möglich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalität der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Frühjahr. N2 - In this dissertation, the Laser Microdissection could be further improved for usage as an adequate tool for expression analyses of plant tissues. Following a large optimization of the technique itself and an adaptation to the conditions of the plant tissues to be analyzed, different physiological questions could be processed using distinct plant species. Methodic improvements Especially while working with infiltrated Arabidopsis plants the methodic improvements were visible: i. The time for sample-generation could be decreased by 60-80 %, at the same time quality and quantity of the isolated RNA could be significantly enhanced. ii. By this the in Deeken et al. (2008) described pre-amplification step, which always leads to loss of low expressed genes, could be omitted, and a considerable higher number of phloem-expressed genes could be identified. iii. Finding 95 % of the in Deeken et al. specified genes in the new list demonstrates the high reproducibility of the LMPC-technique which could be achieved by the optimization. Pathogen response in the Arabidopsis phloem iv. The Laser Microdissection could be used accordingly to i-iii to collect phloem-samples of Arabidopsis inflorescence stalks after a pathogen infection. v. By searching for corresponding phloem-mobile signals that lead to an induction of SAR in systemic tissues it appeared that predominantly the jasmonic acid pathway activated in the phloem of Arabidopsis inflorescence stalks. SAR-marker genes were hardly induced. vi. Comparison of the microarray- and qPCR-data revealed that LMPC shows the processes in the phloem more specific, because analyses of complete inflorescence stalks showed explicit differences to the phloem-microarrays. Analyses of the microarrays as well as the corresponding time course experiments are not yet completed. Poplar wood rays as switch point of seasonal remodeling vii. Alternatively, the Laser Microdissection can be used in an inverted approach. viii. By this approach enriched poplar wood rays allowed deep insight into seasonality of poplar. ix. Together with metabolite- and qPCR-analyses these results provided a timetable of underlying physiological processes, especially during the remodeling from dormancy to resumption of active growth in spring. KW - Pappel KW - Ackerschmalwand KW - Laser KW - Mikrodissektion KW - Pflanzengewebe KW - Genexpression KW - Laser Mikrodissektion KW - Saisonalität KW - Holzstrahlen KW - systemische Resistenz KW - Laser Microdissection KW - seasonality KW - wood rays KW - systemic resistance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70182 ER - TY - THES A1 - Hokema, Anna T1 - Beeinflussung der Genexpression verschiedener Gene durch Xmrk in Pigmentzelltumoren bei Oryzias latipes T1 - The effect of Xmrk on the gene expression of various genes in pigment cell tumors in oryzias latipes N2 - Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten. N2 - Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Hauttumor KW - Genexpression KW - Real time quantitative PCR KW - Onkogen KW - Xmrk KW - Xmrk Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75616 ER - TY - THES A1 - Cremer, Nicole T1 - Genexpression bei der Alzheimer Demenz und dem Morbus Parkinson T1 - Gene expression in Alzheimer Dementia and Parkinson Diseasse N2 - Die Alzheimer Demenz und der Morbus Parkinson als häufigste neurodegenerative Erkrankungen führen zu schwerer Behinderung, zu Pflegebedürftigkeit und meist über Komplikationen zum Tod. Ihr langer Verlauf stellt für Betroffene, Angehörige sowie für das Gesundheitssystem eine enorme Belastung dar. Da die Ätiologie der Alzheimer Demenz und des Morbus Parkinson sowie der meisten neurodegenerativen Krankheiten im Einzelnen nicht bekannt sind und phänotypische Überschneidungen auftreten, sind die Möglichkeiten der eindeutigen Diagnosestellung häufig eingeschränkt oder erst postmortal möglich. Um eine Therapie bei Auftreten der ersten klinischen Symptome zu beginnen oder eine Voraussage der Erkrankungen zu ermöglichen, ist eine sensitive und validierte Frühdiagnostik nötig. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, auf der Genebene potentielle pathogenetische Verbindungen, mögliche diagnostische Markerproteine sowie Zusammenhänge zum zeitlichen Verlauf beider Krankheiten zu identifizieren. Dafür wurde mit der Real-Time Polymerasekettenreaktion die Expression von 44 Genen anhand von post mortem Gehirngewebe von Patienten mit Alzheimer Demenz, Morbus Parkionson im Vergleich zu Gesunden aus den vier Hirnregionen Hippocampus, Gyrus frontalis medialis, Gyrus temporalis medialis und Kleinhirn untersucht. Im Resultat zeigen die Gene mit einer statistisch signifikant veränderten Expression, z. B. Glutamattransporter, olfaktorische Rezeptoren oder vakuoläre Sortierungsproteine, bei beiden Erkrankungen gehäuft gleichsinnige Änderungen. Anhand dieser Ergebnisse ist eine kausale Verknüpfung des veränderten Genmetabolismus mit der ablaufenden Neurodegeneration zu vermuten. Zusätzlich wird die Hypothese gemeinsamer pathogenetischer Mechanismen beider Erkrankungen untermauert. Zusammenhänge der Genexpression zum zeitlichen Verlauf der Erkrankungen werden nur vereinzelt belegt, bekräftigten dann aber die Annahme einer Assoziation zu den degenerativen Prozessen. Die Identifizierung eines spezifischen Biomarkers für eine der beiden Erkrankungen war ein Ziel der vorliegenden Arbeit. Aufgrund seiner Expressionsänderung im Hippocampus bei Patienten mit Alzheimer Demenz könnte das BACE1-Gen (Beta site APP cleaving enzyme 1), das dort eine signifikante Expressionsabnahme zeigt, als solcher für dieses Patientenkollektiv diskutiert werden. Die häufig in dieser Arbeit im Hippocampus detektierten, signifikanten Expressionsänderungen, weisen zudem auf eine besondere Affektion dieser Hirnregion bei der Alzheimer Demenz als auch beim Morbus Parkinson hin. Des Weiteren werden in der vorliegenden Arbeit im Kleinhirn, einer Hirnregion, in der bei beiden Erkrankungen scheinbar kaum oder keine pathologischen Prozesse ablaufen, gehäuft und dann ähnliche Änderungen der Genexpression gemessen, die für eine Beteiligung des Kleinhirns bei beiden Krankheiten sprechen, deren Bedeutung bislang unklar ist. N2 - Alzheimer dementia and Parkinson disease are the most common neurodegenerative diseases. They lead to severe disability and mostly cause death through secondary complications. Their long latency is a big burden for the patients, their families and the health care system. The etiology of the most neurodegenerative diseases including Alzheimer dementia and Parkinson disease is largely unknown and there are phenotypical overlaps that limit the diagnostic options. Sensitive and validated diagnostic tools are necessary to start the appropriate therapy early and to make meaningful predictions. This thesis aims to find genes which can act as diagnostic marker proteins, show pathogenetic commonalities and potential correlations to the chronological sequence of the described diseases. 44 genes were analysed with real time polymerase chain reaction of post mortal tissue of the temporal and frontal cortex, the hippocampus and cerebellum from patients with Alzheimer dementia and Parkinson disease compared to a control group. Genes with statistical significant changes in expression between test subjects and controls as the olfactory receptor gene, the glutamate transporter gene or the vacuolar sorting protein gene often show similar changes in both diseases. These results show a connection between the changed gene expression and the progress of the neurodegenerative process in both diseases. In addition these results support the theory of common pathogenetic pathways in both diseases. Correlations to the chronological sequence of both diseases were confirmed just in individual cases but corroborate the connection to the ongoing neurodegenerative process. Furthermore this thesis aims to identify a diagnostic biological marker. Due to the expression profile of the BACE1 gene in the hippocampus of patients with Alzheimer dementia this gene can be seen as a potential biological marker for this group of patients. The frequently measured changes of gene expression profiles in the hippocampus show the particular significance of this brain region in the Alzheimer dementia and Parkinson disease. Furthermore this thesis shows numerous and similar changes of gene expression profiles for both diseases in the cerebellum, a region which demonstrates nearly no pathological processes in Alzheimer dementia and Parkinson disease. The significance of the findings is yet unknown and requires further research. KW - Alzheimer KW - Demenz KW - Parkinson KW - Genexpression KW - Alzheimer-Krankheit KW - Demenz KW - Parkinson-Krankheit KW - Differentielle Genexpression KW - Genanalyse KW - Gen KW - Alzheimer KW - dementia KW - Parkinson KW - gene KW - gene expression KW - gene analysis KW - Parkinson disease KW - Alzheimer disease Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76748 ER - TY - THES A1 - Huth, Antje [geb. Koppelkamm] T1 - Studien zum mRNA profiling an humanem postmortalem Gewebe T1 - Studies about mRNA profiling on human postmortem tissue N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erhöhtem Postmortalintervall und somit möglicherweise verminderter RNA-Integrität realisierbar sind und in Zukunft als zusätzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden können. Dafür wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verlässlichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen können. Es konnte zunächst für postmortales Skelettmuskelgewebe festgestellt werden, dass Verstorbene mit erhöhtem BMI statistisch signifikant niedrigere RIN-Werte aufweisen als normalgewichtige Personen. Zudem wurde eine Korrelation zwischen dem Gewebetyp und der Integrität der daraus extrahierten RNA gefunden. Unter Anwendung der in dieser Arbeit gewählten Extraktionsmethode scheint postmortales Skelettmuskelgewebe für Genexpressionsstudien an Autopsiematerial besonders geeignet. Dagegen wurde im vorliegenden Probengut kein Zusammenhang zwischen verminderter RNA-Integrität und Parametern wie Geschlecht, PMI, Sterbealter, Dauer der Agonie und Todesursache gefunden. In einer weiteren Teilstudie wurde anhand von postmortalem Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Gehirngewebe aus einer Auswahl von zehn funktionell verschiedenen endogenen Kontrollgenen HMBS, UBC, SDHA und TBP als die Gene mit der größten postmortalen Transkriptstabilität identifiztiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von vier stabilen endogenen Kontrollen am untersuchten Probenmaterial eine verlässliche Datennormalisierung erlaubt. Die validierten Kontrollgene können auch zukünftig für quantitative Genexpressionsstudien eingesetzt werden, solange die untersuchte Probenzusammensetzung der hier vorgestellten ähnelt. Für die Todesursache sowie für den Body Mass Index des Probenspenders wurde in der vorliegenden Arbeit ein statistisch signifikanter Einfluss auf das Expressionslevel instabiler Gene festgestellt. Diese Parameter sind daher geeignet, die gefundenen Instabilitäten möglicher Kontrollgene zu erklären. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen des Weiteren darauf schließen, dass das Erstellen von Degradierungslinien aus kommerziell erhältlicher RNA für jedes verwendete qPCR-Assay ein wichtiges Instrument der Qualitätsprüfung ist. Mit der Degradierungslinie kann die Detektionsgrenze des verwendeten qPCR-Assays validiert werden kann. Nur so ist die Festlegung des Bereichs möglich, in dem ein verändertes Expressionslevel tatsächlich mit dem Einfluss eines spezifischen Parameters in Verbindung gebracht werden kann und klar von einer nur scheinbaren Genexpressionsänderung unterscheidbar ist, die durch eine Degradierung der Probe vorgetäuscht wird. Zudem scheint es praktikabel, in zukünftigen Studien nur Proben mit ähnlichen Integritäten miteinander zu vergleichen. Pathologische Prozesse im menschlichen Körper, auch solche, die die Funktion von Organen sowie die Morphologie betreffen, sind hoch komplex und können interindividuell variieren, weshalb die Genexpression im forensischen Kontext ergänzende Hinweise auf die Diagnose liefern könnte. Als erstes anwendungsbezogenes Beispiel wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Hypoxie auf das Transkriptlevel von HIF-1α, VEGF und SLC2A1 untersucht. Bei Normalisierung der Daten gegen vier stabile Kontrollgene ergaben sich anhand der untersuchten Gewebeproben Hinweise auf eine todesursachenbezogene Hochregulierung der drei Zielgene. Die Studie unterstrich die besondere Bedeutung der gewählten Normalisierungsstrategie. Wurden die Daten nur gegen GAPDH als einzelnes, nicht validiertes Kontrollgen normalisiert, deuteten die Ergebnisse eine überraschende Herunterregulierung der Zielgene an. Als mögliche Ursache für diese scheinbare Diskrepanz kommt die im weiteren Verlauf dieser Studie nachgewiesene Instabilität infolge einer Co-Regulation von GAPDH unter hypoxischen Bedingungen in Betracht. Mit dem Fernziel postmortale Genexpressionsstudien als zusätzliches Instrument in der forensischen Todesursachenbestimmung einzusetzen, schafft die vorliegende Arbeit durch die Einführung von validierten Kontrollgenen sowie durch die Analyse weiterer Einfluss nehmender Faktoren eine Basis für die verlässliche Durchführung künftiger Genexpressionsstudien an humanem Autopsiegewebe. N2 - Using quantitative gene expression studies could form a valuable innovative tool for the determination of the cause of death in forensic pathologies. Thus, the present work focuses on the questions around the possibilities and limitations of gene expression analysis in postmortem human tissue from donors with prolonged postmortem interval (PMI) and probably decreased RNA integrity. Therefore several parameters influencing the reliability of quantitative gene expression data were examined. First, it was found that in postmortem skeletal muscle deceased with an increased body mass index (BMI) reveal decreased RIN values compared to normal weight donors. Moreover, a correlation was found between the type of tissue and the integrity of RNA that was isolated from it. When extracting RNA as presented in this work, postmortem skeletal muscle tissue showed the overall highest RIN values and seems to be best suited for gene expression studies using autopsy material. Using the presented sample set no correlation was found between RNA integrity and parameters like gender, PMI, age at death, duration of agony and cause of death. Second, using postmortem cardiac muscle, skeletal muscle and brain tissue the stability of ten endogenous control genes with different functionality was assessed and HMBS, UBC, SDHA and TBP were identified as genes of high transcript stability. Furthermore, it was shown that four stable endogenous control genes seem to be adequate for a reliable data normalisation. Thus, the four validated control genes mentioned may be used in future quantitative gene expression studies if sample composition is similar to the one presented in this work. Donors cause of death and body mass index were found to significantly influence the expression level of instable genes. Thus, these parameters may be adducted to explain the instability found in some of the assessed potential reference genes. Third, identifying the limit of detection due to degradation processes was found to be an important quality control test for every qPCR assay used. The results of this work confirm the importance of analyzing degradation lines of commercially available RNAs. This information allows the correct interpretation of gene expression levels and an identification of apparent changes in transcript abundances which are the result of degradation rather than biological processes. Finally, it was found that even though it is not always possible to collect only samples with high RIN values, it seems to be workable to use RNA samples of similar integrities in future gene expression studies. Fourth, pathological processes in the human body affecting the function of organs as well as their morphology show high complexity and may vary between individuals. Therefore, analysis of the gene expression status at the time point of death might give valuable hints about donors´ forensically relevant diagnose. Examining the impact of hypoxia on expression levels of HIF-1α, VEGF and SLC2A1 was conducted as a first example. Normalising data against four stable reference genes gave hints to an increased gene expression in donors who died of a hypoxia associated cause of death compared to the control group. Moreover, this study confirmed the particular importance of the elected normalisation strategy. Surprisingly, the four genes of interest suggested a decrease in gene expression after its normalisation against GAPDH as a single nonvalidated control gene. A possible reason for this discrepancy may be found in the apparent instability and the co-regulation of GAPDH under hypoxic conditions. To summarize, the presentation of validated control genes as well as the analysis of parameters affecting RNA integrity and quantitative gene expression data provide a basis for the reliable performance of future gene expression studies using human autopsy samples. This raises hope for the successful implementation of postmortem gene expression studies as additional tool in forensic pathology to assist the determination of somebody´s cause of death. KW - Genexpression KW - Gewebe KW - Mensch KW - Tod KW - Genexpressionsanalysen KW - postmortales Humangewebe KW - Transkriptstabilität KW - RNA Integrität KW - gene expression profiling KW - postmortem human tissue KW - gene stability KW - RNA integrity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74308 N1 - Zweitgutachter in Würzburg: Prof. Dr. Krohne, Lehrstuhl für Zell- und Entwicklungsbiologie der Univ. Würzburg ER -