TY - THES A1 - Neufeld, Bernd T1 - Neue Interaktionspartner der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 T1 - New interaction partners of the MAPKAP-kinases 3pK and MK2 N2 - Auf der Suche nach physiologischen Substraten der MAPK-aktivierten Proteinkinasen (MAPKAP-Kinasen), 3pK und MAPKAP-K2 (MK2), wurden Mitglieder eines Säuger-Polycomb-Komplexes, HPH2 und das Protoonkoprotein Bmi1, als Interaktionspartner identifiziert. Proteine aus der Polycomb-Gruppe (PcG) sind dafür bekannt, multimere, Chromatin-assoziierte Proteinkomplexe zu bilden. Diese wirken als transkriptionelle Repressoren und spielen als solche eine wichtige Rolle sowohl in der Regulation von Entwicklungsprozessen als auch in der Kontrolle der zellulären Proliferation. HPH2 bindet im Hefe two-hybrid-System sowohl an 3pK als auch an MK2. Die Kinasen coimmunpräzipitieren auch mit den PcG-Proteinen. Weiterhin wurde festgestellt, daß nicht aktivierte und DNA-assoziierte 3pK, ähnlich wie Bmi1, in einem in vivo Repressionsassay als transkriptioneller Repressor wirkt. Dies unterstellt, daß 3pK, wie Bmi1, fähig sein muß, andere PcG-Proteine an das Zielgen zu rekrutieren, wo sich dann ein biologisch funktioneller Repressionskomplex rekonstituiert. Bmi1 ist ein Phosphoprotein und beide MAPKAP-Kinasen konnten in dieser Arbeit als in vitro Bmi1-Kinasen identifiziert werden. Da der Phosphorylierungsstatus von Bmi1 mit seiner Dissoziation und der anderer PcG-Proteine vom Chromatin korreliert, könnten die MAPKAP-Kinasen Regulatoren einer phosphorylierungs-abhängigen PcG-Komplex/Chromatin-Interaktion sein. 3pK und MK2 wurden hier als die ersten Kinasen identifiziert, die in Assoziation mit Proteinen von PcG-Komplexen vorliegen, was ein funktionelles Zusammenwirken von MAPK-Signaltransduktionsnetzwerk und der Regulation der PcG-Funktion nahe legt. Ein weiterer durch das two-hybrid-System und Coimmunpräzipitationsexperimente identifizierter Interaktionspartner beider hier analysierter MAPKAP-Kinasen ist der basische Helix-Loop-Helix- (bHLH) Transkriptionsfaktor E47. Dieses E2A-kodierte Protein bindet als Homo- bzw. Heterodimer mit gewebespezifischen bHLH-Proteinen an sogenannte E-Box-DNA-Motive und ist so in die Regulation gewebespezifischer Genexpression und Zelldifferenzierung involviert. In dieser Arbeit konnten 3pK und MK2 als in vitro Kinasen des in Zellen phosphoryliert vorliegenden Transkriptionsfaktors identifiziert werden. Weiterhin führte die transiente Expression jeder dieser Kinasen in einem Reportergenassay mit einem E-Box-Promotorkonstrukt zu einer Repression der transkriptionellen Aktivität von E47. Der bHLH-Transkriptionsfaktor E47 interagiert also mit beiden MAPKAP-Kinasen, 3pK und MK2, was die Kinasen als neu identifizierte Regulatoren der E47-abhängigen Genexpression präsentiert. Mit dieser Arbeit ist ein erster Aufschluß der physiologischen Aktivität der MAPKAP-Kinasen 3pK und MK2 als transkriptionelle Regulatoren gelungen. N2 - SUMMARY In a search for physiological substrates for the MAPK-activated protein kinases (MAPKAP kinases), 3pK and MAPKAPK-2 (MK2), constituents of a mammalian polycomb complex, HPH2 and the proto-oncoprotein Bmi1 were identified as interaction partners. Polycomb group (PcG) proteins are characterised to form large multimeric, chromatin-associated protein complexes with repressive transcriptional function. PcG complexes have an important role in the regulation of developmental processes and in the control of cellular proliferation. HPH2 binds to either kinase in a yeast two-hybrid assay and both, 3pK and MK2 are shown here to coimmunoprecipitate with HPH2 and Bmi1 or Bmi1 from mammalian cell lysates, respectively. Further, non-activated and DNA-bound 3pK could be identified as a transcriptional repressor of a chromatin-embedded gene in an artificial repression assay similar to the function of Bmi1. This suggests, that non-activated and DNA-bound 3pK, like Bmi1, must be able to recruit other PcG proteins to the target gene to reconstitute a functional repressive complex. Bmi1 is a phosphoprotein and both, 3pK and MK2 were identified in this paper to be in vitro Bmi1-kinases. Since the Bmi1 phosphorylation status was shown to be correlated with its dissociation from chromatin, it is likely that the MAPKAP kinases might be regulators of phosphorylation-dependent PcG-complex/chromatin interaction. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 are the first kinases identified to be assembled with members of PcG-protein complexes, suggesting a link of the MAPK signalling network to the regulation of PcG complex function. Another new interaction partner of both MAPKAP kinases which was identified by means of the two-hybrid system and coimmunoprecipitation experiments is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor E47. This E2A-encoded protein is known to be involved in the regulation of tissue-specific gene expression and cell differentiation. E47 is a phosphoprotein, and 3pK and MK2 were identified as E47-kinases in vitro. Further, expression of either kinase results in a repression of the transcriptional activity of overexpressed E47 in transient reporter gene assays with an E-box containing promoter construct. In summary, the MAPK-activated protein kinases 3pK and MK2 were identified to be assembled with the bHLH transcription factor E47 suggesting that these kinases are regulators of E47 activity and E47 dependent gene expression. These results provide first evidence for the physiological function of the MAPKAP kinases 3pK and MK2 as transcriptional regulators. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Molekularbiologie KW - intrazelluläre Signaltransduktion KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP-Kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - Molecular biology KW - intracellular signal transduction KW - MAPK-Signalwege KW - MAPKAP kinase KW - 3pK KW - MK2 KW - Polycomb KW - HPH2 KW - Bmi1 KW - bHLH transcription factor Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1765 ER - TY - THES A1 - Nesper, Jutta M. T1 - Charakterisierung von spontan phagenresistenten Vibrio cholerae O1 El Tor Mutanten T1 - Charakterization of spontaneous phageresistant Vibrio cholerae O1 El Tor mutants N2 - Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberflächenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zusätzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Moleküle synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unverändertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgewählte spontan phagenresistente Stämme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen Stämme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit verändertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das für die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich für die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber verändertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeinträchtigt waren. Zusätzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Phänotyp an abiotischen Oberflächen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose für die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen Mäusen ergaben, daß O-Antigen negative Stämme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im Dünndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte für den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zusätzlich wurde die Überlebensfähigkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen Dünndarm vorkommen, unter „in vitro“ Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegenüber schwachen organischen Säuren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallensäuren. O-Antigen negative Stämme waren dagegen weiterhin resistent gegenüber Gallensäuren und schwachen organischen Säuren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde für keine der LPS-Mutanten eine größere Beeinträchtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilität, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der äußeren Membran war offensichtlich nicht beeinträchtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verstärktem Maße periplasmatische Proteine in den Überstand diffundieren können. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur für eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund dafür ist höchstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen äußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des Dünndarms ermöglicht. N2 - Vibrio cholerae is a Gram-negative, facultative pathogen and is the causative agent of cholera. In this study the adsorption site of the temperate phage K139 on the bacterial cell surface was determined. Phage-binding studies with purified lipopolysaccharide (LPS) showed that the O-antigen of the serogroup O1 serves as the phage receptor. In addition, phage resistant mutants of the O1 El Tor Inaba strain P27459 were screened by using a virulent isolate of phage K139. Analysis of the LPS by PAGE migration patterns revealed that most of the spontaneous mutants synthesize incomplete LPS molecules, either composed of defective O-antigen or core oligosaccharide. Phage resistent isolates with apparently normal LPS form either translucent or opaque colonies. The genetic nature of spontaneous phage resistant strains was investigated. O-antigen negative strains were investigated by Southern hybridization with probes specific for the well known O1-antigen biosynthesis cluster (rfb). Two of the investigated O-antigen negative mutants revealed insertions of element IS1004 into the rfb-gene cluster. Spontaneous phage resistant R-LPS mutants were found to synthesize an altered core without attached O-antigen. This type of mutants are most likely affected in the core oligosaccharide biosynthesis gene cluster (waa), which was identified by searching the V. cholerae genomic database. waaF, encoding heptosyl-II-transferase, was inactivated and the LPS was found to have the same migration behaviour in PAA gels than two spontaneous mutants. However, in contrast to the constructed waaF mutant complementation with waaF in trans restored only the core oligosaccharide but not the O-antigen synthesis in the spontaneous mutants. Further analysis revealed that one mutant had a deletion of 546 bp affecting waaF and waaL, the latter is thought to encode the putative O-antigen-ligase. Spontaneous mutants with intact O-antigen but altered core oligosaccharide were identified as galU mutants, which were also affected in the galactose catabolism. Other gal genes, galE and galK, were inactivated and these mutants were also found to be defective in the catabolism of exogenous galactose but synthesized an apparently normal LPS. Additionally, galU and galE mutants were found to lyse in the presence of high galactose concentrations. Furthermore the role of galU and galE in biofilm formation was investigated. In contrast to the spontaneous phage resistant opaque colony variant the translucent wt-strain was unable to form a biofilm, therefore the galE and galU mutations were also introduced into the opaque colony variant. galU and galE mutants of the opaque strain were translucent and unable to form a biofilm on abiotic surfaces, suggesting that the synthesis of UDP-galactose, via UDP-glucose, is essential for the biosynthesis of the exopolysaccharide. Virulence studies in infant mice indicated that O-antigen negative mutants, galU and R-LPS mutants but not galE and galEK mutants were defective in colonization of the mouse small intestine, excluding any toxic galactose effects in the gut. By investigating the sensitivity to several substances known to be present in the intestine „in vitro“, it was shown that galU and R-LPS mutants were more sensitive to weak organic acids, cationic antimicrobial peptides, the complement system and bile salts. O-antigen negative strains were found to be sensitive against gut-associated bacteriocidal substances, but they displayed significant resistance to bile salts and organic acids. No gross change in other virulence determinants such as motility, synthesis of pili TCP, choleratoxin production or outer-membrane proteins has yet been found for any of the LPS mutants. However, some periplasmic leakage for galU and significant leakage for R-LPS mutants was observed. These results suggest that not only the O-antigen, as already known, but also a specific core oligosaccharide architecture seems to be required for V. cholerae colonization, most probably in providing resistance against bacteriocidal substances. KW - Vibrio cholerae KW - Resistenz KW - Bakteriophagen KW - Vibrio cholerae KW - LPS KW - Virulenz KW - Biofilmbildung KW - Vibrio cholerae KW - LPS KW - virulence KW - biofilmformation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1747 ER - TY - THES A1 - Mehling, Beatrix T1 - Klonierung und Charakterisierung eines polymorphen MHC Kl. I-Moleküls der LEW.1F-Ratte, das präferentiell Va8.2-exprimierende CD8-T-Zellen expandiert T1 - Cloning and characterization of a polymorphic MHC class I molecule of the LEW.1F rat, which preferentially expands Va8.2 positive CD8 T-cells N2 - Der MHC der Lewis.1F-Ratte (RT1f) stimuliert die präferentielle Expansion von CD8-T-Zellen, die das V-Segment 8.2 (AV8S2) der TCR-alpha-Kette verwenden. Sowohl als Folge der positiven thymischen Selektion in der Lewis.1F-Ratte (LEW.1F) wie auch bei der RT1f-Alloerkennung. Es war Ziel dieser Arbeit, das MHC Kl. I-Molekül der LEW.1F-Ratte, das diese präferentielle Expansion von AV8S2-Zellen induziert, zu klonieren sowie die Kontaktpunkte der Interaktion zwischen dem MHC-Molekül und AV8S2 zu kartieren. Über RT-PCR wurde ein MHC-I-Gen der LEW.1F-Ratte (RT1.Af) isoliert, sequenziert und zusammen mit einem anderen MHC-I-Gen aus der LEW.1F-Ratte (A2f) analysiert, das von einer Arbeitsgruppe aus Babraham (Cambridge, UK) gefunden worden war. Durch einen Nukleotidsequenz-Vergleich von Af und A2f mit bekannten Ratte-MHC-I-Genen konnte gezeigt werden, daß die Sequenzen beider charakteristisch für Ratte-MHC-I-Gene sind. Beide Moleküle wurden stabil in L-Zellen, rCD80-transfizierte P815-Zellen und T-Zellhybridomen (THO35/1) exprimiert. Die serologische Charakterisierung mit 19 RT1f-reaktiven Alloantikörpern ergab, daß sich die LEW.1F-Serologie alleine durch Af erklären läßt. In einem Zytotoxizitätstest mit LEW.1F-reaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten, wurde Af spezifisch erkannt, A2f dagegen nicht. Serologie und Zytotoxizitätstest zeigen, daß die RT1f-spezifische Alloerkennung das Af-Molekül fokussiert, A2f unbedeutend scheint. Möglicherweise, da dieses Molekül in der LEW.1F-Ratte nur schwach exprimiert ist. Die Interaktion von Af und A2f mit AV8S2-Zellen wurde mittels einer MLR (gemischte Lymphozytenreaktion) in der Alloerkennung untersucht: Af, nicht aber A2f, stimuliert die präferentielle Expansion AV8S2-positiver CD8-T-Zellen in der Alloreaktion. Somit ist Af als das Molekül identifiziert, daß die Überselektion von AV8S2-Zellen vermutlich auch in der thymischen Repertoire-Selektion induziert. Zur Kartierung der Af/AV8S2-Interaktion wurden Hybridmoleküle aus Aa und Af gentechnisch hergestellt: Aa und Af unterscheiden sich extrazellulär nur in sieben Aminosäuren, die konzentriert auf zwei Regionen des MHC-Moleküls liegen: "Region I" (AS 62, 63, 65, 69, 70) und "Region II" (167, 169). Aa stimuliert keine präferentielle AV8S2-Zell-Expansion, daher muß die charakteristische Kombination dieser sieben Aminosäuren für die präferentielle Interaktion mit AV8S2-positiven CD8-T-Zellen ausschlaggebend sein. Durch MLRs mit Hybrid-exprimierenden Stimulatorzellen wurde gezeigt, daß beide Regionen zur präferentiellen Expansion AV8S2-exprimierender CD8-T-Zellen beitragen. Durch den Vergleich mit anderen Daten unseres Labors konnte dargelegt werden, daß die beta-Kette zur präferentiellen Interaktion von AV8S2-Zellen mit Af keinen spezifischen Beitrag leistet. Ebenso unbeteiligt ist die Komplementarität-bestimmende Region 2 (CDR2) der alpha-Kette. Die charakteristischen Sequenzen von CDR1alpha und CDR3alpha dagegen sind für die präferentielle Expansion von AV8S2-positiven CD8-T-Zellen durch Af essentiell. N2 - It was shown previously that RT1f (the MHC of the LEW.1F rat) preferentially expands AV8S2 (V-segment 8.2 of the TCR-alpha chain) expressing T-cells in positive thymic selection in the LEW.1F rat (overselection) as well as AV8S2 cells alloreactive to RT1f. As the preferential AV8S2 expansion was only detected in the CD8 T-cells, a MHC class I molecule of the LEW.1F rat was postulated to be responsible for the overselection. In this thesis the MHC I molecule of the LEW.1F rat promoting preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells in allorecognition was identified. To this end a MHC I molecule of the LEW.1F rat, Af, was cloned and sequenced. Together with A2f, another MHC I molecule of the LEW.1F rat, cloned and sequenced by a group from Babraham/UK, Af was expressed in various cell lines and hybridomas. The two molecules were tested for recognition by RT1f-reactive antibodies and cytotoxic T-lymphocytes. By these criteria Af was defined as a MHC class I molecule of the LEW.1F rat whereas A2f was not. The ability to overselect AV8S2 CD8 T-cells was examined by MLR (mixed lymphocyte reaction). Preferential interaction of this TCR segment with Af but not A2f has therefore been demonstrated. Thus Af is the molecule preferentially expanding AV8S2 cells. To identify the Af/AV8S2-contact points hybrids between Aa and Af were generated: Extracellularly, Aa differs from Af in only seven aminoacids, which are clustered in two different regions (region I and II). Yet Aa is not able to promote preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells. Therefore the specific combination of the seven aminoacids differing between the two molecules are crucial in the observed preferential AV8S2 reactivity of Af. In generating hybrids differing in these regions, equal contributions of both regions for recognition by AV8S2 RT1f-reactive CD8 T-cells could be demonstrated. By theoretical implication the Af/AV8S2 interaction points could be narrowed down further: On the side of the MHC, solely the presumably directly TCR-contacted MHC aminoacids 62, 65, 69 and 167 are likely to be involved in AV8S2-cell expansion. On TCR side, the beta-chain is not involved in specific Af interaction. Only complementarity determining regions 1 and 3 of the TCR-alpha chain are essential for preferential interaction with Af by AV8S2 positive CD8 T-cells. KW - Antigen CD8 KW - T-Lymphozyt KW - MHC Klasse I KW - Molekulargenetik KW - T-Zellrezeptor KW - MHC Kl. I KW - positive thymische Selektion KW - Alloreaktion KW - gemischte Lymphozytenreaktion KW - CD8 T-Zell-Subpopulation KW - T-cell receptor KW - MHC class I KW - positive thymic selection KW - alloreaction KW - MLR KW - CD8 T-cell subpopulation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1727 ER - TY - THES A1 - Matenia, Dorthe T1 - Die Rolle der Serin/Threonin Kinase Cot in Proliferation, Differenzierung und Apoptose N2 - Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern über komplexe z.T. miteinander verknüpfte Signaltransduktionskaskaden übertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die Fähigkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen führt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese Fähigkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorauslösende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos führt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. Ähnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-Mäusen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade überein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellulären Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot überlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorläuferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copräzipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abhängigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird hauptsächlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopräzipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ansätze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren. N2 - Mitogenic signals initiated at the plasma membrane are transmitted to the nucleus through complex and partially connected signal transduction cascades. The proto oncoprotein Cot was identified in this thesis as a new component of mitogenic signalling cascades, which activates both, the classic cytoplasmic cascade and the JNK stress pathway. Wildtype and activated Cot phosphorylate and activate MEK-1 and SEK-1 in vitro. Moreover, expression of oncogenic Cot in 293, NIH3T3 and PC12 cells leads to phosphorylation of endogenous c-Jun and ERK 1/2 in vivo. To test the relevance of the ability of Cot to stimulate two different signalling cascades we have examined the effects of Cot on different cell types as well as on tumor induction in mice. Expression of oncogenic c-Raf-1 or v-Mos leads to differentiation of PC12 cells. Cot induces as well neurite outgrowth in these cells. Furthermore, oncogenic Cot shows similar to v-raf an antiapoptotic effect on 32D cells after IL-3 deprivation. Retrovirally expressed oncogenic Cot induces B-cell lymphomas in newborn NSF/N mice after a latency of 7-10 weeks similiar to v-raf/v-myc [191]. This data are consistent with the role of Cot in the classic mitogenic cascade and suggest that the simultaneously activated JNK stress pathway has no antagonistic effects in this context. Active NF-kB regulates transcription of a variety of target genes involved in distinct cellular functions. Many stimuli activate NF-kB including members of the mitogenic cascade, e.g. c-Raf-1, which seems to function on the same level as oncogenic Cot and has partially overlapping effects on apoptosis suppression, transformation and differentiation. The work presented in this thesis demonstrates that Cot activates NF-kB and that this activation occurs indirectly via an autocrine loop which involves the EGF-receptor and also results in the activation of the stresskinase pathway. Similar results have been obtained in our lab in the past with Raf-1 [234]. An additional more direct pathway from Cot to NF-kB activation was demonstrated by our identification of p105, a precursor protein and regulator of NF-kB, as Cot interaction partner in a Two-hybrid screen. Furthermore, Cot coprecipitates with IKKa and IkBa, which are both regulators of NF-kB. The process of NF-kB activation is mainly controlled by the shuttling of components of the active transcription factor complex as well as of its regulators between cytosol and the nucleus. It is assumed that the small GTPase Ran plays a crucial role in these transports. Interestingly, we observed in a Two-hybrid screen that Ran is interacting with Cot which also was confirmed by coimmunoprecipitation experiments. These results point to a new mechanism of NF-kB regulation by activated Cot and gives new starting points to analyse the complex functions of Cot in the cell. KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - Apoptosis KW - Proliferation KW - Zelldifferenzierung KW - Molekularbiologie KW - Proto-Onkoprotein Cot KW - Apoptose KW - JNK-Streß-Kinase KW - proto oncoprotein Cot KW - apoptosis KW - JNK stress pathway Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1712 ER - TY - THES A1 - Loske, Claudia T1 - Metabolische Veränderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts" T1 - Metabolic changes and cell death in neural cells by "advanced glycation endproducts" N2 - Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unlöslich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der Hämodialyse eine Rolle, für die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrillärer Bündel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl für eine Akutphasenreaktion als auch für oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von Übergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, lässt sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizität unterschiedlicher Modell-AGEs ist abhängig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Präparationen in vitro. Die AGE-Toxizität ist hauptsächlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress lässt sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellulärer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors für AGEs (RAGE) mit spezifischen Antikörpern konnte die Zahl überlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgelöster Stress führt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu Störungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verhältnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Veränderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anfänglich erhöhter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktatausschüttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien können die Störungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschwächen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringfügig erhöhter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verläuft der durch AGEs ausgelöste Zelltod verläuft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch über rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Veränderungen im Metabolismus der Zelle. Dies führt u. a. dazu, dass für die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr genügend Energie zur Verfügung steht. AGE-Stress trägt damit in einer selbstverstärkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren könnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen. N2 - One of the most important post-translational modification of proteins is the non-enzymatic attachment of reducing sugars. Subsequent oxidations, dehydrations and rearrangements produce a heterogenous group of heterocyclic, coloured and fluorescent compounds termed "advanced glycation endproducts" (AGEs). In the course of their formation, free radicals and other reactive intermediates are created. AGE-modified proteins are resistant to proteases, their formation is irreversible. They accumulate on long-lived proteins with slow turn-over, e.g. on collagen or eye lens cristallin and on pathological protein deposits, e.g. in Alzheimer´s diease (AD). Accumulation of AGEs also occurs in the diabetic kidney and is discussed to be of importance in the etiology of AD. The pathology of Alzheimer´s disease involves accumulation of intra and extracellular protein aggregates like senile plaques and tangles. Further hallmarks are a reduction of glucose metabolism in the affected brain areas, together with signs for an acute phase response and for oxidative stress. In vitro experiments showed that AGEs accelerate the crosslinking of ßA4, the major component of senile plaques in AD. Since glycation of the peptide monomer is the first step of this reaction, this points to a participation of glycation in plaque-formation in AD. The formation of covalently crosslinked hight-weight ßA4 oligomers is further accelerated by micromolar amounts of copper and iron ions. Formation of these AGE-crosslinks can be inhibited by agents which are able of capping amino-groups, by metall chelators and by antioxidants, suggesting that these drugs may have the potential to slow down the formation of insoluble protein deposits in vivo AGEs have a direct toxic effect on BHK 21 fibroblasts and human SH-SY5Y neuroblastoma cells. AGE-modification renders proteins cytotoxic, the toxicity of a protein increases with the total AGE-content and depends from the modified protein. The LD50 of a model-AGE can be correlated with the in vitro radical production by the modified protein. On the level of signal transduction, AGEs induce the activation of the nuclear transcription factor kB as a stress response in neuroblastoma cells. AGEs enhance the formation of intracellular lipid-peroxidation products as markers for oxidative stress. AGE-toxicity is mediated by ROS and oxidative stress since various antioxidants were able to attenuate AGE-induced cell death. The receptor for AGEs (RAGE) appeared to be involved in AGE-toxicity as well, because blocking of RAGE with neutralizing antibodies increased the percentage of vital cells after AGE-treatment. The AGE-induced cell death shows signs of an initial apoptotic, final necrotic pathway. Though the percentage of annexin positive, apoptotic cells is slighly increased in cell cultures treated with sublethal amounts of AGEs and cytochrome c is released in the cytoplasma no activation of caspase-3 was found. AGE-induced stress leads to an imbalance in the cellular redox-status, recognizable by a shift in the GSH/GSSG ratio and a depletion of intracellular glutathione. This is accompanied by changes in the cells glucose metabolism and impairment of energy production. During the first hours of AGE-stress glucose uptake of the cells was increased. After this time point almost no further uptake of glucose from the medium was detectable but hight amounts of lactate were released. The ATP content of the cells was reduced up to 50 per cent. Administration of antioxidants together with or before administration of AGEs normalized ATP-levels as well as glucose uptake and lactate release. Interaction of AGEs with cells has been shown to cause oxidative stress, not only by receptor mediated pathways but also by production of free radicals by chemical oxidation and degradation of AGEs. This causes metabolic dysfunctions, energy depletion and impairment of the cells antioxidative defense. In the AD brain, this may lead to neurodegeneration and cell death, suggesting a role of AGEs in the pathogenesis of this disease. The results encourage the use of membrane permeable antioxidants in novel treatment strategies of AD. AGE-inhibitors may represent an interesting approach to slow down plaque formation. KW - Alzheimer-Krankheit KW - Nervenzelle KW - Zelltod KW - Proteinstoffwechsel KW - Advanced Glycation Endproducts KW - Alzheimer KW - oxidativer Stress KW - beta A4 KW - ATP KW - Antioxidantien KW - Zytotoxizität KW - RAGE KW - Apoptose KW - SH-SY5Y KW - Advanced glycation endproducts KW - Alzheimer KW - oxidative stress KW - beta A4 KW - ATP KW - antioxidants KW - cytotoxicity KW - RAGE KW - SH-SY5Y KW - apoptosis Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1707 ER - TY - THES A1 - Leimeister, Cornelia T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems T1 - Identification and characterization of genes involved in development of the kidney and the urogenital system N2 - Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung. N2 - Studies on kidney development provide insights into general processes of embryogenesis like inductive interactions, mesenchymal condensation, mesenchymal-epithelial interactions, cell fate determination as well as differentiation and thereby into the basis of congenital malformations. Once induced by the ureteric bud, the metanephrogenic mesenchyme gives rise to the functional units of the kidney - the nephrons - and the renal stroma. These morphogenetic processes rely on complex regulatory changes in gene expression, which to date are not understood in detail. The present thesis aimed to identify known and primarily novel genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Gene expression of induced versus uninduced mesenchyme from murine kidney anlagen was compared using ddPCR together with transfilter organ culture. Several candidates were assayed for differential expression by northern blot hybridization and selected for further characterization. As one of the known genes, sFRP2 was verified to be induced within the metanephrogenic mesenchyme. In situ hybridization of whole-mount mouse embryos and paraffin sections revealed specific and dynamic expression patterns for sFRP2 as well as for the related genes sFRP1 and sFRP4 in the developing kidney and other tissues. The detailed sFRP gene expression analysis was performed to guide functional studies for this recently identified novel gene family. Preliminary investigations of the ddPCR products C0-5, J6-3 and M2-4 revealed that they are all derived from novel genes with distinct expression patterns during kidney development. While C0-5 expression dynamically switches from the ureteric bud to the nephron precursors and the collecting system, J6-3 specifies the stromal cell lineage and M2-4 is already detectable in the condensing mesenchyme with subsequent expression in epithelial derivatives. Isolation and analysis of the C0-5 cDNA resulted in the identification of a collagen-like protein in mice and humans that is located upstream of the EWS gene of the human chromosome 22q12. Additionally, a novel gene family related to hairy and the E(spl)-complex genes has been identified. Because of this relationship and a characteristic YRPW tetrapeptide they were designated as Hey genes for "hairy and E(spl) related with YRPW motif". Compared to hairy/E(spl) or the mammalian Hes proteins they show novel features of DNA-binding and protein interaction. Moreover, their expression patterns frequently correlate with those of members of the Delta-Notch signaling pathway suggesting that Hey genes may participate in this pathway in cell fate decisions and boundary formation. Analysis of Dll1 knockout mice partly confirmed this assumption for Hey1 and Hey2 during somitogenesis. This screen has shown that transfilter organ culture in combination with ddPCR is a powerful tool to identify genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Expression and sequence analysis of the novel genes implies a function during development of the kidney and other tissues that can now be studied in further detail. The collection of more than 50 additional candidates for novel genes regulated during nephrogenesis provides a rich resource for future analysis of the networks governing kidney development KW - Niere KW - Entwicklung KW - Molekulargenetik KW - Niere KW - Urogenitalsystem KW - Differential Display PCR KW - Entwicklung KW - In situ Hybridisierung KW - Somitogenese KW - Neurogenese KW - Mesenchym KW - Maus KW - Delta KW - kidney KW - urogenital system KW - differential display PCR KW - development KW - in situ hybridization KW - somitogenesis KW - neurogenesis KW - mesenchyme KW - mouse Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690 ER - TY - THES A1 - Kuß, Andreas T1 - Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus T1 - Investigations concerning the CD40 induced expression of A1 in murine B lymphocytes N2 - Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung. N2 - Engagement of the antigen receptor on murine immature B lymphocytes leads to growth arrest followed by apoptosis. Concomitant signalling through CD40 rescues the cells from apoptosis and sustains proliferation. It is shown here, that in primary murine B cells crosslinking of CD40 stimulates the expression of A1, an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family. CD40 dependent stimulation of A1 was confirmed in WEHI 231 cells, an immature B cell lymphoma line. WEHI 231 cells were transduced with A1 and a chimeric selection marker comprising the enhanced yellow fluorescent protein and the zeocin resistance protein via recombinant replicationdefective retroviruses. Expression of A1 and marker proteins was coupled through an internal ribosomal entry site. A1 transduced WEHI 231 cells showed a significantly enhanced survival rate after engagement of the antigen receptor whereas constitutive expression of A1 did not abrogate c-myc downregulation and activity-loss of a NFkB-dependent luciferase reporter, both of which were induced by BCR-crosslinking. Expression of inducible cMyc-ER in A1 transduced cells did not restore proliferation in these populations. In contrast, upon induction cMyc-ER itself caused growth arrest and apoptosis of these cells despite the presence of A1. Studies of functional properties of A1 revealed that it was able to suppress BCR-induced degradation of the caspase substrate PARP as well as activation of Caspase 7. The generation of reactive oxigen species, a further consequence of BCR signalling, was also significantly reduced by A1. Taken together these result suggest that upstream of A1 the CD40 signal is divided into two major components, one of which is responsible for the upkeep of proliferation whereas the other secures cell survival. It seems that for the latter A1 is of major importance. KW - Apoptosis KW - B-Lymphozyt KW - Proteasen KW - CD40 KW - Bcl-2 KW - Unreife B-Zelle KW - Apoptose KW - Wachstumsstopp KW - Caspasen KW - CD40 KW - bcl-2 KW - Immature B cell KW - Apoptosis KW - Growth Arrest KW - Caspases Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669 ER - TY - THES A1 - Kühlkamp, Thomas T1 - Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern T1 - The plasma membrane associated transport modifier RS1binds ubiquitin und migrates into the nucleus N2 - Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist. N2 - This work discribes investigations about the subcellular distribution and function of the plasma membrane-associated protein RS1, an regulator of plasma membrane transporters like the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 or the organic cation transporter OCT2 (Vehyl et al., 1993; Reinhardt et al., 1999; Valentin et al., 2000). The green fluorescent protein (GFP) was fused to RS1 from pig (pRS1) and expressed in LLC-PK1 cells. The GFP-pRS1 protein could be detected at the plasma membrane, in the cytoplasma and in the nucleus. Expression of various truncated forms of GFP-pRS1 showed that the N-terminal half of pRS1 (amino acids 1-328) is not necessary for the migration of pRS1 into the nucleus. In contrast, truncations of the C-terminus inhibited translocation into the nucleus. The C-terminus of pRS1 contains a conserved ubiquitin associated domain (UBA) at amino acids 579 to 616. Affinity chromatography with ubiquitin-conjungated Sepharose beads showed a noncovalent binding of pRS1 to immobilized ubiquitin, which was abolished in the presence of an excess of free ubiquitin. Further analysis schowed that the C-terminal 111 amino acids were indispensable for ubiquitin binding. A conserved di-leucine signal (pRS1 336/337) is a well known endocytosis motif and points to an involvement of pRS1 in the internalisation of plasma membrane proteins. This hypothesis was supported by the finding of an increased uptake of the intercalating membrane dye RH 414 in a pRS1-overexpressing LLC-PK1 cell line. Based on this findings together with previous data, a model for the physiological role of RS1 was proposed. In this model, RS1 serves as an adaptor which links ubiquitinated plasma membrane transporters such as SGLT1 to the endocytosis machinery. Moreover RS1 migrates into the nucleus and is involved in the transcriptional suppression of SGLT1. KW - Ubiquitin KW - Carrier-Proteine KW - Plasmamembran KW - Zellkern KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - Ubiquitin KW - Plasmamembrane KW - Zellkern KW - Endocytose KW - RS1 KW - SGLT1 KW - UBA KW - ubiquitin KW - plasma membrane KW - nucleus KW - endocytosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179507 ER - TY - THES A1 - Kolb-Mäurer, Annette T1 - Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes T1 - Interaction of human dendritic cells with Listeria monocytogenes N2 - Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger. N2 - Dendritic cells (DC) activate naive CD4+ and CD8+ lymphocytes and are therefore critical for the initiation of an immune response against microorganisms. In this work the interaction between DC and L. monocytogenes was examined. Immature DC show a very efficient uptake of L. monocytogenes. Phagocytosis was much higher in the presence of human plasma than with plasma free media or media with fetal calf serum (FCS). However, the addition of immunoglobulins showed a concentration dependent increase in phagocytosis comparable with the addition of human plasma. Human plama contains antibodies against the listerial surface protein p60. By using a iap-deletion mutant it was shown that antibodies against p60 are the main opsonin for the uptake of L. monocytogenes into DC. Because no difference in the uptake of this deletion mutant in the presence or absence of human plasma was observed; antibodies against p60 appear to be resonsible for the efficient uptake of L. monocytogenes and other apathogenic Listeria strains. A major portion of internalized bacteria is found in membrane-bound phagosomes and rarely free in the cytosol. Most of the bacteria that were taken up by DC were killed very efficiently in the phagosome. Interestingly, infection with L. monocytogenes caused maturation of the immature DC into mature DC. This effect appeared to be largely mediated by listerial lipoteichoic acid. Although L. monocytogenes infection is known to induce death in other cell types, DC were relatively resistant and only 20 per cent of infected DC underwent cell death. Uptake, maturation and resistance to apoptosis suggest that DC are essentiel antigen presenting cell (APC) for L. monocytogenes immunity. Thus these observations into the interaction of L. monocytogenes with human DC provide an important into the pathogenesis of Listeria infection as well as providing a basis for Listeria-based vaccination strategies. KW - Mensch KW - Dendritische Zelle KW - Listeria monocytogenes KW - Dendritische Zelle KW - Listeria monocytogenens KW - Apoptose KW - dendritic cell KW - Listeria monocytogenes KW - apoptosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1638 ER - TY - THES A1 - Kohlert, Claudia T1 - Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer thymianhaltigen Zubereitung im Menschen T1 - Systemic availability and pharmacokinetics of thymol after oral application of a thyme containing preparation in humans N2 - Ätherische Öle bzw. Ätherisch-Öl Komponenten sind etabliert in der Therapie der chronischen und akuten Bronchitis. Eine klinische Studie, die mit Thymianextrakt durchgeführt wurde, ließ auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis schließen. Zahlreiche pharmakodynamische Effekte konnten in vitro für Thymianextrakt bzw. das ätherische Thymianöl gezeigt werden, jedoch wurde bis jetzt die systemische Verfügbarkeit der betreffenden Verbindungen am Zielorgan noch nicht untersucht. Diesbezügliche Untersuchungen sind notwendig, um die Verknüpfung zwischen den in vitro beobachteten Effekten und der klinischen Wirksamkeit herstellen zu können. Eine pharmakokinetische Studie wurde nach Einnahme einer Einzeldosis BronchipretTP (Filmtabletten mit 60 mg Primelwurzelextrakt und 160 mg Thymianextrakt) durchgeführt, um festzustellen, ob Thymol, das den Hauptbestandteil des ätherischen Thymianöls darstellt, zur Wirksamkeit dieser Zubereitung beitragen kann. Dazu wurde eine Extraktionsmethode für die Bestimmung von Thymol nach enzymatischer Spaltung des Phase-II-Konjugates Thymolsulfat im Plasma sowie von Thymolsulfat und Thymolglucuronid im Urin entwickelt. Es wurde eine neuartige, automatisierte headspace Festphasenmikroextraktionsmethode (HS-SPME) entwickelt, die Extraktion, Anreicherung und Probenaufgabe in einem einzigen Schritt ermöglichte. Die Quantifizierung von Thymol im unteren ng.mL-1 Bereich wurde durch die Verwendung von Gaschromatographie in Kombination mit Flammenionisationsdetektion durchgeführt. Die Automatisierung der Methode war notwendig um sie nach internationalen Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden validieren zu können. Dies ist das erste Mal, dass eine Bioverfügbarkeitsstudie bzw. eine pharmakokinetische Studie mit Hilfe der HS-SPME durchgeführt wurde. Thymol selbst war nicht systemisch verfügbar. Es war kein freies Thymol oberhalb von 1,4 ng/mL im Plasma detektierbar. Der systemisch verfügbare Phase-II-Metabolit wurde per LC-MS/MS als Thymolsulfat identifiziert. Thymolsulfat wurde nur im Plasma detektiert, wohingegen sowohl Thymolsulfat als auch Thymolglucuronid im Urin nachgewiesen wurden. Im Urin wurde kein freies Thyxmol oberhalb von 2,1 ng/mL detektiert. Da Thymol nur in Form von Thymolsulfat systemisch verfügbar war, wurde die pharmakokinetische Auswertung an Hand der sich nach enzymatischer Spaltung von Thymolsulfat ergebenden Daten vorgenommen. Die pharmakokinetische Studie wurde nach Verabreichung einer Einzeldosis BronchipretTP (1,08 mg Thymol) mit 12 Probanden durchgeführt. Die Resorption von Thymol war frühzeitig. Bereits nach 20 min konnte Thymol im hydrolisierten Plasma nachgewiesen werden. Maximale Plasmakonzentrationen (cmax) von 93,1±24,5 ng/mL (MW±SD) wurden nach 1,97±0,77 h (tmax) (MW±SD) erreicht. Die Plasmakonzentrationen zeigten einen biphasischen Verlauf und die terminale Eliminationphase setzte nach ca. 10 h ein. Die Eliminationshalbwertszeit errechnete sich zu 10,2 h. Dies betont die Wichtigkeit entsprechend langer Meßzeiträume in Verbindung mit einer hoch sensitiven Analytik, um die Elimination vollständig erfassen zu können. Bezogen auf die verabreichte Thymoldosis (1,08 mg) wurden 16,2±4,5 Prozent (MW±SD) mit unverändertem Thymolgrundgerüst renal eliminiert. Die renale Clearance von 271±156 mL/h (MW±SD) indiziert eine hohe Plasmaeiweißbindung und/oder tubuläre Reabsorption. Die Daten deuten darauf hin, dass die klinische Wirksamkeit nach Applikation einer thymianextrakthaltigen Zubereitung auf Thymolsulfat oder mögliche Phase-I-Metabolite zurückzuführen sein könnte. Die pharmakodynamischen Effekte dieser Verbindungen wurden bislang noch nicht untersucht. Andererseits könnte die Aktivität von Sulfatasen im Lungengewebe die pulmonale Elimination von Thymol erklären. Freies Thymol könnte somit am Respirationstrakt wirksam sein, obwohl es im Plasma nicht detektiert wurde. N2 - Essential oil compounds are established for the therapy of chronic and acute bronchitis. A clinical trial with a preparation containing thyme extract has suggested clinical efficacy for acute bronchitis. Various pharmacodynamic effects have been demonstrated in vitro for thyme extract and the essential thyme oil, respectively, but systemic availability of these compounds in the respective target organs has not been proven yet. Such investigations are necessary to provide the link between in vitro effects and in vivo studies. A pharmacokinetic study following a single dose of BronchipretTP tablets (60 mg primrose extract and 160 mg thyme extract) was performed to determine whether thymol, which is the main compound in the essential oil of thyme, might contribute to the efficacy of this formulation containing thyme extract. Therefore an extraction method for the analysis of thymol after enzymatic cleavage of the phase II conjugates thymol sulfate in plasma as well as thymol sulfate and thymol glucuronide in urine was developed. A novel automated headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) method was developed, which provided extraction, concentration and sampling in a single step. Quantification of thymol was consequently achieved at the lower ng×mL-1 level using gas chromatography combined with flame ionization detection. Automation of the method was necessary to test the method according to international guidelines for validation of bioanalytical procedures. This is the first time that HS-SPME has been used for a bioavailability or pharmacokinetic study. Thymol itself was not systemically available because no free thymol could be detected in plasma above 1.4 ng/mL. The systemically available phase II metabolite was identified as thymol sulfate by HPLC-MS/MS. Thymol sulfate was identified in plasma whereas both thymol sulfate and thymol glucuronide were detected in urine. No free thymol was detected in urine above a limit of quantification of 2.1 ng/mL. As thymol was systemically available only in the form of thymol sulfate, pharmacokinetic analysis of the data was carried out based on the data obtained after enzymatic cleavage of thymol sulfate. The pharmacokinetic study comprised a single-dose study with 12 healthy volunteers (1 tablet BronchipretTP equivalent to 1.08 mg thymol). Absorption of thymol was rapid after administration of a single dose of BronchipretTP tablets. Thymol could be detected in hydrolyzed plasma 20 min after application. Maximum plasma levels (cmax) of 93.1±24.5 ng/mL(mean±SD) were reached after 1.97±0.77 h (tmax) (mean±SD). Plasma concentrations showed a biphasic profile and the terminal elimination phase set in after about 10 h and continued up to 38 h. The terminal elimination half life was calculated to be 10.2 h. This stresses the importance of long sampling periods in combination with highly sensitive analytical tools to adequately follow the elimination profile. With regard to the applied thymol dose (1.08 mg) the renally eliminated amount of thymol with unchanged thymol base structure was 16.2±4.5 per cent (mean±SD). The renal clearance of 271±156 mL/h (mean±SD) indicates high protein binding and/or tubular reabsorption. The data indicate that the pharmacological effect observed in vivo after application of preparations containing thyme extract could be due to thymol sulfate or putative phase I metabolites. However, the pharmacodynamic effects of these compounds have not been investigated yet. Also the activities of sulfatases in lung tissue could explain the observed pulmonary elimination of thymol. Free thymol could therefore be effective at the respiratory system, although it was not detected in plasma. KW - Mensch KW - Thymian KW - Etherisches Öl KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmakokinetik KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmakokinetik KW - Thymian KW - Thymol KW - BronchipretTP KW - Festphasenmikroextraktion KW - Plasma KW - Urin KW - Bioavailability KW - Pharmacokinetics KW - Thyme KW - Thymol KW - BronchipretTP KW - Solid-phase microextraction KW - Plasma KW - Urine Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1621 ER - TY - THES A1 - König, Jochen T1 - Tex aus Bordetella pertussis definiert eine neue Familie von Nukleinsäure-Bindeproteinen N2 - Das Tex Protein aus Bordetella pertussis definiert eine neue Familie hoch konservierter Proteine in Eubakterien. Ursprünglich wurde das tex Gen aufgrund seines Einflusses auf die Toxinexpression in bestimmten regulatorischen Mutanten von B. pertussis gefunden (Fuchs et al. (1996), J Bacteriol 178, 4445-52). Wie hier gezeigt wird, sind Leserahmen für entsprechende Proteine bei den Eubakterien ubiquitär und mehrheitlich zu über 69 Prozent konserviert. Eine Ausnahme bilden einige wenige Taxa mit bekanntermaßen reduzierten Genomen, bei denen das Gen wahrscheinlich verloren gegangen ist, wie zum Beispiel verschiedene Mycoplasma spp. oder der obligate Blattlaus- (Aphiden-) Symbiont Buchnera aphidicola. In Eukaryonten und Archaeen konnte ein zu tex homologes Gen bisher nicht gefunden werden. Die Funktion von Tex in der Bakterienzelle ist unklar. Während das Gen in B. pertussis essenziell ist und auch nicht überexprimiert werden kann, sind Deletionsmutanten in Neisseria meningitidis und Escherichia coli phänotypisch nicht von den entsprechenden Wildtypen unterscheidbar. Ausgiebige Wachstumsstudien mit einer E. coli tex-Mutante unter verschiedenen Wachstums- und Stressbedingungen ergaben ebenfalls keinen Hinweis auf eine Bedeutung von Tex, die die außerordentliche Konservierung des Proteins erklären könnte. Das Protein zeigt in seinem N-Terminus ausgeprägte Ähnlichkeit mit dem Mannitol-Repressor (MtlR) von Escherichia coli und besitzt eine C-terminale S1-Domäne. Da die meisten der Proteine mit S1-Domänen als RNA-bindende Proteine gelten, wurde die Fähigkeit von Tex untersucht, mit Nukleinsäuren zu interagieren. In Festphasen-Bindeassays mit an Magnetkügelchen immobilisiertem Tex Protein aus E. coli konnte eine spezifische Bindung an RNA-Gesamtpräparationen gezeigt werden. DNA wurde hingegen nicht gebunden. Durch Verkürzung des N-Terminus geht die präferenzielle Bindung an RNA jedoch verloren und die Bindung von DNA erfolgt mit der gleichen Effizienz wie die von RNA. Festphasen-Bindeassays wurden weiterhin dazu benutzt, mögliche spezifische Interaktionspartner von Tex aus RNA-Gesamtpräparationen zu finden. Tatsächlich konnten über diesen Ansatz die regulatorische RNA CsrB und die ribosomale 16S RNA als spezifische Liganden isoliert werden. Über die biologische Relevanz dieser Interaktion kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt allerdings noch keine Aussage gemacht werden. N2 - The Bordetella pertussis Tex protein defines a new family of highly conserved eubacterial proteins. The tex gene was originally found due to its negative influence on toxin expression when over-expressed slightly in certain regulatory mutants of B. pertussis (Fuchs et al. (1996), J Bacteriol 178, 4445-52). As shown in this work apparently homologous reading frames are ubiquitous within the Eubacteria. The majority of these mostly putative proteins are more than 69 per cent conserved. Only some of the genomes of some obligate intracellular pathogens, e. g. various Mycoplasma ssp., or the aphid symbiont Buchnera aphidicola known for their reduced gene numbers were found to lack a tex gene and probably have lost it during phylogeny. The actual function of Tex within the bacterial cell is as yet mysterious as the gene can neither be deleted nor can it be highly over-expressed in B. pertussis. However, deletion mutants in Neisseria gonorrhoeae and Escherichia coli do not show any phenotype different to the respective wild type. Extensive growth studies on an E. coli tex-mutant did not reveal any clue to the reason for the extraordinary conservation of the protein. The N-terminus of Tex shows extensive similarity to the mannitol repressor (MtlR) of E. coli whereas the C-terminus contains an S1 domain. Because most S1 domain containing proteins have been shown to bind RNA, the capacity of Tex to interact with nucleic acids was investigated. In solid phase binding assays with purified Tex protein from E. coli immobilized to magnetic beads the protein showed specific binding of RNA but not DNA. NÓterminal deletions of different length abolished this preference for RNA and both types of nucleic acid bound equally well. Again a solid phase binding assay was used to enrich for specific ligands of Tex from total cellular RNA preparations. This approach identified the regulatory CsrB RNA and ribosomal 16S RNA as preferential binding targets. However, it is not yet possible to comment on the biological relevance of these findings. KW - Bordetella pertussis KW - Nucleinsäuren KW - Bindeproteine KW - tex KW - Bordetella pertussis KW - Bindeprotein Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1601 ER - TY - THES A1 - Köhler, Rolf T1 - Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins T1 - Development of a GFP-Reportersystems in Legionella and molecular analysis of the Legionella Mip-protein N2 - Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist. N2 - The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms. KW - Legionella pneumophila KW - Bakterielle Infektion KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - In vivo KW - Legionella pneumophila KW - GFP-Reportergen KW - in vivo Monitoring KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - FACS-Analyse KW - MIP KW - PPIasen KW - Dimerisierung KW - Legionella pneumophila KW - GFP-reportersystem KW - in vivo monitoring KW - fluorescence microscopy KW - FACS-analysis KW - Mip KW - PPIases KW - dimerization Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594 ER - TY - THES A1 - Knörr, Constanze Helga T1 - Untersuchungen zu den Mechanismen in der Entwicklung maligner B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ T1 - Mechanisms in the development of low-grade B-cell lymphomas of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT)-type N2 - B-Zell-Lymphome des mukosaassoziierten lymphatischen Gewebes (MALT) entwickeln sich außerhalb des primären lymphatischen Gewebes und entstehen hauptsächlich im Magen aufgrund einer H. pylori-assoziierten chronischen Entzündung. Vorangegangene immunhisto-chemische und funktionelle Untersuchungen zeigten, daß die Tumorzellen phänotypisch Gedächtnis-B-Zellen entsprechen und Antigenrezeptoren auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. In der vorliegenden Arbeit konnten mit Hilfe von molekulargenetischen Antigenrezeptor-analysen die Tumorzellpopulationen identifiziert und charakterisiert werden. Dabei wurde deutlich, daß sowohl mono- als auch biklonale B-Zell-Lymphome existieren. Im Vergleich zu neueren veröffentlichten Daten von MALT-Typ Lymphomen aus der Speicheldrüse, konnte jedoch bei den hier untersuchten gastralen Tumoren keine VH-Gen-restriktion nachgewiesen werden. Die tumorspezifischen VH-Mutationsanalysen zeigten, daß es sich bei den Tumor-B-Zellen auch genotypisch um Gedächtnis-B-Zellen handelt, die jedoch offensichtlich unter-schiedlich lange dem Mechanismus der Keimzentrumsmaturation ausgesetzt worden waren. Zudem konnte bei mono- und biklonale Lymphomen, im Gegensatz zu Fällen mit poly-klonalem Entzündungsinfiltrat die Translokation t(11;18)(q21;q21) nachgewiesen werden. Ausgehend von der Tatsache, daß die Tumorprogression dieser B-Zell-Lymphome anfangs noch abhängig von dem lokal vorhandenen Mikromilieu zu sein scheint, wurden die tumorinfiltrierenden T-Zellen (TITL) genauer charakterisiert. Es wurden überwiegend CD4+ TITLs nachgewiesen, die sowohl aktiviert (C69+) als auch immunkompetent (CD28+) waren und die für T/B-Zell-Kooperationen essentiellen Moleküle wie CD40-Ligand und Fas-Ligand exprimierten. Zudem konnten im Tumorgewebe vor allem TH2/3-Typ Cytokine (IL10, IL13, TGFb1) nachgewiesen werden, die ebenfalls das Tumorwachstum in vitro positiv beeinflussen können. Um in Zukunft spezifischere Untersuchungen zu den Wechselwirkungen zwischen Tumor-B-Zellen und TITLs durchführen zu können, wurde abschließend ein Zellkultursystem ent-wickelt, mit dessen Hilfe es möglich sein wird das Tumormikromilieu in vitro spezifisch zu simulieren, um so das Verhalten der Tumor-B-Zellen auch ex vivo beobachten und analysieren zu können. Die Daten dieser Arbeit geben einen vertieften und verbesserten Einblick in die tumorspezifischen Mechanismen und ermöglichen den Entwurf eines neuen detaillierteren Mo-dells zur Tumorentstehung und -progression von niedrig-maligne MALT-Typ Lymphomen. N2 - B-cell lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) arise in sites primarily devoid of lymphoid tissue, preferentially in the stomach preceded by a chronic inflammation associated with H. pylori infection. Previous studies suggested that the tumor cells are the malignant counterpart of memory B-cells and express functional antigen receptors on their cell surfaces with autoantigenic reactivity. In the present work the molecular structure of the tumor antigen receptor was described more detailed in several cases of gastric MALT-type lymphomas and compared with recently published data from normal B-cells and different tumor entities. These findings clearly showed the existence of mono- as well as biclonal B-cell lymphomas. However, in contrast to recent molecular data derived from salivary gland MALT-type lymphomas, no VH-gene restriction was found. The tumorspecific VH-gene analyses confirmed the memory B-cell phenotype of the tumor cells at the DNA level. Furthermore, it is likely that the tumor B-cells passed several rounds of maturation cycles in the germinal centres because of their mutation pattern in the hypervariable region of the antigen receptor. By comparing clonality of the tumors it became obvious that those lymphomas showing the t(11;18)(q21;q21) translocation were directed towards (mono-)clonality. Therefore this translocation appears to represent a major progression event in tumor establishment. Because at least low-grade MALT-type B-cell lymphoma growth is depended on the local microenvironment, the tumorinfiltrating T-lymphocytes (TITL) were investigated in detail. In the tumor tissue CD4+ TITLs were found predominantly which were activated (CD69+) as well as immuncompetent (CD28+) and express CD40-Ligand and Fas-Ligand, two molecules which play a keyrole in T/B-cell interactions in germinal centre reaction. In addition, TH2/3 cytokines (IL10, IL13, TGFb1) were detected in the tumor tissue. These cytokines were shown to stimulate the tumor growth in vitro. Therefore it will be mandatory to engage CD40-Ligand and FAS-Ligand simultaneously for further detailed investigations of early steps of tumor development. An in vitro system will offer the possibility to investigate and analyse the behaviour of tumor B-cells ex vivo and compare t(11;18) positive and negative cases and thus lead to a biological based model of tumor-development and -progression of low-grade MALT-type lymphomas. KW - MALT KW - B-Zell-Lymphom KW - Carcinogenese KW - Molekularbiologie KW - MALT-Typ Lymphom KW - VH-Mutationsanalysen KW - T/B-Zellinteraktion KW - Keimzentrumsreaktion KW - Marginalzone KW - TITL KW - t(11;18)(q21;q21) KW - TH2-Typ Cytokine KW - MALT-type lymphoma KW - VH-mutations KW - T/B-cell-interaction KW - germinal centre KW - marginal zone KW - TITL KW - t(11;18)(q21;q21) KW - TH2-type cytokine Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1586 ER - TY - THES A1 - Knödel, Matthias T1 - Regulation der terminalen B-Zell-Differenzierung durch Blimp-1 T1 - Regulation of B cell terminal differentiation by Blimp-1 N2 - Nach Aktivierung differenzieren B-Zellen entweder direkt zu IgM sezernierenden Plasmazellen oder treten in den Differenzierungsweg zur Gedächtniszelle ein, der sowohl durch die Affinitätsreifung als auch den Klassensprung zu sekundären Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet ist. Welchen Weg die B-Zelle durchläuft, ist abhängig von der Intensität und der Dauer des BZR-Signals, von der Verfügbarkeit und der Art der T-Zell-Hilfe und von weiteren Signalen in der speziellen Mikroumgebung des Keimzentrums. Der Transkriptionsfaktor Blimp-1 ("B lymphocyte induced maturation protein 1") wird als ein „Mastergen“ der terminalen B-Zell-Differenzierung betrachtet und ist in der Lage, die komplexen Differenzierungsprozesse zu Ig-sezernierenden Plasmazellen auszulösen und voranzutreiben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren Blimp-1 als wichtigen Regulator, der bestimmt, ob eine B-Zelle zur Plasmazelle oder zur Gedächtniszelle differenziert. Unter Verwendung ruhender, primärer B-Zellen der Maus, die in vitro mit Interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 oder anti-CD40 in verschiedenen Kombinationen sowohl in An- als auch in Abwesenheit von LPS stimuliert wurden, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die IgM-Sekretion und die Expression von Blimp-1 durch Signalgebung über den BZR oder CD40 und durch IL-4 entweder nicht induziert oder sogar unterdrückt wird. Die Zugabe von IL-2 und IL-5 induziert die Expression von Blimp-1 und erleichtert die Sekretion von IgM und IgG1 in diesem System. Gleiches kann durch direkte Transduktion der B-Zellen mit rekombinanten Retroviren erreicht werden, die für Blimp-1 codieren. Auf der anderen Seite wird der durch IL-4 induzierte Klassensprung nach IgG1 durch Blimp-1 gehemmt. Blimp-1 bewirkt daher ein Umschalten des B-Zell-Differenzierungsweges von der Gedächtniszelle zur Plasmazelle. Die Unterdrückung der Expression von Blimp-1 sowohl durch Antigen-BZR-Wechselwirkungen als auch durch die von T-Helferzellen abhängige Signalgebung über CD40 und IL-4 unterdrückt die terminale Differenzierung zur Plasmazelle und ist für den Eintritt und das Durchlaufen des Gedächtniszell-Differenzierungsweges notwendig. Zur Identifikation von Genen, deren Expression durch Blimp-1 direkt oder indirekt beeinflusst wird, wurde Blimp-1 in WEHI 231 B-Lymphomzellen unter Verwendung rekombinanter Retroviren überexprimiert. Messika et al. zeigten, dass die Überexpression von Blimp-1 in B-Lymphomzellen in Abhängigkeit vom Reifungsstadium der Zelle entweder einen Wachstumsnachteil, gefolgt vom Zelltod, induziert oder zur terminalen Differenzierung führt. Obwohl WEHI 231 Zellen unreife, d.h. sIgM+ B-Zellen repräsentieren, exprimieren Blimp-1 transduzierte WEHI 231 Zellen die J-Kette, zeigen eine erhöhte Konzentration der für die sekretorische Form der my-Kette codierenden mRNA, exprimieren den Plasmazellmarker Syndecan-1 auf ihrer Oberfläche und sezernieren für kurze Zeit IgM. Diese Differenzierungsprozesse gehen allerdings mit einem Wachstumsnachteil und Zellzyklus-Arrest, gefolgt vom Zelltod, einher. Blimp-1 exprimierende WEHI 231 Zellen zeigen somit den Phänotyp kurzlebiger Plasmazellen. Eine Langzeitkultur Blimp-1+ WEHI 231 Zellen führt zum Verlust des differenzierten Phänotyps, d.h der Erhalt IgM-sezernierender WEHI 231 Zellen ist nicht ohne weitere Maßnahmen möglich. Auf molekularer Ebene hemmt Blimp-1 die Expression von c-myc und diejenige des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1, stimuliert aber die Expression von mad4. Die Verschiebung des Verhältnisses von Myc/Max- zu Mad/Max-Heterodimeren zugunsten von Mad/Max-Komplexen und die daraus resultierende Inhibition der Transkription von Myc-abhängigen, proiliferationsfördernden Genen ist in vielen Systemen als von zentraler Bedeutung für die Initiation von Differenzierungsprozessen beschrieben und wurde auch bereits für B-Zellen diskutiert. Auch in primären B-Zellen führt Blimp-1 zu einer verstärkten Expression von mad4. Wird der durch Blimp-1 bewirkte Verlust der Expression von A1 durch dessen Überexpression in Blimp-1+ WEHI 231 Zellen kompensiert, so überleben diese Zellen wieder erheblich länger, bleiben aber weiterhin im Zellzyklus arretiert. Der differenzierte Phänotyp, charakterisiert durch die verstärkte Expression von mad4 und der Sekretion von IgM, wird dabei aufrechterhalten. Wachstumsnachteil und Zelltod können in diesem System daher entkoppelt werden. In primären Zellen führt Blimp-1 ebenfalls zur Erniedrigung der A1 Expression. Da diese Zellen aber nicht in dem Maße wie WEHI 231 Zellen absterben, kann der Verlust von A1 offensichtlich besser kompensiert werden. Die Lebensdauer einer Blimp-1+ Plasmazelle ist somit durch Manipulation der Expression von antiapoptotischen Molekülen wie A1 verlängerbar. N2 - Blimp-1 (“B lymphocyte-induced maturation protein 1”) is a zinc-finger containing transcription factor that drives B-cell terminal differentiation to immunoglobulin-secreting plasma cells. Following stimulation, primary B cells either directly undergo terminal differentiation to IgM secreting plasma cells, thus providing a rapidly established source of neutralizing antibodies, or enter the memory pathway characterized by affinity maturation and isotype switching. Which of the various fates is adopted by the B cells is determined by the strength and the duration of the BCR-signal, the availability and the quality of T cell help and other signals derived from the microenvironment of the germinal center. High rate secretion is correlated with endogenous Blimp-1 levels and can be caused by ectopic expression of Blimp-1, suggesting that Blimp-1 is a master gene which is able to initiate and maintain the complex terminal differentiation program. Using cultures of resting primary mouse B cells stimulated in vitro in various combinations with interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 or anti-CD40 in the absence or presence of LPS, it is shown that IgM secretion and the expression of Blimp-1 is either not induced or even suppressed by BCR or CD40 ligation and by IL-4. Additional treatment with IL-2 and IL-5 induces Blimp-1 expression and facilitates IgM and IgG1 secretion, which can also be achieved by retroviral transduction of Blimp-1. In contrast, the increase in sIgG1+ cells with time in presence of IL-4 is greatly diminished in cells forced to express Blimp-1, suggesting that Blimp-1 inhibits further class-switching. Therefore, Blimp-1 expression takes B cells out of the memory pathway and initiates the terminal differentiation program. On the other hand, suppression of Blimp-1 by antigen-BCR interaction and T helper cell dependent CD40 and IL-4 signalling is necessary to facilitate entrance into the memory pathway and to prevent terminal differentiation. To identify genes whose expression is influenced by Blimp-1, WEHI 231 B lymphoma cells were retrovirally transduced with Blimp-1. Overexpression of Blimp-1 in B lymphoma cells has been reported to induce either growth arrest and cell death or immunoglobulin secretion and terminal differentiation, depending on the developmental stage of the recipient lymphomas. Surprisingly, Blimp-1 transduced immature WEHI 231 cells produce J chain, increased levels of the secretory form of my heavy chain mRNA, express the plasma cell marker syndecan-1 on their surface and secrete IgM for a short period of time. Concomitantly, they exhibit a distinct growth disadvantage with cell cycle arrest, followed by cell death. Thus, Blimp-1+ WEHI 231 cells aquire the phenotype of short-lived plasma cells. However, this differentiated phenotype of Blimp-1+ WEHI 231 cells was transient and not longer observed after long term culture. On the molecular level, Blimp-1 transduced WEHI 231 cells exhibit altered ratios of c-myc/mad4 mRNA levels and a reduction in the expression of the anti-apoptotic bcl-2 family member A1. It is known from several experimental systems that induction of transcripts of the mad family and therefore a change in favor of mad/max rather than myc/max complexes favors differentiation over proliferation. An important role for the myc/max/mad network in B cell proliferation, differen-tiation and apoptosis has recently been discussed by Melchers. The upregulation of mad4 expression by Blimp-1 is also observed in primary B cells. To determine whether A1 downregulation is causally involved in the short live span of Blimp-1+ WEHI 231 cells, sublines overexpressing A1 were established by retroviral transduction. Additional ectopic expression of A1 greatly extends the life span of Blimp-1 expressing WEHI 231 cells but does not overcome their block in cell cycle transition. Therefore, the proliferative disadvantage of Blimp-1 transduced cells can be separated from cell death in this system. A1+ Blimp-1+ WEHI 231 cells still show the differentiated phenotype characterized by IgM secretion and increased mad4 expression. In primary B cells, Blimp-1 also leads to a decrease in the expression of A1. However, the loss of A1 can be compensated in primary B cells since Blimp-1 expression does not lead to a comparable cell death as observed in WEHI 231 cells. These data suggest that levels of A1 and other anti-apoptotic molecules may determine the checkpoint between death and survival of Blimp-1 expressing B cells. KW - B-Lymphozyt KW - Zelldifferenzierung KW - Genregulation KW - Blimp-1 KW - B-Zellen KW - terminale Differenzierung KW - A1 KW - WEHI 231 KW - retroviraler Gentransfer KW - IL-4 KW - CD40 KW - Plasmazellen KW - Gedächtniszellen KW - Blimp-1 KW - B cells KW - terminal differentiation KW - A1 KW - WEHI 231 KW - retroviral gene transfer KW - IL-4 KW - CD40 KW - plasma cells KW - memory cells Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1571 ER - TY - THES A1 - Klagge, Ingo M. T1 - Interaktion von Masernviren mit humanen Dendritischen Zellen T1 - Interaction of Measles Virus with human Dendritic Cells N2 - Das Masernvirus ist ein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae. Obwohl eine wirksame attenuierte Lebendvakzine erhältlich ist, bleiben Masern eine bedeutende virale Infektionserkrankung, die jährlich ca. eine Millionen Opfer fordert. Trotz einer während der Infektion induzierten protektiven und MV-spezifischen Immunantwort, ruft MV eine generelle Immunsuppression hervor, die zu einer Störung der zellulären Immunantwort führt. Diese Immunsuppression begünstigt bakterielle und virale Superinfektionen, was vor allem in unterentwickelten Ländern begleitet von mangelhafter ärztlicher Versorgung und Unternährung zu einem fatalen Ausgang einer MV-Infektion führt. Die molekularen Grundlagen der MV-assoziierten Immunsuppression sind noch nicht ausreichend verstanden. Dendritische Zellen (DC) gelten als ein Bindeglied zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Sie sind entscheidend an der Auslösung einer primären, adaptiven T-Zellantwort beteiligt und könnten im Falle einer MV-Infektion somit sowohl eine Rolle in der Induktion der protektiven Immunantwort als auch in der Etablierung der MV-assoziierten Immunsuppression spielen. Tatsächlich sind DC, die in vitro aus humanen Monozyten des peripheren Bluts (MoDC) generiert wurden, durch MV-Stämme infizierbar. Dabei zeigten sogenannte Wildtypstämme im Vergleich mit Vakzinestämmen eine schnellere Inektionskinetik einhergehend mit einem stärkeren zytopathischen Effekt (CPE) in den MoDC-Kulturen. Zudem konnte festgestellt werden, dass eine Infektion der MoDC-Kulturen zu einer Aktivierung und Ausreifung der Zellen führte, wobei es zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kam. Neben Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a) konnte Typ I-Interferon (IFN) nachgewiesen werden, das die Expression des kostimulatorischen Oberflächenmoleküls CD86 induzierte. MV-Infektionen beeinflussten zudem die Sekretion von Interleukin 12 (IL-12), das als ein Schlüsselzytokin für die Polarisierung von T-Zellantworten angesehen wird. Infektionen mit einem prototypischen MV-Vakzinestamm (ED-B) führten unter allen Stimulationsbedingungen zu einer Hemmung oder deutlichen Reduktion der sezernierten Mengen IL-12. Eine Infektion mit dem Wildtypstamm WTF hingegen induzierte bereits ohne weitere Stimulation der MoDC IL-12 und verstärkte die Sekretion an IL-12 nach Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS). Trotz der zu beobachtenden Aktivierung der MoDC nach Infektion mit MV zeigten diese MoDC-Kulturen in einem funktionellen Test, einer allogenen mixed leukocyte reaction (MLR), keine Stimulation der T-Zellproliferation. Es zeigte sich, dass das Ausbleiben der T-Zellproliferation mit der Zahl an MV-infizierten MoDC korrelierte. MV-infizierte MoDC-Kulturen hemmten zudem die Proliferation von T-Zellkulturen, die mit Phytohämagglutinin (PHA) oder mit Staphylococcusenterotoxin A (SEA) aktiviert worden waren. Diese dominant hemmende Wirkung MV-infizierter MoDC-Kulturen unterblieb, wenn rekombinante MV eingesetzt wurden, denen die MV-spezifischen Glykoproteine H und F fehlten. N2 - Measles virus (MV) is a member of the paramyxoviridae. Despite the existence of a effective attenuated life vaccine measles still remains a important infectious disease which causes the death of over one million people each year. Although a protective and MV-specific immune response is generated during the infection MV induces a profound general immunosuppression disturbing the cellular immune system. This immunosuppression favours bacterial and viral secondary infections which especially in developing countries when accompanied by insufficient medical care and malnutrition leads to a fatal outcome of MV infections. The molecular basis underlying this MV-associated immunosuppression is hardly understood. Dendritic cells (DC) are now seen as a link between the innate and the adaptive immune system. They are decisively involved in the induction of a primary adaptive T cell response. In the case of MV infection DC might play a role both in establishing a MV specific and protective immune response and in inducing the MV-associated immunosuppression.. Indeed, DC generated in vitro using human monocytes from peripheral blood (MoDC) can be infected with MV strains. Compared with vaccine strains so called wildtype strains showed faster infection kinetics and a more pronounced cytopathic effect (CPE) in infected MoDC cultures. Additionally, infection of MoDC cultures led to activation and maturation of the cells resulting in upregulation of costimulatory molecules and secretion of proinflammatory cytokines. Besides tumour necrosis factor alpha (TNF-a) type I interferon (IFN) could be found which induced the expression of the costimulatory surface molecule CD86. Furthermore, MV infection influenced the secretion of interleukin 12 (IL-12) which is recognised as being a key regulator in the polarisation of T cell responses. Infections with the prototypic vaccine strain ED-B resulted in a drastic reduction or repression of the amount of IL-12 released under all conditions tested. Instead, a infection with the MV wildtype strain WTF induced IL-12 secretion by MoDC without additional stimulation and enhanced the secretion of IL-12 after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). In spite of the observed activation of MoDC after infection with MV in a functional assay, the allogenic mixed leukocyte reaction (MLR), these cultures induced no T cell proliferation. The lack of T cell proliferation correlated with the number of MV-infected MoDC. In addition, MV-infected MoDC cultures blocked the proliferation of T cell cultures stimulated with phytohemagglutinin (PHA) or staphylococcus enterotoxin A (SEA). This dominant inhibitory effect was absent when MoDC cultures were infected with recombinant MV lacking the MV specific glycoproteins H and F. KW - Dendritische Zelle KW - Masernvirus KW - Masernvirus KW - Dendritische Zellen KW - Immunsuppression KW - IL-12 KW - MLR KW - Glykoproteine KW - measles virus KW - dendritic cells KW - immunosuppression KW - IL-12 KW - MLR KW - glycoproteins Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180982 ER - TY - THES A1 - Kemmer, Gabriele T1 - Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae T1 - Characterization of the initial uptake of the cofactor V (NAD) in Haemophilus influenzae N2 - H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien für Hämin unter aeroben Bedingungen und für Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es können zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten Stämme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren Stämme, die für Oberflächeninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig über die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des Häminaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der Hämin-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) für die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht fähig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, während die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu klären, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig für die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivität. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivität die einzige für die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminosäureaustausch die Phosphatase-Aktivität verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Phänotypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die Fähigkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Phänotypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die fähig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivität nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN für die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht fähig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschränkt, während mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR über einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der äußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren. N2 - H. influenzae is a facultativ anaerobic, Gram-negative bacterium and belongs to the familiy of Pasteurellaceae. This bacterium shows auxotrophies for hemin under aerobic conditions and for nicotinamid adenine dinucleotide (NAD) at aerobic and anaerobic growth. Two subspecies are distinguishable: the encapsulated strains, the causative agents for systemic and invasive diseases and the unencapsulated or nontypeable strains, responsible for inflammation of the respiratory tract. In H. influenzae little is known about the utilization of NAD, therefore this work was aimed to identify and characterize gene products which are involved in the uptake of NAD. The outer membrane protein e(P4), encoded by the gene hel, was described as a component of the hemin uptake system. In this work a hel deletion mutant was constructed to proof that the acid phosphatase e(P4) is not involved in the uptake of hemin but in the uptake of NAD. With the aid of different phosphatase assays and the maleic enzyme assay NADP and NMN could be identified as the physiological relevant substrates. The biological relevance of e(P4) was proofed by mutant analysis in growth tests and transport assays. It was shown that the hel deletion mutant had a significant growth deficiency with NAD and NMN and was not able to take up both nicotinamide nucleotide sources, whereas the utilization of nicotinamide ribosyl (NR) showed no difference compared to the wildtype. To address the question, wether the localization of the lipoprotein e(P4) at the outer membrane is important for the hydrolysis of NMN, two mutants were constructed which had a Cystein-Glycin replacement in the lipid anchor of the hel gene to express the protein in the periplasm. The periplasm extracts of these Cystein mutants showed no activity in phosphatase assays. To investigate wether the phosphatase acitivty of e(P4) is the only relevant function for the uptake of NAD, phosphatase mutants were constructed and characterized. They expressed a mutated e(P4) protein which had lost the phosphatase activity by an amino acid replacement. The phenotypes of the phosphatase mutants correlated exactly with the phenotype of the deletion mutant concerning the ability to cleave NMN, to take up NAD and NMN and to use them as factor V sources. The periplasmic protein NadN was described as a pyrophosphatase which is able to hydrolase NAD to NMN. Further a 5´-nucleotidase function was identified enabling NadN to dephosphorylate NMN to NR. The relevance of NadN for the utilization of NAD was investigated with a nadN knockout mutant. Growth curves and transport assays revealed that the nadN mutant was not able to take up NAD and to use it for growth. The utilization of NMN was reduced, whereas the utilization of NR showed no difference compared to the wildtype. By characterizing a hel nadN double mutant it was shown that no further enzymes than e(P4) and NadN are involved in the processing of NAD to NR and that only NR is taken up into the cytoplasm through a putativ transporter. The protein OmpP2 is the major porin of the outer membrane. Growth curves and transport assays with an ompP2 deletion mutant revealed that NAD, NMN and NR diffuse through this porin into the periplasm. KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Pyrophosphatase KW - 5`-Nukleotidase KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - pyrophosphatase KW - 5`-nucleotidase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548 ER - TY - THES A1 - Jármy, Gergely T1 - Herstellung und Anwendungen eines replikationsinkompetenten lentiviralen Vektorsystems N2 - Aufgrund ihrer Charakteristika stellen die Lentiviren besonders gut geeignete Vektoren für den Gentransfer in eukaryotische Zellen dar. Lentivirale Vektoren sind in der Lage ruhende und sich nicht teilende Zellen zu infizieren und ihr genetisches Material in das Zielzellgenom zu integrieren. Dies führt zu einer stabilen Expression des Zielgens in den infizierten Zellen und deren Tochterzellen. In den vergangenen Jahren wurden eine Reihe replikationsinkompetenter lentiviraler Vektoren für verschiedene Studien, meist für gentherapeutische Ansätze, hergestellt. Replikationsinkompetente Vektoren sind in der Lage Zielzellen einmalig zu infizieren, können aber in den Zielzellen nicht weiter replizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf HIV-1 basierendes replikationsinkompetentes Vektorsystem etabliert. Mit Hilfe des replikationsinkompetenten Vektorsystems wurde eine rasch durchführbare phänotypische Resistenztestung etabliert, welche für die Messung der Sensitivität von HIV gegen antivirale Inhibitoren geeignet ist. Die Transduktionseffizienz wurde durch den Einbau eines Markergens in das Vektorsystem untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass mit dem Vektorsystem Zielzellen mit hoher Effizienz transduziert werden können. Inhibitoren gegen die virale Protease, Reverse Transkriptase und Integrase waren in der Lage die Transduktion auf konzentrationsabhängige Weise zu reduzieren. In das Vektorsystem konnten PR- und RT-Sequenzen sowohl von viralen Isolaten als auch von Patienten eingesetzt werden und deren Sensitivität bzw. Resistenz gegen die zur Zeit zur Verfügung stehenden Medikamente konnten nachgewiesen werden. Da das hergestellte Vektorsystem den wichtigen Sicherheitsmaßnahmen entspricht, stellt dieses eine sichere Alternative zur Testung der Wirksamkeit von antiviralen Substanzen bei HIV-infizierten Patienten dar. Unter Verwendung des replikationsinkompetenten Vektorsystems konnte die Testung unter biologischer Sicherheitstufe 2 innerhalb von zwei Wochen ausgeführt werden. Damit wurden die bislang zur Verfügung stehenden phänotypischen Resistenztestungen deutlich verbessert. In dieser Arbeit wurde außerdem untersucht, ob das Foamyvirus (FV) Hüllprotein (Env) in der Lage ist, lentivirale Partikel zu pseudotypisieren und welche Bereiche des Hüllproteins für die Pseudotypisierung notwendig sind. Es wurde festgestellt, dass HIV-Kapside mit dem Hüllprotein des Felinen Foamyvirus (FFV) mit sehr hoher Effizienz pseudotypisiert werden können. Das Hüllprotein der Primaten Foamyviren konnte die Pseudotypisierung von lentiviralen Partikel nicht unterstützen. Mit Hilfe verschiedener Mutanten wurde gezeigt, dass bei der Pseudotypisierung das Signalpeptid (SP) eine wichtige Rolle spielt. Die Unterschiede in der Effizienz der Pseudotypisierung zwischen Hüllproteinen von FV verschiedener Spezies wurden primär durch das jeweilige SP bedingt. Aufgrund seines breiten Wirtsspektrum und der Konzentrierbarkeit bietet das FFV-Env eine attraktive Alternative zu herkömmlich verwendeten Hüllproteinen bei der Produktion und Anwendung von HIV-Vektoren. N2 - Vectors based on lentiviruses are highly efficient vehicles for gene transfer approaches. The principle advantages of lentiviral vectors include the infection of nondividing cells, integration into the host cell genome, high level of gene expression and transmission to all the progeny of the infected cell. Within the last years many replication-defective lentiviral vectors have been developed. Replication-defective vectors infect cells, but can not replicate after infection. In the course of these studies a self-inactivating replication-defective vector system derived from the human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) with enhanced biosafety features was constructed. The vector system was used to develop a rapid and easy phenotypic drug resistance assay to detect and measure emerging resistance of HIV against antiviral drugs. The vector system contains a reporter gene for rapid quantification of transduced target cells. The vector proved highly efficient for transducing target cells. Reporter gene transduction could be inhibited with nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase (RT) inhibitors, integrase (IN) and protease (PR) inhibitors in a dose dependent manner. Protease (PR) and reverse transcriptase (RT) gene coding sequences derived either from proviral isolates or from HIV-infected patients could be inserted into this vector system. Both sensitivity and resistance against currently used antiviral drugs could be detected. Due to the biosafety features of the vector system this novel drug resistance assay represents a rapid and easy method without the need for propagation of infectious virus. In the course of these studies was also studied whether capsids of the HIV-1 can be pseudotyped with wild-type and chimeric foamy virus (FV) envelope proteins from virus isolates derived from different species. Further, it was analysed which domains of the FV envelope play a role in pseudotyping HIV capsids. HIV capsids could be efficiently pseudotyped with feline foamy virus (FFV) envelope protein. The primate foamy virus envelope was not able to support the export of lentiviral capsides. The experiments with the chimeric mutants revealed that the signal peptid plays a key role in pseudotyping. Due to the unique properties of the FFV envelope, including the broad host range and the ability to tolerate concentration of viral particles by ultracentrifugation, pseudotyping of HIV capsids with this envelope might provide a useful tool for future gene transfer approaches. KW - Vektor KW - Lentiviren KW - HIV Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181304 ER - TY - THES A1 - Lührmann, Anja T1 - Analyse der Reifung von Afipien- und Rhodokokken-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen T1 - Analysis of the maturation of Afipia- and Rhodococcus-containing phagosomes in macrophages N2 - Die Isolierung von Phagosomen ermöglicht die biochemische Analyse der Phagosomen-Zusammensetzung sowie der an der Phagosomenreifung beteiligten Moleküle. Deshalb wurde im Rahmen dieser Promotionsarbeit eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, Bakterien-enthaltende Phagosomen zu isolieren. Diese Methode erzielt im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen Methoden eine gute Ausbeute (fast 40 Prozent) und vor allem eine höhere Reinheit an Bakterien-enthaltenden Phagosomen. So besteht keine Kontamination mit Teilen des Golgi-Apparates und nur eine sehr geringe Kontamination mit endosomalen und lysosomalen Proteinen sowie Plasmamembranbestandteilen. Allerdings wurde eine Kontamination mit Mitochondrien und ER detektiert. Letzteres muss nicht unbedingt eine Kontamination darstellen, sondern könnte ein wichtiger Bestandteil von Phagosomen sein. Afipia felis ist ein Gram-negatives Bakterium, das für einige Fälle der Katzen-Kratz Krankheit verantwortlich ist. Es kann innerhalb von Makrophagen überleben und sich vermehren. Die genaue Kompartimentierung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in Makrophagen war allerdings unbekannt und sollte deshalb in der vorliegenden Promotionsarbeit analysiert werden. Ovalbumin Texas Red, mit dem Lysosomen vor der Infektion markiert wurden, gelangt nicht in die Afipien-enthaltenden Phagosomen, und die Afipien-enthaltenden Phagosomen sind auch nicht zugänglich für Ovalbumin Texas Red, mit dem das gesamte endozytische System nach der etablierten Infektion markiert wurde. Außerdem sind etablierte, isolierte Afipia felis-enthaltende Phagosomen nur in geringem Umfang positiv für spät endosomale/lysosomale Markerproteine und negativ für früh endosomale Markerproteine. Die Afipien, die ein nicht endozytisches Kompartiment etablieren, werden vom Makrophagen in ein EEA1-negatives Kompartiment aufgenommen, das auch zu späteren Zeitpunkten negativ für LAMP-1 ist. Nur die circa 30 Prozent der Afipien, die sich in einem Kompartiment befinden, das zum endozytischen System gehört, gelangen nach der Aufnahme durch den Makrophagen in ein EEA1-positives Kompartiment, das zu einem späteren Zeitpunkt positiv für LAMP-1 wird. Tötung der Afipien oder Opsonisierung mit Antikörpern vor der Infektion normalisiert die Reifung der Afipia felis-enthaltenden Phagosomen in den J774E-Makrophagen. Somit konnte nachgewiesen werden, dass die Mehrzahl der Phagosomen (70 Prozent), die Afipia felis enthalten, nicht zum endozytischen System gehören. Diese ungewöhnliche Kompartimentierung besteht bereits bei der Aufnahme und kann nur von lebenden Afipien etabliert werden. Rhodococcus equi ist ein Gram-positives Bakterium, das unter anderem Bronchopneumonien beim Fohlen verursacht. Aber auch Menschen und andere Säugetiere sind von Infektionen mit R. equi betroffen. Die Fähigkeit der Rhodokokken, innerhalb der Makrophagen zu überleben und sich zu vermehren, ist mit dem Vorhandensein eines 85 kbp Plasmids assoziiert. Da über die genaue Kompartimentierung von R. equi im Mausmakrophagen wenig bekannt war, und der Frage, ob es einen Unterschied zwischen der Kompartimentierung von R. equi(+)- und R. equi(-)-enthaltenden Phagosomen gibt, noch nicht nachgegangen wurde, war beides Thema dieser Promotionsarbeit. Dabei zeigt sich, dass R. equi(-)-enthaltende Phagosomen wesentlich stärker mit den spät endosomalen/lysosomalen Markerproteinen vATPase und LAMP-1 assoziiert sind sowie eine höhere ß-Galaktosidase-Aktivität aufweisen als die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen. Da sowohl die isolierten R. equi(-)- als auch die R. equi(+)-enthaltenden Phagosomen mit dem früh endosomalen Markerprotein rab5 assoziiert sind, ist anzunehmen, dass Rhodokokken unabhängig vom Vorhandensein des 85 kbp Plasmids in der Lage sind, die Phagosomenreifung zu verzögern. Aber R. equi(-) kann die Reifung zwar verzögern, aber letztendlich nicht verhindern. Wahrscheinlich reifen die Phagosomen, die R. equi(-) enthalten, zu einem späteren Zeitpunkt zu Phagolysosomen, wohingegen R. equi(+) ein ungewöhnliches Kompartiment etabliert und dadurch die Phagosomenreifung endgültig zu verhindern scheint. Somit ist anzunehmen, dass mindestens ein vom 85 kbp Plasmid kodiertes Molekül für die Etablierung dieses ungewöhnlichen, R. equi(+)-enthaltenden Kompartimentes, verantwortlich ist. Da eine Infektion mit Rhodococcus equi zytotoxisch für die infizierte Zelle sein kann, wurde die von den Rhodokokken vermittelte Zytotoxizität näher analysiert. Die in dieser vorliegenden Promotionsarbeit dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass nur die Plasmid-enthaltenden Rhodokokken zur Nekrose, aber nicht zur Apoptose ihrer Wirtszellen führen, während R. equi(-) keinen Einfluss auf die Vitalität ihrer Wirtszellen haben. Dieses Phänomen ist allerdings abhängig vom Wirtszelltyp. So sind R. equi(-) als auch R. equi(+) für humane Monozyten nur geringfügig zytotoxisch. N2 - The isolation of phagosomes from phagocytes enables their fine biochemical analysis as well as the determination of the role of various molecules in phagosome biogenesis. Therefore, a method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages has been established in this study. In comparison with previously described methods a good yield (40 per cent) and a higher level of purity of bacteria-containing phagosomes were obtained using this phagosome isolation method. No Golgi-derived contamination and only very little endosomal or lysosomal and plasma membrane-derived contaminations was found. Furthermore, some mitochondrial and ER contaminations were detectable. Afipia felis is a Gram-negative bacterium that causes some cases of human Cat Scratch Disease. It can survive and multiply in macrophages, but the precise intracellular compartimentalization of Afipia felis-containing phagosomes is unknown. In this study we show evidence, that 70 per cent of Afpia felis-containing phagosomes do not belong to the endocytic pathway. This is supported by the facts that neither did ovalbumin preloaded into lysosomes enter most Afipia felis-containing phagosomes, nor did ovalbumin loaded into the endocytic system after infection. Furthermore the percentage of isolated Afipia felis-containing phagosomes positive for late endosomal/lysosomal markerproteins were very low and early endosomal marker proteins were rarely detectable. Those bacteria that were to be found in a nonendosomal compartment entered the macrophage via an EEA1-negative compartment, which remained negative for LAMP-1. The small population of Afipia felis whose phagosomes were part of the endocytic system entered into an EEA1-positive compartment which also subsequently acquired LAMP-1. Killing of Afipia felis or opsonization with antibodies before infection lead to a strong increase in the percentage of Afipia felis-containing phagosomes that interact with the endocytic system. We conclude that most phagosomes containing Afipia felis are disconnected from the endocytic system. This unusual compartalization is decided at uptake and can only be established by viable Afipia felis. Rhodococcus equi is a Gram-positive bacterium that causes granulomatous pneumonia in foals. It is also a pathogen for other animals and human beings. The pathogenicity of Rhodococcus equi is depending on its ability to exist and multiply inside macrophages and this correlates with the presence of a 85 kbp plasmid. The aim of this study was to elucidate the intracellular compartmentation of Rhodococcus equi and the mechanism by which the bacteria might avoid the destruction in host macrophages. The importance of the virulence-associated plasmid was also evaluated. In this study it is shown that R. equi(-)-containing phagosomes contained much more of the late endosomal/lysosomal marker proteins vATPase or LAMP-1 and also a larger amount of the lysosomal enzyme ß-galactosidase than R. equi(+)-containing phagosomes. Both R. equi(+)- and R. equi(-)-containing phagosomes associated with the early endosomal marker protein rab5. Based on these results it can be speculated that Rhodococcus equi is able to slow down or arrest the maturation of its phagosome independently of the 85 kbp virulence-associated plasmid. Whereas R. equi(-) is able to slow down but not to arrest its phagosomes, R. equi(+) establishes an unusual compartment, which possibly represents a recycling-endosome. Therefore, for the long term establishment of the unusual R. equi(+)-containing phagosomes at least one of the molecules encoded by the 85 kbp plasmid is necessary. Since Rhodococcus equi infection ultimately proves toxic for macrophages, the R. equi mediated cytotoxicity was analyzed. In this study it is shown that Rhodococcus equi induce necrosis in their host cells and which is dependent on the presence of the virulence-associated 85 kbp plasmid. But the Rhodococcus induced necrosis can only be observed in mouse macrophages and not in human monocytes. KW - Afipia KW - Rhodococcus KW - Phagosom KW - Makrophage KW - Makrophage KW - J774 KW - Phagosom KW - Endosom KW - Lysosom KW - Phagozytose KW - Zytotoxizität KW - Afipia felis KW - Rhodococcus equi KW - Macrophage KW - J774 KW - phagosome KW - endosome KW - lysosome KW - phagocytosis KW - cytotoxicity KW - Afipia felis KW - Rhodococcus equi Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1619 ER - TY - THES A1 - Nesplak, Elke T1 - Umstellungsosteotomien des Unterkiefers T1 - Orthodontic osteotomies of the mandible N2 - Umstellungsosteotomien des Unterkiefers Eine retrospektive Analyse des Patientengutes von 1981-1995 an der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgie der Universität Würzburg Die retrospektive Betrachtung des Krankengutes von 1981-1995 bezüglich der Diagnostik, Therapie und Verläufe von Patienten mit Fehlbildungen und Entwicklungsstörungen des Unterkiefers war nach der Erstellung eines standardisierten Datenerhebungsbogen und der Verwendung eines relationalen Datenbank-Managementsystemes, MS-Access 2.0, möglich. Statistische Berechnungen wurden mit dem Chi²-Test sowie dem t-Test mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 durchgeführt. 465 Patienten hatten sich einer sagittalen Spaltung des Unterkiefers und 35 weitere einer anterioren subapikalen Segmentosteotomie des Unterkiefers unterzogen. Auffallend war ein geschlechtsunabhängiger signifikanter Anstieg des Durchschnittsalters von 21,3±6,9 auf 27,4±7,8 Jahre sowie das mit 71,0 Prozent deutliche Überwiegen weiblicher Patienten gegenüber 29,0 Prozent männlicher Patienten. Die Auswertung der Daten ergab in 67,8 Prozent der Fälle eine Distalbiss- und bei 11,8 Prozent der Patienten eine Progeniekorrektur. Es konnte eine Gesamtosteoplastikrate nach anteriorer Segmentosteotomie des Unterkiefers von 40,0 Prozent festgestellt werden, die statistisch signifikant höher war als die entsprechende Quote von 8,0 Prozent nach sagittaler Spaltung des Unterkiefers. Ein Richtwert des Ausmaßes der Verlagerung für die Entscheidung pro oder contra Osteoplastik konnte allerdings nicht ermittelt werden. In 28 Fällen, 5,6 Prozent, wurden Mittelgesichtshypoplasien durch Augmentation korrigiert. 1985 wurde die zentrale Kondylenpositionierung und eine rigide Osteosynthese mit übungsstabilen Positionsschrauben eingeführt. Der stationäre Aufenthalt wurde signifikant von 22,2 ±7,6 auf 10,8±2,4 Tage gekürzt. Es wurden alle Komplikationen und Besonderheiten ermittelt, die während oder nach dem operativen Eingriff zur Dysgnathiekorrektur oder zur Entfernung des Osteosynthesematerials eintraten. Das Risiko einer Verletzung des Nervus alveolaris inferior ist im Rahmen einer Segmentosteotomie mit 5,7 Prozent höher, aber nicht signifikant, als bei sagittalen Spaltungen des Unterkiefers. In 2 Fällen (0,0 Prozent) wurde nach der operativen Korrektur zeitweilig eine Fazialisparese dokumentiert. Die Wundinfektionsrate (2,2 Prozent) ist mit antibiotischer Prophylaxe sehr gering. N2 - Orthodontic osteotomies of the mandible A retrospective analysis of the patients from 1981 to 1995 at the clinic and outpatientsclinic for maxillofacial surgery of the Würzburg university The retrospective analysis of the patients from 1981 to 1995 concerning the diagnostic, therapy and sequels of patients with malformations and deficiencies of the mandible was possible after designing a standard data logging form and making use of a relational data base management system, MS-Access 2.0. Statistical calculations were performed with chi²- and t-test at a significance level of p<0,05. 465 patients underwent sagittal split osteotomy of the mandible and 35 other patients anterior subapical segmental osteotomy of the mandible. Remarkable were a genus independent significant growth of the average age from 21.3±6.9 to 27.4±7.8 years and the clear overbalance of female patients with 71.0 per cent compared with 29.0 per cent male patients. The data processing amounted in 67.8 per cent of the cases to a surgical correction of retrognathism and in 11.8 per cent of the patients to correction of prognathism. A total osteoplastic rate after anterior segmental osteotomy of the mandible of 40.0 per cent, was determined, which is significantly higher than the corresponding rate of 8,0 per cent after sagittal split osteotomy of the mandible. An approximate value of the extent of the shift enabling to decide for or against osteoplasty could not be determinated. Hypoplasia of the midface was corrected in 28 cases, 5.6 per cent, by augmentation. A central positioning of the condyle and a rigid osteosyntesis with functionally stable position screws were introduced in 1985. The stay at a hospital was significantly shortened from 22.2 ±7.6 to 10.8±2.4 days. All complications and characteristic features during or succeeding the surgical correction of the mandibular deficiency or the surgical removing of the osteosynthesis materials were determined. The risk of an injury of the inferior alveolar nerve is for a segmental osteotomy, with 5.7 per cent not significantly higher than for a sagittal split osteotomy (3.0 per cent). A temporal facial nerve palsy after the surgical correction was reported in two cases (0.0 per cent). The rate of wound infection (2.2 per cent) is very low with antibiotic prophylaxis. KW - Unterkieferosteotomie KW - sagittale Unterkieferspaltung KW - anteriore subapikale Segmentosteotomie KW - Osteosynthesematerialien KW - Mittelgesichtshypoplasie KW - osteotomy of the mandible KW - sagittal split osteotomy of the mandible KW - anterior subapical segmental osteotomy KW - osteosynthesis materials Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180878 ER - TY - THES A1 - Mock, Tobias T1 - Die Bestimmung visuell evozierter Potentiale bei Kindern T1 - Determination of visual evoked potentials with children N2 - Zur Messung von visuell evozierten Potentialen ist eine gute Aufmerksamkeit während der Messung notwendig, die jedoch vor allem bei Kindern nicht immer gewährleistet ist. Unser Ziel war es, unter standardisierten Meßbedingungen im klinischen Routinebetrieb eine kindgerechte Meßmethode zu entwickeln, die eine Verbesserung der Aufmerksamkeit ermöglicht. Gleichzeitig sollte die Kontrolle der Aufmerksamkeit verbessert werden. Zusätzlich prüften wir die Meßergebnisse auf ihre Reproduzierbarkeit und untersuchten, ob das VEP bei Kindern unter klinischen Routinebedingungen in unserem Labor eingesetzt werden kann. Wir entwarfen dazu eine Bildergeschichte, die zur Ablenkung während der Meßvorbereitungen dient und die Kinder auf die Meßbedingungen einstimmt. Zusätzlich entwickelten wir ein sog. Aufmerksamkeits-Spiel, das eine gute Fixation auf den Bildschirm erfordert. Die Schwierigkeit der dabei zu lösenden Aufgaben wurde adaptiv angepaßt. Die bei der Aufgabe berechenbare Schwellenzeit war ein Maß zur Beurteilung der Aufmerksamkeit. Die an der Untersuchung teilnehmenden Schielpatienten unserer Sehschule wurden in eine Kindergruppe und eine Erwachsenengruppe eingeteilt. Eine Gruppe von Normalpersonen diente als Vergleichsgruppe zu den erwachsenen Patienten. Abgeleitet wurde ein bipolares VEP nach dem Standard der ISCEV. Die absoluten Werte von Amplitude und Latenz entsprachen den in der Literatur beschriebenen Werten und bei der monokularen Ableitung des Muster-VEPs entsprachen die Meßergebnisse der Schielpatienten denen der Normalpersonen. Zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse werteten wir den relativen Variationskoeffizienten aus. Dieser lag für die Latenz fast um das Zehnfache niedriger als der relative Variationskoeffizient der Amplitude. Bei Kindern war der relative Variationskoeffizient doppelt so groß wie bei Normalpersonen. Die Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse war demnach nur halb so gut. Der Variationskoeffizient der Erwachsenen lag etwas höher als bei den Normalpersonen. Das Aufmerksamkeits-Spiel konnte von fast allen Kindern ab 6 Jahren gelöst werden. Die kindgerechte Gestaltung der standardisierten Versuchsbedingungen mit der Bildergeschichte und dem Aufmerksamkeits-Spiel ermöglicht deshalb den Einsatz der Muster-VEP-Messung im klinischen Routinebetrieb für Kinder ab 6 Jahren. In Einzelfällen können auch jüngere Kinder gemessen werden. Die Schwellenzeit war bei Kindern im Mittel wesentlich höher als bei Erwachsenen und Normalpersonen, d.h. die Aufmerksamkeit war bei ihnen wesentlich schlechter. Die Reproduzierbarkeit der Amplitude nahm mit zunehmender Schwellenzeit ab, die Reproduzierbarkeit der Latenz war unabhängig von der Schwellenzeit. Standardisierte VEP-Messungen unter klinischen Routinebedingungen können damit durch die kindgerechte Gestaltung der Untersuchungsbedingungen auch bei Kindern ab 6 Jahren durchgeführt werden. Die Beurteilung der Aufmerksamkeit konnte durch das Aufmerksamkeits-Spiel verbessert werden. N2 - Visually-evoked potentials should be measured during good mental concentration, seldom the case with children. Our aim was to develop a standardised measuring procedure suitable for use with children under routine clinical conditions and enabling improved concentration. At the same time we wanted to improve concentration assessment. We additionally tested the reproducibility of our results and examined the possibility of VEP measurements on children in our laboratory under routine clinical conditions. For the project we developed a short comic strip to occupy the children during preparations for the experiment and to attune the children to the imminent examination. In addition we created a concentration-based game requiring good fixation on the monitor. The difficulty of this game can be individually adjusted. The threshold time measured during the game reflects the child’s concentration. The strabismus patients in the experiment were divided into a children`s and an adult group. A group of normal-vision adults served as control-group for the adults. We used a bipolar VEP to ISCEV standards. The absolute results of amplitude and latency were comparable with results described in the literature. The results of monocular pattern VEPs of strabismus patients corresponded to those of the normal-vision group. To assess the reproducibility of our results we used the relative variation coefficient. It was for latency about ten times lower than for amplitude. For children the relative variation coefficient was twice as high as for the normal-vision adults. The reproducibility of the results was therefore only half as good as that of the normal-vision adults. The variation coefficient for the adults was slightly higher than for the control group. The concentration-based game could be solved by almost all children aged 6 or more. In individual cases we could also include younger children. The average threshold time for children was significantly higher than for adults and the control-group, i.e. their concentration was considerably poorer. The reproducibility in amplitude decreased with increasing threshold time, the reproducibility of latency was independent of threshold time. We found that use of the comic-strip and the game enabled child-friendly VEP measurement for ages of 6 and upwards under routine clinical conditions. The concentration-based game improved concentration assessment. KW - Vep KW - Kinder KW - Reproduzierbarkeit KW - Aufmerksamkeit KW - Relativer Variationskoeffizient KW - Amplitude KW - Latenz KW - Schwellenzeit KW - Routine KW - VEP KW - children KW - reproducibility KW - assessment KW - relative variation coefficient KW - amplitude KW - latency KW - threshold KW - standard KW - routine Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180405 ER -