TY - THES A1 - Stock, Patrick Maria T1 - Binding site contribution in high resolution records of nicotinic receptor channel currents T1 - Beitrag der Bindungsstellen zum Öffnungsverhalten des nAChRs N2 - The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the ‘primed states’ model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently. N2 - Der nicotinische Acetylcholin-Rezeptorkanal des Skelettmuskels zählt zu den bestuntersuchten synaptischen Proteinen und gilt als Modell für die Familie der Liganden gesteuerten pentameren Ionenkanäle. Rezeptoren dieser Großfamilie besitzen als charakteristisches strukturelles Merkmal ein Cystein-Schleifen-Motiv (C-loop), welches sich nach Bindung eines Agonisten um die Bindungstasche herum schließt und eine Kette weiterer Konformationsänderungen nach sich zieht. Wie in früheren Publikationen festgestellt wurde, ist es nur schwer möglich hochaufgelöste Messdaten mit konservativen kinetischen Modellen ausreichend zu beschreiben (Parzefall et al., 1998; Hallermann et al., 2005). Aktuelle Fortschritte auf dem Gebiet der kinetischen Modellierung von mechanistischen Rezeptormodellen auf Rezeptorströme, zeigen, dass die Einführung zusätzlicher kurzlebiger Geschlossenzustände in den kinetischen Mechanismen die Qualität der Voraussagen der Modelle verbessert. Diese zusätzlichen Geschlossenzustände, welche Zuständen mit gebundenen Agonisten des Rezeptormodells folgen, spiegeln höchstwahrscheinlich die Schließung des Cystein-Schleifen-Motivs wider (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). Trotz der jüngsten Fortschritte wurde bisher nicht beschrieben, wie und ob die strukturellen Unterschiede der 2 vorhandenen Bindungsstellen sich auf die Charakteristika des Öffnungsverhaltens auswirken. Die Bindungsstellen für Agonisten befinden sich am embryonalen nicotinischen Acetylcholinrezeptor des Muskels der Maus an den Schnittstellen der α-δ und der α-γ Untereinheiten. Um der Frage des Einflusses der Bindungsstellendiversität auf den Grund zu gehen, wurden hochaufgelöste Einzelkanalmessungen unter der Verwendung von unterschiedlichen Agonisten, für die bekannt ist, dass sie unterschiedliche Selektivitäten zu den Bindungsstellen besitzen, durchgeführt. Hierdurch ist es möglich ein detailliertes Bild der bindungsstellenbedingten Auslösung definierter Öffnungscharakteristika zu beschreiben. Durch die Zuweisung der Öffnungscharakteristika zu den α-δ und α-γ Bindungsstellen gelingt es die bindungsstellenabhängige Aktivierung von einzelnen kinetischen Zuständen zu zeigen. Darüber hinaus werden direkte Anhaltspunkte dafür gezeigt, dass es möglich ist mit den angeführten kurzlebigen Geschlossenzuständen hochaufgelöste Einzelkanaldaten kinetisch hinreichend zu beschreiben. Schließlich wird ein erweiterter kinetischer Mechanismus vorgestellt, welcher auf dem ‚primed-states’ Modell, das 2009 von Mukhtasimova veröffentlicht wurde, basiert. Zusätzlich ist dieser in der Lage die komplexen kinetischen Charakteristika des embryonalen nicotinischen Rezeptorkanals, unter hoher zeitlicher Auflösung der Messdaten, zu beschreiben. KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Bindestelle KW - Ionenkanal KW - Kinetik KW - Neurobiologie KW - nAChR KW - Kanalkinetik KW - Bindungsstellen KW - Rezeptor KW - neurobiology KW - nAChR KW - receptor channel KW - binding sites KW - kinetics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71769 ER - TY - THES A1 - Schulze, Andrea T1 - Investigating the mechanism of the Hsp90 molecular chaperone using photoinduced electron transfer fluorescence quenching T1 - Untersuchungen zum Mechanismus des molekularen Chaperons Hsp90 mittels photoinduzierter Elektronentransfer-Fluoreszenzlöschung N2 - The molecular chaperone Hsp90 facilitates the folding and activation of a wide array of structurally and functionally diverse client proteins. Hsp90 presents a central node of protein homeostasis and is frequently involved in the development of many human diseases. Although Hsp90 is a promising target for disease treatment, the mechanism by which Hsp90 facilitates client recognition and maturation is poorly understood. The shape of the homodimeric protein resembles a molecular clamp that opens and closes in response to binding and hydrolysis of ATP. Structural studies reveal a network of distinct local conformational rearrangements that coordinate the slow transition into the hydrolysis-active, closed state configuration (time order of minutes). However, the kinetics of local conformational changes remain elusive because spectroscopic tools that can detect them have been missing so far. Fluorescence quenching of extrinsic fluorophores by the natural amino acid Tryptophan is based on a photoinduced electron transfer (PET) reaction, which requires sub-nanometer contact between fluorophore and Tryptophan. This quenching mechanism has been developed into a 1-nm spectroscopic tool for the detection of rapid protein folding dynamics. Within the scope of this doctoral thesis, PET-reporter systems were designed to investigate the kinetics of local conformational motions that are part of the mechanistic core of the Hsp90 chaperone cycle. ATP-triggered kinetics of closure of the ATP-lid as well as swapping of the N-terminal ß-strand across subunits and association of the N-terminal and middle-domain were estimated in solution. Bulk experiments revealed that local motions occur on similar timescales and are in good agreement with the ATP-hydrolysis rate. Functional mutations demonstrated that local motions act cooperatively. Furthermore, the lid was shown to close via a two-step process consisting of a rapid lid-reconfiguration in direct response to ATP-binding, followed by slow closure of the lid. The co-chaperone Aha1 seems to act early in the chaperone cycle by remodelling of the lid and by stabilization of apo Hsp90 in a NM-domain pre-associated conformation. A two-colour single-molecule PET microscopy method was developed to observe local motions at remote positions simultaneously and in real-time. Thus, directionality within the network of local conformational changes could be revealed. In a first attempt, the feasibility of detecting PET-complexes on the single-molecule surface was tested on Hsp90 constructs that report on only one motion (one-colour single-molecule PET microscopy). PET-quenched complexes could be distinguished from photobleached fluorophores through oxidation by molecular oxygen, resulting in fluorescence recovery. In two-colour experiments, a dimmed state was identified for PET-quenched complexes, but not for all of the used PET-reporter systems. Results suggest that local motions occur simultaneously within the time-resolution of the experiment (0.3 sec). Furthermore, bi-exponential kinetics of transition into the closed clamp configuration indicate a more complex mechanism of clamp-closure than of clamp-opening, which could be well described by a mono-exponential function. N2 - Das molekulare Chaperon Hsp90 ermöglicht die korrekte Faltung und Aktivierung eines breiten Spektrums an strukturell und funktionell unterschiedlichen Klienten-Proteinen. Hsp90 bildet einen zentralen Knotenpunkt der Protein-Homöostase und ist an der Entstehung einer Vielzahl von humanen Erkrankungen beteiligt. Trotz des vielversprechenden Potentials, das Hsp90 als Zielprotein für die Behandlung von Erkrankungen besitzt, ist der Mechanismus, durch den Hsp90 seinen Klienten erkennt und dessen Reifung gewährt, noch unbekannt, Die Gestalt des homodimeren Proteins ähnelt einer molekularen Klammer, die sich durch Bindung und Hydrolyse von ATP öffnet und schließt. Strukturelle Studien zeigen ein Netzwerk an weit voneinander entfernt liegenden lokalen Konformationsänderungen, die den langsamen Übergang (im Bereich von Minuten) in die Hydrolyse-aktive, geschlossene Konfiguration koordinieren. Allerdings sind die Kinetiken der lokalen Konformationsänderungen unbekannt, da es bisher noch keine spektroskopische Methode gibt, die diese detektieren könnte. Die natürliche Aminosäure Tryptophan kann durch eine photoinduzierte-Elektronentransfer-(PET)-Reaktion die Fluoreszenz extrinsischer Fluorophore löschen. Fluorophor und Tryptophan müssen hierfür in einer Kontakt-Distanz im sub-nanometer Bereich stehen. Dieser Lösch-Mechanismus wurde zu einem 1-nm sensitiven, spektroskopischen Werkzeug entwickelt, das für die Detektion schneller Proteinfaltungsdynamiken angewendet werden kann. Im Rahmen der hier vorliegenden Dissertation wurden PET-Reporter-Systeme entworfen. Diese dienten der Untersuchung lokaler Konformationsänderungen, die Teil des mechanistischen Kerns des Hsp90-Chaperon-Zyklus sind. ATP-induzierte Kinetiken des ATP-Lid Schlusses sowie des Untereinheiten-Wechsels des N-terminalen ß-Faltblatts als auch der Assoziation der N-terminalen mit der mittleren Domäne wurden ermittelt. In Ensemble Experimenten konnte gezeigt werden, dass lokale Bewegungen auf ähnlichen Zeitskalen stattfinden und in guter Übereinstimmung mit der ATP-Hydrolyserate sind. Durch die Anwendung von Funktionsmutanten konnte demonstriert werden, dass die lokalen Bewegungen zusammenwirkend geschehen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Lid anhand eines zweistufigen Prozesses schließt. Dieser besteht aus einer, durch die Bindung von ATP ausgelösten, raschen Lid-Rekonfiguration, gefolgt von der langsamen Schließung des Lids. Das Co-Chaperon Aha1 scheint den ATPase-Zyklus bereits in einem frühen Stadium, durch die Remodellierung der Lid-Konformation und die Stabilisierung des apo-Hsp90 in einer vor-assoziierten Konformation der NM-Domänen, zu beeinflussen Des Weiteren wurde eine Zwei-Farben-Einzelmolekül-PET-Mikroskopie-Methode entwickelt, die es ermöglicht lokale Bewegungen an entfernten Positionen simultan und in Echtzeit zu beobachten. Dadurch kann festgestellt werden, ob eine Richtungscharakteristik innerhalb des Netzwerks lokaler Konformationsänderungen besteht. Hierfür wurde zunächst anhand von einfach markierten Hsp90 Konstrukten, die nur eine Bewegung darstellen, getestet ob die Detektion von PET-Komplexen auf der Einzelmoleküloberfläche möglich ist (Ein-Farben-Einzelmolekül-PET-Mikroskopie). Die Fluoreszenz PET-gelöschter Komplexe konnte mittels Oxidation durch molekularen Sauerstoff wiederhergestellt werden, wodurch eine Unterscheidung zu photogebleichten Fluorophoren möglich war. In Zwei-Farben-Experimenten konnte zudem ein gedimmter Zustand der PET-gelöschten Fluorophore festgestellt werden, allerdings nicht für jedes der verwendeten PET-Reportersysteme. Die Ergebnisse deuten auf ein innerhalb der Zeitauflösung des Experiments (0.3 sec) gleichzeitiges Auftreten der lokalen Bewegungen hin. Des Weiteren scheint der Mechanismus des Klammerschlusses komplexer zu sein, als der Mechanismus der Klammeröffnung. Während die Kinetiken der Klammeröffnung durch eine mono-exponentielle Fit-funktion angepasst werden konnten, benötigte der Klammerschluss eine bi-exponentielle Anpassungsfunktion. KW - Hitzeschock-Proteine KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Kinetik KW - Heat shock protein 90 KW - Hitzeschockprotein 90 KW - photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - single molecule microscopy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162155 ER - TY - THES A1 - Lohr, Andreas T1 - Self-Assembly of Merocyanines : Thermodynamic and Kinetic Insights into the Formation of Well-Defined Dye Aggregates T1 - Selbstorganisation von Merocyaninen : Thermodynamische und Kinetische Einblicke in die Bildung definierter Farbstoffaggregate N2 - The present thesis demonstrates the potential of dipolar aggregation of merocyanine dyes as novel directional and specific supramolecular binding motif for the creation of more elaborate supramolecular architectures beyond simple dimers. Furthermore, the self-assembly studies into bis(merocyanine) nanorods gave new insights into the kinetics of morphogenesis in supramolecular aggregates. N2 - In der vorliegenden Arbeit konnte das Potential der dipolaren Aggregation von Merocyaninfarbstoffen als neuartiges, gerichtetes und spezifisches Bindungsmotif zum Aufbau wesentlich komplexerer supramolekularer Architekturen als einfachen Dimeren aufgezeigt werden. Desweiteren lieferten Studien zur Selbstorganisation von Bis(merocyanin)-Nanostäbchen neue Erkenntnisse zur Morphogenese supramolekularer Aggregate. KW - Supramolekulare Chemie KW - Selbstorganisation KW - Farbstoff KW - Kinetik KW - Merocyanin KW - H-Aggregate KW - Nanostrukturen KW - Chiralität KW - Merocyanine KW - H-Aggregate KW - Nanostructure KW - Chirality Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28964 ER -