TY - THES A1 - Yuan, Xidi T1 - Aging and inflammation in the peripheral nervous system T1 - Altern und Entzündung im peripheren Nervensystem N2 - Aging is known to be a risk factor for structural abnormalities and functional decline in the nervous system. Characterizing age-related changes is important to identify putative pathways to overcome deleterious effects and improve life quality for the elderly. In this study, the peripheral nervous system of 24-month-old aged C57BL/6 mice has been investigated and compared to 12-month-old adult mice. Aged mice showed pathological alterations in their peripheral nerves similar to nerve biopsies from elderly human individuals, with nerve fibers showing demyelination and axonal damage. Such changes were lacking in nerves of adult 12-month-old mice and adult, non-aged humans. Moreover, neuromuscular junctions of 24-month-old mice showed increased denervation compared to adult mice. These alterations were accompanied by elevated numbers of macrophages in the peripheral nerves of aged mice. The neuroinflammatory conditions were associated with impaired myelin integrity and with a decline of nerve conduction properties and muscle strength in aged mice. To determine the pathological impact of macrophages in the aging mice, macrophage depletion was performed in mice by oral administration of CSF-1R specific kinase (c-FMS) inhibitor PLX5622 (300 mg/kg body weight), which reduced the number of macrophages in the peripheral nerves by 70%. The treated mice showed attenuated demyelination, less muscle denervation and preserved muscle strength. This indicates that macrophage-driven inflammation in the peripheral nerves is partially responsible for the age-related neuropathy in mice. Based on previous observations that systemic inflammation can accelerate disease progression in mouse models of neurodegenerative diseases, it was hypothesized that systemic inflammation can exacerbate the peripheral neuropathy found in aged mice. To investigate this hypothesis, aged C57BL/6 mice were intraperitoneally injected with a single dose of lipopolysaccharide (LPS; 500 μg/kg body weight) to induce systemic inflammation by mimicking bacterial infection, mostly via activation of Toll-like receptors (TLRs). Altered endoneurial macrophage activation, highlighted by Trem2 downregulation, was found in LPS injected aged mice one month after injection. This was accompanied by a so far rarely observed form of axonal perturbation, i.e., the occurrence of “dark axons” characterized by a damaged cytoskeleton and an increased overall electron density of the axoplasm. At the same time, however, LPS injection reduced demyelination and muscle denervation in aged mice. Interestingly, TREM2 deficiency in aged mice led to similar changes to LPS injection. This suggests that LPS injection likely mitigates aging-related demyelination and muscle denervation via Trem2 downregulation. Taken together, this study reveals the role of macrophage-driven inflammation as a pathogenic mediator in age-related peripheral neuropathy, and that targeting macrophages might be an option to mitigate peripheral neuropathies in aging individuals. Furthermore, this study shows that systemic inflammation may be an ambivalent modifier of age-related nerve damage, leading to a distinct type of axonal perturbation, but in addition to functionally counteracting, dampened demyelination and muscle denervation. Translationally, it is plausible to assume that tipping the balance of macrophage polarization to one direction or the other may determine the functional outcome in the aging peripheral nervous system of the elderly. N2 - Es ist bekannt, dass das Altern ein Risikofaktor für strukturelle Veränderungen und Funktionsstörungen des Nervensystems ist. Die Charakterisierung altersbedingter Veränderungen ist wichtig, um mögliche Wege zu identifizieren, um schädliche Auswirkungen zu überwinden und die Lebensqualität älterer Menschen zu verbessern. In dieser Studie wurde das periphere Nervensystem von 24 Monate alten gealterten C57BL/6-Mäusen untersucht und mit 12 Monate alten adulten Mäusen verglichen. Gealterte Mäuse zeigten ähnliche pathologische Veränderungen in ihren peripheren Nerven wie Nervenbiopsien älterer Menschen, wobei die Nervenfasern eine Demyelinisierung und axonale Schädigung zeigten. Bei den Nerven von adulten 12 Monate alten Mäusen und nicht gealterten Menschen fehlten solche Veränderungen. Darüber hinaus wiesen die neuromuskulären Endplatten von 24 Monate alten Mäusen im Vergleich zu adulten Mäusen eine erhöhte Denervation auf. Diese Veränderungen wurden von einer erhöhten Anzahl von Makrophagen in den peripheren Nerven gealterter Mäuse begleitet. Die neuroinflammatorischen Bedingungen waren mit einer Beeinträchtigung der Myelinintegrität, einer Abnahme der Nervenleitungseigenschaften und der Muskelkraft bei gealterten Mäusen verbunden. Um den pathologischen Einfluss von Makrophagen bei alternden Mäusen zu bestimmen, wurde die Makrophagen-Depletion bei Mäusen durch orale Verabreichung des CSF-1R-spezifischen Kinase-Inhibitors (c-FMS) PLX5622 (300 mg/kg Körpergewicht) durchgeführt, welche die Anzahl der Makrophagen in den peripheren Nerven um 70% reduzierte. Die behandelten Mäuse zeigten eine verminderte Demyelinisierung, eine reduzierte Muskeldenervation und einen Erhalt der Muskelkraft. Dies deutet darauf hin, dass die durch Makrophagen verursachte Entzündung in den peripheren Nerven teilweise für die altersbedingte Neuropathie bei Mäusen verantwortlich ist. Auf der Grundlage früherer Beobachtungen, dass systemische Entzündungen das Fortschreiten der Krankheit in Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen beschleunigen können, wurde die Hypothese aufgestellt, dass systemische Entzündungen die periphere Neuropathie in gealterten Mäusen verschlimmern können. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde gealterten C57BL/6-Mäusen eine Einzeldosis Lipopolysaccharid (LPS; 500 μg/kg Körpergewicht) intraperitonal injiziert, um eine systemische Entzündung durch Nachahmung einer bakteriellen Infektion, meist über die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLRs), zu induzieren. Eine veränderte endoneuriale Makrophagenaktivierung, die durch eine reduzierte Trem2-Expression hervorgehoben wird, konnte bei LPS-injizierten gealterten Mäusen einen Monat nach der Injektion gefunden werden. Dies ging einher mit einer bisher selten beobachteten Form der axonalen Perturbation, d.h. dem Auftreten von "dunklen Axonen", die sich durch ein geschädigtes Zytoskelett und eine erhöhte Gesamtelektronendichte des Axoplasmas auszeichnen. Gleichzeitig verringerte die LPS-Injektion jedoch die Demyelinisierung und Muskeldenervation bei gealterten Mäusen. Interessanterweise führte die TREM2 Defizienz bei gealterten Mäusen zu vergleichbaren Veränderungen wie die LPS-Injektion. Dies deutet darauf hin, dass die LPS-Injektion die alterungsbedingte Demyelinisierung und Muskeldenervierung über die Trem2 Herunterregulation abschwächt. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Rolle der Makrophagen-getriebenen Entzündung als pathogener Mediator bei der altersbedingten peripheren Neuropathie. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die gezielte Behandlung von Makrophagen eine Option zur Linderung peripherer Neuropathien bei alternden Menschen sein könnte. Darüber hinaus zeigt diese Studie, dass die systemische Entzündung ein ambivalenter Modifikator der altersbedingten Nervenschädigung sein kann, der zu einer bestimmten Art von axonaler Perturbation führt, aber zusätzlich zu einer funktionell entgegenwirkenden, weniger schweren Demyelinisierung und Muskeldenervation. Translatorisch ist es plausibel anzunehmen, dass eine Veränderung des Gleichgewichts der Makrophagenpolarisation in die eine oder andere Richtung das funktionelle Ergebnis im alternden peripheren Nervensystem der älteren Menschen bestimmen kann. KW - Maus KW - Peripheres Nervensystem KW - Altern KW - Immunsystem KW - macrophages KW - peripheral nervous system KW - aging KW - neuroinflammation KW - Trem2 KW - systemic inflammation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237378 ER - TY - THES A1 - Leikam, Claudia T1 - Oncogene-induced senescence in melanocytes T1 - Onkogen-induzierte Seneszenz in Melanozyten N2 - Melanoma is the most aggressive skin cancer with very limited treatment options. Upon appearance of metastases chemotherapeutics are used to either kill or slow down the growth of cancer cells by inducing apoptosis or senescence, respectively. With melanomas originating from melanocytes, it is vital to elucidate the mechanisms that distinguish senescence induction from proliferation and tumourigenicity. Xmrk (Xiphophorus melanoma receptor kinase), the fish orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR), causes highly aggressive melanoma in fish. Using an inducible variant, HERmrk, I showed that high receptor levels result in melanocyte senescence, whereas low and medium expression allows for cell proliferation and tumourigenicity. Mechanistically, HERmrk leads to increased reactive oxygen species (ROS) levels, which trigger a DNA damage response. Consequently, multinucleated, senescent cells develop by both endomitosis and fusion. Furthermore, oncogenic N‐RAS (N-‐RAS61K) induces a similar multinucleated phenotype in melanocytes. In addition, I found that both overexpression of C‐MYC and the knockdown of miz­‐1 (Myc­‐interacting zinc finger protein 1) diminished HERmrk‐induced senescence entry. C‐MYC prevent ROS induction, DNA damage and senescence, while acting synergistically with HERmrk in conveying tumourigenic features to melanocytes. Further analyses identified cystathionase (CTH) as a novel target gene of Myc and Miz-­1 crucial for senescence prevention. CTH encodes an enzyme involved in the synthesis of cysteine from methionine, thereby allowing for increased ROS detoxification. Even though senescence was thought to be irreversible and hence tumour protective, I demonstrated that prolonged expression of the melanoma oncogene N­‐RAS61K in pigment cells overcomes initial OIS by triggering the emergence of tumour‐initiating, mononucleated stem‐like cells from multinucleated senescent cells. This progeny is dedifferentiated, highly proliferative, anoikis­‐resistant and induces fast­‐growing, metastatic tumours upon transplantation into nude mice. Our data demonstrate that induction of OIS is not only a cellular failsafe mechanism, but also carries the potential to provide a source for highly aggressive, tumour­‐initiating cells. N2 - Das Melanom ist der aggressivste Hautkrebstyp mit aeußerst begrenzten Therapiemoeglichkeiten. Sobald Metastasen diagnostiziert werden, kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, deren Aufgabe darin besteht, die Krebszellen durch Apotoseinduktion zu toeten oder ihre Verbreitung mittels Seneszenz zu verlangsamen. Da Melanome aus Melanozyten hervorgehen, ist es essentiell, die Mechanismen zu analysieren, die entscheiden, ob Zellen seneszent oder tumorigen werden. Xmrk, die Xiphophorus­‐Melanom‐Rezeptor­‐Kinase und Fischortholog des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR), verursacht aggressive Melanome in Fischen. Durch den Einsatz von HERmrk, einer induzierbaren Variante des Rezeptors, konnte ich zeigen, dass hohe Expressionslevel Seneszenz in Melanozyten zur Folge haben, wohingegen niedrige oder mittlere Rezeptorlevel mit erhöhter Zellproliferation und Tumorigenitaet der Zellen einhergehen. Mechanistisch gesehen, führt die Aktivierung von HERmrk zu gesteigerten Level an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die wiederum DNA‐Schäden verursachen und dadurch bestimmte Signalwege auslösen. Durch Endomitose und Fusion entstehen letztendlich multinukleaere, seneszente Zellen. Interessanterweise, führte die Expression von onkogenem N‐RAS (N‐RAS61K) in Melanozyten zu einem sehr ähnlichen Phaenotyp. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass sowohl die Überexpression von C-­MYC als auch der Knockdown von miz‐1 (Myc­‐interagierendes Zinkfingerprotein 1) der HERmrk-­induzierten Seneszenz entgegenwirkten. C‐MYC verhindert einerseits die Entstehung von ROS, die dadurch verursachten DNA‐Schaeden und damit die Seneszenz und wirkt andererseits synergistisch mit HERmrk, indem es den Melanozyten tumorigene Eigenschaften verleiht. In weiteren Analysen wurde Cystathionase (CTH) als neues Zielgen von Myc und Miz-­1 identifiziert, dem eine zentrale Rolle in der Seneszenzverhinderung zukommt. CTH kodiert fuer ein Enzym, das die Synthese von Cystein aus Methionin und damit die Entsorgung von ROS ermöglicht. Obwohl man davon ausgeht, dass Seneszenz einen irreversiblen Mechanismus darstellt, der die Tumorentstehung verhindert, konnte ich zeigen, dass die langfristige Expression des Melanomonkogens N‐RAS61K die initiale Seneszenzinduktion durchbricht. Dabei gehen mononukleaere, tumorigene, stammzellaehnliche Zellen aus seneszenten Zellen hervor. Diese Tochterzellen sind dedifferenziert, hochproliferativ, Anoikis­‐resistent und induzieren schnellwachsende, metastasierende Tumoren in Nacktmaeusen. Damit machen meine Daten deutlich, dass Seneszenz nicht nur als zellulaerer Schadensbegrenzungsmechanismus fungiert, sondern auch das Potential hat, aeußerst aggressive Tumorzellen zu generieren. KW - Melanom KW - Altern KW - Onkogen KW - Melanophor KW - Hautkrebs KW - Seneszenz KW - Xmrk KW - N-RAS KW - melanoma KW - senescence KW - OIS KW - skin cancer KW - oncogenes Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79316 ER - TY - THES A1 - Brandes, Nicolas T1 - Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms T1 - Oxidative Thiol Modifikationen in Pro- und Eukaryotischen Organismen N2 - Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivität der freien Thiol-Gruppe sowie dessen Fähigkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Veränderungen ihrer Aktivität zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktionsänderungen solcher Proteine erklären möglicherweise die veränderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF & IlvC mitverantwortlich sind für die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivitätsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegenüber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorgänge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress während des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zunächst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben übernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivität dieser Proteine gegenüber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellulären Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorgängen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen für die Bekämpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. Für diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zelluläre Redox-Homöostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erhöht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verzögert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Homöostase beitragen könnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verständnis, wie sich Veränderungen in der Redox-Homöostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen N2 - Cysteines play important roles in the biochemistry of many proteins. The high reactivity, redox properties, and ability of the free thiol group to coordinate metal ions designate cysteines as the amino acids of choice to form key catalytic components of many enzymes. Also, cysteines readily react with reactive oxygen and nitrogen species to form reversible oxidative thiol modifications. Over the last few years, an increasing number of proteins have been identified that use redox-mediated thiol modifications to modulate their function, activity, or localization. These redox-regulated proteins are central players in numerous important cellular processes. First aim of this study was to discover nitric oxide (NO) sensitive proteins in E. coli, whose redox-mediated functional changes might explain the physiological alterations observed in E. coli cells suffering from NO-stress. To identify E. coli proteins that undergo reversible thiol modifications upon NO-treatment in vivo, I applied a differential thiol trapping technique combined with two-dimensional gel analysis. 10 proteins were found to contain thiol groups sensitive to NO-treatment. Subsequent genetic studies revealed that the oxidative modifications of AceF & IlvC are, in part, responsible for the observed NO-induced growth inhibition. Noteworthy, the majority of identified protein targets turned out to be specifically sensitive towards reactive nitrogen species. This oxidant specificity was tested on one NO-sensitive protein, the small subunit of glutamate synthase. In vivo and in vitro activity studies demonstrated that glutamate synthase rapidly inactivates upon nitric oxide treatment but is resistant towards other oxidative stressors. These results imply that reactive oxygen and nitrogen species affect distinct physiological processes in bacteria. The second aim of my study was to identify redox-sensitive proteins in S. cerevisiae and to use their redox state as in vivo read-out to assess the role of oxidative stress during the eukaryotic aging process. I first determined the precise in vivo thiol status of almost 300 yeast proteins located in the cytosol and sub-cellular compartments of yeast cells using a highly quantitative mass spectrometry based thiol trapping technique, called OxICAT. The identified proteins can be clustered in four groups: 1) proteins, whose cysteine residues are oxidation resistant; 2) proteins with structurally or functionally important cysteine modifications 3) proteins with highly oxidation-sensitive active site cysteines, which are partially oxidized in exponentially growing yeast cells due to their exquisite sensitivity towards low amounts of ROS; 4) proteins that are reduced in exponentially growing cells but harbor redox-sensitive cysteine(s) that affect the catalytic function of the protein during oxidative stress. These oxidative stress sensitive proteins were identified by exposure of yeast cells to sublethal concentrations of H2O2 or superoxide. It was shown that the major targets of peroxide- and superoxide-mediated stress in the cell are proteins involved in translation, glycolysis, TCA cycle and amino acid biosynthesis. These targets indicate that cells rapidly redirect the metabolic flux and energy towards the pentose phosphate pathway in an attempt to ensure the production of the reducing equivalent NADPH to counterattack oxidative stress. These results reveal that the quantitative assessment of a protein’s oxidation state is a valuable tool to identify catalytically active and redox-sensitive cysteine residues. The OxICAT technology was then used to precisely determine extent and onset of oxidative stress in chronologically aging S. cerevisiae cells by utilizing the redox status of proteins as physiological read-out. I found that chronological aging yeast cells undergo a global collapse of the cellular redox homeostasis, which precedes cell death. The onset of this collapse appears to correlate with the yeast life span, as caloric restriction increases the life span and delays the redox collapse. These results suggest that maintenance of the redox balance might contribute to the life expanding benefits of regulating the caloric intake of yeast. Clustering analysis of all oxidatively modified proteins in chronological aging yeast revealed a subset of proteins whose oxidative thiol modifications significantly precede the general redox collapse. Oxidation of these early target proteins, which most likely results in a loss of their activity, might contribute to or even cause the observed loss of redox homeostasis (i.e., thioredoxin reductase) in chronologically aging yeast. These studies in aging yeast expand our understanding how changes in redox homeostasis affect the life span of yeast cells and confirm the importance of oxidative thiol modifications as key posttranslational modifications in pro- and eukaryotic organisms. KW - Oxidativer Stress KW - Cystein KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Escherichia coli KW - Wasserstoffperoxid KW - Hyperoxide KW - Sauerstoffradikal KW - Thiolgruppe KW - Altern KW - Oxidation KW - Biologische Oxidation KW - Oxidative Thiol Modifikationen KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Chronologisches Altern KW - Reversibel KW - Posttranslational KW - oxidative thiol modification KW - chronological aging KW - reactive oxygen species KW - Saccharomyces cerevisiae KW - thioredoxin reductase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542 ER -