TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Thielmann, Ina T1 - Function and regulation of phospholipase D in blood platelets: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Funktion und Regulation von Phospholipase D in Thrombozyten: in vitro und in vivo Studien in Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation are crucial for primary hemostasis but can also result in occlusive thrombus formation. Agonist induced platelet activation involves different signaling pathways leading to the activation of phospholipases (PL) which produce second messengers. While the role of PLCs in platelet activation is well established, less is known about the relevance of PLDs. In the current study, the function and regulation of PLD in platelets was investigated using genetic and pharmacological approaches. In the first part of this thesis, adhesion, activation and aggregation of platelets from mice lacking PLD2 or both PLD1 and PLD2 were analyzed in vitro and in vivo. While the absence of PLD2 resulted in slightly reduced PLD activity in platelets, it had no detectable effect on the platelet function in vitro and in vivo. However, the combined deficiency of both PLD isoforms resulted in defective alpha-granule release and protection in a model of ferric chloride induced arteriolar thrombosis, effects that were not observed in mice lacking only one PLD isoform. These results revealed, for the first time, redundant roles of PLD1 and PLD2 in platelet alpha-granule secretion and indicate that this may be relevant for pathological thrombus formation. Thus, PLD might represent a promising target for antithrombotic therapy. Thus, this hypothesis was tested more directly in the second part of this thesis. The effects of pharmacological inhibition of PLD activity on hemostasis, thrombosis and thrombo-inflammatory brain infarction in mice were assessed. Treatment of platelets with the reversible, small molecule PLD inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) led to a specific blockade of PLD activity that was associated with reduced -granule release and integrin activation. Mice that received FIPI at a dose of 3 mg/kg displayed reduced occlusive thrombus formation upon chemical injury of carotid arteries or mesenterial arterioles. Similarly, FIPI-treated mice had smaller infarct sizes and significantly better motor and neurological function 24 hours after transient middle cerebral artery occlusion. This protective effect was not associated with major intracerebral hemorrhage or prolonged tail bleeding times. Thus, pharmacological PLD inhibition might represent a safe therapeutic strategy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. After revealing a central role for PLD in thrombo-inflammation, the regulation of PLD activity in platelets was analyzed in the last part of the thesis. Up to date, most studies made use of inhibitors potentially exerting off-target effects and consequently PLD regulation is discussed controversially. Therefore, PLD activity in mice genetically lacking potential modulators of PLD activity was determined to address these controversies. These studies revealed that PLD is tightly regulated during initial platelet activation. While integrin outside-in signaling and Gi signaling was dispensable for PLD activation, it was found that PLC dependent pathways were relevant for the regulation of PLD enzyme activity. N2 - Zusammenfassung Thrombozytenaktivierung und -aggregation sowie die anschließende Thrombusbildung sind essentielle Prozesse während der primären Hämostase. Andererseits kann unkontrollierte Thrombozytenaktivierung zum Gefäßverschluss und somit zu Schlaganfall oder Herzinfarkt führen. Verschiedene Signalwege, die für die Thrombozytenaktivierung von Bedeutung sind, führen zur Aktivierung von Phospholipasen (PL), die daraufhin sekundäre intrazelluläre Botenstoffe generieren. Während die Rolle von PLCs für die Thrombozytenaktivierung bekannt ist, ist die Relevanz der PLDs noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Regulation von PLD in der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung mittels genetisch veränderter Mäuse. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Adhäsion, Aktivierung und Aggregation von Pld2-/- und Pld1-/-/Pld2-/- Thrombozyten in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von PLD2 zu einer verminderten PLD Aktivität in Thrombozyten führte. Dies hatte allerdings keinen erkennbaren Effekt auf die Funktion der Thrombozyten in vitro und in vivo. Die PLD doppel-defizienten Thrombozyten hingegen wiesen Defekte bei der Sekretion der α-Granula auf, was zur Bildung von instabilen FeCl3-induzierten Thromben in einem in vivo Thrombosemodell führte. Diese Effekte waren in den einzeldefizienten Mäusen nicht vorhanden, was auf redundante Funktionen von PLD1 und PLD2 in diesem Prozess schließen lässt. Interessanterweise wurden keine hämostatischen Defekte durch die Doppeldefizienz hervorgerufen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PLD eine neue potentielle antithrombotische Zielstruktur darstellt. Diese Hypothese wurde im zweiten Teil der Arbeit weiter überprüft. Der Effekt einer PLD Hemmung durch den reversiblen PLD Inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) auf Hämostase und Thrombose wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit FIPI zu einer spezifischen Blockade von PLD führte, die die alpha-Degranulierung und Integrinaktivierung, im ähnlichen Ausmaß wie in den doppeldefizienten Mäusen, beeinträchtigte. Des Weiteren zeigten Mäuse, die mit 3 mg/kg FIPI behandelt wurden, starke Defekte in der arteriellen Thrombusbildung in Makro- und Mikrogefäßen. FIPI vermittelte PLD Inhibition führte außerdem zu einem Schutz der Mäuse in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls, ohne intrazerebrale Blutungen hervorzurufen. Diese Ergebnisse etablieren FIPI als potentiellen antithrombotischen Wirkstoff für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Da PLD eine zentrale Rolle während der Thrombusbildung hat, wurde im letzten Teil der Arbeit auf die Regulation von PLD während der Thrombozytenaktivierung eingegangen. Bisherige Studien verwendeten häufig Inhibitoren, die zu unspezifischen Effekten führen können. Daher wird die Regulation von PLD in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Untersuchung der PLD Aktivität in verschiedenen knockout Mauslinien stellt einen nützlichen Ansatz dar, um die kontrovers diskutierte PLD Regulation aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde die PLD Aktivität in genetisch veränderten Mäusen, denen potentielle Regulatoren von PLD fehlen, gemessen. Im Zuge diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass integrinabhängige- und Gi-vermittelte Signalwege keinen Einfluss auf die Regulation von PLD hatten, während PLC vermittelte Signale von Bedeutung waren. KW - Phospholipase D KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Schlaganfall KW - Hämsotase KW - Phospholipase D KW - Thrombose KW - Hämostase KW - Schlaganfall KW - Blutstillung KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99179 ER -