TY - THES A1 - Gerold, Kay T1 - CTLA4 and CLEC16A in Type 1 Diabetes - Looking behind the association T1 - CTLA4 und CLEC16A in Typ 1 Diabetes - Ein Blick hinter die Assoziation N2 - Type 1 diabetes is an autoimmune disease that leads to the destruction of insulin-producing pancreatic beta cells and consequently to hyperglycemia. In the last 60 years, the prevalence of type 1 diabetes has been increasing constantly and is predicted to continue rising. About 80% of the disease risk is attributable to the genetic variation. Thanks to genome wide association studies the number of known disease-associated polymorphisms climbed from five to 53 in the last 10 years. As these studies reveal possible candidate genes but not underlying mechanisms we strove to take the next step and explore the association of two genes suggested by these studies with type 1 diabetes. As a method of choice we decided to use lentiviral RNAi in non obese diabetic (NOD) mice, a widely-used model for type 1 diabetes, introducing a shRNA directed against the target message into the genome of this mouse strain via a lentivirus. This allowed us to study the partial loss-of-function of the target gene within the context of diabetes, directly seeing its effect on autoimmune mechanisms. In this thesis we examined two different genes in this manner, Ctla4 and Clec16a. A type 1 diabetes associated polymorphism in the CTLA4 gene had been found to alter the splicing ratio of its variants soluble CTLA-4 (sCTLA-4) and full length CTLA-4, the associated allele producing less sCTLA-4 than the protective allele. We mimicked this effect by specifically targeting the sCtla4 mRNA via lentiviral RNAi in the NOD model. As a result we could confirm the reduction of sCTLA-4 to accelerate type 1 diabetes development. Furthermore we could show a function of sCTLA-4 in regulatory T cells, more specifically at least partly in their ability to modulate costimulation by antigen presenting cells. The second candidate gene, Clec16a was targeted with the shRNA in a way that was designed to knock down most splice variants. As the gene function and the effect of the associated SUMMARY 10 polymorphism was unknown, we reasoned this method to be feasible to investigate its role in type 1 diabetes. The knockdown of Clec16a in NOD mice resulted in an almost complete protection from diabetes development that could be attributed to T cells dysfunction. However, as expression patterns and a study of the Drospophila orthologue suggested a possible role of CLEC16A in antigen presentation we also examined antigen presenting cells in the thymus and periphery. Although we did not detect any effect of the knockdown on peripheral antigen presenting cells, thymic epithelial cells were clearly affected by the loss of CLEC16A, rendering them more activated and shifting the ratio of cortical to medullary epithelial cells in favor of cortical cells. We therefore suggest a role of CLEC16A in the selection of T cells, that needs, however, to be further investigated. In this thesis we provided a feasible and fast method to study function of genes and even of single splice variants within the NOD mouse model. We demonstrate its usefulness on two candidate genes associated with type 1 diabetes by confirming and unraveling the cause of their connection to the disease. N2 - Typ 1 Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, bei der es zur Zerstörung von pankreatischen beta-Zellen und daraus folgend zu einer Hyperglykämie kommt. In den letzten 60 Jahren stieg die Diabetes Prävalenz stetig an und Studien sagen voraus, dass sich dieser Trend in Zukunft noch stärker fortsetzen wird. Man geht davon aus, dass ca. 80% des Erkrankungsrisikos für autoimmunen Diabetes genetischer Natur sind. Dank Genom-weiter Assoziationsstudien wurde dieser Beitrag gerade in den letzten zehn Jahren immer weiter aufgeklärt und bis heute wurden 53 mit Typ 1 Diabetes assozierte Polymorphismen identifiziert. Da diese Studien es nur leisten können, mögliche Kandidatengene aufzuzeigen, allerdings keine Aussagen über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen machen können, haben wir es uns zum Ziel gesetzt diesen nächsten Schritt zu gehen und zwei der durch diese Studien vorgeschlagenen Gene auf ihre Rolle in der Typ 1 Diabetes Ätiologie zu untersuchen. Unsere Methode der Wahl war die lentivirale RNA Interferenz im Mausmodell der nonobese diabetic mouse (NOD). Via lentiviralen Vektoren wird die Information für eine shRNA, die an die mRNA des Zielgenes bindet, in das Empfängergenom integriert. Die daraus folgende Herabregulierung der Ziel-mRNA erlaubt es uns den Effekt dieser fehlenden Geninformation auf die Immunregulation zu analysieren. Auf diese Weise wurden in dieser Thesis zwei Kandidatengene untersucht, Ctla4 und Clec16a. Der mit Typ 1 Diabetes assoziierte Polymorphismus im CTLA4 Gen verursacht eine Verschiebung im Splice Verhältnis der beiden Isoformen im Menschen, soluble CTLA-4 (sCTLA-4) und full length CTLA-4, zu Gunsten der full length Variante. Im NOD Mausmodell konnte diese Verschiebung durch eine Einführung einer gegen sCtla4 gerichteten shRNA nachgeahmt werden. In Folge dessen konnten wir bestätigen, dass eine eduzierung der sCTLA-4 Variante die Typ 1 Diabetes Entwicklung beschleunigt. Zudem ZUSAMMENFASSUNG 12 konnten wir eine Rolle von sCTLA-4 in der Funktion von regulatorischen T Zellen, genauer in deren Fähigkeit die Kostimulation durch Antigen präsentierenden Zellen zu modulieren, zeigen. Bei dem zweiten Gen, das in dieser Thesis untersucht wurde handelte sich um Clec16a. Es wurde von einer shRNA herunterreguliert, die den Großteil der Varianten abdeckt, da die Funktion des Genes, sowie die Auswirkungen des assoziierten Polymorphismus unbekannt waren. Der Knockdown von Clec16a in der NOD Maus verursachte einen fast vollständigen Schutz vor Diabetes, der im weiteren Verlauf den T Zellen zugerechnet werden konnte. Allerdings hatten das Expressionsmuster, sowie eine Studie am Drosophila Ortholog ema eine Rolle von CLEC16A in Antigen präsentierenden Zellen impliziert. Folglich untersuchten wir die Möglichkeit, dass diese Zellgruppe in der Peripherie oder im Thymus durch den CLEC16A Mangel beeinträchtigt sein könnten. Tatsächlich wies die Zellgruppe, die im Thymus für die Selektion von T Zellen zuständig ist einen erhöhten Aktivierungsstatus auf, was auf eine modifizierte T Zell Selektion hindeuten könnte. Mit dieser Arbeit konnten wir eine praktikable und schnelle Methode, für die funktionelle Analyse von Genen und sogar einzelnen Splice Varianten, aufzeigen. Wir konnten ihren Nutzen weiterhin an zwei mit Typ 1 Diabetes assoziierten Kandidatengenen unter Beweis stellen, indem wir so die Assoziation bestätigen und Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen werfen konnten. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - Molekulargenetik KW - Type 1 Diabetes Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66617 ER - TY - THES A1 - Roth, Heide Marie T1 - Nucleotide Excision Repair: From Recognition to Incision of damaged DNA T1 - Nukleotid-Exzisions-Reparatur: Vom Erkennen zum Schneiden der geschädigten DNA N2 - The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is able to remove a vast diversity of structurally unrelated DNA lesions and is the only repair mechanism in humans responsible for the excision of UV induced DNA damages. The NER mechanism raises two fundamental questions: 1) How is DNA damage recognition achieved discriminating damaged from non damaged DNA? 2) How is DNA incision regulated preventing endonucleases to cleave DNA non specifically but induce and ensure dual incision of damaged DNA? Thus, the aim of this work was to investigate the mechanisms leading from recognition to incision of damaged DNA. To decipher the underlying process of damage recognition in a prokaryotic model system, the intention of the first part of this work was to co crystallize the helicase UvrB form Bacillus caldotenax together with a DNA substrate comprising a fluorescein adducted thymine as an NER substrate. Incision assays were performed to address the question whether UvrB in complex with the endonuclease UvrC is able to specifically incise damaged DNA employing DNA substrates with unpaired regions at different positions with respect to the DNA lesion. The results presented here indicate that the formation of a specific pre incision complex is independent of the damage sensor UvrA. The preference for 5’ bubble substrate suggests that UvrB is able to slide along the DNA favorably in a 5’ → 3’ direction until it directly encounters a DNA damage on the translocating strand to then recruit the endonuclease UvrC. In the second part of this work, the novel endonuclease Bax1 from Thermoplasma acidophilum was characterized. Due to its close association to archaeal XPB, a potential involvement of Bax1 in archaeal NER has been postulated. Bax1 was shown to be a Mg2+ dependent, structure specific endonuclease incising 3’ overhang substrates in the single stranded region close to the ssDNA/dsDNA junction. Site directed mutagenesis of conserved amino acids was employed to identify putative active site residues of Bax1. In complex with the helicase XPB, however, incision activity of Bax1 is altered regarding substrate specificity. The presence of two distinct XPB/Bax1 complexes with different endonuclease activities indicates that XPB regulates Bax1 incision activity providing insights into the physical and functional interactions of XPB and Bax1. N2 - Die Nukleotid-Exzisions-Reparatur (NER) ist in der Lage, eine Vielfalt an strukturell unterschiedlichen DNA Schädigungen zu entfernen, und ist überdies der einzige DNA-Reparaturmechanismus im Menschen, der UV induzierte DNA-Schädigungen entfernen kann. Der NER Mechanismus impliziert zwei grundlegende Fragen: 1) Wie wird geschädigte DNA erkannt und worauf gründet sich die Unterscheidung zwischen geschädigter und nicht geschädigter DNA? 2) Wie wird das Schneiden der DNA reguliert? Wie wird unspezifisches Schneiden verhindert und sichergestellt, dass die geschädigte DNA auf beiden Seiten der Schädigung herausgeschnitten wird? Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die Mechanismen zu untersuchen, die vom Erkennen zum Herausschneiden geschädigter DNA führen. Um im bakteriellen Modelsystem den zugrundeliegenden Prozess der Schadenserkennung zu entschlüsseln, sollte im ersten Teil dieser Arbeit die Helikase UvrB aus Bacillus caldotenax zusammen mit einem geschädigten DNA Substrat kristallisiert werden. Als Schädigung wurde ein Fluorescein-Molekül genutzt, das an eine Thymin-Base gekoppelt wurde. Biochemische Experimente wurden durchgeführt um herauszufinden, ob UvrB im Komplex mit der Endonuklease UvrC spezifisch geschädigte DNA schneiden kann. Dafür wurden DNA-Substrate eingesetzt, die ungepaarte Basen an verschiedenen Stellen bezüglich der DNA-Schädigung enthielten. Die hier gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein spezifischer Komplex gebildet werden kann, der auch unabhängig von dem Schadenssensor UvrA zum Schneiden der DNA befähigt ist. Die Schnitt-Präferenz für die 5‘ ungepaarte Region lässt vermuten, dass UvrB bevorzugt in 5‘→3‘ Richtung an der DNA entlanggleiten kann. Sobald UvrB auf eine Schädigung auf diesem DNA Strang trifft, wird die Endonuklease UvrC rekrutiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die neuartige Endonuklease Bax1 aus Thermoplasma acidophilum charakterisiert. Aufgrund der engen Assoziation zu archaischem XPB wurde eine Beteiligung an der archaischen NER postuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Bax1 eine Mg2+ abhängige, strukturspezifische Endonuklease ist, die 3‘-Überhang Substrate im Einzelstrangbereich nahe des Einzelstrang/Doppelstrang Überganges schneidet. Konservierte Aminosäuren wurden gezielt verändert, um diejenigen Reste zu identifizieren, die möglicherweise das aktive Zentrum bilden. Im Komplex mit der Helikase XPB veränderte sich jedoch das Schneideverhalten im Hinblick auf die Substratspezifizität. Die Existenz von zwei verschiedenen XPB/Bax1 Komplexen mit unterschiedlicher Aktivität bezüglich des Schnittverhaltens könnte darauf hinweisen, dass XPB Bax1 reguliert. Diese Beobachtung erlaubt zugleich Einblicke in die Interaktion von XPB und Bax1 auf physikalischer und funktioneller Ebene. KW - DNS-Reparatur KW - Nucleasen KW - Helicasen KW - Archaebakterien KW - DNA Repair KW - Nuclease KW - Helicase KW - Archaea Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57098 ER - TY - THES A1 - Salvador, Ellaine Riciel P. T1 - Characterization of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Isolates: virulence traits and host-pathogen interactions T1 - Charakterisierung der Virulenzeigenschaften und Wirt-Pathogen-Interaktionen von asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolaten N2 - Urinary tract infection (UTI) is one of the most serious health problems worldwide. It accounts for a million hospital visits annually in the United States. Among the many uropathogenic bacteria, uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the most common causative agent of UTI. However, not all E. coli that inhabit the urinary tract can cause UTI. Some of them thrive for long periods of time in the urinary bladder without causing overt symptoms of infection. This carrier state is called asymptomatic bacteriuria (ABU). E. coli ABU isolates can live in the host without inducing host response due to deletions, insertions and point mutations in the genome leading to the attenuation of virulence genes. They therefore behave in the same way as commensals. Since bacteria that inhabit the urinary tract are said to originate from the lower intestinal tract and ABU behave in a similar way as commensals, this study compared various phenotypic and genotypic characteristics of ABU and commensal E. coli fecal isolates. The two groups did not show a strict clustering with regards to phylogenetic lineage since there appears to be overlaps in their distribution in some clonal complexes. In addition, it was observed that the UPEC virulence genes were more frequently inactivated in ABU than in fecal isolates. Hence, ABU tend to have less functional virulence traits compared to the fecal isolates. The ABU model organism E. coli 83972 which is known not only for its commensal behavior in the urinary bladder but its ability to outcompete other bacteria in the urinary tract is currently being used as prophylactic treatment in patients who have recurrent episodes of UTI at the University Hospital in Lund, Sweden. The pilot studies showed that upon deliberate long-term colonization of the patients with E. coli 83972, they become protected from symptomatic UTI. In this study, the phenotypic and genotypic characteristics of eight re-isolates taken from initially asymptomatically colonized patients enrolled in the deliberate colonization study who reported an episode of symptoms during the colonization period were investigated. Two out of the eight re-isolates were proven to be a result of super infection by another uropathogen. Six re-isolates, on the other hand, were E. coli 83972. The urine re-isolates confirmed to be E. coli 83972 were phenotypically heterogeneous in that they varied in colony size as well as in swarming motility. Four of these re-isolates were morphologically homogenous and similar to the parent isolate E. coli 83972 whereas one of them appeared phenotypically heterogenous as a mixture of smaller and normal-sized colonies. Still another re-isolate phenotypically resembled small colony variants. Meanwhile, three of the six re-isolates did not differ from the parent isolate with regards to motility. On the other hand, three exhibited a markedly increased motility compared to the parent isolate. Transcriptome analysis demonstrated the upregulation of a cascade of genes involved in flagellar expression and biosynthesis in one of the three motile re-isolates. However, upon further investigation, it was found out that the expression of flagella had no effect on bacterial adhesion to host cells in vitro as well as to the induction of host inflammatory markers. Thus, this implies that the increased motility in the re-isolates is used by the bacteria as a fitness factor for its benefit and not as a virulence factor. In addition, among the various deregulated genes, it was observed that gene regulation tends to be host-specific in that there is no common pattern as to which genes are deregulated in the re-isolates. Taken together, results of this study therefore suggest that the use of E. coli 83972 for prophylactic treatment of symptomatic UTI remains to be very promising. N2 - Harnwegsinfektionen (HWI) sind weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem, auf welches allein in den USA jährlich ca. eine Million Krankenhausbesuche entfallen. Innerhalb der Gruppe uropathogener Bakterien stellen die uropathogenen Escherichia coli (UPEC) die wichtigsten Verursacher akuter Harnwegserkrankungen dar. Interessanterweise führen nicht alle E. coli Varianten, die den Harnweg besiedeln, zwangsläufig zu HWI. Einige von ihnen sind in der Lage, die Harnblase über einen langen Zeitraum zu kolonisieren ohne Symptome einer HWI auszulösen. Dieses Phänomen wird als asymptomatische Bakteriurie (ABU) bezeichnet. Die Eigenschaft von E. coli ABU-Isolaten innerhalb des Wirtsorganismus leben zu können, ohne eine deutliche Wirtsabwehrreaktion hervorzurufen, ist unter anderem bedingt durch Deletionen, Insertionen und Punktmutationen im bakteriellen Genom und der daraus resultierenden Inaktivierung einiger Virulenzgene. Ihre Lebensweise ist daher mit der kommensaler Organismen vergleichbar. Da die den Harnweg besiedelnden Bakterien mit hoher Wahrscheinlichkeit ihren Ursprung im unteren Darmtrakt haben und sich die ABU-Isolate ähnlich der Kommensalen verhalten, wurden in dieser Arbeit zahlreiche phäno- und genotypische Charakteristika von ABU-Isolaten mit denen kommensaler E. coli-Fäkalisolate verglichen. Für diese beiden Gruppen konnte hinsichtlich ihrer phylogenetischen Abstammung keine strikte Clusterbildung festgestellt werden, da ihre Verteilung in einigen klonalen Komplexen Überlappungen aufwies. Es zeigte sich jedoch, dass die UPEC-Virulenzgene in den ABU-Isolaten häufiger inaktiviert vorlagen als in den Fäkalisolaten. Demzufolge scheinen die ABU-Isolate weniger funktionale Virulenzeigenschaften zu besitzen als die Fäkalisolate. Der Modell-ABU Stamm E. coli 83972 ist sowohl für sein kommensales Verhalten in der menschlichen Blase bekannt, als auch für seine Fähigkeit, andere Bakterien aus dem Harntrakt zu verdrängen. Er wird gegenwärtig am Universitätsklinikum in Lund (Schweden) als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von Patienten mit rezidivierenden HWI eingesetzt. In Pilotstudien konnte gezeigt werden, dass eine vorsätzliche Langzeit-Kolonisierung von Patienten mit E. coli 83972 zum Schutz vor symptomatischen HWI führt. In der vorliegenden Arbeit wurden die phäno- und genotypischen Charakteristika von acht Patienten-Reisolaten dieser Langzeitstudie untersucht. Die Reisolate wurden aus zunächst asymptomatisch kolonisierten Patienten isoliert, die allerdings im Verlauf der Langzeit-Kolonisierung über eine Reihe von Symptomen klagten. Zwei dieser acht Reisolate waren nachweislich das Resultat einer Superinfektion mit einem anderen uropathogenen Bakterium. Die restlichen sechs Reisolate konnten jedoch als E. coli 83972 identifiziert werden. Für diese sechs Reisolate war eine phänotypische Heterogenität zu beobachten, die sich zum einen in variierender Koloniegröße, zum anderen in unterschiedlichem Schwärmverhalten zeigte: Vier der Reisolate entsprachen morphologisch dem Ausgangsstamm E. coli 83972, wohingegen ein Reisolat phänotypisch abweichend als Mischung von kleineren und normal-großen Kolonien in Erscheinung trat. Ein weiteres Reisolat ähnelte phänotypisch sogenannten „Small Colony Variants“. Das Schwärmverhalten betreffend unterschieden sich indessen drei der sechs Reisolate vom Ausgangsstamm. Sie zeigten im Vergleich eine erhöhte Motilität. In einem dieser drei motilen Reisolate konnte mittels Transkriptomanalyse die hochregulierte Expression einer Reihe von Genen, welche für die Flagellenexpression und -biosynthese verantwortlich sind, aufgezeigt werden. Weiterführende in vitro-Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese erhöhte Flagellenexpression weder einen verstärkenden Effekt auf die bakterielle Adhäsion an die Wirtszellen hat, noch in der Wirtszelle die Bildung von Entzündungsmarkern induziert. Dieses Ergebnis impliziert, dass die erhöhte Motilität der Reisolate als Fitnessfaktor und nicht als Virulenzfaktor zu betrachten ist. Ferner führte die genauere Analyse der deregulierten Gene zu der Annahme, dass die Genregulation in den Reisolaten wirtsspezifisch ist, da sich kein übereinstimmendes Muster bezüglich der Deregulation abzeichnete. Unter Berücksichtigung aller Ergebnisse dieser Studie lässt sich abschließend sagen, dass die Verwendung des E. coli Stammes 83972 als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von symptomatischen HWI weiterhin als sehr vielversprechend angesehen werden kann. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Virulenz KW - Escherichia coli KW - Urinary tract infection KW - asymptomatic bacteriuria Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71283 ER - TY - THES A1 - Simon, Christian Marc T1 - Effects of the neurotrophic factors CNTF and IGF-1 in mouse models for spinal muscular atrophy and diabetic neuropathy T1 - Effekte der neurotrophen Faktoren CNTF und IGF-1 in Mausmodellen für spinale Muskelatrophie und diabetische Neuropathie N2 - In this study I investigate the role of Schwann cell and axon-derived trophic signals as modifiers of axonal integrity and sprouting in motoneuron disease and diabetic neuropathy (DNP). The first part of this thesis focuses on the role of the Schwann-cell-derived ciliary neurotrophic factor (CNTF) for compensatory sprouting in a mouse model for mild spinal muscular atrophy (SMA). In the second part, the role of the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and its binding protein 5 (IGFBP-5) is examined in the peripheral nerves of patients with DNP and in two corresponding mouse models. Proximal SMA is caused by homozygous loss or mutation of the SMN1 gene on human chromosome 5. The different forms of SMA can be divided into four groups, depending on the levels of SMN protein produced from a second SMN gene (SMN2) and the severity of the disease. Patients with milder forms of the disease, type III and type IV SMA, normally reach adulthood and regularly show enlargement of motor units, signifying the reinnervation of denervated muscle fibers. However, the underlying mechanisms are not understood. Smn+/- mice, a model of type III/IV SMA, are phenotypically normal, but they reveal progressive loss of motor neurons and denervation of motor endplates starting at 4 weeks of age. The progressive loss of spinal motor neurons reaches 50% at 12 months but muscle strength is not reduced. The first evidence for axonal sprouting as a compensatory mechanism in these animals was the more than 2-fold increase in amplitude of single motor unit action potentials (SMUAP) in the gastrocnemius muscle. Confocal analysis confirmed pronounced sprouting of innervating motor axons. As CNTF is highly expressed in Schwann cells and known to be involved in sprouting, its role for this compensatory sprouting response and the maintenance of muscle strength in Smn+/- mice was investigated. Deletion of CNTF in this mouse model results in reduced sprouting and decline of muscle strength in Smn+/- Cntf-/- mice. These findings indicate that CNTF is necessary for a sprouting response and thus enhances the size of motor units in skeletal muscles of Smn+/- mice. DNP afflicting motor and sensory nerve fibers is a major complication in diabetes mellitus. The underlying cellular mechanisms of motor axon degeneration are poorly understood. IGFBP-5, an inhibitory binding protein for IGF-1, is highly upregulated in peripheral nerves in patients with DNP. The study investigates the pathogenic relevance of this finding in transgenic mice overexpressing IGFBP-5 in motor axons. These mice develop motor axonopathy similar to that seen in DNP. Motor axon degeneration is also observed in mice in which the IGF-1 receptor (IGF-1R) was conditionally depleted in motoneurons, indicating that reduced activity of IGF-1 on IGF-1R in motoneurons is responsible for the observed effect. These data provide evidence that elevated expression of IGFBP-5 in diabetic nerves reduces the availability of IGF-1 for IGF-1R on motor axons leading to progressive neurodegeneration, and thus offers novel treatment strategies. N2 - In dieser Arbeit habe ich die Rolle der neurotrophen Faktoren Ciliary neurotrophic factor (CNTF) und Insulin-like-growth factor 1 (IGF-1), die in Schwannzellen gebildet werden, als Modulatoren der axonalen Integrität bei einer degenerativen Motoneuronenerkrankung und bei diabetischer Neuropathie (DNP) untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass CNTF für ein kompensatorisches Sprouting von motorischen Axonen in einem Mausmodell für spinale Muskelatrophie (SMA) verantwortlich ist. Im zweiten Teil wird die Rolle von IGF-1 und dessen Bindeprotein, IGFBP-5, in Axonen motorischer Nerven bei Patienten mit DNP und zwei korrespondieren Mausmodellen gezeigt. Die proximale SMA wird durch einen homozygoten Verlust oder Mutation des SMN1 Gens auf dem Chromosom 5 verursacht. Bei der spinalen Muskelatrophie unterscheidet man verschiedene Schweregrade, abhängig von der Menge an SMN Protein, das vom zweiten SMN Gen (SMN2) produziert werden kann. Patienten mit einer milderen Form von SMA (Typ III und IV) erreichen das Erwachsenenalter und zeigen oft vergrößerte motorische Einheiten, im Gegensatz zu Patienten mit den schweren kindlichen Formen der Erkrankung. Smn+/- Mäuse, ein Modell für die leichten SMA Formen Typ II und IV, zeigen denervierte Endplatten bereits 4 Wochen nach der Geburt und einen fortschreitenden Verlust von Motoneuronen, der nach 12 Monaten mehr als 50% beträgt, ohne dass sich die Muskelkraft der Tiere verringert. Die Amplitude der Summenpotenziale von einzelnen motorischen Einheiten (Single motor unit action potential, SMUAP) im Wadenmuskel ist mehr als 2-fach erhöht. Konfokale Aufnahmen bestätigen ausgeprägtes Sprouting der noch innervierenden Axone. Smn+/- Mäuse ohne CNTF, das normalerweise stark in Schwann-Zellen exprimiert ist, zeigen reduziertes Sprouting und verringerte Muskelkraft. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass CNTF für das Sprouting und die vergrößerten motorischen Einheiten in Smn+/- Mäusen verantwortlich ist. Dieser kompensatorische Mechanismus könnte neue Behandlungs-möglichkeiten für Motoneuronerkrankungen eröffnen. Die Diabetische Neuropathie (DNP), eine der Hauptkomplikationen bei Diabetes Mellitus, betrifft sowohl motorische als auch sensorische Nervenfasern. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, die zur Degeneration motorischer Axone in Spätstadien der Erkrankung führen, sind größtenteils noch ungeklärt. IGFBP-5, ein IGF-1 hemmendes Bindeprotein, ist in peripheren Nervbiopsien von DNP Patienten stark überexprimiert. Diese potenzielle pathogene Relevanz wurde bei IGFBP-5 überexprimierenden transgenen Mäusen untersucht. Diese Mäuse entwickeln ähnlich wie die DNP Patienten eine motorische Axonopathie. Diese Axondegeneration zeigen auch Mäuse, bei denen der IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) neuronenspezifisch ausgeschaltet wurde. Das bedeutet, dass reduzierte Wirkung von IGF-1 am IGF-1R auf Axonen von Motoneuronen für die beobachtete Axonopathie verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass erhöhtes IGFBP-5 in diabetischen Nerven die Verfügbarkeit von IGF-1 für den IGF-1R reduziert und zu progressiver Neurodegeneration führt. Diese Erkenntnis könnte neue Behandlungsstrategien für Patienten mit DNP eröffnen. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Ciliary neurotrophic factor KW - Insulin-like-Growth-Factor-Binding-Protein-5 KW - Diabetische Polyneuropathie KW - Insulin-like Growth KW - Spinal muscular atrophy KW - Ciliary neurotrophic factor KW - Insulin-like-Growth-Factor-Binding-Protein-5 KW - Diabetic polyneuropathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70207 ER - TY - THES A1 - Sareen, Preeti T1 - Visual attention in Drosophila melanogaster T1 - Visuelle Aufmerksamkeit bei Drosophila melanogaster N2 - There is such vast amount of visual information in our surroundings at any time that filtering out the important information for further processing is a basic requirement for any visual system. This is accomplished by deploying attention to focus on one source of sensory inputs to the exclusion of others (Luck and Mangun 2009). Attention has been studied extensively in humans and non human primates (NHPs). In Drosophila, visual attention was first demonstrated in 1980 (Wolf and Heisenberg 1980) but this field remained largely unexplored until recently. Lately, however, studies have emerged that hypothesize the role of attention in several behaviors but do not specify the characteristic properties of attention. So, the aim of this research was to characterize the phenomenon of visual attention in wild-type Drosophila, including both externally cued and covert attention using tethered flight at a torque meter. Development of systematic quantifiable behavioral tests was a key aspect for this which was not only important for analyzing the behavior of a population of wild-type flies but also for comparing the wild-type flies with mutant flies. The latter would help understand the molecular, genetic, and neuronal bases of attention. Since Drosophila provides handy genetic tools, a model of attention in Drosophila will serve to the greater questions about the neuronal circuitry and mechanisms involved which might be analogous to those in primates. Such a model might later be used in research involving disorders of attention. Attention can be guided to a certain location in the visual field by the use of external cues. Here, using visual cues the attention of the fly was directed to one or the other of the two visual half-fields. A simple yet robust paradigm was designed with which the results were easily quantifiable. This paradigm helped discover several interesting properties of the cued attention, the most substantial one being that this kind of external guidance of attention is restricted to the lower part of the fly’s visual field. The guiding cue had an after-effect, i.e. it could occur at least up to 2 seconds before the test and still bias it. The cue could also be spatially separated from the test by at least 20° and yet attract the attention although the extent of the focus of attention (FoA) was smaller than one lower visual half-field. These observations excluded the possibility of any kind of interference between the test and the cue stimuli. Another interesting observation was the essentiality of continuous visibility of the test stimulus but not the cue for effective cuing. When the contrast of the visual scene was inverted, differences in response frequencies and cuing effects were observed. Syndirectional yaw torque responses became more frequent than the antidirectional responses and cuing was no longer effective in the lower visual field with inverted contrast. Interestingly, the test stimulus with simultaneous displacement of two stripes not only effectuated a phasic yaw torque response but also a landing response. A 50 landing response was produced in more than half of the cases whenever a yaw torque response was produced. Elucidation of the neuronal correlates of the cued attention was commenced. Pilot experiments with hydroxyurea (HU) treated flies showed that mushroom bodies were not required for the kind of guidance of attention tested in this study. Dopamine mutants were also tested for the guidance of attention in the lower visual field. Surprisingly, TH-Gal4/UAS-shits1 flies flew like wild-type flies and also showed normal optomotor response during the initial calibration phase of the experiment but did not show any phasic yaw torque or landing response at 18 °C, 25 °C or 30 °C. dumb2 flies that have almost no D1 dopamine receptor dDA1 expression in the mushroom bodies and the central complex (Kim et al. 2007) were also tested and like THGal4/ UAS-shits1 flies did not show any phasic yaw torque or landing response. Since the dopamine mutants did not show the basic yaw torque response for the test the role of dopamine in attention could not be deduced. A different paradigm would be needed to test these mutants. Not only can attention be guided through external cues, it can also be shifted endogenously (covert attention). Experiments with the windows having oscillating stripes nicely demonstrated the phenomenon of covert attention due to the production of a characteristic yaw torque pattern by the flies. However, the results were not easily quantifiable and reproducible thereby calling for a more systematic approach. Experiments with simultaneous opposing displacements of two stripes provide a promising avenue as the results from these experiments showed that the flies had a higher tendency to deliver one type of response than when the responses would be produced stochastically suggesting that attention increased this tendency. Further experiments and analysis of such experiments could shed more light on the mechanisms of covert attention in flies. N2 - Zu jedem Zeitpunkt stellt unsere Umgebung eine so große Menge an visueller Information zur Verfügung, dass das Herausfiltern der wichtigen Informationen für eine weitere Verarbeitung eine grundlegende Herausforderung für jedes komplexe visuelle System darstellt. Bewerkstelligt wird dies u.a. mittels der selektiven Aufmerksamkeit, die die sensorischen Inputs einer Quelle, unter Ausschluss aller anderen, hervorhebt (Luck und Mangun 2009). Aufmerksamkeit wurde an Menschen und nichtmenschlichen Primaten bereits ausgiebig untersucht. Visuelle Aufmerksamkeit bei Drosophila konnte 1980 zum ersten Mal nachgewiesen werden (Wolf und Heisenberg 1980), jedoch blieb dieses Feld bis heute großen Teils unerforscht. In jüngster Zeit tauchten Studien auf, die der Aufmerksamkeit eine Rolle bei verschiedenen Verhaltensleistungen zuweisen, ohne jedoch die charakteristischen Eigenschaften von Aufmerksamkeit zu spezifizieren. Es ist das Ziel dieser Arbeit, das Phänomen der sowohl durch externe Reize ausgelösten, als auch endogen erzeugten (covert attention) visuellen Aufmerksamkeit bei wildtypischen Drosophila im stationären Flug am Drehmoment-Messgerät zu charakterisieren. Hierbei ist ein wesentlicher Aspekt durch die Entwicklung von quantitativen Tests das Verhalten von wildtypischen Fliegen so zu analysieren, dass es mit dem Verhalten genetischer Varianten verglichen werden kann. Ein solcher Vergleich würde helfen, die molekularen, genetischen und neuronalen Grundlagen der Aufmerksamkeit zu verstehen, da bei Drosophila für solche Untersuchungen einfach anwendbare genetische Werkzeuge zur Verfügung stehen. Ein Modell der Aufmerksamkeit bei Drosophila könnte auch für die visuelle Aufmerksamkeit bei Primaten relevant sein, falls diese Systeme homolog sind, d.h. in der Stammesgeschichte einen gemeinsamen Ursprung haben. Mittels äußerer Reize lässt sich die Aufmerksamkeit auf einen bestimmten Ort im visuellen Feld führen. In dieser Arbeit wird die Aufmerksamkeit einer Fliege durch visuelle Reize auf jeweils eines der beiden visuellen Halbfelder gelenkt. Es wird ein einfaches und robustes Paradigma entwickelt, dessen Ergebnisse ohne viel Aufwand quantifizierbar sind. Eine wesentliche Eigenschaft der exogen gelenkten visuellen Aufmerksamkeit, zu deren Entdeckung dieses Paradigma unter anderen beigetragen hat, ist, dass diese Art der Lenkung der Aufmerksamkeit auf den unteren Teil des visuellen Feldes der Fliege beschränkt ist. Der lenkende Reiz hat einen Nacheffekt, das heißt, er kann bis zu zwei Sekunden vor dem Test auftreten und dessen Ergebnis trotzdem beeinflussen. Auch bei einer räumlichen Trennung des Reizes vom Test um mindestens 20° kann er noch die Aufmerksamkeit auf diesen ziehen, wobei hier dann die Ausdehnung des Aufmerksamkeitsfeldes kleiner als ein unteres visuelles Halbfeld 52 ist. Durch diese Beobachtungen wird eine mögliche Interferenz zwischen Reiz und Test ausgeschlossen. Eine weitere interessante Beobachtung ist, dass für ein effektives Lenken der Aufmerksamkeit der Teststimulus aber nicht der lenkende Reiz durchgehend sichtbar sein muss. Eine Invertierung des Kontrastes der visuellen Reizgebung führt zu veränderten Antwortfrequenzen und Effekten der Aufmerksamkeitslenkung. So treten syndirektionale Drehmoment-Antworten häufiger auf als antidirektionale und die Lenkung der Aufmerksamkeit im unteren visuellen Feld durch einen vorhergehenden Reiz tritt nicht auf. Interessanterweise kann der Teststimulus, die simultane Verschiebung zweier Streifen nicht nur eine phasische Drehmoment-Antwort, sondern auch einen Landeversuch auslösen. Dieser wird in mehr als der Hälfte aller Fälle, in denen eine Drehmomentantwort gezeigt wird, beobachtet. Eine Untersuchung der neuronalen Korrelate der reizgelenkten Aufmerksamkeit wurde begonnen. In Pilotexperimenten mit Fliegen, die mit Hydroxyharnstoff (HU) behandelt worden waren, zeigte sich, dass die adulten Pilzkörper nicht für diese Art der Lenkung der Aufmerksamkeit, wie sie in der vorliegenden Arbeit untersucht wird, benötigt werden. Des weiteren wurden auch Fliegenmutanten mit Defekten im Dopamin-System getestet. Überraschenderweise flogen TH-Gal4/UAS-shits1 Fliegen wie wildtypische Fliegen und zeigten auch ein normales optomotorisches Verhalten während der anfänglichen Kalibrierungsphase des Experimentes. Sie zeigten jedoch weder phasische Drehmoment-Antworten noch Landeversuche bei 18°C, 25°C oder 30°C. Auch dumb2 Fliegen, die so gut wie keine D1 Dopaminrezeptoren in den Pilzkörpern und im Zentralkomplex exprimieren (Kim et al. 2007), zeigten die gleichen Verhaltensdefekte wie TH-Gal4/UAS-shits1 -Fliegen. Da bei den Dopaminmutanten die phasische Drehmomentantwort fehlte, konnte die Bedeutung von Dopamin für Aufmerksamkeit aus diesem Test nicht abgeleitet werden. Um diese Mutanten zu testen, bedarf es eines anderen Paradigmas. Die Richtung der Aufmerksamkeit kann nicht nur durch äußere Reize gelenkt, sondern auch endogen verändert werden (covert attention). Experimente mit zwei oszillierenden Streifenmustern in der rechten und linken Sehfeld-Hälfte verdeutlichen das Phänomen der endogen gesteuerten Aufmerksamkeit anschaulich, da die Fliegen hierbei charakteristische Drehmomentmuster für das eine oder andere Muster erzeugen. Weil diese Einzelbeobachtungen aber nicht leicht quantifizierbar sind, ist hier ein neuer Ansatz notwendig. Die obigen Experimente mit zwei einzelnen Streifen, die gleichzeitig nach rechts und links versetzt werden, versprechen systematischere Ergebnisse. Die Fliegen neigen stärker dazu einen bestimmten Antwort-Typ (Drehmoment nach links bzw. nach rechts) beizubehalten, als eine statistische Verteilung annehmen ließe. Es ist zu vermuten, dass dieser Effekt durch die Aufmerksamkeit hervorgerufen wird. Die Analyse solcher Experimente könnte also die endogene Steuerung der Aufmerksamkeit beleuchten. KW - Visuelle Aufmerksamkeit KW - Taufliege KW - Visuelle Aufmerksamkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Visual attention KW - Drosophila melanogaster KW - torque meter Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69616 ER - TY - THES A1 - Eschbach, Claire T1 - Classical and operant learning in the larvae of Drosophila melanogaster T1 - Klassiches und operantes Lernen bei Larven der Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit studiere ich einige psychologische Aspekte im Verhalten der Drosophila, insbesondere von Drosophila Larven. Nach einer Einleitung, in der ich den wissenschaftlichen Kontext darstelle und die Mechanismen der olfaktorischen Wahrnehmung sowie des klassichen und operanten Lernens beschreibe, stelle ich die verschiedenen Experimente meiner Doktorarbeit vor. Wahrnehmung Das zweite Kapitel behandelt die Art, in der adulte Drosophila zwischen Einzeldüften und Duftgemischen generaliseren. Ich habe gefunden, daß die Fliegen eine Mischung aus zwei Düften als gleich verschieden von ihren beiden Elementen wahrnehmen; und daß die Intensität sowie die chemisch-physikalische Natur der Elemente das Ausmass der Generalisierung zwischen der Mischung und ihren beiden Elementen beeinflusst. Diese Entdeckungen sollten für die weitere Forschung anregend sein, wie zum Beispiel zum functional imaging. Gedächtnis Das dritte Kapitel stellt die Etablierung eines neuen Protokolls zur klassischen Konditionierung bei Drosophila Larven dar. Es handelt sich um Experimente, bei denen ein Duft mit einer mechanischen Störung als Strafreiz verknüpft wird. Das Protokoll wird einen Vergleich zwischen zwei Arten vom aversiven Gedächtnissen (Geschmack vs. mechanische Störung als Strafreize) ermöglichen, einschliesslich eines Vergleiches ihrer neurogenetischen Grundlagen; zudem kann nun geforscht werden, ob die jeweiligen Gedächtnisse spezifisch für die Art des verwendeten Strafreizes sind. Selbstgestaltung Das vierte Kapitel umfasst unsere Versuche, operantes Gedächtnis bei Drosophila Larven zu beobachten. Zumindest für die unmittelbar ersten Momente des Tests konnte ich zeigen, dass die Larven ihr Verhalten entsprechend dem Training ausrichten. Dieses Gedächtnis scheint jedoch im Laufe des Tests schnell zu verschwinden. Es ist daher geraten, diese Ergebnisse über operantes Lernen zu wiederholen, eventuell das experimentelle Protokoll zu verbessern, um so eine systematische Analyse der Bedingungen und Mechanismen für das operante Lernen bei der Drosophila Larve zu erlauben. Im fünften Kapitel verwende ich die im Rahmen des vierten Kapitels entwickelten Methoden für eine Analyse der Fortbewegung der Larven. Ich habe insbesondere die Wirkung des pflanzlichen ‚cognitive enhancers’ Rhodiola rosea untersucht, sowie die Auswirkungen von Mutationen in den Genen, welche für Synapsin und SAP47 kodieren; schliesslich habe ich getestet, ob die Geschmacksqualität der Testsituation lokomotorische Parameter verändert. Diese Dissertation erbringt also eine Reihe neuer Aspekte zur Psychologie der Drosophila und wird hoffentlich in diesem Bereich der Forschung neue Wege öffnen. N2 - In this thesis I studied psychological aspects in the behaviour of Drosophila, and especially Drosophila larvae. After an introduction where I present the general scientific context and describe the mechanisms of olfactory perception as well as of classical and operant conditioning, I present the different experiments that I realised during my PhD. Perception The second chapter deals with the way adult Drosophila generalise between single odours and binary mixtures of odours. I found that flies perceive a mixture of two odours as equally similar to the two elements composing it; and that the intensity as well as the physico-chemical nature of the elements composing a mixture affect the degree of generalisation between this mixture and one of its elements. These findings now call for further investigation on the physiological level, using functional imaging. Memory The third chapter presents a series of experiments in Drosophila larvae in order to define some characteristics of a new protocol for classical aversive learning which involves associating odours with mechanical disturbance as a punishment. The protocol and the first results should open new doors for the study of classical conditioning in Drosophila larvae, by allowing the comparison between two types of aversive memory (gustatory vs. mechanical reinforcement), including a comparison of their neurogenetic bases. It will also allow enquiries into the question whether these respective memories are specific for the kind of reinforcer used. Agency The fourth chapter documents our attempts to establish operant memory in Drosophila larvae. By analysing the first moments of the test, I could reveal that the larvae modified their behaviour according to their previous operant training. However, this memory seems to be quickly extinguished during the course of the test. We now aim at repeating these results and improving the protocol, in order to be able to systematically study the mechanisms allowing and underlying operant learning in Drosophila larvae. In the fifth chapter, I use the methods developed in chapter four for an analysis of larval locomotion. I determine whether larval locomotion in terms of speed or angular speed is affected by a treatment with the “cognitive enhancer” Rhodiola rosea, or by mutations in the Synapsin or SAP47 genes which are involved in the formation of olfactory memory. I also characterize the modifications induced by the presence of gustatory stimuli in the substrate on which the larvae are crawling. This thesis thus brings new elements to the current knowledge of Drosophila KW - Lernen KW - Taufliege KW - Neurobiologie KW - Drosophila KW - learning KW - Drosophila KW - neurobiology KW - behaviour Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70583 ER - TY - THES A1 - Pletinckx, Katrien T1 - Dendritic cell maturation and instruction of CD4+ T cell tolerance in vitro T1 - Reifung der dendritischen Zelle und Instruktion der CD4+ T Zell Toleranz in vitro N2 - Effective T cell immunity was believed to occur by mature DC, whereas tolerogenicity was attributed strictly to immature DC phenotypes. However, intermediate DC maturation stages were identified conditioned by inflammatory mediators like TNF. Furthermore, the T cell tolerance mechanisms are dependent on distinct modes and intensities of co-stimulation. Therefore, in this study it was addressed how distinct DC maturation signatures instruct CD4+ T cell tolerance mechanisms. DC acquire antigens from apoptotic cells for self-peptide-MHC presentation and functionally adapt presumed tolerogenic DC phenotypes. Here, immature murine bone-marrow derived DC representing both inflammatory and conventional DC subsets adapted a maturationresistant DC signature upon apoptotic cell recognition but no additional tolerogenic features. Immature DC instruct CD4+ FoxP3+ regulatory T cells in a TGF-β prone micro-environment or generate anergic CD4+ T cells hampered in the TCR-induced proliferation and IL-2 secretion. Secondary stimulation of such anergic CD4+ T cells by immature DC increased primarily IL-10 production and conferred regulatory function. These IL-10+ regulatory T cells expressed high levels of CTLA-4, which is potently induced by immature DC in particular. Data in this work showed that anergic T cells can be re-programmed to become IL-10+ regulatory T cells upon ligation of CTLA-4 and CD28 signalling cascades by B7 costimulatory ligands on immature DC. In contrast, semi-mature DC phenotypes conditioned by the inflammatory mediator TNF prevented autoimmune disorders by induction of IL-10+ Th2 responses as demonstrated previously. Here, it was shown that TNF as an endogenous maturation stimulus and pathogenic Trypanosoma brucei variant-specific surface glycoproteins (VSG) induced highly similar DC gene expression signatures which instructed default effector Th2 responses. Repetitive administration of the differentially conditioned semi-mature DC effectively skewed T cell immunity to IL-10+ Th2 cells, mediating immune deviation and suppression. Collectively, the data presented in this work provide novel insights how immature and partially mature DC phenotypes generate T cell tolerance mechanisms in vitro, which has important implications for the design of effective DC-targeted vaccines. Unravelling the DC maturation signatures is central to the long-standing quest to break tolerance mimicked by malignant tumours or re-establish immune homeostasis in allergic or autoimmune disorders. N2 - Reife DC sind potente Induktoren von T Zell Immunität, wogegen unreife DC Stadien zur Induktion von Immuntoleranz befähigt sind. Zudem sind intermediäre semireife DC Entwicklungsstadien identifiziert worden, wie sie nach Behandlung mit inflammatorischen TNF entstehen. Die bekannten T Zell Toleranzmechanismen sind wiederum abhängig von unterschiedlicher Art und Intensität von Kostimulation. Hier wurde deshalb untersucht wie verschiedene DC Reifungsstadien CD4+ T Zelltoleranz induzieren können. DC nehmen apoptotisches Zellmaterial auf, was als Antigenquelle zur Präsentation von MHC/Selbstpeptid-Komplexen genutzt wird und tolerogene Funktionen in DC hervorrufen kann. Unsere Ergebnisse zeigten dass aus Knochenmark generierte DC der Maus, die sowohl inflammatorische als auch klassische DC Subtypen darstellen, nach Erkennung apoptotischen Zellmaterials reifungsresistent wurden, jedoch unverändert unreif und keine neuen tolerogenen Funktionen erwarben. Unreife DC induzierten in Gegenwart von TGF-β CD4+ FoxP3+ regulatorische T Zellen und in dessen Abwesenheit anergische CD4+ T Zellen. Wiederholte Stimulation anergischer CD4+ T Zellen durch unreife DC, induzierte deren IL-10 Produktion und regulatorische Eigenschaften. Diese IL-10+ regulatorischen T Zellen zeigten keine FoxP3 Expression, jedoch verstärkt CTLA-4, insbesondere nach Interaktion mit unreifen DC. Zusammen zeigten die hier erhaltenen Daten, dass das Reprogrammieren anergischer T Zellen zu IL-10+ regulatorischen T Zellen über CTLA-4 als auch über CD28 Signalkaskaden durch deren B7 Liganden auf der Zelloberfläche unreifer DC gesteuert wird. Frühere Arbeiten zeigten, dass repetitive Injektion semireifer DC, Autoimmunerkrankungen vorbeugen konnten durch die Induktion IL-10+ Th2 Antworten. Hier konnte gezeigt werden dass TNF als endogener Reifungsstimulus sowie pathogene T. brucei Varianten-spezifische Glykoproteine (VSG) sehr ähnliche semireife DC Reifungsqualitäten hervorrufen. Die entsprechend generierten Th2 Effektor Zellen unterschieden sich lediglich geringfügig in deren Zytokinproduktion. Repetitive Injektionen dieser semireifen DC induzierten ebenfalls IL-10+ Th2 Differenzierung und effektive Immundeviation in vivo. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit wichtige Erkenntnisse ergeben, wie unreife und semireife DC die Generierung unterschiedlicher T Zell Toleranzmechanismen in vitro unterstützen. Diese Erkenntnisse sind ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung effektiver DC-basierter Immunvakzinen. Die Definition der verschiedenen DC Reifungsstadien ist von großer Bedeutung bei der Optimierung von Behandlungsverfahren gegen infektiöse Erreger, Krebs oder Autoimmunerkrankungen. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Toleranz KW - Dendritic cell KW - tolerance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67375 ER - TY - THES A1 - Wolski, Stefanie Carola T1 - Structural and functional characterization of nucleotide excision repair proteins T1 - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Nucleotid-Exzisions-Reparatur Proteinen N2 - XPD is a 5‘-3‘ helicase of the superfamily 2. As part of the transcription factor IIH it functions in transcription initiation and nucleotide excision repair. This work focus on the role of XPD in nucleotide excision repair. NER is a DNA repair pathway unique for its broad substrate range. In placental mammals NER is the only repair mechanism able to remove lesions induced by UV-light. NER can be divided into four different steps that are conserved between pro- and eukaryotes. Step 1 consists of the initial damage recognition, during step 2 the putative damage is verified, in step 3 the verified damage is excised and in the 4th and final step the resulting gap in the DNA is refilled. XPD was shown to be involved in the damage verification step. It was possible to solve the first apo XPD structure by a MAD approach using only the endogenous iron from the iron sulfur cluster. Based on the apo XPD structure several questions arise: where is DNA bound? Where is DNA separated? How is damage verification achieved? What is the role of the FeS cluster? These questions were addressed in this work. Hypothesis driven structure based functional mutagenesis was employed and combined with detailed biochemical characterization of the variants. The variants were analyzed by thermal unfolding studies to exclude the possibility that the overall stability could be affected by the point mutation. DNA binding assays, ATPase assays and helicase assays were performed to delineate amino acid residues important for DNA binding, helicase activity and damage recognition. A structure of XPD containing a four base pair DNA fragment was solved by molecular replacement. This structure displays the polarity of the translocated strand with respect to the helicase framework. Moreover the properties of the FeS cluster were studied by electron paramagnetic resonance to get insights into the role of the FeS cluster. Furthermore XPD from Ferroplasma acidarmanus was investigated since it was shown that it is stalled at CPD containing lesions. The data provide the first detailed insight into the translocation mechanism of a SF2B helicase and reveal how polarity is achieved. This provides a basis for further anlayses understanding the combined action of the helicase and the 4Fe4S cluster to accomplish damage verification within the NER cascade. N2 - XPD ist eine 5‘-3‘ Helicase der Superfamilie 2. Als Untereinheit des Transkriptionsfaktors IIH ist XPD in Transkriptionsinitiation und Nucleotid-Exzisions-Reparatur involviert. Diese Arbeit fokusiert auf die Rolle von XPD in der NER. NER ist ein DNA Reparatur Weg der bekannt ist für seine breite Substratspezifität. In Säugetieren ist NER der einzige Reparaturmechanismus, der fähig ist Läsionen zu reparieren, die durch UV Strahlung induziert werden. NER kann man in vier unterschiedliche Schritte aufteilen die zwischen Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Schritt 1 besteht aus der initialen Schadenserkennung, während des zweiten Schrittes wird der mögliche Schaden verifiziert, im dritten Schritt wird der verifizierte Schaden ausgeschnitten und im vierten und letzten Schritt wird die resultierende Lücke in der DNA geschlossen. Es wurde gezeigt, dass XPD in die Schadensverifizierung involviert ist. Ein MAD Versuch, bei dem nur das endogene Eisen des Eisen-Schwefel-Clusters verwendet wurde ermöglichte die Strukturlösung der ersten apo XPD Struktur. Basierend auf der Struktur ergeben sich verschiedene Fragen: wo wird DNA gebunden? Wo wird DNA aufgetrennt? Wie wird Schadenserkennung ermöglicht? Was ist die Rolle des Eisen-Schwefel-Clusters? Diese Fragen werden in dieser Arbeit angesprochen. Strukturbasierte funktionelle Mutagenesestudien, die auf Hypothesen basiert sind, wurden angewendet und mit einer detailierten biochemischen Charakterizierung der Varianten kombiniert. Die Varianten wurden mittels thermischen Entfaltungsstudien analysiert, um die Möglichkeit auszuschliessen, dass die Stabilität durch die Punktmutation betroffen ist. DNA-Bindungs- Assays, ATPase Assays und Helikase Assays wurden durchgeführt um Aminosäurereste zu identifizieren, die für DNA Bindung, Helikase Aktivität und Schadenserkennung wichtig sind. Eine Struktur von XPD, die ein DNA Fragment mit vier Basen enthält, wurde mittels Molekularem Ersatz gelöst. Diese Struktur zeigt die Polarität des translozierenden DNA- Stranges im Verhältnis zu der Helikasestruktur auf. Desweiteren wurden die Eigenschaften des FeS Clusters mittels paramagnetischen Elektronenresonanz Studien untersucht, um Einblicke in die Rolle des FeS Clusters zu bekommen. Ausserdem wurde XPD aus Ferroplasma acidarmanus erforscht, da gezeigt wurde, dass es an CPD enthaltenden Läsionen hängen bleibt. Diese Daten stellen die ersten detailierten Einblicke in den Translokationsmechanismus einer SF2B Helikase dar und zeigen wie Polarität erzielt wird. Das ist eine Basis für weitere Analysen, um die kombinierte Aktion von Helikase und dem 4Fe4S Cluster zu verstehen, die zur Schadenserkennung in der NER Kaskade führt. KW - DNS-Reparatur KW - Helicasen KW - Kristallographie KW - XPD KW - Xeroderma pigmentosum KW - TFIIH KW - Nukleotid-Exzisions-Reparatur KW - X-ray Crystallography KW - XPD KW - TFIIH KW - Nucleotide-Excision-Repair KW - FeS cluster Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67183 ER - TY - THES A1 - Angermeier, Hilde Gabriele T1 - Molecular and ecological investigations of Caribbean sponge diseases T1 - Molekulare und ökologische Untersuchungen zu Krankheiten Karibischer Meeresschwämme N2 - Während gewinnbringende Assoziationen von Schwämmen mit Mikroorganismen in den letzten Jahren viel Aufmerksamkeit erhalten haben, wurde weit weniger in die Interaktion von Schwämmen mit möglicherweise pathogenen Mikroben investiert. Somit war es das Ziel dieser Studie zwei ausgewählte Karibische Schwammkrankheiten namens „Sponge Orange Band“ und „Sponge White Patch“ mittels ökologischer und molekularer Methoden zu untersuchen. Die Sponge Orange Band (SOB) Erkrankung befällt den bedeutenden karibischen Fass-Schwamm Xestospongia muta, der zu den bakterienhaltigen (HMA) Schwämmen gezählt wird, während die Sponge White Patch (SWP) Erkrankung den häufig vorkommenden Seil-Schwamm Amphimedon compressa betrifft, der zu den bakterienarmen (LMA) Schwämmen gehört. Für beide Karibischen Schwammkrankheiten konnte ich einen Krankheitsverlauf beschreiben, der mit massiver Gewebszerstörung und dem Verlust charakteristischer mikrobieller Signaturen einhergeht. Obwohl ich zeigen konnte, dass zusätzliche Bakterienarten die gebleichten Schwammbereiche kolonisieren, lieferten meine Infektionsversuche in beiden Fällen keinen Beweis für die Beteiligung eines mikrobiellen Pathogens als Krankheitserreger. Somit liegen die eigentlichen Auslöser der Erkrankungen Sponge Orange Band als auch Sponge White Patch noch immer im Dunkeln. N2 - While beneficial sponge-microbe associations have received much attention in recent years, less effort has been undertaken to investigate the interactions of sponges with potentially pathogenic microorganisms. Thus, the aim of this study was to examine two selected Caribbean disease conditions, termed “Sponge Orange Band” and “Sponge White Patch”, via ecological and molecular methods. Sponge Orange Band (SOB) disease affects the prominent Caribbean barrel sponge Xestospongia muta that is counted among the high-microbial-abundance (HMA) sponges, whereas Sponge White Patch (SWP) disease affects the abundant rope sponge Amphimedon compressa that belongs to the low-microbial-abundance (LMA) sponges. I have documented for both Caribbean sponge diseases a disease progression going along with massive tissue destruction as well as loss of the characteristic microbial signatures. Even though new bacteria were shown to colonize the bleached areas, the infection trials revealed in both cases no indication for the involvement of a microbial pathogen as an etiologic agent of disease leaving us still in the dark about the cause of Sponge Orange Band as well as Sponge White Patch disease. KW - Meeresschwämme KW - Pathogene Bakterien KW - Porifera KW - Schwamm KW - Bakterien KW - Cyanobakterien KW - Pathologie KW - Mikroskopie KW - Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese KW - Symbiose KW - Sponge diseases KW - Porifera KW - Bacteria KW - Cyanobacteria KW - Pathogens KW - Symbionts KW - Pathology KW - Microscopy KW - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56855 N1 - weitere Originalveröffentlichungen: Angermeier H, Glöckner V, Pawlik JR, Lindquist NL & Hentschel U (2012). Sponge white patch disease affecting the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Diseases of Aquatic Organisms 99 (2): 95-102. ER - TY - THES A1 - Önal-Hartmann, Cigdem T1 - Emotional Modulation of Motor Memory Formation T1 - Emotionale Modulation des Motorischen Gedächtnises N2 - Hintergründe: Wie eine Vielzahl von Studien belegt, kann das explizite Gedächtnis, das die bewusste Erinnerung an enkodierte Informationen beinhaltet, durch Emotionen beeinflusst werden, und zwar über den Einfluss auf verschiedene Verarbeitungsebenen (Enkodierung, Konsolidierung, Abruf usw.). Bisher wenig untersucht ist, ob und wie Emotionen Vorgänge der motorischen Gedächtnisbildung, die nicht auf bewusster Erinnerung beruhen und sich stattdessen durch Veränderungen im Verhalten darstellen, modulieren. Experiment 1: Das Ziel des ersten Experimentes war es, den Einfluss von Emotionen auf motorisches Lernen zu untersuchen. Vier Gruppen von Probanden mussten in einer motorischen Lernaufgabe schnelle, seitliche Bewegungen mit dem Daumen ausführen. Während dieser Aufgabe hörten die Probanden emotionale Klänge, die in Valenz und Arousal variierten: 1. Valenz negativ/ Arousal niedrig (V-/A-), 2. Valenz negativ/ Arousal hoch (V-/A+), 3. Valenz positiv/ Arousal niedrig (V+/A-), 4. Valenz positiv/ Arousal hoch (V+/A+). Die deskriptive Analyse aller Daten sprach für beste Ergebnisse für das motorische Lernen in der Bedingung V-/A-, aber die Unterschiede zwischen den Bedingungen waren nicht signifikant. Die Interaktion zwischen Valenz und Arousal emotionaler Töne scheint demnach motorische Enkodierungsprozesse zu modulieren, jedoch müssen zukünftige Studien mit unterschiedlichen emotionalen Stimuli die Annahme weiter untersuchen, dass negative Stimuli mit niedrigem Arousal während der Enkodierung einen fördernden Effekt auf das motorische Kurzzeitgedächtnis haben. Experiment 2: Die Absicht des zweiten Experimentes war es, die Auswirkungen emotionaler Interferenzen auf die Konsolidierung beim Sequenzlernen zu untersuchen. Sechs Gruppen von Probanden trainierten zuerst in getrennten Sitzungen eine SRTT-Aufgabe (serial reaction time task). Um die Konsolidierung der neu erlernten Fertigkeit zu modulieren, wurden die Probanden nach dem Training einer von drei unterschiedlichen Klassen emotionaler Stimuli (positiv, negativ oder neutral) ausgesetzt. Diese bestanden aus einem Set emotionaler Bilder, die mit emotional kongruenten Musikstücken oder neutralen Klängen kombiniert waren. Bei den Probandengruppen wurde die emotionale Interferenz nach zwei unterschiedlichen Zeitintervallen realisiert, entweder direkt nach der Trainingssitzung oder sechs Stunden später. 72 Stunden nach der Trainingssitzung wurde jede Gruppe erneut mit der SRTT-Aufgabe getestet. Die Leistung in diesem Nachtest wurde mittels Reaktionszeit und Genauigkeit bei der Ausführung der Zielsequenz analysiert. Die emotionale Interferenz beeinflusste weder die Nachtestergebnisse für die Reaktionszeit noch die für die Genauigkeit. Allerdings konnte eine Steigerung der expliziten Sequenzerkennung durch erregende negative Stimuli festgestellt werden, wenn diese direkt nach der ersten Trainingseinheit (0h) dargeboten wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Konsolidierung der expliziten Aspekte prozeduralen Lernens in einer stärkeren Wechselwirkung mit emotionalen Interferenzen stehen könnte als die der impliziten Aspekte. Die Konsolidierung unterschiedlicher Ebenen des Fertigkeitserwerbs könnte demnach von unterschiedlichen Mechanismen gesteuert werden. Da Performanz und explizites Sequenzerkennen nicht korrelierten, vermuten wir, dass implizite und explizite Modalitäten bei der Durchführung der SRTT-Aufgabe nicht komplementär sind. Experiment 3: Es sollte untersucht werden, ob es eine Präferenz der linken Gehirnhemisphäre bei der Kontrolle von Flexionsreaktionen auf positive Stimuli gibt und der rechten Hemisphäre bei der Kontrolle von Extensionsreaktionen auf negative Stimuli. Zu diesem Zweck sollten rechtshändige Probanden einen Joystick zu sich ziehen oder von sich weg drücken, nachdem sie einen positiven oder negativen Stimulus in ihrem linken oder rechten Gesichtsfeld gesehen hatten. Die Flexionsreaktionen waren bei positiven Stimuli schneller, Extensionsreaktion hingegen bei negativen Stimuli. Insgesamt war die Performanz am schnellsten, wenn die emotionalen Stimuli im linken Gesichtsfeld präsentiert wurden. Dieser Vorrang der rechten Gehirnhemisphäre war besonders deutlich für negative Stimuli, wohingegen die Reaktionszeiten auf positive Bilder keine hemisphärische Differenzierung zeigten. Wir konnten keine Interaktion zwischen Gesichtsfeld und Reaktionstyp belegen, auch fand sich keine Dreifachinteraktion zwischen Valenz, Gesichtsfeld und Reaktionstyp. In unserem experimentellen Kontext scheint die Interaktion zwischen Valenz und Gesichtsfeld stärker zu sein als die Interaktion zwischen Valenz und motorischem Verhalten. Auf Grund dieser Ergebnisse vermuten wir, dass unter gewissen Bedingungen eine Hierarchisierung der asymmetrischen Muster Vorrang hat, die möglicherweise andere vorhandene Asymmetrien maskieren könnte. N2 - Background: There is extensive evidence that explicit memory, which involves conscious recall of encoded information, can be modulated by emotions; emotions may influence encoding, consolidation or retrieval of information. However, less is known about the modulatory effects of emotions on procedural processes like motor memory, which do not depend upon conscious recall and are instead demonstrated through changes in behaviour. Experiment 1: The goal of the first experiment was to examine the influence of emotions on motor learning. Four groups of subjects completed a motor learning task performing brisk isometric abductions with their thumb. While performing the motor task, the subjects heard emotional sounds varying in arousal and valence: (1) valence negative / arousal low (V-/A-), (2) valence negative / arousal high (V-/A+), (3) valence positive / arousal low (V+/A-), and (4) valence positive / arousal high (V+/A+). Descriptive analysis of the complete data set showed best performances for motor learning in the V-/A- condition, but the differences between the conditions did not reach significance. Results suggest that the interaction between valence and arousal may modulate motor encoding processes. Since limitations of the study cannot be ruled out, future studies with different emotional stimuli have to test the assumption that exposure to low arousing negative stimuli during encoding has a facilitating effect on short term motor memory. Experiment 2: The purpose of the second experiment was to investigate the effects of emotional interference on consolidation of sequential learning. In different sessions, 6 groups of subjects were initially trained on a serial reaction time task (SRTT). To modulate consolidation of the newly learned skill, subjects were exposed, after the training, to 1 of 3 (positive, negative or neutral) different classes of emotional stimuli which consisted of a set of emotional pictures combined with congruent emotional musical pieces or neutral sound. Emotional intervention for each subject group was done in 2 different time intervals (either directly after the training session, or 6 h later). After a 72 h post-training interval, each group was retested on the SRTT. Re-test performance was evaluated in terms of response times and accuracy during performance of the target sequence. Emotional intervention did not influence either response times or accuracy of re-testing SRTT task performance. However, explicit awareness of sequence knowledge was enhanced by arousing negative stimuli applied at 0 h after training. These findings suggest that consolidation of explicit aspects of procedural learning may be more responsive toward emotional interference than are implicit aspects. Consolidation of different domains of skill acquisition may be governed by different mechanisms. Since skill performance did not correlate with explicit awareness we suggest that implicit and explicit modes of SRTT performance are not complementary. Experiment 3: The aim of the third experiment was to analyze if the left hemisphere preferentially controls flexion responses towards positive stimuli, while the right hemisphere is specialized towards extensor responses to negative pictures. To this end, right-handed subjects had to pull or push a joystick subsequent to seeing a positive or a negative stimulus in their left or right hemifield. Flexion responses were faster for positive stimuli, while negative stimuli were associated with faster extensions responses. Overall, performance was fastest when emotional stimuli were presented to the left visual hemifield. This right hemisphere superiority was especially clear for negative stimuli, while reaction times towards positive pictures showed no hemispheric difference. We did not find any interaction between hemifield and response type. Neither was there a triple interaction between valence, hemifield and response type. In our experimental context the interaction between valence and hemifield seems to be stronger than the interaction between valence and motor behaviour. From these results we suppose that under certain conditions a hierarchy scaling of the asymmetry patterns prevails, which might mask any other existing asymmetries. KW - Motorisches Lernen KW - Gefühl KW - Motorisches Gedächtnis KW - Emotionen KW - Konsolidierung KW - Motor Memory KW - Emotion Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64838 ER - TY - THES A1 - Zelman-Femiak, Monika T1 - Single Particle Tracking ; Membrane Receptor Dynamics T1 - Einzelpartikelverfolgung ; Dynamik der Membranrezeptoren N2 - Single-molecule microscopy is one of the decisive methodologies that allows one to clarify cellular signaling in both spatial and temporal dimentions by tracking with nanometer precision the diffusion of individual microscopic particles coupled to relevant biological molecules. Trajectory analysis not only enables determination of the mechanisms that drive and constrain the particles motion but also to reveal crucial information about the molecule interaction, mobility, stoichiometry, all existing subpopulations and unique functions of particular molecules. Efficacy of this technique depends on two problematic issues the usage of the proper fluorophore and the type of biochemical attachment of the fluorophore to a biomolecule. The goal of this study was to evolve a highly specific labeling method suitable for single molecule tracking, internalization and trafficking studies that would attain a calculable 1:1 fluorophore-to-receptor stoichiometry. A covalent attachment of quantum dots to transmembrane receptors was successfully achieved with a techinque that amalgamates acyl carrier protein (ACP) system as a comparatively small linker and coenzyme A (CoA)-functionalized quantum dots. The necessity of optimization of the quantum dot usage for more precise calculation of the membrane protein stoichiometries in larger assemblies led to the further study in which methods maximizing the number of signals and the tracking times of diverse QD types were examined. Next, the optimized techniques were applied to analyze behavior of interleukin-5 β-common chain receptor (IL-5Rβc) receptors that are endogenously expressed at low level on living differentiated eosinophil-like HL-60 cells. Obtained data disclosed that perused receptors form stable and higher order oligomers. Additionally, the mobility analysis based on increased in number (>10%) uninterrupted 1000-step trajectories revealed two patterns of confined motion. Thereupon methods were developed that allow both, determination of stoichiometries of cell surface protein complexes and the acquisition of long trajectories for mobility analysis. Sequentially, the aforementioned methods were used to scrutinize on the mobility, internalization and recycling dynamics characterization of a G protein-coupled receptor (GPCRs), the parathyroid hormone receptor (PTHR1) and several bone morphogenetic proteins (BMPs), a member of the TGF-beta superfamily of receptors. These receptors are two important representatives of two varied membrane receptor classes. BMPs activate SMAD- and non-SMAD pathways and as members of the transforming growth factor β (TGF-β) superfamily are entailed in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis, and apoptosis. For effective ligand induced and ligand independent signaling, two types of transmembrane serine/threonine kinases, BMP type I and type II receptors (BMPRI and BMPRII, respectively) are engaged. Apparently, the lateral mobility profiles of BMPRI and BMPRII receptors differ markedly, which determinate specificity of the signal. Non-SMAD signaling and subsequent osteoblastic differentiation of precursor cells particularly necessitate the confinement of the BMP type I receptor, resulting in the conclusion that receptor lateral mobility is a dominative mechanism to modulate SMAD versus non-SMAD signaling during differentiation. Confined motion was also predominantly observed in the studies devoted to, entailed in the regulation of calcium homeostasis and in bone remodeling, the parathyroid hormone receptor (PTHR1), in which stimulation with five peptide ligands, specific fragments of PTH: hPTH(1–34), hPTHrP(107–111)NH2; PTH(1–14); PTH(1–28) G1R19, bPTH(3–34), first four belonging to PTH agonist group and the last to the antagonist one, were tested in the wide concentration range on living COS-1 and AD293 cells. Next to the mobility, defining the internalization and recycling rates of the PTHR1 receptor maintained in this investigation one of the crucial questions. Internalization, in general, allows to diminish the magnitude of the receptor-mediated G protein signals (desensitization), receptor resensitization via recycling, degradation (down-regulation), and coupling to other signaling pathways (e.g. MAP kinases). Determinants of the internalization process are one of the most addressed in recent studies as key factors for clearer understanding of the process and linking it with biological responses evoked by the signal transduction. The internalization of the PTH-receptor complex occurs via the clathrin-coated pit pathway involving β-arrestin2 and is initiated through the agonist occupancy of the PTHR1 leading to activation of adenylyl cyclase (via Gs), and phosphatidylinositol-specific phospholipase Cβ (via Gq). Taken together, this work embodies complex study of the interleukin-5 β-common chain receptor (IL-5Rβc) receptors, bone morphogenetic proteins (BMPs) and the parathyroid hormone receptor with the application of single-molecule microscopy with the newly attained ACP-quantum dot labeling method and standard techniques. N2 - Die Einzelmolekül-Mikroskopie, das Verfolgen der Diffusion einzelner, mikroskopischer Partikel, welche an relevanten biologischen Molekülen gekoppelt sind, ist eine der entscheidenden Verfahren zur räumlichen und zeitlichen Quantifizierung der Zellsignalisierung und hat eine Genauigkeit im Nanometerbereich. Die so gewonnene Trajektorienanalyse ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Mechanismen, die der Bewegung der Partikel zugrunde liegen, sondern liefert auch wichtige Informationen über die molekulare Wechselwirkungen, Bewegungsfreiheit und Stöchiometrie sowie über alle existierenden Subpopulationen und besondere Funktionen der einzelnen Moleküle. Die Wirksamkeit dieser Technik hängt von der Verwendung des geeigneten Flurophors und der Art seiner biochemischen Anhaftung ab. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines hochspezifischen Markierungsverfahrens, das zur Verwendung der Einzelmolekül-Mikroskopie für Studien im Bereich Endozytose geeignet ist und gleichzeitig eine Fluorophore-Rezeptor Stöchiometrie von 1:1 erreicht. Eine kovalente Anhaftung von Quantenpunkten an Membranrezeptoren wurde erfolgreich in einer Methode realisiert, die ACP-Systeme (Engl. Acyl-Carrier-Protein) mit Koenzym A (CoA-) funktionalisierten Quantenpunkten amalgamiert. Die notwendige Optimierung der Verwendung von Quantenpunkten mit dem Ziel einer genaueren Berechnung der Stöchiometrie von Membranproteinen sehr großer Anzahl führte zu weiteren Studien. In diesem Zusammenhang wurden Methoden zur Maximierung der Signalanzahl und Beobachtungszeiten diverser Quantenpunktentypen untersucht. Im nächsten Schritt wurden die optimierten Verfahren angewendet, um das Verhalten von IL-5Rßc (Engl. Interleukin-5 ß-common chain receptor) Rezeptoren, die endogen auf niedriger Stufe auf lebende differenzierte eosinophile-ähnlichen HL-60 Zellen existieren, zu analysieren. Die gewonnenen Daten haben gezeigt, dass die Rezeptoren sich in stabilen Oligomeren hoher Ordnung bilden, was zusätzlich mit den Ergebnissen der Analyse der Mobilität, die auf einer hohen Anzahl unterbrochener 1000-Schritt Trajektorien basiert, zwei abgegrenzte Bewegungsmuster ergab. Daraufhin wurden Methoden entwickelt, die eine Bestimmung der Stöchiometrie von Zelloberflächen-Proteinkomplexen und die Erfassung umfangreicher Trajektorien zur Bewegungsanalyse ermöglichen. Im Weiteren wurden die zuvor genannten Methoden zur genauen Überprüfung der Mobilität, Endozytose und der Charakterisierung der rückläufigen Dynamik der repräsentativen Rezeptoren von zwei verschiedenen Membranrezeptoren Klassen, des Parathormon-Rezeptors (Engl. the parathyroid hormone receptor), der zu der G-Protein-gekoppelter Rezeptor Gruppe (GPCRs) gehört und der Rezeptoren der knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs) verwendet. BMPs aktivieren SMAD- und non-SMAD Signalkaskaden und als ein Bestandteil des TGF-β-Signalszstem sind sie in die Proliferation, die Differenyiation, die Chemotaxis und die Apoptose involviert. Zwei BMP Rezeptor Typen, BMP Typ I und BMP Typ II (BMPRI und BMPRII) sind nötig für die effektive Signalwirkung. Offenbar sind die Bewegungsmuster für BMPRI und BMPRII sehr unterschiedlich, was hier die Genauigkeit des Signals festlegt. Non-SMAD Kaskade und die nachfolgende Differenzierung von den Osteoblastenzellen benötigt das abgegrenzte Bewegungsmuster von BMPRI. Daraus folgert, dass die laterale Mobilität ein Hauptmechanismus in der SMAD gegen non-SMAD Signalwirkung während der Differenziation ist. Das abgegrenzte Bewegungsmuster war auch für den Parathormon Rezeptor (Engl. the parathyroid hormone receptor) (PTHR1), der in die Calcium Homeostase und den Knochenumbau involviert ist, in den Studien zu beobachten. In diesen Studien wurden fünf Peptide Ligande, spezifische Teile von dem PTH: hPTH(1–34), hPTHrP(107–111)NH2; PTH(1–14); PTH(1–28) G1R19, bPTH(3–34), von denen die ersten vier zu der Agonistengruppe und der Letzte zu der Antagonistengruppe gehören, in verschiedenen Konzentrationen mit lebenden COS-1 und AD293 Zellen verwendet. (oder aufgebracht) Eine der Hauptfragen war die Festlegung der Rate der PTHR1 Internalisierung und des Recycling in dieser Forschung. Im Allgemeinen reduziert Internalisierung die Stärke der Signale, die von den G Proteinen kommen und durch die Rezeptoren übermittelt (die Desensibilisierung) werden. Durch den Rücklauf werden die Rezeptoren wieder sensibilisiert, degradiert und können somit an anderen Signalkaskaden ankoppeln (zB. MAP-Kinase ). Die Determinanten der Internalisierung sind das Hauptthema in den aktuellen Studien, da sie der Schlüssel zum besseren Verständnis der Internalisierung und zu den nachfolgenden biologischen Antworten sind. Die Internalisierung von dem PTH Rezeptor verläuft entsprechend des Clathrin-coated Pit Weges mit der Teilnahme von β-arrestin2 und ist durch den Ligand eingeleitet, der zur Aktivierung von adenylyl cyclase (via Gs), und phosphatidylinositol-specific phospholipase Cβ (via Gq) führt. Zusammenfassend ist diese Arbeit unter Verwendung von Einzelmolekül-Mikroskopie mit der neuen ACP-Quantumpunktmethoden sowie standard Markierungsmethoden ein komplexes Studium über die IL-5Rßc Rezeptoren, die BMP Rezeptoren und den PTH Rezeptor. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Membranrezeptor KW - Dynamik KW - Einzelpartikelverfolgung KW - Dynamik von Membranrezeptoren KW - Mikroskopie KW - Single Particle Tracking KW - Membrane Receptor Dynamics KW - Microscopy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65420 ER - TY - THES A1 - Zanucco, Emanuele T1 - Role of oncogenic and wild type B-RAF in mouse lung tumor models T1 - Untersuchungen zur Rolle der onkogenen und wildtypischen B-RAF Kinase in Lungentumormodellen der Maus N2 - Von Wachstumsfaktoren regulierte Signalkaskaden sind Schlüsselelemente in der Gewebeentwicklung und Geweberegeneration. Eine Deregulation dieser Kaskaden führt zu Entwicklungsstörungen und neoplastischen Krankheiten. Für viele humane Krebsformen sind aktivierende Mutationen der Kinasen der RAF Familie verantwortlich. Das erste Projekt dieser Doktorarbeit fokussiert auf der Rolle des B-RAF V600E, welches als eine der am häufigsten vorkommenden Mutantionen in humanen Krebszellen identifiziert worden ist. Um die onkogene Funktion des B-RAF V600E zu untersuchen, haben wir transgene Mauslinien hergestellt, welche das aktivierte Onkogen spezifisch in alveolaren Lungenepithelzellen des Typ II exprimieren. Konstitutive Expression des B-RAF V600E führte zu einer abnormen alveolaren Epithelzellbildung und zu Emphysem-ähnlichen Läsionen. Diese Läsionen wiesen Zeichen einer Gewebsumstrukturierung auf, oft in Assoziation mit chronischer Inflammation und geringer Inzidenz von Lungentumoren. Die Infiltration der entzündlichen Zellen erfolgte erst nach der Entstehung von Emphysem-ähnlichen Läsionen und könnte zur späteren Tumorbildung beigetragen haben. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in welchem der kontinuierliche regenerative Prozess eine tumorfördernde Umgebung schafft. Dabei induziert die Aktivität des onkogenen B-RAF eine alveolare Störung, welche ursächlich verantwortlich ist für den kontinuierlichen regenerativen Prozess. Das zweite Projekt fokussiert auf die Rolle von endogenem (wildtypischen) B-RAF in einem durch onkogenes C-RAF induzierten Maus Lungentumormodell. Für unsere Untersuchungen haben wir eine Mauslinie geschaffen, in welcher B-RAF in den C-RAF Lungentumoren konditionell eliminiert werden kann. Eine konditionelle Eliminierung des B-RAF hat die Entstehung von Lungentumoren nicht blockiert, aber zu reduziertem Tumorwachstum geführt. Dieses reduzierte Tumorwachstum konnte auf eine reduzierte Zellproliferation zurückgeführt werden. Außerdem konnten wir durch die B-RAF Elimination eine Reduktion der Intensität der mitogenen Signalkaskade beobachten. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das onkogene Potential von C-RAF in vivo unabhängig von B-RAF ist und eine Kooperation von B-RAF und C-RAF jedoch für die vollständige Aktivierung der mitogenen Signalkaskade wichtig ist. N2 - Growth factor induced signaling cascades are key regulatory elements in tissue development, maintenance and regeneration. Deregulation of the cascades has severe consequences, leading to developmental disorders and neoplastic diseases. As a major function in signal transduction, activating mutations in RAF family kinases are the cause of many human cancers. In the first project described in this thesis we focused on B-RAF V600E that has been identified as the most prevalent B-RAF mutant in human cancer. In order to address the oncogenic function of B-RAF V600E, we have generated transgenic mice expressing the activated oncogene specifically in lung alveolar epithelial type II cells. Constitutive expression of B-RAF V600E caused abnormalities in alveolar epithelium formation that led to airspace enlargements. These lung lesions showed signs of tissue remodeling and were often associated with chronic inflammation and low incidence of lung tumors. Inflammatory cell infiltration did not precede the formation of emphysema-like lesions but was rather accompanied with late tumor development. These data support a model where the continuous regenerative process initiated by oncogenic B-RAF-driven alveolar disruption provides a tumor-promoting environment associated with chronic inflammation. In the second project we focused on wild type B-RAF and its role in an oncogenic-C-RAF driven mouse lung tumor model. Toward this aim we have generated compound mice in which we could conditionally deplete B-RAF in oncogenic-C-RAF driven lung tumors. Conditional elimination of B-RAF did not block lung tumor formation however led to reduced tumor growth. The diminished tumor growth was not caused by increased cell death instead was a consequence of reduced cell proliferation. Moreover, B-RAF ablation caused a reduction in the amplitude of the mitogenic signalling cascade. These data indicate that in vivo B-RAF is dispensable for the oncogenic potential of active C-RAF; however it cooperates with oncogenic C-RAF in the activation of the mitogenic cascade. KW - Lungenkrebs KW - Biochemie KW - Maus KW - Lung cancer KW - RAF Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69603 ER - TY - THES A1 - Rajaraman, Gnana Oli T1 - Oxidative stress: Role in genomic damage and disease T1 - Oxidativer Stress: Bedeutung für genomische Schäden und Krankheit N2 - Bei einem Ungleichgewicht zwischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und endogenen Antioxidantien (Glutathion (GSH), Superoxiddismutase (SOD), Katalase etc.) ist der oxidative Stress erhöht, was zur Oxidation von Lipiden, Proteinen und DNA führt. Obwohl auch oxidierte Lipide und Proteine mit steigendem Alter akkumulieren können, führen nur DNA-Oxidationen zu veränderter genomischer Information. Ein möglicher Signalweg für gesteigerte ROS-Produktion ist die Aktivierung des Enzyms NADPH-Oxidase (NOX) und die damit verbundene Generierung von ROS durch viele endogene und exogene Substanzen. p47phox ist ein cytosolisches Protein, das eine wichtige Rolle bei der NOX-Aktivierung spielt. Angiotensin II (Ang II) ist ein Beispiel für eine endogene Verbindung, die über NOX-Aktivierung ROS produziert. Rosuvastatin ist ein Arzneistoff mit antioxidativen Eigenschaften (Hochregulation endogener Antioxidantien). Es gehört zur Gruppe der Cholesterinsenker und reduziert ausserdem erhöhtes Auftreten des Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptors (AT1R). Normalerweise ist oxidativer Stress im Alter und bei Alterskrankheiten (z. B. Parkinson-Krankheit) erhöht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, mit Hilfe unterschiedlicher Modelle in vitro und in vivo die Rolle von DNA-Schaden durch NOX-vermittelte ROS zu untersuchen und den Einfluss von ROS auf den Alterungsprozess und auf Alterskrankheiten zu bestimmen. N2 - When there is an imbalance between reactive oxygen species (ROS) and endogenous antioxidants (glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase etc.) the oxidative stress is increased and results in the oxidation of lipids, proteins and DNA. Although oxidation of lipids and proteins may also accumulates with age, only DNA oxidation leads to altered genomic information. As one pathway for increased ROS production, many endogenous and exogenous substances activate NADPH oxidase (NOX) enzyme and produce ROS. p47phox is a cytosolic organizer protein which plays an important role in NOX activation. Angiotensin II (Ang II) is an example for an endogenous compound which causes ROS through NOX activation. Rosuvastatin is an example for a drug with antioxidative capacity (upregulation of endogenous antioxidants). It is a lipid lowering drug which also reduces an elevated level of angiotensin II type 1 receptor (AT1R). Commonly, oxidative stress is elevated in ageing and age related diseases (eg. Parkinson’s disease (PD)). The aim of the present study was to investigate the role of NOX derived ROS induced oxidative DNA damage and the influence of ROS in ageing and age related diseases, using different in vitro and in vivo models. KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - Oxidativer Stress KW - genomische Schäden KW - Oxidative stress KW - genomic damage Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64869 ER - TY - THES A1 - Frey, Monika T1 - Effects and mechanisms of a putative human pheromone T1 - Effekte und Mechanismen eines putativen menschlichen Pheromons N2 - There is evidence that pheromones are communicative signals in animals. However, the existence and function of human pheromones are still under discussion. During the last years several substances have been labeled as putative human pheromones and especially 4,16–androstadien-3-one (androstadienone), found in male and female sweat, became subject of intense investigation. In contrast to common odors androstadienone presumably modulates human physiological and psychological reactions. Data suggest that androstadienone might influence the processing of visual cues, specifically faces or affective stimuli, via projections from the fusiform gyrus and the amygdala. Moreover, attentional processes may be modulated, which is supported by explicit and implicit behavioral data. This thesis includes three experimental studies examining effects of androstadienone exposure on behavioral and cortical reactions to visual and emotional stimuli. The main hypotheses were that androstadienone might influence human behavior to and perception of visual cues. The first study sought to clarify androstadienone effects on attention-related reactions as well as on behavioral tendencies. Motoric approach-avoidance reactions in response to happy and angry facial expressions were investigated in 30 women and 32 men. Participants either inhaled androstadienone or a control solution, without knowing the real content, while performing the following task: they had to push away or to pull towards them a joystick as fast as possible in reaction to either an angry or a happy cartoon face, which was presented on a computer screen. Results showed that androstadienone modulated the participant´s task performance by accelerating the reaction speed compared to the control compound. Faster reactions were observed particularly when reacting to angry faces but not when reacting to happy faces. This might be explained by the finding that human body odors, the source of androstadienone, were found to activate the human fear system, i.e. modulating fear-related attentional processes. Therefore, the quicker reaction towards angry faces with exposure to androstadienone could be due to an enhanced allocation of attentional resources towards fear-related cues like angry faces. Results also showed that androstadienone enhanced men´s approach tendency towards faces independent of emotional expressions. This observation might be explained by androstadienone´s former shown ability to improve attractiveness ratings of other persons. In this regard, the endogenous odor might enhance evaluations of faces in men and, thus, might improve their willingness to approach social stimuli. In contrast to men, women already showed in the control condition higher approach tendency towards faces. Therefore, androstadienone might rather maintain than enhance the approach score in women. In the second study event-related brain potentials (ERPs) triggered by social and non-social visual stimuli were investigated by means of electroencephalography. In a double-blind between-subjects design 51 women participated. Twenty-eight women inhaled androstadienone, whereas 23 women inhaled a control solution. Four different picture categories, i.e. real faces, pictures with couples, pictures with social and non-social scenes, each including three different valence categories, i.e. positive, negative and neutral, should clarify the stimulus type or context androstadienone is acting on. The androstadienone compared to the control odor did not influence brain responses significantly. Explorative analyses, however, suggested that androstadienone influences the processing of faces. While in the control group angry faces elicited larger P300 amplitudes than happy faces, the androstadienone group showed similar P300 amplitudes concerning all emotional expressions. This observation tentatively indicates that the endogenous odor might indeed affect the neuronal responses to emotional facial stimuli, especially late components reflecting evaluative processes. However, this observation has to be verified and further investigated, in particular whether androstadienone caused reduced responses to angry faces or enhanced responses to happy faces. The third study investigated androstadienone effects on face processing especially in men. ERPs elicited by happy, angry and neutral cartoon faces, which were presented on a computer screen, were measured while 16 men, not knowing the applicated odor, inhaled either androstadienone or a control solution. Exposure to androstadienone significantly increased later neuronal responses, the P300 amplitude. This belated component of the ERP reflects attention allocation and evaluative processes towards important stimuli. Therefore, androstadienone might facilitate central nervous face processing by enhancing attention towards these stimuli. In sum, the current results corroborate the notion of androstadienone as an active social chemosignal. In minute amounts and not detectable as an odor it influenced cortical and motoric reactions. Therefore, it might be concluded that androstadienone indeed affects cognitive functions like attentional processes and in turn affects our behavior. The current results further support the notion that androstadienone acts like a human modulator pheromone, namely modulating ongoing behavior or a psychological reaction to a particular context, changing stimulus sensitivity, salience and sensory-motor integration. However, these conclusions remain tentative until further replication takes place, best in ecologically valid environments. Furthermore, one has to keep in mind that the current studies could not replicate several previous findings and could not verify some hypotheses assuming communicative effects of androstadienone. Thus, the main assumption of this thesis that androstadienone is an active chemosignal is still challenged. Also, whether the term “pheromone” is indeed suitable to label androstadienone remains open. N2 - Pheromone sind als Kommunikationssubstanzen im Tierreich unabkömmlich. Ob jedoch menschliche Pheromone tatsächlich existieren, wird noch immer diskutiert. Während der letzten Jahre wurden mehrere Substanzen als putative menschliche Pheromone bezeichnet. Unter diesen wurde v.a. 4,16–androstadien-3-on (Androstadienon), eine Komponente des männlichen und weiblichen Schweißes, intensiv untersucht. Bisherige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Androstadienon im Gegensatz zu herkömmlichen Duftstoffen die Verarbeitung visueller Stimuli, v.a. von Gesichtern und von affektiven Stimuli, vermutlich über eine Modulation der Aktivität des Gyrus fusiformis und der Amygdala beeinflussen kann. Außerdem könnten Aufmerksamkeitsprozesse durch Androstadienon beeinflusst sein, was durch explizite und implizite Verhaltensdaten angedeutet wird. Diese Doktorarbeit untersuchte in drei verschiedenen Studien die Effekte von Androstadienon auf kortikale Reaktionen und Verhalten bei Männern und Frauen, während diese mit visuellen, insbesondere emotionalen Stimuli konfrontiert wurden. Die Haupthypothesen waren, dass Androstadienon die Wahrnehmung visueller Stimuli und menschliches Verhalten gegenüber diesen beeinflussen könnte. Die erste Studie untersuchte Androstadienoneffekte auf aufmerksamkeitsabhängige, motorische Reaktionen sowie auf Verhaltenstendenzen. Motorisches Annäherungs- und Vermeidungsverhalten als Reaktion auf freudige und ärgerliche Gesichter wurden bei 30 Frauen und 32 Männern untersucht. Während diese entweder Androstadienon oder einen Kontrollduft inhalierten, ohne zu wissen welchen, mussten sie so schnell wie möglich einen Joystick jeweils wegdrücken oder zu sich heranziehen, sobald entweder ein freudiges oder ärgerliches Gesicht auf einem Computerbildschirm erschien. Im Vergleich zum Kontrollduft beschleunigte Androstadienon die Reaktionsgeschwindigkeit spezifisch auf ärgerliche Gesichter unabhängig von der Bewegungsrichtung. Dies könnte damit zusammenhängen, dass menschlicher Körpergeruch, die Quelle von Androstadienon, das Angstsystem im menschlichen Gehirn aktiviert. Die schnellere Reaktion auf ärgerliche Gesichter durch den endogenen Geruch könnte dementsprechend auf eine erhöhte Bereitstellung von Aufmerksamkeitsressourcen für angstverwandte Stimuli, wie ärgerliche Gesichter, zurückzuführen sein. Zusätzlich zeigten die Ergebnisse, dass Androstadienon unabhängig vom Emotionsausdruck die Annäherungstendenz bei Männern zu den Gesichtern erhöht. Diese Beobachtung könnte durch die in einer früheren Studie gezeigte Eigenschaft von Androstadienon, die Attraktivitätsbewertungen anderer Personen zu erhöhen, erklärt werden. Demnach könnte der endogene Duftstoff bei Männern die Bewertung von Gesichtern verbessern und folglich die Bereitschaft, sich sozialen Stimuli anzunähern, erhöhen. Im Gegensatz zu Männern zeigten Frauen schon in der Kontrollbedingung eine stärkere Annäherungstendenz zu Gesichtern. Folglich könnte Androstadienon diese verstärkte Tendenz bei Frauen eher aufrechterhalten als verstärken. In der zweiten Studie wurden kortikale Reaktionen, d.h. ereigniskorrelierte Gehirnpotentiale (EKPs), auf soziale und nicht-soziale visuelle Bilder bei 28 Frauen, die Androstadienon rochen, und bei 23 Frauen die einem Kontrollduft ausgesetzt waren, mit Elektroenzephalographie untersucht. Allen Teilnehmerinnen war der Inhalt des applizierten Duftstoffes nicht bewusst. Vier verschiedene Bildkategorien, d.h. echte Gesichter, Bilder mit Paaren, Bilder mit Gruppen von Menschen und Bilder ohne Personen, mit jeweils positiver, negativer und neutraler Valenz wurden verwendet, um den Wirkkontext von Androstadienon zu klären. Androstadienon beeinflusste die Hirnreaktionen auf diese Stimuli nicht signifikant. Explorative Analysen deuteten aber an, dass Androstadienon die späte EKP Komponente, P300, beeinflussen kann. Während in der Kontrollgruppe ärgerliche Gesichter größere P300 Amplituden auslösten als freudige Gesichter, erzeugten in der Androstadienongruppe alle emotionalen Ausdrücke ähnliche P300 Amplituden. Dies könnte andeuten, dass Androstadienon attentive oder evaluative Prozesse bei der Gesichtsverarbeitung beeinflusst, was aber durch weitere Studien bestätigt und präzisiert werden muss. Die dritte Studie untersuchte Androstadienoneffekte auf zentralnervöse Prozesse der Gesichtsverarbeitung von Männern. EKPs auf freudige, ärgerliche und neutrale Cartoongesichter wurden aufgezeichnet, während 16 Männer entweder Androstadienon oder den Kontrollduft inhalierten, ohne jeweils zu wissen welchen. Androstadienon verstärkte eine späte neuronale Reaktion, die P300 Komponente, auf alle Gesichter signifikant. Diese Komponente des ereigniskorrelierten Potenzials spiegelt die Bereitstellung von Aufmerksamkeit auf wichtige Stimuli wider. Androstadienon könnte folglich die zentralnervöse Verarbeitung von Gesichtern erleichtern, indem es Aufmerksamkeit auf diese Stimuli lenkt. Zusammenfassend stützen die genannten Ergebnisse die Annahme, dass Androstadienon ein aktives soziales Chemosignal ist. In winzigen, bewusst nicht wahrnehmbaren Mengen beeinflusste es kortikale und motorische Reaktionen. Demzufolge scheint Androstadienon tatsächlich auf kognitive Funktionen wie Aufmerksamkeit zu wirken und deshalb unser Verhalten beeinflussen zu können. Die aktuellen Ergebnisse unterstützen auch die Annahme, dass Androstadienon ein menschliches Modulatorpheromon ist, das in einem speziellen Kontext unser Verhalten und eine psychologische Reaktion moduliert und Stimulussensitivität und die Sensor-Motor-Integration ändert. Dennoch müssen diese Interpretationen als vorläufig betrachtet werden bis die dargestellten Ergebnisse auch unter ökologisch validen Bedingungen repliziert werden konnten. Außerdem muss berücksichtigt werden, dass in dieser Doktorarbeit einige frühere Ergebnisse und einige Hypothesen bezüglich kommunikativer Effekte von Androstadienone nicht bestätigt werden konnten. Deshalb kann die Annahme, dass Androstadienon ein aktives Chemosignal ist, immer noch in Frage gestellt werden. Auch ob Androstadienon tatsächlich als menschliches Pheromon bezeichnet werden sollte bleibt offen. KW - Pheromon KW - Aufmerksamkeit KW - Mensch KW - Androstadienon KW - ereigniskorreliertes Potential KW - Antwortverhalten KW - Geruchssinn KW - androstadienone KW - humans KW - olfaction KW - pheromone KW - behavior KW - attention Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72292 ER - TY - THES A1 - Deb, Jolly T1 - Role of Transcription Factor NFATc1 in Development, Survival and Function of B Lymphocytes T1 - Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFATc1 für die Entwicklung, das Überleben und die Funktion von B-Lymphozyten N2 - Die Transkriptionsfaktoren der NFAT-Proteinfamilie (Nuclear Factor of Activated T cells, NFATc1-4) sind an entscheidender Stelle in die Regulation des Zellzyklus, des programmierten Zelltodes und der Kanzerogenese involviert. NFATc1 nimmt innerhalb dieser Familie eine Sonderrolle ein, da dessen Aktivität auch durch eine stark induzierbare Expression gesteigert werden kann. Dies ist insbesondere für die Differenzierung und Funktion von T- und B-Lymphozyten von Bedeutung. Weiterhin ist NFATc1 für die Muskel- oder Herzentwicklung notwendig. Eine Reihe von Arbeiten belegen darüber hinaus eine Beteiligung dieses Transkriptionsfaktors an der Entstehung von Leukämien und Lymphomen. Während klassische Hodgkin-Lymphome allerdings durch eine abgeschaltete NFATc1-Expression gekennzeichnet sind, wird für T-ALL (Akute Lymphatische Leukämie der T-Zelle) eine Überexpression beschrieben. Die Kernlokalisation dieses Transkriptionsfaktors erfolgt nach Dephosphorylierung des zytoplasmatischen Proteins durch die Phosphatase Calcineurin. Deren Phosphataseaktivität wird durch einen Anstieg des intrazellulären Ca++-Spiegels aktiviert. Inwiefern die Calcineurin-abhängige Kerntranslokalisation den einzigen Aktivierungsmechanismus für NFAT-Faktoren darstellt, ist noch nicht eindeutig geklärt. Nach optimaler Aktivierung von T- bzw. B-Zellen ist die kurze, induzierbare Isoform NFATc1/A das Hauptprodukt des NFATc1-Gens. In dieser Arbeit wurden für die gezielte Deletion des NFATc1-Gens in der Maus zwei verschiedene konditionelle Systeme verwandt. Hierzu wurden Tiere, die ein mit „flox“-Sequenzen versehenes drittes Exon des NFATc1-Gens in der Keimbahn tragen, mit verschiedenen Cre-Rekombinase expremierenden Linien verkreuzt. Der Verlust funktionellen NFATc1-Proteins erfolgt dann früh in der B-Zell-Differenzierung im Knochenmark (Cd79a/mb-1-cre x Nfatc1flx/fl) bzw. in reifen B-Zellen (Cd23-cre x Nfatc1flx/flx). Während in keiner dieser Linien signifikante Defekte in der Differenzierung “konventioneller B2” B-Lymphozyten beobachtet wurden, hatte die frühe Inaktivierung des NFATc1-Gens im Knochenmark den Verlust der B1a-Zell-Population im Peritoneum zur Folge. In vitro zeigten NFATc1-/--B-Zellen aus der Milz nach Aktivierung über den B-Zell-Rezeptor deutliche Defekte in der Zellteilung bei einer gleichzeitigen Zunahme des aktivierungsinduzierten Zelltodes (AICD, activation induced cell death). Die vergleichende Transkriptomanalyse identifizierte wichtige Gene des Ca++/Calcineurin-Signalweges als NFATc1-Zielgene und mitverantwortlich für die Proliferationsdefekte. In NFATc1-defizienten B-Zellen konnte Re-Expression von NFATc1 in geringer Konzentration den aktivierten Zelltod inhibieren, wohingegen hohe Konzentrationen diesen noch weiter förderten. Zusammengenommen lässt sich daher schließen, dass NFATc1 entscheidend an der Kontrolle von Proliferation und Zelltod peripherer B-Lymphozyten beteiligt ist. Eine weitere wichtige Funktion kommt NFATc1 beim Klassenwechsel im Immunglobulin-Lokus zu. In den untersuchten Mäusen war die IgG3-Produktion nach Immunisierung mit NP-Ficoll (einem T-Zell-unabhängigen Antigen des Typs II) deutlich reduziert, wenn das NFATc1-Gen in den B-Lymphozyten funktionslos war. Auch die Bildung von IgG3+-Plasmablasten war gehemmt. Zu ähnlichen Ergebnissen führten Untersuchungen an isolierten B-Lymphozyten in einem in vitro Klassenwechsel-Modell. Demgegenüber zeigten Immunisierungen der Tiere mit NP-KLH (einem T-Zell-abhängigen Antigen) keine signifikanten Abweichungen im Klassenwechsel. Zusammengefasst zeigen diese Daten die große Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFATc1 für das Überleben und die Funktion peripherer B-Lymphozyten. N2 - The Nuclear Factors of Activated T cells (NFATs) are critical transcription factors playing major roles in the control of the cell cycle, apoptosis and, probably, also cancerogenesis. Of all the four genuine NFATc family members, NFATc1 has the unique induction property which appears to be essential for T and B cell development, along with its considerable role in cytokine gene expression and function in non-lymphoid tissues and during organ development (such as in the development of muscle and heart cells). A number of studies have proved the potential role of NFATc1 protein in development of lymphomas and leukemias and provided evidence of differential expression of the same gene in different tumours (Suppression in classical Hodgkin lymphomas but overexpression in T-ALLs). Although the most commonly accepted pathway is the dephosphorylation of NFAT by calcineurin upon a rise in intracellular Ca++ leading to nuclear translocation followed by transcription of Il2 gene and related cytokines, it is quite possible that signaling mechanisms other than (or in addition to) calcineurin activation lead to NFATc1 induction as well. One of the major isoforms of NFATc1, NFATc1/αA, is the short inducible factor, produced upon full T and B cell activation. Here we used two different conditional knock-out mice as our study model. Inactivation of the murine Nfatc1 gene in bone marrow (of Cd79a/mb-1-cre x Nfatc1flx/flx mice) and spleen (of Cd23-cre x Nfatc1flx/flx mice) resulted in complete ablation of NFATc1 expression in splenic B cells. Although no severe developmental defects were found for the generation of ‘conventional’ B2 cells, NFATc1 inactivation in bone marrow B-cells led to a strong decrease in the peritoneal B1a cell population. In-vitro studies showed a clear-cut decrease in proliferation and an increase in Activation Induced Cell Death (AICD) of NFATc1-/- splenic B cells upon BCR stimulation. While NFATc1 appears to control directly the AICD of peripheral B cells, further studies revealed an effect of NFATc1 on proliferation by a sustained differentiation program controlling Ca++ flux and calcineurin activity which are needed to maintain transcription and proliferation of primary B cells. Re-expression of NFATc1 at a low dose could protect cells against AICD, whereas at a higher dose it initiated AICD. These data suggest an important dual role of NFATc1 in controlling proliferation and apoptosis of peripheral B lymphocytes. NFATc1 ablation also impaired the Ig class switch to IgG3 by T cell-independent (TI) type II antigens and impaired IgG3+ plasmablast formation when studied in-vivo by NP-Ficoll immunization or in-vitro using an in-vitro class-switch model. Contrary to the immunizations with TI-type II antigen, no significant differences were documented in Ig class switch upon immunization with NP-KLH, a T-cell dependent (TD) antigen. Taken together, the data indicate NFATc1/αA as a crucial player in the activation and function of splenic B cells upon BCR stimulation. Missing or incomplete NFATc1/αA induction appears to be one reason for the generation of B cell unresponsiveness, whereas uncontrolled NFATc1/αA expression could lead to unbalanced immune reactions and autoimmune diseases. KW - NFATc1 KW - B-Lymphozyten KW - NFATc1 KW - B Lymphocytes Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57050 ER - TY - THES A1 - Polzien, Lisa T1 - BAD Phosphorylation: A Novel Link between Apoptosis and Cancer T1 - BAD Phosphorylierung: Eine Neue Verbindung zwischen Apoptose und Krebs N2 - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family that is regulated by phosphorylation in response to survival factors. Although much attention has been devoted to the identification of phosphorylation sites in murine BAD (mBAD), little data are available with respect to phosphorylation of human BAD (hBAD) protein. In this work, we investigated the quantitative contribution of BAD targeting kinases in phosphorylating serines 75, 99 and 118 of hBAD (Chapter 3.1). Our results indicate that RAF kinases phosphorylate hBAD in vivo at these established serine residues. RAF-induced phosphorylation of hBAD was not prevented by MEK inhibitors but could be reduced to control levels by use of the RAF inhibitor Sorafenib (BAY 43-9006). Consistently, expression of active RAF suppressed apoptosis induced by hBAD and the inhibition of colony formation caused by hBAD could be prevented by RAF. In addition, using surface plasmon resonance technique we analyzed the direct consequences of hBAD phosphorylation by RAF with respect to complex formation of BAD with 14-3-3 proteins and Bcl-XL. Phosphorylation of hBAD by active RAF promotes 14-3-3 protein association, whereby the phosphoserine 99 represents the major binding site. Furthermore, we demonstrate in this work that hBAD forms channels in planar bilayer membranes in vitro. This pore-forming capacity is dependent on phosphorylation status and interaction with 14-3-3 proteins. Additionally, we show that hBAD pores possess a funnel-shaped geometry that can be entered by ions and non-charged molecules up to 200 Da (Chapter 3.2). Since both lipid binding domains of hBAD (LBD1 and LBD2) are located within the C-terminal region, we investigated this part of the protein with respect to its structural properties (Chapter 3.3). Our results demonstrate that the C-terminus of hBAD possesses an ordered β-sheet structure in aqueous solution that adopts helical disposition upon interaction with lipid membranes. Additionally, we show that the interaction of the C-terminal segment of hBAD with the BH3 domain results in the formation of permanently open pores, whereby the phosphorylation of serine 118 proved to be necessary for effective pore-formation. In contrast, phosphorylation of serine 99 in combination with 14-3-3 association suppresses formation of channels. These results indicate that the C-terminal part of hBAD controls hBAD function by structural transitions, lipid binding and phosphorylation. Using mass spectrometry we identified in this work, besides the established in vivo phosphorylation sites at serines 75, 99 and 118, several novel hBAD phosphorylation sites (serines 25, 32/34, 97, 124 and 134, Chapter 3.1). To further analyze the regulation of hBAD function, we investigated the role of these newly identified phosphorylation sites on BAD-mediated apoptosis. We found that in contrast to the N-terminal phosphorylation sites, the C-terminal serines 124 and 134 act in an anti-apoptotic manner (Chapter 3.4). Our results further indicate that RAF kinases and PAK1 effectively phosphorylate BAD at serine 134. Notably, in the presence of wild type hBAD, co-expression of survival kinases, such as RAF and PAK1, leads to a strongly increased proliferation, whereas substitution of serine 134 by alanine abolishes this process. Furthermore, we identified hBAD serine 134 to be strongly involved in survival signaling in B-RAF-V600E containing tumor cells and found phosphorylation of this residue to be crucial for efficient proliferation in these cells. Collectively, our findings provide new insights into the regulation of hBAD function by phosphorylation and its role in cancer signaling. N2 - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) ist ein pro-apoptotisches Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie und wird in Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren durch Phosphorylierung reguliert. Obwohl der Identifizierung von Phosphorylierungsstellen in murinem BAD (mBAD) in den vergangenen Jahren viel Aufmerksamkeit gewidmet wurde, ist die Phosphorylierung des humanen BAD (hBAD) Proteins kaum charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wird der quantitative Beitrag unterschiedlicher Kinasen in Bezug auf die Phosphorylierung der etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118 von hBAD dargestellt (Kapitel 3.1). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass RAF-Kinasen hBAD in vivo an diesen etablierten Stellen phosphorylieren. Die RAF-bedingte Phosphorylierung konnte nicht durch MEK-Inhibitoren beeinflusst werden, dagegen bewirkte die Gabe des RAF-Inhibitors Sorafenib (BAY 43-9006) eine Reduktion der Phosphorylierung auf das Niveau der Kontrollproben. Übereinstimmend konnte durch die Expression von aktiven RAF-Kinasen die BAD-induzierte Apoptose sowie die BAD-bedingte Inhibierung der Koloniebildung unterdrückt werden. Zusätzlich verwendeten wir Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie um die Auswirkungen der RAF-bedingten BAD-Phosphorylierung auf die Komplexbildung von hBAD mit 14-3-3-Proteinen und Bcl-XL zu analysieren. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von hBAD durch aktive RAF-Kinasen die Assoziierung von 14-3-3 begünstigt, wobei Phosphoserin 99 die Hauptbindungsstelle darstellt. Weiterhin gelang der Nachweis, dass hBAD in vitro Poren in Lipid-Doppelschicht-Membranen bilden kann. Wir wiesen nach, dass die Fähigkeit von hBAD Poren zu bilden phosphorylierungsabhängig ist und durch die Interaktion mit 14-3-3-Proteinen beeinflusst wird. Außerdem demonstrieren wir in dieser Arbeit, dass die BAD-Poren eine zylinderförmige Geometrie aufweisen und sowohl für Ionen als auch für ungeladene Moleküle mit einer Größe von bis zu 200 Da zugänglich sind (Kapitel 3.2). Da beide Lipid-Bindungsstellen (LBD1 und LBD2) am C-Terminus des hBAD lokalisiert sind, charakterisierten wir des Weiteren diesen Teil des Proteins in Hinblick auf seinen strukturellen Aufbau (Kapitel 3.3). Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass der hBAD-C-Terminus in wässriger Lösung eine geordnete β-Faltblattstruktur aufweist und bei Eintritt in eine Lipidumgebung helikale Elemente ausbildet. Zusätzlich zeigen wir in dieser Arbeit, dass die Interaktion des C-terminalen hBAD-Segments mit der BH3-Domäne zur Ausbildung von permanent offenen Poren führt, wobei die Phosphorylierung an Serin 118 eine Notwendigkeit für effektive Porenbildung darstellt. In Gegensatz dazu bewirkte die Phosphorylierung von Serin 99 in Kombination mit der Assoziierung von 14-3-3-Protein eine Inhibierung der Porenbildung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der C-terminale Teil von hBAD durch strukturelle Veränderungen, Lipidbindung und Phosphorylierung entscheidend die Funktion von hBAD reguliert. Mit Hilfe von Massenspektroskopie konnten wir im Rahmen dieser Arbeit, zusätzlich zu den etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118, einige neue in vivo Phosphorylierungsstellen von hBAD identifizieren (Serin 25, 32/34, 97, 124 und 134, Kapitel 3.1). Um die Regulierung der Funktion von hBAD weiter zu analysieren, untersuchten wir die Rolle dieser neu identifizierten Phosphorylierungsstellen in Bezug auf die BAD-induzierte Apoptose (Kapitel 3.4). Wir fanden heraus, dass im Gegensatz zu den N-terminalen Phosphorylierungsstellen, die Phosphorylierungsstellen am C-Terminus an der Apoptoseregulation mitwirken. Weiterhin weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass RAF-Kinasen, neben PAK1, an der Phosphorylierung von Serin 134 von hBAD beteiligt sind. Interessanterweise bewirkte die Co-Expression von RAF oder PAK1 mit dem wildtypischen hBAD eine erhebliche Verstärkung der Zellproliferation. Diese verstärkte Proliferation konnte durch einen Serin-zu-Alanin-Austausch in hBAD an der Stelle 134 vollständig verhindert werden. Weiterhin entdeckten wir, dass die Phosphorylierung dieser Stelle in B-RAF-V600E enthaltenden Tumorzellen bei der Regulation der Zellproliferation mitwirkt und für eine effiziente Proliferation entscheidend ist. Zusammenfassend gewähren unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Regulierung der Funktion von hBAD durch Phosphorylierung sowie in die Rolle von hBAD bei der Krebsentwicklung. KW - Krebs KW - Apoptosis KW - Bcl-2-Proteinfamilie KW - Raf KW - BH3-only proteins KW - BAD KW - cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56919 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - THES A1 - Jacobs, Graeme Brendon T1 - HIV-1 resistance analyses from therapy-naïve patients in South Africa, Tanzania and the characterization of a new HIV-1 subtype C proviral molecular clone T1 - HIV-1 Resistenz-Analysen von nicht-therapierten Patienten aus Südafrika und Tansania und Charakterisierung eines neuen HIV-1 Subtyp C proviralen molekularen Klons N2 - The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is currently the most infectious disease worldwide. It is caused by the human immunodeficiency virus (HIV). At the moment there are ~33.3 million people infected with HIV. Sub-Saharan Africa, with ~22.5 million people infected accounts for 68% of the global burden. In most African countries antiretroviral therapy (ART) is administered in limited-resource settings with standardised first- and second-line ART regimens. During this study I analysed the therapy-naïve population of Cape Town, South Africa and Mwanza, Tanzania for any resistance associated mutations (RAMs) against protease inhibitors, nucleoside reverse transcriptase inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. My results indicate that HIV-1 subtype C accounts for ~95% of all circulating strains in Cape Town, South Africa. I could show that ~3.6% of the patient derived viruses had RAMs, despite patients being therapy-naïve. In Mwanza, Tanzania the HIV drug resistance (HIVDR) prevalence in the therapy-naïve population was 14.8% and significantly higher in the older population, >25 years. Therefore, the current WHO transmitted HIVDR (tHIVDR) survey that is solely focused on the transmission of HIVDR and that excludes patients over 25 years of age may result in substantial underestimation of the prevalence of HIVDR in the therapy-naïve population. Based on the prevalence rates of tHIVDR in the study populations it is recommended that all HIV-1 positive individuals undergo a genotyping resistance test before starting ART. I also characterized vif sequences from HIV-1 infected patients from Cape Town, South Africa as the Vif protein has been shown to counteract the antiretroviral activity of the cellular APOBEC3G/F cytidine deaminases. There is no selective pressure on the HIV-1 Vif protein from current ART regimens and vif sequences was used as an evolutionary control. As the majority of phenotypic resistance assays are still based on HIV-1 subtype B, I wanted to design an infectious HIV-1 subtype C proviral molecular clone that can be used for in vitro assays based on circulating strains in South Africa. Therefore, I characterized an early primary HIV-1 subtype C isolate from Cape Town, South Africa and created a new infectious subtype C proviral molecular clone (pZAC). The new pZAC virus has a significantly higher transient viral titer after transfection and replication rate than the previously published HIV-1 subtype C virus from Botswana. The optimized proviral molecular clone, pZAC could be used in future cell culture and phenotypic HIV resistance assays regarding HIV-1 subtype C. N2 - Das erworbene Immundefektsyndrom (“acquired immunodeficiency syndrome”, AIDS), verursacht durch das Humane Immundefizienzvirus (HIV), ist derzeit die häufigste Infektionskrankheit weltweit. Zirka 33,3 Millionen Menschen sind gegenwärtig mit HIV infiziert, wobei hiervon etwa 22,5 Millionen Infizierte (68%) in den Ländern südlich der Sahara leben. In den meisten dieser Länder ist die antiretrovirale Therapie (ART) in nur zwei standardisierten Medikamentenkombinationen verfügbar. In dieser Arbeit wurden nichttherapierte Patienten aus Kapstadt (Südafrika) und Mwanza (Tansania) auf resistenzassoziierte Mutationen (RAMs) gegen Protease Inhibitoren, nukleosidische- und nichtnukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren analysiert. Meine Ergebnisse zeigten, dass in 3,6 % der Patienten RAMs gefunden wurden, obwohl diese nicht vortherapiert waren. In der Patientengruppe aus Tansania wurden sogar in 14,8 % der Patientenviren RAMs gefunden. Dieses Patientenkollektiv war signifikant älter als 25 Jahre und damit außerhalb der von der WHO beobachteten Altersgruppe. Meine Studie legt nahe, dass die WHO-Kriterien zur Überwachung der Übertragung von resistenten HIVs die Weitergabe von resistenten Viren unterschätzt, da Patienten über 25 Jahre ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden vif Sequenzen von HIV-1 infizierten Patienten aus Kapstadt charakterisiert, da bereits gezeigt wurde, dass das HIV Vif Protein die antiretrovirale Aktivität der Cytidin Deaminase APOBEC3G/F antagonisieren kann. Da jedoch keine Medikamenten induzierte Selektion auf diesen Sequenzen liegt, wurden diese zur Analyse der viralen Evolution verwendet. Phenotypische Resistenzanalysen basieren gegenwärtig meist auf dem HIV Subtyp B, jedoch sind die meisten Infizierten in Südafrika und sogar weltweit mit Subtyp C infiziert. Deshalb war es ein Ziel dieser Arbeit einen proviralen HIV Subtyp C Plasmid zu entwickeln. Dazu wurde das Virus aus einem frühen HIV Subtyp C Isolat kloniert. Das hier neu klonierte Virus (HIV-ZAC) zeigt sowohl einen höheren viralen Titer nach der Transfektion und auch eine höhere Replikationsrate als das zuvor publizierte HIV-1 Suptyp C Virus aus Botswana. Deshalb könnte der von mir optimierte und neu charakterisierte provirale molekulare Klon, pZAC, zukünftig in der Zellkultur und bei phenotypischen HIV Resistenztests als wildtypisches HIV-1 Suptyp C Virus eingesetzt werden. KW - HIV KW - Immunität KW - Südafrika KW - Tansania KW - HIV-1 KW - Subtyp C KW - HIV-1 KW - resistance KW - diversity KW - South Africa KW - Tanzania Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67319 ER - TY - THES A1 - Beisser, Daniela T1 - Integrated functional analysis of biological networks T1 - Integrierte funktionelle Analyse biologischer Netzwerke N2 - In recent years high-throughput experiments provided a vast amount of data from all areas of molecular biology, including genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Its analysis using bioinformatics methods has developed accordingly, towards a systematic approach to understand how genes and their resulting proteins give rise to biological form and function. They interact with each other and with other molecules in highly complex structures, which are explored in network biology. The in-depth knowledge of genes and proteins obtained from high-throughput experiments can be complemented by the architecture of molecular networks to gain a deeper understanding of biological processes. This thesis provides methods and statistical analyses for the integration of molecular data into biological networks and the identification of functional modules, as well as its application to distinct biological data. The integrated network approach is implemented as a software package, termed BioNet, for the statistical language R. The package includes the statistics for the integration of transcriptomic and functional data with biological networks, the scoring of nodes and edges of these networks as well as methods for subnetwork search and visualisation. The exact algorithm is extensively tested in a simulation study and outperforms existing heuristic methods for the calculation of this NP-hard problem in accuracy and robustness. The variability of the resulting solutions is assessed on perturbed data, mimicking random or biased factors that obscure the biological signal, generated for the integrated data and the network. An optimal, robust module can be calculated using a consensus approach, based on a resampling method. It summarizes optimally an ensemble of solutions in a robust consensus module with the estimated variability indicated by confidence values for the nodes and edges. The approach is subsequently applied to two gene expression data sets. The first application analyses gene expression data for acute lymphoblastic leukaemia (ALL) and differences between the subgroups with and without an oncogenic BCR/ABL gene fusion. In a second application gene expression and survival data from diffuse large B-cell lymphomas are examined. The identified modules include and extend already existing gene lists and signatures by further significant genes and their interactions. The most important novelty is that these genes are determined and visualised in the context of their interactions as a functional module and not as a list of independent and unrelated transcripts. In a third application the integrative network approach is used to trace changes in tardigrade metabolism to identify pathways responsible for their extreme resistance to environmental changes and endurance in an inactive tun state. For the first time a metabolic network approach is proposed to detect shifts in metabolic pathways, integrating transcriptome and metabolite data. Concluding, the presented integrated network approach is an adequate technique to unite high-throughput experimental data for single molecules and their intermolecular dependencies. It is flexible to apply on diverse data, ranging from gene expression changes over metabolite abundances to protein modifications in a combination with a suitable molecular network. The exact algorithm is accurate and robust in comparison to heuristic approaches and delivers an optimal, robust solution in form of a consensus module with confidence values. By the integration of diverse sources of information and a simultaneous inspection of a molecular event from different points of view, new and exhaustive insights into biological processes can be acquired. N2 - In den letzten Jahren haben Hochdurchsatz-Experimente gewaltige Mengen an molekularbiologischen Daten geliefert, angefangen mit dem ersten sequenzierten Genom von Haemophilus influenzae im Jahr 1995 und dem menschlichen Genom im Jahr 2001. Mittlerweile umfassen die resultierenden Daten neben der Genomik die Bereiche der Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik. Die Analyse der Daten mithilfe von bioinformatischen Methoden hat sich entsprechend mit verändert und weiterentwickelt. Durch neuartige, systembiologische Ansätze versucht man zu verstehen, wie Gene und die aus ihnen resultierenden Proteine, biologische Formen und Funktionen entstehen lassen. Dabei interagieren sie miteinander und mit anderen Molekülen in hoch komplexen Strukturen, welche durch neue Ansätze der Netzwerkbiologie untersucht werden. Das tiefgreifende Wissen über einzelne Moleküle, verfügbar durch Hochdurchsatz-Technologien, kann komplementiert werden durch die Architektur und dynamischen Interaktionen molekularer Netzwerke und somit ein umfassenderes Verständnis biologischer Prozesse ermöglichen. Die vorliegende Dissertation stellt Methoden und statistische Analysen zur Integration molekularer Daten in biologische Netzwerke, Identifikation robuster, funktionaler Subnetzwerke sowie die Anwendung auf verschiedenste biologische Daten vor. Der integrative Netzwerkansatz wurde als ein Softwarepaket, BioNet, in der statistischen Programmiersprache R implementiert. Das Paket beinhaltet statistische Verfahren zur Integration transkriptomischer und funktionaler Daten, die Gewichtung von Knoten und Kanten in biologischen Netzwerken sowie Methoden zur Suche signifikanter Bereiche, Module, und deren Visualisierung. Der exakte Algorithmus wird ausführlich in einer Simulationsstudie getestet und übertrifft heuristische Methoden zur Lösung dieses NP-vollständigen Problems in Genauigkeit und Robustheit. Die Variabilität der resultierenden Lösungen wird bestimmt anhand von gestörten integrierten Daten und gestörten Netzwerken, welche zufällige und verzerrende Einflüsse darstellen, die die Daten verrauschen. Ein optimales, robustes Modul kann durch einen Konsensusansatz bestimmt werden. Basierend auf einer wiederholten Stichprobennahme der integrierten Daten, wird ein Ensemble von Lösungen erstellt, aus welchem sich das robuste und optimale Konsensusmodul berechnen lässt. Zusätzlich erlaubt dieser Ansatz eine Schätzung der Variabilität des Konsensusmoduls und die Berechnung von Konfidenzwerte für Knoten und Kanten. Der Ansatz wird anschließend auf zwei Genexpressionsdatensätze angewandt. Die erste Anwendung untersucht Genexpressionsdaten für akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und analysiert Unterschiede in Subgruppen mit und ohne BRC/ABL Genfusion. Die zweite Anwendung wertet Genexpressions- und Lebenszeitdaten für diffuse großzellige B-Zell Lymphome (DLBCL) aus, beruhend auf molekularen Unterschieden zwischen zwei DLBCL Subtypen mit unterschiedlicher Malignität. In einer dritten Anwendung wird der integrierte Netzwerkansatz benutzt, um Veränderungen im Metabolismus von Tardigraden aufzuspüren und Signalwege zu identifizieren, welche für die extreme Anpassungsfähigkeit an wechselnde Umweltbedingungen und Überdauerung in einem inaktiven Tönnchenstadium verantwortlich sind. Zum ersten Mal wird dafür ein metabolischer Netzwerkansatz vorgeschlagen, der metabolische Veränderungen durch die Integration von metabolischen und transkriptomischen Daten bestimmt. Abschließend ist zu bemerken, dass die präsentierte integrierte Netzwerkanalyse eine adäquate Technik ist, um experimentelle Daten aus Hochdurchsatz-Methoden, die spezialisiert auf eine Molekülart sind, mit ihren intermolekularen Wechselwirkungen und Abhängigkeiten in Verbindung zu bringen. Sie ist flexibel in der Anwendung auf verschiedenste Daten, von der Analyse von Genexpressionsveränderungen, über Metabolitvorkommen bis zu Proteinmodifikationen, in Kombination mit einem geeigneten molekularen Netzwerk. Der exakte Algorithmus ist akkurat und robust in Vergleich zu heuristischen Methoden und liefert eine optimale, robuste Lösung in Form eines Konsensusmoduls mit zugewiesenen Konfidenzwerten. Durch die Integration verschiedenster Informationsquellen und gleichzeitige Betrachtung eines biologischen Ereignisses von diversen Blickwinkeln aus, können neue und vollständigere Erkenntnisse physiologischer Prozesse gewonnen werden. KW - Bioinformatik KW - differenzielle Genexpression KW - Bioinformatik KW - Netzwerkanalyse KW - differenzielle Genexpression KW - funktionelle Module KW - bioinformatics KW - networkanalysis KW - differential geneexpression KW - functional modules Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70150 ER - TY - THES A1 - Joseph, Julie T1 - Studying the role of Th17 cells in autoimmune diabetes and generation of a beta cell reporter mouse by lentiviral transgenesis T1 - Lentivirale transgene Technologie zur Erforschung der Rolle von Th17 Zellen im autoimmunen Diabetes und zur Generierung einer Beta-Zell-Reportermaus N2 - Type 1 diabetes affects around 0.5% of the population in developed countries and the incidence rates have been rising over the years. The destruction of beta cells is irreversible and the current therapy available to patients only manages the symptoms and does not prevent the associated pathological manifestations. The patients need lifelong therapy and intensive research is being carried out to identify ways to eliminate autoimmune responses directed against pancreatic beta cells and to replace or regenerate beta cells. The work presented herein aimed at analyzing the role of the Th17 T cell subset, characterized by secretion of the pro- inflammatory cytokine IL-17A, in autoimmune diabetes and also at generating a beta cell reporter mouse line in the NOD background, the most widely- used mouse model for type 1 diabetes. We generated IL- 17A knockdown (KD) NOD mice, using RNAi in combination with lentiviral transgenesis. We analyzed diabetes frequency in IL-17A deficient mice and found that the loss of IL-17A did not protect the transgenic mice from diabetes. Based on these observations, we believe that Th17 cells do not play a critical role in type 1 diabetes through the IL-17A pathway, though they might still be involved in the disease process through alternate pathways. We also generated NOD and NOD-SCID mice with a transgene that drives the beta cell specific expression of a luciferase reporter gene. We used a lentiviral construct, which combined a luciferase sequence and a short- hairpin RNA (shRNA) expression cassette, allowing gene- knockdown under the beta cell specific rat insulin promoter (RIP). These mice will be of use in studying beta cell phenotypes resulting from the knockdown of target genes, using non- invasive bioimaging. We believe that the generation of these reporter mouse lines for diabetes studies will prove valuable in future investigations. Furthermore, the demonstration that the loss of IL-17A does not alter susceptibility to type 1 diabetes should help clarify the controversial involvement of Th17 cells in this disease. N2 - In Industrieländern erkranken etwa 0,5 % der Bevölkerung an Typ-1-Diabetes und die Krankheitsrate ist in den letzten Jahren angestiegen. Die dabei stattfindende Zerstörung der insulinproduzierenden Beta-Zellen ist irreversibel und die derzeitig verfügbaren Therapien behandeln lediglich Symptome, verhindern die pathologischen Auswirkungen aber nicht. Patienten benötigen daher eine lebenslange Therapie und es wird intensiv daran gearbeitet, Wege zu identifizieren, die die autoimmune Antwort gegen pankreatische Beta-Zellen unterbinden, oder aber Beta-Zellen ersetzen, beziehungsweise regenerieren lassen. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, die Rolle der Th17 T-Zellen, welche durch die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-17A gekennzeichnet sind, in Typ-1- Diabetes zu analysieren. Zusätzlich wurden Reportermauslinien im NOD Hintergrund, dem am weitesten verbreiteten Mausmodell für Typ-1-Diabetes, generiert. Durch RNAi, in Kombination mit lentiviraler transgener Technologie, wurden IL-17A Knockdown (KD) NOD Mäuse generiert. Die Diabeteshäufigkeit in IL-17A defizienten Mäusen wurde mit dem Ergebnis untersucht, dass der Verlust von IL-17A die transgenen Mäuse nicht vor Diabetes schützt. Von dieser Beobachtung ausgehend wurde gefolgert, dass Th17 Zellen zumindest über den IL-17A Signalweg keine entscheidende Rolle bei Typ-1-Diabetes spielen, diese allerdings durch alternative Signalwege durchaus im Krankheitsprozess beteiligt sein könnten. Außerdem wurden NOD und NOD-SCID Mäuse mit einem Transgen, das die Beta-Zell spezifische Expression eines Luciferasereporters steuert, generiert. Hierbei wurde ein lentivirales Konstrukt genutzt, welches sowohl die Luciferase, als auch eine short-hairpin RNA (shRNA) Expressionssequenz beinhaltet, um einen Genknockdown unter Kontrolle des spezifischen Insulinpromotors der Ratte (RIP) zu erlauben. Diese Mäuse werden bei zukünftigen nicht-invasiven bildgebenden Untersuchungen des Beta-Zell Phänotyps, der aus dem Knockdown von Zielgenen resultiert, von großem Nutzen sein. In zukünftigen Untersuchungen wird sich die Generierung dieser Reportermauslininien für Diabetesstudien sicherlich als wertvoll erweisen. Des Weiteren sollte die Erkenntnis, dass der Verlust von IL-17A die Anfälligkeit für Typ-1-Diabetes nicht verändert, zu einem besseren Verständnis der kontrovers diskutierten Beteiligung der Th17 Zellen führen. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - RNS-Interferenz KW - Interleukin 17 KW - Diabetes KW - Insulin KW - type 1 diabetes KW - RNAi KW - Lentiviral transgenesis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66571 ER -