TY - THES A1 - Gaballa, Abdallah Hatem Hassan Hosny Ahmed T1 - PAF1c drives MYC-mediated immune evasion in pancreatic ductal adenocarcinoma T1 - PAF1c treibt die MYC-vermittelte Immunevasion im duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse an N2 - The expression of the MYC proto-oncogene is elevated in a large proportion of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Previous findings in PDAC have shown that this increased MYC expression mediates immune evasion and promotes S-phase progression. How these functions are mediated and whether a downstream factor of MYC mediates these functions has remained elusive. Recent studies identifying the MYC interactome revealed a complex network of interaction partners, highlighting the need to identify the oncogenic pathway of MYC in an unbiased manner. In this work, we have shown that MYC ensures genomic stability during S-phase and prevents transcription-replication conflicts. Depletion of MYC and inhibition of ATR kinase showed a synergistic effect to induce DNA damage. A targeted siRNA screen targeting downstream factors of MYC revealed that PAF1c is required for DNA repair and S-phase progression. Recruitment of PAF1c to RNAPII was shown to be MYC dependent. PAF1c was shown to be largely dispensable for cell proliferation and regulation of MYC target genes. Depletion of CTR9, a subunit of PAF1c, caused strong tumor regression in a pancreatic ductal adenocarcinoma model, with long-term survival in a subset of mice. This effect was not due to induction of DNA damage, but to restoration of tumor immune surveillance. Depletion of PAF1c resulted in the release of RNAPII with transcription elongation factors, including SPT6, from the bodies of long genes, promoting full-length transcription of short genes. This resulted in the downregulation of long DNA repair genes and the concomitant upregulation of short genes, including MHC class I genes. These data demonstrate that a balance between long and short gene transcription is essential for tumor progression and that interference with PAF1c levels shifts this balance toward a tumor-suppressive transcriptional program. It also directly links MYC-mediated S-phase progression to immune evasion. Unlike MYC, PAF1c has a stable, known folded structure; therefore, the development of a small molecule targeting PAF1c may disrupt the immune evasive function of MYC while sparing its physiological functions in cellular growth. N2 - Die Expression des MYC-Proto-Onkogens ist bei einem großen Teil der Patienten mit duktalem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) erhöht. Bisherige Erkenntnisse in der Erforschung des ankreaskarzinoms zeigen, dass die erhöhte MYCExpression die Umgehung des Immunsystems bewirkt und die Progression der S-Phase fördert. Wie diese Funktionen vermittelt werden und ob ein nachgeschalteter Faktor von MYC für diese Funktion verantwortlich ist, blieb jedoch bisher ungeklärt. Jüngste Studien zur Identifizierung des MYC-Interaktoms haben ein sehr komplexes Netzwerk an Interaktionspartnern von MYC aufgedeckt, was die Notwendigkeit unterstreicht, die onkogenen Eigenschaften von MYC und seinen Interaktionspartnern unvoreingenommen und genau zu untersuchen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MYC die genomische Stabilität während der S-Phase herstellt und Konflikte zwischen Transkription und Replikation verhindert. Die Depletion von MYC und die Hemmung der ATR-Kinase zeigten bei der Induktion von DNA Schäden eine synergistische Wirkung. Ein siRNA-Screen, der Gene beinhaltete, die MYC nachgeschaltet sind, ergab, dass PAF1c für die DNA-Reparatur und die S-PhasenProgression erforderlich ist. Es zeigte sich außerdem, dass die Rekrutierung von PAF1c an RNAPII von MYC abhängig ist. Für die Zellproliferation und die Regulierung von MYCZielgenen ist PAF1c jedoch weitgehend entbehrlich. Es konnte gezeigt werden, dass die Depletion von CTR9, einer Untereinheit von PAF1c, in einem murinen Modell des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zu einer starken Tumorregression mit langfristigem Überleben einiger Mäuse führte. Diese Wirkung war nicht auf die Induktion von DNA-Schäden zurückzuführen, sondern auf die Wiederherstellung der Immunüberwachung des Tumors. Die Deletion von PAF1c führte zu einer Umverteilung von RNAPII und Trankriptionselongationsfaktoren wie SPT6, von langen Genen hin zu kurzen Genen. Dadurch wurden lange Gene wie zum Beispiel DNA Reparaturgene nicht vollständig transkribiert, kurze Gene wie MHC-Klasse-I-Gene hingegen schon. Diese Daten zeigen, dass ein Gleichgewicht zwischen der Transkription langer und kurzer Gene für die Tumorprogression wichtig ist und dass eine Verminderung der PAF1c-Konzentration dieses Gleichgewicht in Richtung eines tumorsuppressiven Transkriptionsprogramms verschiebt. Außerdem besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der MYCvermittelten S-Phasen-Progression und der Umgehung des Immunsystems. Im Gegensatz zu MYC verfügt PAF1c über eine stabile und gut bekannte gefaltete Struktur. Daher könnte die Entwicklung eines kleinen Moleküls, das PAF1c hemmt, die Funktion von MYC zur Umgehung des Immunsystems stören und gleichzeitig seine physiologischen Funktionen für das Zellwachstum nicht beeinträchtigen. KW - Myc KW - Transkription KW - PAF1c KW - Transcription elongation KW - Immune evasion KW - Immunevasion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360459 ER - TY - THES A1 - Englmeier, Jana T1 - Consequences of climate change and land-use intensification for decomposer communities and decomposition processes T1 - Folgen von Klimawandel und intensiver Landnutzung für Zersetzergemeinschaften und Abbauprozesse N2 - The increase in intensively used areas and climate change are direct and indirect consequences of anthropogenic actions, caused by a growing population and increasing greenhouse gas emissions. The number of research studies, investigating the effects of land use and climate change on ecosystems, including flora, fauna, and ecosystem services, is steadily growing. This thesis contributes to this research area by investigating land-use and climate effects on decomposer communities (arthropods and microbes) and the ecosystem service ‘decomposition of dead material’. Chapter II deals with consequences of intensified land use and climate change for the ecosystem service ‘decomposition of dead organic material’ (necromass). Considering the severe decline in insects, we experimentally excluded insects from half of the study objects. The decomposition of both dung and carrion was robust to land-use changes. Dung decomposition, moreover, was unaffected by temperature and the presence/ absence of insects. Along the altitudinal gradient, however, highest dung decomposition was observed at medium elevation between 600 and 700 m above sea level (although insignificant). As a consequence, we assume that at this elevation there is an ideal precipitation:temperature ratio for decomposing organisms, such as earthworms or collembolans. Carrion decomposition was accelerated by increasing elevation and by the presence of insects, indicating that increasing variability in climate and an ongoing decline in insects could modify decomposition processes and consequently natural nutrient cycles. Moreover, we show that different types of dead organic material respond differently to environmental factors and should be treated separately in future studies. In Chapter III, we investigated land-use and climate effects on dung-visiting beetles and their resource specialization. Here, all beetles that are preferentially found on dung, carrion or other rotten material were included. Both α- and γ-diversity were strongly reduced in agricultural and urban areas. High precipitation reduced dung-visiting beetle abundance, whereas γ-diversity was lowest in the warmest regions. Resource specialization decreased with increasing temperatures. The results give evidence that land use as well as climate can alter dung-visiting beetle diversity and resource specialization and may hence influence the natural balance of beetle communities and their contribution to the ecosystem service ‘decomposition of dead material’. The following chapter, Chapter IV, contributes to the findings in Chapter II. Here, carrion decomposition is not only explained by land-use intensity and climate but also by diversity and community composition of two taxonomic groups found on carrion, beetles and bacteria. The results revealed a strong correlation between bacteria diversity and community composition with temperature. Carrion decomposition was to a great extent directed by bacterial community composition and precipitation. The role of beetles was neglectable in carrion decomposition. With this study, I show that microbes, despite their microscopic size, direct carrion decomposition and may not be neglected in future decomposition studies. In Chapter V a third necromass type is investigated, namely deadwood. The aim was to assess climate and land-use effects on deadwood-inhabiting fungi and bacteria. Main driver for microbial richness (measured as number of OTUs) was climate, including temperature and precipitation. Warmer climates promoted the diversity of bacteria, whereas fungi richness was unaffected by temperature. In turn, fungi richness was lower in urban landscapes compared to near-natural landscapes and bacteria richness was higher on meadows than on forest sites. Fungi were extremely specialized on their host tree, independent of land use and climate. Bacteria specialization, however, was strongly directed by land use and climate. These results underpin previous studies showing that fungi are highly specialized in contrast to bacteria and add new insights into the robustness of fungi specialization to climate and land use. I summarize that climate as well as intensive land use influence biodiversity. Temperature and precipitation, however, had positive and negative effects on decomposer diversity, while anthropogenic land use had mostly negative effects on the diversity of decomposers. N2 - Die Zunahme intensiv genutzter Landschaften und der Klimawandel sind direkte und indirekte Folgen menschlichen Handelns, verursacht durch eine wachsende Weltbevölkerung und zunehmende Mengen an Treibhausgasen. Die Zahl der wissenschaftlichen Studien, die sich mit den Veränderungen der Umwelt und den Konsequenzen für Ökosysteme, einschließlich Flora, Fauna und Ökosystemleistungen auseinandersetzen, steigt stetig. Mit dieser Thesis möchte ich meinen Beitrag zu diesem wichtigen und aktuellen Forschungsgebiet leisten. Dazu untersuche ich die Auswirkungen von Landnutzung und Klima auf die Ökosystemleistung „Zersetzung toten organischen Materials“ (Nekromasse) und die Auswirkungen auf die daran beteiligten Arthropoden- und Mikrobengemeinschaften. Kapitel II dieser Thesis setzt sich mit den Konsequenzen von intensiver Landnutzung und Klimawandel für die Ökosystemleistung „Zersetzung toten Materials“ auseinander. Unter Anbetracht des globalen Insektenrückgangs, wurde dieser Aspekt anhand eines Insektenausschluss-Experimentes zusätzlich simuliert. Es stellt sich heraus, dass sowohl der Abbau von Dung als auch von Aas sehr robust gegenüber landschaftlicher Nutzung war. Zudem blieb der Abbau von Dung unberührt von Temperaturänderungen und dem Ausschluss von Insekten. Entlang eines Höhengradienten wurde hingegen ein Trend zu einem unimodalen Muster mit maximaler Zersetzung bei ca. 600-700 m ü.M. beobachtet. Dieser Trend lässt vermuten, dass in dieser Höhe das Verhältnis von Niederschlag und Temperatur ideal für Dung zersetzende Gemeinschaften ist. Aas hingegen wurde in zunehmender Höhe und unter der Beteiligung von Insekten schneller zersetzt, was verdeutlich, dass Klimaänderungen und ein ansteigender Insektenrückgang starke Auswirkungen auf die Zersetzung von Aas und somit auf Nährstoffkreisläufe haben können. Hierbei wurde zudem ersichtlich, dass verschiedene Typen von Nekromasse unterschiedlich auf Umweltparameter reagieren und daher in künftigen Studien und Auswertungen separat betrachtet werden sollten. Kapitel III behandelt die Auswirkungen von Landnutzung und Klima auf die Biodiversität und Spezialisierung von Käfergemeinschaften an Dung. Hierbei wurden sämtliche Käfer berücksichtigt, welche vor allem an Dung, Aas oder sonstigem faulenden Material gefunden werden können. Sowohl α- als auch γ-Diversität von diesen Käfern wurde durch Agrarlandschaften und urbane Gebiete stark reduziert. Hohe Niederschlagsmengen wirkten sich negativ auf die Abundanz von Dungkäfern aus, wohingegen die γ-Diversität in warmen Regionen am niedrigsten war. Der Grad der Spezialisierung von Käfergemeinschaften auf verschiedene Dungressourcen nahm mit abnehmenden Temperaturen zu. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass sowohl intensive Landnutzung als auch Klimaveränderungen Auswirkungen auf die Diversität und den Spezialisierungsgrad von Käfergemeinschaften an Dung haben können und somit das ökologische Gleichgewicht der Dungkäfergemeinschaften und ihren Ökosystemfunktionen beeinflussen können. Das darauffolgende Kapitel IV stellt eine Ergänzung zu Kapitel II dar. Hier wird die Zersetzung von Aas nicht nur anhand von Landnutzung und Klima erklärt, sondern auch anhand der α-Diversität und der Artenzusammensetzung von Käfern und Bakterien an Aas diskutiert. Es zeigte sich, dass Abundanz und Artenzusammensetzung der Bakteriengemeinschaft an Aas vor allem von der Temperatur abhingen. Außerdem wurde die Zersetzungsgeschwindigkeit maßgeblich von der Bakteriengemeinschaft und der Niederschlagsmenge bestimmt. Mit dieser Studie konnte ich zeigen, dass Bakterien trotz ihrer mikroskopischen Größe maßgeblich an der Zersetzung von Aas beteiligt sind und diese in Zersetzungsversuchen nicht vernachlässigt werden sollten. Das letzte Kapitel, Kapitel V, befasst sich mit den Konsequenzen von intensiver Landnutzung und Klimawandel auf mikrobielle Gemeinschaften in Totholz. Untersucht wurden hier sowohl Bakterien- als auch Pilzgemeinschaften. Haupttreiber der Artenvielfalt für beide Gruppen (gemessen als Anzahl an OTUs) war das Klima (Niederschlag und Temperatur). Ein wärmeres Klima kam der Vielfalt von Bakterien zugute, wohingegen die Pilzvielfalt nicht tangiert wurde. Außerdem reagierten Pilze negativ auf urbane Landnutzung, Bakterienvielfalt in Totholz war auf Wiesen jedoch höher als im Wald. Vor allem Pilze zeigten eine sehr starke Bindung zu ihrem Wirtsbaum, welche auch von äußeren Einflüssen wie Landnutzung und Klima nicht beeinflusst werden konnte. Die Spezialisierung von Bakterien hingegen wurde stark von Landnutzung und Klima beeinflusst. Diese Ergebnisse untermauern frühere Studien, die besagen, dass Pilze hoch spezialisiert sind und geben neue Erkenntnisse zur Robustheit der Spezialisierung gegenüber Landnutzungsintensität und Klima. Zusammenfassend kann ich sagen, dass sowohl Klima als auch Landnutzung Auswirkungen auf die Biodiversität haben. Während Temperatur und Niederschlag jedoch positive so wie negative Effekte hatten, wirkte sich anthropogene Landnutzung überwiegend negativ auf die Diversität von Zersetzergemeinschaften aus. KW - Mikroorganismus KW - decomposition KW - Klimaänderung KW - Zersetzungsprozess KW - microbes KW - dead organic material KW - Mikroben Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313994 ER - TY - THES A1 - Kuklovsky [former Finke], Valerie T1 - Are some bees smarter than others? An examination of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees T1 - Sind manche Bienen schlauer als andere? Eine Untersuchung von konsistenten individuellen Unterschieden in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen N2 - Cognition refers to the ability to of animals to acquire, process, store and use vital information from the environment. Cognitive processes are necessary to predict the future and reduce the uncertainty of the ever-changing environment. Classically, research on animal cognition focuses on decisive cognitive tests to determine the capacity of a species by the testing the ability of a few individuals. This approach views variability between these tested key individuals as unwanted noise and is thus often neglected. However, inter-individual variability provides important insights to behavioral plasticity, cognitive specialization and brain modularity. Honey bees Apis mellifera are a robust and traditional model for the study of learning, memory and cognition due to their impressive capabilities and rich behavioral repertoire. In this thesis I have applied a novel view on the learning abilities of honey bees by looking explicitly at individual differences in a variety of learning tasks. Are some individual bees consistently smarter than some of her sisters? If so, will a smart individual always perform good independent of the time, the context and the cognitive requirements or do bees show distinct isolated ‘cognitive modules’? My thesis presents the first comprehensive investigation of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees. To speak of an individual as behaving consistently, a crucial step is to test the individual multiple times to examine the repeatability of a behavior. I show that free-flying bees remain consistent in a visual discrimination task for three consecutive days. Successively, I explored individual consistency in cognitive proficiency across tasks involving different sensory modalities, contexts and cognitive requirements. I found that free-flying bees show a cognitive specialization between visual and olfactory learning but remained consistent across a simple discrimination task and a complex concept learning task. I wished to further explore individual consistency with respect to tasks of different cognitive complexity, a question that has never been tackled before in an insect. I thus performed a series of four experiments using either visual or olfactory stimuli and a different training context (free-flying and restrained) and tested bees in a discrimination task, reversal learning and negative patterning. Intriguingly, across all these experiments I evidenced the same results: The bees’ performances were consistent across the discrimination task and reversal learning and negative patterning respectively. No association was evidenced between reversal learning and negative patterning. After establishing the existence of consistent individual differences in the cognitive proficiency of honey bees I wished to determine factors which could underlie these differences. Since genetic components are known to underlie inter-individual variability in learning abilities, I studied the effects of genetics on consistency in cognitive proficiency by contrasting bees originating from either from a hive with a single patriline (low genetic diversity) or with multiple patrilines (high genetic diversity). These two groups of bees showed differences in the patterns of individually correlated performances, indicating a genetic component accounts for consistent cognitive individuality. Another major factor underlying variability in learning performances is the individual responsiveness to sucrose solution and to visual stimuli, as evidenced by many studies on restrained bees showing a positive correlation between responsiveness to task relevant stimuli and learning performances. I thus tested whether these relationships between sucrose/visual responsiveness and learning performances are applicable for free-flying bees. Free-flying bees were again subjected to reversal learning and negative patterning and subsequently tested in the laboratory for their responsiveness to sucrose and to light. There was no evidence of a positive relationship between sucrose/visual responsiveness and neither performances of free-flying bees in an elemental discrimination, reversal learning and negative patterning. These findings indicate that relationships established between responsiveness to task relevant stimuli and learning proficiency established in the laboratory with restrained bees might not hold true for a completely different behavioral context i.e. for free-flying bees in their natural environment. These results show that the honey bee is an excellent insect model to study consistency in cognitive proficiency and to identify the underlying factors. I mainly discuss the results with respect to the question of brain modularity in insects and the adaptive significance of individuality in cognitive abilities for honey bee colonies. I also provide a proposition of research questions which tie in this theme of consistent cognitive proficiency and could provide fruitful areas for future research. N2 - Unter Kognition versteht man die Fähigkeit von Tieren, essenzielle Informationen aus der Umwelt zu erfassen, zu verarbeiten, zu speichern und zu nutzen. Kognitive Prozesse sind notwendig, um die Zukunft vorherzusagen und die Unvorhersehbarkeit der sich ständig verändernden Umwelt zu verringern. Die Forschung der Kognition von Tieren konzentriert sich klassischerweise auf entscheidende kognitive Tests, um die Fähigkeit einer Spezies anhand der Leistungen einiger weniger Individuen zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wird die Variabilität zwischen Individuen als unerwünschtes Rauschen betrachtet und daher vernachlässigt. Die interindividuelle Variabilität liefert jedoch wichtige Erkenntnisse über die Plastizität des Verhaltens, die kognitive Spezialisierung und die Modularität des Gehirns. Die Honigbiene Apis mellifera ist aufgrund ihrer eindrucksvollen Fähigkeiten und ihres reichen Verhaltensrepertoires ein robuster und traditioneller Modellorganismus für die Untersuchung von Lernen, Gedächtnis und Kognition. In dieser Arbeit habe ich das Lernverhalten von Honigbienen in einem neuen Blickwinkel betrachtet, indem ich explizit die individuellen Unterschiede bei diversen Lernaufgaben untersucht habe. Zeigen manche Bienen durchweg eine erhöhte Lernleistung im Vergleich zu ihren Schwestern? Wenn ja, erbringt ein Individuum unabhängig von der Zeit, dem Kontext und den kognitiven Anforderungen der Lernaufgaben immer gute Leistungen, oder zeigen Bienen ausgeprägte unabhängige "kognitive Module"? Die vorliegende Doktorarbeit stellt die erste umfassende Untersuchung konsistenter individueller Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen dar. Um von einem konsistenten Verhalten sprechen zu können, ist es entscheidend das Individuum mehrfach zu testen, um die Wiederholbarkeit eines Verhaltens zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass frei fliegende Bienen bei einer visuellen Unterscheidungsaufgabe an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine konsistente Lernleistung zeigen. Im Anschluss untersuchte ich die individuelle Konsistenz der kognitiven Fähigkeiten bei Lernaufgaben mit unterschiedlichen sensorischen Modalitäten, Kontexten und kognitiven Anforderungen. Frei fliegende Bienen zeigten eine kognitive Spezialisierung zwischen visuellem und olfaktorischem Lernen, während sie bei einer einfachen Unterscheidungsaufgabe und einer komplexen Konzeptlernaufgabe konsistent im Lernverhalten blieben. Anschließend wollte ich die individuelle Konsistenz im Lernverhalten bei Aufgaben unterschiedlicher kognitiver Komplexität weiter erforschen, eine Frage, die bisher noch nie bei einem Insekt behandelt wurde. Ich führte dazu eine Reihe von vier Experimenten durch, bei denen entweder visuelle oder olfaktorische Stimuli und ein unterschiedlicher Trainingskontext (frei fliegend oder eingespannt) verwendet wurden. Die Bienen wurden in einer Unterscheidungsaufgabe, einer Umlernaufgabe und in Negative Patterning getestet. Erstaunlicherweise wurden bei diesen Experimenten die gleichen Ergebnisse festgestellt: Die Lernleitung der Bienen in der Unterscheidungsaufgabe zeigte eine positive Korrelation mit der Lernleistung im Umlernen und Negative Patterning. Zwischen dem Umkehrlernen und Negative Patterning konnte jedoch kein Zusammenhang festgestellt werden. Nachdem ich festgestellt hatte, dass es konsistente individuelle Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Bienen gibt, wollte ich die Faktoren ermitteln, die diesen Unterschieden zugrunde liegen könnten. Es war bereits bekannt, dass genetische Komponenten der interindividuellen Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegen. Deshalb untersuchte ich den Einfluss von genetischer Vielfalt auf die Beständigkeit von kognitiven Fähigkeiten, indem ich Bienen gegenüberstellte, die entweder aus einem Bienenstock mit einer einzigen Patriline (geringe genetische Vielfalt) oder mit mehreren Patrilinen (hohe genetische Vielfalt) stammten. Diese beiden Gruppen von Bienen wiesen Unterschiede in den Mustern der individuellen korrelierten Lernleistungen auf, was darauf hindeutet, dass eine genetische Komponente für kognitive Individualität verantwortlich ist. Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher der Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegt, ist die individuelle Reaktionsfähigkeit auf Saccharose Lösungen und auf visuelle Stimuli. Dies wurde durch viele Studien an eingespannten Bienen gezeigt, die eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Reize und den Lernfähigkeiten feststellten. Ich habe daher untersucht, ob diese Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und visuellen Stimuli und den Lernleistungen auch für frei fliegende Bienen zutreffen. Die individuellen Lernleistungen im Umlernen und Negative patterning von frei fliegenden Bienen wurden erneut ermittelt und anschließend wurde im Labor die Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht getestet. Es gab keine Hinweise auf eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht und den Lernleistungen von frei fliegenden Bienen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Stimuli und der Lernleistung, die im Labor mit eingespannten Bienen festgestellt wurden, möglicherweise nicht für einen anderen Verhaltenskontext gelten, d. h. für frei fliegende Bienen in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Honigbiene ein hervorragendes Insektenmodell ist, um die Konsistenz kognitiver Fähigkeiten zu untersuchen und die zugrunde liegenden Faktoren zu ermitteln. Ich diskutiere die Ergebnisse vor allem im Hinblick auf die Frage der Modularität des Gehirns bei Insekten und die adaptive Bedeutung von individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten für Honigbienenvölker. Ich schlage auch Forschungsfragen vor, die mit individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten zusammenhängen und wertvolle Bereiche für künftige Forschungen darstellen könnten. KW - Lernen KW - Biene KW - Kognition KW - Individual differences KW - Cognitive consistency KW - Cognitive profile KW - Learning KW - Honeybee KW - Cognition Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323012 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Oliver T1 - Development of somatic modified mouse models of Non-Small cell lung cancer T1 - Entwicklung von somatisch veränderten Mausmodellen für nichtkleinzelligen Lungenkrebs N2 - In 2020, cancer was the leading cause of death worldwide, accounting for nearly 10 million deaths. Lung cancer was the most common cancer, with 2.21 million cases per year in both sexes. This non-homogeneous disease is further subdivided into small cell lung cancer (SCLC, 15%) and non-small cell lung cancer (NSCLC, 85%). By 2023, the American Cancer Society estimates that NSCLC will account for 13% of all new cancer cases and 21% of all estimated cancer deaths. In recent years, the treatment of patients with NSCLC has improved with the development of new therapeutic interventions and the advent of targeted and personalised therapies. However, these advances have only marginally improved the five-year survival rate, which remains alarmingly low for patients with NSCLC. This observation highlights the importance of having more appropriate experimental and preclinical models to recapitulate, identify and test novel susceptibilities in NSCLC. In recent years, the Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mouse model developed by Tuveson, Jacks and Berns has been the main in vivo model used to study NSCLC. This model mimics ADC and SCC to a certain extent. However, it is limited in its ability to reflect the genetic complexity of NSCLC. In this work, we use CRISPR/Cas9 genome editing with targeted mutagenesis and gene deletions to recapitulate the conditional model. By comparing the Trp53fl/fl KRaslsl- G12D/wt with the CRISPR-mediated Trp53mut KRasG12D, we demonstrated that both showed no differences in histopathological features, morphology, and marker expression. Furthermore, next-generation sequencing revealed a very high similarity in their transcriptional profile. Adeno-associated virus-mediated tumour induction and the modular design of the viral vector allow us to introduce additional mutations in a timely manner. CRISPR-mediated mutation of commonly mutated tumour suppressors in NSCLC reliably recapitulated the phenotypes described in patients in the animal model. Lastly, the dual viral approach could induce the formation of lung tumours not only in constitutive Cas9 expressing animals, but also in wildtype animals. Thus, the implementation of CRISPR genome editing can rapidly advance the repertoire of in vivo models for NSCLC research. Furthermore, it can reduce the necessity of extensive breeding. N2 - Krebs war mit fast 10 Millionen Todesfällen weltweit die häufigste Todesursache in 2020. Mit 2,21 Millionen Fällen pro Jahr in beiden Geschlechtern kombiniert war Lungenkrebs die häufigste Unterart. Auszeichnend für dieses Krankheit ist die hohe Komplexität und Heterogenität. Daher wird diese weiter in kleinzelligen Lungenkrebs (SCLC, 15 %) und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC, 85 %) unterteilt. Die American Cancer Society schätzt, dass bis 2023 13 % aller neuen Krebsfälle und 21 % aller geschätzten Krebstodesfälle auf das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom entfallen werden. In den letzten Jahren hat sich die Behandlung von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom durch die Entwicklung neuer therapeutischer Maßnahmen und das Anwenden personalisierter Therapien verbessert. Allerdings haben diese Fortschritte die Fünfjahresüberlebensrate nur geringfügig verbessert, die für Patienten mit NSCLC nach wie vor alarmierend niedrig ist. Diese macht deutlich, wie wichtig es ist, über geeignetere experimentelle und präklinische Modelle zu verfügen, um neue Therapieansätze beim NSCLC zu rekapitulieren, zu identifizieren und zu testen. In der letzten Dekade war das von Tuveson, Jacks und Berns entwickelte Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt-Mausmodell das wichtigste In-vivo-Modell zur Untersuchung von NSCLC. Dieses kann grundlegend das Krankheitsbild von NSCLC wiederspiegeln. Es ist jedoch nur begrenzt in der Lage, die genetische Komplexität von NSCLC im vollen Umfang zu refelktieren. In dieser Arbeit verwenden wir CRISPR/Cas9 Genome Editing mit gezielter Mutagenese und Gendeletionen, um das konditionale Modell zu rekapitulieren. Durch den Vergleich des Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mit dem CRISPR-vermittelten Trp53mut KRasG12D konnten wir zeigen, dass beide keine Unterschiede in Bezug auf histopathologische Merkmale, Morphologie und Markerexpression aufweisen. Darüber hinaus ergab die Analyse mittels Next Generation Sequencing 8Hochdruchsatz.Sequenzierung) eine sehr große Ähnlichkeit in ihrem Transkriptionsprofil. Die Adeno-assoziierte Virus-vermittelte Tumorinduktion und der modulare Aufbau des viralen Vektors ermöglichen es uns, zusätzliche Mutationen zeitnah einzuführen. Die CRISPR-vermittelte Mutation von häufig mutierten Tumorsuppressoren bei NSCLC rekapitulierte zuverlässig die bei Patienten beschriebenen Phänotypen im Tiermodell. Schließlich konnte der duale virale Ansatz die Bildung von Lungentumoren nicht nur in konstitutiv Cas9 exprimierenden Tieren, sondern auch in Wildtyp-Tieren induzieren. Somit kann die Anwendung von CRISPR-Genome Editing das Repertoire an In-vivo- Modellen für die NSCLC-Forschung rasch erweitern. Darüber hinaus kann es die Notwendigkeit umfangreicher Züchtungen verringern. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - in vivo KW - Lung Cancer KW - CRISPR/Cas9 KW - in vivo genome editing KW - Immunohistochemistry KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom KW - NSCLC KW - Mouse Model KW - CRISPR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363401 ER - TY - THES A1 - Aroko, Erick Onyango T1 - Trans-regulation of \(Trypanosoma\) \(brucei\) variant surface glycoprotein (VSG) mRNA and structural analysis of a \(Trypanosoma\) \(vivax\) VSG using X-ray crystallography T1 - Trans-regulierung der mRNA des variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und strukturelle Analyse eines \(Trypanosoma\) \(vivax\) VSG mittels Kristallstrukturanalyse N2 - African trypanosomes are unicellular parasites that cause nagana and sleeping sickness in livestock and man, respectively. The major pathogens for the animal disease include Trypanosoma vivax, T. congolense, and T. brucei brucei, whereas T. b. gambiense and T. b. rhodesiense are responsible for human infections. Given that the bloodstream form (BSF) of African trypanosomes is exclusively extracellular, its cell surface forms a critical boundary with the host environment. The cell surface of the BSF African trypanosomes is covered by a dense coat of immunogenic variant surface glycoproteins (VSGs). This surface protein acts as an impenetrable shield that protects the cells from host immune factors and is also involved in antibody clearance and antigenic variation, which collectively ensure that the parasite stays ahead of the host immune system. Gene expression in T. brucei is markedly different from other eukaryotes: most genes are transcribed as long polycistronic units, processed by trans-splicing a 39-nucleotide mini exon at the 5′ and polyadenylation at the 3′ ends of individual genes to generate the mature mRNA. Therefore, gene expression in T. brucei is regulated post-transcriptionally, mainly by the action of RNA binding proteins (RBPs) and conserved elements in the 3′ untranslated regions (UTR) of transcripts. The expression of VSGs is highly regulated, and only a single VSG gene is expressed at a time from one of the ~15 subtelomeric domains termed bloodstream expression sites (BES). When cells are engineered to simultaneously express two VSGs, the total VSG mRNA do not exceed the wild type amounts. This suggests that a robust VSG mRNA balancing mechanism exists in T. brucei. The present study uses inducible and constitutive expression of ectopic VSG genes to show that the endogenous VSG mRNA is regulated only if the second VSG is properly targeted to the ER. Additionally, the endogenous VSG mRNA response is triggered when high amounts of the GFP reporter with a VSG 3′UTR is targeted to the ER. Further evidence that non-VSG ER import signals can efficiently target VSGs to the ER is presented. This study suggests that a robust trans-regulation of the VSG mRNA is elicited at the ER through a feedback loop to keep the VSG transcripts in check and avoid overshooting the secretory pathway capacity. Further, it was shown that induction of expression of the T. vivax VSG ILDat1.2 in T. brucei causes a dual cell cycle arrest, with concomitant upregulation of the protein associated with differentiation (PAD1) expression. It could be shown that T. vivax VSG ILDat1.2 can only be sufficiently expressed in T. brucei after replacing its native GPI signal peptide with that of a T. brucei VSG. Taken together, these data indicate that inefficient VSG GPI anchoring and expression of low levels of the VSG protein can trigger differentiation from slender BSF to stumpy forms. However, a second T. vivax VSG, ILDat2.1, is not expressed in T. brucei even after similar modifications to its GPI signals. An X-ray crystallography approach was utilized to solve the N-terminal domain (NTD) structure of VSG ILDat1.2. This is first structure of a non-T. brucei VSG, and the first of a surface protein of T. vivax to be solved. VSG ILDat1.2 NTD maintains the three-helical bundle scaffold conserved in T. brucei surface proteins. However, it is likely that there are variations in the architecture of the membrane proximal region of the ILDat1.2 NTD and its CTD from T. brucei VSGs. The tractable T. brucei system is presented as a model that can be used to study surface proteins of related trypanosome species, thus creating avenues for further characterization of trypanosome surface coats. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind einzellige Parasiten, die Nagana in Nutzvieh und die Schlafkrankheit im Menschen verursachen. Zu den Hauptverursachern der Tierkrankheit gehören Trypanosoma vivax, T. congolense und T. brucei brucei, während T. b. gambiense und T. b. rhodesiense für Infektionen im Menschen verantwortlich sind. Da die Blutstromform (BSF) der afrikanischen Trypanosomen rein extrazellulär vorkommt, bildet die Zelloberfläche eine kritische Grenzregion mit der Wirtsumgebung. Die Zelloberoberfläche der BSF afrikanischer Trypanosomen ist mit einem dichten Mantel an immunogenen variablen Oberflächenglykoproteinen (variant surface glycoprotein, VSG) umgeben. Dieses Oberflächenprotein dient als Barriere zum Schutz gegen Faktoren des Wirtsimmunsystems und spielt ebenfalls eine Rolle in Antikörper-Clearance und antigener Variation, welche gemeinsam dafür sorgen, dass der Parasit dem Wirtsimmunsystem stets einen Schritt voraus bleibt. Die Genexpression von T. brucei weist dezidierte Unterschiede im Vergleich zu anderen Eukaryoten auf: Die meisten Gene werden als lange polyzystronische Einheiten transkribiert, die durch trans-Splicing eines Miniexons aus 39 Nukleotiden am 5′ und Polyadenylierung am 3′ Ende der individuellen Gene prozessiert wird. Daher wird die Genexpression in T. brucei posttranskriptionell reguliert, zumeist durch RNA Bindeproteine (RBPs) und konservierte Elemente in der 3′ untranslatierten Region (UTR). Die Expression der VSGs ist stark reguliert, so wird zu einer gegebenen Zeit stets nur ein VSG Gen aus einer von ~15 Subtelomerregionen, die Blutstrom Expressionsorte (bloodstream expression sites, BES) genannt werden, exprimiert. Zellen, die gentechnisch manipuliert wurden um zwei VSGs zu exprimieren, produzieren die gleiche Menge an VSG mRNA wie Wildtyp Zellen. Dies deutet auf die Existenz eines robusten Mechanismus zur Regulierung der Gesamt-VSG mRNA Menge in T. brucei hin. Diese Arbeit verwendet induzierbare sowie konstitutive Expression eines ektopischen VSG Gens um zu zeigen, dass die endogene VSG mRNA nur reguliert wird, wenn das zweite VSG zum ER gelangt. Außerdem wird die endogene VSG mRNA Antwort auch ausgelöst, wenn hohe Mengen eines GFP Reporters, der eine VSG 3′UTR enthält, zum ER geleitet wird. Weiterhin, wird gezeigt, dass ER Importsignale anderer Proteine VSGs effizient zum ER dirigieren können. Das Ergebnis dieser Studie deutet darauf hin, dass eine Rückkopplungsschleife am ER eine robuste trans-Regulation der VSG mRNA auslöst, die die VSG Transkripte limitiert und somit eine Überlastung des sekretorischen Wegs verhindert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es nach Induktion der Expression des T. vivax VSGs ILDat1.2 in T. brucei zu einem doppelten Zellzyklusarrest mit gleichzeitiger Hochregulation der Expression des protein associated with differentation (PAD1) kam und dass dieses T. vivax VSG nur nach Austausch des GPI Signalpeptids durch das eines T. brucei VSGs effizient exprimiert werden konnte. Zusammengenommen suggerieren diese Daten, dass eine ineffiziente GPI-Verankerung und wenig abundante Expression des VSGs die Differenzierung der sogenannten slender BSF zur sogenannten stumpy Form einleiten kann. Ein zweites T. vivax VSG, ILDat2.1, konnte hingegen auch nach Austausch des GPI Signals nicht in T. brucei exprimiert werden. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse wurde die Struktur der N-terminalen Domäne (NTD) des ILDat1.2 VSGs gelöst. Es handelt sich hierbei um die erste Proteinstruktur eines VSGs, welches nicht aus T. brucei stammt und die erste Struktur eines Oberflächenproteins von T. vivax. Das in T. brucei Oberflächenproteinen konservierte drei-Helix Grundgerüst ist auch in der NTD des ILDat1.2 VSGs enthalten. Die Architektur der Membranproximalen Gegend der IlDat1.2 NTD und CTD unterscheiden sich aber vermutlich von der der T. brucei VSGs. Das leicht handhabbare T. brucei System bietet somit ein geeignetes Modell um die Oberflächenproteine anderer afrikanischer Trypanosomen Spezies zu untersuchen und eröffnet neue Wege zur Charakterisierung ihrer Oberflächenmäntel. KW - Trypanosoma vivax KW - Trypanosoma brucei KW - Variant surface glycoprotein KW - messenger RNA KW - Regulation of expression KW - messenger RNA regulation KW - VSG structure Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241773 ER - TY - THES A1 - Heimberger, Kevin T1 - Regulation pathways of c-MYC under glutamine-starving conditions in colon carcinoma cells T1 - Regulierungsmechanismen von c-MYC in Darmkrebszellen unter Glutaminmangelbedingungen N2 - Colon carcinomas (CRC) are statistically among the most fatal cancer types and hence one of the top reasons for premature mortality in the developed world. CRC cells are characterized by high proliferation rates caused by deregulation of gene transcription of proto-oncogenes and general chromosomal instability. On macroscopic level, CRC cells show a strongly altered nutrient and energy metabolism. This work presents research to understand general links between the metabolism and transcription alteration. Mainly focussing on glutamine dependency, shown in colon carcinoma cells and expression pathways of the pro-proliferation protein c-MYC. Previous studies showed that a depletion of glutamine in the cultivation medium of colon carcinoma cell lines caused a proliferation arrest and a strong decrease of overall c-MYC levels. Re-addition of glutamine quickly replenished c-MYC levels through an unknown mechanism. Several proteins altering this regulation mechanism were identified and proposed as possible starting point for further in detail studies to unveil the precise biochemical pathway controlling c-MYC translation repression and reactivation in a rapid manner. On a transcriptional level the formation of RNA:DNA hybrids, so called R-loops, was observed under glutamine depleted conditions. The introduction and overexpression of RNaseH1, a R-loop degrading enzyme, in combination with an ectopically expressed c-MYC variant, independent of cellular regulation mechanisms by deleting the regulatory 3’-UTR of the c-MYC gene, lead to a high rate of apoptotic cells in culture. Expression of a functionally inactive variant of RNaseH1 abolished this effect. This indicates a regulatory function of R-loops formed during glutamine starvation in the presence of c-MYC protein in a cell. Degradation of R-loops and high c-MYC levels in this stress condition had no imminent effect on the cell cycle progression is CRC cells but disturbed the nucleotide metabolism. Nucleotide triphosphates were strongly reduced in comparison to starving cells without R-loop degradation and proliferating cells. This study proposes a model of a terminal cycle of transcription termination, unregulated initiation and elongation of transcription leading to a depletion of energy resources of cells. This could finally lead to high apoptosis of the cells. Sequencing experiments to determine a coinciding of termination sites and R-loop formation sides failed so far but show a starting point for further studies in this essential survival mechanism involving R-loop formation and c-MYC downregulation. N2 - Darmkrebs gehört statistisch zu den Krebsarten mit den höchsten Sterblichkeitsraten und zählen somit zu den häufigsten Todesursachen der entwickelten Länder. Darmkrebszellen zeichnen sich durch chromosomale Instabilität und hohe Proliferationsraten aus, die durch eine Deregulierung der Expression verschiedener Proto-Onkogene zustande kommen. Generell besitzen diese Krebszellen einen stark veränderten Nährstoff- und Energiestoffwechsel im Vergleich zu gesunden somatischen Zellen. Diese Arbeit strebt ein besseres Verständnis der Verbindung zwischen dem Metabolismus und der Gen-Expression an. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf dem Mechanismus der Expression des proliferationsfördernden Proteins c-MYC und der Abhängigkeit von Glutamin, die Darmkrebszellen charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Entzug von Glutamin aus dem Kulturmedium von Darmkrebszelllinien eine Arretierung des Zellzyklus bewirkt sowie die Konzentration des Proteins c-MYC reduziert. Erneute Zugabe von Glutamin zum Medium stellt die MYC-Konzentration schnell wieder her. Die Hintergründe dieses Mechanismus sind bislang aber kaum verstanden. Einige Proteine wurden hier als potenzielle Kandidaten identifiziert, die einen Einfluss auf den biochemischen Prozess haben könnten, der die schnelle Wiederaufnahme der c-MYC Translation gewährleistet. Auf Translationsebene wurden RNA:DNA-Hybriden, sogenannte R-loops, gefunden, die sich unter anderem unter Glutamin-Mangelbedingungen im Genom bilden können. Ein gezielter Abbau dieser R-loops mithilfe des Enzyms RNaseH1, in Kombination mit der ektopischen Expression einer c-MYC-Variante, die unempfindlich gegenüber der zelleigenen Regulationsmechanismen ist, führte zu einer erhöhten Anzahl an apoptotischen Zellen in Kultur. Exprimiert man eine funktionell inaktive Variante der RNaseH1, statt der funktionellen, so kann dieser Apoptose-fördernde Prozess nicht beobachtet werden. Dies bestärkt die Hypothese, dass die R-loops, die sich während eines Glutamin-Mangels und hoher c-MYC-Konzentration bilden, eine regulatorische Funktion innehaben. Als Ursache für die Apoptose konnte ein Effekt der veränderten Expression auf das Fortschreiten des Zellzyklus ausgeschlossen werden. Jedoch zeigte sich eine Veränderung im Nukleotid-Metabolismus. Betroffene Zellen zeigten deutlich reduzierte Nuklotidtriphosphat-Konzentrationen im Vergleich zu Zellen unter Glutaminmangelbedingungen ohne R-loop-Abbau. In dieser Arbeit wurde ein Modell entwickelt, das einen sich selbst negativ verstärkenden Zyklus vorschlägt, der die Zellen zur Apoptose führt. Transkriptionstermination und eine unkontrollierte Initiation der Transkription im Wechsel führt zu einem Verbrauch der lebensnotwendigen Energieressourcen der Zellen. Sequenzierungsexperimente zur Lokalisierung der R-loops und Terminationsstellen sind bislang fehlgeschlagen, bieten jedoch Ansätze für künftige Forschung. KW - Myc KW - cMYC regulation KW - Colorectal Cancer KW - Glutamine KW - Translation regulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363316 ER - TY - THES A1 - Hahn, Sarah T1 - Investigating non-canonical, 5' UTR-dependent translation of MYC and its impact on colorectal cancer development T1 - Untersuchung der nicht-kanonischen, 5' UTR-abhängigen Translation von MYC und ihres Einflusses auf die Entwicklung von Darmkrebs N2 - Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. N2 - Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird. KW - Myc KW - Translation KW - Colorectal cancer KW - 5' UTR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364202 ER - TY - THES A1 - Adhikari, Bikash T1 - Targeted degradation of Myc-interacting oncoproteins T1 - Gezielte Degradation von mit Myc interagierenden Onkoproteinen N2 - The hallmark oncoprotein Myc is a major driver of tumorigenesis in various human cancer entities. However, Myc’s structural features make it challenging to develop small molecules against it. A promising strategy to indirectly inhibit the function of Myc is by targeting its interactors. Many Myc-interacting proteins have reported scaffolding functions which are difficult to target using conventional occupancy- driven inhibitors. Thus, in this thesis, the proteolysis targeting chimera (PROTAC) approach was used to target two oncoproteins interacting with Myc which promote the oncogenicity of Myc, Aurora-A and WDR5. PROTACs are bifunctional small molecules that bind to the target protein with one ligand and recruit a cellular E3- ligase with the other ligand to induce target degradation via the ubiquitin- proteasome system. So far, the most widely used E3-ligases for PROTAC development are Cereblon (CRBN) and von Hippel–Lindau tumor suppressor (VHL). Furthermore, there are cases of incompatibility between some E3-ligases and proteins to bring about degradation. Hence there is a need to explore new E3- ligases and a demand for a tool to predict degradative E3-ligases for the target protein in the PROTAC field. In the first part, a highly specific mitotic kinase Aurora-A degrader, JB170, was developed. This compound utilized Aurora-A inhibitor alisertib as the target ligand and thalidomide as the E3-ligase CRBN harness. The specificity of JB170 and the ternary complex formation was supported by the interactions between Aurora-A and CRBN. The PROTAC-mediated degradation of Aurora-A induced a distinct S- phase defect rather than mitotic arrest, shown by its catalytic inhibition. The finding demonstrates that Aurora-A has a non-catalytic role in the S-phase. Furthermore, the degradation of Aurora-A led to apoptosis in various cancer cell lines. In the second part, two different series of WDR5 PROTACs based on two protein- protein inhibitors of WDR5 were evaluated. The most efficient degraders from both series recruited VHL as a E3-ligase and showed partial degradation of WDR5. In addition, the degradation efficiency of the PROTACs was significantly affected by the linker nature and length, highlighting the importance of linker length and composition in PROTAC design. The degraders showed modest proliferation defects at best in cancer cell lines. However, overexpression of VHL increased the degradation efficiency and the antiproliferative effect of the PROTACs. In the last part, a rapamycin-based assay was developed to predict the degradative E3-ligase for a target. The assay was validated using the WDR5/VHL and Aurora- A/CRBN pairs. The result that WDR5 is degraded by VHL but not CRBN and Aurora-A is degraded by CRBN, matches observations made with PROTACs. This technique will be used in the future to find effective tissue-specific and essential E3-ligases for targeted degradation of oncoproteins using PROTACs. Collectively, the work presented here provides a strategy to improve PROTAC development and a starting point for developing Aurora-A and WDR5 PROTACs for cancer therapy. N2 - Das Onkoprotein Myc ist ein wichtiger Faktor bei der Tumorentstehung in verschiedenen menschlichen Krebsarten. Die strukturellen Merkmale von Myc machen es jedoch schwierig, kleine Moleküle gegen dieses Protein zu entwickeln. Eine vielversprechende Strategie zur indirekten Hemmung der Funktion von Myc besteht darin, auf seine Interaktoren abzuzielen. Viele Proteine, die mit Myc interagieren, haben Gerüstfunktionen, die mit herkömmlichen Inhibitoren nur schwer zu hemmen sind. Daher wurde in dieser Arbeit der PROTAC-Ansatz (Proteolysis Targeting Chimera) verwendet, um zwei Onkoproteine, die mit Myc interagieren und die Onkogenität von Myc fördern, ins Visier zu nehmen: Aurora-A und WDR5. PROTACs sind bifunktionale kleine Moleküle, die mit einem Liganden an das Zielprotein binden und mit dem anderen Liganden eine zelluläre E3-Ligase rekrutieren, um den Abbau des Zielproteins über das Ubiquitin-Proteasom-System einzuleiten. Die bisher am häufigsten verwendeten E3-Ligasen für die Entwicklung von PROTACs sind Cereblon (CRBN) und der von Hippel-Lindau-Tumorsuppressor (VHL). Außerdem gibt es Fälle von Inkompatibilität zwischen einigen E3-Ligasen und Proteinen, die abgebaut werden sollen. Daher besteht die Notwendigkeit, neue E3-Ligasen zu erforschen und Werkzeuge zur Vorhersage abbauender E3-Ligasen für das Zielprotein zu entwickeln. Im ersten Teil wurde ein hochspezifischer Degrader der mitotischen Kinase Aurora-A, JB170, entwickelt. Bei dieser Verbindung wurde der Aurora-A-Inhibitor Alisertib als Zielligand und Thalidomid als Binder für die E3-Ligase CRBN verwendet. Die Spezifität von JB170 und die ternäre Komplexbildung wurden durch die Wechselwirkungen zwischen Aurora-A und CRBN unterstützt. Der durch PROTAC vermittelte Abbau von Aurora-A führte zu einem deutlichen Defekt in der S-Phase und nicht zu einem mitotischen Stillstand, wie es für dessen katalytische Hemmung beobachtet wurde. Dies zeigt, dass Aurora-A eine nicht-katalytische Funktion in der S-Phase hat. Außerdem führte der Abbau von Aurora-A in verschiedenen Krebszelllinien zur Apoptose. Im zweiten Teil wurden zwei verschiedene Serien von WDR5 PROTACs auf der Grundlage von zwei Protein-Protein-Inhibitoren von WDR5 untersucht. Die effizientesten Degrader aus beiden Serien rekrutierten VHL als E3-Ligase und zeigten einen teilweisen Abbau von WDR5. Darüber hinaus wurde die Abbaueffizienz der PROTACs erheblich von der Art und Länge des Linkers beeinflusst, was die Bedeutung der Linkerlänge und -zusammensetzung bei der Entwicklung von PROTACs unterstreicht. Die Abbauprodukte zeigten bestenfalls bescheidene Proliferationsdefekte in Krebszelllinien. Eine Überexpression von VHL erhöhte jedoch die Abbaueffizienz und den antiproliferativen Effekt der PROTACs. Im letzten Teil wurde ein auf Rapamycin basierender Assay entwickelt, um die abbauende E3-Ligase für ein Target vorherzusagen. Der Assay wurde anhand der Paare WDR5/VHL und Aurora-A/CRBN validiert. Das Ergebnis, dass WDR5 von VHL, aber nicht von CRBN abgebaut wird und Aurora-A von CRBN abgebaut wird, stimmt mit den Beobachtungen überein, die mit PROTACs gemacht wurden. Diese Technik wird in Zukunft eingesetzt werden, um wirksame gewebespezifische und essentielle E3-Ligasen für den gezielten Abbau von Onkoproteinen mit Hilfe von PROTACs zu finden. Insgesamt bieten die hier vorgestellten Arbeiten eine Strategie zur Verbesserung der PROTAC-Entwicklung und einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von Aurora-A- und WDR5-PROTACs für die Krebstherapie. KW - Degradation KW - PROTACs KW - Oncoprotein KW - Cancer KW - Onkoprotein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317326 ER - TY - THES A1 - Schwebs, Marie T1 - Structure and dynamics of the plasma membrane: a single-molecule study in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Die Struktur und Dynamik der Plasmamembran: eine Einzelmolekülstudie in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular, flagellated parasite Trypanosoma brucei is the causative agent of human African sleeping sickness and nagana in livestock. In the last decades, it has become an established eukaryotic model organism in the field of biology, as well as in the interdisciplinary field of biophysics. For instance, the dense variant surface glycoprotein (VSG) coat offers the possibility to study the dynamics of GPI-anchored proteins in the plasma membrane of living cells. The fluidity of the VSG coat is not only an interesting object of study for its own sake, but is critically important for the survival of the parasite in the mammalian host. In order to maintain the integrity of the coat, the entire VSG coat is recycled within a few minutes. This is surprisingly fast for a purely diffusive process with the flagellar pocket (FP) as the sole site for endo- and exocytosis. Previous studies characterising VSG dynamics using FRAP reported diffusion coefficients that were not sufficient to to enable fast turnover based on passive VSG randomisation on the trypanosome surface. In this thesis, live-cell single-molecule fluorescence microscopy (SMFM) was employed to elucidate whether VSG diffusion coefficients were priorly underestimated or whether directed forces could be involved to bias VSGs towards the entrance of the FP. Embedding the highly motile trypanosomes in thermo-stable hydrogels facilitated the investigation of VSG dynamics on living trypanosomes at the mammalian host's temperature of 37°C. To allow for a spatial correlation of the VSG dynamics to the FP entrance, a cell line was employed harbouring a fluorescently labelled structure as a reference. Sequential two-colour SMFM was then established to allow for recording and registration of the dynamic and static single-molecule information. In order to characterise VSG dynamics, an algorithm to obtain reliable information from short trajectories was adapted (shortTrAn). It allowed for the quantification of the local dynamics in two distinct scenarios: diffusion and directed motion. The adaptation of the algorithm to the VSG data sets required the introduction of an additional projection filter. The algorithm was further extended to take into account the localisation errors inherent to single-particle tracking. The results of the quantification of diffusion and directed motion were presented in maps of the trypanosome surface, including an outline generated from a super-resolved static structure as a reference. Information on diffusion was displayed in one map, an ellipse plot. The colour code represented the local diffusion coefficient, while the shape of the ellipses provided an indication of the diffusion behaviour (aniso- or isotropic diffusion). The eccentricity of the ellipses was used to quantify deviations from isotropic diffusion. Information on directed motion was shown in three maps: A velocity map, representing the amplitude of the local velocities in a colour code. A quiver plot, illustrating the orientation of directed motion, and a third map which indicated the relative standard error of the local velocities colour-coded. Finally, a guideline based on random walk simulations was used to identify which of the two motion scenarios dominated locally. Application of the guideline to the VSG dynamics analysed by shortTrAn yielded supermaps that showed the locally dominant motion mode colour-coded. I found that VSG dynamics are dominated by diffusion, but several times faster than previously determined. The diffusion behaviour was additionally characterised by spatial heterogeneity. Moreover, isolated regions exhibiting the characteristics of round and elongated traps were observed on the cell surface. Additionally, VSG dynamics were studied with respect to the entrance of the FP. VSG dynamics in this region displayed similar characteristics compared to the remainder of the cell surface and forces biasing VSGs into the FP were not found. Furthermore, I investigated a potential interference of the attachment of the cytoskeleton to the plasma membrane with the dynamics of VSGs which are anchored to the outer leaflet of the membrane. Preliminary experiments were conducted on osmotically swollen trypanosomes and trypanosomes depleted for a microtubule-associated protein anchoring the subpellicular microtubule cytoskeleton to the plasma membrane. The measurements revealed a trend that detachment of the cytoskeleton could be associated with a reduction in the VSG diffusion coefficient and a loss of elongated traps. The latter could be an indication that these isolated regions were caused by underlying structures associated with the cytoskeleton. The measurements on cells with an intact cytoskeleton were complemented by random walk simulations of VSG dynamics with the newly determined diffusion coefficient on long time scales not accessible in experiments. Simulations showed that passive VSG randomisation is fast enough to allow for a turnover of the full VSG coat within a few minutes. According to an estimate based on the known rate of endocytosis and the newly determined VSG diffusion coefficient, the majority of exocytosed VSGs could escape from the FP to the cell surface without being immediately re-endocytosed. N2 - Der einzellige, begeißelte Parasit Trypanosoma brucei ist der Erreger der humanen Afrikanischen Schlafkrankheit und Nagana bei Nutztieren. In den vergangenen Jahrzehnten hat er sich sowohl in der Biologie als auch im interdisziplinären Bereich der Biophysik als eukaryotischer Modellorganismus etabliert. So bietet der dichte variant surface glycoprotein (VSG) Mantel beispielsweise die Möglichkeit, die Dynamik von GPI-verankerten Proteinen in der Plasmamembran von lebenden Zellen zu untersuchen. Die Fluidität des VSG-Mantels ist nicht nur um ihrer selbst Willen ein interessantes Studienobjekt, sondern auch von entscheidender Bedeutung für das Überleben des Parasiten im Säugetierwirt. Damit die Integrität des Mantels erhalten bleibt, wird der gesamte VSG Mantel kontinuierlich innerhalb weniger Minuten ausgetauscht. Dies ist erstaunlich schnell für einen rein diffusiven Prozess, bei welchem die Geißeltasche (GT) der einzige Ort für Endo- und Exozytose ist. Bisherige Studien zur Charakterisierung der VSG Dynamik mit FRAP ermittelten Diffusionskoeffizienten, welche nicht ausreichten, um einen schnellen Austausch durch eine passive Randomisierung der VSG auf der Trypanosomenoberfläche zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie (EMFM) an lebenden Zellen eingesetzt, um herauszufinden, ob die VSG Diffusionskoeffizienten zuvor unterschätzt wurden oder ob gerichtete Kräfte beteiligt sein könnten, um VSGs zum Eingang der GT zu leiten. Die Einbettung der hochmotilen Trypanosomen in thermostabilen Hydrogelen erlaubte die Analyse der VSG Dynamik auf lebenden Trypanosomen bei einer Temperatur des Säugetierwirts von 37°C. Um eine räumliche Korrelation der VSG Dynamik mit dem Eingang zur GT zu ermöglichen, wurde eine Zelllinie verwendet, die eine fluoreszenzmarkierte Struktur als Referenz besaß. Anschließend wurde die sequenzielle EMFM in zwei Farben etabliert, um sowohl die Aufzeichnung als auch die Registrierung der dynamischen und statischen Einzelmolekülinformationen zu gewährleisten. Um die VSG Dynamik zu charakterisieren, wurde ein Algorithmus zur Gewinnung von zuverlässigen Informationen aus kurzen Trajektorien adaptiert (shortTrAn). Dieser ließ die Quantifizierung der lokalen Dynamik anhand zweier unterschiedlicher Szenarien zu: Diffusion und gerichtete Bewegung. Die Anpassung des Algorithmus an die VSG Datensätze erforderte die Einführung eines zusätzlichen Projektionsfilters. Darüber hinaus wurde der Algorithmus erweitert, um die Lokalisierungsfehler zu berücksichtigen, die bei der Verfolgung von Einzelpartikeln unvermeidbar auftreten. Anschließend wurden die Ergebnisse der Quantifizierung von Diffusion und gerichteter Bewegung in Karten präsentiert, die die Trypanosomenoberfläche abbildeten, einschließlich eines Umrisses, der als Referenz aus einer hochaufgelösten statischen Struktur generiert wurde. Die Informationen zur Diffusion wurden in einer Karte, einem Ellipsenplot, dargestellt. Dabei repräsentierte eine Farbkodierung die lokalen Diffusionskoeffizienten, während die Form der Ellipsen einen Hinweis auf das Diffusionsverhalten (aniso- oder isotrope Diffusion) gab. Die Exzentrizität der Ellipsen wurde hierbei genutzt, um die Abweichung von isotroper Diffusion zu quantifizieren. Die Informationen zur gerichteten Bewegung wurden in drei Karten wiedergegeben: Eine Karte für die Geschwindigkeit zeigte die Amplitude der lokalen Geschwindigkeiten farbkodiert. Ein Köcherplot veranschaulichte die Richtung der Geschwindigkeit und eine dritte Karte zeigte den relativen Standardfehler der lokalen Geschwindigkeiten farblich kodiert an. Abschließend wurde ein auf Random-Walk-Simulationen basierender Leitfaden herangezogen, um zu entscheiden, welches der beiden Szenarien lokal dominierte. Die Anwendung des Leitfadens auf die mit shortTrAn analysierte VSG Dynamik ergab Übersichtskarten, in denen der lokal dominierende Bewegungsmodus farblich kodiert war. Ich konnte zeigen, dass die VSG Dynamik von der Diffusion dominiert wird. Jedoch war diese um ein Vielfaches schneller als bisher angenommen. Das Diffusionsverhalten war zudem durch eine räumliche Heterogenität charakterisiert. Des Weiteren wurden auf der Zelloberfläche isolierte Regionen beobachtet, die die Eigenschaften von runden und länglichen Fallen aufwiesen. Zusätzlich wurde die VSG Dynamik in Bezug auf den Eingang der GT untersucht. Die VSG Dynamik in dieser Region wies ähnliche Kennwerte auf wie die restliche Zelloberfläche, und es konnten keine Kräfte festgestellt werden, welche die VSGs in die GT dirigieren. Des Weiteren habe ich den potenziellen Einfluss der Verankerung des Zytoskeletts an der Plasmamembran auf die Dynamik der VSGs untersucht, die in der äußeren Membranschicht verankert sind. Hierzu wurden vorläufige Experimente auf osmotisch geschwollenen Trypanosomen und Trypanosomen durchgeführt, denen ein Mikrotubuli assoziiertes Protein fehlte, welches das subpellikuläre Mikrotubuli-Zytoskelett an der Plasmamembran verankert. Bei den Messungen wurde ein Trend festgestellt, wonach die Ablösung des Zytoskeletts mit einer Verringerung des VSG Diffusionskoeffizienten und dem Verlust der länglichen Fallen korrelieren könnte. Letzteres könnte ein Hinweis darauf sein, dass diese isolierten Regionen durch darunter liegende, mit dem Zytoskelett verbundene Strukturen verursacht wurden. Die Messungen auf Zellen mit intaktem Zytoskelett wurden durch Random-Walk-Simulationen von VSG Trajektorien mit dem neu ermittelten Diffusionskoeffizienten auf langen, experimentell nicht zugänglichen Zeitskalen ergänzt. Die Simulationen zeigten, dass die passive Randomisierung der VSGs schnell genug ist, um einen Austausch des gesamten VSG Mantels innerhalb weniger Minuten zu ermöglichen. Einer Schätzung zufolge, die auf der bekannten Endozytoserate und dem neu ermittelten VSG Diffusionskoeffizienten basierte, könnte der Großteil der exozytierten VSGs aus der GT zur Zelloberfläche gelangen, ohne unmittelbar wieder endozytiert zu werden. KW - Trypanosoma brucei KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Membranproteine KW - Diffusionskoeffizient KW - Single-molecule fluorescence microscopy KW - Single-molecule tracking KW - Variant surface glycoprotein KW - GPI-anchored protein KW - Diffusion coefficient KW - Zellskelett KW - Zytoskelett Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275699 ER - TY - THES A1 - Dehmer, Markus T1 - A novel USP11-TCEAL1-mediated mechanism protects transcriptional elongation by RNA Polymerase II T1 - Ein neuer USP11-TCEAL1 vermittelter Mechanismus schützt die transkriptionelle Elongation der RNA Polymerase II N2 - Deregulated expression of MYC oncoproteins is a driving event in many human cancers. Therefore, understanding and targeting MYC protein-driven mechanisms in tumor biology remain a major challenge. Oncogenic transcription in MYCN-amplified neuroblastoma leads to the formation of the MYCN-BRCA1-USP11 complex that terminates transcription by evicting stalling RNAPII from chromatin. This reduces cellular stress and allows reinitiation of new rounds of transcription. Basically, tumors with amplified MYC genes have a high demand on well orchestration of transcriptional processes-dependent and independent from MYC proteins functions in gene regulation. To date, the cooperation between promoter-proximal termination and transcriptional elongation in cancer cells remains still incomplete in its understanding. In this study the putative role of the dubiquitinase Ubiquitin Specific Protease 11 (USP11) in transcription regulation was further investigated. First, several USP11 interaction partners involved in transcriptional regulation in neuroblastoma cancer cells were identified. In particular, the transcription elongation factor A like 1 (TCEAL1) protein, which assists USP11 to engage protein-protein interactions in a MYCN-dependent manner, was characterized. The data clearly show that TCEAL1 acts as a pro-transcriptional factor for RNA polymerase II (RNAPII)-medi- ated transcription. In detail, TCEAL1 controls the transcription factor S-II (TFIIS), a factor that assists RNAPII to escape from paused sites. The findings claim that TCEAL1 outcompetes the transcription elongation factor TFIIS in a non-catalytic manner on chromatin of highly expressed genes. This is reasoned by the need regulating TFIIS function in transcription. TCEAL1 equili- brates excessive backtracking and premature termination of transcription caused by TFIIS. Collectively, the work shed light on the stoichiometric control of TFIIS demand in transcriptional regulation via the USP11-TCEAL1-USP7 complex. This complex protects RNAPII from TFIIS-mediated termination helping to regulate productive transcription of highly active genes in neuroblastoma. N2 - Die deregulierte Expression von MYC Onkoproteinen ist ein zentrales Event in vielen huma-nen Krebsarten. Aus diesem Grund sind das Verständnis und die gezielte Bekämpfung MYC-getriebener Mechanismen in der Tumorbiologie nach wie vor eine große Herausforderung. In MYCN-amplifizierten Neuroblastomen führt eine übermäßig hohe Transkriptionsrate zur stress-bedingten Rekrutierung des MYCN-BRCA1-USP11-Komplexes. Dieser Komplex be-endet vorzeitig die Transkription, indem er RNAPII Moleküle vom Chromatin wirft. Durch diesen Mechanismus wird zellulärer Stress reduziert und ermöglicht dadurch einen erneuten Start der Transkription. Grundsätzlich stellen Tumoren mit einer Amplifikation von einem der MYC Proteine hohe Anforderungen an eine feine Abstimmung der einzelnen Schritte in der Transkription. Dies ist sowohl abhängig als auch unabhängig von den bereits beschriebe-nen Funktionen der MYC-Proteine in der Genregulation. Bis heute ist das Zusammenspiel zwischen promoter-proximaler Termination und transkriptioneller Elongation noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Studie wurde eine potenzielle Rolle von USP11 in der Regulation der Transkription weitergehend untersucht. Zunächst wurden mehrere Interaktionspartner von USP11, die an der Regulation der Transkription in Neuroblastom Krebszellen beteiligt sind, identifiziert. Es wurde insbesondere das Transcription Elongation Factor A Like 1 (TCEAL1) Protein charak-terisiert. Dieses Protein unterstützt USP11 dabei, Protein-Protein-Interaktionen MYCN-vermittelt einzugehen. Die Daten zeigen, dass TCEAL1 als pro-transkriptioneller Faktor für die RNA-Polymerase II (RNAPII) -vermittelte Transkription fungiert. Genauer, TCEAL1 kontrolliert den Transkriptionsfaktor S-II (TFIIS), einen Faktor, der der RNAPII dabei hilft, die Transkription nach einem kurzen Pausieren („pausing“) fortzusetzen. Die Ergebnisse zei-gen, dass TCEAL1 den Elongationsfaktor TFIIS auf nicht-katalytische Weise von dem Chromatin von hochexprimierten Genen verdrängt. Dies ist darin begründet, dass die Funkti-on von TFIIS bei der Transkription reguliert werden muss. TCEAL1 gleicht übermäßiges Zurückwandern der RNAPII und die vorzeitige Beendigung der Transkription, das durch TFIIS vermittelt wird, aus. Diese Arbeit gibt Aufschluss über die stöchiometrische Kontrolle des TFIIS-Bedarfs bei der Transkriptionsregulation durch den USP11-TCEAL1-USP7-Komplex. Dieser Komplex schützt die RNAPII vor der TFIIS-vermittelter Termination der Transkription und trägt zur Regulierung einer produktiven Transkription hochaktiver Gene im Neuroblastom bei. KW - Transkription KW - N-Myc KW - Transcription Regulation KW - Pause Release KW - Ubiquitin Specific Protease 11 KW - transcription elongation factor A (SII)-like 1 (TCEAL1) KW - RNA Polymerase II (RNAPII) KW - Transcriptional Stress Response Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360544 ER - TY - THES A1 - Amini, Emad T1 - How central and peripheral clocks and the neuroendocrine system interact to time eclosion behavior in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Wie zentrale und periphere Uhren und das neuroendokrine System zusammenwirken, um das Schlupfverhalten von \(Drosophila\) \(melanogaster\) zeitlich festzulegen N2 - To grow larger, insects must shed their old rigid exoskeleton and replace it with a new one. This process is called molting and the motor behavior that sheds the old cuticle is called ecdysis. Holometabolic insects have pupal stages in between their larval and adult forms, during which they perform metamorphosis. The pupal stage ends with eclosion, i.e., the emergence of the adult from the pupal shell. Insects typically eclose at a specific time during the day, likely when abiotic conditions are at their optimum. A newly eclosed insect is fragile and needs time to harden its exoskeleton. Hence, eclosion is regulated by sophisticated developmental and circadian timing mechanisms. In Drosophila melanogaster, eclosion is limited to a daily time window in the morning, regarded as the “eclosion gate”. In a population of laboratory flies entrained by light/dark cycles, most of the flies eclose around lights on. This rhythmic eclosion pattern is controlled by the circadian clock and persists even under constant conditions. Developmental timing is under the control of complex hormonal signaling, including the steroid ecdysone, insulin-like peptides, and prothoracicotropic hormone (PTTH). The interactions of the central circadian clock in the brain and a peripheral clock in the prothoracic gland (PG) that produces ecdysone are important for the circadian timing of eclosion. These two clocks are connected by a bilateral pair of peptidergic PTTH neurons (PTTHn) that project to the PG. Before each molt, the ecdysone level rises and then falls shortly before ecdysis. The falling ecdysone level must fall below a certain threshold value for the eclosion gate to open. The activity of PTTHn is inhibited by short neuropeptide F (sNPF) from the small ventrolateral neurons (sLNvs) and inhibition is thought to lead to a decrease in ecdysone production. The general aim of this thesis is to further the understanding of how the circadian clock and neuroendocrinal pathways are coordinated to drive eclosion rhythmicity and to identify when these endocrinal signaling pathways are active. In Chapter I, a series of conditional PTTHn silencing-based behavioral assays, combined with neuronal activity imaging techniques such as non-invasive ARG-Luc show that PTTH signaling is active and required shortly before eclosion and may serve to phase-adjust the activity of the PG at the end of pupal development. Trans-synaptic anatomical stainings identified the sLNvs, dorsal neurons 1 (DN1), dorsal neurons 2 (DN2), and lateral posterior neurons (LPNs) clock neurons as directly upstream of the PTTHn. Eclosion motor behavior is initiated by Ecdysis triggering hormone (ETH) which activates a pair of ventromedial (Vm) neurons to release eclosion hormone (EH) which positively feeds back to the source of ETH, the endocrine Inka cells. In Chapter II trans-synaptic tracing showed that most clock neurons provide input to the Vm and non-canonical EH neurons. Hence, clock can potentially influence the ETH/EH feedback loop. The activity profile of the Inka cells and Vm neurons before eclosion is described. Vm and Inka cells are active around seven hours before eclosion. Interestingly, all EH neurons appear to be exclusively peptidergic. In Chapter III, using chemoconnectomics, PTTHns were found to express receptors for sNPF, allatostatin A (AstA), allatostatin C (AstC), and myosuppressin (Ms), while EH neurons expressed only Ms and AstA receptors. Eclosion assays of flies with impaired AstA, AstC, or Ms signaling do not show arrhythmicity under constant conditions. However, optogenetic activation of the AstA neurons strongly suppresses eclosion. Chapter IV focuses on peripheral ventral’ Tracheal dendrite (v’Td) and class IV dendritic arborization (C4da) neurons. The C4da neurons mediate larval light avoidance through endocrine PTTH signaling. The v’Td neurons mainly receive O2/CO2 input from the trachea and are upstream of Vm neurons but are not required for eclosion rhythmicity. Conditional ablation of the C4da neurons or torso (receptor of PTTH) knock-out in the C4da neurons impaired eclosion rhythmicity. Six to seven hours before eclosion, PTTHn, C4da, and Vm neurons are active based on ARG-Luc imaging. Thus, C4da neurons may indirectly connect the PTTHn to the Vm neurons. In summary, this thesis advances our knowledge of the temporal activity and role of PTTH signaling during pupal development and rhythmic eclosion. It further provides a comprehensive characterization of the synaptic and peptidergic inputs from clock neurons to PTTHn and EH neurons. AstA, AstC, and Ms are identified as potential modulators of eclosion circuits and suggest an indirect effect of PTTH signaling on EH signaling via the peripheral sensory C4da neurons. N2 - Um zu wachsen, müssen Insekten ihr altes, starres Exoskelett abwerfen und durch ein neues ersetzen. Dieser Vorgang wird als Häutung bezeichnet, und das motorische Verhalten, bei dem die alte Kutikula abgestoßen wird, heißt Ekdysis. Holometabole Insekten haben zwischen ihrer Larven- und Erwachsenenform ein Puppenstadium, in welchem sie eine Metamorphose durchlaufen. Das Puppenstadium endet mit dem Schlüpfen des erwachsenen Tieres aus der Puppenhülle. Die Insekten schlüpfen in der Regel zu einem bestimmten Zeitpunkt am Tag, wenn die abiotischen Bedingungen optimal sind, da das frisch geschlüpfte Insekt zerbrechlich ist und Zeit braucht, um sein Exoskelett auszuhärten. Daher wird der Schlupf durch ausgeklügelte Mechanismen der Entwicklung und der inneren Uhr gesteuert. Bei Drosophila melanogaster ist der Sclupf auf ein tägliches Zeitfenster am Morgen beschränkt, das als "Schlupffenster" bezeichnet wird. In einer Population von Laborfliegen, die durch Licht/Dunkel-Zyklen gesteuert wird, schlüpfen die meisten Fliegen in etwa um das Einschalten der Beleuchtung. Dieses rhythmische Schlupfmuster wird von der inneren Uhr gesteuert und bleibt auch unter konstanten Bedingungen bestehen. Das Timing der Entwicklung wird von komplexen hormonellen Signalen gesteuert, darunter das Steroid Ecdyson, insulinähnliche Peptide und das prothorakotrope Hormon (PTTH). Die Wechselwirkungen zwischen der zentralen zirkadianen Uhr im Gehirn und einer peripheren Uhr in der Prothorakaldrüse (PG), die Ecdyson produziert, sind wichtig für die zirkadiane Zeitsteuerung des Schlupfs. Diese beiden Uhren sind durch ein bilaterales Paar peptiderger PTTH-Neuronen (PTTHn) verbunden, die in die PG projizieren. Vor jeder Häutung steigt der Ecdysonspiegel an und fällt dann kurz vor danach wieder ab. Der fallende Ecdysonspiegel muss einen bestimmten Schwellenwert unterschreiten, damit sich das Schlupffenster öffnen kann. Die Aktivität der PTTHn wird durch das kurze Neuropeptid F (sNPF) aus den kleinen ventrolateralen Neuronen (sLNvs) gehemmt, und es wird angenommen, dass die Hemmung zu einer Abnahme der Ecdysonproduktion führt. Das allgemeine Ziel dieser Thesis besteht darin, die Koordination zwischen der zirkadianen Uhr und den neuroendokrinen Signalwegen zur Steuerung der Eklosionsrhythmik weiter zu charakterisieren und zu ermitteln, wann diese endokrinen Signalwege aktiv sind. In Kapitel I zeigen eine Reihe von Verhaltenstests, die auf der konditionalen Ausschaltung von PTTHn basieren, in Kombination mit Techniken zur Darstellung neuronaler Aktivität, wie z. B. nicht-invasives ARG-Luc imaging, dass PTTH-Signale kurz vor dem Schlupf aktiv und erforderlich sind und zur Phasenanpassung der Aktivität der PG am Ende der Puppenentwicklung dienen könnten. Trans-synaptische anatomische Färbungen identifizierten die sLNvs, die dorsalen Neuronen 1 (DN1), die dorsalen Neuronen 2 (DN2) und die lateralen posterioren Neuronen (LPNs) als Uhrneuronen, die dem PTTHn direkt vorgeschaltet sind. Das motorische Schlupfverhalten wird durch das Ecdysis-auslösende Hormon (ETH) ausgelöst, das ein Paar ventromedialer (Vm) Neuronen zur Freisetzung des Eklosionshormons (EH) anregt, welches positiv an die Quelle des ETH, die endokrinen Inka-Zellen, zurückkoppelt. In Kapitel II zeigte die trans-synaptische Nachverfolgung, dass die meisten Uhrneuronen Input für die Vm- und nicht-kanonischen EH-Neuronen liefern, sodass die Uhr möglicherweise die ETH/EH-Rückkopplungsschleife beeinflussen kann. Das Aktivitätsprofil der Inka-Zellen und Vm-Neuronen vor dem Schlupf wird beschrieben. Vm- und Inka-Zellen sind etwa sieben Stunden vor dem Schlupf aktiv. Interessanterweise scheinen alle EH-Neuronen ausschließlich peptiderg zu sein. In Kapitel III wurde mit Hilfe von Chemoconnectomics festgestellt, dass PTTH-Neuronen Rezeptoren für sNPF, Allatostatin A (AstA), Allatostatin C (AstC) und Myosuppressin (Ms) exprimieren, während EH nur Ms- und AstA-Rezeptoren exprimieren. Eklosionsversuche mit Fliegen, deren AstA-, AstC- oder Ms-Signalübertragung beeinträchtigt ist, zeigen unter konstanten Bedingungen keine Arrhythmie. Eine optogenetische Aktivierung der AstA-Neuronen führt jedoch zu einer starken Unterdrückung des Schlupfs. Kapitel IV konzentriert sich auf die peripheren ventralen Trachealdendritischen Neurone (v'Td) und dendritische Verzweigungsneurone der Klasse IV (C4da). Die C4da-Neuronen vermitteln die Lichtvermeidung der Larven durch endokrine PTTH-Signale. Die v'Td-Neuronen erhalten hauptsächlich O2/CO2-Input aus den Tracheen und sind den Vm-Neuronen vorgeschaltet, werden aber für die Schlupfrhythmik nicht benötigt. Die bedingte Ablation der C4da-Neuronen und das Knock-out von torso (Rezeptor für PTTH) in den C4da-Neuronen beeinträchtigten die Schlupfrhythmik. Sechs bis sieben Stunden vor dem Schlupf sind die PTTHn-, C4da- und Vm-Neuronen aktiv. Somit könnten C4da-Neuronen indirekt die PTTHn mit den Vm-Neuronen verbinden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit unser Wissen über das zeitliche Aktivitätsmuster und der Rolle des PTTH signalling während der Puppenentwicklung und dem rhythmisches Schlupf erweitert. Sie liefert auch eine umfassende Charakterisierung der synaptischen und peptidergen Eingänge von Uhrneuronen zu PTTHn- und EH-Neuronen. AstA, AstC und Ms wurden als potenzielle Modulatoren der neuronalen Schlupfschaltkreise identifiziert und deuten auf einen indirekten Effekt der PTTH-Signalgebung auf das EH signalling über die peripheren sensorischen C4da-Neuronen hin. KW - Prothoracicotropic hormone KW - Prothoracic gland KW - Eclosion KW - Eclosion hormone KW - C4da KW - v’Td KW - Neuropeptide KW - Neuroendokrines System KW - Taufliege Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-361309 ER - TY - THES A1 - Gabel, Martin Sebastian T1 - Behavioural resistance to \(Varroa\) \(destructor\) in the Western honeybee \(Apis\) \(mellifera\) - Mechanisms leading to decreased mite reproduction T1 - Resistenzverhalten der Westlichen Honigbiene \(Apis\) \(mellifera\) gegen \(Varroa\) \(destructor\) - Zu verringerter Milbenreproduktion führende Mechanismen N2 - The Western Honeybee (Apis mellifera) is among the most versatile species in the world. Its adaptability is rooted in thousands of the differently specialized individuals acting jointly together. Thus, bees that are able to handle a certain task or condition well can back up other individuals less capable to do so on the colony level. Vice versa, the latter individuals might perform better in other situations. This evolutionary recipe for success ensures the survival of colonies despite challenging habitat conditions. In this context, the ectoparasitic mite Varroa destructor reflects the most pronounced biotic challenge to honeybees worldwide. Without proper treatment, infested colonies rapidly dwindle and ultimately die. Nevertheless, resistance behaviours against this parasite have evolved in some populations through natural selection, enabling colonies to survive untreated. In this, different behaviours appear to be adapted to the respective habitat conditions and may complement each other. Yet, the why and how of this behavioural response to the mite remains largely unknown. My thesis focuses on the biological background of Varroa-resistance traits in honeybees and presents important findings for the comprehension of this complex host-parasite interaction. Based on this, I draw implications for both, applied bee breeding and scientific investigations in the field of Varroa-resistance. Specifically, I focus on two traits commonly found in resistant and, to a lower degree, also mite-susceptible colonies: decreased mite reproduction and the uncapping and subsequent recapping of sealed brood cells. Examining failures in the reproductive success of mites as a primary mechanism of Varroa-resistance, I was able to link them to specific bee behaviours and external factors. Since mite reproduction and the brood rearing of bees are inevitably connected, I first investigated the effects of brood interruption on the reproductive success of mites. Brood interruption decreased the reproductive success of mites both immediately and in the long term. By examining the causes of reproductive failure, I could show that this was mainly due to an increased share of infertile mites. Furthermore, I proved that interruption in brood rearing significantly increased the expression of recapping behaviour. These findings consequently showed a dynamic modulation of mite reproduction and recapping, as well as a direct effect of brood interruption on both traits. To further elucidate the plasticity in the expression of both traits, I studied mite reproduction, recapping behaviour and infestation levels over the course of three years. The resulting extensive dataset unveiled a significant seasonal variation in mite reproduction and recapping. In addition, I show that recapping decreases the reproductive success of mites by increasing delayed developing female offspring and cells lacking male offspring. By establishing a novel picture-based brood investigation method, I could furthermore show that both the removal of brood cells and recapping activity specifically target brood ages in which mite offspring would be expected. Recapping, however, did not cause infertility of mites. Considering the findings of my first study, this points towards complementary mechanisms. This underlines the importance of increased recapping behaviour and decreased mite reproduction as resistance traits, while at the same time emphasising the challenges of reliable data acquisition. To pave the way for a practical application of these findings in breeding, we then investigated the heritability (i.e., the share of genotypic variation on the observed phenotypic variation) of the accounted traits. By elaborating comparable test protocols and compiling data from over 4,000 colonies, we could, for the first time, demonstrate that recapping of infested cells and decreased reproductive success of mites are heritable (and thus selectable) traits in managed honeybee populations. My thesis proves the importance of recapping and decreased mite reproduction as resistance traits and therefore valuable goals for breeding efforts. In this regard, I shed light on the underlying mechanisms of both traits, and present clear evidence for their interaction and heritability. N2 - Die Westliche Honigbiene (Apis mellifera) zählt zu den anpassungsfähigsten Arten der Welt. Diese Anpassungsfähigkeit liegt in der Zusammenarbeit tausender unterschiedlich spezialisierter Individuen begründet. Auf Volksebene können Bienen, die mit einer bestimmten Aufgabe oder Situation gut umgehen können, andere Individuen, die dies weniger gut können, absichern. Andererseits können Letztere womöglich mit anderen Situationen besser umgehen. Dieses evolutionäre Erfolgskonzept sichert das Überleben der Völker selbst unter herausfordernden Habitatbedingungen. Die ektoparasitäre Milbe Varroa destructor stellt in diesem Zusammenhang weltweit die größte biotische Herausforderung dar. Ohne entsprechende Behandlung siechen die Völker rasch dahin und sterben schlussendlich. In einigen Populationen haben sich jedoch Resistenzmechanismen durch natürliche Selektion herausgebildet, die es den Völkern ermöglichen, ohne Behandlung zu überleben. Die verschiedenen Verhaltensweisen scheinen dabei an die jeweiligen Habitatbedingungen angepasst zu sein und sich gegenseitig zu ergänzen. Was diese Reaktion auf die Milben auslöst und wie sie funktioniert ist allerdings noch weitestgehend unbekannt. Meine Dissertation fokussiert den biologischen Hintergrund von Varroa-resistenzmechanismen bei Honigbienen und stellt dabei wichtige Erkenntnisse zum Verständnis dieser komplexen Parasit-Wirt-Beziehung vor. Darauf aufbauend leite ich Implikationen für die angewandte Bienenzucht und wissenschaftliche Untersuchungen auf dem Gebiet der Varroa-resistenz ab. Hierbei konzentriere ich mich insbesondere auf zwei Merkmale, die häufig in resistenten Völkern zu finden sind: die reduzierte Milbenreproduktion und das Entdeckeln und Wiederverdeckeln bereits verschlossener Brutzellen. Beide Merkmale treten in geringerem Umfang auch in milbenanfälligen Populationen auf und sind daher von besonderem Interesse für jedwede Zuchtbemühung mit dem Ziel der Varroa-resistenz. Durch die Untersuchung von Fehlern in der Reproduktion der Milben, konnte ich diesen Hauptmechanismus der Varroa-resistenz mit Verhaltensweisen der Bienen, sowie äußeren Faktoren in Verbindung setzen. Da die Milbenvermehrung untrennbar mit der Brutaufzucht der Bienen verbunden ist, habe ich zunächst die Einflüsse von Brutunterbrechungen auf den Vermehrungserfolg der Milben untersucht. Diese Untersuchung zeigte auf, dass Brutunterbrechungen den Vermehrungserfolg der Milben sowohl kurzfristig, als auch langfristig herabsetzen. Durch die Untersuchung der jeweils zugrundeliegenden Ursachen gescheiterter Milbenreproduktion konnte ich zeigen, dass dies vor Allem auf einen gesteigerten Anteil infertiler Milben zurückzuführen war. Des Weiteren konnte ich beweisen, dass die Unterbrechung der Brutaufzucht die Ausprägung des Wiederverdeckelns signifikant verstärkte. Folglich zeigten diese Ergebnisse eine dynamische Anpassung der Milbenreproduktion und des Wiederverdeckelns, sowie einen direkten Einfluss der Brutunterbrechungen auf beide Eigenschaften. Um die Plastizität der Ausprägung beider Merkmale genauer zu erklären, untersuchte ich daraufhin drei Jahre lang die Milbenvermehrung, das Verhalten des Wiederverdeckelns, sowie die Befallsentwicklung. Daraus resultierte ein umfangreicher Datensatz, der eine signifikante saisonale Variation der Milbenvermehrung und des Wiederverdeckelns belegte. Ich konnte außerdem eindeutig beweisen, dass das Wiederverdeckeln den Reproduktionserfolg der Milben herabsetzt, indem es die Anteile von verzögert heranwachsenden weiblichen Nachkommen und fehlenden Männchen steigert. Durch Anwendung einer neuartigen Bild-basierten Methode der Brutuntersuchung, konnte ich darüber hinaus zeigen, dass sich sowohl das Ausräumen, als auch das Wiederverdeckeln von Brutzellen auf Brutalter konzentriert, in denen Milbennachwuchs erwartet werden würde. Das Wiederverdeckeln trug jedoch nicht zur Infertilität der Milben bei, was zusammen mit den Ergebnissen meiner ersten Untersuchung auf komplementäre Mechanismen hinweist. Dies unterstreicht die Bedeutung des Wiederverdeckelns und der verminderten Milbenreproduktion als Resistenzmechanismen, hebt aber gleichzeitig auch die Herausforderungen einer verlässlichen Datenerhebung hervor. Um den Weg für die praktische Anwendung dieser Erkenntnisse in der Zuchtarbeit zu ebnen, untersuchten wir daraufhin die Erblichkeit (den Anteil der genotypischen Variation an der beobachteten phänotypischen Variation) der betrachteten Merkmale. Durch das Erarbeiten vergleichbarer Prüfprotokolle und Zusammenführen von Daten aus über 4000 Völkern, konnten wir erstmalig zeigen, dass das Wiederverdeckeln befallener Zellen und der verminderte Vermehrungserfolg der Milben erbliche und damit selektierbare Merkmale in bewirtschafteten Honigbienenpopulationen sind. Meine Dissertation beweist die Relevanz des Wiederverdeckelns und der verminderten Milbenreproduktion als Resistenzmerkmale und damit lohnende Ziele für Zuchtbemühungen. In diesem Zusammenhang beleuchtete ich verschiedene Mechanismen, die der Ausprägung beider Merkmale zugrunde liegen und lieferte eindeutige Beweise für deren Interaktion und Erblichkeit. KW - Varroa destructor KW - Resistenz KW - Biene KW - mite non-reproduction KW - recapping KW - Varroa resistance KW - biotechnical Varroa control KW - heritability KW - selection KW - honeybees KW - Varroa mites KW - Züchtung KW - Apis mellifera KW - Breeding Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360536 ER - TY - JOUR A1 - Rackevei, Antonia S. A1 - Karnkowska, Anna A1 - Wolf, Matthias T1 - 18S rDNA sequence–structure phylogeny of the Euglenophyceae (Euglenozoa, Euglenida) JF - Journal of Eukaryotic Microbiology N2 - The phylogeny of Euglenophyceae (Euglenozoa, Euglenida) has been discussed for decades with new genera being described in the last few years. In this study, we reconstruct a phylogeny using 18S rDNA sequence and structural data simultaneously. Using homology modeling, individual secondary structures were predicted. Sequence–structure data are encoded and automatically aligned. Here, we present a sequence–structure neighbor‐joining tree of more than 300 taxa classified as Euglenophyceae. Profile neighbor‐joining was used to resolve the basal branching pattern. Neighbor‐joining, maximum parsimony, and maximum likelihood analyses were performed using sequence–structure information for manually chosen subsets. All analyses supported the monophyly of Eutreptiella, Discoplastis, Lepocinclis, Strombomonas, Cryptoglena, Monomorphina, Euglenaria, and Colacium. Well‐supported topologies were generally consistent with previous studies using a combined dataset of genetic markers. Our study supports the simultaneous use of sequence and structural data to reconstruct more accurate and robust trees. The average bootstrap value is significantly higher than the average bootstrap value obtained from sequence‐only analyses, which is promising for resolving relationships between more closely related taxa. KW - euglena KW - euglenids KW - phylogenetics KW - secondary structure Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311896 VL - 70 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Kerner, Janika M. A1 - Krauss, Jochen A1 - Maihoff, Fabienne A1 - Bofinger, Lukas A1 - Classen, Alice T1 - Alpine butterflies want to fly high: Species and communities shift upwards faster than their host plants JF - Ecology N2 - Despite sometimes strong codependencies of insect herbivores and plants, the responses of individual taxa to accelerating climate change are typically studied in isolation. For this reason, biotic interactions that potentially limit species in tracking their preferred climatic niches are ignored. Here, we chose butterflies as a prominent representative of herbivorous insects to investigate the impacts of temperature changes and their larval host plant distributions along a 1.4‐km elevational gradient in the German Alps. Following a sampling protocol of 2009, we revisited 33 grassland plots in 2019 over an entire growing season. We quantified changes in butterfly abundance and richness by repeated transect walks on each plot and disentangled the direct and indirect effects of locally assessed temperature, site management, and larval and adult food resource availability on these patterns. Additionally, we determined elevational range shifts of butterflies and host plants at both the community and species level. Comparing the two sampled years (2009 and 2019), we found a severe decline in butterfly abundance and a clear upward shift of butterflies along the elevational gradient. We detected shifts in the peak of species richness, community composition, and at the species level, whereby mountainous species shifted particularly strongly. In contrast, host plants showed barely any change, neither in connection with species richness nor individual species shifts. Further, temperature and host plant richness were the main drivers of butterfly richness, with change in temperature best explaining the change in richness over time. We concluded that host plants were not yet hindering butterfly species and communities from shifting upwards. However, the mismatch between butterfly and host plant shifts might become a problem for this very close plant–herbivore relationship, especially toward higher elevations, if butterflies fail to adapt to new host plants. Further, our results support the value of conserving traditional extensive pasture use as a promoter of host plant and, hence, butterfly richness. KW - Alps KW - altitudinal gradient KW - global warming KW - grazing KW - Lepidoptera KW - mountain biodiversity KW - plant–herbivore interactions KW - species range shifts KW - upslope shift Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312015 VL - 104 IS - 1 ER - TY - JOUR A1 - Fricke, Ute A1 - Redlich, Sarah A1 - Zhang, Jie A1 - Benjamin, Caryl S. A1 - Englmeier, Jana A1 - Ganuza, Cristina A1 - Haensel, Maria A1 - Riebl, Rebekka A1 - Rojas‐Botero, Sandra A1 - Tobisch, Cynthia A1 - Uhler, Johannes A1 - Uphus, Lars A1 - Steffan‐Dewenter, Ingolf T1 - Earlier flowering of winter oilseed rape compensates for higher pest pressure in warmer climates JF - Journal of Applied Ecology N2 - Global warming can increase insect pest pressure by enhancing reproductive rates. Whether this translates into yield losses depends on phenological synchronisation of pests with their host plants and natural enemies. Simultaneously, landscape composition may mitigate climate effects by shaping the resource availability for pests and their antagonists. Here, we study the combined effects of temperature and landscape composition on pest abundances, larval parasitism, crop damage and yield, while also considering crop phenology, to identify strategies for sustainable management of oilseed rape (OSR) pests under warming climates. In all, 29 winter OSR crop fields were investigated in different climates (defined by multi‐annual mean temperature, MAT) and landscape contexts in Bavaria, Germany. We measured abundances of adult pollen beetles and stem weevil larvae, pollen beetle larval parasitism, bud loss, stem damage and seed yield, and calculated the flowering date from growth stage observations. Landscape parameters (proportion of non‐crop and OSR area, change in OSR area relative to the previous year) were calculated at six spatial scales (0.6–5 km). Pollen beetle abundance increased with MAT but to different degrees depending on the landscape context, that is, increased less strongly when OSR proportions were high (1‐km scale), interannually constant (5‐km scale) or both. In contrast, stem weevil abundance and stem damage did not respond to landscape composition nor MAT. Pollen beetle larval parasitism was overall low, but occasionally exceeded 30% under both low and high MAT and with reduced OSR area (0.6‐km scale). Despite high pollen beetle abundance in warm climates, yields were high when OSR flowered early. Thereby, higher temperatures favoured early flowering. Only among late‐flowering OSR crop fields yield was higher in cooler than warmer climates. Bud loss responded analogously. Landscape composition did not substantially affect bud loss and yield. Synthesis and applications: Earlier flowering of winter OSR compensates for higher pollen beetle abundance in warmer climates, while interannual continuity of OSR area prevents high pollen beetle abundance in the first place. Thus, regional coordination of crop rotation and crop management promoting early flowering may contribute to sustainable pest management in OSR under current and future climatic conditions. KW - canola KW - climate‐smart pest management KW - crop rotation KW - global warming KW - oilseed rape KW - pollen beetle KW - seed yield KW - stem weevil Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312562 VL - 60 IS - 2 SP - 365 EP - 375 ER - TY - JOUR A1 - Graus, Dorothea A1 - Li, Kunkun A1 - Rathje, Jan M. A1 - Ding, Meiqi A1 - Krischke, Markus A1 - Müller, Martin J. A1 - Cuin, Tracey Ann A1 - Al‐Rasheid, Khaled A. S. A1 - Scherzer, Sönke A1 - Marten, Irene A1 - Konrad, Kai R. A1 - Hedrich, Rainer T1 - Tobacco leaf tissue rapidly detoxifies direct salt loads without activation of calcium and SOS signaling JF - New Phytologist N2 - Salt stress is a major abiotic stress, responsible for declining agricultural productivity. Roots are regarded as hubs for salt detoxification, however, leaf salt concentrations may exceed those of roots. How mature leaves manage acute sodium chloride (NaCl) stress is mostly unknown. To analyze the mechanisms for NaCl redistribution in leaves, salt was infiltrated into intact tobacco leaves. It initiated pronounced osmotically‐driven leaf movements. Leaf downward movement caused by hydro‐passive turgor loss reached a maximum within 2 h. Salt‐driven cellular water release was accompanied by a transient change in membrane depolarization but not an increase in cytosolic calcium ion (Ca\(^{2+}\)) level. Nonetheless, only half an hour later, the leaves had completely regained turgor. This recovery phase was characterized by an increase in mesophyll cell plasma membrane hydrogen ion (H\(^{+}\)) pumping, a salt uptake‐dependent cytosolic alkalization, and a return of the apoplast osmolality to pre‐stress levels. Although, transcript numbers of abscisic acid‐ and Salt Overly Sensitive pathway elements remained unchanged, salt adaptation depended on the vacuolar H\(^{+}\)/Na\(^{+}\)‐exchanger NHX1. Altogether, tobacco leaves can detoxify sodium ions (Na\(^{+}\)) rapidly even under massive salt loads, based on pre‐established posttranslational settings and NHX1 cation/H+ antiport activity. Unlike roots, signaling and processing of salt stress in tobacco leaves does not depend on Ca\(^{2+}\) signaling. KW - calcium signaling KW - cytosolic pH KW - leaf response KW - NaCl transport KW - NHX1 KW - osmotic effects KW - Salt Overly Sensitive pathway KW - salt stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312152 VL - 237 IS - 1 SP - 217 EP - 231 ER - TY - INPR A1 - Dandekar, Thomas T1 - A modified inflation cosmology relying on qubit-crystallization: rare qubit interactions trigger qubit ensemble growth and crystallization into “real” bit-ensembles and emergent time N2 - In a modified inflation scenario we replace the “big bang” by a condensation event in an eternal all-compassing big ocean of free qubits in our modified cosmology. Interactions of qubits in the qubit ocean are rare. If they happen, they provide a nucleus for a new universe as the qubits become decoherent and freeze-out into defined bit ensembles. Second, we replace inflation by a crystallization event triggered by the nucleus of interacting qubits to which rapidly more and more qubits attach (like in everyday crystal growth) – the crystal unit cell guarantees same symmetries everywhere. Hence, the textbook inflation scenario to explain the same laws of nature in our domain is replaced by the crystal unit cell of the crystal formed. We give here only the perspective or outline of this modified inflation theory, as the detailed mathematical physics behind this has still to be formulated and described. Interacting qubits solidify, quantum entropy decreases (but increases in the ocean around). The interacting qubits form a rapidly growing domain where the n**m states become separated ensemble states, rising long-range forces stop ultimately further growth. After that very early events, standard cosmology with the hot fireball model takes over. Our theory agrees well with lack of inflation traces in cosmic background measurements, but more importantly can explain well by such a type of cosmological crystallization instead of inflation the early creation of large-scale structure of voids and filaments, supercluster formation, galaxy formation, and the dominance of matter: no annihilation of antimatter necessary, rather the unit cell of our crystal universe has a matter handedness avoiding anti-matter. We prove a triggering of qubit interactions can only be 1,2,4 or 8-dimensional (agrees with E8 symmetry of our universe). Repulsive forces at ultrashort distances result from quantization, long-range forces limit crystal growth. Crystals come and go in the qubit ocean. This selects for the ability to lay seeds for new crystals, for self-organization and life-friendliness. The phase space of the crystal agrees with the standard model of the basic four forces for n quanta. It includes all possible ensemble combinations of their quantum states m, a total of n**m states. Neighbor states reach according to transition possibilities (S-matrix) with emergent time from entropic ensemble gradients. However, this means that in our four dimensions there is only one bit overlap to neighbor states left (almost solid, only below h dash liquidity left). However, the E8 symmetry of heterotic string theory has six rolled-up, small dimensions which help to keep the qubit crystal together and will never expand. Finally, we give first energy estimates for free qubits vs bound qubits, misplacements in the qubit crystal and entropy increase during qubit decoherence / crystal formation. Scalar fields for color interaction and gravity derive from the permeating qubit-interaction field in the crystal. Hence, vacuum energy gets low inside the qubit crystal. Condensed mathematics may advantageously help to model free (many states denote the same qubit) and bound qubits in phase space. KW - qubit KW - cosmology KW - decoherence KW - crystallization KW - emergent time Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321777 ER - TY - JOUR A1 - Diebold, Mathias A1 - Schönemann, Lars A1 - Eilers, Martin A1 - Sotriffer, Christoph A1 - Schindelin, Hermann T1 - Crystal structure of a covalently linked Aurora-A-MYCN complex JF - Acta Crystallographica N2 - Formation of the Aurora-A–MYCN complex increases levels of the oncogenic transcription factor MYCN in neuroblastoma cells by abrogating its degradation through the ubiquitin proteasome system. While some small-molecule inhibitors of Aurora-A were shown to destabilize MYCN, clinical trials have not been satisfactory to date. MYCN itself is considered to be `undruggable' due to its large intrinsically disordered regions. Targeting the Aurora-A–MYCN complex rather than Aurora-A or MYCN alone will open new possibilities for drug development and screening campaigns. To overcome the challenges that a ternary system composed of Aurora-A, MYCN and a small molecule entails, a covalently cross-linked construct of the Aurora-A–MYCN complex was designed, expressed and characterized, thus enabling screening and design campaigns to identify selective binders. KW - MYCNv KW - neuroblastoma cell KW - proteasome system Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-318855 VL - D79 SP - 1 EP - 9 ER - TY - THES A1 - Petrov, Ivan T1 - Combinational therapy of tumors in syngeneic mouse tumor models with oncolytic Vaccinia virus strains expressing IL-2 and INF-g. Human adipose tissue-derived stem cell mediated delivery of oncolytic Vaccinia virus T1 - Kombinationstherapie von Tumoren in syngenen Maus-Tumormodellen mit onkolytischen Vaccinia-Virenstämmen, die IL-2 und INF-g exprimieren. Übertragung von onkolytischen Vaccinia-Viren durch menschliche Fettstammzellen N2 - Cancer is one of the leading causes of death worldwide, with currently assessed chances to develop at least one cancer in a lifetime for about 20%. High cases rates and mortality require the development of new anticancer therapies and treatment strategies. Another important concern is toxicity normally associated with conventional therapy methods, such as chemo- and radiotherapy. Among many proposed antitumoral agents, oncolytic viruses are still one of the promising and fast-developing fields of research with almost a hundred studies published data on over 3000 patients since the beginning of the new millennia. Among all oncolytic viruses, the Vaccinia virus is arguably one of the safest, with an extremely long and prominent history of use, since it was the one and only vaccine used in the Smallpox Eradication Program in the 1970s. Interestingly enough, it was the first oncolytic virus proven to have tumor tropism in vitro and in vivo in laboratory settings, and this year we can celebrate an unofficial 100th anniversary since the publication of the fact. While being highly immunogenic, Vaccinia virus DNA replication takes place in the cytoplasm of the infected cell, and virus genes never integrate into the host genome. Another advantage of using Vaccinia as an oncolytic agent is its high genome capacity, which allows inserting up to 25 kbps of exogenous genes, thus allowing to additionally arm the virus against the tumor. Oncolytic virus action consists of two major parts: direct oncolysis and immune activation against the tumor, with the latter being the key to successful treatment. To this moment, preclinical research data are mostly generated in immunocompromised xenograft models, which have hurdles to be properly translated for clinical use. In the first part of the current study, fourteen different recombinant Vaccinia virus strains were tested in two different murine tumor cell lines and corresponding immunocompetent animal models. We found, that Copenhagen backbone Vaccinia viruses while being extremely effective in cell culture, do not show significant oncolytic efficacy in animals. In contrast, several of the LIVP backbone viruses tested (specifically, IL-2 expressing ones) have little replication ability when compared to the Copenhagen strain, but are able to significantly delay tumor growth and prolong survival of the treated animals. We have also noted cytokine related toxicity of the animals to be mouse strain specific. We have also tested the virus with the highest therapeutic benefit in combination with romidepsin and cyclophosphamide. While the combination with histone deacetylase inhibitor romidepsin did not result in therapeutic benefit in our settings, the addition of cyclophosphamide significantly improved the efficacy of the treatment, at the same time reducing cytokine-associated toxicity of the IL-2 expressing virus. In the second part of the work, we analyzed the ability of adipose-derived mesenchymal stem cells to serve as a carrier for the oncolytic Vaccinia virus. We showed for the first time that the cells can be infected with the virus and can generate virus progeny. They are also able to survive for a substantially long time and, when injected into the bloodstream of tumor-bearing animals, produce the virus that is colonizing the tumor. Analysis of the systemic distribution of the cells after injection revealed that infected and uninfected cells are not distributed in the same manner, possibly suggesting that infected cells are getting recognized and cleared by an impaired immune system of athymic mice faster than non-infected cells. Despite this, injection of virus-loaded adipose-derived mesenchymal stem cells to human A549 tumor-bearing xenograft mice resulted in rapid tumor regression and reduced virus-related side effects of the treatment when compared to injection of the naked virus. In conclusion, we have tested two different approaches to augmenting oncolytic Vaccinia virus therapy. First, the combination of recombinant Vaccinia virus expressing IL-2 and cyclophosphamide showed promising results in a syngeneic mouse model, despite the low permissivity of murine cells to the virus. Second, we loaded the oncolytic Vaccinia virus into mesenchymal stem cells and have proven that they can potentially serve as a vehicle for the virus. N2 - Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit, wobei die Wahrscheinlichkeit, im Laufe des Lebens an mindestens einer Krebsart zu erkranken, derzeit auf etwa 20 % geschätzt wird. Die hohen Fallzahlen und die hohe Sterblichkeit erfordern die Entwicklung neuer Krebstherapien und Behandlungsstrategien. Ein weiteres wichtiges Problem ist die Toxizität, die normalerweise mit konventionellen Behandlungsmethoden, wie Chemo- und Strahlentherapie, einhergeht. Unter den vielen vorgeschlagenen antitumoralen Wirkstoffen sind onkolytische Viren nach wie vor eines der vielversprechendsten und sich schnell entwickelnden Forschungsgebiete mit fast hundert veröffentlichten Studien an über 3000 Patienten seit Beginn des neuen Jahrtausends. Unter allen onkolytischen Viren ist das Vaccinia Virus wohl eines der Sichersten und hat eine extrem lange und prominente Anwendungsgeschichte, da es der einzige Impfstoff war, der im Pockenausrottungsprogramm in den 1970er Jahren verwendet wurde. Interessanterweise war es das erste onkolytische Virus, dessen Tumortropismus in vitro und in vivo im Labor nachgewiesen wurde. In diesem Jahr (2022) können wir das inoffizielle 100-jährige Jubiläum seit der Veröffentlichung dieser Tatsache feiern. Obwohl Vaccinia hoch immunogen ist, findet die Replikation im Zytoplasma der infizierten Zelle statt, und die Virusgene werden niemals in das menschliche Genom integriert. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Vaccinia als onkolytisches Agens ist seine hohe Genomkapazität, die es ermöglicht, bis zu 25 kbit/s an exogenen Genen einzufügen, wodurch das Virus zusätzlich gegen den Tumor aufgerüstet werden kann. Die Wirkung des onkolytischen Virus besteht aus zwei Hauptbestandteilen: der direkten Onkolyse und die Aktivierung des Immunsystems gegen den Tumor, wobei letztere der Schlüssel zum Behandlungserfolg ist. Bislang wurden präklinische Forschungsdaten meist in immungeschwächten Xenotransplantationsmodellen gewonnen, die sich nur schwer für den klinischen Einsatz eignen. Im ersten Teil der aktuellen Studie wurden vierzehn verschiedene rekombinante Vaccinia-Virusstämme in zwei verschiedenen murinen Tumorzelllinien und in entsprechenden immunkompetenten Tiermodellen getestet. Wir fanden heraus, dass Kopenhagener Backbone-Vaccinia-Viren zwar in der Zellkultur äußerst wirksam sind, im Tiermodell jedoch keine signifikante onkolytische Wirksamkeit zeigen. Im Gegensatz dazu haben mehrere der getesteten LIVP-Backbone-Viren (insbesondere die IL-2 exprimierenden) im Vergleich zum Kopenhagener Stamm nur eine geringe Replikationsfähigkeit, sind aber in der Lage, das Tumorwachstum deutlich zu verzögern und das Überleben der behandelten Tiere zu verlängern. Wir haben auch festgestellt, dass die Zytokin-bedingte Toxizität der Tiere mausstammspezifisch ist. Wir haben auch das Virus mit dem höchsten therapeutischen Nutzen in Kombination mit Romidepsin und Cyclophosphamid getestet. Während die Kombination mit dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Romidepsin in unseren Versuchsreihen keinen therapeutischen Nutzen erbrachte, verbesserte die Zugabe von Cyclophosphamid die Wirksamkeit der Behandlung erheblich und verringerte gleichzeitig die zytokinbedingte Toxizität des IL-2-exprimierenden Virus. Im zweiten Teil der Arbeit analysierten wir die Fähigkeit von aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen, als Träger für das onkolytische Vaccinia-Virus zu dienen. Wir konnten zum ersten Mal zeigen, dass die Zellen mit dem Virus infiziert werden können und Virusnachkommen erzeugen können. Sie sind auch in der Lage, sehr lange zu überleben und, wenn sie in den Blutkreislauf von Tieren mit Tumoren injiziert werden, das Virus zu produzieren, das den Tumor besiedelt. Die Analyse der systemischen Verteilung der Zellen nach der Injektion ergab, dass infizierte und nicht infizierte Zellen nicht auf die gleiche Weise verteilt werden, was möglicherweise darauf hindeutet, dass infizierte Zellen von einem beeinträchtigten Immunsystem der athymischen Mäuse schneller erkannt und beseitigt werden, als nicht infizierte Zellen. Trotzdem führte die Injektion von virusbeladenen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe in A549-Tumor-tragende Xenograft-Mäuse zu einer schnellen Tumorregression und zu geringeren virusbedingten Nebenwirkungen der Behandlung, als bei der Injektion des nackten Virus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir zwei verschiedene Ansätze zur Verstärkung der onkolytischen Vaccinia-Virus-Therapie getestet haben. Erstens zeigte die Kombination aus rekombinantem Vaccinia-Virus, das IL-2 exprimiert, und Cyclophosphamid in einem syngenen Mausmodell vielversprechende Ergebnisse, trotz der geringen Permissivität der Mäusezellen für das Virus. Zweitens haben wir onkolytische Vaccinia-Viren in mesenchymale Stammzellen eingebracht und nachgewiesen, dass diese als Vehikel für das Virus dienen können. KW - Vaccinia-virus KW - Vaccinia KW - ADSCs KW - Cancer Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-273550 ER - TY - JOUR A1 - Kaltdorf, Martin A1 - Breitenbach, Tim A1 - Karl, Stefan A1 - Fuchs, Maximilian A1 - Kessie, David Komla A1 - Psota, Eric A1 - Prelog, Martina A1 - Sarukhanyan, Edita A1 - Ebert, Regina A1 - Jakob, Franz A1 - Dandekar, Gudrun A1 - Naseem, Muhammad A1 - Liang, Chunguang A1 - Dandekar, Thomas T1 - Software JimenaE allows efficient dynamic simulations of Boolean networks, centrality and system state analysis JF - Scientific Reports N2 - The signal modelling framework JimenaE simulates dynamically Boolean networks. In contrast to SQUAD, there is systematic and not just heuristic calculation of all system states. These specific features are not present in CellNetAnalyzer and BoolNet. JimenaE is an expert extension of Jimena, with new optimized code, network conversion into different formats, rapid convergence both for system state calculation as well as for all three network centralities. It allows higher accuracy in determining network states and allows to dissect networks and identification of network control type and amount for each protein with high accuracy. Biological examples demonstrate this: (i) High plasticity of mesenchymal stromal cells for differentiation into chondrocytes, osteoblasts and adipocytes and differentiation-specific network control focusses on wnt-, TGF-beta and PPAR-gamma signaling. JimenaE allows to study individual proteins, removal or adding interactions (or autocrine loops) and accurately quantifies effects as well as number of system states. (ii) Dynamical modelling of cell–cell interactions of plant Arapidopsis thaliana against Pseudomonas syringae DC3000: We analyze for the first time the pathogen perspective and its interaction with the host. We next provide a detailed analysis on how plant hormonal regulation stimulates specific proteins and who and which protein has which type and amount of network control including a detailed heatmap of the A.thaliana response distinguishing between two states of the immune response. (iii) In an immune response network of dendritic cells confronted with Aspergillus fumigatus, JimenaE calculates now accurately the specific values for centralities and protein-specific network control including chemokine and pattern recognition receptors. KW - cellular signalling networks KW - computer modelling Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313303 VL - 13 ER -