TY - THES A1 - Englmeier, Jana T1 - Consequences of climate change and land-use intensification for decomposer communities and decomposition processes T1 - Folgen von Klimawandel und intensiver Landnutzung für Zersetzergemeinschaften und Abbauprozesse N2 - The increase in intensively used areas and climate change are direct and indirect consequences of anthropogenic actions, caused by a growing population and increasing greenhouse gas emissions. The number of research studies, investigating the effects of land use and climate change on ecosystems, including flora, fauna, and ecosystem services, is steadily growing. This thesis contributes to this research area by investigating land-use and climate effects on decomposer communities (arthropods and microbes) and the ecosystem service ‘decomposition of dead material’. Chapter II deals with consequences of intensified land use and climate change for the ecosystem service ‘decomposition of dead organic material’ (necromass). Considering the severe decline in insects, we experimentally excluded insects from half of the study objects. The decomposition of both dung and carrion was robust to land-use changes. Dung decomposition, moreover, was unaffected by temperature and the presence/ absence of insects. Along the altitudinal gradient, however, highest dung decomposition was observed at medium elevation between 600 and 700 m above sea level (although insignificant). As a consequence, we assume that at this elevation there is an ideal precipitation:temperature ratio for decomposing organisms, such as earthworms or collembolans. Carrion decomposition was accelerated by increasing elevation and by the presence of insects, indicating that increasing variability in climate and an ongoing decline in insects could modify decomposition processes and consequently natural nutrient cycles. Moreover, we show that different types of dead organic material respond differently to environmental factors and should be treated separately in future studies. In Chapter III, we investigated land-use and climate effects on dung-visiting beetles and their resource specialization. Here, all beetles that are preferentially found on dung, carrion or other rotten material were included. Both α- and γ-diversity were strongly reduced in agricultural and urban areas. High precipitation reduced dung-visiting beetle abundance, whereas γ-diversity was lowest in the warmest regions. Resource specialization decreased with increasing temperatures. The results give evidence that land use as well as climate can alter dung-visiting beetle diversity and resource specialization and may hence influence the natural balance of beetle communities and their contribution to the ecosystem service ‘decomposition of dead material’. The following chapter, Chapter IV, contributes to the findings in Chapter II. Here, carrion decomposition is not only explained by land-use intensity and climate but also by diversity and community composition of two taxonomic groups found on carrion, beetles and bacteria. The results revealed a strong correlation between bacteria diversity and community composition with temperature. Carrion decomposition was to a great extent directed by bacterial community composition and precipitation. The role of beetles was neglectable in carrion decomposition. With this study, I show that microbes, despite their microscopic size, direct carrion decomposition and may not be neglected in future decomposition studies. In Chapter V a third necromass type is investigated, namely deadwood. The aim was to assess climate and land-use effects on deadwood-inhabiting fungi and bacteria. Main driver for microbial richness (measured as number of OTUs) was climate, including temperature and precipitation. Warmer climates promoted the diversity of bacteria, whereas fungi richness was unaffected by temperature. In turn, fungi richness was lower in urban landscapes compared to near-natural landscapes and bacteria richness was higher on meadows than on forest sites. Fungi were extremely specialized on their host tree, independent of land use and climate. Bacteria specialization, however, was strongly directed by land use and climate. These results underpin previous studies showing that fungi are highly specialized in contrast to bacteria and add new insights into the robustness of fungi specialization to climate and land use. I summarize that climate as well as intensive land use influence biodiversity. Temperature and precipitation, however, had positive and negative effects on decomposer diversity, while anthropogenic land use had mostly negative effects on the diversity of decomposers. N2 - Die Zunahme intensiv genutzter Landschaften und der Klimawandel sind direkte und indirekte Folgen menschlichen Handelns, verursacht durch eine wachsende Weltbevölkerung und zunehmende Mengen an Treibhausgasen. Die Zahl der wissenschaftlichen Studien, die sich mit den Veränderungen der Umwelt und den Konsequenzen für Ökosysteme, einschließlich Flora, Fauna und Ökosystemleistungen auseinandersetzen, steigt stetig. Mit dieser Thesis möchte ich meinen Beitrag zu diesem wichtigen und aktuellen Forschungsgebiet leisten. Dazu untersuche ich die Auswirkungen von Landnutzung und Klima auf die Ökosystemleistung „Zersetzung toten organischen Materials“ (Nekromasse) und die Auswirkungen auf die daran beteiligten Arthropoden- und Mikrobengemeinschaften. Kapitel II dieser Thesis setzt sich mit den Konsequenzen von intensiver Landnutzung und Klimawandel für die Ökosystemleistung „Zersetzung toten Materials“ auseinander. Unter Anbetracht des globalen Insektenrückgangs, wurde dieser Aspekt anhand eines Insektenausschluss-Experimentes zusätzlich simuliert. Es stellt sich heraus, dass sowohl der Abbau von Dung als auch von Aas sehr robust gegenüber landschaftlicher Nutzung war. Zudem blieb der Abbau von Dung unberührt von Temperaturänderungen und dem Ausschluss von Insekten. Entlang eines Höhengradienten wurde hingegen ein Trend zu einem unimodalen Muster mit maximaler Zersetzung bei ca. 600-700 m ü.M. beobachtet. Dieser Trend lässt vermuten, dass in dieser Höhe das Verhältnis von Niederschlag und Temperatur ideal für Dung zersetzende Gemeinschaften ist. Aas hingegen wurde in zunehmender Höhe und unter der Beteiligung von Insekten schneller zersetzt, was verdeutlich, dass Klimaänderungen und ein ansteigender Insektenrückgang starke Auswirkungen auf die Zersetzung von Aas und somit auf Nährstoffkreisläufe haben können. Hierbei wurde zudem ersichtlich, dass verschiedene Typen von Nekromasse unterschiedlich auf Umweltparameter reagieren und daher in künftigen Studien und Auswertungen separat betrachtet werden sollten. Kapitel III behandelt die Auswirkungen von Landnutzung und Klima auf die Biodiversität und Spezialisierung von Käfergemeinschaften an Dung. Hierbei wurden sämtliche Käfer berücksichtigt, welche vor allem an Dung, Aas oder sonstigem faulenden Material gefunden werden können. Sowohl α- als auch γ-Diversität von diesen Käfern wurde durch Agrarlandschaften und urbane Gebiete stark reduziert. Hohe Niederschlagsmengen wirkten sich negativ auf die Abundanz von Dungkäfern aus, wohingegen die γ-Diversität in warmen Regionen am niedrigsten war. Der Grad der Spezialisierung von Käfergemeinschaften auf verschiedene Dungressourcen nahm mit abnehmenden Temperaturen zu. Aus den Ergebnissen geht hervor, dass sowohl intensive Landnutzung als auch Klimaveränderungen Auswirkungen auf die Diversität und den Spezialisierungsgrad von Käfergemeinschaften an Dung haben können und somit das ökologische Gleichgewicht der Dungkäfergemeinschaften und ihren Ökosystemfunktionen beeinflussen können. Das darauffolgende Kapitel IV stellt eine Ergänzung zu Kapitel II dar. Hier wird die Zersetzung von Aas nicht nur anhand von Landnutzung und Klima erklärt, sondern auch anhand der α-Diversität und der Artenzusammensetzung von Käfern und Bakterien an Aas diskutiert. Es zeigte sich, dass Abundanz und Artenzusammensetzung der Bakteriengemeinschaft an Aas vor allem von der Temperatur abhingen. Außerdem wurde die Zersetzungsgeschwindigkeit maßgeblich von der Bakteriengemeinschaft und der Niederschlagsmenge bestimmt. Mit dieser Studie konnte ich zeigen, dass Bakterien trotz ihrer mikroskopischen Größe maßgeblich an der Zersetzung von Aas beteiligt sind und diese in Zersetzungsversuchen nicht vernachlässigt werden sollten. Das letzte Kapitel, Kapitel V, befasst sich mit den Konsequenzen von intensiver Landnutzung und Klimawandel auf mikrobielle Gemeinschaften in Totholz. Untersucht wurden hier sowohl Bakterien- als auch Pilzgemeinschaften. Haupttreiber der Artenvielfalt für beide Gruppen (gemessen als Anzahl an OTUs) war das Klima (Niederschlag und Temperatur). Ein wärmeres Klima kam der Vielfalt von Bakterien zugute, wohingegen die Pilzvielfalt nicht tangiert wurde. Außerdem reagierten Pilze negativ auf urbane Landnutzung, Bakterienvielfalt in Totholz war auf Wiesen jedoch höher als im Wald. Vor allem Pilze zeigten eine sehr starke Bindung zu ihrem Wirtsbaum, welche auch von äußeren Einflüssen wie Landnutzung und Klima nicht beeinflusst werden konnte. Die Spezialisierung von Bakterien hingegen wurde stark von Landnutzung und Klima beeinflusst. Diese Ergebnisse untermauern frühere Studien, die besagen, dass Pilze hoch spezialisiert sind und geben neue Erkenntnisse zur Robustheit der Spezialisierung gegenüber Landnutzungsintensität und Klima. Zusammenfassend kann ich sagen, dass sowohl Klima als auch Landnutzung Auswirkungen auf die Biodiversität haben. Während Temperatur und Niederschlag jedoch positive so wie negative Effekte hatten, wirkte sich anthropogene Landnutzung überwiegend negativ auf die Diversität von Zersetzergemeinschaften aus. KW - Mikroorganismus KW - decomposition KW - Klimaänderung KW - Zersetzungsprozess KW - microbes KW - dead organic material KW - Mikroben Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313994 ER - TY - THES A1 - Gabel, Martin Sebastian T1 - Behavioural resistance to \(Varroa\) \(destructor\) in the Western honeybee \(Apis\) \(mellifera\) - Mechanisms leading to decreased mite reproduction T1 - Resistenzverhalten der Westlichen Honigbiene \(Apis\) \(mellifera\) gegen \(Varroa\) \(destructor\) - Zu verringerter Milbenreproduktion führende Mechanismen N2 - The Western Honeybee (Apis mellifera) is among the most versatile species in the world. Its adaptability is rooted in thousands of the differently specialized individuals acting jointly together. Thus, bees that are able to handle a certain task or condition well can back up other individuals less capable to do so on the colony level. Vice versa, the latter individuals might perform better in other situations. This evolutionary recipe for success ensures the survival of colonies despite challenging habitat conditions. In this context, the ectoparasitic mite Varroa destructor reflects the most pronounced biotic challenge to honeybees worldwide. Without proper treatment, infested colonies rapidly dwindle and ultimately die. Nevertheless, resistance behaviours against this parasite have evolved in some populations through natural selection, enabling colonies to survive untreated. In this, different behaviours appear to be adapted to the respective habitat conditions and may complement each other. Yet, the why and how of this behavioural response to the mite remains largely unknown. My thesis focuses on the biological background of Varroa-resistance traits in honeybees and presents important findings for the comprehension of this complex host-parasite interaction. Based on this, I draw implications for both, applied bee breeding and scientific investigations in the field of Varroa-resistance. Specifically, I focus on two traits commonly found in resistant and, to a lower degree, also mite-susceptible colonies: decreased mite reproduction and the uncapping and subsequent recapping of sealed brood cells. Examining failures in the reproductive success of mites as a primary mechanism of Varroa-resistance, I was able to link them to specific bee behaviours and external factors. Since mite reproduction and the brood rearing of bees are inevitably connected, I first investigated the effects of brood interruption on the reproductive success of mites. Brood interruption decreased the reproductive success of mites both immediately and in the long term. By examining the causes of reproductive failure, I could show that this was mainly due to an increased share of infertile mites. Furthermore, I proved that interruption in brood rearing significantly increased the expression of recapping behaviour. These findings consequently showed a dynamic modulation of mite reproduction and recapping, as well as a direct effect of brood interruption on both traits. To further elucidate the plasticity in the expression of both traits, I studied mite reproduction, recapping behaviour and infestation levels over the course of three years. The resulting extensive dataset unveiled a significant seasonal variation in mite reproduction and recapping. In addition, I show that recapping decreases the reproductive success of mites by increasing delayed developing female offspring and cells lacking male offspring. By establishing a novel picture-based brood investigation method, I could furthermore show that both the removal of brood cells and recapping activity specifically target brood ages in which mite offspring would be expected. Recapping, however, did not cause infertility of mites. Considering the findings of my first study, this points towards complementary mechanisms. This underlines the importance of increased recapping behaviour and decreased mite reproduction as resistance traits, while at the same time emphasising the challenges of reliable data acquisition. To pave the way for a practical application of these findings in breeding, we then investigated the heritability (i.e., the share of genotypic variation on the observed phenotypic variation) of the accounted traits. By elaborating comparable test protocols and compiling data from over 4,000 colonies, we could, for the first time, demonstrate that recapping of infested cells and decreased reproductive success of mites are heritable (and thus selectable) traits in managed honeybee populations. My thesis proves the importance of recapping and decreased mite reproduction as resistance traits and therefore valuable goals for breeding efforts. In this regard, I shed light on the underlying mechanisms of both traits, and present clear evidence for their interaction and heritability. N2 - Die Westliche Honigbiene (Apis mellifera) zählt zu den anpassungsfähigsten Arten der Welt. Diese Anpassungsfähigkeit liegt in der Zusammenarbeit tausender unterschiedlich spezialisierter Individuen begründet. Auf Volksebene können Bienen, die mit einer bestimmten Aufgabe oder Situation gut umgehen können, andere Individuen, die dies weniger gut können, absichern. Andererseits können Letztere womöglich mit anderen Situationen besser umgehen. Dieses evolutionäre Erfolgskonzept sichert das Überleben der Völker selbst unter herausfordernden Habitatbedingungen. Die ektoparasitäre Milbe Varroa destructor stellt in diesem Zusammenhang weltweit die größte biotische Herausforderung dar. Ohne entsprechende Behandlung siechen die Völker rasch dahin und sterben schlussendlich. In einigen Populationen haben sich jedoch Resistenzmechanismen durch natürliche Selektion herausgebildet, die es den Völkern ermöglichen, ohne Behandlung zu überleben. Die verschiedenen Verhaltensweisen scheinen dabei an die jeweiligen Habitatbedingungen angepasst zu sein und sich gegenseitig zu ergänzen. Was diese Reaktion auf die Milben auslöst und wie sie funktioniert ist allerdings noch weitestgehend unbekannt. Meine Dissertation fokussiert den biologischen Hintergrund von Varroa-resistenzmechanismen bei Honigbienen und stellt dabei wichtige Erkenntnisse zum Verständnis dieser komplexen Parasit-Wirt-Beziehung vor. Darauf aufbauend leite ich Implikationen für die angewandte Bienenzucht und wissenschaftliche Untersuchungen auf dem Gebiet der Varroa-resistenz ab. Hierbei konzentriere ich mich insbesondere auf zwei Merkmale, die häufig in resistenten Völkern zu finden sind: die reduzierte Milbenreproduktion und das Entdeckeln und Wiederverdeckeln bereits verschlossener Brutzellen. Beide Merkmale treten in geringerem Umfang auch in milbenanfälligen Populationen auf und sind daher von besonderem Interesse für jedwede Zuchtbemühung mit dem Ziel der Varroa-resistenz. Durch die Untersuchung von Fehlern in der Reproduktion der Milben, konnte ich diesen Hauptmechanismus der Varroa-resistenz mit Verhaltensweisen der Bienen, sowie äußeren Faktoren in Verbindung setzen. Da die Milbenvermehrung untrennbar mit der Brutaufzucht der Bienen verbunden ist, habe ich zunächst die Einflüsse von Brutunterbrechungen auf den Vermehrungserfolg der Milben untersucht. Diese Untersuchung zeigte auf, dass Brutunterbrechungen den Vermehrungserfolg der Milben sowohl kurzfristig, als auch langfristig herabsetzen. Durch die Untersuchung der jeweils zugrundeliegenden Ursachen gescheiterter Milbenreproduktion konnte ich zeigen, dass dies vor Allem auf einen gesteigerten Anteil infertiler Milben zurückzuführen war. Des Weiteren konnte ich beweisen, dass die Unterbrechung der Brutaufzucht die Ausprägung des Wiederverdeckelns signifikant verstärkte. Folglich zeigten diese Ergebnisse eine dynamische Anpassung der Milbenreproduktion und des Wiederverdeckelns, sowie einen direkten Einfluss der Brutunterbrechungen auf beide Eigenschaften. Um die Plastizität der Ausprägung beider Merkmale genauer zu erklären, untersuchte ich daraufhin drei Jahre lang die Milbenvermehrung, das Verhalten des Wiederverdeckelns, sowie die Befallsentwicklung. Daraus resultierte ein umfangreicher Datensatz, der eine signifikante saisonale Variation der Milbenvermehrung und des Wiederverdeckelns belegte. Ich konnte außerdem eindeutig beweisen, dass das Wiederverdeckeln den Reproduktionserfolg der Milben herabsetzt, indem es die Anteile von verzögert heranwachsenden weiblichen Nachkommen und fehlenden Männchen steigert. Durch Anwendung einer neuartigen Bild-basierten Methode der Brutuntersuchung, konnte ich darüber hinaus zeigen, dass sich sowohl das Ausräumen, als auch das Wiederverdeckeln von Brutzellen auf Brutalter konzentriert, in denen Milbennachwuchs erwartet werden würde. Das Wiederverdeckeln trug jedoch nicht zur Infertilität der Milben bei, was zusammen mit den Ergebnissen meiner ersten Untersuchung auf komplementäre Mechanismen hinweist. Dies unterstreicht die Bedeutung des Wiederverdeckelns und der verminderten Milbenreproduktion als Resistenzmechanismen, hebt aber gleichzeitig auch die Herausforderungen einer verlässlichen Datenerhebung hervor. Um den Weg für die praktische Anwendung dieser Erkenntnisse in der Zuchtarbeit zu ebnen, untersuchten wir daraufhin die Erblichkeit (den Anteil der genotypischen Variation an der beobachteten phänotypischen Variation) der betrachteten Merkmale. Durch das Erarbeiten vergleichbarer Prüfprotokolle und Zusammenführen von Daten aus über 4000 Völkern, konnten wir erstmalig zeigen, dass das Wiederverdeckeln befallener Zellen und der verminderte Vermehrungserfolg der Milben erbliche und damit selektierbare Merkmale in bewirtschafteten Honigbienenpopulationen sind. Meine Dissertation beweist die Relevanz des Wiederverdeckelns und der verminderten Milbenreproduktion als Resistenzmerkmale und damit lohnende Ziele für Zuchtbemühungen. In diesem Zusammenhang beleuchtete ich verschiedene Mechanismen, die der Ausprägung beider Merkmale zugrunde liegen und lieferte eindeutige Beweise für deren Interaktion und Erblichkeit. KW - Varroa destructor KW - Resistenz KW - Biene KW - mite non-reproduction KW - recapping KW - Varroa resistance KW - biotechnical Varroa control KW - heritability KW - selection KW - honeybees KW - Varroa mites KW - Züchtung KW - Apis mellifera KW - Breeding Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360536 ER - TY - THES A1 - Gaballa, Abdallah Hatem Hassan Hosny Ahmed T1 - PAF1c drives MYC-mediated immune evasion in pancreatic ductal adenocarcinoma T1 - PAF1c treibt die MYC-vermittelte Immunevasion im duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse an N2 - The expression of the MYC proto-oncogene is elevated in a large proportion of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). Previous findings in PDAC have shown that this increased MYC expression mediates immune evasion and promotes S-phase progression. How these functions are mediated and whether a downstream factor of MYC mediates these functions has remained elusive. Recent studies identifying the MYC interactome revealed a complex network of interaction partners, highlighting the need to identify the oncogenic pathway of MYC in an unbiased manner. In this work, we have shown that MYC ensures genomic stability during S-phase and prevents transcription-replication conflicts. Depletion of MYC and inhibition of ATR kinase showed a synergistic effect to induce DNA damage. A targeted siRNA screen targeting downstream factors of MYC revealed that PAF1c is required for DNA repair and S-phase progression. Recruitment of PAF1c to RNAPII was shown to be MYC dependent. PAF1c was shown to be largely dispensable for cell proliferation and regulation of MYC target genes. Depletion of CTR9, a subunit of PAF1c, caused strong tumor regression in a pancreatic ductal adenocarcinoma model, with long-term survival in a subset of mice. This effect was not due to induction of DNA damage, but to restoration of tumor immune surveillance. Depletion of PAF1c resulted in the release of RNAPII with transcription elongation factors, including SPT6, from the bodies of long genes, promoting full-length transcription of short genes. This resulted in the downregulation of long DNA repair genes and the concomitant upregulation of short genes, including MHC class I genes. These data demonstrate that a balance between long and short gene transcription is essential for tumor progression and that interference with PAF1c levels shifts this balance toward a tumor-suppressive transcriptional program. It also directly links MYC-mediated S-phase progression to immune evasion. Unlike MYC, PAF1c has a stable, known folded structure; therefore, the development of a small molecule targeting PAF1c may disrupt the immune evasive function of MYC while sparing its physiological functions in cellular growth. N2 - Die Expression des MYC-Proto-Onkogens ist bei einem großen Teil der Patienten mit duktalem Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) erhöht. Bisherige Erkenntnisse in der Erforschung des ankreaskarzinoms zeigen, dass die erhöhte MYCExpression die Umgehung des Immunsystems bewirkt und die Progression der S-Phase fördert. Wie diese Funktionen vermittelt werden und ob ein nachgeschalteter Faktor von MYC für diese Funktion verantwortlich ist, blieb jedoch bisher ungeklärt. Jüngste Studien zur Identifizierung des MYC-Interaktoms haben ein sehr komplexes Netzwerk an Interaktionspartnern von MYC aufgedeckt, was die Notwendigkeit unterstreicht, die onkogenen Eigenschaften von MYC und seinen Interaktionspartnern unvoreingenommen und genau zu untersuchen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MYC die genomische Stabilität während der S-Phase herstellt und Konflikte zwischen Transkription und Replikation verhindert. Die Depletion von MYC und die Hemmung der ATR-Kinase zeigten bei der Induktion von DNA Schäden eine synergistische Wirkung. Ein siRNA-Screen, der Gene beinhaltete, die MYC nachgeschaltet sind, ergab, dass PAF1c für die DNA-Reparatur und die S-PhasenProgression erforderlich ist. Es zeigte sich außerdem, dass die Rekrutierung von PAF1c an RNAPII von MYC abhängig ist. Für die Zellproliferation und die Regulierung von MYCZielgenen ist PAF1c jedoch weitgehend entbehrlich. Es konnte gezeigt werden, dass die Depletion von CTR9, einer Untereinheit von PAF1c, in einem murinen Modell des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zu einer starken Tumorregression mit langfristigem Überleben einiger Mäuse führte. Diese Wirkung war nicht auf die Induktion von DNA-Schäden zurückzuführen, sondern auf die Wiederherstellung der Immunüberwachung des Tumors. Die Deletion von PAF1c führte zu einer Umverteilung von RNAPII und Trankriptionselongationsfaktoren wie SPT6, von langen Genen hin zu kurzen Genen. Dadurch wurden lange Gene wie zum Beispiel DNA Reparaturgene nicht vollständig transkribiert, kurze Gene wie MHC-Klasse-I-Gene hingegen schon. Diese Daten zeigen, dass ein Gleichgewicht zwischen der Transkription langer und kurzer Gene für die Tumorprogression wichtig ist und dass eine Verminderung der PAF1c-Konzentration dieses Gleichgewicht in Richtung eines tumorsuppressiven Transkriptionsprogramms verschiebt. Außerdem besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der MYCvermittelten S-Phasen-Progression und der Umgehung des Immunsystems. Im Gegensatz zu MYC verfügt PAF1c über eine stabile und gut bekannte gefaltete Struktur. Daher könnte die Entwicklung eines kleinen Moleküls, das PAF1c hemmt, die Funktion von MYC zur Umgehung des Immunsystems stören und gleichzeitig seine physiologischen Funktionen für das Zellwachstum nicht beeinträchtigen. KW - Myc KW - Transkription KW - PAF1c KW - Transcription elongation KW - Immune evasion KW - Immunevasion Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-360459 ER - TY - THES A1 - Amini, Emad T1 - How central and peripheral clocks and the neuroendocrine system interact to time eclosion behavior in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Wie zentrale und periphere Uhren und das neuroendokrine System zusammenwirken, um das Schlupfverhalten von \(Drosophila\) \(melanogaster\) zeitlich festzulegen N2 - To grow larger, insects must shed their old rigid exoskeleton and replace it with a new one. This process is called molting and the motor behavior that sheds the old cuticle is called ecdysis. Holometabolic insects have pupal stages in between their larval and adult forms, during which they perform metamorphosis. The pupal stage ends with eclosion, i.e., the emergence of the adult from the pupal shell. Insects typically eclose at a specific time during the day, likely when abiotic conditions are at their optimum. A newly eclosed insect is fragile and needs time to harden its exoskeleton. Hence, eclosion is regulated by sophisticated developmental and circadian timing mechanisms. In Drosophila melanogaster, eclosion is limited to a daily time window in the morning, regarded as the “eclosion gate”. In a population of laboratory flies entrained by light/dark cycles, most of the flies eclose around lights on. This rhythmic eclosion pattern is controlled by the circadian clock and persists even under constant conditions. Developmental timing is under the control of complex hormonal signaling, including the steroid ecdysone, insulin-like peptides, and prothoracicotropic hormone (PTTH). The interactions of the central circadian clock in the brain and a peripheral clock in the prothoracic gland (PG) that produces ecdysone are important for the circadian timing of eclosion. These two clocks are connected by a bilateral pair of peptidergic PTTH neurons (PTTHn) that project to the PG. Before each molt, the ecdysone level rises and then falls shortly before ecdysis. The falling ecdysone level must fall below a certain threshold value for the eclosion gate to open. The activity of PTTHn is inhibited by short neuropeptide F (sNPF) from the small ventrolateral neurons (sLNvs) and inhibition is thought to lead to a decrease in ecdysone production. The general aim of this thesis is to further the understanding of how the circadian clock and neuroendocrinal pathways are coordinated to drive eclosion rhythmicity and to identify when these endocrinal signaling pathways are active. In Chapter I, a series of conditional PTTHn silencing-based behavioral assays, combined with neuronal activity imaging techniques such as non-invasive ARG-Luc show that PTTH signaling is active and required shortly before eclosion and may serve to phase-adjust the activity of the PG at the end of pupal development. Trans-synaptic anatomical stainings identified the sLNvs, dorsal neurons 1 (DN1), dorsal neurons 2 (DN2), and lateral posterior neurons (LPNs) clock neurons as directly upstream of the PTTHn. Eclosion motor behavior is initiated by Ecdysis triggering hormone (ETH) which activates a pair of ventromedial (Vm) neurons to release eclosion hormone (EH) which positively feeds back to the source of ETH, the endocrine Inka cells. In Chapter II trans-synaptic tracing showed that most clock neurons provide input to the Vm and non-canonical EH neurons. Hence, clock can potentially influence the ETH/EH feedback loop. The activity profile of the Inka cells and Vm neurons before eclosion is described. Vm and Inka cells are active around seven hours before eclosion. Interestingly, all EH neurons appear to be exclusively peptidergic. In Chapter III, using chemoconnectomics, PTTHns were found to express receptors for sNPF, allatostatin A (AstA), allatostatin C (AstC), and myosuppressin (Ms), while EH neurons expressed only Ms and AstA receptors. Eclosion assays of flies with impaired AstA, AstC, or Ms signaling do not show arrhythmicity under constant conditions. However, optogenetic activation of the AstA neurons strongly suppresses eclosion. Chapter IV focuses on peripheral ventral’ Tracheal dendrite (v’Td) and class IV dendritic arborization (C4da) neurons. The C4da neurons mediate larval light avoidance through endocrine PTTH signaling. The v’Td neurons mainly receive O2/CO2 input from the trachea and are upstream of Vm neurons but are not required for eclosion rhythmicity. Conditional ablation of the C4da neurons or torso (receptor of PTTH) knock-out in the C4da neurons impaired eclosion rhythmicity. Six to seven hours before eclosion, PTTHn, C4da, and Vm neurons are active based on ARG-Luc imaging. Thus, C4da neurons may indirectly connect the PTTHn to the Vm neurons. In summary, this thesis advances our knowledge of the temporal activity and role of PTTH signaling during pupal development and rhythmic eclosion. It further provides a comprehensive characterization of the synaptic and peptidergic inputs from clock neurons to PTTHn and EH neurons. AstA, AstC, and Ms are identified as potential modulators of eclosion circuits and suggest an indirect effect of PTTH signaling on EH signaling via the peripheral sensory C4da neurons. N2 - Um zu wachsen, müssen Insekten ihr altes, starres Exoskelett abwerfen und durch ein neues ersetzen. Dieser Vorgang wird als Häutung bezeichnet, und das motorische Verhalten, bei dem die alte Kutikula abgestoßen wird, heißt Ekdysis. Holometabole Insekten haben zwischen ihrer Larven- und Erwachsenenform ein Puppenstadium, in welchem sie eine Metamorphose durchlaufen. Das Puppenstadium endet mit dem Schlüpfen des erwachsenen Tieres aus der Puppenhülle. Die Insekten schlüpfen in der Regel zu einem bestimmten Zeitpunkt am Tag, wenn die abiotischen Bedingungen optimal sind, da das frisch geschlüpfte Insekt zerbrechlich ist und Zeit braucht, um sein Exoskelett auszuhärten. Daher wird der Schlupf durch ausgeklügelte Mechanismen der Entwicklung und der inneren Uhr gesteuert. Bei Drosophila melanogaster ist der Sclupf auf ein tägliches Zeitfenster am Morgen beschränkt, das als "Schlupffenster" bezeichnet wird. In einer Population von Laborfliegen, die durch Licht/Dunkel-Zyklen gesteuert wird, schlüpfen die meisten Fliegen in etwa um das Einschalten der Beleuchtung. Dieses rhythmische Schlupfmuster wird von der inneren Uhr gesteuert und bleibt auch unter konstanten Bedingungen bestehen. Das Timing der Entwicklung wird von komplexen hormonellen Signalen gesteuert, darunter das Steroid Ecdyson, insulinähnliche Peptide und das prothorakotrope Hormon (PTTH). Die Wechselwirkungen zwischen der zentralen zirkadianen Uhr im Gehirn und einer peripheren Uhr in der Prothorakaldrüse (PG), die Ecdyson produziert, sind wichtig für die zirkadiane Zeitsteuerung des Schlupfs. Diese beiden Uhren sind durch ein bilaterales Paar peptiderger PTTH-Neuronen (PTTHn) verbunden, die in die PG projizieren. Vor jeder Häutung steigt der Ecdysonspiegel an und fällt dann kurz vor danach wieder ab. Der fallende Ecdysonspiegel muss einen bestimmten Schwellenwert unterschreiten, damit sich das Schlupffenster öffnen kann. Die Aktivität der PTTHn wird durch das kurze Neuropeptid F (sNPF) aus den kleinen ventrolateralen Neuronen (sLNvs) gehemmt, und es wird angenommen, dass die Hemmung zu einer Abnahme der Ecdysonproduktion führt. Das allgemeine Ziel dieser Thesis besteht darin, die Koordination zwischen der zirkadianen Uhr und den neuroendokrinen Signalwegen zur Steuerung der Eklosionsrhythmik weiter zu charakterisieren und zu ermitteln, wann diese endokrinen Signalwege aktiv sind. In Kapitel I zeigen eine Reihe von Verhaltenstests, die auf der konditionalen Ausschaltung von PTTHn basieren, in Kombination mit Techniken zur Darstellung neuronaler Aktivität, wie z. B. nicht-invasives ARG-Luc imaging, dass PTTH-Signale kurz vor dem Schlupf aktiv und erforderlich sind und zur Phasenanpassung der Aktivität der PG am Ende der Puppenentwicklung dienen könnten. Trans-synaptische anatomische Färbungen identifizierten die sLNvs, die dorsalen Neuronen 1 (DN1), die dorsalen Neuronen 2 (DN2) und die lateralen posterioren Neuronen (LPNs) als Uhrneuronen, die dem PTTHn direkt vorgeschaltet sind. Das motorische Schlupfverhalten wird durch das Ecdysis-auslösende Hormon (ETH) ausgelöst, das ein Paar ventromedialer (Vm) Neuronen zur Freisetzung des Eklosionshormons (EH) anregt, welches positiv an die Quelle des ETH, die endokrinen Inka-Zellen, zurückkoppelt. In Kapitel II zeigte die trans-synaptische Nachverfolgung, dass die meisten Uhrneuronen Input für die Vm- und nicht-kanonischen EH-Neuronen liefern, sodass die Uhr möglicherweise die ETH/EH-Rückkopplungsschleife beeinflussen kann. Das Aktivitätsprofil der Inka-Zellen und Vm-Neuronen vor dem Schlupf wird beschrieben. Vm- und Inka-Zellen sind etwa sieben Stunden vor dem Schlupf aktiv. Interessanterweise scheinen alle EH-Neuronen ausschließlich peptiderg zu sein. In Kapitel III wurde mit Hilfe von Chemoconnectomics festgestellt, dass PTTH-Neuronen Rezeptoren für sNPF, Allatostatin A (AstA), Allatostatin C (AstC) und Myosuppressin (Ms) exprimieren, während EH nur Ms- und AstA-Rezeptoren exprimieren. Eklosionsversuche mit Fliegen, deren AstA-, AstC- oder Ms-Signalübertragung beeinträchtigt ist, zeigen unter konstanten Bedingungen keine Arrhythmie. Eine optogenetische Aktivierung der AstA-Neuronen führt jedoch zu einer starken Unterdrückung des Schlupfs. Kapitel IV konzentriert sich auf die peripheren ventralen Trachealdendritischen Neurone (v'Td) und dendritische Verzweigungsneurone der Klasse IV (C4da). Die C4da-Neuronen vermitteln die Lichtvermeidung der Larven durch endokrine PTTH-Signale. Die v'Td-Neuronen erhalten hauptsächlich O2/CO2-Input aus den Tracheen und sind den Vm-Neuronen vorgeschaltet, werden aber für die Schlupfrhythmik nicht benötigt. Die bedingte Ablation der C4da-Neuronen und das Knock-out von torso (Rezeptor für PTTH) in den C4da-Neuronen beeinträchtigten die Schlupfrhythmik. Sechs bis sieben Stunden vor dem Schlupf sind die PTTHn-, C4da- und Vm-Neuronen aktiv. Somit könnten C4da-Neuronen indirekt die PTTHn mit den Vm-Neuronen verbinden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit unser Wissen über das zeitliche Aktivitätsmuster und der Rolle des PTTH signalling während der Puppenentwicklung und dem rhythmisches Schlupf erweitert. Sie liefert auch eine umfassende Charakterisierung der synaptischen und peptidergen Eingänge von Uhrneuronen zu PTTHn- und EH-Neuronen. AstA, AstC und Ms wurden als potenzielle Modulatoren der neuronalen Schlupfschaltkreise identifiziert und deuten auf einen indirekten Effekt der PTTH-Signalgebung auf das EH signalling über die peripheren sensorischen C4da-Neuronen hin. KW - Prothoracicotropic hormone KW - Prothoracic gland KW - Eclosion KW - Eclosion hormone KW - C4da KW - v’Td KW - Neuropeptide KW - Neuroendokrines System KW - Taufliege Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-361309 ER - TY - THES A1 - Nirchal, Naveen Kumar T1 - Mechanistische Regulierung des gastroösophagealen Übergangs und die Rolle der Retinsäure bei der Entwicklung des Barrett-Ösophagus T1 - Mechanistic regulation of gastroesophageal junction and role of retinoic acid in the development of Barrett's esophagus N2 - Der gastroösophageale Übergang (GEJ), der die Region abgrenzt, in der der distale Ösophagus auf die proximale Magenregion trifft, ist bekannt für die Entwicklung pathologischer Zustände, wie Metaplasie und Adenokarzinom des Ösophagus (EAC). Es ist wichtig, die Mechanismen der Entwicklungsstadien zu verstehen, die zu EAC führen, da die Inzidenzrate von EAC in den letzten 4 Jahrzehnten um das 7-fache gestiegen ist und die Gesamtüberlebensrate von 5 Jahren 18,4 % beträgt. In den meisten Fällenwird die Diagnose im fortgeschrittenen Stadium ohne vorherige Symptome erstellt. Der Hauptvorläufer für die Entwicklung von EAC ist eine prämaligne Vorstufe namens Barrett-Ösophagus (BE). BE ist der metaplastische Zustand, bei dem das mehrschichtige Plattenepithel des nativen Ösophagus durch ein spezialisiertes einschichtiges Säulenepithel ersetzt wird, das die molekularen Eigenschaften des Magen- sowie des Darmepithels aufweist. Zu den wichtigsten Risikofaktoren für die Entwicklung von BE gehören die chronische gastroösophageale Refluxkrankheit (GERD), eine veränderte Mikrobiota und veränderte Retinsäure-Signalwege (RA). Es ist unklar, welche Zelle der Ursprung für BE ist, da es keine eindeutigen Beweisen für den Prozess der BE-Initiation gibt. In dieser Arbeit habe ich untersucht, wie die GEJ-Homöostase in gesundem Gewebe durch stammzellregulatorische Morphogene aufrechterhalten wird, welche Rolle der Vitamin-A (RA-Signalübertragung) spieltund wie ihre Veränderung zur BE-Entwicklung beiträgt. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich anhand von Einzelmolekül-RNA in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie eindeutig das Vorhandensein von zwei Arten von Epithelzellen nachweisen können, dem Plattenepithel in der Speiseröhre und dem Säulenepithel imMagenbereich des GEJ. Mittels Abstammungsanalysen im Mausmodell konnte ich zeigen, dass die Epithelzellen des Ösophagus und des Magens von zwei verschiedenen epithelialen Stammzelllinien imGEJ abstammen. Die Grenze zwischen Plattenepithel und Säulenepithelzellen im SCJ des GEJ wirddurch gegensätzliche Wnt-Mikroumgebungen streng reguliert. Plattenepithelstammzellen des Ösophagus werden durch das Wnt-hemmende Mikroumgebungssignal aufrechterhalten, während Magensäulenepithelzellen durch das Wnt-aktivierende Signal aus dem Stromakompartiment erhalten werden. Ich habe die in vivo Erhaltung der Epithelstammzellen des GEJ mit Hilfe eines in vitro Epithel-3D-Organoidkulturmodells rekonstruiert. Das Wachstum und die Vermehrung von Magensäulenepithel-Organoiden hängen von Wnt-Wachstumsfaktoren ab, während das Wachstum von Plattenepithel-Organoiden von Wnt-defizienten Kulturbedingungen abhängt. Darüber hinaus zeigte die Einzelzell-RNA-Sequenzanalyse (scRNA-seq) der aus Organoiden gewonnenenEpithelzellen, dass der nicht-kanonische Wnt/ planar cell polarity (PCP) Signalweg an der Regulierung der Plattenepithelzellen beteiligt ist. Im Gegensatz dazu werden säulenförmige Magenepithelzellen durch den kanonischen Wnt/beta-Catenin- und den nicht-kanonischen Wnt/Ca2+-Weg reguliert. Meine Daten zeigen, dass die SCJ-Epithelzellen, die am GEJ verschmelzen, durch entgegengesetzte stromale Wnt-Faktoren und unterschiedliche Wnt-Weg-Signalee in den Epithelzellen reguliert werden. Im zweiten Teil der Dissertation untersuchte ich die Rolle der bioaktiven Vitamin A Verbindung RA auf Ösophagus- und Magenepithelstammzellen. Die In-vitro-Behandlung von epithelialen Organoiden der Speiseröhre und des Magens mitRA oder seinem pharmakologischen Inhibitors BMS 493 zeigte, dass jeder Zelltyp unterschiedlich reguliert wurde. Ich beobachtete, dass eine verstärkte RA die Differenzierung von Stammzellen und den Verlust der Schichtung förderte, während die RA-Hemmung zu einer verstärkten Stammzellbildung und Regeneration im mehrschichtigen Epithel der Speiseröhre führte. Im Gegensatz zur Speiseröhre ist der RA-Signalweg in Magen-Organoiden aktiv, und die Hemmung von RA hat ein reduziertes Wachstum von Magen-Organoiden. Globale transkriptomische Daten und scRNA-seq-Daten zeigten, dass derRA-Signalweg einen Ruhephänotyp in den Ösophaguszellen induziert. Dagegen führt das Fehlen von RA in Magenepithelzellen zur Expression von Genen, die mit BE assoziiert sind. Daher isteine räumlich definierte Regulation der Wnt- und Retinsäure-Signalgebung amGEJ entscheidend für eine gesunde Homöostase, und ihre Störung führt zur Entwicklung von Krankheiten. N2 - Gastroesophageal junction (GEJ), demarcating the region where the distal esophagus meets with the proximal stomach region, is known for developing pathological conditions, including metaplasia and esophageal adenocarcinoma (EAC). It is essential to understand the mechanisms of developmental stages which lead to EAC since the incidence rate of EAC increased over 7-fold during the past four decades, and the overall five years survival rate is 18.4%. In most cases, patients are diagnosed in the advanced stage without prior symptoms. The main precursor for the development of EAC is a pre-malignant condition called Barrett's esophagus (BE). BE is the metaplastic condition where the multilayered squamous epithelium of the native esophagus is replaced by specialized single-layered columnar epithelium, which shows the molecular characteristics of the gastric as well as intestinal epithelium. The main risk factors for BE development include chronic gastro-esophageal acid reflux disease (GERD), altered microbiota, and altered retinoic acid signaling (RA). The cell of origin of BE is under debate due to a lack of clear evidence demonstrating the process of BE initiation. Here, I investigated how GEJ homeostasis is maintained in healthy tissue by stem cell regulatory morphogens, the role of vitamin A (RA signaling), and how its alteration contributes to BE development. In the first part of my thesis, I showed the presence of two types of epithelial cells, the squamous type in the esophagus and the columnar type in the stomach region in the GEJ, using single-molecule RNA in situ hybridization (smRNA-ISH) and immunohistochemistry. Employing lineage tracing in the mouse model, I have demonstrated that the esophageal epithelial and stomach epithelial cells derived from two distinct epithelial stem cell lineages in the GEJ. The border between squamous and columnar epithelial cells in the Squamo-columnar junction (SCJ) of GEJ is regulated by opposing Wnt microenvironments. The regeneration of stomach columnar epithelial stem cells is maintained by Wnt activating signal from the stromal compartment while squamous epithelial stem cells of the esophagus are maintained by the Wnt inhibitory signals. I recapitulated the in vivo GEJ epithelial stem cell maintenance by using in vitro epithelial 3D organoid culture model. The growth and propagation of stomach columnar epithelial organoids depend on Wnt growth factors, while squamous epithelial organoids' development needs Wnt-deficient culture conditions. Further, single-cell RNA sequence (scRNA-seq) analysis of organoid-derived epithelial cells revealed the non-canonical Wnt/ planar cell polarity (PCP) pathway involvement in regulating the squamous epithelial cells. In contrast, columnar stomach epithelial cells are regulated by the canonical Wnt/ beta-catenin and non-canonical Wnt/Ca2+ pathways. My data indicate that the SCJ epithelial cells that merge at the GEJ are regulated by opposing stromal Wnt factors and distinct Wnt pathway signaling in the epithelial cells. In the second part of the thesis, I investigated the role of Vitamin A-derived bioactive compound RA on esophageal and stomach epithelial stem cells. In vitro treatment of esophageal and stomach, epithelial organoids with RA or its pharmacological inhibitor BMS 493 revealed that each cell type was regulated distinctly. I observed that enhanced RA promoted esophageal stem cell differentiation and loss of stratification, while RA inhibition led to enhanced stemness and regeneration of the esophagus stratified epithelium. As opposed to the esophagus, RA signaling is active in the stomach organoids, and inhibition of RA reduces the growth of stomach organoids. Global transcriptomic data and scRNA-seq data revealed that RA signaling induces dormancy phenotype in the esophageal cells. In contrast, the absence of RA in stomach epithelial cells induces the expression of genes associated with BE. Thus, spatially defined regulation of Wnt and RA signaling at GEJ is critical for healthy homeostasis, and its perturbation leads to disease development. KW - Retinoesäure KW - Esophageal adenocarcinoma KW - Intestinal metaplasia KW - Epithelial lineage KW - Organoid KW - Retinoic acid KW - Gastroesophageal reflux KW - Endobrachyösophagus KW - Esophageal disease Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311556 ER - TY - THES A1 - König, Sebastian Thomas T1 - Temperature-driven assembly processes of Orthoptera communities: Lessons on diversity, species traits, feeding interactions, and associated faecal microorganisms from elevational gradients in Southern Germany (Berchtesgaden Alps) T1 - Temperaturabhängige Zusammensetzungsprozesse von Heuschreckengemeinschaften: Lektionen über die Diversität, Artmerkmale, Fraßinteraktionen, und Kot-Mikroorganismen von Höhengradienten in Süddeutschland (Berchtesgadener Alpen) N2 - Chapter I: Introduction Temperature is a major driver of biodiversity and abundance patterns on our planet, which becomes particularly relevant facing the entanglement of an imminent biodiversity and climate crisis. Climate shapes the composition of species assemblages either directly via abiotic filtering mechanisms or indirectly through alterations in biotic interactions. Insects - integral elements of Earth’s ecosystems - are affected by climatic variation such as warming, yet responses vary among species. While species’ traits, antagonistic biotic interactions, and even species’ microbial mutualists may determine temperature-dependent assembly processes, the lion’s share of these complex relationships remains poorly understood due to methodological constraints. Mountains, recognized as hotspots of diversity and threatened by rapidly changing climatic conditions, can serve as natural experimental settings to study the response of insect assemblages and their trophic interactions to temperature variation, instrumentalizing the high regional heterogeneity of micro- and macroclimate. With this thesis, we aim to enhance our mechanistic understanding of temperature-driven assembly processes within insect communities, exemplified by Orthoptera, that are significant herbivores in temperate mountain grassland ecosystems. Therefore, we combined field surveys of Orthoptera assemblages on grassland sites with molecular tools for foodweb reconstruction, primarily leveraging the elevational gradients offered by the complex topography within the Berchtesgaden Alpine region (Bavaria, Germany) as surrogate for temperature variation (space-for-time substitution approach). In this framework, we studied the effects of temperature variation on (1) species richness, abundance, community composition, and interspecific as well as intraspecific trait patterns, (2) ecological feeding specialisation, and (3) previously neglected links to microbial associates found in the faeces. Chapter II: Temperature-driven assembly processes Climate varies at multiple scales. Since microclimate is often overlooked, we assessed effects of local temperature deviations on species and trait compositions of insect communities along macroclimatic temperature gradients in Chapter II. Therefore, we employed joint species distribution modelling to explore how traits drive variation in the climatic niches of Orthoptera species at grassland sites characterized by contrasting micro- and macroclimatic conditions. Our findings revealed two key insights: (1) additive effects of micro- and macroclimate on the diversity, but (2) interactive effects on the abundance of several species, resulting in turnover and indicating that species possess narrower climatic niches than their elevational distributions might imply. This chapter suggests positive effects of warming on Orthoptera, but also highlights that the interplay of macro- and microclimate plays a pivotal role in structuring insect communities. Thus, it underscores the importance of considering both elements when predicting the responses of species to climate change. Additionally, this chapter revealed inter- and intraspecific effects of traits on the niches and distribution of species. Chapter III: Dietary specialisation along climatic gradients A crucial trait linked to the position of climatic niches is dietary specialisation. According to the ‘altitudinal niche-breadth hypothesis’, species of high-elevation habitats should be less specialized compared to their low-elevation counterparts. However, empirical evidence on shifts in specialization is scarce for generalist insect herbivores and existing studies often fail to control for the phylogeny and abundance of interaction partners. In Chapter III, we used a combination of field observations and amplicon sequencing to reconstruct dietary relationships between Orthoptera and plants along an extensive temperature gradient. We did not find close but flexible links between individual grasshopper and plant taxa in space. While interaction network specialisation increased with temperature, the corrected dietary specialisation pattern peaked at intermediate elevations on assemblage level. These nuanced findings demonstrate that (1) resource availability, (2) phylogenetic relationships, and (3) climate can affect empirical foodwebs intra- and interspecifically and, hence, the dietary specialisation of herbivorous insects. In this context, we discuss that the underlying mechanisms involved in shaping the specialisation of herbivore assemblages may switch along temperature clines. Chapter IV: Links between faecal microbe communities, feeding habits, and climate Since gut microbes affect the fitness and digestion of insects, studying their diversity could provide novel insights into specialisation patterns. However, their association with insect hosts that differ in feeding habits and specialisation has never been investigated along elevational climatic gradients. In Chapter IV, we utilized the dietary information gathered in Chapter III to characterize links between insects with distinct feeding behaviour and the microbial communities present in their faeces, using amplicon sequencing. Both, feeding and climate affected the bacterial communities. However, the large overlap of microbes at site level suggests that common bacteria are acquired from the shared feeding environment, such as the plants consumed by the insects. These findings emphasize the influence of a broader environmental context on the composition of insect gut microbial communities. Chapter V: Discussion & Conclusions Cumulatively, the sections of this dissertation provide support for the hypothesis that climatic conditions play a role in shaping plant–herbivore systems. The detected variation of taxonomic and functional compositions contributes to our understanding of assembly processes and resulting diversity patterns within Orthoptera communities, shedding light on the mechanisms that structure their trophic interactions in diverse climates. The combined results presented suggest that a warmer climate could foster an increase of Orthoptera species richness in Central European semi-natural grasslands, also because the weak links observed between insect herbivores and plants are unlikely to limit decoupled range shifts. However, the restructuring of Orthoptera communities in response to warmer temperatures depends on species' traits such as moisture preferences or phenology. Notably, we were able to demonstrate a crucial role of microclimate for many species, partly unravelling narrower climatic niches than their elevational ranges suggest. We found evidence that not only Orthoptera community composition, specialisation, and traits varied along elevational gradients, but even microbial communities in the faeces of Orthoptera changed, which is a novel finding. This complex restructuring and reassembly of communities, coupled with the nonlinear specialisation of trophic interactions and a high diversity of associated bacteria, emphasize our currently incomplete comprehension of how ecosystems will develop under future climatic conditions, demanding caution in making simplified predictions for biodiversity change under climate warming. Since these predictions may benefit from including biotic interactions and both, micro- and macroclimate based on our findings, conservation authorities and practitioners must not neglect improving microclimatic conditions to ensure local survival of a diverse set of threatened and demanding species. In this context, mountains can play a pivotal role for biodiversity conservation since these offer heterogeneous microclimatic conditions in proximity that can be utilized by species with distinct niches. N2 - Kapitel I: Einleitung Die Temperatur ist eine wichtige Triebkraft hinter den Artenvielfalts- und Abundanzmustern auf unserem Planeten, was angesichts der Verflechtung der unmittelbar bevorstehenden Biodiversitäts- und Klimakrise besonders relevant ist. Das Klima strukturiert die Artenvielfalt direkt durch abiotische Filtermechanismen oder indirekt durch Veränderungen biotischer Wechselwirkungen. Insekten - wesentliche Bestandteile der Ökosysteme der Erde - sind von klimatischen Veränderungen wie der Erwärmung betroffen, reagieren aber je nach Art unterschiedlich. Während die Merkmale der Arten, antagonistische biotische Interaktionen und sogar die mikrobiellen Partner der Arten temperaturabhängige Zusammensetzungsprozesse bestimmen können, bleibt ein Großteil dieser komplexen Beziehungen aufgrund methodischer Einschränkungen nach wie vor schlecht verstanden. Gebirge, die als Hotspots der Diversität gelten und von sich rasch verändernden klimatischen Bedingungen bedroht sind, können durch Nutzung der großen regionalen Heterogenität der Klein- und Großklimate als natürliche Experimente dienen, um die Reaktion von Insektengemeinschaften und deren trophischen Interaktionen auf Temperaturänderungen zu untersuchen. Mit dieser Arbeit möchten wir einen Beitrag zum mechanistischen Verständnis der temperaturbedingten Zusammensetzungsprozesse von Insektengemeinschaften leisten, am Beispiel von Heuschrecken, die bedeutende Pflanzenfresser in Grünlandökosystemen der gemäßigten Breiten sind. Hierfür kombinierten wir Felduntersuchungen von Heuschreckengemeinschaften in Grünlandstandorten mit molekularen Methoden zur Rekonstruktion von Nahrungsbeziehungen, wobei wir hauptsächlich die Höhengradienten, die die komplexe Topografie der Berchtesgadener Alpenregion (Bayern, Deutschland) bietet, stellvertretend für Temperaturveränderungen verwendeten (Raum-Zeit-Substitutionsansatz). In diesem Rahmen untersuchten wir die Auswirkungen von Temperaturvariation auf (1) den Artenreichtum, die Abundanz, die Zusammensetzung der Gemeinschaft und die inter- und intraspezifischen Merkmalsmuster, (2) die ökologische Nahrungsspezialisierung und (3) die bis dato vernachlässigte Verbindung zu den mikrobiellen Begleitarten im Kot. Kapitel II: Temperaturabhängige Zusammensetzungsprozesse Das Klima variiert auf verschiedenen Ebenen. Da Veränderungen im Kleinklima oft vernachlässigt werden, haben wir in Kapitel II die Auswirkungen der lokalen Temperaturunterschiede auf die Arten- und Merkmalszusammensetzung von Insektengemeinschaften entlang makroklimatischer Temperaturgradienten untersucht. Hierfür haben wir die Methode der gemeinsamen Artenverteilungsmodellierung verwendet, um zu untersuchen, wie Artmerkmale die Unterschiede in klimatischen Nischen von Heuschreckenarten auf Grünlandstandorten mit gegensätzlichen mikro- und makroklimatischen Bedingungen beeinflussen. Unsere Ergebnisse brachten zwei wichtige Erkenntnisse zutage: (1) additive Auswirkungen des Mikro- und Makroklimas auf die Vielfalt, aber (2) interaktive Effekte auf die Häufigkeit mehrerer Arten, die sich in Zusammensetzungsunterschieden niederschlagen und auf engere klimatische Nischen hinweisen, als es die Höhenverbreitung vermuten lässt. Dieses Kapitel deutet auf positive Auswirkungen einer Erwärmung auf Orthoptera hin, zeigt aber auch, dass das Zusammenspiel von Makro- und Mikroklima eine Schlüsselrolle bei der Strukturierung von Insektengemeinschaften spielt und beide Elemente bei der Vorhersage der Reaktionen von Arten auf den Klimawandel berücksichtigt werden sollten. Darüber hinaus wurden in diesem Kapitel die inter- und intraspezifischen Auswirkungen von Merkmalen auf die Nischen und die Verbreitung von Arten aufgezeigt. Kapitel III: Nahrungsspezialisierung entlang von Klimagradienten Ein entscheidendes Merkmal für die Lage der klimatischen Nische einer Art ist die Nahrungsspezialisierung. Nach der "Hypothese der Höhenlagen-abhängigen Nischenbreite" sollten Arten in hoch gelegenen Lebensräumen weniger spezialisiert sein als ihre Pendants in niedrigen Lagen. Empirische Belege für Verschiebungen in der Spezialisierung von generalistischen, herbivoren Insekten sind jedoch rar und es fehlt eine Berücksichtigung der Häufigkeit und Phylogenie von Interaktionspartnern. In Kapitel III haben wir eine Kombination aus Feldbeobachtungen und Amplikonsequenzierung verwendet, um die Nahrungsbeziehungen von Heuschrecken und Pflanzen entlang eines ausgedehnten Temperaturgradienten zu rekonstruieren. Wir konnten keine engen, sondern flexible Beziehungen zwischen einzelnen Herbivoren- und Pflanzentaxa feststellen. Während die Spezialisierung der Interaktionsnetzwerke mit der Temperatur zunahm, erreichte das korrigierte Muster der Nahrungsspezialisierung auf Gemeinschaftsebene seinen Höhepunkt in mittleren Höhenlagen. Diese differenzierten Ergebnisse zeigen, dass (1) die Verfügbarkeit von Ressourcen, (2) phylogenetische Beziehungen und (3) das Klima intra- und interspezifische empirische Nahrungsbeziehungen und damit die Nahrungsspezialisierung pflanzenfressender Insekten beeinflussen können. In diesem Kontext diskutieren wir, dass die zugrundeliegenden Mechanismen hinter der Nahrungsspezialisierung von herbivoren Insekten entlang von Temperaturgradienten wechseln könnten. Kapitel IV: Verbindungen zwischen Kotbakteriengemeinschaften, Ernährungsgewohnheiten und Klima. Da Darmbakterien die Fitness und Verdauung von Insekten beeinflussen, könnte die Untersuchung deren Vielfalt neue Erkenntnisse über Spezialisierungsmuster liefern. Ihre Verbindung mit Insekten, die sich in ihren Ernährungsgewohnheiten und ihrer Spezialisierung unterscheiden, wurde jedoch noch nie entlang klimatischer Höhengradienten untersucht. In Kapitel IV verwendeten wir Nahrungsinformationen aus Kapitel III, um mit Hilfe von Amplikonsequenzierung Verbindungen zwischen Insekten mit unterschiedlichem Ernährungsverhalten und mikrobiellen Gemeinschaften in deren Kot zu charakterisieren. Sowohl die Nahrung als auch das Klima hatten Auswirkungen auf die bakteriellen Gemeinschaften. Die große Überschneidung der Mikrobengemeinschaften auf Standortebene deutet jedoch darauf hin, dass gemeinsame Bakterien aus der geteilten Nahrungsumgebung, wie z.B. den von den Insekten verzehrten Pflanzen, stammen. Diese Ergebnisse unterstreichen den Einfluss eines breiteren Umweltkontextes auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften im Insektendarm. Kapitel V: Diskussion & Schlussfolgerungen Insgesamt stützen die Kapitel dieser Dissertation die Hypothese, dass klimatische Verhältnisse Pflanzen-Pflanzenfresser-Systeme prägen. Die festgestellten Unterschiede in der taxonomischen und funktionellen Zusammensetzung tragen zu unserem Verständnis der Zusammensetzungsprozesse und daraus resultierenden Diversitätsmustern von Heuschreckengemeinschaften sowie der Mechanismen bei, die deren trophische Interaktionen in verschiedenen Klimazonen strukturieren. Die Kombination der Ergebnisse deutet darauf hin, dass wärmeres Klima eine Zunahme des Heuschreckenartenreichtums in naturnahen Grünlandgebieten Mitteleuropas begünstigen könnte, auch weil die schwachen Verbindungen zwischen den herbivoren Insekten und Pflanzen entkoppelte Arealverschiebungen wahrscheinlich nicht limitieren. Jedoch könnten höhere Temperaturen die Zusammensetzung von Heuschreckengemeinschaften je nach den Merkmalen der Arten wie deren Feuchtigkeitsvorlieben oder der Schlupfphänologie verändern. Darüber hinaus konnten wir nachweisen, dass das Mikroklima für viele Arten eine entscheidende Rolle spielt, da es teilweise engere klimatische Nischen aufdeckt, als ihre Höhenverbreitung vermuten lassen. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich nicht nur die Zusammensetzung, Spezialisierung und Merkmale der Heuschreckengemeinschaften entlang der Höhengradienten ändern, sondern dass sogar die mikrobiellen Gemeinschaften im Kot variieren, was eine neue Erkenntnis darstellt. Diese komplexe Umstrukturierung und Neuzusammensetzung von Gemeinschaften in Kombination mit der nichtlinearen Spezialisierung von Interaktionen und einer hohen Vielfalt an assoziierten Bakterien unterstreichen unser noch immer begrenztes Verständnis davon, wie sich Ökosysteme unter zukünftigen Klimabedingungen entwickeln werden, und mahnen zur Vorsicht bei vereinfachten Vorhersagen über die Veränderung der biologischen Vielfalt im Zuge der Klimaerwärmung. Da solche Vorhersagen auf Grundlage unserer Ergebnisse vom Einbezug biotischer Wechselwirkungen und des Mikro- und Makroklimas profitieren können, dürfen Naturschutzverantwortliche eine Verbesserung der mikroklimatischen Bedingungen nicht vernachlässigen, um das lokale Überleben einer Vielzahl bedrohter und anspruchsvoller Arten zu sichern. In diesem Zusammenhang können Berge eine entscheidende Rolle für den Erhalt der biologischen Vielfalt spielen, da sie in räumlicher Nähe heterogene mikroklimatische Bedingungen bieten, die von Arten mit unterschiedlichen Nischen genutzt werden können. KW - Heuschrecken KW - Mikroklima KW - Bayerische Alpen KW - Nahrung KW - Mikrobiom KW - biotic interactions KW - plant-herbivore-interactions KW - elevational gradients Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-354608 ER - TY - THES A1 - Weisert, Nadine T1 - Characterization of telomere-associated proteins in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Charakterisierung Telomer-assoziierter Proteine in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular pathogen Trypanosoma brucei is the causative agent of African trypanosomiasis, an endemic disease prevalent in sub-Saharan Africa. Trypanosoma brucei alternates between a mammalian host and the tsetse fly vector. The extracellular parasite survives in the mammalian bloodstream by periodically exchanging their ˈvariant surface glycoproteinˈ (VSG) coat to evade the host immune response. This antigenic variation is achieved through monoallelic expression of one VSG variant from subtelomeric ˈbloodstream form expression sitesˈ (BES) at a given timepoint. During the differentiation from the bloodstream form (BSF) to the procyclic form (PCF) in the tsetse fly midgut, the stage specific surface protein is transcriptionally silenced and replaced by procyclins. Due to their subtelomeric localization on the chromosomes, VSG transcription and silencing is partly regulated by homologues of the mammalian telomere complex such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 as well as by ˈtelomere-associated proteinsˈ (TelAPs) like TelAP1. To gain more insights into transcription regulation of VSG genes, the identification and characterization of other TelAPs is critical and has not yet been achieved. In a previous study, two biochemical approaches were used to identify other novel TelAPs. By using ˈco-immunoprecipitationˈ (co-IP) to enrich possible interaction partners of TbTRF and by affinity chromatography using telomeric repeat oligonucleotides, a listing of TelAP candidates has been conducted. With this approach TelAP1 was identified as a novel component of the telomere complex, involved in the kinetics of transcriptional BES silencing during BSF to PCF differentiation. To gain further insights into the telomere complex composition, other previously enriched proteins were characterized through a screening process using RNA interference to deplete potential candidates. VSG expression profile changes and overall proteomic changes after depletion were analyzed by mass spectrometry. With this method, one can gain insights into the functions of the proteins and their involvement in VSG expression site regulation. To validate the interaction of proteins enriched by co-IP with TbTRF and TelAP1 and to identify novel interaction proteins, I performed reciprocal affinity purifications of the four most promising candidates (TelAP2, TelAP3, PPL2 and PolIE) and additionally confirmed colocalization of two candidates with TbTRF via immunofluorescence (TelAP2, TelAP3). TelAP3 colocalizes with TbTRF and potentially interacts with TbTRF, TbTIF2, TelAP1 and TelAP2, as well as with two translesion polymerases PPL2 and PolIE in BSF. PPL2 and PolIE seem to be in close contact to each other at the telomeric ends and fulfill different roles as only PolIE is involved in VSG regulation while PPL2 is not. TelAP2 was previously characterized to be associated with telomeres by partially colocalizing with TbTRF and cells show a VSG derepression phenotype when the protein was depleted. Here I show that TelAP2 interacts with the telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2 as well as with the telomere-associated protein TelAP1 in BSF and that TelAP2 depletion results in a loss of TelAP1 colocalization with TbTRF in BSF. In conclusion, this study demonstrates that characterizing potential TelAPs is effective in gaining insights into the telomeric complex's composition and its role in VSG regulation in Trypanosoma brucei. Understanding these interactions could potentially lead to new therapeutic targets for combatting African trypanosomiasis. N2 - Der einzellige Pathogen Trypanosoma brucei ist der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis, eine endemische Krankheit vertreten in der Sub-Sahara Zone Afrikas. Trypanosoma brucei wechselt zwischen einem Säugerwirt und dem Insektenvektor, der Tsetse-Fliege. Der im Blutstrom des Säugers vorkommende, extrazelluläre Parasit ändert seinen Oberflächenmantel bestehend aus dem ˈvariablen Oberflächenproteinˈ (VSG) in periodischen Abständen, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen. Diese antigenetische Variation wird durch die monoallelische Expression einer einzelnen VSG-Variante, lokalisiert auf den ˈBlutstromform Expressionsseitenˈ (BES), zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht. Diese stadienspezifischen Oberflächenproteine werden während der Differenzierung der ˈBlutstromformˈ (BSF) zur ˈprozyklischen Formˈ (PCF) im Mitteldarm der Tsetse-Fliege stillgelegt und durch Prozykline ersetzt. Wegen der subtelomeren Lokalisation wird die VSG Transkription und Stilllegung teilweise durch Homologe des Säuger Telomerkomplexes TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1 als auch durch Telomer-assoziierte Proteine (TelAPs) wie TelAP1 reguliert. Um Einblicke in die Transkriptionsregulation der VSG Gene zu erhalten, ist die Identifikation und Charakterisierung anderer Telomer-assoziierter Proteine von großem Interesse. In einer vorherigen Studie wurden zwei komplementäre biochemische Versuchsansätze verwendet, um weitere neue TelAPs zu identifizieren. Es wurde eine ko-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner von TbTRF zu identifizieren, sowie eine Affinitätschromatographie unter Verwendung telomerischen Wiederholungseinheiten. Hierdurch wurde eine Liste von potenziellen Kandidaten generiert. Mit diesem Ansatz wurde TelAP1 als neue Komponente des Telomerkomplexes identifiziert, welches an der Kinetik der transkriptionellen BES-Stilllegung während der Differenzierung von BSF zu PCF beteiligt ist. Um weitere Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes zu erhalten, wurden zuvor angereicherte Proteine durch einen Screening-Prozess unter Verwendung von RNA-Interferenz charakterisiert. Nach der Depletion von 21 Proteinen wurden massenspektrometrische Analysen der VSG Expressionsprofiländerungen sowie allgemeine Veränderungen des Proteomenprofils analysiert. Mit dieser Methode können Erkenntnisse über die Funktion der jeweiligen Proteine und ihrer Beteiligung an der Regulierung der antigenetischen Variation von T. brucei gewonnen werden. Um die Interaktionen von Proteinen zu validieren, welche bei den Co-Immunpräzipitationen mit TbTRF und TelAP1 angereichert wurden, habe ich eine reziproke Affinitätschromatographie mit vier der vielversprechendsten Kandidaten durchgeführt (TelAP2, TelAP3, PPL2 und PolIE). Zusätzlich bestätigte ich die Co-lokalisation von zwei Kandidaten mit TbTRF via Immunfluoreszenzaufnahmen (TelAP2, TelAP3). TelAP3 ko-lokalisiert mit TbTRF und TelAP1 und interagiert potenziell mit TbTRF, TbTIF2, TelAP1 und TelAP2 als auch mit den zwei Transläsionspolymerasen PPL2 und PolIE in BSF. PPL2 und PolIE stehen in engem Kontakt zueinander und nehmen an den Telomerenden unterschiedliche Funktionen ein, da nur PolIE an der VSG Regulation beteiligt ist. TelAP2 wurde in einer vorherigen Publikation als Telomer-assoziiertes Protein durch partielle Co-Lokalisation mit TbTRF identifiziert und Zellen zeigen nach der Depletion von TelAP2 eine Derepression von zuvor stillgelegten VSGs. In dieser Studie zeige ich, dass TelAP2 mit den Telomer-bindenden Proteinen TbTRF und TbTIF2 sowie mit dem telomerassoziierten Protein TelAP1 in BSF interagiert und dass die Depletion von TelAP2 zu dem Verlust der Co-Lokalisation von TelAP1 mit TbTRF in BSF führt. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Charakterisierung potenzieller TelAPs dazu beiträgt, Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes und dessen Rolle bei der VSG-Regulation in Trypanosoma brucei zu gewinnen. Das Verständnis dieser Interaktionen könnte möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten zur Bekämpfung der afrikanischen Trypanosomiasis führen. KW - Telomer KW - Trypanosoma brucei KW - telomere-associated protein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352732 ER - TY - THES A1 - Kuklovsky [former Finke], Valerie T1 - Are some bees smarter than others? An examination of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees T1 - Sind manche Bienen schlauer als andere? Eine Untersuchung von konsistenten individuellen Unterschieden in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen N2 - Cognition refers to the ability to of animals to acquire, process, store and use vital information from the environment. Cognitive processes are necessary to predict the future and reduce the uncertainty of the ever-changing environment. Classically, research on animal cognition focuses on decisive cognitive tests to determine the capacity of a species by the testing the ability of a few individuals. This approach views variability between these tested key individuals as unwanted noise and is thus often neglected. However, inter-individual variability provides important insights to behavioral plasticity, cognitive specialization and brain modularity. Honey bees Apis mellifera are a robust and traditional model for the study of learning, memory and cognition due to their impressive capabilities and rich behavioral repertoire. In this thesis I have applied a novel view on the learning abilities of honey bees by looking explicitly at individual differences in a variety of learning tasks. Are some individual bees consistently smarter than some of her sisters? If so, will a smart individual always perform good independent of the time, the context and the cognitive requirements or do bees show distinct isolated ‘cognitive modules’? My thesis presents the first comprehensive investigation of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees. To speak of an individual as behaving consistently, a crucial step is to test the individual multiple times to examine the repeatability of a behavior. I show that free-flying bees remain consistent in a visual discrimination task for three consecutive days. Successively, I explored individual consistency in cognitive proficiency across tasks involving different sensory modalities, contexts and cognitive requirements. I found that free-flying bees show a cognitive specialization between visual and olfactory learning but remained consistent across a simple discrimination task and a complex concept learning task. I wished to further explore individual consistency with respect to tasks of different cognitive complexity, a question that has never been tackled before in an insect. I thus performed a series of four experiments using either visual or olfactory stimuli and a different training context (free-flying and restrained) and tested bees in a discrimination task, reversal learning and negative patterning. Intriguingly, across all these experiments I evidenced the same results: The bees’ performances were consistent across the discrimination task and reversal learning and negative patterning respectively. No association was evidenced between reversal learning and negative patterning. After establishing the existence of consistent individual differences in the cognitive proficiency of honey bees I wished to determine factors which could underlie these differences. Since genetic components are known to underlie inter-individual variability in learning abilities, I studied the effects of genetics on consistency in cognitive proficiency by contrasting bees originating from either from a hive with a single patriline (low genetic diversity) or with multiple patrilines (high genetic diversity). These two groups of bees showed differences in the patterns of individually correlated performances, indicating a genetic component accounts for consistent cognitive individuality. Another major factor underlying variability in learning performances is the individual responsiveness to sucrose solution and to visual stimuli, as evidenced by many studies on restrained bees showing a positive correlation between responsiveness to task relevant stimuli and learning performances. I thus tested whether these relationships between sucrose/visual responsiveness and learning performances are applicable for free-flying bees. Free-flying bees were again subjected to reversal learning and negative patterning and subsequently tested in the laboratory for their responsiveness to sucrose and to light. There was no evidence of a positive relationship between sucrose/visual responsiveness and neither performances of free-flying bees in an elemental discrimination, reversal learning and negative patterning. These findings indicate that relationships established between responsiveness to task relevant stimuli and learning proficiency established in the laboratory with restrained bees might not hold true for a completely different behavioral context i.e. for free-flying bees in their natural environment. These results show that the honey bee is an excellent insect model to study consistency in cognitive proficiency and to identify the underlying factors. I mainly discuss the results with respect to the question of brain modularity in insects and the adaptive significance of individuality in cognitive abilities for honey bee colonies. I also provide a proposition of research questions which tie in this theme of consistent cognitive proficiency and could provide fruitful areas for future research. N2 - Unter Kognition versteht man die Fähigkeit von Tieren, essenzielle Informationen aus der Umwelt zu erfassen, zu verarbeiten, zu speichern und zu nutzen. Kognitive Prozesse sind notwendig, um die Zukunft vorherzusagen und die Unvorhersehbarkeit der sich ständig verändernden Umwelt zu verringern. Die Forschung der Kognition von Tieren konzentriert sich klassischerweise auf entscheidende kognitive Tests, um die Fähigkeit einer Spezies anhand der Leistungen einiger weniger Individuen zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wird die Variabilität zwischen Individuen als unerwünschtes Rauschen betrachtet und daher vernachlässigt. Die interindividuelle Variabilität liefert jedoch wichtige Erkenntnisse über die Plastizität des Verhaltens, die kognitive Spezialisierung und die Modularität des Gehirns. Die Honigbiene Apis mellifera ist aufgrund ihrer eindrucksvollen Fähigkeiten und ihres reichen Verhaltensrepertoires ein robuster und traditioneller Modellorganismus für die Untersuchung von Lernen, Gedächtnis und Kognition. In dieser Arbeit habe ich das Lernverhalten von Honigbienen in einem neuen Blickwinkel betrachtet, indem ich explizit die individuellen Unterschiede bei diversen Lernaufgaben untersucht habe. Zeigen manche Bienen durchweg eine erhöhte Lernleistung im Vergleich zu ihren Schwestern? Wenn ja, erbringt ein Individuum unabhängig von der Zeit, dem Kontext und den kognitiven Anforderungen der Lernaufgaben immer gute Leistungen, oder zeigen Bienen ausgeprägte unabhängige "kognitive Module"? Die vorliegende Doktorarbeit stellt die erste umfassende Untersuchung konsistenter individueller Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen dar. Um von einem konsistenten Verhalten sprechen zu können, ist es entscheidend das Individuum mehrfach zu testen, um die Wiederholbarkeit eines Verhaltens zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass frei fliegende Bienen bei einer visuellen Unterscheidungsaufgabe an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine konsistente Lernleistung zeigen. Im Anschluss untersuchte ich die individuelle Konsistenz der kognitiven Fähigkeiten bei Lernaufgaben mit unterschiedlichen sensorischen Modalitäten, Kontexten und kognitiven Anforderungen. Frei fliegende Bienen zeigten eine kognitive Spezialisierung zwischen visuellem und olfaktorischem Lernen, während sie bei einer einfachen Unterscheidungsaufgabe und einer komplexen Konzeptlernaufgabe konsistent im Lernverhalten blieben. Anschließend wollte ich die individuelle Konsistenz im Lernverhalten bei Aufgaben unterschiedlicher kognitiver Komplexität weiter erforschen, eine Frage, die bisher noch nie bei einem Insekt behandelt wurde. Ich führte dazu eine Reihe von vier Experimenten durch, bei denen entweder visuelle oder olfaktorische Stimuli und ein unterschiedlicher Trainingskontext (frei fliegend oder eingespannt) verwendet wurden. Die Bienen wurden in einer Unterscheidungsaufgabe, einer Umlernaufgabe und in Negative Patterning getestet. Erstaunlicherweise wurden bei diesen Experimenten die gleichen Ergebnisse festgestellt: Die Lernleitung der Bienen in der Unterscheidungsaufgabe zeigte eine positive Korrelation mit der Lernleistung im Umlernen und Negative Patterning. Zwischen dem Umkehrlernen und Negative Patterning konnte jedoch kein Zusammenhang festgestellt werden. Nachdem ich festgestellt hatte, dass es konsistente individuelle Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Bienen gibt, wollte ich die Faktoren ermitteln, die diesen Unterschieden zugrunde liegen könnten. Es war bereits bekannt, dass genetische Komponenten der interindividuellen Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegen. Deshalb untersuchte ich den Einfluss von genetischer Vielfalt auf die Beständigkeit von kognitiven Fähigkeiten, indem ich Bienen gegenüberstellte, die entweder aus einem Bienenstock mit einer einzigen Patriline (geringe genetische Vielfalt) oder mit mehreren Patrilinen (hohe genetische Vielfalt) stammten. Diese beiden Gruppen von Bienen wiesen Unterschiede in den Mustern der individuellen korrelierten Lernleistungen auf, was darauf hindeutet, dass eine genetische Komponente für kognitive Individualität verantwortlich ist. Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher der Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegt, ist die individuelle Reaktionsfähigkeit auf Saccharose Lösungen und auf visuelle Stimuli. Dies wurde durch viele Studien an eingespannten Bienen gezeigt, die eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Reize und den Lernfähigkeiten feststellten. Ich habe daher untersucht, ob diese Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und visuellen Stimuli und den Lernleistungen auch für frei fliegende Bienen zutreffen. Die individuellen Lernleistungen im Umlernen und Negative patterning von frei fliegenden Bienen wurden erneut ermittelt und anschließend wurde im Labor die Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht getestet. Es gab keine Hinweise auf eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht und den Lernleistungen von frei fliegenden Bienen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Stimuli und der Lernleistung, die im Labor mit eingespannten Bienen festgestellt wurden, möglicherweise nicht für einen anderen Verhaltenskontext gelten, d. h. für frei fliegende Bienen in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Honigbiene ein hervorragendes Insektenmodell ist, um die Konsistenz kognitiver Fähigkeiten zu untersuchen und die zugrunde liegenden Faktoren zu ermitteln. Ich diskutiere die Ergebnisse vor allem im Hinblick auf die Frage der Modularität des Gehirns bei Insekten und die adaptive Bedeutung von individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten für Honigbienenvölker. Ich schlage auch Forschungsfragen vor, die mit individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten zusammenhängen und wertvolle Bereiche für künftige Forschungen darstellen könnten. KW - Lernen KW - Biene KW - Kognition KW - Individual differences KW - Cognitive consistency KW - Cognitive profile KW - Learning KW - Honeybee KW - Cognition Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323012 ER - TY - THES A1 - Hahn, Sarah T1 - Investigating non-canonical, 5' UTR-dependent translation of MYC and its impact on colorectal cancer development T1 - Untersuchung der nicht-kanonischen, 5' UTR-abhängigen Translation von MYC und ihres Einflusses auf die Entwicklung von Darmkrebs N2 - Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. N2 - Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird. KW - Myc KW - Translation KW - Colorectal cancer KW - 5' UTR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364202 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Oliver T1 - Development of somatic modified mouse models of Non-Small cell lung cancer T1 - Entwicklung von somatisch veränderten Mausmodellen für nichtkleinzelligen Lungenkrebs N2 - In 2020, cancer was the leading cause of death worldwide, accounting for nearly 10 million deaths. Lung cancer was the most common cancer, with 2.21 million cases per year in both sexes. This non-homogeneous disease is further subdivided into small cell lung cancer (SCLC, 15%) and non-small cell lung cancer (NSCLC, 85%). By 2023, the American Cancer Society estimates that NSCLC will account for 13% of all new cancer cases and 21% of all estimated cancer deaths. In recent years, the treatment of patients with NSCLC has improved with the development of new therapeutic interventions and the advent of targeted and personalised therapies. However, these advances have only marginally improved the five-year survival rate, which remains alarmingly low for patients with NSCLC. This observation highlights the importance of having more appropriate experimental and preclinical models to recapitulate, identify and test novel susceptibilities in NSCLC. In recent years, the Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mouse model developed by Tuveson, Jacks and Berns has been the main in vivo model used to study NSCLC. This model mimics ADC and SCC to a certain extent. However, it is limited in its ability to reflect the genetic complexity of NSCLC. In this work, we use CRISPR/Cas9 genome editing with targeted mutagenesis and gene deletions to recapitulate the conditional model. By comparing the Trp53fl/fl KRaslsl- G12D/wt with the CRISPR-mediated Trp53mut KRasG12D, we demonstrated that both showed no differences in histopathological features, morphology, and marker expression. Furthermore, next-generation sequencing revealed a very high similarity in their transcriptional profile. Adeno-associated virus-mediated tumour induction and the modular design of the viral vector allow us to introduce additional mutations in a timely manner. CRISPR-mediated mutation of commonly mutated tumour suppressors in NSCLC reliably recapitulated the phenotypes described in patients in the animal model. Lastly, the dual viral approach could induce the formation of lung tumours not only in constitutive Cas9 expressing animals, but also in wildtype animals. Thus, the implementation of CRISPR genome editing can rapidly advance the repertoire of in vivo models for NSCLC research. Furthermore, it can reduce the necessity of extensive breeding. N2 - Krebs war mit fast 10 Millionen Todesfällen weltweit die häufigste Todesursache in 2020. Mit 2,21 Millionen Fällen pro Jahr in beiden Geschlechtern kombiniert war Lungenkrebs die häufigste Unterart. Auszeichnend für dieses Krankheit ist die hohe Komplexität und Heterogenität. Daher wird diese weiter in kleinzelligen Lungenkrebs (SCLC, 15 %) und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC, 85 %) unterteilt. Die American Cancer Society schätzt, dass bis 2023 13 % aller neuen Krebsfälle und 21 % aller geschätzten Krebstodesfälle auf das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom entfallen werden. In den letzten Jahren hat sich die Behandlung von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom durch die Entwicklung neuer therapeutischer Maßnahmen und das Anwenden personalisierter Therapien verbessert. Allerdings haben diese Fortschritte die Fünfjahresüberlebensrate nur geringfügig verbessert, die für Patienten mit NSCLC nach wie vor alarmierend niedrig ist. Diese macht deutlich, wie wichtig es ist, über geeignetere experimentelle und präklinische Modelle zu verfügen, um neue Therapieansätze beim NSCLC zu rekapitulieren, zu identifizieren und zu testen. In der letzten Dekade war das von Tuveson, Jacks und Berns entwickelte Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt-Mausmodell das wichtigste In-vivo-Modell zur Untersuchung von NSCLC. Dieses kann grundlegend das Krankheitsbild von NSCLC wiederspiegeln. Es ist jedoch nur begrenzt in der Lage, die genetische Komplexität von NSCLC im vollen Umfang zu refelktieren. In dieser Arbeit verwenden wir CRISPR/Cas9 Genome Editing mit gezielter Mutagenese und Gendeletionen, um das konditionale Modell zu rekapitulieren. Durch den Vergleich des Trp53fl/fl KRaslsl-G12D/wt mit dem CRISPR-vermittelten Trp53mut KRasG12D konnten wir zeigen, dass beide keine Unterschiede in Bezug auf histopathologische Merkmale, Morphologie und Markerexpression aufweisen. Darüber hinaus ergab die Analyse mittels Next Generation Sequencing 8Hochdruchsatz.Sequenzierung) eine sehr große Ähnlichkeit in ihrem Transkriptionsprofil. Die Adeno-assoziierte Virus-vermittelte Tumorinduktion und der modulare Aufbau des viralen Vektors ermöglichen es uns, zusätzliche Mutationen zeitnah einzuführen. Die CRISPR-vermittelte Mutation von häufig mutierten Tumorsuppressoren bei NSCLC rekapitulierte zuverlässig die bei Patienten beschriebenen Phänotypen im Tiermodell. Schließlich konnte der duale virale Ansatz die Bildung von Lungentumoren nicht nur in konstitutiv Cas9 exprimierenden Tieren, sondern auch in Wildtyp-Tieren induzieren. Somit kann die Anwendung von CRISPR-Genome Editing das Repertoire an In-vivo- Modellen für die NSCLC-Forschung rasch erweitern. Darüber hinaus kann es die Notwendigkeit umfangreicher Züchtungen verringern. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - in vivo KW - Lung Cancer KW - CRISPR/Cas9 KW - in vivo genome editing KW - Immunohistochemistry KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom KW - NSCLC KW - Mouse Model KW - CRISPR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363401 ER - TY - THES A1 - Heimberger, Kevin T1 - Regulation pathways of c-MYC under glutamine-starving conditions in colon carcinoma cells T1 - Regulierungsmechanismen von c-MYC in Darmkrebszellen unter Glutaminmangelbedingungen N2 - Colon carcinomas (CRC) are statistically among the most fatal cancer types and hence one of the top reasons for premature mortality in the developed world. CRC cells are characterized by high proliferation rates caused by deregulation of gene transcription of proto-oncogenes and general chromosomal instability. On macroscopic level, CRC cells show a strongly altered nutrient and energy metabolism. This work presents research to understand general links between the metabolism and transcription alteration. Mainly focussing on glutamine dependency, shown in colon carcinoma cells and expression pathways of the pro-proliferation protein c-MYC. Previous studies showed that a depletion of glutamine in the cultivation medium of colon carcinoma cell lines caused a proliferation arrest and a strong decrease of overall c-MYC levels. Re-addition of glutamine quickly replenished c-MYC levels through an unknown mechanism. Several proteins altering this regulation mechanism were identified and proposed as possible starting point for further in detail studies to unveil the precise biochemical pathway controlling c-MYC translation repression and reactivation in a rapid manner. On a transcriptional level the formation of RNA:DNA hybrids, so called R-loops, was observed under glutamine depleted conditions. The introduction and overexpression of RNaseH1, a R-loop degrading enzyme, in combination with an ectopically expressed c-MYC variant, independent of cellular regulation mechanisms by deleting the regulatory 3’-UTR of the c-MYC gene, lead to a high rate of apoptotic cells in culture. Expression of a functionally inactive variant of RNaseH1 abolished this effect. This indicates a regulatory function of R-loops formed during glutamine starvation in the presence of c-MYC protein in a cell. Degradation of R-loops and high c-MYC levels in this stress condition had no imminent effect on the cell cycle progression is CRC cells but disturbed the nucleotide metabolism. Nucleotide triphosphates were strongly reduced in comparison to starving cells without R-loop degradation and proliferating cells. This study proposes a model of a terminal cycle of transcription termination, unregulated initiation and elongation of transcription leading to a depletion of energy resources of cells. This could finally lead to high apoptosis of the cells. Sequencing experiments to determine a coinciding of termination sites and R-loop formation sides failed so far but show a starting point for further studies in this essential survival mechanism involving R-loop formation and c-MYC downregulation. N2 - Darmkrebs gehört statistisch zu den Krebsarten mit den höchsten Sterblichkeitsraten und zählen somit zu den häufigsten Todesursachen der entwickelten Länder. Darmkrebszellen zeichnen sich durch chromosomale Instabilität und hohe Proliferationsraten aus, die durch eine Deregulierung der Expression verschiedener Proto-Onkogene zustande kommen. Generell besitzen diese Krebszellen einen stark veränderten Nährstoff- und Energiestoffwechsel im Vergleich zu gesunden somatischen Zellen. Diese Arbeit strebt ein besseres Verständnis der Verbindung zwischen dem Metabolismus und der Gen-Expression an. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf dem Mechanismus der Expression des proliferationsfördernden Proteins c-MYC und der Abhängigkeit von Glutamin, die Darmkrebszellen charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass der Entzug von Glutamin aus dem Kulturmedium von Darmkrebszelllinien eine Arretierung des Zellzyklus bewirkt sowie die Konzentration des Proteins c-MYC reduziert. Erneute Zugabe von Glutamin zum Medium stellt die MYC-Konzentration schnell wieder her. Die Hintergründe dieses Mechanismus sind bislang aber kaum verstanden. Einige Proteine wurden hier als potenzielle Kandidaten identifiziert, die einen Einfluss auf den biochemischen Prozess haben könnten, der die schnelle Wiederaufnahme der c-MYC Translation gewährleistet. Auf Translationsebene wurden RNA:DNA-Hybriden, sogenannte R-loops, gefunden, die sich unter anderem unter Glutamin-Mangelbedingungen im Genom bilden können. Ein gezielter Abbau dieser R-loops mithilfe des Enzyms RNaseH1, in Kombination mit der ektopischen Expression einer c-MYC-Variante, die unempfindlich gegenüber der zelleigenen Regulationsmechanismen ist, führte zu einer erhöhten Anzahl an apoptotischen Zellen in Kultur. Exprimiert man eine funktionell inaktive Variante der RNaseH1, statt der funktionellen, so kann dieser Apoptose-fördernde Prozess nicht beobachtet werden. Dies bestärkt die Hypothese, dass die R-loops, die sich während eines Glutamin-Mangels und hoher c-MYC-Konzentration bilden, eine regulatorische Funktion innehaben. Als Ursache für die Apoptose konnte ein Effekt der veränderten Expression auf das Fortschreiten des Zellzyklus ausgeschlossen werden. Jedoch zeigte sich eine Veränderung im Nukleotid-Metabolismus. Betroffene Zellen zeigten deutlich reduzierte Nuklotidtriphosphat-Konzentrationen im Vergleich zu Zellen unter Glutaminmangelbedingungen ohne R-loop-Abbau. In dieser Arbeit wurde ein Modell entwickelt, das einen sich selbst negativ verstärkenden Zyklus vorschlägt, der die Zellen zur Apoptose führt. Transkriptionstermination und eine unkontrollierte Initiation der Transkription im Wechsel führt zu einem Verbrauch der lebensnotwendigen Energieressourcen der Zellen. Sequenzierungsexperimente zur Lokalisierung der R-loops und Terminationsstellen sind bislang fehlgeschlagen, bieten jedoch Ansätze für künftige Forschung. KW - Myc KW - cMYC regulation KW - Colorectal Cancer KW - Glutamine KW - Translation regulation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363316 ER - TY - THES A1 - Aroko, Erick Onyango T1 - Trans-regulation of \(Trypanosoma\) \(brucei\) variant surface glycoprotein (VSG) mRNA and structural analysis of a \(Trypanosoma\) \(vivax\) VSG using X-ray crystallography T1 - Trans-regulierung der mRNA des variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) von \(Trypanosoma\) \(brucei\) und strukturelle Analyse eines \(Trypanosoma\) \(vivax\) VSG mittels Kristallstrukturanalyse N2 - African trypanosomes are unicellular parasites that cause nagana and sleeping sickness in livestock and man, respectively. The major pathogens for the animal disease include Trypanosoma vivax, T. congolense, and T. brucei brucei, whereas T. b. gambiense and T. b. rhodesiense are responsible for human infections. Given that the bloodstream form (BSF) of African trypanosomes is exclusively extracellular, its cell surface forms a critical boundary with the host environment. The cell surface of the BSF African trypanosomes is covered by a dense coat of immunogenic variant surface glycoproteins (VSGs). This surface protein acts as an impenetrable shield that protects the cells from host immune factors and is also involved in antibody clearance and antigenic variation, which collectively ensure that the parasite stays ahead of the host immune system. Gene expression in T. brucei is markedly different from other eukaryotes: most genes are transcribed as long polycistronic units, processed by trans-splicing a 39-nucleotide mini exon at the 5′ and polyadenylation at the 3′ ends of individual genes to generate the mature mRNA. Therefore, gene expression in T. brucei is regulated post-transcriptionally, mainly by the action of RNA binding proteins (RBPs) and conserved elements in the 3′ untranslated regions (UTR) of transcripts. The expression of VSGs is highly regulated, and only a single VSG gene is expressed at a time from one of the ~15 subtelomeric domains termed bloodstream expression sites (BES). When cells are engineered to simultaneously express two VSGs, the total VSG mRNA do not exceed the wild type amounts. This suggests that a robust VSG mRNA balancing mechanism exists in T. brucei. The present study uses inducible and constitutive expression of ectopic VSG genes to show that the endogenous VSG mRNA is regulated only if the second VSG is properly targeted to the ER. Additionally, the endogenous VSG mRNA response is triggered when high amounts of the GFP reporter with a VSG 3′UTR is targeted to the ER. Further evidence that non-VSG ER import signals can efficiently target VSGs to the ER is presented. This study suggests that a robust trans-regulation of the VSG mRNA is elicited at the ER through a feedback loop to keep the VSG transcripts in check and avoid overshooting the secretory pathway capacity. Further, it was shown that induction of expression of the T. vivax VSG ILDat1.2 in T. brucei causes a dual cell cycle arrest, with concomitant upregulation of the protein associated with differentiation (PAD1) expression. It could be shown that T. vivax VSG ILDat1.2 can only be sufficiently expressed in T. brucei after replacing its native GPI signal peptide with that of a T. brucei VSG. Taken together, these data indicate that inefficient VSG GPI anchoring and expression of low levels of the VSG protein can trigger differentiation from slender BSF to stumpy forms. However, a second T. vivax VSG, ILDat2.1, is not expressed in T. brucei even after similar modifications to its GPI signals. An X-ray crystallography approach was utilized to solve the N-terminal domain (NTD) structure of VSG ILDat1.2. This is first structure of a non-T. brucei VSG, and the first of a surface protein of T. vivax to be solved. VSG ILDat1.2 NTD maintains the three-helical bundle scaffold conserved in T. brucei surface proteins. However, it is likely that there are variations in the architecture of the membrane proximal region of the ILDat1.2 NTD and its CTD from T. brucei VSGs. The tractable T. brucei system is presented as a model that can be used to study surface proteins of related trypanosome species, thus creating avenues for further characterization of trypanosome surface coats. N2 - Afrikanische Trypanosomen sind einzellige Parasiten, die Nagana in Nutzvieh und die Schlafkrankheit im Menschen verursachen. Zu den Hauptverursachern der Tierkrankheit gehören Trypanosoma vivax, T. congolense und T. brucei brucei, während T. b. gambiense und T. b. rhodesiense für Infektionen im Menschen verantwortlich sind. Da die Blutstromform (BSF) der afrikanischen Trypanosomen rein extrazellulär vorkommt, bildet die Zelloberfläche eine kritische Grenzregion mit der Wirtsumgebung. Die Zelloberoberfläche der BSF afrikanischer Trypanosomen ist mit einem dichten Mantel an immunogenen variablen Oberflächenglykoproteinen (variant surface glycoprotein, VSG) umgeben. Dieses Oberflächenprotein dient als Barriere zum Schutz gegen Faktoren des Wirtsimmunsystems und spielt ebenfalls eine Rolle in Antikörper-Clearance und antigener Variation, welche gemeinsam dafür sorgen, dass der Parasit dem Wirtsimmunsystem stets einen Schritt voraus bleibt. Die Genexpression von T. brucei weist dezidierte Unterschiede im Vergleich zu anderen Eukaryoten auf: Die meisten Gene werden als lange polyzystronische Einheiten transkribiert, die durch trans-Splicing eines Miniexons aus 39 Nukleotiden am 5′ und Polyadenylierung am 3′ Ende der individuellen Gene prozessiert wird. Daher wird die Genexpression in T. brucei posttranskriptionell reguliert, zumeist durch RNA Bindeproteine (RBPs) und konservierte Elemente in der 3′ untranslatierten Region (UTR). Die Expression der VSGs ist stark reguliert, so wird zu einer gegebenen Zeit stets nur ein VSG Gen aus einer von ~15 Subtelomerregionen, die Blutstrom Expressionsorte (bloodstream expression sites, BES) genannt werden, exprimiert. Zellen, die gentechnisch manipuliert wurden um zwei VSGs zu exprimieren, produzieren die gleiche Menge an VSG mRNA wie Wildtyp Zellen. Dies deutet auf die Existenz eines robusten Mechanismus zur Regulierung der Gesamt-VSG mRNA Menge in T. brucei hin. Diese Arbeit verwendet induzierbare sowie konstitutive Expression eines ektopischen VSG Gens um zu zeigen, dass die endogene VSG mRNA nur reguliert wird, wenn das zweite VSG zum ER gelangt. Außerdem wird die endogene VSG mRNA Antwort auch ausgelöst, wenn hohe Mengen eines GFP Reporters, der eine VSG 3′UTR enthält, zum ER geleitet wird. Weiterhin, wird gezeigt, dass ER Importsignale anderer Proteine VSGs effizient zum ER dirigieren können. Das Ergebnis dieser Studie deutet darauf hin, dass eine Rückkopplungsschleife am ER eine robuste trans-Regulation der VSG mRNA auslöst, die die VSG Transkripte limitiert und somit eine Überlastung des sekretorischen Wegs verhindert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es nach Induktion der Expression des T. vivax VSGs ILDat1.2 in T. brucei zu einem doppelten Zellzyklusarrest mit gleichzeitiger Hochregulation der Expression des protein associated with differentation (PAD1) kam und dass dieses T. vivax VSG nur nach Austausch des GPI Signalpeptids durch das eines T. brucei VSGs effizient exprimiert werden konnte. Zusammengenommen suggerieren diese Daten, dass eine ineffiziente GPI-Verankerung und wenig abundante Expression des VSGs die Differenzierung der sogenannten slender BSF zur sogenannten stumpy Form einleiten kann. Ein zweites T. vivax VSG, ILDat2.1, konnte hingegen auch nach Austausch des GPI Signals nicht in T. brucei exprimiert werden. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse wurde die Struktur der N-terminalen Domäne (NTD) des ILDat1.2 VSGs gelöst. Es handelt sich hierbei um die erste Proteinstruktur eines VSGs, welches nicht aus T. brucei stammt und die erste Struktur eines Oberflächenproteins von T. vivax. Das in T. brucei Oberflächenproteinen konservierte drei-Helix Grundgerüst ist auch in der NTD des ILDat1.2 VSGs enthalten. Die Architektur der Membranproximalen Gegend der IlDat1.2 NTD und CTD unterscheiden sich aber vermutlich von der der T. brucei VSGs. Das leicht handhabbare T. brucei System bietet somit ein geeignetes Modell um die Oberflächenproteine anderer afrikanischer Trypanosomen Spezies zu untersuchen und eröffnet neue Wege zur Charakterisierung ihrer Oberflächenmäntel. KW - Trypanosoma vivax KW - Trypanosoma brucei KW - Variant surface glycoprotein KW - messenger RNA KW - Regulation of expression KW - messenger RNA regulation KW - VSG structure Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-241773 ER -