TY - THES A1 - Aboagye, Benjamin T1 - Behavioral and physiologic consequences of inducible inactivation of the \(Tryptophan\) \(hydroxylase\) 2 gene in interaction with early-life adversity T1 - Verhaltens- und physiologische Konsequenzen einer induzierbaren Inaktivierung des \(Tryptophan\) \(hydroxylase\) 2-Gens Interaktion mit frühkindlichen Stresses N2 - Disruptions in brain serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) signaling pathways have been associated with etiology and pathogenesis of various neuropsychiatric disorders, but specific neural mechanisms of 5-HT function are yet to be fully elucidated. Tryptophan hydroxylase 2 (TPH2) is the rate-limiting enzyme for brain 5-HT synthesis. Therefore, in this study a tamoxifen (Tam)-inducible cre-mediated conditional gene (Tph2) knockout in adult mouse brain (Tph2icKO) has been established to decipher the specific role of brain 5-HT in the regulation of behavior in adulthood. Immunohistochemistry and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used first to test the efficacy of Tam-inducible inactivation of Tph2 and consequential reduction of 5-HT in adult mouse brain. Tam treatment resulted in ≥90% reduction in the number of 5-HT immuno-reactive cells in the anterior raphe nuclei. HPLC revealed a significant reduction in concentration of 5-HT and its metabolite 5-hydroxyindole acetic acid (5-HIAA) in selected brain regions of Tph2icKO, indicating the effectiveness of the protocol used. Second, standard behavioral tests were used to assess whether reduced brain 5-HT concentrations could alter anxiety-, fear- and depressive-like behavior in mice. No altered anxiety- and depressive-like behaviors were observed in Tph2icKO compared to control mice (Tph2CON) in all indices measured, but Tph2icKO mice exhibited intense and sustained freezing during context-dependent fear memory retrieval. Tph2icKO mice also exhibited locomotor hyperactivity in the aversive environments, such as the open field, and consumed more food and fluid than Tph2CON mice. Lastly, the combined effect of maternal separation (MS) stress and adult brain 5-HT depletion on behavior was assessed in male and female mice. Here, MS stress, 5-HT depletion and their interaction elicited anxiety-like behavior in a sex-dependent manner. MS reduced exploratory behavior in both male and female mice. Reduced 5-HT enhanced anxiety in female, but not in male mice. Furthermore, expression of genes related to the 5-HT system and emotionality (Tph2, Htr1a, Htr2a, Maoa and Avpr1a) was assessed by performing a quantitative real-time PCR. In Tph2icKO mice there was a reduction in expression of Tph2 in the raphe nuclei of both male and female mice. Interaction between MS stress and 5-HT deficiency was detected showing increased Htr2a and Maoa expression in raphe and hippocampus respectively of female mice. In male mice, MS stress and 5-HT depletion interaction effects reduced Avpr1a expression in raphe, while the expression of Htr1a, Htr2a and Maoa was differentially altered by 5-HT depletion and MS in various brain regions. N2 - Unterbrechungen der Serotonin-Stoffwechselwege (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) im Gehirn wurden mit der Ätiologie und der Pathogenese von verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert, wobei die neuronalen Mechanismen der 5-HT Funktionen noch vollständig entschlüsselt werden müssen. Die Tryptophan-Hydroxylase 2 (TPH2) ist das limitierende Enzym für die 5-HT Synthese im Gehirn, weshalb der durch Tamoxifen (Tam) induzierbare, cre-vermittelte Tph2 Gen-Knockout (Tph2icKO) im adulten Mausgehirn möglicherweise helfen könnte die spezifische Rolle von 5-HT im Gehirn in der Regulation von adultem Verhalten zu entschlüsseln. Zuerst wurden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Immunhistochemische Analysen durchgeführt um die Effizienz der Tam induzierten Inaktivierung des Tph2 und die daraus folgende Reduktion von 5-HT im Gehirn zu überprüfen. Die Behandlung mit Tam resultierte in einer ≥86% Reduktion der Anzahl von 5-HT immunoreaktiven Zellen in der anterioren Raphe im Gehirn. Die HPLC zeigte eine signifikante Reduktion der 5-HT Konzentration und dessen Stoffwechselprodukts 5-Hydroxyindolylessigsäure (5-HIAA) in ausgewählten Gehirn regionen von Tph2icKO, was auf die Effektivität des benutzten Protokolls hindeutet. Danach wurden standarisierte Verhaltens tests durchgeführt um festzustellen, ob eine reduzierte 5-HT Konzentrationen im Gehirn zu einer Veränderung in der Angstreaktion, Depression und im Furchtverhalten der Mäuse führt. Bei allen Tests konnte sowohl in den Tph2icKO-Mäusen als auch in den Kontrolltieren kein offensichtliches angstbezogenes und depressionsähnliches Verhalten festgestellt werden, wobei die Tph2icKO-Mäuse intensive und anhaltende Furcht im Kontext „dependent fear retrieval“ zeigten. Tph2icKO-Mäuse zeigten zudem lokomotorische Hyperaktivität und konsumierten mehr Futter und Flüssigkeit als die Kontrolltiere. Zuletzt wurde der kombinierte Effekt von Stress durch mütterliche Trennung (MS) und adulter 5-HT Reduktion im Gehirn auf das Verhalten von männlichen und weiblichen Mäusen untersucht. Wieder rief nicht der depressionsähnliche Phänotyp, sondernder Stress durch die mütterliche Trennung (MS) und 5-HT Verarmung und deren Interaktion ein angstähnliches Verhalten in Abhängigkeit vom Geschlecht hervor. Reduziertes 5-HT vergrößerte die Angst in weiblichen, aber nicht in männlichen Mäusen. Stress durch mütterliche Trennung (MS) reduzierte das explorative Verhalten sowohl in Männchen als auch in Weibchen. Die Expression von Genen, welche im Bezug zum 5-HT System stehen (Tph2, Htr1a, Htr2a, Maoa und Avpr1a) wurden mit Hilfe von quantitativer Real-Time PCR untersucht. Die Tam Behandlung reduzierte dasTph2 Level in der Raphe bei beiden Geschlechtern signifikant. In weiblichen Mäusen steigertedie Interaktion zwischen Stress durch mütterliche Trennung (MS) und 5-HT Verarmung das Htr2a und Maoa Expressions level in der Raphe und im Hippokampus. In männlichen Mäusen reduzierte die Interaktion von Stress durch mütterliche Trennung (MS) und 5-HT Reduktion die Avpr1a Expression in der Raphe. Die Expression von Htr1a, Htr2a und Maoa wurde in verschiedenen Gehirn regionen unterschiedlich von Tam und Mütterliche Trennung MS verändert. In der Amygdala wurde nur ein MS Effekt auf die Tph2 Expression in den Mäusen sichtbar. KW - Anxiety KW - Angst KW - Depression KW - Serotonin KW - Tamoxifen KW - Tryptophan hydroxylase Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173581 ER - TY - THES A1 - Wermser, Charlotte T1 - Morphology, regulation and interstrain interactions in a new macrocolony biofilm model of the human pathogen \(Staphylococcus\) \(aureus\) T1 - Morphologie, Regulation und stammübergreifende Wechselwirkungen in einem neuen Makrokolonie-Biofilmmodell des Humanpathogens \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - The role of multicellularity as the predominant microbial lifestyle has been affirmed by studies on the genetic regulation of biofilms and the conditions driving their formation. Biofilms are of prime importance for the pathology of chronic infections of the opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus. The recent development of a macrocolony biofilm model in S. aureus opened new opportunities to study evolution and physiological specialization in biofilm communities in this organism. In the macrocolony biofilm model, bacteria form complex aggregates with a sophisticated spatial organization on the micro- and macroscale. The central positive and negative regulators of this organization in S. aureus are the alternative sigma factor σB and the quorum sensing system Agr, respectively. Nevertheless, nothing is known on additional factors controlling the macrocolony morphogenesis. In this work, the genome of S. aureus was screened for novel factors that are required for the development of the macrocolony architecture. A central role for basic metabolic pathways was demonstrated in this context as the macrocolony architecture was strongly altered by the disruption of nucleotide and carbohydrate synthesis. Environmental signals further modulate macrocolony morphogenesis as illustrated by the role of an oxygen-sensitive gene regulator, which is required for the formation of complex surface structures. A further application of the macrocolony biofilm model was demonstrated in the study of interstrain interactions. The integrity of macrocolony communities was macroscopically visibly disturbed by competitive interactions between clinical isolates of S. aureus. The results of this work contribute to the characterization of the macrocolony biofilm model and improve our understanding of developmental processes relevant in staphylococcal infections. The identification of anti-biofilm effects exercised through competitive interactions could lead to the design of novel antimicrobial strategies targeting multicellular bacterial communities. N2 - Die Rolle von Multizellularität als der vorherrschende mikrobielle Lebensstil wurde durch Studien über die genetische Steuerung von Biofilmen und über Biofilmbildung-fördernde Bedingungen bestätigt. Biofilme sind wichtige Faktoren in der Pathogenese chronischer Infektionen durch das opportunistische Humanpathogen Staphylococcus aureus. Die kürzlich erfolgte Entwicklung eines Makrokolonie-Biofilmmodells für S. aureus eröffnet neue Möglichkeiten evolutionäre Entwicklungen und die physiologische Spezialisierung in bakteriellen Gemeinschaften zu untersuchen. Im Makrokolonie-Biofilmmodell bilden Bakterien komplexe Aggregate, die sich durch eine hochentwickelte räumliche Organisation auf mikroskopischer und makroskopischer Ebene auszeichnen. Die positiven und negativen Hauptregulatoren dieser Organisation sind der alternative Sigmafaktor σB sowie das Quorum sensing System Agr. Dennoch sind weitere Faktoren, die die Morphogenese der Makrokolonien steuern, unbekannt. In dieser Arbeit wurde das Genom von S. aureus im Hinblick auf neue Faktoren, die für die Entwicklung der Makrokoloniearchitektur nötig sind, analysiert. Dabei wurde belegt, dass zentrale Stoffwechselwege eine zentrale Rolle spielen. Störungen der Nukleotid- und Kohlenhydrat-Synthese hatten starke Auswirkungen auf die Makrokoloniearchitektur. Weiterhin wurde anhand eines Sauerstoff-sensitiven Genregulators, der für die Ausbildung von Oberflächenstrukturen nötig ist, demonstriert, wie die Morphogenese der Makrokolonien durch Umweltsignale moduliert wird. Das Makrokolonie-Biofilmmodell fand weitere Anwendung in der Untersuchung von stammübergreifenden Interaktionen. Die Integrität der Makrokolonie-Biofilme wurde durch die Wechselwirkungen in Konkurrenz stehender klinischer Isolate stark herabgesetzt. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zur Charakterisierung des Makrokolonie-Biofilmmodells bei und geben Einsicht in Entwicklungsprozesse, die während Staphylokokken-Infektionen ablaufen. Die Beschreibung der negativen Beeinflussung der Biofilme durch bakterielle Wechselwirkungen könnte zur Entwicklung neuer antimikrobieller Strategien, die gezielt gegen multizelluläre bakterielle Gemeinschaften wirksam sind, beitragen. KW - Staphylococcus aureus KW - Biofilm KW - MRSA KW - macrocolony KW - interactions KW - biofilm architecture KW - Makrokolonie KW - Wechselwirkungen KW - Biofilmarchitektur Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165931 ER - TY - THES A1 - Flechsenhar, Aleya Felicia T1 - The Ubiquity of Social Attention – a Detailed Investigation of the Underlying Mechanisms T1 - Die Allgegenwärtigkeit Sozialer Aufmerksamkeit – eine Detaillierte Erforschung Zugrundeliegender Mechanismen N2 - This dissertation highlights various aspects of basic social attention by choosing versatile approaches to disentangle the precise mechanisms underlying the preference to focus on other human beings. The progressive examination of different social processes contrasted with aspects of previously adopted principles of general attention. Recent research investigating eye movements during free exploration revealed a clear and robust social bias, especially for the faces of depicted human beings in a naturalistic scene. However, free viewing implies a combination of mechanisms, namely automatic attention (bottom-up), goal-driven allocation (top-down), or contextual cues and inquires consideration of overt (open exploration using the eyes) as well as covert orienting (peripheral attention without eye movement). Within the scope of this dissertation, all of these aspects have been disentangled in three studies to provide a thorough investigation of different influences on social attention mechanisms. In the first study (section 2.1), we implemented top-down manipulations targeting non-social features in a social scene to test competing resources. Interestingly, attention towards social aspects prevailed, even though this was detrimental to completing the requirements. Furthermore, the tendency of this bias was evident for overall fixation patterns, as well as fixations occurring directly after stimulus onset, suggesting sustained as well as early preferential processing of social features. Although the introduction of tasks generally changes gaze patterns, our results imply only subtle variance when stimuli are social. Concluding, this experiment indicates that attention towards social aspects remains preferential even in light of top-down demands. The second study (section 2.2) comprised of two separate experiments, one in which we investigated reflexive covert attention and another in which we tested reflexive as well as sustained overt attention for images in which a human being was unilaterally located on either the left or right half of the scene. The first experiment consisted of a modified dot-probe paradigm, in which peripheral probes were presented either congruently on the side of the social aspect, or incongruently on the non-social side. This was based on the assumption that social features would act similar to cues in traditional spatial cueing paradigms, thereby facilitating reaction times for probes presented on the social half as opposed to the non-social half. Indeed, results reflected such congruency effect. The second experiment investigated these reflexive mechanisms by monitoring eye movements and specifying the location of saccades and fixations for short as well as long presentation times. Again, we found the majority of initial saccades to be congruently directed to the social side of the stimulus. Furthermore, we replicated findings for sustained attention processes with highest fixation densities for the head region of the displayed human being. The third study (section 2.3), tackled the other mechanism proposed in the attention dichotomy, the bottom-up influence. Specifically, we reduced the available contextual information of a scene by using a gaze-contingent display, in which only the currently fixated regions would be visible to the viewer, while the remaining image would remain masked. Thereby, participants had to voluntarily change their gaze in order to explore the stimulus. First, results revealed a replication of a social bias in free-viewing displays. Second, the preference to select social features was also evident in gaze-contingent displays. Third, we find higher recurrent gaze patterns for social images compared to non-social ones for both viewing modalities. Taken together, these findings imply a top-down driven preference for social features largely independent of contextual information. Importantly, for all experiments, we took saliency predictions of different computational algorithms into consideration to ensure that the observed social bias was not a result of high physical saliency within these areas. For our second experiment, we even reduced the stimulus set to those images, which yielded lower mean and peak saliency for the side of the stimulus containing the social information, while considering algorithms based on low-level features, as well as pre-trained high-level features incorporated in deep learning algorithms. Our experiments offer new insights into single attentional mechanisms with regard to static social naturalistic scenes and enable a further understanding of basic social processing, contrasting from that of non-social attention. The replicability and consistency of our findings across experiments speaks for a robust effect, attributing social attention an exceptional role within the general attention construct, not only behaviorally, but potentially also on a neuronal level and further allowing implications for clinical populations with impaired social functioning. N2 - Diese Dissertation beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten grundlegender sozialer Aufmerksamkeitsprozesse. Insbesondere werden durch vielseitige Herangehensweisen einzelne Mechanismen untersucht, die der bevorzugten Betrachtung von Menschen zugrunde liegen. Die progressive Untersuchung unterschiedlicher sozialer Vorgänge widerspricht einiger zuvor angenommener Grundlagen allgemeiner Aufmerksamkeitsprozesse. So zeigen beispielsweise Probanden bei freier Betrachtung naturalistischer Bilder eine klare Präferenz für abgebildete Menschen, v.a. deren Gesichter. Allerdings beinhaltet die freie Betrachtung eine Kombination aus mehreren Vorgängen, wie automatische (engl. bottom-up) und zielorientierte, willentliche Aufmerksamkeitslenkung (engl. top-down), als auch den Einfluss von Kontextzusammenhängen. Dies bedingt weiter die Berücksichtigung offener (engl. overt; Exploration mittels Augenbewegungen), als auch verdeckter Aufmerksamkeit (engl. covert; periphere Erkundung ohne Augenbewegungen). Im Rahmen der Dissertation werden alle genannten Aspekte anhand von drei Studien behandelt, wodurch eine sorgfältige Untersuchung verschiedener Einflüsse sozialer Aufmerksamkeitsprozesse erfolgt. In der ersten Studie (Abschnitt 2.1) wurden zielgerichtete Manipulationen in Form von Aufgabenstellungen vorgenommen, welche die Aufmerksamkeit innerhalb einer sozialen Szene spezifisch auf nicht-soziale Reize lenken sollten, um kompetitive Ressourcen von sozialer und zielgerichteter Aufmerksamkeit zu untersuchen. Interessanterweise überwog die Tendenz, soziale Aspekte zu betrachten, obwohl dies nachteilig für das Lösen der Aufgaben war. Diese Neigung erwies sich für die allgemeine Fixationsverteilung als auch für Fixationen, die unmittelbar nach Erscheinen der Stimuli auftraten. Dieser Befund impliziert, dass soziale Reize sowohl bei dauerhaften als auch frühen Aufmerksamkeitsprozessen bevorzugt werden. Obwohl es einen allgemeinen Konsens gibt, dass eine Implementierung von Aufgaben zu verändertem Blickverhalten führt, deuten unsere Ergebnisse lediglich auf subtile Abweichungen hin, wenn die Stimuli sozialer Natur sind. Abschließend indiziert dieses Experiment, dass auch mit steigender Bedeutung anderer top-down Modulationen bevorzugt soziale Aspekte betrachtet werden. Die zweite Studie (Abschnitt 2.2) bestand aus zwei separaten Experimenten, welche verdeckte und offene Aufmerksamkeit auf soziale Reize untersuchten. Hierfür wurden in beiden Studien dieselben Bilder verwendet, in denen ein Mensch unilateral, entweder auf der rechten oder linken Hälfte abgebildet war. Das erste Experiment bestand aus einer modifizierten Variante des Dot-Probe Paradigmas, bei dem periphere Zielreize entweder kongruent auf der Seite des sozialen Stimulus erschienen, oder inkongruent auf der nicht sozialen Seite präsentiert wurden. Diese Zuteilung basierte auf der Annahme, dass soziale Merkmale auf ähnliche Weise fungieren wie Hinweisreize in traditionellen Spatial-Cueing-Paradigmen, indem sie Reaktionszeiten auf Zielobjekte, die auf der sozialen Seite präsentiert werden, beschleunigen. Tatsächlich wiesen unsere Ergebnisse einen solchen Kongruenzeffekt auf. Das zweite Experiment überprüfte die reflexiven Vorgänge durch die Messung von Augenbewegungen mittels Spezifizierung der Sakkadenrichtung und Fixationsdichte für kurze als auch lange Präsentationszeiten. Wiederum stellte sich heraus, dass die Mehrzahl der initialen Sakkaden kongruent zum sozialen Reiz gerichtet waren. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse für kontinuierliche Aufmerksamkeitsprozesse durch eine erhöhte Fixationsdichte auf Kopfregionen der abgebildeten Menschen repliziert. Die dritte Studie (Abschnitt 2.3) behandelte den umgekehrten Mechanismus der Aufmerksamkeitsdichotomie, nämlich den bottom-up Einfluss. Durch die Verwendung eines blickkongruenten Paradigmas, konnte der kontextuelle Informationsgehalt der Szenen so reduziert werden, dass nur noch der aktuell betrachtete Bereich sichtbar war, während der Rest des Bildes maskiert blieb. Somit mussten die Teilnehmer willentlich ihren Blick verändern, um die Szene zu erkunden. Erstens zeigten die Ergebnisse eine Replikation des sozialen Bias bei freier Betrachtung. Zweitens scheint die Präferenz, soziale Aspekte zu selektieren, in der blickkongruenten Darstellung bestehen zu bleiben. Drittens zeigte sich ein erhöhtes wiederkehrendes Blickmuster bei sozialen im Vergleich zu nicht sozialen Bildern für beide Betrachtungsmodalitäten. Zusammenfassend implizieren diese Ergebnisse eine zielgerichtete Präferenz für soziale Reize, welche größtenteils kontextunabhängig ist. Hervorzuheben ist auch, dass bei allen Experimenten Salienzprädiktoren verschiedener Algorithmen in Betracht gezogen wurden, um sicher zu stellen, dass die Tendenz soziale Reize zu bevorzugen nicht alleine durch hohe physikalische Salienz in diesen Bereichen bedingt wurde. Insbesondere für die zweite Studie (Abschnitt 2.2) wurden Algorithmen verwendet, die sowohl untergeordnete Merkmale als Prädiktoren integrierten als auch Deep Learning Algorithmen, welche vortrainierte, übergeordnete Merkmale definieren, um Vorhersagen zu treffen. So wurde das verwendete Stimulusmaterial reduziert, so dass nur Bilder mit niedriger mittlerer als auch maximaler Salienz auf der nicht-sozialen Seite analysiert wurden. Diese Experimente geben Aufschluss auf einzelne Aufmerksamkeitsprozesse bei der Betrachtung von statischen, sozialen, naturalistischen Szenen und ermöglichen ein tiefergehendes Verständnis für grundlegende soziale Verarbeitung, welche sich von nicht-sozialer Aufmerksamkeit abhebt. Die Replizierbarkeit und Konsistenz der Experimente implizieren einen robusten Effekt und suggerieren eine gesonderte Rolle der sozialen Aufmerksamkeit innerhalb des allgemeinen Aufmerksamkeitskonstrukts. Dies basiert nicht nur auf Verhaltensparametern, sondern potentiell auch auf neuronaler Ebene und enthält darüber hinaus auch Implikationen für klinische Populationen mit beeinträchtigten sozialen Funktionen. KW - Aufmerksamkeit KW - Soziale Wahrnehmung KW - Mechanisms of Social Attention Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184528 ER - TY - THES A1 - Potabattula, Ramya Sri Krishna T1 - Male aging and obesity effects on sperm methylome and consequences for the next generation T1 - Alters- und Adipositas-Effekte auf das Spermien-Methylom und die Konsequenzen für die nächste Generation N2 - Besides a growing tendency for delayed parenthood, sedentary lifestyle coupled with overnutrition has dramatically increased worldwide over the last few decades. Epigenetic mechanisms can help us understand the epidemics and heritability of complex traits like obesity to a significant extent. Majority of the research till now has focused on determining the impact of maternal factors on health and disease risk in the offspring(s). This doctoral thesis is focused on deciphering the potential effects of male aging and obesity on sperm methylome, and consequences/transmission via germline to the next generation. In humans, this was assessed in a unique cohort of ~300 sperm samples, collected after in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection, as well as in conceived fetal cord blood samples of the children. Furthermore, aging effect on sperm samples derived from a bovine cohort was analyzed. The study identified that human male aging significantly increased the DNA methylation levels of the promoter, the upstream core element, the 18S, and the 28S regions of ribosomal DNA (rDNA) in sperm. Prediction models were developed to anticipate an individual’s age based on the methylation status of rDNA regions in his sperm. Hypermethylation of alpha satellite and LINE1 repeats in human sperm was also observed with aging. Epimutations, which are aberrantly methylated CpG sites, were significantly higher in sperm of older males compared to the younger ones. These effects on the male germline had a negative impact on embryo quality of the next generation. Consistent with these results, DNA methylation of rDNA regions, bovine alpha satellite, and testis satellite repeats displayed a significant positive correlation with aging sperm samples within the same individual and across different age-grouped bulls. A positive association between human male obesity/body mass index (BMI) and DNA methylation of the imprinted MEG3 gene and the obesity-related HIF3A gene was detected in sperm. These BMI-induced sperm DNA methylation signatures were transmitted to next generation fetal cord blood (FCB) samples in a gender-specific manner. Males, but not female offsprings exhibited a significant positive correlation between father’s BMI and FCB DNA methylation in the two above-mentioned amplicons. Additionally, hypomethylation of IGF2 with increased paternal BMI was observed in female FCB samples. Parental allele-specific in-depth methylation analysis of imprinted genes using next generation sequencing technology also revealed significant correlations between paternal factors like age and BMI, and the corresponding father’s allele DNA methylation in FCB samples. Deep bisulphite sequencing of imprinted genes in diploid somatic cord blood cells of offspring detected that the levels of DNA methylation signatures largely depended on the underlying genetic variant, i.e. sequence haplotypes. Allele-specific epimutations were observed in PEG1, PEG5, MEG3, H19, and IGF2 amplicons. For the former three genes, the non-imprinted unmethylated allele displayed more epimutations than the imprinted methylated allele. On the other hand, for the latter two genes, the imprinted allele exhibited higher epimutation rate than that of the non-imprinted allele. In summary, the present study proved that male aging and obesity impacts the DNA methylome of repetitive elements and imprinted genes respectively in sperm, and also has considerable consequences on the next generation. Nevertheless, longitudinal follow-up studies are highly encouraged to elucidate if these effects can influence the risk of developing abnormal phenotype in the offspring during adulthood. N2 - Weltweit kann ein Trend zur späteren Elternschaft sowie die dramatische Zunahme eines bewegungsarmen Lebensstils in Kombination mit einer Überernährung beobachtet werden. Die Verbreitung sowie die Vererbung derartig komplexer Merkmale oder Erkrankungen lassen sich oftmals unter Berücksichtigung epigenetischer Mechanismen besser verstehen. Vorangegangene Studien untersuchten hierbei jedoch primär den Einfluss maternaler Faktoren auf die Gesundheit und das Krankheitsrisiko der nächsten Generation. Diese Doktorarbeit hat das Ziel potentielle Altersinduzierte sowie Adipositas-bedingte Effekte auf das Methylom von Spermien sowie die damit einhergehenden Konsequenzen für die nächste Generation zu identifizieren. Hierfür stand eine humane Kohorte bestehend aus ~300 Spermienproben, welche nach einer in vitro Fertilisation bzw. Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion gesammelt wurden, und das entsprechende Nabelschnurblut der mit Hilfe dieser Behandlungen gezeugten Kinder zur Verfügung. Ergänzend dazu wurde der Alterseffekt in bovinen Spermienproben analysiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine signifikante Korrelation des männlichen Alterungsprozesses mit einer erhöhten DNA-Methylierung der ribosomalen DNA (rDNA) in der Promotorregion, dem strangaufwärts gelegenen Promotorelement (Upstream Core Element), der 18S- sowie der 28S-Region von Keimzellen aufgezeigt werden. Hierauf basierend wurde ein Vorhersageprogramm entwickelt, welches es ermöglicht anhand des Methylierungslevels der rDNA in den Spermien das Alter des entsprechenden Mannes zu berechnen. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass mit dem Alterungsprozess in Spermien eine Hypermethylierung der Long Interspersed Nuclear Elements (LINE-1) und der Alpha-Satelliten-DNA einhergeht. Des Weiteren zeigte der Vergleich von Spermien alter und junger Männer auf, dass Epimutationen, welche als fehlerhaft methylierte CpG-Stellen definiert werden, signifikant häufiger in Spermien alter Männer detektierbar sind. Allgemein zeigte sich zudem, dass diese altersabhängigen Effekte auf die Keimzellen sich negativ auf die Qualität der Embryonen auswirken. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen konnte auch in Spermien von Rindern dieser Alterseffekt nachgewiesen werden. Es zeigte sich mit zunehmendem Alter eine signifikant erhöhte Methylierung der rDNA-Regionen und der Alpha-/ Testis-Satelliten-DNAs sowohl innerhalb eines Individuums, als auch zwischen verschiedenen altersgruppierten Individuen. Weiterhin konnte eine positive Korrelation des Body-Mass-Index (engl. body mass index; kurz: BMI) eines Mannes und der Methylierung in MEG3 und HIF3A in dessen Spermien detektiert werden. Anhand der untersuchten Nabelschnurblute konnte aufgezeigt werden, dass diese BMI-induzierten Methylierungsveränderungen in einem geschlechter-spezifischen Kontext an die nächste Generation weitergegeben werden. So war ausschließlich bei männlichen Nachkommen eine signifikant positive Assoziation des väterlichen BMIs und der DNA-Methylierung dieser beiden Gene im Nabelschnurblut nachweisbar. Eine mit dem väterlichen BMI einhergehende Hypomethylierung des Gens IGF2 war hingegen ausschließlich in den Nabelschnurblut-Proben weiblicher Nachkommen messbar. Die Auftrennung der Allele nach ihrer parentalen Herkunft, zeigte eine signifikante Korrelation zwischen den paternalen Faktoren, wie Alter und BMI, und dem Methylierungslevel des korrespondierenden paternalen Allels im Nabelschnurblut. Mit Hilfe der Deep Bisulfite Sequenzierung diploider Zellen aus dem Nabelschnurblut der Nachkommen wurde die DNA-Methylierung geprägte Gene untersucht. Hierbei konnte aufgezeigt werden, dass das Methylierungslevel stark von der zu Grunde liegenden genetischen Variante (Haplotyp) abhängt. Allel-spezifische Epimutationen wurden in den untersuchten Amplikons der Gene PEG1, PEG5, MEG3, H19 und IGF2 nachgewiesen. Bei PEG1, PEG5 und MEG3 waren mehr Epimutationen der nicht-geprägten unmethylierten Allele, als der geprägten methylierten Allele detektierbar. Konträr hierzu war bei den Genen H19 und IGF2 eine erhöhte Epimutationsrate der geprägten und somit methylierten Allele nachweisbar. Diese Doktorarbeit offenbart altersinduzierte sowie Adipositas-bedingte Einflüsse auf die DNA-Methylierung repetitiver Elemente und geprägter Gene in männlichen Keimzellen, sowie damit einhergehende potentielle Konsequenzen für die nächste Generation. Um schlussendlich jedoch eine Aussage treffen zu können, ob aufgrund dieser Effekte eine erhöhte Prädisposition der nächsten Generation zur Entwicklung anormaler Phänotypen besteht, müssen longitudinale Folgestudien durchgeführt werden. KW - Paternal age and BMI effects Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165481 ER - TY - THES A1 - Baig, Ayesha Anjum T1 - Studies on platelet interactions with the coagulation system and on modulators of platelet (hem)ITAM signaling in genetically modified mice T1 - Studien zur Thrombozyteninteraktion mit der Gerinnungskaskade und Modulation des (hem)ITAM Signalwegs in genetisch veränderaten Mäusen N2 - Activated platelets and coagulation jointly contribute to physiological hemostasis. However, pathological conditions can also trigger unwanted platelet activation and initiation of coagulation resulting in thrombosis and precipitation of ischemic damage of vital organs such as the heart or brain. The specific contribution of procoagulant platelets, positioned at the interface of the processes of platelet activation and coagulation, in ischemic stroke had remained uninvestigated. The first section of the thesis addresses this aspect through experiments conducted in novel megakaryocyte- and platelet-specific TMEM16F conditional KO mice (cKO). cKO platelets phenocopied defects in platelets from Scott Syndrome patients and had severely impaired procoagulant characteristics. This led to decelerated platelet-driven thrombin generation and delayed fibrin formation. cKO mice displayed prolonged bleeding times and impaired arterial thrombosis. However, infarct volumes in cKO mice were comparable to wildtype (WT) mice in an experimental model of ischemic stroke. Therefore, while TMEM16F-regulated platelet procoagulant activity is critical for hemostasis and thrombosis, it is dispensable for cerebral thrombo-inflammation in mice. The second section describes the generation and initial characterization of a novel knockin mouse strain that expresses human coagulation factor XII (FXII) instead of endogenous murine FXII. These knockin mice had normal occlusion times in an experimental model of arterial thrombosis demonstrating that human FXII is functional in mice. Therefore, these mice constitute a valuable tool for testing novel pharmacological agents against human FXII – an attractive potential target for antithrombotic therapy. Glycoprotein (GP)VI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2)-mediated (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) signaling represent a major pathway for platelet activation. The last section of the thesis provides experimental evidence for redundant functions between the two members of the Grb2 family of adapter proteins - Grb2 and Gads that lie downstream of GPVI and CLEC-2 stimulation. In vitro and in vivo studies in mice deficient in both Grb2 and Gads (DKO) revealed that DKO platelets had defects in (hem)ITAM-stimulation-specific activation, aggregation and signal transduction that were more severe than the defects observed in single Grb2 KO or Gads KO mice. Furthermore, the specific role of these adapters downstream of (hem)ITAM signaling was essential for maintenance of hemostasis but dispensable for the known CLEC-2 dependent regulation of blood-lymphatic vessel separation. N2 - Aktivierte Thrombozyten und die Gerinnungskaskade bilden gemeinsam die Grundlage der physiologischen Hämostase. Daneben können jedoch auch pathologische Bedingungen Thrombozytenaktivierung herbeiführen und die Gerinnungskaskade auslösen und somit zum Gefäßverschluss führen, was häufig ischämische Schäden lebenswichtiger Organe wie beispielsweise des Herzens oder des Gehirns verursachen kann. Prokoagulante Thrombozy-ten befinden sich an der Schnittstelle zwischen Thrombozytenaktivierung und der Gerin-nungskaskade, ihre Funktion bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls wurde jedoch bisher nicht im Detail untersucht. Der erste Teil dieser Doktorarbeit widmet sich dieser Fragestellung durch die Analyse von neu generierten konditionalen, Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Tmem16f Knockout Mäusen. TMEM16F-defiziente Thrombozy-ten wiesen ähnliche Defekte wie die Thrombozyten von Scott-Syndrom-Patienten sowie stark beeinträchtigte prokoagulante Eigenschaften auf. Diese Defekte gingen mit signifikant verlangsamter thrombozytenabhängiger Thrombingenerierung und verzögerter Fibrinbildung einher. TMEM16F-Defizienz führte zu verlängerter Blutungszeit und beeinträchtigte in einem experimentellen Modell die Bildung arterieller Thromben. TMEM16F-defiziente Mäuse wiesen jedoch im Vergleich zu wildtypischen Mäusen keinerlei Unterschiede im experimentellen ischämischen Schlaganfall auf. TMEM16F-gesteuerte prokoagulante Thrombozytenfunktion ist demnach kritisch für Hämostase und Thrombose, während sie eine untergeordnete Rolle in zerebraler Thrombo-Inflammation spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Generierung und Erstbeschreibung einer neuen Mauslinie, welche den humanen Hageman-Faktor (FXII) anstelle des endogenen murinen FXII exprimiert. In den resultierenden Knock-in Mäusen war die Bildung okklusiver arterieller Thromben nach chemisch induzierter Gefäßverletzung nicht beeinträchtigt, was zeigt, dass der humane FXII im Maussystem voll funktionstüchtig ist. Somit können diese Mäuse in der Zukunft als ein wertvolles Werkzeug zum Testen neuer pharmakologischer Ansätze zur Herabsetzung der FXII-Aktivität eingesetzt werden, welche einen vielver-sprechenden Targets neuartiger antithrombotischer Behandlungsansätze darstellt. Die thrombozytären Rezeptoren Glykoprotein (GP)VI und C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) lösen (hem)immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelte Signalwege aus, welche eine eine Schlüsselrolle in der Thrombozytenaktivierung spielen. Der dritte Teil dieser Doktorarbeit liefert experimentelle Hinweise für überlappende Funkti-onen der Adapterproteine Grb2 und Gads in der (hem)ITAM-anhängigen Signalkaskade. In vitro und in vivo Studien zeigten, dass Grb2/Gads-doppeldefiziente Thrombozyten (hem)ITAM-spezifische Defekte in der Aktivierung, Aggregation und Signaltransduktion aufweisen, die im Vergleich zu einzeldefizienten Thrombozyten deutlich ausgeprägter sind und somit eine redundante Rolle der Adapterproteine offenbaren. Während Grb2 und Gads gemeinsam an der Aufrechterhaltung physiologischer Hämostase beteiligt sind, tragen sie nicht entscheidend zur bekannten CLEC-2-abhängigen Regulation der Trennung von Blut- und Lymphgefäßen bei. KW - Blutgerinnung KW - Thrombozyt KW - Signaltransduktion KW - Maus KW - Thrombosis KW - Thrombo-inflammation KW - TMEM16F KW - (hem)ITAM signaling Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164888 ER - TY - THES A1 - Sauer, Markus T1 - DHX36 function in RNA G-quadruplex-mediated posttranscriptional gene regulation T1 - Funktion von DHX36 in RNA G-Quadruplex-vermittelter posttranskriptioneller Genregulierung N2 - The expression of genetic information into proteins is a key aspect of life. The efficient and exact regulation of this process is essential for the cell to produce the correct amounts of these effector molecules to a given situation. For this purpose, eukaryotic cells have developed many different levels of transcriptional and posttranscriptional gene regulation. These mechanisms themselves heavily rely on interactions of proteins with associated nucleic acids. In the case of posttranscriptional gene regulation an orchestrated interplay between RNA-binding proteins, messenger RNAs (mRNA), and non-coding RNAs is compulsory to achieve this important function. A pivotal factor hereby are RNA secondary structures. One of the most stable and diverse representatives is the G-quadruplex structure (G4) implicated in many cellular mechanisms, such as mRNA processing and translation. In protein biosynthesis, G4s often act as obstacles but can also assist in this process. However, their presence has to be tightly regulated, a task which is often fulfilled by helicases. One of the best characterized G4-resolving factors is the DEAH-box protein DHX36. The in vitro function of this helicase is extensively described and individual reports aimed to address diverse cellular functions as well. Nevertheless, a comprehensive and systems-wide study on the function of this specific helicase was missing, so far. The here-presented doctoral thesis provides a detailed view on the global cellular function of DHX36. The binding sites of this helicase were defined in a transcriptome-wide manner, a consensus binding motif was deviated, and RNA targets as well as the effect this helicase exerts on them were examined. In human embryonic kidney cells, DHX36 is a mainly cytoplasmic protein preferentially binding to G-rich and G4-forming sequence motifs on more than 4,500 mRNAs. Loss of DHX36 leads to increased target mRNA levels whereas ribosome occupancy on and protein output of these transcripts are reduced. Furthermore, DHX36 knockout leads to higher RNA G4 levels and concomitant stress reactions in the cell. I hypothesize that, upon loss of this helicase, translationally-incompetent structured DHX36 target mRNAs, prone to localize in stress granules, accumulate in the cell. The cell reacts with basal stress to avoid cytotoxic effects produced by these mis-regulated and structured transcripts. N2 - Die Umsetzung genetischer Information in Proteine stellt einen Schlüsselaspekt des Lebens dar. Dabei ist die effiziente und exakte Regulierung dieses Prozesses für die Zelle essentiell, um die korrekte Menge dieser Effektormoleküle in einer gegebenen Situation zu produzieren. Zu diesem Zweck haben eukaryotische Zellen viele verschiedene Ebenen der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation entwickelt. Diese Mechanismen wiederum beruhen insbesondere auf den Interaktionen von Proteinen mit assoziierten Nukleinsäuren. Im Fall der posttranskriptionellen Genregulation ist ein abgestimmtes Wechselspiel zwischen RNA-bindenden Proteinen, Boten-RNAs und nicht-kodierenden RNAs zwingend erforderlich um diese wichtige Funktion zu erfüllen. Ein zentrales Element hierbei bilden RNA-Sekundärstrukturen. Einer der stabilsten und variantenreichsten Vertreter dieser Strukturen ist die G-Quadruplexstruktur (G4), die in vielen zellulären Mechanismen, wie zum Beispiel Prozessierung und Translation der Boten-RNA, involviert ist. Während der Proteinbiosynthese agieren G4s häufig als Hindernisse, können diesen Prozess allerdings auch unterstützen. In beiden Fällen muss deren Präsenz genau reguliert werden, was häufig durch Helikasen erfolgt. Einer der bestcharakterisiertesten, G4-entwindenden Faktoren ist das DEAH-Box Protein DHX36. Die in vitro Funktion dieser Helikase wurde bereits ausführlich beschrieben und einzelne Berichte haben darüber hinaus versucht, ihr verschiedene Funktionen in der Zelle zuzuweisen. Nichtsdestotrotz fehlt bislang eine umfassende und systemweite Studie zur Funktion dieser speziellen Helikase. Die hier präsentierte Doktorarbeit liefert einen detaillierten Blick auf die globale Funktion von DHX36 in der Zelle. Bindestellen dieser Helikase im Transkriptom wurden definiert, ein allgemeines Bindemotiv abgeleitet und RNA-Bindeziele sowie der Effekt, den diese Helikase auf jene ausübt, untersucht. In humanen embryonalen Nierenzellen ist DHX36 ein vorwiegend zytoplasmatisches Protein, das bevorzugt G-reiche und G4-bildende Sequenzmotive auf über 4.500 Boten-RNAs bindet. Verlust von DHX36 führt zu einem erhöhten Level dieser Boten-RNAs in der Zelle, wobei deren Besetzung mit Ribosomen und die damit verbundene Proteinproduktion reduziert ist. Weiterhin führt der Verlust von DHX36 zu einem höheren RNA G4 Level und zu gleichzeitigen Stressreaktionen in der Zelle. Meine Vermutung ist, dass sich bei einem Verlust von DHX36 translationsinkompetente, strukturierte und leicht akkumulierende Ziel-Boten-RNAs in der Zelle anreichern. Die Zelle reagiert darauf mit basalem Stress um zytotoxische Effekte dieser miss-regulierten und strukturierten Transkripte zu vermeiden. KW - RNS KW - Helicasen KW - Genexpression KW - RNA secondary structures KW - G-quadruplex KW - RNA protein interactions Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183954 ER - TY - THES A1 - Kremer, Antje T1 - Tissue Engineering of a Vascularized Meniscus Implant T1 - Tissue Engineering eines vaskularisierten Meniskus-Implantates N2 - The knee joint is a complex composite joint containing the C-shaped wedge-like menisci composed of fibrocartilage. Due to their complex composition and structure, they provide mechanical resilience to the knee joint protecting the articular cartilage. Because of the limited repair potential, meniscal injuries do not only affect the meniscus itself but also lead to altered joint homeostasis and inevitably to secondary osteoarthritis. The meniscus was characterized focusing on its anatomy, structure and meniscal markers such as aggrecan, collagen type I (Col I) and Col II. The components relevant for meniscus tissue engineering, namely cells, Col I scaffolds, biochemical and biomechanical stimuli were studied. Meniscal cells (MCs) were isolated from meniscus, mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow and dermal microvascular endothelial cells (d-mvECs) from foreskin biopsies. For the human (h) meniscus model, wedge-shape compression of a hMSC-laden Col I gel was successfully established. During three weeks of static culture, the biochemical stimulus transforming growth factor beta-3 (TGF beta-3) led to a compact collagen structure. On day 21, this meniscus model showed high metabolic activity and matrix remodeling as confirmed by matrix metalloproteinases detection. The fibrochondrogenic properties were illustrated by immunohistochemical detection of meniscal markers, significant GAG/DNA increase and increased compressive properties. For further improvement, biomechanical stimulation systems by compression and hydrostatic pressure were designed. As one vascularization approach, direct stimulation with ciclopirox olamine (CPX) significantly increased sprouting of hd-mvEC spheroids even in absence of auxiliary cells such as MSCs. Second, a cell sheet composed of hMSCs and hd-mvECs was fabricated by temperature triggered cell sheet engineering and transferred onto the wedge-shaped meniscus model. Third, a biological vascularized scaffold (BioVaSc-TERM) was re-endothelialized with hd-mvECs providing a viable vascularized network. The vascularized BioVaSc-TERM was suggested as wrapping scaffold of the meniscus model by using two suture techniques, the all-inside-repair (AIR) for the posterior horn, and the outside-in-refixation (OIR) for the anterior horn and the middle part. This meniscus model for replacing torn menisci is a promising approach to be further optimized regarding vascularization, biochemical and biomechanical stimuli. N2 - Das Knie ist ein komplex zusammengesetztes Gelenk mit zwei C-förmigen Keilen aus Bindegewebsknorpel, die Menisken. Sie sorgen für die mechanische Belastbarkeit des Knies, wodurch der Gelenksknorpel geschützt wird. Aufgrund des limitierten Heilungspotentials beeinträchtigen Meniskusverletzungen nicht nur den Meniskus selbst, sondern schädigen auch das Gelenksgleichgewicht und führen zu sekundärer Osteoarthritis. Der Meniskus wurde in seiner Anatomie, Struktur und Meniskusmarkern wie Aggrekan, Kollagen I und Kollagen II charakterisiert. Die Komponenten von Meniskus Tissue Engineering, Zellen, Kollagen I Materialien, biochemische und biomechanische Stimuli wurden untersucht. Meniskuszellen (MCs) wurden aus Meniskus isoliert, mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Knochenmark und dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (d-mvECs) aus Vorhautbiopsien. Für das humane (h) Meniskus-Modell wurde die keilförmige Kompression eines hMSC-beladenen Kollagen I Gels erfolgreich etabliert. Während drei Wochen statischer Kultur führte der biochemische Stimulus transformierender Wachs-tumsfaktor beta-3 (TGF beta-3) zu einer kompakten Kollagenstruktur. An Tag 21 zeigte dieses Meniskus-Modell eine hohe metabolische Aktivität und Matrixumbau durch die Detektion von Matrix-Metalloproteasen. Der Bindegewebsknorpel wurde durch immunhistochemische Detektion der Meniskusmarker, einem signifikanten GAG/DNA Anstieg und erhöhter Kompressionseigenschaften bestätigt. Für weitere Verbesserungen wurden biomechanische Stimulierungssysteme mittels Kompression und hydrostatischen Druck aufgebaut. Als Vaskularisierungsansatz führte die direkte Stimulierung mit Ciclopirox Olamine (CPX) sogar in Abwesenheit von Helferzellen wie MSCs zu einem erhöhten Sprouting der hd-mvEC Spheroide. Zweitens wurde ein hMSC/hd-mvEC Sheet mithilfe eines Temperatur-abhängigen Verfahrens produziert und auf das keilförmige Meniskus-Modell transferiert. Drittens wurde ein vaskularisiertes Biomaterial (BioVaSc-TERM) mit hd-mvECs besiedelt, wodurch ein vitales Gefäßystem bereitgestellt wurde. Die vaskularisierte BioVaSc-TERM wurde als Hülle des Meniskus-Modells unter der Verwendung von zwei Nahttechniken vorgeschlagen: die All-Inside-Repair (AIR) für das Hinterhorn und die Outside-In-Refixation (OIR) für das Vorderhorn und den mittleren Teil. Dieses Meniskus-Modell ist ein vielversprechender Ansatz für den Meniskusersatz, um in Vaskularisierung, biochemischer und biomechanischer Stimuli weiter optimiert zu werden. KW - Meniskus KW - Tissue Engineering KW - Regenerative Medizin KW - Meniskusimplantat KW - meniscus implant KW - Tissue Engineering KW - tissue engineering KW - vascularization KW - Vaskularisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184326 ER - TY - THES A1 - Reinhard, Julia T1 - Developmental Aspects of Fear Learning and Fear Generalization T1 - Entwicklungsaspekte des Furchterwerbs und der Furchtgenerealisierung N2 - In situations of real threat, showing a fear reaction makes sense, thus, increasing the chance to survive. The question is, how could anybody differentiate between a real and an apparent threat? Here, the slogan counts “better safe than sorry”, meaning that it is better to shy away once too often from nothing than once too little from a real threat. Furthermore, in a complex environment it is adaptive to generalize from one threatening situation or stimulus to another similar situation/stimulus. But, the danger hereby is to generalize in a maladaptive manner involving as it is to strong and/or fear too often “harmless” (safety) situations/stimuli, as it is known to be a criterion of anxiety disorders (AD). Fear conditioning and fear generalization paradigms are well suited to investigate fear learning processes. It is remarkable that despite increasing interest in this topic there is only little research on fear generalization. Especially, most research on human fear conditioning and its generalization has focused on adults, whereas only little is known about these processes in children, even though AD is typically developing during childhood. To address this knowledge gap, four experiments were conducted, in which a discriminative fear conditioning and generalization paradigm was used. In the first two experiments, developmental aspects of fear learning and generalization were of special interest. Therefore, in the first experiment 267 children and 285 adults were compared in the differential fear conditioning paradigm and generalization test. Skin conductance responses (SCRs) and ratings of valence and arousal were obtained to indicate fear learning. Both groups displayed robust and similar differential conditioning on subjective and physiological levels. However, children showed heightened fear generalization compared to adults as indexed by higher arousal ratings and SCRs to the generalization stimuli. Results indicate overgeneralization of conditioned fear as a developmental correlate of fear learning. The developmental change from a shallow to a steeper generalization gradient is likely related to the maturation of brain structures that modulate efficient discrimination between threatening and (ambiguous) safety cues. The question hereby is, at which developmental stage fear generalization gradients of children adapt to the gradients of adults. Following up on this question, in a second experiment, developmental changes in fear conditioning and fear generalization between children and adolescents were investigated. According to experiment 1 and previous studies in children, which showed changes in fear learning with increasing age, it was assumed that older children were better at discriminating threat and safety stimuli. Therefore, 396 healthy participants (aged 8 to 12 years) were examined with the fear conditioning and generalization paradigm. Again, ratings of valence, arousal, and SCRs were obtained. SCRs indicated differences in fear generalization with best fear discrimination in 12-year-old children suggesting that the age of 12 years seems to play an important role, since generalization gradients were similar to that of adults. These age differences were seen in boys and girls, but best discrimination was found in 12-year-old boys, indicating different development of generalization gradients according to sex. This result fits nicely with the fact that the prevalence of AD is higher in women than in men. In a third study, it was supposed that the developmental trajectory from increased trait anxiety in childhood to manifest AD could be mediated by abnormal fear conditioning and generalization processes. To this end, 394 children aged 8 to 12 years with different scores in trait anxiety were compared with each other. Results provided evidence that children with high trait anxiety showed stronger responses to threat cues and impaired safety signal learning contingent on awareness as indicated by arousal at acquisition. Furthermore, analyses revealed that children with high trait anxiety showed overall higher arousal ratings at generalization. Contrary to what was expected, high trait anxious children did not show significantly more fear generalization than children with low trait anxiety. However, high-trait-anxious (HA) participants showed a trend for a more linear gradient, whereas moderate-trait-anxious (MA) and low-trait-anxious (LA) participants showed more quadratic gradients according to arousal. Additionally, after controlling for age, sex and negative life experience, SCR to the safety stimulus predicted the trait anxiety level of children suggesting that impaired safety signal learning may be a risk factor for the development of AD. Results provide hints that frontal maturation could develop differently according to trait anxiety resulting in different stimuli discrimination. Thus, in a fourth experiment, 40 typically developing volunteers aged 10 to 18 years were screened for trait anxiety and investigated with the differential fear conditioning and generalization paradigm in the scanner. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) were used to identify the neural mechanisms of fear learning and fear generalization investigating differences in this neural mechanism according to trait anxiety, developmental aspects and sex. At acquisition, HA participants showed reduced activation in frontal brain regions, but at generalization, HA participants showed an increase in these frontal regions with stronger linear increase in activation with similarity to CS+ in HA when compared to LA participants. This indicates that there is a hyper-regulation in adolescents to compensate the higher difficulties at generalization in form of a compensatory mechanism, which decompensates with adulthood and/or may be collapsed in manifest AD. Additionally, significant developmental effects were found: the older the subjects the stronger the hippocampus and frontal activation with resemblance to CS+, which could explain the overgeneralization of younger children. Furthermore, there were differences according to sex: males showed stronger activation with resemblance to CS+ in the hippocampus and frontal regions when compared to females fitting again nicely with the observation that prevalence rates for AD are higher for females than males. In sum, the studies suggest that investigating developmental aspects of (maladaptive) overgeneralization may lead to better understanding of the mechanisms of manifest anxiety disorders, which could result in development and provision of prevention strategies. Although, there is need for further investigations, the present work gives some first hints for such approaches. N2 - Im Angesicht realer Bedrohung macht es durchaus Sinn, eine Furchtreaktion zu zeigen, denn dadurch kann die Überlebenschance erhöht werden. Die aufkommende Frage hierbei lautet: wie kann man eine “echte” Gefahr von einer “Attrappe” unterscheiden? Hier gilt der Spruch: besser einmal zu viel (Angst), als einmal zu wenig. Es macht also in einer komplexen Umwelt durchaus Sinn, von einer bestimmten Situation oder Gefahrenquelle auf eine andere, dieser ähnlichen, zu generalisieren. Dies birgt allerdings die Gefahr, zu stark zu generalisieren und/oder zu oft vor “harmlosen” Situationen oder Dingen Angst zu haben, wie uns das von den Angststörungen her bekannt ist. Furchterwerb und -generalisierung lassen sich mithilfe von Furchtkonditionierungs- und Generalisierungsparadigmen untersuchen. In Anbetracht der Tatsache, dass Furchtlernen und Furchtgeneralisierung wichtige Rollen in der Entwicklung von Angsterkrankungen zu spielen scheinen, ist es verwunderlich, dass es, trotz zunehmenden Interesses, nur wenig Forschung im Bereich Furchtgeneralisierung gibt. Die meisten Humanstudien hierzu wurden mit erwachsenen Probanden durchgeführt, wohingegen nur sehr wenig über diese Prozesse im Kindesalter bekannt ist. Um diese Wissenslücke etwas zu schließen, wurden in dieser vorliegenden Arbeit vier Studien generiert, in welchen ein differenzielles Furchtkonditionierungs- und Generalisierungsparadigma zum Einsatz kam. In den ersten beiden Experimenten standen Entwicklungsaspekte des Furchterwerbs und der Furchtgeneralisierung im Fokus. In der ersten Studie haben wir deshalb 267 Kinder und 285 Erwachsene mit dem differenziellen Furchtkonditionierungs- und Generalisierungsparadigma untersucht und bezüglich Valenz, Arousal und Hautleitfähigkeitsreaktion verglichen. Während beide Gruppen vergleichbare Konditionierungseffekte aufwiesen, zeigten die Kinder eine stärkere Generalisierung. Dies machte sich sowohl im Arousal als auch in der Hautleitfähigkeit bemerkbar. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass eine Entwicklung von einem flachen hin zu einem steileren Generalisierungsgradienten möglicherweise auf die Reifung bestimmter Hirnstrukturen zurückzuführen ist, die die effektive Diskriminierung zwischen gefährlichen und (vermeintlich) ungefährlichen Reizen modulieren. Die Frage schließt sich an, in welchem Entwicklungsstadium sich die Generalisierungsgradienten von Kindern denen der Erwachsenen angleichen. Um dieser Frage weiter nachzugehen wurden in der zweiten Studie entwicklungsbedingte Veränderungen der Furchtkonditionierung und -generalisierung bei Kindern und Jugendlichen untersucht. Laut dem ersten Experiment und weiteren Studien, die auf altersbedingte Veränderungen im Furchtlernen hinweisen, lag hier die Annahme zugrunde, dass Kinder mit zunehmendem Alter besser zwischen gefährlichen und (vermeintlich) ungefährlichen Reizen unterscheiden können. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden 396 gesunde Probanden (zwischen 8 und 12 Jahren) mittels des Furchtkonditionierungs- und Generalisierungsparadigmas untersucht. Wie bereits in der ersten Studie wurden Valenz, Arousal und die Hautleitfähigkeitsreaktion ausgewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass Kinder aller Altersstufen vergleichbare Konditionierungseffekte aufweisen, dass aber laut der Hautleitfähigkeitsreaktion 12-jährige Kinder im Vergleich zu den jüngeren Kindern am besten zwischen den Stimuli unterscheiden konnten. Wenn nach Geschlecht aufgeteilt wird, diskriminierten 12-jährige Jungs am besten, was darauf schließen lässt, dass sich Furchtgeneralisierung je nach Geschlecht unterschiedlich entwickeln könnte, was in Anbetracht der Tatsache interessant ist, dass Frauen höhere Prävalenzraten für Angsterkrankungen haben als Männer. Einer dritten Studie liegt die Annahme zugrunde, dass ein Entwicklungsstrang von einer ängstlichen Persönlichkeit hin zu einer Angsterkrankung durch abweichende Furchtkonditionierung und -Generalisierung vermittelt werden könnte. Daher wurden 394 Kinder zwischen 8 und 12 Jahren mit unterschiedlichen Ausprägungen in ihrer Ängstlichkeit mit dem Furchtkonditionierungs- und Generalisierungsparadigma untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Kinder mit hohen Angst Werten je nach dem Grad ihrer Kontingenz-Bewusstheit während der Konditionierung mit stärkerer Erregung auf mit Gefahr assoziierte Reize und beeinträchtigtem Lernen des sicheren Reizes reagierten. Es zeigte sich, dass Kinder mit hohen Angst Werten generell höhere Erregungs-Werte während der Generalisierung aufwiesen als Kinder mit niedrigen Werten. Entgegen den Annahmen generalisierten Kinder mit hoher Ängstlichkeit nicht signifikant stärker als Kinder mit niedrigen Werten. Es gab jedoch einen Trend dahingehend, dass hoch-ängstliche Kinder eher lineare Generalisierungsgradienten aufweisen (was für mehr Generalisierung spricht), während moderat- und niedrig-ängstliche Kinder eher quadratische Gradienten haben (was für bessere Differenzierung spricht). Zudem konnten die SCRs auf den „sicheren“ Stimulus (CS-) den Ängstlichkeitswert voraussagen (nachdem für Alter, Geschlecht und negative Lebenserfahrung korrigiert wurde). Dies könnte bedeuten, dass eine Beeinträchtigung im Lernen des sicheren Reizes ein Risikofaktor für die Entwicklung einer Angsterkrankung im Jugendalter sein könnte. Allgemein liefern die Ergebnisse erste Hinweise darauf, dass sich frontale Hirnstrukturen je nach Ausprägung der Ängstlichkeit unterschiedlich entwickeln könnten, was sich in unterschiedlicher Diskriminierungsfähigkeit spiegeln könnte. Um dem weiter nachzugehen, wurden im vierten Experiment 40 der Norm entsprechend entwickelte Probanden zwischen 10 und 18 Jahren mit unterschiedlichen hoher Ängstlichkeit mittels fMRT auf Unterschiede in der Furchtkonditionierung und -generalisierung hin untersucht. Außerdem wurden Zusammenhänge mit dem Alter und dem Geschlecht der Probanden untersucht. Die frontale Aktivität zeigte sich unterschiedlich je nach Ängstlichkeit, mit stärkerer linearer Zunahme in der Aktivierung mit Ähnlichkeit zum CS+ während der Generalisierung bei hoch ängstlichen Probanden. Dies lässt auf eine Hyperregulierung bei Jugendlichen im Vergleich zu Erwachsenen schließen, wenn es darum geht, die Schwierigkeiten bezüglich der Differenzierung der dem bedrohlichen Reiz sehr ähnlichen Reize zu kompensieren. Diese Hyperregulierung könnte einen Kompensationsmechanismus der hoch ängstlichen Kinder widerspiegeln, welcher mit zunehmendem Alter verschwindet und bei manifesten Angsterkrankungen zusammenbricht. Außerdem konnten signifikante Entwicklungseffekte gefunden werden: je älter die Probanden waren, desto stärker war deren Aktivierung im Hippocampus und in frontalen Regionen während der Generalisierung mit zunehmender Ähnlichkeit zum CS+. Diese Altersunterschiede könnten die Übergeneralisierung jüngerer Kinder erklären und folglich zur Erklärung beitragen, weshalb Angsterkrankungen häufig ihren Ursprung in frühen Altersstufen haben. Männliche Probanden zeigten außerdem stärkere Aktivierung mit zunehmender Ähnlichkeit zum CS+ im Hippocampus und in frontalen Regionen. Dieses Ergebnis ergänzt die Resultate des zweiten Experiments und passt zur Tatsache, dass die Prävalenzraten für Angsterkrankungen für Frauen höher sind als für Männer. Zusammengenommen legen die Studien nahe, dass es sich lohnt, sich mit Entwicklungsaspekten von Furchtgeneralisierung zu befassen. Ein besseres Verständnis von Mechanismen des Furchterwerbs und besonders von Furchtgeneralisierung könnte dabei helfen, die Entstehungsmechanismen von Angsterkrankungen besser zu verstehen und könnte somit bei der Entwicklung von Präventionsansätzen wichtig sein. Obwohl viele Fragen noch offen sind und einige weitere Untersuchungen anstehen, liefert diese Arbeit erste Ideen für solche Ansätze. KW - Furcht KW - Development KW - Entwicklung KW - Fear Learning KW - Fear Generalization KW - Furchkonditionierung KW - Furchtgeneralisierung KW - Konditionierung KW - Generalisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164372 ER - TY - THES A1 - Mendes Pereira, Lenon T1 - Morphological and Functional Ultrashort Echo Time (UTE) Magnetic Resonance Imaging of the Human Lung T1 - Morphologische und funktionelle Magnetresonanztomographie der menschlichen Lunge mit ultrakurzen Echozeiten (UTE) N2 - In this thesis, a 3D Ultrashort echo time (3D-UTE) sequence was introduced in the Self-gated Non-Contrast-Enhanced Functional Lung Imaging (SENCEFUL) framework. The sequence was developed and implemented on a 3 Tesla MR scanner. The 3D-UTE technique consisted of a nonselective RF pulse followed by a koosh ball quasi-random sampling order of the k-space. Measurements in free-breathing and without contrast agent were performed in healthy subjects and a patient with lung cancer. A gating technique, using a combination of different coils with high signal correlation, was evaluated in-vivo and compared with a manual approach of coil selection. The gating signal offered an estimation of the breathing motion during measurement and was used as a reference to segment the acquired data into different breathing phases. Gradient delays and trajectory errors were corrected during post-processing using the Gradient Impulse Response Function. Iterative SENSE was then applied to determine the fully sampled data. In order to eliminate signal changes caused by motion, a 3D image registration was employed, and the results were compared to a 2D image registration method. Ventilation was assessed in 3D and regionally quantified by monitoring the signal changes in the lung parenchyma. Finally, image quality and quantitative ventilation values were compared to the standard 2D-SENCEFUL technique. 3D-UTE, combined with an automatic gating technique and SENCEFUL MRI, offered ventilation maps with high spatial resolution and SNR. Compared to the 2D method, UTE-SENCEFUL greatly improved the clinical quality of the structural images and the visualization of the lung parenchyma. Through‐plane motion, partial volume effects and ventilation artifacts were also reduced with a three-dimensional method for image registration. UTE-SENCEFUL was also able to quantify regional ventilation and presented similar results to previous studies. N2 - In dieser Arbeit wurde eine 3D-UTE (ultrashort echo time) Sequenz mit SENCEFUL-MRI kombiniert. Die Sequenz wurde für einen 3 T MR-Scanner entwickelt und implementiert. Die 3D-UTE-Technik bestand aus einem nichtselektiven HF- Impuls, gefolgt von einer quasi-zufälligen Abtastung des k-Raums. Messungen in freier Atmung und ohne Kontrastmittel wurden bei gesunden Probanden und einem Patienten mit Lungenkrebs durchgeführt. Zur Zuordnung der Daten zu verschiedene Atemphasen wurde eine Technik verwendet, die verschiedene Spulen mit hoher Signalkorrelation kombiniert. Die Ergebnisse wurden in einer in-vivo Messung bewertet und mit einem manuellen Ansatz der Spulenselektion verglichen. Die Technik ermöglichte eine Visualisierung der Atembewegung und wurde als Referenz verwendet, um die erfassten Daten in mehrere Atemphasen zu segmentieren. Gradientenverzögerungen und Trajektorienfehler wurden mit der "Gradient Impulse Response Function - GIRF" korrigiert. Bei der Bildrekonstruktion kam Iteratives SENSE zum Einsatz. Eine 3D-Bildregistrierung erlaubte es, Signaländerungen durch Bewegung zu eliminieren. Es erfolgte ein Vergleich der Ergebnisse mit einem 2D- Bildregistrierungsverfahren. Die Lungenventilation wurde in 3D gemessen und anhand der Signaländerungen im Lungenparenchym quantifiziert. Schließlich, wurden die Werte für die Bildqualität und Lungenventilation mit der Standard-2D-SENCEFUL-Technik verglichen. Die 3D-UTE-Sequenz in Kombination mit einer automatischen Gating-Technik und SENCEFUL-MRI, ermöglichte die Akquise von Ventilationskarten mit hoher räumlicher Auflösung und SNR. Im Vergleich zur 2D-Methode, verbesserte UTE- SENCEFUL die klinische Qualität der Morphologischen Bilder. Bewegung, Partialvolumeneffekte und Ventilationsartefakte wurden ebenfalls mit einer dreidimensionalen Methode zur Bildregistrierung reduziert. Insgesamt konnten mit der 3D-UTE Technik die Ergebnisse vorangegangener Studien reproduziert und die Bildqualität verbessert werden. KW - Kernspintomografie KW - Lunge KW - MRI KW - Ultrashort echo time - UTE KW - Magnetic Resonance Imaging KW - Lung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183176 ER - TY - THES A1 - Turakhiya, Ankit T1 - Functional characterization of the role of ZFAND1 in stress granule turnover T1 - Funktionelle Charakterisierung der Rolle von ZFAND1 im Umsatz von Stressgranula N2 - Protein quality control systems are critical for cellular proteostasis and survival under stress conditions. The ubiquitin proteasome system (UPS) plays a pivotal role in proteostasis by eliminating misfolded and damaged proteins. However, exposure to the environmental toxin arsenite results in the accumulation of polyubiquitylated proteins, indicating an overload of the UPS. Arsenite stress induces the rapid formation of stress granules (SGs), which are cytoplasmic assemblies of mRNPs stalled in translation initiation. The mammalian proteins ZFAND2A/B (also known as AIRAP and AIRAPL, respectively) bind to the 26S proteasome, and ZFAND2A has been shown to adapt proteasome activity to arsenite stress. They belong to a small subfamily of AN1 type zinc finger containing proteins that also comprises the unexplored mammalian member ZFAND1 and its yeast homolog Cuz1. In this thesis, the cellular function of Cuz1 and ZFAND1 was investigated. Cuz1/ZFAND1 was found to interact with the ubiquitin-selective, chaperone-like ATPase Cdc48/p97 and with the 26S proteasome. The interaction between Cuz1/ZFAND1 and Cdc48/p97 requires a predicted ubiquitin-like domain of Cuz1/ZFAND1. In vivo, this interaction was strongly dependent on acute arsenite stress, suggesting that it is a part of the cellular arsenite stress response. Lack of Cuz1/ZFAND1 caused a defect in the clearance of arsenite induced SG clearance. ZFAND1 recruits both, the 26S proteasome and p97, to arsenite-induced SGs for their normal clearance. In the absence of ZFAND1, SGs lack the 26S proteasome and p97, accumulate defective ribosomal products and become aberrant. These aberrant SGs persist after arsenite removal and undergo degradation via autophagy. ZFAND1 depletion is epistatic to the expression of pathogenic mutant p97 with respect to SG clearance, suggesting that ZFAND1 function is relevant to the multisystem degenerative disorder, inclusion body myopathy associated with Paget’s disease of bone and frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis (IBMPFD/ALS). N2 - Systeme zur Sicherung der Proteinqualität sind von essentieller Bedeutung für die zelluläre Proteostase und das Überleben unter Stressbedingungen. Dabei spielt das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) eine entscheidende Rolle: Es beseitigt fehlgefaltete und beschädigte Proteine. Sind Zellen dem Umweltgift Arsenit ausgesetzt, kommt es zu einer Akkumulation von polyubiquitinierten Proteinen, was auf eine Überlastung des UPS hinweist. Dieser durch Arsenit verursachte Stress bewirkt eine schnelle Bildung von Stressgranula (SGs), einer cytoplasmatischen Ansammlung von mRNPs, die in der Initiation der Translation blockiert sind. Die Säuger Proteine ZFAND2A/B (auch bekannt als AIRAP und AIRAPL) binden an das 26S Proteasom. Zusätzlich wurde gezeigt, dass ZFAND2A die Aktivität des Proteasoms an durch Arsenit verursachten Stress, anpasst. Diese Proteine gehören zu einer kleinen Unterfamilie von Zinkfinger von AN1-type enthaltenden Proteinen, zu der auch das bislang nicht erforschte Säuge Protein ZFAND1 und sein Hefehomolog Cuz1 gehören. In dieser Arbeit wurde die zelluläre Funktion von Cuz1 und ZFAND1 untersucht. Es zeigte sich, dass Cuz1/ZFAND1 mit dem 26S Proteasom und der Ubiquitin-selektiven, Chaperon-ähnlichen ATPase Cdc48/p97 interagiert. Die Interaktion zwischen Cuz1/ZFAND1 und Cdc48/p97 benötigt eine vorhergesagte Ubiquitin-ähnliche Domäne von Cuz1/ZFAND1. Diese Interaktion ist in vivo stark von akutem Arsenitstress abhängig, was darauf hindeutet, dass sie Teil der zellulären Stressantwort gegen Arsenit ist. Fehlt Cuz1/ZFAND1, so kommt es zu einer Störung bei der Beseitigung der von Arsenit verursachten SGs. Normalerweise rekrutiert ZFAND1 sowohl das 26S Proteasom als auch p97 zu diesen SGs, um sie zu entfernen. Wenn ZFAND1 jedoch fehlt, sind auch p97 und das 26S Proteasom nicht an den SGs lokalisiert. Dadurch sammeln sich dort defekte ribosomale Produkte an, und die SGs werden abnormal. Auch nach Entfernung des Arsenitstresses bestehen diese abnormalen SGs fort und werden schließlich über Autophagie abgebaut. Bei der Beseitigung der SGs ist das Fehlen von ZFAND1 epistatisch zu der Expression einer pathogenen p97-Mutante, was darauf hinweirt, dass ZFAND1 bei der degenerativen Multisystemerkrankung Einschlusskörper-Myopathie assoziiert mit Pagets Erkrankung der Knochen und frontotemporaler Demenz und Amyotrophe Lateralsklerose (IBMPFD/ALS) eine Rolle spielt. KW - ubiquitin KW - ZFAND1 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163751 ER - TY - THES A1 - Nieberler, Matthias T1 - The physiological role of autoproteolysis of the Adhesion GPCR Latrophilin/dCIRL T1 - Die physiologische Bedeutung der Autoproteolyse des Adhäsions-GPCR Latrophilin/dCIRL N2 - G protein-coupled receptors of the Adhesion family (aGPCRs) comprise the second largest group within the GPCR realm with over 30 mammalian homologs. They contain a unique structure with unusually large extracellular domains (ECDs) holding many structural folds known to mediate cell-cell and cell-matrix interactions. Furthermore, aGPCRs undergo autoproteolytic cleavage at the GPCR proteolysis site (GPS), an integral portion of the GPCR autoproteolysis inducing (GAIN) domain. Thus far, it is largely unknown if and how self-cleavage affects aGPCR activation and signaling and how these signals may shape the physiological function of cells. Latrophilin, alternatively termed the calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL) constitutes a highly conserved, prototypic aGPCR and has been assigned roles in various biological processes such as synaptic development and maturation or the regulation of neurotransmitter release. The Drosophila melanogaster homolog dCIRL is found in numerous sensory neurons including the mechanosensory larval pentascolopidial chordotonal organs (CHOs), which rely on dCIRL function in order to sense mechanical cues and to modulate the mechanogating properties of present ionotropic receptors. This study reveals further insight into the broad distribution of dCirl expression throughout the larval central nervous system, at the neuromuscular junction (NMJ), as well as subcellular localization of dCIRL in distal dendrites and cilia of chordotonal neurons. Furthermore, targeted mutagenesis which disabled GPS cleavage of dCIRL left intracellular trafficking in larval CHOs unaffected and proved autoproteolysis is not required for dCIRL function in vivo. However, substitution of a threonine residue, intrinsic to a putative tethered agonist called Stachel that has previously been documented for several other aGPCRs, abrogated receptor function. Conclusively, while this uncovered the presence of Stachel in dCIRL, it leaves the question about the biological relevance of the predetermined breaking point at the GPS unanswered. In an independent approach, the structure of the “Inter-RBL-HRM” (IRH) region, the region linking the N-terminal Rhamnose-binding lectin-like (RBL) and the hormone receptor motif (HRM) domains of dCIRL, was analyzed. Results suggest random protein folding, excessive glycosylation, and a drastic expansion of the size of IRH. Therefore, the IRH might represent a molecular spacer ensuring a certain ECD dimension, which in turn may be a prerequisite for proper receptor function. Taken together, the results of this study are consistent with dCIRL’s mechanoceptive faculty and its role as a molecular sensor that translates mechanical cues into metabotropic signals through a yet undefined Stachel-dependent mechanism. N2 - G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der Adhäsions-Klasse (aGPCRs) bilden mit über 30 Homologen in Säugern die zweitgrößte Gruppe innerhalb des GPCR-Reichs. Sie teilen eine einzigartige Morphologie mit einer ungewöhnlich großen extrazellulären Domäne (ECD), welche meist vielfältige Strukturen enthält, die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen vermitteln. Weiterhin unterziehen sich aGPCRs einer autoproteolytischen Spaltung an der GPCR proteolysis site (GPS), die einen integralen Bestandteil der GPCR autoproteolysis inducing (GAIN) Domäne darstellt. Bisher ist weitestgehend unbekannt, ob und wie die Selbstspaltung Aktivierung und Signaltransduktion von aGPCRs beeinflusst und wie diese Signale die physiologische Zellfunktion modulieren. Latrophilin, oder auch der Kalzium-unabhängige Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL), stellt einen evolutiv stark konservierten, prototypischen aGPCR dar und spielt eine Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, darunter die Entwicklung und Reifung von Synapsen, sowie die Regulation der Neurotransmitterausschüttung. Zusätzlich ist dCIRL, das Latrophilinhomolog von Drosophila melanogaster, an der Wahrnehmung mechanischer Reize beteiligt und moduliert die Mechanosensitivität larvaler Chordotonalorgane (CHOs), indem es das mechanisch gesteuerte Verhalten vorliegender ionotroper Rezeptoren verändert. Die vorliegende Arbeit enthüllt weitere Erkenntnisse zur umfassenden Expression von dCirl im larvalen Zentralnervensystem, an der motorischen Endplatte (NMJ), und stellt erstmals dessen subzelluläre Lokalisation in distalen Dendriten und Zilien von Chordotonalneuronen dar. Außerdem zeigen Mutationsstudien mit ausgeschalteter Autoproteolyse an der GPS, dass diese für den intrazellulären Transport und die Rolle von dCIRL in larvalen CHOs in vivo von untergeordneter Bedeutung ist. Die Mutation eines Threonins, welches integraler Bestandteil eines möglichen gebundenen Agonisten Stachel, der kürzlich für einige andere aGPCRs beschrieben wurde, ist, verschlechtert jedoch drastisch die Rezeptorfunktion. Während dies die Existenz Stachels in dCIRL aufdeckt, bleibt die Frage nach der biologischen Bedeutung der vorgegebenen Bruchstelle an der GPS unbeantwortet. Zusätzlich wurde die Struktur der „Inter-RBL-HRM“ (IRH) Region von dCIRL, die die N-terminale Rhamnose-binding lectin-like (RBL) und die hormone receptor motif (HRM) Domänen verbindet, analysiert. Die Ergebnisse legen eine zufällige Proteinfaltung, starke Glykosylierung sowie riesige strukturelle Ausmaße von IRH nahe. Daher könnte die IRH einen molekularen Abstandhalter für dCIRL darstellen, der eine bestimmte Länge der ECD sicherstellt, was wiederum eine Voraussetzung für die Rezeptorfunktion sein könnte. Zusammen betrachtet sind die Ergebnisse dieser Arbeit vereinbar mit der mechanozeptiven Funktion von dCIRL und dessen Rolle als molekularer Sensor, der mechanische Reize mit Hilfe eines bisher unbekannten Stachel-abhängigen Mechanismus in metabotrope Signale umwandelt. KW - Latrophilin KW - Autoproteolysis KW - Adhesion GPCR KW - Mechanosensation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165894 ER - TY - THES A1 - Rydzek, Julian T1 - NF-κB/NFAT Reporter Cell Platform for Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Library Screening T1 - NF-κB/NFAT-Reporterzellplattform für das Screening von Chimären Antigenrezeptor (CAR)-Bibliotheken N2 - Immunotherapy with engineered T cells expressing a tumor-specific chimeric antigen receptor (CAR) is under intense preclinical and clinical investigation. This involves a rapidly increasing portfolio of novel target antigens and CAR designs that need to be tested in time- and work-intensive screening campaigns in primary T cells. Therefore, we anticipated that a standardized screening platform, similar as in pharmaceutical small molecule and antibody discovery, would facilitate the analysis of CARs by pre-selecting lead candidates from a large pool of constructs that differ in their extracellular and intracellular modules. Because CARs integrate structural elements of the T cell receptor (TCR) complex and engage TCR-associated signaling molecules upon stimulation, we reasoned that the transcription factors nuclear factor-κB (NF-κB) and nuclear factor of activated T cells (NFAT) could serve as surrogate markers for primary T cell function. The nuclear translocation of both transcription factors in primary T cells, which we observed following CAR stimulation, supported our rationale to use NF-κB and NFAT as indicators of CAR-mediated activation in a screening platform. To enable standardized and convenient analyses, we have established a CAR-screening platform based on the human T cell lymphoma line Jurkat that has been modified to provide rapid detection of NF-κB and NFAT activation. For this purpose, Jurkat cells contained NF-κB and NFAT-inducible reporter genes that generate a duplex output of cyan fluorescent protein (CFP) and green fluorescent protein (GFP), respectively. Upon stimulation of NF-κB/NFAT reporter cells, the expression of both fluorophores could be readily quantified in high-throughput screening campaigns by flow cytometry. We modified the reporter cells with CD19-specific and ROR1-specific CARs, and we co-cultured them with antigen-positive stimulator cells to analyze NF-κB and NFAT activation. CAR-induced reporter signals could already be detected after 6 hours. The optimal readout window with high-level reporter activation was set to 24 hours, allowing the CAR-screening platform to deliver results in a rapid turnaround time. A reporter cell-screening campaign of a spacer library with CARs comprising a short, intermediate or long IgG4-Fc domain allowed distinguishing functional from non-functional constructs. Similarly, reporter cell-based analyses identified a ROR1-CAR with 4-1BB domain from a library with different intracellular signal modules due to its ability to confer high NF-κB activation, consistent with data from in vitro and in vivo studies with primary T cells. The results of both CAR screening campaigns were highly reproducible, and the time required for completing each testing campaign was substantially shorter with reporter cells (6 days) compared to primary T cells (21 days). We further challenged the reporter cells in a large-scale screening campaign with a ROR1 CAR library comprising mutations in the VH CDR3 sequence of the R11 scFv. This region is crucial for binding the R11 epitope of ROR1, and we anticipated that mutations here would cause a loss of specificity and affinity for most of the CAR variants. This provided the opportunity to determine whether the CAR screening platform was able to retrieve functional constructs from a large pool of CAR variants. Indeed, using a customized pre enrichment and screening strategy, the reporter cells identified a functional CAR variant that was present with a frequency of only 6 in 1.05x10^6. As our CAR-screening platform enabled the analysis of activating signal modules, it encouraged us to also evaluate inhibitory signal modules that change the CAR mode of action. Such an inhibitory CAR (iCAR) can be used in logic gates with an activating CAR to interfere with T cell stimulation. By selecting appropriate target antigens for iCAR and CAR, this novel application aims to improve the selectivity towards tumor cells, and it could readily be studied using our screening platform. Accordingly, we tested CD19-specific iCARs with inhibitory PD-1 signal module for their suppressive effect on reporter gene activation. In logic gates with CAR or TCR stimulation, a decrease of NF-κB and NFAT signals was only observed when activating and inhibitory receptors were forced into spatial proximity. These results were further verified by experiments with primary T cells. In conclusion, our reporter cell system is attractive as a platform technology because it is independent of testing in primary T cells, exportable between laboratories, and scalable to enable small- to large-scale screening campaigns of CAR libraries. The pre-selection of appropriate lead candidates with optimal extracellular and intracellular modules can reduce the number of CAR constructs to be investigated in further in vitro and in vivo studies with primary T cells. We are therefore confident that our CAR-screening platform based on NF-κB/NFAT reporter cells will be useful to accelerate translational research by facilitating the evaluation of CARs with novel design parameters. N2 - Die Immuntherapie mit modifizierten T-Zellen, die einen tumorspezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, wird präklinisch und klinisch intensiv erforscht. Dies beinhaltet ein rasant anwachsendes Portfolio an neuartigen Zielantigenen und CAR-Designs, die in zeit- und arbeitsintensiven Screenings in primären T-Zellen untersucht werden müssen. Daher haben wir angenommen, dass eine standardisierte Screening-Plattform, ähnlich wie in der pharmazeutischen Kleinmolekül- und Antikörperforschung, die Analyse von CARs erleichtern würde. Die Plattform könnte funktionelle Kandidaten aus einer großen Anzahl von CAR Konstrukten, die sich durch ihre extrazellulären und intrazellulären Module unterscheiden, herausfiltern. Da CARs strukturelle Elemente des T-Zell-Rezeptor Komplexes enthalten und T-Zell-Rezeptor-assoziierte Signalmoleküle nach Stimulation aktivieren, sind wir zu der Annahme gelangt, dass die Transkriptionsfaktoren Nukleärer Faktor κB (NF-κB) und Nukleärer Faktor aktivierter T-Zellen (NFAT) als Surrogatmarker für primäre T Zellfunktionen dienen könnten. Die nukleäre Translokation beider Transkriptionsfaktoren in primären T-Zellen, die wir nach der CAR-Stimulation beobachten konnten, unterstützte unsere Überlegung NF-κB und NFAT als Indikatoren für die CAR-vermittelte Aktivierung in einer Screening-Plattform zu verwenden. Um standardisierte und benutzerfreundliche Analysen zu ermöglichen, haben wir eine CAR Screening-Plattform basierend auf der humanen T-Zell-Lymphomlinie Jurkat etabliert, die modifiziert wurde, um einen schnellen Nachweis der Aktivierung von NF-κB und NFAT zu gewährleisten. Hierfür enthielten die Jurkat-Zellen NF-κB- und NFAT-induzierbare Reportergene, die mittels dem blauen Fluorophor CFP und dem grünen Fluorophor GFP eine Doppeldetektion erlauben. Bei Stimulation der NF-κB/NFAT-Reporterzellen konnte die Expression beider Fluorophore in Hochdurchsatz-Screenings mithilfe der Durchflusszytometrie schnell quantifiziert werden. Die Reporterzellen wurden mit CD19-spezifischen und ROR1-spezifischen CARs modifiziert und anschließend mit antigenpositiven Stimulatorzellen kokultiviert, um die Aktivierung von NF-κB und NFAT zu analysieren. CAR-induzierte Reportersignale konnten bereits nach 6 Stunden detektiert werden. Das optimale Zeitfenster zur Auslesung hoher Reporteraktivierung wurde auf 24 Stunden festgelegt, so dass die CAR-Screening-Plattform in kurzer Zeit Ergebnisse liefern kann. Ein Reporterzell-Screening mit einer Spacer-Bibliothek aus CARs, die eine kurze, mittlere oder lange IgG4-Fc-Domäne enthielten, ermöglichte die Unterscheidung zwischen funktionellen und nicht-funktionellen Konstrukten. Ebenso konnten reporterzellgestützte Analysen einen ROR1-CAR mit 4-1BB Domäne aus einer Bibliothek mit verschiedenen intrazellulären Signalmodulen aufgrund seiner hohen NF-κB Aktivierung identifizieren, was im Einklang mit Daten aus in vitro- und in vivo-Studien mit primären T Zellen steht. Die Ergebnisse beider CAR-Screenings waren höchst reproduzierbar und die Zeit, welche für die Durchführung jeder Testung benötigt wurde, war mit Reporterzellen (6 Tage) wesentlich kürzer als mit primären T-Zellen (21 Tage). Des Weiteren haben wir die Reporterzellen für ein groß angelegtes Screening mit einer Bibliothek aus ROR1-CARs verwendet, welche Mutationen in der VH CDR3-Sequenz des R11 scFv enthielten. Diese Region ist entscheidend für die Bindung des R11-Epitops von ROR1 und wir haben erwartetet, dass Mutationen hier zu einem Verlust der Spezifität und Affinität für die Mehrzahl der CAR-Varianten führen würden. Somit wollten wir feststellen, ob die CAR-Screening-Plattform in der Lage war funktionelle Konstrukte aus einer großen Anzahl von CAR-Varianten wiederzufinden. Tatsächlich identifizierten die Reporterzellen mittels einer angepassten Anreicherungs- und Screeningstrategie eine funktionelle CAR-Variante, die mit einer Häufigkeit von nur 6 in 1,05x10^6 vorkam. Da unsere CAR-Screening-Plattform die Analyse aktivierender Signalmodule ermöglicht hat, veranlasste uns dies auch inhibitorische Signalmodule zu untersuchen, welche die Funktionsweise des CAR verändern. Ein solcher inhibitorischer CAR (iCAR) kann in Kombination mit einem aktivierenden CAR verwendet werden, um die T-Zellstimulation zu stören. Durch die Auswahl geeigneter Zielantigene für iCAR und CAR soll diese neuartige Anwendung die Selektivität gegenüber Tumorzellen verbessern und sie könnte mit unserer Screening-Plattform einfach untersucht werden. Dementsprechend haben wir CD19 spezifische iCARs mit inhibitorischem PD-1-Signalmodul hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die Reportergenaktivierung getestet. In Kombination mit CAR- oder TCR-Stimulation wurde eine Abnahme der NF-κB- und NFAT-Signale nur dann beobachtet, wenn aktivierende und inhibitorische Rezeptoren in räumliche Nähe gebracht wurden. Diese Ergebnisse wurden durch Experimente mit primären T-Zellen weiter verifiziert. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass unser Reporterzellsystem als Plattformtechnologie von großem Wert ist, da es die Analyse unabhängig von primären T-Zellen erlaubt, zwischen Laboren exportierbar ist und angepasst werden kann, um klein bis groß angelegte Screenings mit CAR Bibliotheken zu ermöglichen. Die Auswahl geeigneter Kandidaten mit optimalen extrazellulären und intrazellulären Modulen kann die Anzahl der zu untersuchenden CAR-Konstrukte in anschließenden in vitro- und in vivo-Studien mit primären T-Zellen reduzieren. Wir sind daher überzeugt, dass unsere CAR-Screening-Plattform basierend auf NF-κB/NFAT-Reporterzellen hilfreich sein wird, um die translationale Forschung zu beschleunigen, indem sie die Untersuchung von neuen Designparametern in CARs erleichtert. KW - Antigenrezeptor KW - Screening KW - Chimeric Antigen Receptor KW - Library Screening KW - Reporter Cells KW - Chimärer Antigenrezeptor KW - Reporterzellen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179187 ER - TY - THES A1 - Schmitt [geb. Wolf], Karen T1 - Studies on the role of platelet serotonin in platelet function, hemostasis, thrombosis and stroke T1 - Studien zur Rolle des Serotonins aus Thrombozyten für die Thrombozytenfunktion, Hämostase, Thrombose und Schlaganfall N2 - Platelet activation and aggregation are important processes in hemostasis resulting in reduction of blood loss upon vessel wall injury. However, platelet activation can lead to thrombotic events causing myocardial infarction and stroke. A more detailed understanding of the regulation of platelet activation and the subsequent formation of thrombi is essential to prevent thrombosis and ischemic stroke. Cations, platelet surface receptors, cytoskeletal rearrangements, activation of the coagulation cas-cade and intracellular signaling molecules are important in platelet activation and thrombus formation. One such important molecule is serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), an indolamine platelet agonist, biochemically derived from tryptophan. 5 HT is secreted from the enterochromaffin cells into the gastrointestinal tract (GI) and blood. Blood borne 5 HT has been proposed to regulate hemostasis by acting as a vaso-constrictor and by triggering platelet signaling through 5 HT2A receptor. Although platelets do not synthetize 5 HT, they take it up from the blood and store it in their dense granules which are secreted upon platelet activation. To identify the molecu-lar composite of the 5 HT uptake system in platelets and elucidate the role of platelet released 5-HT in thrombosis and ischemic stroke, 5 HT transporter knock out mice (5Htt / ) were analyzed in different in vitro and in vivo assays and in a model of is-chemic stroke. In 5Htt / platelets, 5 HT uptake from the blood was completely abol-ished and agonist-induced Ca2+ influx through store operated Ca2+ entry (SOCE), integrin activation, degranulation and aggregation responses to glycoprotein (GP) VI and C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) were reduced. These observed in vitro defects in 5Htt / platelets could be normalized by the addition of exogenous 5 HT. Moreover, reduced 5 HT levels in the plasma, an increased bleeding time and the formation of unstable thrombi were observed ex vivo under flow and in vivo in the abdominal aorta and carotid artery of 5Htt / mice. Surprisingly, in the transient middle cerebral artery occlusion model (tMCAO) of ischemic stroke 5Htt / mice showed near-ly normal infarct volumes and a neurological outcome comparable to control mice. Although secreted platelet 5 HT does not appear to play a crucial role in the devel-opment of reperfusion injury after stroke, it is essential to amplify the second phase of platelet activation through SOCE and thus plays an important role in thrombus stabilization. To further investigate the role of cations, granules and their contents and regulation of integrin activation in the process of thrombus formation, genetically modified mice were analyzed in the different in vivo thrombosis models. Whereas Tph1 / mice (lacking the enzyme responsible for the production of 5 HT in the periphery), Trpm7KI (point mu-tation in the kinase domain of Trpm7 channel, lacking kinase activity) and Unc13d / /Nbeal2 / mice (lacking α granules and the release machinery of dense granules) showed a delayed thrombus formation in vivo, MagT1y/ mice (lacking a specific Mg2+ transporter) displayed a pro thrombotic phenotype in vivo. Trpm7fl/fl Pf4Cre (lacking the non specific Mg2+ channel) and RIAM / mice (lacking a potential linker protein in integrin “inside out” signaling) showed no alterations in thrombus formation upon injury of the vessel wall. N2 - Thrombozytenaktivierung und Aggregation sind wichtige Schritte der Hämostase, die zur Reduktion des Blutverlustes bei Gefäßwandverletzung führen. Jedoch kann die Aktivierung von Thrombozyten zur Thrombose führen, wodurch Herzinfarkt und Schlaganfall entstehen kann. Ein besseres Verständnis der Regulierung der Throm-bozytenaktivierung und die darauf folgende Thrombusbildung sind notwendig, um Thrombose und Hirninfarkte zu vermeiden. Kationen, Thrombozy-ten Oberflächenrezeptoren, Zytoskelett Reorganisation, Aktivierung der Koagulati-onskaskade und intrazellulare Signalmoleküle sind wichtig in der Thrombozytenakti-vierung und Thrombusbildung. Solch ein wichtiges Molekül ist Serotonin (5 hydroxytryptamin, 5 HT), ein Indolamin Thrombozyten-Agonist, welcher aus Tryp-tophan synthetisiert wird. 5 HT wird aus den Enterochromaffinzellen in den Gastroin-testinaltrakt (GI) und das Blut abgegeben. 5 HT aus dem Blut wirkt als Regulator der Hämostase durch die Wirkung als Vasokonstriktor und die Auslösung der Throm-bozyten-Signalwege durch den 5 HT2A Rezeptor. Thrombozyten synthetisieren kein 5 HT, sondern nehmen es aus dem Blut auf und speichern es in den dichten Granu-la, die nach der Thrombozyten-Aktivierung freigesetzt werden. Um die molekulare Zusammensetzung des 5 HT Aufnahmesystems in Thrombozyten zu identifizieren und die Rolle des 5 HT aus Thrombozyten in Thrombose und ischämischem Schlag-anfalls zu klären, wurde eine 5 HT Transporter-defiziente Mauslinie (5Htt / ) in ver-schiedenen in vitro und in vivo Untersuchungen und im Model des ischämischen Schlaganfalls analysiert. In 5Htt / Thrombozyten ist die Aufnahme von 5 HT aus dem Blut vollständig geblockt und Agonisten-induzierter Ca2+ Fluss durch Speicher-abhängigen Ca2+ Einstrom (SOCE), Integrinaktivierung, Degranulierung und Aggre-gation abhängig von Glykoprotein (GP) VI und C type lectin-like receptor 2 (CLEC 2) waren reduziert. Diese in vitro beobachteten Defekte in 5Htt / Thrombozyten konnten durch Zugabe von 5 HT normalisiert werden. Zudem wurden reduzierte 5 HT Werte im Plasma, eine erhöhte Blutungszeit und die Bildung von instabilen Thromben ex vivo unter Fluss und in vivo in der abdominalen Aorta und der Carotis von 5Htt / Mäusen beobachtet. Überraschenderweise zeigten die 5Htt / Mäuse nach transientem Verschluss der A. cerebri media (tMCAO), einem Modell des ischämi-schen Schlaganfalls, ein normales Infarktvolumen und einen unveränderten neurolo-gischen Endzustand im Vergleich zu Kontrollmäusen. Obwohl sekretiertes 5 HT aus Thrombozyten keine wesentliche Rolle in der Entwicklung eines Reperfusionsscha-dens nach einem Schlaganfall spielt, ist es essentiell in der Verstärkung der zweiten Phase der Thrombozytenaktivierung durch SOCE und spielt eine wichtige Rolle in der Thrombusstabilität. Um die Rolle von Kationen, Granula und deren Bestandteile und der Regulierung in der Integrinaktivierung im Prozess der Thrombusbildung zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse in den verschiedenen in vivo Thrombosemodellen ge-testet. Während Tph1 / Mäuse (denen das Enzym zur Produktion von 5 HT in der Peripherie fehlt), Trpm7KI (Punktmutation in der Kinasedomäne des Trpm7 Kanals, Fehlen der Kinase Aktivität) und Unc13d / /Nbeal2 / Mäuse (denen die α Granula und die Freisetzungsmaschinerie der dichten Granula fehlt) und keine oder eine verlang-samte Thrombusbildung zeigten, wiesen MagT1y/ Mäuse (denen der spezifische Mg2+ Transporter fehlt) einen prothrombotischen Phänotyp auf. Trpm7fl/fl Pf4Cre Mäuse (denen der nicht spezifische Mg2+ Kanal fehlt) und RIAM / Mäuse (denen ein potenti-elles Linker Protein im Integrin “inside out” Signal fehlt) zeigten keine Veränderung in der Thrombus Bildung nach Verletzung der Gefäßwand. KW - Biomedicine KW - Serotonin KW - Blutgerinnung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134711 ER - TY - THES A1 - Uri, Anna T1 - Differential requirement for CD28 co-stimulation on donor T cell subsets in mouse models of acute graft versus host disease and graft versus tumour effect T1 - Unterschiedlicher Einfluss der CD28 Kostimulation auf Donor-T Zell-Populationen in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Disease und des Graft-versus-Tumor Effekts N2 - Hematopoietic stem cell transplantation is a curative therapy for malignant diseases of the haematopoietic system. The patients first undergo chemotherapy or irradiation therapy which depletes the majority of tumour cells before they receive the transplant, consisting of haematopoietic stem cells and mature T cells from a healthy donor. The donor T cells kill malignant cells that have not been eliminated by the conditioning therapy (graft versus leukaemia effect, GvL), and, therefore, are crucially required to prevent relapse of the tumour. However, the donor T cells may also severely damage the patient’s organs causing acute graft versus host disease (aGvHD). In mice, aGvHD can be prevented by interfering with the co-stimulatory CD28 signal on donor T cells. However, experimental models using conventional CD28 knockout mice as T cell donors or αCD28 antibodies have some disadvantages, i.e. impaired T cell development in the thymus of CD28 knockout mice and systemic CD28 blockade with αCD28 antibodies. Thus, it remains unclear how CD28 co-stimulation on different donor T cell subsets contributes to the GvL effect and aGvHD, respectively. We developed mouse models of aGvHD and the GvL effect that allowed to selectively delete CD28 on certain donor T cell populations or on all donor T cells. CD4+ conventional T cells (Tconv cells), regulatory T cells (Treg cells) or CD8+ T cells were isolated from either Tamoxifen-inducible CD28 knockout (iCD28KO) mice or their wild type (wt) littermates. Allogeneic recipient mice were then transplanted with T cell depleted bone marrow cells and different combinations of iCD28KO and wt T cell subsets. Tamoxifen treatment of the recipients caused irreversible CD28 deletion on the iCD28KO donor T cell population. In order to study the GvL response, BCL-1 tumour cells were injected into the mice shortly before transfer of the T cells. CD4+ Tconv mediated aGvHD was efficiently inhibited when wt Treg cells were co-transplanted. In contrast, after selective CD28 deletion on donor Treg cells, the mice developed a late and lethal flare of aGvHD, i.e. late-onset aGvHD. This was associated with a decline in iCD28KO Treg cell numbers around day 20 after transplantation. CD28 ablation on either donor CD4+ Tconv cells or CD8+ T cells reduced but did not abrogate aGvHD. Moreover, iCD28KO and wt CD8+ T cells were equally capable of killing allogeneic target cells in vivo and in vitro. Due to this sufficient anti-tumour activity of iCD28KO CD8+ T cells, they had a therapeutic effect in our GvL model and 25% of the mice survived until the end of the experiment (day 120) without any sign of the malignant disease. Similarly, CD28 deletion on all donor T cells induced long-term survival. This was not the case when all donor T cells were isolated from wt donor mice. In contrast to the beneficial outcome after CD28 deletion on all donor T cells or only CD8+ T cells, selective CD28 deletion on donor CD4+ Tconv cells completely abrogated the GvL effect due to insufficient CD4+ T cell help from iCD28KO CD4+ Tconv cells. This study demonstrates that therapeutic inhibition of the co-stimulatory CD28 signal in either all donor T cells or only in CD8+ T cells might protect patients from aGvHD without increasing the risk of relapse of the underlying disease. Moreover, deletion of CD28 on donor Treg cells constitutes a mouse model of late-onset aGvHD which can be a useful tool in aGvHD research. N2 - Die hämatopoetische Stammzelltransplantation ist eine heilende Therapie für maligne Erkrankungen des blutbildenden Systems. Die Patienten müssen sich zuerst einer Chemotherapie oder einer Strahlentherapie unterziehen, welche den Großteil der Tumorzellen beseitigt, bevor sie das Transplantat erhalten. Dieses besteht aus hämatopoetischen Stammzellen und reifen T-Zellen eines gesunden Spenders. Die transplantierten T-Zellen töten die malignen Zellen, die zuvor durch die Chemo- bzw. Strahlentherapie nicht zerstört wurden (Graft versus Leukämie Effekt, GvL), und sind daher essenziell, um ein Rezidiv der Tumorerkrankung zu verhindern. Die T-Zellen des Spenders können aber auch die Organe des Patienten schwer schädigen und dadurch die akute Graft versus Host Disease (aGvHD) verursachen. In Mäusen kann die aGvHD verhindert werden, indem man das kostimulatorische Signal des CD28 Moleküls moduliert. Mausmodelle, in denen konventionelle CD28 Knock-out Mäuse als T-Zell-Donoren verwendet werden oder αCD28 Antikörper eingesetzt werden, haben einige Nachteile, wie zum Beispiel eine gestörte T-Zell Entwicklung in CD28 Knock-out Mäusen oder die systemische Blockade des CD28 Moleküls mit Antikörpern. Dadurch blieb bislang unklar, inwiefern CD28-Kostimulation auf verschiedenen T-Zell-Populationen zum GvL Effekt und zur aGvHD beiträgt. Wir haben Mausmodelle der aGvHD und des GvL Effekts entwickelt, die ermöglichen, das CD28 Molekül entweder nur auf bestimmten Spender-T-Zell-Populationen oder auf allen Spender-T-Zellen zu deletieren. Hierfür wurden CD4+ konventionelle T-Zellen (Tconv Zellen), regulatorische T Zellen (Treg Zellen) und CD8+ T-Zellen von Tamoxifen-induzierbaren CD28 Knockout (iCD28KO) Mäusen bzw. deren wildtypischen (wt) Wurfgeschwistern isoliert. Den allogenen Empfängermäusen wurden dann T-Zell-depletierte Knochenmarkszellen und verschiedene Kombinationen aus iCD28KO und wt Spender-T-Zellen transplantiert. Die Behandlung der Empfängertiere mit Tamoxifen führte zu einer irreversiblen Deletion von CD28 auf den iCD28KO T-Zell-Populationen. Um den GvL Effekt zu untersuchen, wurden den Mäusen kurz vor dem T-Zell-Transfer BCL-1 Tumorzellen injiziert. Die von den CD4+ Tconv Zellen verursachte aGvHD konnte sehr gut kontrolliert werden, indem zusätzlich wt Treg Zellen transplantiert wurden. Im Gegensatz dazu entwickelten die Mäuse einen späten und tödlichen Schub der aGvHD, auch late-onset aGvHD genannt, wenn die CD28 Expression auf den Treg Zellen des Spenders deletiert wurde. Dies ging mit einem Rückgang der iCD28KO Treg-Zellzahlen ca. 20 Tage nach Transplantation einher. Die Deletion von CD28 auf CD4+ Tconv Zellen oder auf CD8+ T-Zellen reduzierte die aGvHD, konnte diese aber nicht vollständig verhindern. Des Weiteren waren iCD28KO und wildtypische CD8+ T-Zellen gleichermaßen in der Lage, allogene Zellen zu töten, in vivo wie auch in vitro. Aufgrund dieser hinreichenden Anti-Tumor-Antwort hatten iCD28KO CD8+ T-Zellen einen therapeutischen Effekt in unserem GvL Modell und 25 % der Tiere überlebte bis zum Versuchsende (Tag 120) ohne Anzeichen des Tumors. Ein Langzeitüberleben der Tiere wurde auch beobachtet, wenn das CD28 Molekül auf allen Spender-T-Zellen fehlte. Dies war nicht der Fall, wenn alle Spender-T-Zellen von wt Mäusen isoliert wurden. Im Gegensatz zur CD28 Deletion auf entweder allen Spender-T-Zellen oder nur auf den CD8+ T-Zellen, ging der GvL Effekt vollständig verloren, wenn CD28 nur auf den CD4+ Tconv Zellen entfernt wurde, da diese dann keine ausreichende T-Zellhilfe mehr leisten konnten. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine therapeutische Blockade des kostimulatorischen CD28 Signals entweder in allen Spender T-Zellen oder nur in CD8+ T-Zellen vor der aGvHD schützen könnte ohne gleichzeitig das Risiko eines Rezidivs zu erhöhen. Darüber hinaus steht mit der Deletion von CD28 auf Treg Zellen ein Mausmodell der late-onset aGvHD zur Verfügung, welches für die weitere Erforschung dieser Krankheit nützlich sein kann. KW - Antigen CD28 KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Maus KW - Graft versus host disease KW - GvHD Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165863 ER - TY - THES A1 - Kaymak, Irem T1 - Identification of metabolic liabilities in 3D models of cancer T1 - Identifikation metabolischer Abhängigkeiten in 3D Tumormodellen N2 - Inefficient vascularisation of solid tumours leads to the formation of oxygen and nutrient gradients. In order to mimic this specific feature of the tumour microenvironment, a multicellular tumour spheroid (SPH) culture system was used. These experiments were implemented in p53 isogenic colon cancer cell lines (HCT116 p53 +/+ and HCT116 p53-/-) since Tp53 has important regulatory functions in tumour metabolism. First, the characteristics of the cells cultured as monolayers and as spheroids were investigated by using RNA sequencing and metabolomics to compare gene expression and metabolic features of cells grown in different conditions. This analysis showed that certain features of gene expression found in tumours are also present in spheroids but not in monolayer cultures, including reduced proliferation and induction of hypoxia related genes. Moreover, comparison between the different genotypes revealed that the expression of genes involved in cholesterol homeostasis is induced in p53 deficient cells compared to p53 wild type cells and this difference was only detected in spheroids and tumour samples but not in monolayer cultures. In addition, it was established that loss of p53 leads to the induction of enzymes of the mevalonate pathway via activation of the transcription factor SREBP2, resulting in a metabolic rewiring that supports the generation of ubiquinone (coenzyme Q10). An adequate supply of ubiquinone was essential to support mitochondrial electron transport and pyrimidine biosynthesis in p53 deficient cancer cells under conditions of metabolic stress. Moreover, inhibition of the mevalonate pathway using statins selectively induced oxidative stress and apoptosis in p53 deficient colon cancer cells exposed to oxygen and nutrient deprivation. This was caused by ubiquinone being required for electron transfer by dihydroorotate dehydrogenase, an essential enzyme of the pyrimidine nucleotide biosynthesis pathway. Supplementation with exogenous nucleosides relieved the demand for electron transfer and restored viability of p53 deficient cancer cells under metabolic stress. Moreover, the mevalonate pathway was also essential for the synthesis of ubiquinone for nucleotide biosynthesis to support growth of intestinal tumour organoids. Together, these findings highlight the importance of the mevalonate pathway in cancer cells and provide molecular evidence for an enhanced sensitivity towards the inhibition of mitochondrial electron transfer in tumour-like metabolic environments. N2 - In soliden Tumoren führt die ineffiziente Bildung von Blutgefäßen (Vaskularisierung) zu einem Nährstoff- und Sauerstoffgradienten im gesamten Tumor, welches eine spezifische Tumormikroumgebung schafft. Um diese Tumorumgebung nachzuahmen, wurde ein spezielles multi-zelluläres Tumorsphäroid (SPH) Zellkultursystem verwendet. Da Tp53 wichtige regulatorische Funktionen im Tumormetabolismus hat, wurde zur Generierung von Sphäroiden p53 isogene Darmkrebs-Zelllinen HCT116 (p53 +/+ und p53 -/-) verwendet. Zunächst wurden die Sphäroide mittels RNA Sequenzierung und Metabolomik charakterisiert, um die Genexpression und metabolischen Eigenschaften in verschiedenen Zellkulturbedingungen zu vergleichen. Diese Analyse hat gezeigt, dass gewisse Genexpressionsmuster in Tumoren wie beispielsweise Proliferations- und Hypoxia verwandte Gene in Sphäroiden übereinstimmen, nicht jedoch in Monolayer-Kulturen. Vergleicht man die zwei unterschiedlichen Genotypen miteinander, so sind Gene, die in der Cholesterinhomöostase involviert sind, in p53 defizienten Zellen induziert, nicht jedoch in p53 wildtypischen Zellen. Dieser Unterschied ist in Sphäroiden vorhanden, nicht jedoch in Monolayer-Kulturen. Verlust von p53 führt über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors SREBP2 zur Induktion von Enzymen des Mevalonat-Synthesewegs und zudem zu einer neuen metabolischen Vernetzung, die die Generierung von Ubichinon (Coenzym Q10) unterstützt. Eine ausreichende Ubichinon-Versorgung ist wichtig, um den mitochondrialen Elektronentransport und die Pyrimidin-Biosynthese in p53-defizienten Krebszellen unter metabolischen Stressbedingungen zu unterstützen. Darüber hinaus induziert die Inhibition des Mevalonat-Synthesewegs durch Statine in p53-defizienten Darmkrebszellen, die Sauerstoff und Nährstoffmangel ausgesetzt sind, selektiv oxidativen Stress und Apoptose. Verursacht wird dies durch einen Mangel an Ubichinon, welches für den Elektronentransfer der Dihydroorotatdehydrogenase, einem essentiellen Enzym der Pyrimidinnukleotid-Biosynthese, notwendig ist. Gabe von exogenen Nukleosiden entlastete die Nachfrage an Elektronentransfer und stellte die Lebensfähigkeit von p53-defizienten Krebszellen unter metabolischem Stress wieder her. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Mevalonat-Syntheseweg auch für die Synthese von Ubichinon für die Pyrimidinnukleotid-Biosynthese unerlässlich ist, um das Wachstum von Darmtumor-Organoiden zu unterstützen. Zusammengenommen interstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung des Mevalonat-Syntheseweg in Krebszellen und liefern den molekularen Mechanismus für die erhöhte Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber der Hemmung des mitochondrialen Elektronentransfers in einer Tumor-ähnlichen Stoffwechselumgebung. KW - p53 KW - cancer KW - CoQ10 KW - Tumor KW - Modell KW - Stoffwechsel Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181544 ER - TY - THES A1 - Simon, Katja T1 - Identifying the role of Myb-MuvB in gene expression and proliferation of lung cancer cells T1 - Identifizierung der Rolle des Myb-MuvB in der Genexpression und der Proliferation von Lungenkrebszellen N2 - The evolutionary conserved Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex is a transcriptional master regulator of mitotic gene expression. The MMB subunits B-MYB, FOXM1 as well as target genes of MMB are often overexpressed in different cancer types. Elevated expression of these genes correlates with an advanced tumor state and a poor prognosis for patients. Furthermore, it has been reported that pathways, which are involved in regulating the mitotic machinery are attractive for a potential treatment of cancers harbouring Ras mutations (Luo et al., 2009). This suggest that the MMB complex could be required for tumorigenesis by mediating overactivity of mitotic genes and that the MMB could be a useful target for lung cancer treatment. However, although MMB has been characterized biochemically, the contribution of MMB to tumorigenesis is largely unknown in particular in vivo. In this thesis, it was demonstrated that the MMB complex is required for lung tumorigenesis in vivo in a mouse model of non small cell lung cancer. Elevated levels of B-MYB, NUSAP1 or CENPF in advanced tumors as opposed to low levels of these proteins levels in grade 1 or 2 tumors support the possible contribution of MMB to lung tumorigenesis and the oncogenic potential of B-MYB.The tumor growth promoting function of B-MYB was illustrated by a lower fraction of KI-67 positive cells in vivo and a significantly high impairment in proliferation after loss of B-Myb in vitro. Defects in cytokinesis and an abnormal cell cycle profile after loss of B-Myb underscore the impact of B-MYB on proliferation of lung cancer cell lines. The incomplete recombination of B-Myb in murine lung tumors and in the tumor derived primary cell lines illustrates the selection pressure against the complete loss of B-Myb and further demonstrats that B-Myb is a tumor-essential gene. In the last part of this thesis, the contribution of MMB to the proliferation of human lung cancer cells was demonstrated by the RNAi-mediated depletion of B-Myb. Detection of elevated B-MYB levels in human adenocarcinoma and a reduced proliferation, cytokinesis defects and abnormal cell cycle profile after loss of B-MYB in human lung cancer cell lines underlines the potential of B-MYB to serve as a clinical marker. N2 - Der evolutionär konservierte Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex ist ein transkriptionaler Meisterregulator der mitotischen Genexpression. Die MMB Untereinheiten B-MYB, FOXM1 und ihre Zielgene sind oft überexprimiert in verschiedenen Krebsarten. Die erhöhte Expression dieser Gene korreliert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium und einer schlechten Prognose für Patienten. Außerdem wurde berichtet, dass Signalwege, die die Mitosemaschinerie betreffen, reizvoll sind als mögliches Target für die Behandlung von Ras mutierten Krebsarten (Lao et al., 2009). Dies weißt auf darauf hin, dass der MMB Komplex an der Tumorentstehung beteiligt sein könnte, indem er die Überexpression mitotischer Gene fördert und damit ein geeignetes Target zur Behandlung von Krebs darstellen könnte. Obwohl der MMB biochemisch eingehend untersucht wurde, ist die Beteiligung des MMB an der Tumorgenese weitestgehend unbekannt speziell in vivo. In dieser Doktorarbeit wurde anhand eines NSCLC Mausmodells gezeigt, dass der MMB für die Lungentumorgenese in vivo erforderlich ist. Erhöhte Level von B-MYB, NUSAP1 oder CENPF in fortgeschrittenen Tumoren und im Gegenzug niedrigen Leveln in Grad 1 und 2 Tumoren unterstreichen die mögliche Beteiligung des MMB an der Lungentumorgenese und das onkogene Potential von B-MYB. Die Tumorwachstum-fördernde Funktion von B-MYB wurde veranschaulicht durch eine geringere Anzahl an KI-67 positiven Zellen in vivo und einem signifikant hohen Beeinträchtigung der Proliferation nach dem Verlust von B-MYB in vitro. Defekte in der Zytokinese und ein abnormales Zellzyklusprofil nach dem Verlust von B-MYB heben den Einfluss von B-Myb auf die Proliferation von Lungenkrebszelllinien hervor. Die unvollständige Rekombination von B-Myb in murinen Lungentumoren und den daraus hergestellten primären Tumorzelllinien veranschaulichen den Selektionsdruck auf den kompletten Verlust von B-MYB und zeigen zusätzlich, dass B-MYB ein für den Tumor essentielles Gen ist. Im letzten Teil der Doktorarbeit konnte die Beteiligung des MMB auf die Proliferation auf Lungenkrebszellen gezeigt werden durch den Verlust von B-MYB durch RNAi-Interferenz (RNAi). Detektion erhöhter B-Myb Level in humanen Adenokarzinomen und eine verminderte Proliferation, Zytokinese-Defekte und ein abnormales Zellzyklusprofil nach B-MYB Verlust in humanen Lungenkrebszelllinien unterstreichen das Potential von B-MYB als klinischer Marker zu fungieren. KW - Lungenkrebs KW - MMB KW - B-MYB KW - K-RAS KW - lung cancer KW - Mitose KW - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161814 ER - TY - THES A1 - Heck, Johannes T1 - Role of cyclase-associated protein 2 in platelet function and description of an inherited macrothrombocytopenia T1 - Rolle von cyclase-associated protein 2 in der Thrombozytenfunktion und Beschreibung einer erblich bedingten Makrothrombozytopenie N2 - Cyclase-associated protein (CAP)2 is an evolutionarily highly conserved actin-binding protein implicated in striated muscle development, carcinogenesis, and wound healing in mammals. To date, the presence as well as the putative role(s) of CAP2 in platelets, however, remain unknown. Therefore, mice constitutively lacking CAP2 (Cap2gt/gt mice) were examined for platelet function. These studies confirmed the presence of both mammalian CAP isoforms, CAP1 and CAP2, in platelets. CAP2-deficient platelets were slightly larger than WT controls and displayed increased GPIIbIIIa activation and P-selectin recruitment in response to the (hem)ITAM-specific agonists collagen-related peptide and rhodocytin. However, spreading of CAP2-deficient platelets on a fibrinogen matrix was unaltered. In conclusion, the functionally redundant CAP1 isoform may compensate for the lack of CAP2 in murine platelets. Moreover, the studies presented in this thesis unveiled a severe macrothrombocytopenia that occurred independently of the targeted Cap2 allele and which was preliminarily termed orphan (orph). Crossing of the respective mice to C57BL/6J wild-type animals revealed an autosomal recessive inheritance. Orph mice were anemic and developed splenomegaly as well as BM fibrosis, suggesting a general hematopoietic defect. Strikingly, BM MKs of orph mice demonstrated an aberrant morphology and appeared to release platelets ectopically into the BM cavity, thus pointing to defective thrombopoiesis as cause for the low platelet counts. Orph platelets exhibited marked activation defects and spread poorly on fibrinogen. The unaltered protein content strongly suggested a defective alpha-granule release to account for the observed hyporesponsiveness. In addition, the cytoskeleton of orph platelets was characterized by disorganized microtubules and accumulations of filamentous actin. However, further experiments are required to elucidate the activation defects and cytoskeletal abnormalities in orph platelets. Above all, the gene mutation responsible for the phenotype of orph mice needs to be determined by next-generation sequencing in order to shed light on the underlying genetic and mechanistic cause. N2 - Cyclase-associated protein 2 (CAP)2 ist ein evolutionär hoch konserviertes Aktin-bindendes Protein, welches in der Entwicklung der quergestreiften Muskulatur, der Krebsentstehung und der Wundheilung von Säugetieren eine Rolle spielt. Bis heute sind jedoch das Vorhandensein sowie die mutmaßliche(n) Funktion(en) von CAP2 in Thrombozyten unbekannt. Aus diesem Grund wurden Mäuse, denen konstitutiv CAP2 fehlt (Cap2gt/gt-Mäuse), im Hinblick auf ihre Thrombozytenfunktion untersucht. Diese Untersuchungen bestätigten die Anwesenheit beider Säugetierisoforme von CAP, CAP1 und CAP2, in Thrombozyten. CAP2-defiziente Thrombozyten waren geringfügig größer als WT-Kontrollen und zeigten eine erhöhte GPIIbIIIa-Aktivierung und P-Selektin-Rekrutierung nach Stimulation durch die (hem)ITAM-spezifischen Agonisten collagen-related peptide und Rhodozytin. Demgegenüber verlief die Adhäsion (sog. spreading) CAP2-defizienter Thrombozyten auf einer Fibrinogen-Matrix unverändert. Dies legt den Schluss nahe, dass die funktionell redundante CAP1-Isoform in der Lage ist, den Mangel an CAP2 in Mäusethrombozyten zu kompensieren. Darüber hinaus offenbarten die in dieser Dissertation präsentierten Untersuchungen eine schwere Makrothrombozytopenie, welche unabhängig von dem veränderten Cap2-Allel auftrat und welche vorläufig als orphan (orph) bezeichnet wurde. Das Kreuzen der entsprechenden Mäuse mit C57BL/6J-Wildtyp-Tieren enthüllte einen autosomal rezessiven Erbgang. Orph-Mäuse waren anämisch und entwickelten eine Milzvergrößerung sowie eine Knochenmarkfibrose, was einen generellen hämatopoetischen Defekt nahelegte. Bemerkenswerterweise waren Knochenmarksmegakaryozten von orph-Mäusen morphologisch auffällig und gaben allem Anschein nach Thrombozyten ektop in das Knochenmarkstroma ab, was auf eine defekte Thrombopoese als Ursache für die niedrigen Thrombozytenzahlen hindeutet. Orph-Thrombozyten zeigten ausgesprochene Aktivierungsdefekte und adhärierten kaum auf Fibrinogen. Der unveränderte Gehalt an Proteinen lenkte den Verdacht auf eine defekte Exozytose von Alpha-Granula als Ursache der Mindererregbarkeit. Des Weiteren war das Zytoskelett von orph-Thrombozyten durch unorganisierte Mikrotubuli und Akkumulationen von filamentösem Aktin charakterisiert. Weitere Experimente sind jedoch notwendig, um die Aktivierungsdefekte und die Zytoskelettveränderungen aufzuklären. Vor allem aber muss die Genmutation, welche für den Phänotyp der orph-Mäuse verantwortlich ist, mittels Sequenziermethoden der nächsten Generation (next-generation sequencing) aufgeklärt werden um Aufschluss über die zugrunde liegende genetische und mechanistische Ursache zu geben. KW - Thrombozyt KW - Actin KW - Actin-bindende Proteine KW - Thrombozytopenie KW - platelets KW - actin cytoskeleton KW - actin-binding proteins KW - cyclase-associated protein KW - cyclase-associated protein 2 KW - inherited macrothrombocytopenia Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179968 ER - TY - THES A1 - Awad, Eman Da'as T1 - Modulation of insulin-induced genotoxicity in vitro and genomic damage in gestational diabetes T1 - Modulation der Insulin-induzierten Genotoxizität in vitro und Genomschäden bei Frauen mit Gestationsdiabetes N2 - Diabetes mellitus is a global health problem, where the risk of diabetes increases rapidly due to the lifestyle changes. Patients with type II diabetes have many complications with increased risk of morbidity and mortality. High levels of insulin may lead to DNA oxidation and damage. Several studies proposed that hyperinsulinemia may be an important risk factor for various types of cancer. To investigate insulin signaling pathway inducing oxidative stress and genomic damage, pharmaceutical and natural compounds which can interfere with the insulin pathway including PI3K inhibitors, resveratrol, lovastatin, and RAD-001 were selected due to their beneficial effects against metabolic disorder. Thus, the anti-genotoxic potential of these compounds regarding insulin-mediated oxidative stress were investigated in normal rat kidney cells in vitro. Our compounds showed protective effect against genotoxic damage and significantly decreased reactive oxygen specious after treatment of cells with insulin with different mechanisms of protection between the compounds. Thus, these compounds may be attractive candidates for future support of diabetes mellitus therapy. Next, we explored the link between gestational diabetes mellitus and genomic damage in cells derived from human blood. Moreover, we investigated the influence of estradiol, progesterone, adrenaline and triiodothyronine on insulin-induced genomic damage in vitro. First, we studied the effect of these hormones in human promyelocytic leukemia cells and next ex vivo with non-stimulated and stimulated peripheral blood mononuclear cells. In parallel, we also measured the basal genomic damage using three conditions (whole blood, non-stimulated and stimulated peripheral blood mononuclear cells) in a small patient study including non-pregnant controls with/without hormonal contraceptives, with a subgroup of obese women, pregnant women, and gestational diabetes affected women. A second-time point after delivery was also applied for analysis of the blood samples. Our results showed that GDM subjects and obese individuals exhibited higher basal DNA damage compared to lower weight nonpregnant or healthy pregnant women in stimulated peripheral blood mononuclear cells in both comet and micronucleus assays. On the other hand, the DNA damage in GDM women had decreased at two months after birth. Moreover, the applied hormones also showed an influence in vitro in the enhancement of the genomic damage in cells of the control and pregnant groups but this damage did not exceed the damage which existed in obese and gestational diabetes mellitus patients with high level of genomic damage. In conclusion, insulin can induce genomic damage in cultured cells, which can be modulated by pharmaceutical and naturals substances. This may be for future use in the protection of diabetic patients, who suffer from hyperinsulinemia during certain disease stages. A particular form of diabetes, GDM, was shown to lead to elevated DNA damage in affected women, which is reduced again after delivery. Cells of affected women do not show an enhanced, but rather a reduced sensitivity for further DNA damage induction by hormonal treatment in vitro. A potential reason may be an existence of a maximally inducible damage by hormonal influences. N2 - Diabetes mellitus stellt eine globales Gesundheitsproblem dar, das aufgrund der sich ändernden Lebensführung rapide ansteigt. Bei Patienten mit Diabetes Typ II kommt es verstärkt zu Komplikationen, was eine erhöhte Morbidität und Mortalität zur Folge hat. Ein hoher Insulinspiegel kann zur DNA-Oxidation und damit zu DNA-Schäden führen. Diverse Studien postulieren, dass Hyperinsulinämie ein entscheidender Risikofaktor für verschiedene Krebserkrankungen darstellt. Zur Untersuchung des Insulin- Signaltransduktionsweg, über den oxidativer Stress und daraus resultierender Genomschäden induziert werden, wurden aus diversen Pharmazeutika und Naturstoffen, welche den Insulin-Signalweg beeinträchtigen, PI3K Inhibitoren, Resveratrol, Lovastatin und RAD-001 aufgrund ihrer positiven Effekte bei Stoffwechselerkrankungen, ausgewählt. Mit diesen Verbindungen wurde die anti-Genotoxizität (Schutzwirkung) hinsichtlich des durch Insulin induzierten oxidativen Stresses und Genomschadens in einer primären Nierenzelllinie der Ratte in vitro untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten protektive Effekte der ausgewählten Substanzen hinsichtlich genotoxischer Schäden sowie einen signifikanten Rückgang reaktiver Sauerstoffspezies bei insulinbehandelten Zellen, wobei der Wirkmechanismus zwischen den Substanzen jedoch unterschiedlich war. Somit handelt es sich bei den untersuchten Stoffen um äußerst interessante Verbindungen, die in der Zukunft Diabetes mellitus Therapien unterstützen könnten. Außerdem untersuchten wir den Zusammenhang zwischen Schwangerschaftsdiabetes und Genomschäden in humanen Blutzellen. Dafür verwendeten wir neben humanen HL-60 Zellen nicht stimulierte sowie mit Hilfe von Phytohemagglutinin (PHA) zur Aufnahme des Zellzyklus stimulierte periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden sowie von Gestationsdiabetes betroffenen Probandinnen. Wir analysierten zunächst den Einfluss von Östradiol, Progesteron, Adrenalin und Triiodthyronin auf den Genomschaden dieser Zellen in vitro.. Parallel dazu bestimmten wir in die basalen Genomschäden im Vollblut, in nicht stimulierten sowie in PHA-stimulierten peripheren mononukleären Blutzellen. Diese Studie schloss nicht-schwangere Frauen mit bzw. ohne Einnahme hormoneller Kontrazeptiva sowie je eine Subgruppen mit übergewichtigen Frauen, gesunden schwangeren Frauen und Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes ein. Bei Schwangeren wurde einige Zeit nach der Entbindung eine zweite Blutuntersuchung durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes sowie übergewichtige Frauen im Vergleich zu normalgewichtigen, nicht-schwangeren Frauen sowie gesunden schwangeren Frauen mehr basale DNA-Schäden sowohl im Comet-Assay als auch im Mikrokern-Test in stimulierten peripheren mononuklearen Zellen aufweisen. Des Weiteren sanken die DNA-Schäden bei Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes zwei Monate nach der Geburt. Darüber hinaus verstärkten die verwendeten Hormone in vitro die zellulären Genomschäden, jedoch überstiegen sie nicht die größere Menge an DNA-Schäden, welche bei übergewichtigen Frauen bzw. Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes nachgewiesenen wurden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Insulin Zellschäden in vitro induzieren kann, die jedoch durch Pharmazeutika und Naturstoffen reguliert werden können. Diese Erkenntnis könnte zukünftig Diabetespatienten helfen, die an Hyperinsulinämie leiden. Schwangerschaftsdiabetes, eine besondere Form des Diabetes, führt zu erhöhten DNASchäden bei betroffenen Frauen, die sich nach der Geburt jedoch wieder verringern. Die Zellen betroffener Frauen zeigen keine erhöhte, sondern vielmehr eine verminderte Sensitivität für weiteren DNA-Schäden durch hormonelle Behandlung in vitro. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass eine maximal induzierbare Zahl an DNASchäden, die durch hormonelle Einflüsse bzw. daraus resultierenden Aktivierungen von Signalkaskaden hervorgerufen werden können, existiert. KW - Gestationsdiabetes KW - DNA-Schäden KW - Insulin KW - Gestational diabetes KW - DNA damage Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161866 ER - TY - THES A1 - Kruber, Philip T1 - Functional analysis of DROSHA and SIX1 mutations in kidney development and Wilms tumor T1 - Funktionelle Analysen von DROSHA und SIX1 Mutationen in der Nierenentwicklung und dem Wilms Tumor N2 - Wilms tumor (WT) is the most common kidney cancer in childhood. It is a genetically heterogeneous tumor and several genetic alterations have been identified in WT patients. Recurrent mutations were found in the homeo-domain of SIX1 and SIX2 in high proliferative tumors (18.1% of the blastemal-type tumors) as well as in the microprocessor genes DROSHA and DGCR8 (18.2% of the blastemal-type tumors), indicating a critical role of the SIX-SALL pathway and aberrant miRNA processing in WT formation. Underlined by the fact that a significant overlap between mutations in DROSHA and SIX1 was found, indicating a synergistic effect. To characterize the in vivo role of DROSHA and SIX mutations during kidney development and their oncogenic potential, I analyzed mouse lines with either a targeted deletion of Drosha or an inducible expression of human DROSHA or SIX1 carrying a tumor-specific E1147K or Q177R mutation, respectively. The DROSHA mutation E1147K was predicted to act in a dominant negative manner. Six2-cre mediated deletion of Drosha in nephron progenitors led to a lethal phenotype with apoptotic loss of progenitor cells and early termination of nephrogenesis. Mosaic deletions via Wt1-creERT2 resulted in a milder phenotype with viable offspring that developed proteinuria after 2-4 weeks, but no evidence of tumor formation. Activation of the DROSHA-E1147K transgene via Six2-cre, on the other hand, induced a more severe phenotype with apoptosis of progenitor cells, proteinuria and glomerular sclerosis. The severely growth-retarded mice died within the first two months. This strong phenotype was consistent with the predicted dominant-negative effect of DROSHA-E1147K. Analysis of the SIX1-Q177R mutation suggested that the mutation leads to a shift in DNA binding specificity instead of a complete loss of DNA binding. This may end up in subtle changes of the gene regulatory capacity of SIX1. Six2-cre mediated activation of SIX1-Q177R lead to a viable phenotype with no alterations or shortened life span. Yet a global activation of SIX1-Q177R mediated by Zp3-cre resulted in bilateral hydronephrosis and juvenile death of the mice. To mimic the synergistic effect of DROSHA and SIX1 mutations, I generated compound mutants in two combinations: A homozygous deletion of Drosha combined with an activation of SIX1-Q177R and a compound mutant with activation of DROSHA-E1147K and SIX1-Q177R. Each mouse model variant displayed new phenotypical alterations. Mice with Six2-cre mediated homozygous deletion of Drosha and activation of SIX1-Q177R were not viable, yet heterozygous deletion of Drosha and activation of SIX1-Q177R led to hydronephrosis, proteinuria and an early death around stage P28. Combined activation of DROSHA-E1147K and SIX1-Q177R under Six2-cre resulted in proteinuria, glomerulosclerosis and lesions inside the kidney. These mice also suffered from juvenile death. Both mouse models could confirm the predicted synergistic effect. While these results underscore the importance of a viable self-renewing progenitor pool for kidney development, there was no evidence of tumor formation. This suggests that either additional alterations in mitogenic or antiapoptotic pathways are needed for malignant transformation, or premature loss of a susceptible target cell population and early lethality prevent WT formation. N2 - Der Wilms Tumor ist der am häufigsten auftretende Nierentumor im Kindesalter. Er ist genetisch heterogen und bisher wurden bereits verschiedene genetische Mutationen in Wilms Tumor Patienten gefunden. Es konnten wiederkehrende Mutationen in der Homeo-Domäne der Gene SIX1 und SIX2 und in den Genen des Mikroprozessorkomplexes DROSHA und DGCR8 gefunden werden. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass einerseits die gestörte Prozessierung von miRNAs und andererseits der SIX-SALL Signalweg eine wichtige Rolle im Entstehungsprozess des Wilms Tumors spielen. Des Weiteren konnte die Analyse der blastem-reichen Tumore einen möglichen synergetischen Effekt zwischen DROSHA und SIX1 aufzeigen. Um die Bedeutung von DROSHA und SIX Mutationen für die Nierenentwicklung und für die Tumorgenese in vivo zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit Mausmodelle mit konditioneller Deletion von DROSHA oder induzierbarer Expression der DROSHA Mutation E1147K bzw. der SIX1 Mutation Q177R analysiert. Es wurde vermutet, dass die E1147K Mutation einen dominant-negativen Effekt besitzt. Six2-cre vermittelte Deletion von DROSHA in Nierenvorläuferzellen führte zu einem letalen Phänotyp, der sich durch Apoptose von Vorläuferzellen und vorzeitigen Abbruch der Nephrogenese auszeichnete. Mosaik-Deletion mittels Wt1-creERT2 führte zu einem deutlich milderen Phänotyp. Die Nachkommen waren lebensfähig, entwickelten aber innerhalb der ersten 2-4 Wochen eine Proteinurie. Bei beiden, so erzeugten, Mauslinien konnten keine Tumorbildung feststellen werden. Aktivierung des DROSHA-E1147K Transgenes durch Six2-cre brachte einen deutlich gravierenderen Phänotyp hervor. Dieser zeichnete sich durch Apoptose von Vorläuferzellen, sowie Proteinurie und Glomerulosklerose aus. Die im Wachstum stark retardierten Mäuse starben innerhalb der ersten zwei Monate nach der Geburt. Dieser Phänotyp unterstreicht den vermuteten dominant-negativen Effekt von DROSHA-E1147K auch in vivo. Analysen der Q177R Mutation konnten zeigen, dass diese Mutation in der Homeo-Domäne des SIX1 Genes wahrscheinlich nicht zu einem kompletten Verlust der Fähigkeit, DNA zu binden, führt, sondern eher eine leichte Verschiebung der DNA Bindespezifität als Folge hat. Das könnte eine subtile Veränderung in der Fähigkeit von SIX1 Gene zu regulieren bedeuten. Six2-cre vermittelte Aktivierung des SIX1-Q177R Transgenes hatte jedoch keinen sichtbaren Effekt für den Phänotyp der Mäuse. Dennoch hatte eine globale Aktivierung des Transgenes durch Zp3-cre bilaterale Hydronephrose und einen frühzeitigen Tod der Mäuse zur Folge. Um den bereits vermuteten Synergieeffekt zwischen DROSHA-E1147K und SIX1-Q177R zu untersuchen, wurden zwei neue Mausgenotypen erzeugt. Einerseits wurde eine Mauslinie mit dem SIX1-Q177R Transgen und der Drosha Deletion, andererseits eine Mauslinie, die sowohl das SIX1-Q177R Transgen, als auch das DROSHA-E1147K Transgen besitzt, verpaart. Beide Mauslinien entwickelten jeweils neue Phänotypen. Mäuse mit Six2-cre vermittelter, homozygoter Deletion von Drosha und gleichzeitiger Aktvierung von SIX1-Q177R waren nicht lebensfähig, während Mäuse mit heterozygoter Deletion von Drosha und gleichzeitiger Aktvierung von SIX1-Q177R sehr wohl lebensfähig waren. Diese Mäuse entwickelten wiederum Hydronephrose, sowie Proteinurie und verstarben innerhalb des ersten Lebensmonats. Kombinierte Aktivierung von DROSHA-E1147K und SIX1-Q177R mittels Six2-cre führte ebenfalls zu Proteinurie. Jedoch litten die Mäuse nicht an Hydronephrose, sondern an Glomerulosklerose und Zystenbildung. Ebenfalls starben die Mäuse einen frühzeitigen Tod. Beide Mausmodelle konnten, durch die Ausprägung neuer Phänotypen, den vermuteten Synergieeffekt beweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen deutlich, wie wichtig ein lebensfähiger Zellpool an selbst-erneuernden Vorläuferzellen für die Nierenentwicklung ist. Dennoch konnten keine Anzeichen für eine Tumorbildung gefunden werden. Das lässt vermuten, dass weitere genetische Veränderungen z.B. in mitogenen oder anti-apoptotischen Signalwegen von Nöten sind, um eine maligne Transformation zu gewährleisten. Natürlich könnte auch der frühzeitige Verlust der verantwortlichen Zellpopulation und das frühe Absterben der Embryos ein Hindernis für die Wilms Tumorbildung sein. KW - Nephroblastom KW - micro processor complex KW - DROSHA KW - Wilms tumor KW - kidney development KW - SIX1 KW - Nephrogenese KW - Wilms-Tumor KW - microRNA KW - Genmutation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161418 ER - TY - THES A1 - Kiser, Dominik Pascal T1 - Gene x Environment Interactions in Cdh13-deficient Mice: CDH13 as a Factor for Adaptation to the Environment T1 - Gen x Umwelt-Interaktionen in Cdh13-defizienten Mäusen: CDH13 als ein Faktor für Umweltanpassung N2 - Neurodevelopmental disorders, including attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder (ASD) are disorders of mostly unknown etiopathogenesis, for which both genetic and environmental influences are expected to contribute to the phenotype observed in patients. Changes at all levels of brain function, from network connectivity between brain areas, over neuronal survival, synaptic connectivity and axonal growth, down to molecular changes and epigenetic modifications are suspected to play a key roles in these diseases, resulting in life-long behavioural changes. Genome-wide association as well as copy-number variation studies have linked cadherin-13 (CDH13) as a novel genetic risk factor to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. CDH13 is highly expressed during embryonic brain development, as well as in the adult brain, where it is present in regions including the hippocampus, striatum and thalamus (among others) and is upregulated in response to chronic stress exposure. It is however unclear how CDH13 interacts with environmentally relevant cues, including stressful triggers, in the formation of long-lasting behavioural and molecular changes. It is currently unknown how the environment influences CDH13 and which long term changes in behaviour and gene expression are caused by their interaction. This work therefore investigates the interaction between CDH13 deficiency and neonatal maternal separation (MS) in mice with the aim to elucidate the function of CDH13 and its role in the response to early-life stress (ELS). For this purpose, mixed litters of wild-type (Cdh13+/+), heterozygous (Cdh13+/-) and homozygous knockout (Cdh13-/-) mice were maternally separated from postnatal day 1 (PN1) to postnatal day 14 (PN14) for 3 hours each day (180MS; PN1-PN14). In a first series of experiments, these mice were subjected to a battery of behavioural tests starting at 8 weeks of age in order to assess motor activity, memory functions as well as measures of anxiety. Subsequently, expression of RNA in various brain regions was measured using quantitativ real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). A second cohort of mice was exposed to the same MS procedure, but was not behaviourally tested, to assess molecular changes in hippocampus using RNA sequencing. Behavioural analysis revealed that MS had an overall anxiolytic-like effect, with mice after MS spending more time in the open arms of the elevated-plus-maze (EPM) and the light compartment in the light-dark box (LDB). As a notable exception, Cdh13-/- mice did not show an increase of time spent in the light compartment after MS compared to Cdh13+/+ and Cdh13+/- MS mice. During the Barnes-maze learning task, mice of most groups showed a similar ability in learning the location of the escape hole, both in terms of primary latency and primary errors. Cdh13-/- control (CTRL) mice however committed more primary errors than Cdh13-/- MS mice. In the contextual fear conditioning (cFC) test, Cdh13-/- mice showed more freezing responses during the extinction recall, indicating a reduced extinction of fear memory. In the step-down test, an impulsivity task, Cdh13-/- mice had a tendency to wait longer before stepping down from the platform, indicative of more hesitant behaviour. In the same animals, qRT-PCR of several brain areas revealed changes in the GABAergic and glutamatergic systems, while also highlighting changes in the gatekeeper enzyme Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a), both in relation to Cdh13 deficiency and MS. Results from the RNA sequencing study and subsequent gene-set enrichment analysis revealed changes in adhesion and developmental genes due to Cdh13 deficiency, while also highlighting a strong link between CDH13 and endoplasmatic reticulum function. In addition, some results suggest that MS increased pro-survival pathways, while a gene x environment analysis showed alterations in apoptotic pathways and migration, as well as immune factors and membrane metabolism. An analysis of the overlap between gene and environment, as well as their interaction, highlighted an effect on cell adhesion factors, underscoring their importance for adaptation to the environment. Overall, the stress model resulted in increased stress resilience in Cdh13+/+ and Cdh13+/- mice, a change absent in Cdh13-/- mice, suggesting a role of CDH13 during programming and adaptation to early-life experiences, that can results in long-lasting consequences on brain functions and associated behaviours. These changes were also visible in the RNA sequencing, where key pathways for cell-cell adhesion, neuronal survival and cell-stress adaptation were altered. In conclusion, these findings further highlight the role of CDH13 during brain development, while also shedding light on its function in the adaptation and response during (early life) environmental challenges. N2 - Neuronale Entwicklungsstörungen (NES), wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) oder Autismus Spektrums Störung (ASS), haben eine größtenteils unbekannte Krankheitsentwicklung, deren klinisches Erscheinungsbild bei dem Patienten durch die individuelle Genetik und Umwelt beieinflusst wird. Veränderungen in allen funktionellen Ebenen des Gehirns, von Netzwerkaktivität zwischen unterschiedlichen Gehirnregionen, über synaptischer Verschaltung, axonalem Wachstum und den Überlebenschancen einzelner Neuronen, bis hin zu molekularen und epigenetischen Modifikationen werden als Schlüsselrollen in NES betrachtet, welche schlussendlich zu langfristigen Verhaltensauffälligkeiten führen. Genome-weite-Assoziations und genomische Kopiezahlvariations Studien haben Cadherin 13 (CDH13) als neuartiges Risikogen für neuropsychiatrische und neuronale Entwicklungsstörungen identifizieren können. CDH13 wird sowohl während der embryonalen Entwicklung, als auch im adulten Gehirn, stark exprimiert und kann dort in Regionen wie dem Hippocampus, Striatum und Thalamus gefunden werden. Darüber hinaus wird es als Reaktion auf akuten (physiologischen und psychologischen) Stress exprimiert. Gegenwärtig ist jedoch nicht bekannt, wie Umwelteinflüsse mit CDH13 interagieren und langanhaltende Veränderungen im Verhalten und der Gene Expression im Gehirn herbeiführen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die Interaktion zwischen CDH13 und Stress während eines frühen Lebensabschnitts. Hierfür wurden Würfe mit wildtyp (Cdh13+/+), heterozygoten (Cdh13+/-) und homozygoten knockout (Cdh13-/-) Mäusen zwischen dem ersten und vierzehnten Tag nach der Geburt für jeweils 3 Stunden von ihren Müttern getrennt (englisch: maternal separation, MS). In einem ersten Experiment wurden diese Mäuse dann im Alter von 8 Wochen in einer Reihe von Verhaltensversuchen auf ihre motorischen Fähigkeiten und Gedächtnisleistung getestet. Im Anschluss daran wurde mittels der quantitativen Polymerase Kettenreaktion (qPCR) verschiedene Gehirnregionen dieser Tiere auf Expressionsunterschiede in Faktoren für Neurotransmittersysteme, Neurogenese und DNA Methylierungsmechanismen hin analysiert. Das Hippocampus-Gewebe einer zweiten gleich aufgebauten Versuchsgruppe wurde mittels RNA Sequenzierung untersucht. Die Verhaltensanalyse zeigt das MS einen überwiegend angst-lindernden Einfluss auf die Mäuse hatte. Im Vergleich zu Mäusen ohne MS verbrachten MS-Mäuse mehr Zeit auf dem offenen Arm eines erhöhten Plus-Labyrinths, so wie in der hell-erleuchteten Seite einer Hell-Dunkel Box (HDB). Eine auffallende Ausnahme stellten jedoch die Cdh13-/- Mäuse dar, welche in der HDB keinen Zeitanstieg wie ihre Cdh13+/+ und Cdh13+/- MS Geschwister auf der hell-erleuchteten Seite aufwiesen. In dem Barnes Labyrinth (einem Test für räumliches Lernen) zeigte sich, dass alle Tiere, gemessen an den Fehlern und der Zeit die sie brauchten bis sie den Ausgang fanden, zunächst ähnliche Lernerfolge hatten. Im zweiten Teil des Experiments, in dem der Ausgang auf eine neue Position gelegt wurde, begangen Cdh13-/- Mäuse ohne MS hingegen mehr Fehler als Cdh13-/- MS Mäusee. In der Kontext-Angst-Konditionierung (KAK) zeigten männliche Cdh13-/- Mäuse mehr Angst-Starre während der Extinktions-Wiederholung; ein Befund der eine reduzierte Angst-Auslöschung impliziert. Im Abstiegs-Test, einem Impulsivitätstest, blieben Cdh13-/- Mäuse länger auf einem Podest stehen. Mittels qPCR konnte außerdem gezeigt werden dass sowohl ein Cdh13-/- Defizit, als auch MS, Veränderungen von GABAergen und glutamatergen Faktoren, so wie Änderungen in dem wichtigen Signalmolekühl Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a) verursacht haben. Die Ergebnisse der RNA Sequenzierung zeigten eine Anreicherung von Veränderungen in Adhesions-, Entwicklungs- und Endoplasmatischen Reticulumgenen in Cdh13-/- defiziten Tieren im Vergleich zu Cdh13+/+ Mäusen. Im selben Versuch trug MS zu einer erhöhten Aktivierung von Anti-Apoptotischen Signalwegen im Hippocampus bei, während Zell-Adhesionsmoleküle maßgeblich von der Wechselwirkung beider Faktoren betroffen waren. Zusammenfassend waren Cdh13+/+ und Cdh13+/- Mäuse im Gegensatz zu Cdh13-/- Tieren größtenteils stressresitenter, während die RNA Sequenzierung aufzeigte, dass CDH13 Schlüsselkomponenten von Zell-Zell-Adhesions, Überlebens und Zell-Stress-Signalwegen reguiert. Dies suggeriert, dass CDH13 die Programmierung und Anpassung an Umwelteinflüsse steuert, was wiederum lang anhaltende Auswirkungen auf molekularer Ebene und auf das Verhalten der Mäuse zur Folge hat. Abschließend legen die Befunde eine Rolle von CDH13 in der Umgebungsanpassung während der Entwicklung nahe. KW - Cadherine KW - Genexpression KW - Tiermodell KW - Animales Nervensystem KW - Verhalten KW - Cdh13 KW - RNA Sequencing KW - Gene by Environment KW - Neurodevelopmental Disorder KW - ADHD KW - Hippocampus KW - Prefrontal cortex KW - Amygdala KW - Raphe KW - Adaptation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179591 ER -