TY - THES A1 - Karch, Oliver T1 - Where am I? - Indoor localization based on range measurements T1 - Wo bin ich? - Lokalisation mit Hilfe von Entfernungsmesswerten N2 - Nowadays, robotics plays an important role in increasing fields of application. There exist many environments or situations where mobile robots instead of human beings are used, since the tasks are too hazardous, uncomfortable, repetitive, or costly for humans to perform. The autonomy and the mobility of the robot are often essential for a good solution of these problems. Thus, such a robot should at least be able to answer the question "Where am I?". This thesis investigates the problem of self-localizing a robot in an indoor environment using range measurements. That is, a robot equipped with a range sensor wakes up inside a building and has to determine its position using only its sensor data and a map of its environment. We examine this problem from an idealizing point of view (reducing it into a pure geometric one) and further investigate a method of Guibas, Motwani, and Raghavan from the field of computational geometry to solving it. Here, so-called visibility skeletons, which can be seen as coarsened representations of visibility polygons, play a decisive role. In the major part of this thesis we analyze the structures and the occurring complexities in the framework of this scheme. It turns out that the main source of complication are so-called overlapping embeddings of skeletons into the map polygon, for which we derive some restrictive visibility constraints. Based on these results we are able to improve one of the occurring complexity bounds in the sense that we can formulate it with respect to the number of reflex vertices instead of the total number of map vertices. This also affects the worst-case bound on the preprocessing complexity of the method. The second part of this thesis compares the previous idealizing assumptions with the properties of real-world environments and discusses the occurring problems. In order to circumvent these problems, we use the concept of distance functions, which model the resemblance between the sensor data and the map, and appropriately adapt the above method to the needs of realistic scenarios. In particular, we introduce a distance function, namely the polar coordinate metric, which seems to be well suited to the localization problem. Finally, we present the RoLoPro software where most of the discussed algorithms are implemented (including the polar coordinate metric). N2 - Heutzutage spielen autonome Roboter bei einer wachsenden Zahl von Anwendungsgebieten eine entscheidende Rolle. Sie werden überall dort anstelle von menschlichen Arbeitskräften eingesetzt, wo die jeweiligen Aufgaben für Menschen zu gefährlich, unangenehm, monoton oder schlicht zu teuer sind. Dabei sind die Autonomie und Mobilität des Roboters sehr oft grundlegend für eine gute Problemlösung. Ein solcher Roboter sollte also zumindest die Frage "Wo bin ich?" zufriedenstellend beantworten können. Diese Arbeit behandelt das Problem der Selbstlokalisation in einer Gebäudeumgebung mit Hilfe von Entfernungsmesswerten. Das heißt, ein Roboter - ausgestattet mit einem Entfernungssensor - wacht innerhalb eines Gebäudes auf und muss mit Hilfe seiner Sensordaten und einer Karte seiner Einsatzumgebung seine Position bestimmen. Wir betrachten eine idealisierte Variante dieser Aufgabe, die ein rein geometrisches Problem zum Inhalt hat, und untersuchen ein Verfahren von Guibas, Motwani und Raghavan aus dem Gebiet der Algorithmischen Geometrie, welches dieses löst. Hierbei spielen sogenannte Sichtbarkeitsskelette (vergröberte Darstellungen von Sichtbarkeitspolygonen) eine entscheidende Rolle. Im Hauptteil der Arbeit analysieren wir die Strukturen und die auftretenden Komplexitäten im Rahmen dieses Verfahrens. Es stellt sich heraus, dass die Hauptschwierigkeiten sogenannte überlappende Einbettungen von Skeletten in das Kartenpolygon zur Ursache haben, für die wir einige einschränkende Sichtbarkeitsbedingungen zeigen. Gestützt auf diese Resultate können wir die auftretenden Komplexitätsschranken dahingehend verbessern, dass wir diese nicht nur in Abhängigkeit der Gesamtzahl aller Kartenecken angeben, sondern in Abhängigkeit der Zahl der konkaven Ecken. Dies hat ebenfalls Auswirkungen auf die Worst-Case-Schranken für die Preprocessing-Komplexität des Verfahrens. Der zweite Teil der Arbeit vergleicht die anfangs gemachten idealisierenden Annahmen mit den Gegebenheiten realer Umgebungen und adressiert die auftretenden Probleme. Um diese zu umgehen verwenden wir das Konzept sogenannter Distanzfunktionen, welche die Ähnlichkeit zwischen den Sensordaten und der Karte modellieren, und passen das Verfahren auf geeignete Weise an die Bedürfnisse realistischer Szenarien an. Insbesondere führen wir eine Distanzfunktion ein - die Polarkoordinatenmetrik - welche sich für das Lokalisationsproblem besonders gut zu eignen scheint. Schlussendlich stellen wir die Software RoLoPro vor, in der die meisten der diskutierten Algorithmen (einschließlich der Polarkoordinatenmetrik) implementiert sind. KW - Autonomer Roboter KW - Mobiler Roboter KW - Lokalisation KW - Lokalisation KW - Autonomer Roboter KW - Sichtbarkeit KW - Ähnlichkeitsmaß KW - Algorithmische Geometrie KW - Localization KW - Autonomous Robot KW - Visibility KW - Similarity Measure KW - Computational Geometry Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8442 ER - TY - THES A1 - Hupp, Thomas T1 - Ab Initio Treatment of Complex Systems Kohn-Sham Orbitals for Multi Reference Methods and the Base Pairing Properties of Xanthine T1 - Ab initio Behandlung komplexer Systeme Kohn-Sham Orbitale für Multireferenzverfahren und die Basenpaarungseigenschaften von Xanthin N2 - Die vorliegende Arbeit besteht aus zwei Teilen. Der erste untersucht die Eignung von LHF-Orbitalen für Multireferenzverfahren. Das Ziel dieses Teils ist eine effizientere Berechnung angeregter Zustände, was zur spektroskopischen Charakterisierung vieler organischer und bioorganischer Moleküle wichtig ist. Der zweite Teil befasst sich mit bioorganischen Fragestellungen und untersucht die Paarungseigenschaften der Purinbase Xanthin. Es wird unter anderem die unerwartet hohe Stabilität der Xanthin Selbstpaarung in Alanyl-PNA erklärt und es wird untersucht, auf welche Weise Xanthin in der DNA mutagene Fehlpaarungen mit Thymin eingehen kann. Teil1: Im Unterschied zu HF- und Standard-DFT-Methoden führt der LHF-Ansatz zu einem vollständig gebundenen Orbitalspektrum, da Coulomb-Selbstwechselwirkungen im LHF-Ansatz exakt korrigiert werden. Durch die Korrektur der Coulomb-Selbstwechselwirkungen sind im LHF-Ansatz auch die Energien der besetzten Orbitale nicht wie in Standard-DFT-Methoden zu höheren Werten verschoben, so dass das Koopmans' Theorem gültig bleibt und die besetzten LHF-Orbitale etwas kompakter als Standard-DFT-Orbitale sind. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass beide Eigenschaften deutliche Vorteile für MR-Verfahren darstellen. Die virtuellen LHF-Orbitale sind gut optimiert und erlauben eine effizienteBeschreibung sowohl angeregter Zustände als auch statischer Korrelationseffekte in MRCI und MRPT2-Ansätzen. Weiterhin führt die kompaktere Struktur der besetzten LHF-Orbitale zu einer besseren Beschreibung des kationischen Rumpfes von Rydbergzuständen. Andererseits wurden zu beiden genannten Vorteilen auch jeweils ein Beispielmolekül gefunden, in dem die Vorteile nicht zum Tragen kommen, und zu deren Beschreibung Orbitale aus HF- oder Standard-DFT-Methoden besser geeignet sind. Diese Beispiele zeigen, dass jeder Einzelfall für sich getestet werden muss, auch wenn die angeregten Zustände der meisten Moleküle sehr gut mit LHF-Orbitalen beschrieben werden können. Teil 2: Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Paarungseigenschaften von Xanthin und Xanthinderivaten untersucht. Ziel dieses Teils war es, eine Erklärung für die unerwartet hohe Stabilität des Xanthin Alanyl-PNA Selbstpaarung zu finden. Weiterhin wurde untersucht, weshalb Xanthin, das in der DNA u.a. unter chemischem Stress gebildet wird, mutagene Fehlpaarungen mit der Pyrimidinbase Thymin eingehen kann. Stabilität der Xanthin Alanyl PNA: Zunächst wurde durch den Vergleich experimenteller und berechneter 13C-NMR-Spektra das Regiosomer von Xanthin bestimmt, welches zu der ungewöhnlich hohen Stabilität der Xanthin-Xanthin-Selbstpaarung in Alanyl-PNA verantwortlich ist. Zur Untersuchung der Stabilität der Xanthin-Selbstpaarung wurde ein stark vereinfachendes Modell aufgestellt,in dem die Stabilit� at der PNA-Duplexe nur über die Energiebeiträge aus den Wasserstoffbrücken (EDim) und der Basenstapelung (EStap) bestimmt wird. Die Dimerisierungs- und Stapelungsenergien unterschiedlicher Paarungen wurden mit DFT- und MP2-Methoden bestimmt. Solvenseffekte wurden über ein Kontinuummodell erfasst und der Einfluss des peptidischen Rückgrats auf die Stapelungsgeometrie wurde durch Kraftfeldmethoden berücksichtigt. Während die einzelnen Energiekomponenten aus den H-Br� ucken und der Basenstapelung keinen eindeutigen Zusammenhang zu den Schmelztemperaturen erkennen lassen, korreliert die Summe aus beiden linear mit den experimentell ermittelten Tm-Werten. Dies bedeutet, dass die Beiträge aus der Entropie, der molekularen Wasserumgebung und der Rückgratspannung sich entweder aufheben oder f� ur alle behandelten Systeme sehr ähnlich sind. Die Stabilität der Xanthin-Xanthin- und die der 2,6-Diaminopurin-Xanthin-Paarung, ergibt sich durch einen erhöhten Stapelungsbeitrag der Purinpaarungen, während die Wasserstoffbrücken der Xanthin Selbstpaarung nur wenig zur Stabilisierung des Xanthin-Xanthin und des Xanthin-Diaminopurin-Alanyl-PNA-Doppelstrangs beitragen. Paarungseigenschaften von N9-Xanthin: Zur Untersuchung der Paarungseigenschaften von N9-Xanthin wurden zun� achst H-verbrückte Homodimere von Xanthin untersucht. Hierbei wurden extreme Variationen in den Bindungsstärken der einzelnen H-Brücken gefunden, die sich zwischen -4 bis -11 kcal/mol in der Gasphase und -2.5 bis -5 kcal/mol im Solvens betragen. Durch Vergleich mit Modellsystemen konnte die starke Varianz der H-Brückenstärke auf anziehende bzw. abstoßende sekundäre elektrostatische Wechselwirkungen zurückgeführt werden. Weiterhin wurde das Homodimer von Hypoxanthin untersucht, bei dem die H-Brücken durch eine Erhöhung der Aromatizität im Pyrimidinring zusätzlich verstärkt werden, was zu einer deutlichen Stabilisierung des Dimers führt. Elektronische Effekte müssen vor allem deshalb berücksichtigt werden, da sie im Unterschied zu rein elektrostatischen Effekten deutlich weniger von der Solvensumgebung beein usst werden. Mutagenität von Hypoxanthin und Xanthin: Zur Erklärung der Mutagenität von Hypoxanthin und Xanthin wurden verschiedene neutrale und anionische Watson-Crick Basenpaarungen von Hypoxanthin und Xanthin mit Pyrimidinbasen berechnet. Hierbei wurden u. a. auch tautomere und anionische Formen von Xanthin berücksichtigt. Zur Bewertung der erhaltenen Dimerisierungsenergien wurden die Paarungen danach klassifiziert, ob ihre Geometrien mit denen der kanonischen Basenpaarungen deckungsgleich sind, oder ob sie in einer verzerrten Watson-Crick Geometrie vorliegen, was die Einbaurate in die DNA aufgrund des räumlichen Anspruchs der DNA-Polymerase vermindert. Die Rechnungen zeigen, dass Xanthin nur mit Cytosin Watson-Crick-Paarungen eingehen kann, welche jedoch nur sehr schwach gebunden sind. In der neutralen Form scheint eine dreizähnige Basenpaarung unter Beteiligung einer tautomeren Form des Xanthins etwas stabiler zu sein als die zweizähnige Paarung von Diketoxanthin mit Cytosin. Da die Dimerisierungsenergie sowohl der neutralen als auch der anionischen Basenpaarung nur wenig unter 0 kcal/mol liegt, ist der Einbau der Xanthin-Cytosin-Paarung in die DNA zwar aufgrund der günstigen Geometrie möglich, wird aber nicht durch einen Energiebeitrag aus den H-Brücken verstärkt. Die im Vergleich zur Guanin-Cytosin Paarung deutlich geringere Aromatizität von Xanthin zu Cytosin ist im Einklang mit dem experimentellen Befund, dass die Cytosin-Xanthin Paarung deulich langsamer als die Guanin-Cytosin Paarungen in die DNA eingebaut werden. Während die Rechnungen nur eine geringe Aromatizität von Xanthin zu Cytosin vorhersagen, scheint das Anion von Xanthin in der Lage zu sein, eine sehr stabile Basenpaarung mit Thymin einzugehen. Allerdings muss die Dimerisierungsenergie die schlechtere Anpassung in die Bindungstasche der DNA-Polymerase ausgleichen, da die Paarung in einer etwas verzerrten Watson-Crick Geometrie vorliegt. Insgesamt wird die Paarung daher nicht schneller in die DNA eingebaut, wie erwartet aufgrund der H-Brückenstärken, stattdessen besitzt sie eine ähnliche Einbaurate wie die geometrisch günstigere aber weniger stabile Xanthin-Cytosin Paarung. N2 - The present work consists of two parts. The first one deals with theoretical questions and tests the performance of orbitals obtained from a self-interaction free KS method, the LHFapproach, in multireference ab initio methods. The purpose of this part is to enable a more efficient computation of excitation energies, which is important for the spectroscopic characterization of many organic and bioorganic molecules. The second part focuses on bioorganic questions and studies the base pairing properties of the purine base xanthine in order to explain, e.g., the unusually high stability of selfpairing xanthine alanyl-PNA double strands and the mutagenicity of xanthine formed in DNA. Part1: In contrast to HF- and standard DFT-methods, the LHF-approach leads to a fully bound virtual orbital spectrum, because Coulomb self interactions are exactly canceled in the LHFansatz. Furthermore, the energies of the occupied orbitals are not upshifted, like it is the case for standard DFT-methods, so that Koopmans' theorem remains valid. In line with this, also the occupied LHF-orbitals are somewhat more compact than standard DFT-orbitals. The present work shows that both properties are of great benefit for MR methods. The virtual LHF-orbitals are well optimized and allow an efficient description of excited states and static correlation in both MRCI- and MRPT2-approaches. Furthermore, the higher compactness of the occupied LHF- compared to standard DFT-orbitals leads to a better description of the center ion of Rydberg states. However, for each of the two advantages mentioned at least one example molecule has been found, for which LHF-orbitals actually perform worse than HF-and/or standard DFT-orbitals. This shows, that even though LHF virtual orbitals allow an excellent MRCI- and MRPT2-description for the electronically excited states of a large number of molecules, this cannot be generalized and their performance needs to be tested for each individual case. In the second part of the present work, the base pairing properties of xanthine and xanthine derivatives were studied. The purpose of this part was to find an explanation for the unexpectedly high stability of the xanthine alanyl PNA double strand. Furthermore, it was analyzed, why xanthine, that is formed from guanine in DNA under chemical stress, is able to form mismatched base pairs with the pyrimidine base thymine. Stability of xanthine alanyl PNA: In the first step, the regioisomer present in the considered alanyl PNA was identified to be the N7-regioisomer of xanthine by a theoretical analysis of the 13C-NMR spectrum. To analyze the stability of the xanthine self-pairing, a simplified model was set up, in which the stability of the PNA double strand was explained solely by the energy contributions from H-bonding and base stacking. For that purpose, the dimerization and stacking energies for the xanthine-xanthine, guaninecytosine, adenine-thymine and xanthine-2,6-diaminopurine base pairs were computed using DFT and MP2 methods. Solvent effects were taken into account by the conductor like screening model. The influence of the peptide backbone on the stacking geometry was considered by force field optimizations. While the individual contributions from hydrogen bonding and stacking do not correlate with the melting temperature Tm, the sum of both correlates linearly with Tm. This correlation is somewhat surprising, because this means that the effects of the entropy and the molecular water environment either cancel or are similar for all systems compared. In this model, the stability of the xanthine selfpairing mainly stems from an enlarged stacking interaction, while the H-bonds give only minor contributions to the stability of the xanthine selfpaired double strand of alanyl-PNA. Base pairing properties of N9-Xanthine: The computation of the base pairing properties of N9-xanthine revealed a strong variation in the individual H-bond strengths for the selfpairing of xanthine, that range from -4 to -11 kcal/mol in the gas phase and -2.5 to -5 kcal/mol in polar solvent. By comparison with model systems it was shown that the strong variance of the H-bond strength is mainly due to attractive or repulsive secondary electrostatic interactions. For the homodimer of hypoxanthine it was shown that the increase of aromaticity in the pyrimidine ring upon dimer formation leads to a strengthening of the hydrogen bonds. Mutagenicity of hypoxanthine and xanthine: Several neutral and anionic Watson-Crick base pairs of xanthine were computed with MP2- and DFT-methods in order to explain the mutagenicity of hypoxanthine and xanthine. Also basepairs involving tautomeric forms of xanthine and hypoxanthine were considered. To evaluate the dimerization energies found, the dimers were classified into pairings that have the exact geometry of the canonical base pairs and those that realize a distorted Watson-Crick pairing mode. The computations show that a stable pairing which realizes the exact geometry of a canonical Watson Crick base pairing is only possible for the pairing of xanthine to cytosine, however, the base pairs are only weakly bound. The dimerization energies of both the neutral and the anionic pairing is around 0 kcal/mol, so that the xanthine-cytosine base pairs are incorporated into DNA solely because the base pairs fulfill the geometric demands of DNA polymerase, but it does not profit from any additional stabilization due to hydrogen bonding. The bonding that in the Watson-Crick pairing mode xanthine has almost no affinity to cytosine is in correspondence with the experimental result that the cytosine-xanthine base pair is incorporated into DNA at a much lower rate than the cytosine-guanine base pair, which has a very strong hydrogen bonding. While the affinity of xanthine to cytosine is very low, the computations predict that xanthine is able to form a stable Watson-Crick pairing with thymine. However, the pairing has a somewhat distorted Watson-Crick geometry, so that its high stability is outbalanced by the worsened fit to the binding pocket of DNA-polymerase. As a consequence, the xanthinethymine pairing is incorporated into DNA not at a faster, but only at a rate comparable to that of the xanthine-cytosine pairing. KW - Kohn-Sham Orbitale KW - MRCI KW - angeregte Zustände KW - Basenpaarung KW - Xanthin KW - Kohn-Sham Orbitals KW - MRCI KW - excited states KW - Base pairing KW - xanthine Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8244 ER - TY - THES A1 - Noskov, Andrey T1 - Structural and functional studies of the Interleukin-5 receptor system T1 - Struktur und Funktionsanalyse des Interleukin-5 Rezeptor Systems N2 - The aim of current work was contribution to the long-term ongoing project on developing human IL-5 agonists/antagonists that intervene with or inhibit IL-5 numerous functions in cell culture and/or in animal disease models. To facilitate design of an IL-5 antagonist variant or low-molecular weight mimetics only capable of binding to the specific receptor alpha chain, but would lack the ability to attract the receptor common β-chain and thus initiate receptor complex activation it is necessary to gain the information on minimal structural and functional epitopes. Such a strategy was successfully adopted in our group on example of Interleukin 4. To precisely localize minimal structural epitope it is essential to have structure of the ligand in its bound form and especially informative would be structure of complex of the ligand and its specific receptor alpha chain. For this purpose large quantities (tens of milligrams), retaining full biological activity IL-5 and extracellular domain of IL-5 specific receptor α-chain were expressed in a bacterial expression system (E.coli). After successful refolding proteins were purified to 95-99% Stable and soluble receptor:ligand complex was prepared. Each established purification and refolding procedures were subjected to optimization targeting maximal yields and purity. Produced receptor:ligand complex was applied to crystallization experiments. Microcrystals were initially obtained with a flexible sparse matrix screening methodology. Crystal quality was subsequently improved by fine-tuning of the crystallization conditions. At this stage crystals of about 800x150x30µm in size can be obtained. They possess desirable visible characteristics of crystals including optical clarity, smooth facecs and sharp edges. Crystals rotate plane polarized light reflecting their well internal organization. Unfortunately relative slimness and sometimes cluster nature of the produced crystals complicates acquisition of high-resolution dataset and resolution of the structure. With some of obtained crystals diffraction to a resolution up to 4Å was observed. N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, einen Beitrag zum langfristigen Projekt der Entwicklung humaner IL-5 Agonisten/Antagonisten zu leisten, die im tierischen Krankheitsmodell oder in der Zellkultur in die verschiedenen Funktionen des IL-5 eingreifen oder sie inhibieren. Um das Design eines IL-5 Antagonisten oder einer Mimetika mit geringem Molekulargewicht zu vereinfachen, die nur an die spezifische α-Rezeptorkette bindet, nicht jedoch an die gemeinsame β-Kette und somit die Aktivierung des Rezeptorkomplexes initiieren, ist es notwendig, Informationen über minimale strukturelle und funktionelle Epitope zu erhalten. Diese Strategie wurde in unserer Arbeitsgruppe erfolgreich am Beispiel von Interleukin 4 angewandt. Um minimale strukturelle Epitope präzise zu lokalisieren, ist es es notwendig, die Struktur des Liganden in seiner gebundenen Form zu kennen. Besonders informativ wäre die Struktur des Komplexes aus Ligand und spezifischer Rezeptor α-Kette. Zu diesem Zweck wurden große Mengen (einige 10 mg) IL-5 mit vollständiger biologischer Funktionaltät und der extrazellulären Domäne der IL-5 spezifischen Rezeptor α-Kette in einem bakteriellen Expressionssystem (E. coli) exprimiert. Nach erfolgreicher Faltung wurden die Proteine zu einer Reinheit von 95-99% aufgereinigt und ein stabiler und löslicher Rezeptor:Ligandenkomplex erzeugt. Die erfolgreiche Aufreinigung und Faltungsprozedur wurde bezüglich maximaler Menge und Reinheit optimiert. Mit den produzierten Rezeptor:Ligandenkomplexen wurden Kristallisationsexperimente durchgeführt. Zunächst wurden mit einer flexiblen Sparse-Matrix Screening Methode Mikrokristalle erzeugt. Die Qualität der Kristalle wurde dann durch Feinabstimmung der Kristallisationsbedingungen verbessert. In diesem Stadium wurden Kristalle von etwa 800x150x30µm Größe erzeugt, die die gewünschten optischen Eigenschaften wie glatte Oberflächen und scharfe Kanten besaßen. Die Kristalle drehen die Polarisationsebene linear polarisierten Lichtes, was ihren gleichmäßigen Aufbau zeigt. Leider verkompliziert die geringe Dicke und das teilweise Auftreten von Clustern die Aufnahme hochauflösender Daten und damit Auflösung der Struktur. Mit einigen der erhaltenen Kristalle wurde eine Beugung bis zur Auflösung von 4 Å beobachtet. KW - Interleukin 5 KW - Rezeptor KW - Struktur KW - Interleukin-5 KW - Rezeptor KW - Asthma KW - X-ray KW - Protein-Kristallisierung KW - Interleukin-5 KW - receptor KW - asthma KW - X-ray KW - protein crystallization Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8195 ER - TY - THES A1 - Majidifard, Mahmoud Reza T1 - Biostratigraphy, lithostratigraphy, ammonite taxonomy and microfacies analysis of the Middle and Upper Jurassic of northeastern Iran T1 - Biostratigraphie, Lithostratigraphie, Ammoniten-Taxonomie und Mikrofazies-Analyse des Mittel- und Oberjura in Nordost-Iran N2 - The Middle and Upper Jurassic sedimentary successions of Alborz in northern Iran and Koppeh Dagh in northeastern Iran comprise four formations; Dalichai, Lar (Alborz) and Chaman Bid, Mozduran (Koppeh Dagh). In this thesis, the biostratigraphy, lithostratigraphy, microfacies, depositional environments and palaeobiogeography of these rocks are discussed with special emphasis on the abundant ammonite fauna. They constitute a more or less continuous sequence, being confined by two tectonic events, one at the base, in the uppermost part of the Shemshak Formation (Bajocian), the so-called Mid-Cimmerian Event, the other one at the top (early Cretaceous), the so-called Late-Cimmerian Event. The lowermost unit constitutes the uppermost member of a siliciclastic and partly continental depositional sequence known as Shemshak Formation. It contains a fairly abundant ammonite fauna ranging in age from Aalenian to early Bajocian. The following unit (Dalichai Formation) begins everywhere with a significant marine transgression of late Bajocian age. The following four sections were measured: The Dalichai section (97 m) with three members; the Golbini-Jorbat composite section (449 m) with three members of the Dalichai Formation (414 m) and two members of the Lar Formation (414 m); the Chaman Bid section (1556 m) with seven members, and the Tooy-Takhtehbashgheh composite section (567 m) with three members of the Chaman Bid Formation (567 m) and four members of the Mozduran Formation (1092 m). Altogether, 80 species of ammonites from the Dalichai and Chaman Bid formations belonging to 30 genera and 16 families are described. Among the taxa Phylloceratidae are most abundant, followed by Ataxioceratidae, Perisphinctidae, and Cardioceratidae. Pachyceratidae are the least common family. The ammonite fauna is of low diversity and is concentrated in several levels. Some of the ammonite genera and species are recorded from Iran for the first time. These include Pachyceras lalandei, Cardioceras praecordatum, Microbajocisphinctes sp., Geyssantia geyssanti, Larcheria schilli, Passendorferia sp., Sequeirosia sp., Phanerostephanus subsenex, Nothostephanus sp., Nannostephanus cf. subcomutus, Parawedekindia callomoni, Physodoceras sp., Extrenodites sp.. Biostratigraphically, thirty ammonite zones have been recognized for the Middle and Upper Jurassic successions at the four studied sections. Based on ammonites, the Dalichai Formation ranges from the Upper Bajocian to Callovian (Dalichai section) and from the Upper Bajocian to Lower Tithonian (Golbini-Jorbat section), the Chaman Bid Formation ranges from the ?Bathonian to Lower Tithonian (Chaman Bid section) and from the Upper Bajocian to Middle Kimmeridgian (Tooy-Takhtehbashgheh section), the Lar Formation ranges from the Middle to Upper Tithonian (Golbini-Jorbat section), and the Mozduran Formation from the Upper Kimmeridgian to ?Tithonian. Forty-four Microfacies types are briefly described. They were grouped into 16 facies associations, which then were interpreted in terms of their palaeoenvironments. They are part of a carbonate system consisting of a platform and adjacent slope to basin. Five major environments are represented: Tidal flat, shelf lagoon, and platform margin barrier as parts of the carbonate platform, and slope to basin representing open marine conditions. The sediments of the Dalichai and Chaman Bid formations are the slope and basinal sediments of the diachronous Lar and Mozduran formations, which formed an extensive carbonate platform in the Middle and Upper Jurassic. N2 - In der sedimentären Abfolge des Mittel- und Oberjura im Alborz (nördlicher Iran) und im Koppeh Dagh (nordöstlicher Iran) werden vier Formationen ausgeschieden: Dalichai- und Lar-Formation im Alborz und Chaman Bid- und Mozduran-Formation im Koppeh Dagh. Die Biostratigraphie, Lithostratigraphie, Mikrofazies, Ablagerungsbedingungen und Paläobiogeographie der Abfolgen werden diskutiert, unter besonderer Berücksichtigung der reichen Ammonitenfauna. Die Abfolgen stellen eine mehr oder wenig kontinuierliche sedimentäre Sequenz dar, die an der Basis und am Top von bedeutenden überregionalen tektonischen Unconfomities begrenzt wird, verursacht durch die Mittel-Cimmerischen Bewegungen im Bajoc und die Spät-Cimmerischen Bewegungen in der frühen Kreide. Die folgenden vier Profile wurden bearbeitet: das Dalichai-Typprofil (97 m) mit drei Membern; das zusammengesetzte Golbini-Jorbat-Profil (449 m) mit drei Membern der Dalichai-Formation (414 m) und zwei Membern der Lar-Formation (414 m); das Chaman Bid-Typprofil (1556 m) mit sieben Membern, und das zusammengesetzte Tooy-Takhtehbashgheh-Profil (567 m) mit drei Membern der Chaman Bid-Formation (567 m) und vier Membern der Mozduran-Formation (1092 m). Insgesamt werden 80 Ammonitenarten aus der Dalichai- und der Chaman Bid-Formation beschrieben, die zu 30 Gattungen und 16 Familien gehören. Die Phylloceratidae zeigen die höchste Abundanz, gefolgt von den Ataxioceratidae, Perisphinctidae und Cardioceratidae. Die Pachyceratidae sind die am wenigsten häufige Familie. Die Ammonitenfauna ist gering divers und an bestimmte Horizonte gebunden. Die folgenden Ammoniten-Gattungen und -Arten werden zum ersten mal aus dem Iran beschrieben: Pachyceras lalandei, Cardioceras praecordatum, Microbajocisphinctes sp., Geyssantia geyssanti, Larcheria schilli, Passendorferia sp., Sequeirosia sp., Phanerostephanus subsenex, Nothostephanus sp., Nannostephanus cf. subcomutus, Parawedekindia callomoni, Physodoceras sp., Extrenodites sp.. 30 Ammoniten-Biozonen konnten in der Mittel- bis Oberjura-Abfolge erkannt werden. Basierend auf der Ammoniten-Biostratigraphie kann die stratigraphische Reichweite der Formationen präzisiert werden: die Dalichai-Formation reicht vom Oberbajoc bis zum Callov (Dalichai-Profil) und vom Oberbajoc bis zum Untertithon (Golbini-Jorbat-Profil); die Chaman Bid-Formation reicht vom ?Bathon bis ins Untertithonian (Chaman Bid-Profil) und vom Oberbajoc bis Mittelkimmeridge (Tooy-Takhtehbashgheh-Profil); die Lar-Formation reicht vom Mittel- bis ins Obertithon (Golbini-Jorbat-Profil); die Mozduran-Formation reicht vom Oberkimmeridge bis zum ?Tithon. 44 Mikrofaziestypen, gruppiert in 16 Fazies-Assoziationen, werden kurz beschrieben und im Hinblick auf ihre Bildungsbedingungen interpretiert. Sie dokumentieren ein Karbonatsystem bestehend aus einer Plattform, einem Hang und einem Becken. Fünf Hauptablagerungsbereiche können ausgeschieden werden: Karbonatwatten, Schelflagune und Plattformrand als Teile der ehemaligen Karbopnatplattform sowie Hang und Becken des offenmarinen Bereiches. Die Sedimente der Dalichai- und Chaman Bid-Formationen repräsentieren Hang- und Becken-Sedimente einer sich diachron in Mittel- und Oberjura bildenden Karbonatplattform, die durch die Lar- und Mozduran-Formationen dokumentiert wird. KW - Chorasan KW - Jura KW - Ammoniten KW - Biostratigraphie KW - Lithostratigraphie KW - Jura KW - Iran KW - Ammoniten KW - (Bio-)Stratigraphie KW - Mikrofaziesanalyse KW - Jurassic KW - Iran KW - ammonites KW - (bio-)stratigraphy KW - microfacies analysis Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8045 ER - TY - THES A1 - Musch, Patrick T1 - Large-Scale Applications of Multi-Reference Methods in Chemistry and Development of a Multi-Reference Moller-Plesset Perturbation Theory Program T1 - Anwendung von Multireferenz-Methoden in der Chemie und Entwicklung eines Multireferenz Moller-Plesset-Störungstheorie-Programmes N2 - The first part of this work focuses on the characterization of systems which complex electronic structures require the application of multi-reference methods. The anti-tumor efficacy of the natural product Neocarzinostatin is based on the formation of diradicals and causes DNA cleavage and finally cytolysis. Computations on model systems performed in the present work show the influence of structural features on the mode of action and the efficacy of this antitumor-antibiotic. The cyclization of systems related to the enyne-cumulene framework like the enyne-allenes was investigated earlier and relations to the more unusual class of enyne-ketenes are analyzed. The class of enyne-ketenes (and also the enyne-allenes) show a broad spectrum of possible intermediates (diradicals, zwitterions, allenes). The electronic structures of these intermediates are also possible for the (heteroatom substituted) 1,2,4-cyclohexatriene and a model for their energetic sequence based on high-level multi-reference computations is proposed. In all three projects the application of multi-reference approaches is necessary to obtain a comprehensive picture of the reactivity and electronic structure but also shows up the limits inherently existing in the currently available programs with respect to the size of the molecules. In the second part, algorithms for a multi-reference Moller-Plesset perturbation theory (MR-MP2) program, designed to perform large-scale computations, were developed and implemented. The MR-MP2 approach represents the most cost-effective multireference ansatz and requires an efficient evaluation of the Hamilton matrix for which an algorithm is designed to instantly recognize only non-vanishing matrix elements and to employ the recurring interaction patterns of the Hamilton matrix. The direct construction of the Hamilton matrix is additionally parallelized to work on cluster environments. N2 - Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von Systemen, deren komplexe elektronische Struktur die Anwendung von Multireferenz-Methoden erfordert. Die Antitumor-Wirkung des Naturstoffes Neocarzinostatin beruht auf der Bildung von Diradikalen und führt zur Spaltung der DNS und löst den Zelltod aus. Berechnungen an Modellsystemen zeigen den Einfluss der Strukturmotive auf die Wirkungsweise und die Wirksamkeit des Antitumor-Antibiotikums. Die Cyclisierung von Systemen, wie die Eninallene, die dem Enincumulen-Grundgerüst des aktivierten Neocarzinostatin-Chromophors verwandt sind, wurden schon in früheren Arbeiten untersucht und die Verwandtschaft zur ungewöhnlicheren Substanzklasse der Eninketene wird in dieser Arbeit analysiert. Diese Verbindungsklasse und die der Eninallene zeigen ein breites Spektrum an möglichen Intermediaten, wie Diradikale, Carbene, Zwitterionen und Allene, deren elektronische Strukturen auch bei (heterosubstituierten) 1,2,4 Cyclohexatrienen auftreten. Für diese Verbindungen wird ein Modell für die energetische Abfolge der elektronischen Strukturen auf Basis von hochwertigen Multireferenz-Rechnungen vorgeschlagen. In den drei aufgeführten Projekten ist die Anwendung von Multireferenz-Ansätzen notwendig um ein umfassendes Bild der Reaktivitäten und elektronischen Strukturen zu erhalten, zeigen im Hinblick auf große Moleküle aber auch die inhärenten Grenzen in den zur Zeit verfügbaren Programme auf. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Algorithmen für ein Multireferenz-Moller-Plesset-Störungstheorie-Programmes (MR-MP2) entwickelt und implementiert. Der MR-MP2-Ansatz stellt den effizientesten Multireferenz-Ansatz dar und setzt eine geschickte und schnelle Berechnung der Hamilton-Matrix voraus. Hierfür ist ein Algorithmus konzipiert worden, der zum einen verschwindende Matrixelemente sofort erkennt und die sich wiederholenden Muster innerhalb der Hamilton-Matrix zu Nutze macht. Die Konstruktion der Hamilton-Matrix für das direkte Verfahren ist zudem für Clusterumgebungen parallelisiert. KW - Theoretische Chemie KW - Organische Chemie KW - Multireferenz KW - Moller-Plesset KW - Antitumor-Antibiotikum KW - Theoretical Chemistry KW - Organic Chemistry KW - Multi Reference KW - Moller-Plesset KW - Antitumor-antibitioc Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7741 ER - TY - THES A1 - Kocher, Nikolaus T1 - Experimental charge density studies of highly polar bonds T1 - Experimentelle Bestimmung der Elektronendichteverteilung Stark Polarer Bindungen N2 - The main aim of this work was the classification of highly polar E–N (E = Al, Si, P) and Li–E’ (E’ = C, N, O) bonds in terms of ionic (closed-shell) or covalent (shared) interactions. To answer this question the experimentally determined electron density was analyzed using Bader’s theory of ‘Atoms in Molecules’ (AIM). This allows a quantitative evaluation of properties derived from the electron density, such as the Laplacian, the ellipticitiy and the ratio of the highest charge concentration perpendicular to the bond path, to the largest charge depletion along the bonding vector. Most of these properties were monitored along the entire bonding region and not limited to the BCP as in former studies. The analyses are completed by the calculation of the electronic energy densities Hl at the BCPs and the integration of atomic basins also defined within the AIM theory. The electrostatic potential (ESP) was computed from the multipole parameters to reveal preferred reactive sites of the structures under investigation. Apart from that, the multipole formalism was applied to problematic crystal structures in order to open this method for twinned samples or those including disordered groups in the molecule. N2 - Die zentrale Fragestellung der Arbeit war die Klassifizierung der stark polaren Bindungen E–N (E = Al, Si, P) sowie Li–E’ (E’ = C, N, O) im Hinblick auf ionische und kovalente Wechselwirkungen. Um diese Frage zu beantworten wurde die experimentell bestimmte Elektronendichte mit der ‚Atoms in Molecules’ Theorie von Bader analysiert. Sie ermöglicht eine quantitative Auswertung von Eigenschaften wie dem Laplacian, der Elliptizität oder dem Verhältnis der Eigenwerte, die aus der Elektronendichte erhalten werden. Die meisten dieser elektronischen Eigenschaften wurden entlang des gesamten Bindungspfades untersucht; die Analyse war nicht, wie in früheren Arbeiten auf die bindungskritischen Punkte (BCPs) beschränkt. Die Untersuchungen wurden durch die Berechnung der Energiedichte Hl am BCP und die Integration der atomaren Basins vervollständigt. Weiterhin wurde aus den Multipolpopulationen das Elektrostatische Potential bestimmt, um reaktive Zentren der untersuchten Verbindungen zu quantifizieren. Das Multipolmodell wurde auch auf Kristalle mit problematischer Elektronendichteverteilung angewendet, um die Methode für verzwillingte Kristalle bzw. solche mit fehlgeordneten Gruppen zu erschließen. KW - Elektronendichte KW - Chemische Bindung KW - Räumliche Verteilung KW - Elektronendichteverteilung KW - Multipolverfeinerung KW - Topologie KW - AIM KW - molekulare Eigenschaften KW - charge density KW - electron density distribution KW - multipole refinement KW - topology KW - molecular properties Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7614 ER - TY - THES A1 - Attia, Mohamad Ibrahim T1 - Design, synthesis and pharmacological evaluation of certain GABAB agonists T1 - Design, Synthese und pharmakologische Untersuchungen der GABAB-Agonisten N2 - Ziel dieser Arbeit war die Synthese von (RS)-5-Amino-3-aryl(methyl)-pentansäure Hydrochloride, 3-Aminomethyl-5-chlor-benzolsäure Hydrochlorid und(RS)-4-Amino-3-(4´-ethynyl(jod)-phenyl)-butansäure Hydrochloride und die Testung der pharmakologischen Aktivität dieser Verbindungen. Die synthetisierten Verbindungen wurden als GABAB-Rezeptor Agonisten, in einem auf Ca2+-Messungen basierenden Funktional-Assay (in vitro tsA Zellen mit GABAB1b/GABAB2/Gαq-z5 transfektiert), getestet und daraus ein Struktur-Aktivitäts Modell abgeleitet. Im allgemein Teil dieser Arbeit wird ein Überblick, über die Neurotransmitter- Rezeptoren (Liganden gesteuerte Ionen-Kanal-Rezeptoren und G Protein-gekoppelte Rezeptoren) des zentralen Nervensystems und deren Agonisten und Antagonisten, gegeben. Eine ausführliche Diskussion zur Synthesestrategie der Verbindungen der Zwischenstufen und der Ausgangsmaterialien wird in den Schemata 2-6 beschrieben. Die synthetisierten Verbindungen wurden als GABAB Agonisten geprüft. Zusätzlich wurden diese im 3D Homologie Modell mit FlexiDock Programm gedockt. Daraus wurde ein Modell zur Voraussage der Aktivität von Analogen und Homologen des Baclofens abgeleitet. Letztendlich wurde ein Pharmakophor-Modell für GABAB Agonisten mit DISCO (DIStance COmparisons) Programm erstellt. N2 - Synthesis of (RS)-5-amino-3-aryl (methyl)-pentanoic acid hydrochlorides, 3 aminomethyl-5-chloro-benzoic acid hydrochloride and (RS)-4-amino-3-(4`-ethynyl(iodo)-phenyl)-butanoic acid hydrochlorides have been accomplished. The aim of their synthesis was to evaluate their GABABR agonist activity and to derive a model which will correlate their structure with the observed pEC50. The GABABR agonist activity of the prepared compounds has been determined in functional assay based on calcium measurement in vitro using tsA cells transfected with GABAB1b/GABAB2/Gαq-z5. Reviews on the neurotransmitter receptors (ligand-gated ion channel receptors and G protein-coupled receptors), their agonists and antagonists have been given in the general part of this work. A detailed discussion on the strategy followed for the synthesis of the designed compounds as well as the starting materials and intermediates has been described and illustrated in Schemes 2-6. The synthesized compounds were evaluated for their GABABR agonist activity. Furthermore, these compounds were docked in the available 3D homology model of GABABR using the program FlexiDock implemented in SYBYL software. Subsequently, we derived a predictive model which correlates the experimentally determined pEC50 with the calculated binding energy of certain baclofen analogues and homologues. In addition, we used the program DISCO (DIStance COmparisons) implemented in SYBYL software to find the pharmacophore features of GABAB agonists. KW - Baclofen KW - Analoga KW - GABA-Rezeptor-Agonist KW - Pharmakologie KW - GABAB KW - Sythese KW - Baclofen KW - Pharmakologie KW - Molekular Modeling KW - GABAB KW - synthesis KW - baclofen KW - pharmacology KW - molecular modeling Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7551 ER - TY - THES A1 - Roth, Martin T1 - Functional and developmental characterisation of matrix binding sites in decapentaplegic T1 - Funktionelle und entwicklungsspezifische Charakterisierung von Matrix-Bindungsstellen von decapentaplegic N2 - In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites. N2 - In den letzten Jahren wurde deutlich, daß viele Zytokine nicht nur mit ihren spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren interagieren, sondern auch Affinität zu Komponenten der Extrazellulären Matrix zeigen. Vor allem in Drosophila konnten viele Enzyme zur Synthese von Glukosaminoglykanen identifiziert werden. Mutationen in diesen Enzymen führen in der Regel zu Störungen verschiedener Signalwege, wie z.B. hedgehog, wingless, FGF oder dpp. Aufgrund dieser pleiotropen Effekte, war es meist nicht möglich, die Bedeutung der Matrix-Interaktionen für bestimmte Zytokine zu untersuchen. In dieser Arbeit sollte die Bedeutung der Matrix-Interaktion für das TGF-ß-Superfamilienmitglied DPP unter-sucht werden. Ausgehend von der hohen Homologie zwischen humanem BMP-2 und DPP wurde der basische N-Terminus von DPP, der im BMP-2 für die Heparininteraktion verantwortlich ist, verändert. Es wurde neben einer Wildtypvariante (D-MYC) eine Deletionsvariante (D-DEL) generiert, die keine basischen Aminosäuren im N-Terminus aufweist, sowie eine Duplikationsvariante (D-DUP), die eine zweite Kopie des basischen Hauptmotivs im N-Terminus enthält. Zur biochemischen Charakterisierung wurden die Varianten sowie wildtypisches DPP in E.coli exprimiert und in eine bioaktive Form zurückgefaltet. Im Limbbud-Test zeigte sich vergleichbar zum BMP-2 eine stark erhöhte Aktivität der Deletionsvariante gegenüber Wildtyp-DPP. Durch Biacore-Messungen an der immobilisierten Ektodomäne des hochaffinen DPP TypI-Rezeptors Thick veins konnte gezeigt werden, daß alle Varianten gleiche Rezeptoraffinität haben und sich nur in der Matrixbindung unterscheiden. Letzteres wurde durch eine analytische FPLC mit Heparin als Matrix gezeigt. Die biologische Relevanz der Matrixbindung wurde in transgenen Fliegen untersucht. Hierbei wurden die DPP-Varianten hinter einen UAS-Promoter kloniert, um jene unter der Kontrolle verschiedener Gal4-Treiberlinien exprimieren zu können. In der frühen Tracheenentwicklung zeigte sich eine sehr starke Matrix-Abhängigkeit der DPP-Wirkung. Während ektopische Expression der Deletionsvariante fast keine Störung der Zellmigration verursachte, war das Muster der Tracheenäste bei ektopischer Expression von D-MYC als auch D-DUP massiv gestört. Ubiquitäre Expression der Varianten in der Flügelimaginalscheibe verursachte Überproliferation und eine Ausdehnung der Expressionsdomäne des omb-Genes. Die Stärke der Phänotypen korrelierte dabei mit der Matrixbindung der Varianten. Entsprechende Störungen des Venenmusters konnten in Flügeln adulter Tiere festgestellt werden. Durch Kreuzung zweier dpp-Allele konnten transheterozygote Fliegen gewonnen werden, die keine dpp-Expression in den Imaginalscheiben zeigen. Die Expression der Varianten unter Kontrolle eines geeigneten dpp-Gal4-Treibers in diesen Fliegen gab Aufschluß über die tatsächliche Relevanz der DPP-Matrix-Interaktion für die Ausbildung eines DPP-Gradienten und spezifische Aktivierung verschiedener Targetgene in der Flügelscheibe. Es wurde gezeigt, daß alle Varianten dazu in der Lage sind, einen DPP-Gradienten mit entsprechender Expression der Targetgene omb und spalt zu erzeugen. Wieder wurde eine Korrelation zwischen Ausdehnung der Targetgen-Domänen und der Matrixbindung der Varianten beobachtet. Somit konnte durch Mutation des N-Terminus des DPP-Proteins gezeigt werden, daß dieser für die Matrixinteraktion von DPP verantwortlich ist. Auch wurde Aufschluß über die Bedeutung der Matrixinteraktion an verschiedenen DPP-Wirkungsorten gewonnen. Die Abhängigkeit des DPP-Signalpotentials von der Matrixbindung differiert zwischen verschiedenen Gewebetypen. Während die Wirkung von DPP in der Restrukturierung der trachealen Migration sehr stark von einer Matrixbindung abhängt, sieht man in bei der Proliferation und Musterbildung in der Imaginalscheibe nur graduelle Effekte. Diese Daten führten zur Etablierung eines Models für den Wirkungsmechanismus von DPP/TGFß Molekülen als morphogene Faktoren. Während eine Deletion von Matrixbindung zu einem Verlust der spezifischen biologischen Aktivität führt, wird durch zusätzliche Matrixbindung eine erhöhte Aktivität erreicht. KW - Taufliege KW - Transforming Growth Factor beta KW - Extrazellulärraum KW - extrazelluläre Matrix KW - decapentaplegic KW - Drosophila KW - Glucosaminoglykane KW - extracellular matrix KW - decapentaplegic KW - Drosophila KW - glucosaminoglycans Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7542 ER - TY - THES A1 - Schulz, Heidi T1 - Towards a comprehensive description of the human retinal transcriptome: identification and characterization of differentially expressed genes T1 - Identifizierung und Charakterisierung von differenziell exprimierten Genen - ein Beitrag zur umfassenden Beschreibung des Transkriptoms der menschilchen Netzhaut N2 - The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3’-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases. N2 - Die menschliche Retina ist ein mehrschichtiges neuroektodermales Gewebe, das auf die Umwandlung von Lichtenergie in elektrische Impulse spezialisiert ist. Diese Impulse werden zum Gehirn weitergeleitet, wo sie als Bilder gesehen werden. Da die Retina experimentell leicht zugänglich ist und funktionelle Aspekte direkt untersucht werden können, nehmen Experimente an diesem Gewebe in der neurologischen Forschung seit mehr als einem Jahrhundert einen Spitzenplatz ein. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Funktionen der Retina durch eine enorme Differenzierung in mehr als 55 Zelltypen, die koordiniert miteinander in Kontakt treten, ermöglicht wird. Die hohe strukturelle und funktionelle Komplexität der Retina wiederum ist das Resultat ihres Transkriptoms und ihres Proteoms. Die Komplexität der Retina erschwert es, die Zahl aktiv transkribierter Gene in diesem Gewebe zu schätzen. Durch die vielfältigen Bemühungen, Gene zu identifizieren, die mit retinalen Erkrankungen in Zusammenhang stehen, konnten bisher 139 Genloci mit retinalen Krankheiten in Verbindung gebracht werden und in 90 Fällen wurden die jeweiligen Gene bereits kloniert . Während auf dem Gebiet der hereditären Erkrankungen damit bereits große Erfolge erzielt wurden, sind die Resultate, was komplexe Erkrankungen wie die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) betrifft, noch spärlich. AMD ist eine retinale Erkrankung, die einen signifikanten Prozentsatz der älteren Bevölkerung betrifft. Es wird angenommen, dass sowohl exogene als auf genetische Faktoren als Auslöser beteiligt sind. Um die Physiologie der Retina besser zu verstehen und die Identifikation von Genen, die in retinale Erkrankungen involviert sind, zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit ein Schwerpunkt auf die systematische Analyse des retinalen Transkriptoms gelegt. Etwa die Hälfte aller Gene, die bei retinalen Erkrankungen eine Rolle spielen und bis heute identifiziert wurden, werden überwiegend in der Retina exprimiert. Das Erstellen von Genexpressionsprofilen und die Identifikation von retina-spezifischen Transkripten ist daher der erste wichtige Schritt für die Charakterisierung von Kandidatengenen für retinale Erkrankungen. Zu diesem Zweck wurde eine „Expressed Sequence Tags“ (ESTs) Analyse durchgeführt, in der alle Retina „Clusters“ der UniGene Datenbank sowie 1080 einzelne ESTs einer laboreigenen, suppressiv-subtraktiv hybridisierten (SSH) cDNA Bank der menschlichen Retina bewertet. Insgesamt wurden 6603 EST „Clusters“ während dieser Arbeit untersucht und für 750 eine detaillierte in-silico Analyse angeschlossen. Die Expression der Gene wurde mittels reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht und mit quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) bestätigt. Außerdem wurden konventionelle und virtuelle Northern Blot Hybridisierungen zur Aufklärung der Expressionsprofile eingesetzt. Die Expressionsprofile von 337 EST „clustern“ führte zur Identifikation von 111 Transkripten, von denen 60 abundant oder spezifisch in der Retina exprimiert werden, drei eine hohe Expression im retinalen Pigmentepithel (RPE) zeigen und 48 sowohl in der Retina als auch im Gehirn vorkommen. Die Bewertung der ESTs zur Auswahl von Kandidatengenen erlaubte einen direkten Vergleich der beiden genutzten Datenressoucen, der UniGene Datenbank und der retinalen SSH (retSSH) cDNA Bank. Die Resultate zeigten, dass die Generierung einer SSH Bank zur Identifikation zellspezifischer Transkripte die effektivere Methode darstellt. Durch die Nutzung dieser cDNA Bank konnte nicht nur ein Großteil der Kandidatengene, sondern auch Gene mit einer niedrigen Expression identifiziert werden. Außerdem zeigt die cDNA Bank eine Anreicherung an Retina-Transkripten. Somit stellt die retSSH cDNA Bank eine wertvolle Quelle zu Identifizierung neuer retinaler Gene dar. Durch diese und andere Arbeiten konnte die vollständige kodierende Sequenz von 55 der 111 retinaspezifischen oder –abundanten Gene ermittelt werden. Mittels verschiedener Methoden wie bioinformatische Analysen, „EST assembly“, cDNA Bank „screening“ und „RACE-Experimenten“ konnten im Lauf dieser Arbeit mehrere Gene, darunter C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1 und GRM7, kloniert werden. Mit bioinformatischen Analysen und cDNA Bank „screening“ wurde die Volllänge cDNA Sequenz und die genomische Organisation von C7orf9 (alias RFRP), ermittelt. Das 1190 bp retinaspezifische Transkript auf Chromosom 7p15.3 kodiert ein Vorläuferprotein für mindestens zwei kleine Neuropeptide, RFRP-1 und RFRP-3. Da C7orf9 in einer kritischen Region für die dominante zystoide Makuladystrophie liegt, wurde eine mögliche Rolle für die Pathologie der Krankheit untersucht. Mittels Southern Blot Hybridisierungen und der Sequenzierung von C7orf9 zweier betroffener Patienten des gleichen Stammbaums, der für die Lokalisierung des Krankheitsgens verwendet worden war, konnte eine Beteiligung des Genes am Krankheitsbild ausgeschlossen werden. Mehrere Isoformen des C12orf7 Gens konnten mit Hilfe verschiedener Klone aus cDNA Bank „screeining“, PCR Amplifikationen und „RACE-Experimenten“ identifiziert werden. Die von Chromosom 12q13.13 transkribierten Genvarianten zeigen eine retinaspezifische Expression. Aufgrund der vielfältigen Spleißvarianten des Gens kann über die Eigenschaften des kodierten Proteins nur spekuliert werden. Das längste Transkript, das alle sechs Exone und die letzte Intron-Sequenz enthält, kodiert ein Protein mit 471 AS, das ein Kernlokalisierungssignal und fünf Ankyrin „Domains“ aufweist. Die Existenz mehrere Isoformen wurde auch in der Maus nachgewiesen, was auf eine funktionelle Relevanz in der Physiologie der Zelle hinweist. Fünf neue Spleißvarianten des Glutamat metabotropen Rezeptors 7 (GRM7) mit alternativen Exonen am 3´Ende wurden identifiziert und charakterisiert. Eine der neuen Varianten, GRM7_v3 kodiert ein 924 AS-langer Protein und stellt damit das mutmaßlich längste GRM7 Protein dar. Die Isoformen werden nicht retinaspezifisch, sondern verstärkt in neuronalen Gewebe exprimiert. Obwohl die funktionellen Eigenschaften der spezifischen Carboxyl-Enden noch nicht geklärt sind, ist bekannt, dass „axon-targeting“ von GRM7_v1 von den letzten 60 AS des Proteins vermittelt wird. Die neuen Isoformen könnten daher eine Rolle im subzellulären Transport des Proteins spielen. Das C1orf32 Gen, das vorwiegend in der Retina exprimiert wird, besitzt zehn Exone und liegt auf Chromosom 1q24.1. Mit bioinformatische Analysen konnten nicht nur die orthologen Gene des putativen Proteins mit 639 AS in Maus und Ratte, sondern auch das LISCH7 Gen als potentielles Mitglied der Genfamilie identifiziert werden. Für LISCH7 ist eine Funktion als „low density lipoprotein receptor“ bekannt, das C1orf32 Protein ist damit möglicherweise in den retinalen Fettstoffwechsel involviert. Störungen im Fettstoffwechsel sind als Ursache für AMD vorgeschlagen worden, die Rolle von C1orf32 in dieser komplexen Krankheit sollte deshalb untersucht werden. Expressionsanalysen des „death-associated protein-like 1“ (DAPL1) Gens zeigten eine hohe Expression sowohl in Retina als auch im retinales Pigmentepithel. Das 552 bp Transkript kodiert ein Protein mit 107 AS und liegt auf Chromosom 2q24.1. In-silico Analysen identifizierten 12 weitere verwandte Proteine verschiedener Spezies, die eine hohe Ähnlichkeit aufweisen und eine neue Proteinfamilie darstellen. Vor allem die Ähnlichkeit mit dem „death-associated“ Protein, das für den programmierten Zelltod essentiell ist, ist von besonderem Interesse. Apoptose ist meist der ultimative Grund der retinalen Degeneration und somit stellt DAPL1 ein ausgezeichnetes Kandidatengen für Retinopathien dar. C4orf11, lokalisiert auf Chromosom 4q21.22 und C14orf2, lokalisiert auf Chromosom 14q22.1, sind retinaspezifische Genen und werden in mehren Isoformen transkribiert. Die kodierten Proteine enthalten keine bekannten Domänen, wegen ihrer retinaspezifischen Transkription kann allerdings eine wichtige Rolle für die Funktion der Retina nicht ausgeschlossen werden. Als eines der langfristigen Ziele dieses Projekts wurden mehrere der geklonten Gene genotypisiert um „single nucleotide polymorphism“ (SNP) Karten zu erstellen. Die derzeitigen Projekte untersuchen die Haplotypfrequenzen der Kandidatengene in großen Kohorten von AMD Patienten und nicht betroffenen Kontrollpersonen. Die Kollektion von 111 retinaspezifischen oder –abundanten Genen, die in dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert wurden, hat damit eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung retinaler Erkrankungen gelegt. KW - Netzhaut KW - Transkription KW - Gen KW - Netzhaut KW - Transkriptome KW - Retina KW - Transcriptome KW - Retina Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7278 ER - TY - THES A1 - Kilic, Mehtap T1 - Formation of caspase activating complexes and activation of caspase-12 during apoptosis in AKR-2B mouse fibroblasts T1 - Formation des Caspase Aktivierenden Komplexes und Aktivierung von Caspase-12 wahrend der Apoptose von AKR-2B Maus Fibroblasten N2 - Der Zelltod kann in Dichte-arretierten AKR-2B Mausfibroblasten durch Entzug des Serums oder Behandlung mit Anisomycin induziert werden. Der Zelltod zeigt zwar die für die Apoptose typischen morphologischen Veränderungen der Zelle wie Zellfragmentierung und Chromatinkondensation jedoch fehlen andere apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder Änderung des Membranpotentials der Mitochondria. Während der Apoptose wurde eine beachtliche DEVDase Aktivität nach- gewiesen, die einem einzelnen Enzym zugeordnet werden konnte. Dieses Enzym hatte typische Eigenschaften von Effektor-Caspasen, wie die der Caspase-3, besaß jedoch einen ungewöhnlich hohen KM Wert von 100 µM, und die Molmasse der großen Untereinheit betrug 19 kDa anstelle der erwarteten 17 kDa. Mit Hilfe des rekombinanten mCaspase-3 Proteins wurde dieses Enzym in der vorliegenden Untersuchung als Caspase-3 identifiziert. Die N-terminale Sequenzierung des mCaspase-3 Proteins ergab, daß sich die Spaltstelle seiner Prodomäne von der des humanen homologen Proteins unterschied (Asp-9 von Asp-28). Somit betrug die Molmasse der großen Untereinheit der aktiven Caspase-3 19 kDa. Darüberhinaus stimmte der KM-Wert der rekombinanter mCaspase-3 von ~100 µM mit der überein, die in Zellextrakten bestimmt wurde. Die Affinitätmarkierung in Kombination mit einer 2D-Gelelektrophorese bestätigte, daß tatsächlich Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase in AKR-2B-Zellen während der Apoptose aktiviert wird. Im Folgenden wurde untersucht, welcher Signalwege in AKR-2B-Zellen, denen Serum aus dem Nährmedia entzogen wurden war oder die mit Anisomycin behandelt worden waren, zur Aktivierung der Caspase-3 führt. Da eine Beteiligunug des Rezeptor-vermittelte Signalweges bereits zuvor ausgeschlossen worden war,wurde überprüft, ob der mitochondrial vermittelte Signalweg bei der Aktivierung von Caspase-3 ein Rolle spielt. Gelfiltrations- experimente ergaben, daß Caspase-3 als freies Enzym und nur in geringen Mengen innerhalb unterschiedlich große Komplexe der Molmassen 600 kDa und 250 kDa eluiert wird. Obwohl die apparenten Molmassen der Caspase-3-haltigen Komplexe mit kürzlich veröffentlichten Daten übereinstimmten, enthielten sie weder Apaf-1 noch Caspase-9. Dies deutet daraufhin, daß der mitochondrial-vermittelte Signalweg ebenfalls nicht an der Caspase-3 Aktivierung beteiligt ist. Darüberhinaus wurde ein neuer Caspase-6 enthaltender Komplex (450 kDa) nach Serumentzug in AKR-2B-Zellen gefunden, der sich deutlich von Caspase-3 haltigen Komplexen unterscheidet. Caspase-3 ist für die meisten morphologische Veränderungen während der Apoptose verantwortlich. Wahrend der Apoptose in der AKR-2B-Zellen zwar Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase identifiziert worden war, jedoch keine intranukleosomale Fragmentierung nachgeweisen werden konnen, da bei wurde die intrazelluläre Lokalisation der Caspase-3 untersucht. Durch Überexpression eines Caspase-3-GFP Fusionskonstruktes in AKR-2B Zellen wurde die Procaspase-3 im Cytoplasma lokalisiert, während die aktive Caspase-3 vorwiegend in membranumhüllten Vesikeln und zum Teil im Cytoplasma aktiviert wurde. Ebenfalls wurde eine mögliche Beteiligung von Caspase-12 und eine ER-Streß vermittelte Signalleitung an der Apoptose in AKR-2B-Zellen untersucht. Kinetische Untersuchungen zeigten, daß Caspase-12 im Fall von Serumentzug oder Behandlung mit Anisomycin zeitgleich mit Caspase-3 aktiviert wurde, was zur Bildung von zwei Spaltprodukte der Molmassen 47 kDa und 35 kDa führte. Gelfiltrationsexperimente ergaben, daß Caspase-12 als freies Enzym während der Apoptose auftritt. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde in allen Publikationen beschrieben, daß Caspase-12 in Folge von ER-Streß aktiviert wird. Nach Serumentzug oder Zugabe von Anisomycin zu AKR-2B-Zellen wurde jedoch kein Anstieg der Synthese des Chaperon-Proteins Grp78, einem Marker für ER-Streß, beobachtet. Dies zeigt, daß beide Behandlungen nicht zur ER-Streß führen. Im Gegensatz dazu erzeugten bekannte Indikatoren von ER Streß wie Thapsigargin und A23187 (ionophor) ER-Streß in AKR-2B-Zellen, was zu unspezifischem Abbau der Caspase-12 führte. Darum ist es unwahrscheinlich, daß in AKR-2B- Zellen Caspase-12 bei ER-Streß aktiviert wird. Zusammenfassend zeigten diese Daten, daß Caspase-12 in AKR-2B-Zellen über Signalwegen aktiviert wird, die ER stress un- abhängig sind und zeigen daß Caspase-3 bei der Aktivierung von Caspase-12 beteiligt ist somit liefern die vorliegenden Untersuchungen einen Hinweis darauf daß neben den klassischen Signalwege weitere Signalwege existieren, die zur Apoptose führten. N2 - Density arrested AKR-2B cells die rapidly in response to serum starvation or treatment by Anisomycin. Cell death is associated with typical hallmarks of apoptosis including membrane blebbing and chromatin condensation but lacks energy dissipation in mitochondria and intranucleosomal fragmentation. During apoptosis a considerable DEVDase activity has been detected which seemed to be represented by a single enzyme. This enzyme had typical effector caspase characteristics, like caspase-3, but exhibited an unusual high KM values of ~100 µM and its large subunit exhibited a molecular weight of 19 kDa, instead of expected 17 kDa. In the present study, this enzyme was identified to be caspase-3 with the help of the generation of recombinant mcaspase-3 protein. N-terminal sequencing of the recombinant mcaspase-3 protein revealed that its prodomain cleavage site differs from that in the human homologue (Asp-9 instead of Asp-28). Thus the large subunit of active caspase-3 was found to be 19 kDa. Furthermore the KM value of recombinant mcaspase-3 was ~100 µM in perfect agreement with that found in cell extracts. Affinity labeling in combination with 2D-GE confirmed that indeed caspase-3 is activated as the main executioner in AKR-2B cells during apoptosis. Since the receptor mediated pathway has already been excluded previously [129], a possible involvement of mitochondria mediated pathway in the activation of caspase-3 was examined. Gel filtration experiments revealed that caspase-3 is mainly eluted as free enzyme and in lower levels within the differently sized high molecular weight complexes of ~600 kDa and 250 kDa in response to serum starvation or Anisomycin treatment. Though the apparent molecular weight of the complexes containing caspase-3 are in accordance with recently published data, they were devoid of Apaf-1 and caspase-9. Apparently, mitochondria mediated pathway is also not involved since neither formation of high molecular weight complexes of Apaf-1 nor cleavage of caspase-9 was observed. Thus, the activation of caspase-3 is caused by a noncanonical pathway during apoptosis. In addition a new 450 kDa complex containing activated caspase-6 was found in response to serum starvation which is clearly separated from caspase-3 containing complexes. Generally caspase-3 has been found to be responsible for most of the morphological changes during apoptosis. One of those is intranucleosomal fragmentation. Although caspase-3 was found to be the main executioner caspase in AKR-2B cells the lack of the intranucleosomal fragmentation led to examine its localization. As detected by overexpression of the Caspase-3-GFP fusion construct in AKR-2B, procaspase-3 was localized in the cytoplasm, wheras the active caspase-3 was mainly found in the membrane blebs and partially in the cytoplasm. Clearly no nuclear localization of active caspase-3 was detected. These data gave first hints on the mechanism of degradation of AKR-2B cells demonstrating that cytoplasmic membrane is the primary site of activation of caspase-3. The possible role of caspase-12 and ER stress mediated pathway of apoptosis was also examined in AKR-2B cells. Kinetic studies showed that caspase-12 is activated at the same time together with caspase-3 in response to serum starvation or Anisomycin treatment resulting in two cleavage products of 47 kDa and 35 kDa, respectively. It was therefore examined whether these two caspases were eluted in the same complexes. Gel filtration experiments revealed that caspase-12 is released as free enzyme during apoptosis. To date all the studies have identified that caspase-12 is specifically activated in response to ER stress. After serum starvation or Anisomycin addition there was no increase of the protein expression level of the chaperone protein Grp 78 which is known to be higly elevated in response to ER stress indicating that both treatments did not lead to ER stress. In contrast treatment with ER stressor substances i.e. Thapsigargin, A23187 (ionophore) induced an ER stress in AKR-2B which lead to unspecifically degradation of caspase-12. Thus it is unlikely that caspase-12 is activated in response to ER stress in AKR-2B cells. However, after the in vitro addition of recombinant caspase-3 to cytosolic extracts caspase-12 is cleaved into 47 kDa and 35 kDa fragments similiar to those observed in vivo. In conclusion the present data demostrated that caspase-12 is activated in AKR-2B cells during apoptosis triggered through pathways that do not involve (the) ER stress and provided evidence that caspase-3 might be involved in activation of caspase-12. Thus the present study in AKR-2B cells gives hints for the existence of additional pathways for apoptosis other than the classical ones. KW - Apoptosis KW - Caspasen KW - Apoptose KW - Casapse KW - AKR-2B KW - Fibroblasten KW - Apoptosis KW - Caspases KW - AKR-2B KW - fibroblasts Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7190 ER - TY - THES A1 - Pavel, Ioana-Emilia T1 - Vibrational spectroscopy and density functional theory calculations, a powerful approach for the characterization of pharmaceuticals and new organometallic complexes T1 - Schwingungsspektroskopie und Dichtefunktionaltheorie-Rechnungen, ein vielversprechender Ansatz zur Charakterisierung von Pharmazeutika und neuer metallorganischer Komplexe. N2 - In the current work, several well-known pharmaceuticals (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate, caffeine, and papaverine hydrochloride) and new organometallic compounds (nickel(II) cupferronato complexes NiL2An, L = PhN2O2-, n = 1, A = o-phenanthroline (1), o,o’-bipyridine (2) and n = 2, A = H2O (3), o-NH2Py (4), o-C6H4(NH2)2 (5); silylene-bridged dinuclear iron complexes [Cp(OC)2Fe]2SiX2 (X = H (6), F (7), Cl (8), Br (9), I (10)); 3-silaoxetane 3,3-dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-oxa-3-silacyclobutane (11) and 3-silathietane 3,3-dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-sila-3-thiacyclobutane (12) compounds), which have successfully been characterized by using vibrational spectroscopy in conjunction with accurate density functional theory (DFT) calculations, are presented. The DFT computed molecular geometries of the species of interest reproduced the crystal structure data very well and in conjunction with IR and Raman measurements helped us to clarify the structures of the compounds, for which no experimental data were available; and this, especially for the new organometallic compounds, where the X-Ray analysis was limited by the non-availability of single crystals (3, 5, 10). Furthermore, a natural population analysis (NPA) and natural bond orbital (NBO) calculations together with a detailed analysis of the IR and Raman experimental as well as calculated spectra of the new organometallic compounds, allowed us to study some special bonding situations (1-12) or to monitor the structural changes observed with the change in temperature during the Raman experiments (11, 12). By combining these two methods (DFT and vibrational spectroscopy), the auspicious results obtained on the organometallic compounds 6-12 and overall in literature, made us confident of the power of theoretical calculations in aiding the interpretation of rich SERS spectra by solving some interesting issues. Consequently, the Raman and SERS spectra of well-known pharmaceuticals (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate, caffeine, and papaverine hydrochloride) or new potentially biological active organometallic complexes (1-5), that were synthetized by our coworkers, were discussed with the assistance of the accurate results obtained from DFT calculations (structural parameters, harmonic vibrational wavenumbers, Raman scattering activities), and many previous incomplete assignments have been analyzed and improved. This allowed us to establish the vibrational behavior of these biological compounds near a biological artificial model at different pH values or concentrations (Ag substrate), taking into account that information about the species present under particular conditions could be of great importance for the interpretation of biochemical processes. The total electron density of molecules and the partial charges situated on selected atoms, which were determined theoretically by NPA, allowed us to establish the probability of different atoms acting as an adsorptive site for the metal surface. Moreover, a closer examination of the calculated orbitals of molecules brought further arguments on the presence or absence of the photoproducts at the Ag surface during the irradiation (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate). Overall, the results provide a benchmark illustration of the virtues of DFT in aiding the interpretation of rich vibrational spectra attainable for larger polyatomic adsorbates by using SERS, as well as in furnishing detailed insight into the relation between the vibrational properties and the nature of the Ag substrate-adsorbate bonding. Therefore, we strongly believe that theoretical calculations will become a matter of rapidly growing scientific and practical interest in SERS. N2 - In der vorliegenden Arbeit werden allgemein bekannte Pharmazeutika (1,4-Dihydrazin-phtalazinsulfat, Koffein und Papaverinhydrochlorid) und mehrere neue metallorganische Verbindungen (Nickel(II)-Kupferron-Komplexe NiL2An, L = PhN2O2-, n = 1, A = o-phenanthrolin (1), o,o’-bipyridine (2) and n = 2, A = H2O (3), o-NH2Py (4), o-C6H4(NH2)2 (5); Silicium-verbrückte dinucleare Eisen-Komplexe [Cp(OC)2Fe]2SiX2 (X = H (6), F (7), Cl (8), Br (9), I (10)); 3-Silaoxetan 3,3-Dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-oxa-3-silacyclobutan (11) und 3-Silathietan 3,3-Dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-sila-thiacyclobutan (12) Verbindungen) vorgestellt, die erfolgreich unter Verwendung schwingungsspektroskopischer Methoden in Verbindung mit genauen DFT Rechnungen charakterisiert worden sind. Die mittels DFT berechneten Molekülgeometrien der uns interessierenden Substanzen gaben die Daten, die aus Kristallstrukturanalyse erhalten worden sind, sehr gut wieder und halfen uns zusammen mit IR- und Raman-Messungen die Strukturen der Verbindungen aufzuklären, für die bisher keine experimentellen Daten erhältlich waren. Besondere Aufmerksamkeit wurde denjenigen neuen Metallorganika geschenkt, deren Röntgenstrukturanalyse (3, 5, 10) auf Grund der Fehlens von Einkristallen eingeschränkt war. Desweiteren erlaubten uns “natural population analysis” (NPA)- und ” natural bond orbital“ (NBO)-Analysen, ebenso wie detallierte Auswertungen der experimentellen und berechneten Spektren (IR, Raman) der metallorganischen Verbindungen, die Untersuchung spezieller Bindungssituationen (1-12) und die strukturellen Änderungen (11, 12) zu verfolgen, die mit der Variation der Temperatur während der Raman-Messungen einhergehen. Die vielversprechenden Ergebnisse der Untersuchungen an metallorganischen Verbindungen 6-12 sowie entsprechende bisher publizierte Ergebnisse, die durch Kombination dieser zwei Methoden (DFT und Schwingungsspektroskopie) erhalten worden sind, machten uns zuversichtlich, dass theoretische Berechnungen bei der Auswertung auch komplexer SERS-Spektren durch Lösung einiger interessanter Probleme sehr behilflich sein könnten. Folglich konnten die Raman- und SERS-Spektren von bekannten Pharmazeutika (1,4-Dihydrazin-phtalazinsulfat, Koffein und Papaverinhydrochlorid) oder von neuen, potentiell biologisch aktiven Organometall-Komplexen (1-5), die von Mitarbeitern anderer Institute synthetisiert worden sind, unter Zuhilfenahme genauer Ergebnisse aus DFT-Rechnungen (strukturelle Parameter, harmonische Schwingungswellenzahlen, Raman-Streuaktivitäten) interpretiert werden. So war es möglich, viele bisher unvollständig zugeordnete Schwingungen zuzuordnen und zu erklären. Dies erlaubte uns, das Schwingungsverhalten dieser biologischen Substanzen innerhalb eines künstlichen biologischen Modells (Ag-Substrat) bei verschiedenen pH-Werten und Konzentrationen zu ermitteln. Informationen über das Verhalten solcher Verbindungen unter besonderen Bedingungen könnten bei der Interpretation biologischer Prozesse eine wichtige Rolle spielen. Die totale Elektronendichte dieser Moleküle und die Partialladung an unterschiedlichen Atomen, die durch NPA bestimmt wurden, ermöglichten uns, die Adsorptionswahrscheinlichkeit verschiedener Atome an bestimmten Stellen der Metalloberfläche zu ermitteln. Ferner lieferte eine genauere Betrachtung der berechneten Molekülorbitale weitere Hinweise auf das Auftreten oder Fehlen von Photoprodukten auf der Silberoberfläche während der Bestrahlung (1,4-Dihydrazin-phtalazinsulfat). Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse die Vorteile von DFT-Rechnungen bei der Interpretation komplexer Schwingungsspektren größerer polyatomarer Adsorbate auf, die nur unter Ausnützung des SERS-Effekts aufgenommen werden können. Auch tragen sie dazu bei, einen detaillierten Einblick in den Zusammenhang zwischen den Schwingungseigenschaften und der Natur der Silbersubstratadsorbat-Bindung zu liefern. Demzufolge sind wir davon überzeugt, dass theoretische Methoden einen größeren Stellenwert bei einem schnell wachsenden wissenschaftlichen und praktischen Interesse an SERS gewinnen werden. KW - Arzneimittel KW - Oberflächenverstärkter Raman-Effekt KW - Dichtefunktionsformalismus KW - Infrarot- und Raman-Spektroskopie KW - SERS KW - DFT KW - Pharmazeutika KW - neue metallorganische Komplexe KW - Infrared and Raman spectroscopy KW - SERS KW - DFT KW - pharmaceuticals KW - new organometallic complexes Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7186 ER - TY - THES A1 - Drüppel, Kirsten T1 - Petrogenesis of the Mesoproterozoic anorthosite, syenite and carbonatite suites of NW Namibia and their contribution to the metasomatic formation of the Swartbooisdrif sodalite deposits T1 - Petrogenese der mesoproterozoischen Anorthosite, Syenite und Karbonatite NW-Namibias und ihr Einfluss auf die metasomatische Bildung der Sodalith-Vorkommen von Swartbooisdrif N2 - During the Mesoproterozoic large volumes of magma were repeatedly emplaced within the basement of NW Namibia. Magmatic activity started with the intrusion of the anorthositic rocks of the Kunene Intrusive Complex (KIC) at 1,385-1,347 Ma. At its south-eastern margin the KIC was invaded by syenite dykes (1,380-1,340 Ma) and younger carbonatites (1,140-1,120 Ma) along ENE and SE trending faults. Older ferrocarbonatite intrusions, the ‘carbonatitic breccia’, frequently contain wallrock fragments, whereas subordinate ferrocarbonatite veins are almost xenolith-free. Metasomatic interaction between carbonatite-derived fluids and the neighbouring and incorporated anorthosites led to the formation of economically important sodalite deposits. Investigated anorthosite samples display the magmatic mineral assemblage of Pl (An37-75) ± Ol ± Opx ± Cpx + Ilm + Mag + Ap ± Zrn. Ilmenite and pyroxene are surrounded by narrow reaction rims of biotite and pargasite. During the subsolidus stage sporadic coronitic garnet-orthopyroxene-quartz assemblages were produced. Thermobarometry studies on amphiboles yield temperatures of 985-950°C whereas the chemical composition of coronitic garnet and orthopyroxene indicate a subsolidus re-equilibration of the KIC at conditions of 760 ± 100°C and 7.3 ± 1 kbar. In the syenites Kfs, Pl, Hbl and/or Cpx crystallized first, followed by a second generation of Kfs, Hbl, Fe-Ti oxides and Ttn. Crystallization of potassium feldspar occurred under temperatures of 890-790°C. For the crystallization of hastingsite pressures of 6.5 ± 0.6 kbar are obtained. In order to constrain the source rocks of the two suites, oxygen isotope analyses of feldspar as well as geochemical bulk rock analyses were carried out. In case of the anorthosites, the general geochemical characteristics are in excellent agreement with their derivation from fractionated basaltic liquids, with the d18O values (5.88 ± 0.19 ‰) proving their derivation from mantle-derived magmas. The results obtained for the felsic suite, provide evidence against consanguinity of the anorthosites and the syenites, i.e. (1) compositional gaps between the geochemical data of the two suites, (2) trace element data of the felsic suite points to a mixed crustal-mantle source, (3) syenites do not exhibit ubiquitous negative Eu-anomalies in their REE patterns, which would be expected from fractionation products of melts that previously formed plagioclase cumulates and (4) feldspar d18O values from the syenites fall in a range of 7.20-7.92 ‰, which, however, is about 1.6 ‰ higher than the average d18O of the anorthosites. Conformably, the crustal-derived felsic and the mantle-derived anorthositic suite are suggested to be coeval but not consanguineous. Their spatial and temporal association can be accounted for, if the heat necessary for crustal melting is provided by the upwelling and emplacement of mantle-derived melts, parental to the anorthosites. In order to constrain the source of the 1,140-1,120 Ma carbonatites and to elucidate the fenitizing processes, which led to the formation of the sodalite, detailed mineralogical and geochemical investigations, stable isotope (C,O,S) analyses and fluid inclusion measurements (microthermometrical studies and synchrotron-micro-XRF analyses) have been combined. There is striking evidence that carbonatites of both generations are magmatic in origin. They occur as dykes with cross-cutting relationships and margins disturbed by fenitic aureoles, and contain abundant flow-oriented xenoliths. The mineral assemblage of both carbonatite generations of Ank + Cal + Ilm + Mag + Bt ± Ap ± pyrochlore ± sulphides in the main carbonatite body and Ank + Cal + Mag ± pyrochlore ± rutile in the ferrocarbonatite veins, their geochemical characteristics and the O and C isotope values of ankerite (8.91 to 9.73 and –6.73 to –6.98, respectively) again indicate igneous derivation, with the 18O values suggesting minor subsolidus alteration. NaCl-rich fluids, released from the carbonatite melt mainly caused the fenitization of both, the incorporated and the bordering anorthosite. This process is characterized by the progressive transformation of Ca-rich plagioclase into albite and sodalite. Applying conventional geothermobarometry combined with fluid-inclusion isochore data, it was possible to reconstruct the P-T conditions for the carbonatite emplacement and crystallization (1200-630°C, 4-5 kbar) and for several mineral-forming processes during metasomatism (e.g. formation of sodalite: 800-530°C). The composition and evolutionary trends of the fenitizing solution were estimated from both the sequence of metasomatic reactions within wallrock xenoliths in the carbonatitic breccia and fluid inclusion data. The fenitizing solutions responsible for the transformation of albite into sodalite can be characterised as of NaCl-rich aqueous brines (19-30 wt.% NaCl eq.), that contained only minor amounts of Sr, Ba, Fe, Nb, and LREE. N2 - Die mesoproterozoische Entwicklung Namibias ist durch wiederholte magmatische Aktivität gekennzeichnet. Zunächst erfolgte vor 1385-1347 Ma die Platznahme von Anorthositen des Kunene-Intrusiv-Komplexes (KIK) innerhalb von hochgradig metamorphen Gesteinen des Epupa-Komplexes. Der KIK wurde nahe seiner südöstlichen Begrenzung von zahlreichen Störungen durchschlagen. In diese SE-NW und ENE-WSW streichenden Schwächezonen intrudierten Syenite (ca. 1380-1340 Ma) sowie jüngere Karbonatite (ca. 1140-1120 Ma). Hierbei erfolgte zunächst die Platznahme einer ersten Ferrokarbonatit-Generation, die in hohem Maße durch Anorthosit-Xenolithe kontaminiert ist („karbonatitische Brekzie“). Diese wird von jüngeren und annähernd Xenolith-freien Ferrokarbonatit-Adern durchschlagen. Metasomatische Wechselwirkungen den Karbonatit-Magmen und angrenzenden Anorthositen und Anorthosit-Xenolithen führten zur Bildung ökonomisch bedeutsamer Sodalith-Vorkommen. Die typische primär-magmatische Mineralogie in den Gesteinen des KIK umfasst: Pl (An37-75) ± Ol ± Opx ± Cpx + Fe-Ti-Oxide + Ap ± Zrn. Säume von Amphibol und Biotit umgeben Pyroxen und Ilmenit. Geothermometrische Untersuchungen ergaben Temperaturen von 985-950°C für die Kristallisation von Amphibol. Eine Reequilibrierung der Anorthosite unter granulit- bis amphibolitfaziellen Bedingungen (760 ± 100°C; 7.3 ± 1 kbar) wurde für Orthopyroxen-Granat-Quarz-Koronen um Olivin festgestellt. In den Syeniten kristallisierten zunächst Kfs, Pl, Cpx und Hbl, gefolgt von einer zweiten Generation von Kfs, Hbl, Fe-Ti-Oxiden und Ttn. Die Kristallisation von K-Feldspat fand unter Temperaturbedingungen von 890-790°C statt. Für die Kristallisation von Hastingsit wurden Drucke von 6.5 ± 0.6 kbar ermittelt. Mit dem Ziel, die Natur der Magmenquelle der Anorthosite und Syenite zu charakterisieren wurden geochemische Untersuchungen durchgeführt, sowie die Sauerstoff-Isotopie von Feldspat-Separaten bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen belegen, dass es sich bei den Stamm-Magmen der Anorthosite um fraktionierte basaltische Magmen handelt. Die d18O-Daten (5.61-6.13 ‰) legen nahe, dass diese Schmelzen durch partielle Aufschmelzung des Erdmantels entstanden sind. Die für die Syenite ermittelten Ergebnisse belegen, dass es sich bei Anorthositen und Syeniten um chemisch unabhängige Systeme handelt, da (1) keine chemische Kontinuität zwischen Anorthositen und Syeniten vorliegt, (2) die Spurenelementgehalte der Syenite auf eine gemischte Kruste-Mantel-Quelle hindeuten, (3) Chondrit-normierte Seltenerd-Element-Muster der Syenite keine negative Eu-Anomalie aufweisen, und (4) die d18O-Werte von Feldspat der Syenite mit 7.20-7.92 ‰ etwa 1.6 ‰ höher liegen als die der Anorthosite. Dementsprechend liegt die enge räumliche und zeitliche Assoziation von Anorthosite und Syeniten vermutlich darin begründet, dass der Aufstieg und die Platznahme der Stamm-Magmen der Anorthosite zum partiellen Aufschmelzen der Unterkruste und somit zur Bildung potentieller Stamm-Magmen der Syenite führten. Um eine umfassende Vorstellung über die genetische und zeitliche Stellung der Karbonatite und über die Sodalith-bildenden Vorgänge zu gewinnen, wurden verschiedene Untersuchungsmethoden angewendet (petrographische und Mikrosonden-analytische Bearbeitung von Dünnschliffen, Bestimmung der Gesamtgesteins-Geochemie, mikrothermometrische Untersuchungen sowie Synchrotron-XRF(SRXRF)-Untersuchungen von Fluid-Einschlüssen, Laser-ICPMS und SRXRF-Analysen der Spurenelement-Gehalte ausgesuchter Minerale sowie O-, C- und S-Isotopenanalytik). Die für die Karbonatite gewonnenen Ergebnisse belegen eindeutig, dass es sich hierbei um magmatische Kristallisationsprodukte fraktionierter Mantelschmelzen darstellen: Die Karbonatite treten als Gänge auf, welche ältere Gesteinseinheiten durchschlagen. Gesteine im Kontakt zu den Karbonatiten haben eine metasomatische Überprägung erfahren; Nebengesteinsklasten werden von Karbonat-reichen Lagen umflossen. Die Mineralogie beider Karbonatit-Generationen, i.e. (1) Ank + Cal + Mag + Bt ± Ilm ± Ap ± Pyrochlor ± Sulfide in der karbonatitischen Brekzie und (2) Ank + Cal + Mag ± Pyrochlor ± Rutil der Ferrokarbonatit-Adern, ihre geochemischen Signaturen sowie die O- und C-Isotopie von Ankerit (8.91-9.73 ‰ d18O und –6.73 bis –6.98 ‰ d13C) bestätigen diese Interpretation, wobei die O-Isotopendaten eine schwache hydrothermale Alteration der Karbonatite nahe legen. Die Ergebnisse von konventioneller Geothermometrie in Kombination mit den für Fluid-Einschlüsse kalkulierten Isochoren belegen, dass die Platznahme der Karbonatite unter P-T-Bedingungen von 4-5 kbar und 1200-630°C erfolgte. Unter Temperaturen von 800-530°C bewirkte die Zirkulation NaCl-reicher wässriger Fluide (19-30 Gew.% NaCl äquivalent) die Umwandlung von Albit der eingeschlossenen Anorthosit-Bruchstücke in Sodalith. Wie SRXRF-Analysen belegen, enthielten die fenitisierenden Fluide zudem geringe Konzentrationen an Sr, Ba, Fe, Nb und SEE. KW - Namibia KW - Mesoproterozoikum KW - Anorthosit KW - Syenit KW - Karbonatit KW - Gesteinsbildung KW - Anorthosit KW - Karbonatit KW - Namibia KW - Sodalith KW - Syenit KW - anorthosite KW - carbonatite KW - Namibia KW - sodalite KW - syenite Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6987 ER - TY - THES A1 - Abdel Rahman, Faisal Mirghani T1 - Systematic analysis of genes expressed in the retinal pigment epithelium (RPE) and identification of candidates for genetic susceptibility to age-related macular degeneration (AMD) N2 - Age related macular degeneration (AMD) is the leading cause of visual impairment in the elderly and the major cause of blindness in the developed world. To date, the molecular mechanisms underlying the disease are not well understood although in recent years a primary involvement of the retinal pigment epithelium (RPE) has become evident. The aim of the present study is to systematically analyse genes which are differentially expressed in the RPE, and to assess their possible association with mechanisms and pathways likely to be related to retinal disease, in particular AMD. Towards this goal, 2379 expressed sequence tags (ESTs) were established from an inhouse generated RPE cDNA library. This library was constructed by using the suppression subtraction hybridization (SSH) technique which normalises redundant sequences and ensures enrichment of rare transcripts. In a first phase, 1002 ESTs were sequenced and subjected to comprehensive alignment with public nucleotide and protein databases. A search of the 1002 ESTs against the human genome draft sequence yielded 168 known genes, 51 predicted genes, 15 unknown transcripts and 41 clones with no significant similarity. Reverse Northern blot hybridization was performed for 318 EST clusters to identify abundantly expressed genes in the RPE and to prioritize subsequent analyses. Representative clones were spotted onto a nylon membrane and hybridized with cDNA probes of driver (heart and liver) and tester (RPE) used in the cDNA library construction. Subsequently, 107 EST clusters were subjected to Northern blot hybridizations. These analyses identified 7 RPE-specific, 3 retina-specific, 7 RPE/retina-specific, and 7 tissue restricted transcripts, while 29 EST clusters were ubiquitously expressed, and evaluation was not possible for another 54 EST clusters. Of the 24 transcripts with specific or restricted expression, 16 clones were selected for further characterization. The predicted gene MGC2477 and 2 novel isoforms of the human transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3 (TRPM3) were cloned and further described in detail. In addition, polymorphic variations for these 2 genes as well as for the human MT-Protocadherin gene were determined. For MGC2477, 15 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified, with 13 having a frequency of the minor allele greater than 20%. 10 of the 15 SNPs have not been reported in so far in public SNP repertoires. Partial assessment of the TRPM3 gene yielded 35 SNPs. Of these, 30 (85.7%) were highly frequent (0.17-0.5%), and 14 (40%) were novel. The MT-Protocadherin gene revealed 35 SNPs, including 28 (80%) with high frequency of the minor allele. 23 (65.7%) were novel SNPs. These SNPs will be used to construct the most common haplotypes. These will be used in case/control association studies in 400 AMD patients and 200 ethnically and aged matched controls to assess a possible contribution of these genes in the etiology of AMD. N2 - Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache von gravierenden Einschränkungen des Sehvermögens im fortgeschrittenen Lebensalter. In den Industriestaaten ist die AMD zudem die Hauptursache für Altersblindheit. Die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung der AMD führen, sind bisher nur unzureichend bekannt. In den letzten Jahren hat es sich jedoch herausgestellt, dass das retinale Pigmentepithel (RPE) eine primäre Rolle in der Pathogenese der AMD spielt. Ziel dieser Arbeit war die systematische Analyse von Genen, welche im RPE differentiell exprimiert werden. Entsprechende Kandidatengene sollten auf deren mögliche Beteiligung an der Entstehung von Erkrankungen der Retina, insbesondere der AMD, untersucht werden. Zunächst wurden 2379 ESTs aus einer innerhalb der Arbeitsgruppe generierten RPE cDNA Bibliothek definiert. Die dazu verwendete cDNA Bibliothek wurde durch die Suppressions- Subtraktions Hybridisierungs-Technik (SSH) konstruiert. Diese Technik gestattet eine Normalisierung gegenüber redundanten Sequenzen und begünstigt gleichzeitig die Anreicherung von seltenen Transkripten. In einer ersten Phase wurden 1002 ESTs sequenziert und einer umfassenden bioinformatischen Analyse mit Hilfe der verfügbaren DNA- und Protein Datenbanken unterzogen. Der Vergleich der 1002 ESTs mit der Draft Sequenz des menschlichen Genoms ergab den Hinweis auf 168 bereits bekannte Gene, 51 mögliche Gene, 15 völlig unbekannte Transkripte und 41 nicht weiter zuordenbare cDNA Klone. 318 EST Cluster wurden einer reversen Northen-Blot Analyse unterzogen um hochexprimierte Gene zu identifizieren und damit Prioritäten für die weiteren Analysen zu setzen. Im Rahmen der Northern-Analyse wurden repräsentative Klone von 107 EST-Klustern mit cDNA Sonden der ursprünglichen cDNA-Bibliothek hybridisiert. Als Ergebnis dieser Analyse fanden sich 7 RPE-spezifische, 3 Retina-spezifische, 7 sowohl RPE- als auch Retinaspezifische sowie 7 auf einzelne Gewebe limitierte Transkripte. 29 EST Cluster erwiesen sich als ubiquitär exprimiert, und 54 Kluster konnten nicht näher zugeordnet werden. Von den 24 Transkripten mit spezifischer oder zumindest begrenzter Expression wurden 16 Klone zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Aus diesen Material wurden im Rahmen dieser Arbeit das Kandidatengen MGC2477 sowie 2 neue Isoformen des menschlichen TRPM3-Gens kloniert und näher charakterisiert. Weiterhin wurden polymorphe Varianten dieser beiden Isoformen und des menschlichen MTProtocadherin- Gens definiert. Im Gen MGC2477 wurden 15 SNPs identifiziert, wovon die Allelhäufigkeit des selteneren Allels bei 13 der SNPs über 20% lag. Für 10 der insgesamt 15 vii SNPs dieses Gens fanden sich bisher keine Einträge in den entprechenden Datenbanken. Die SNP-Suche wurde auch für das TRPM3-Gen durchgeführt und ergab 35 SNPs, wovon 30 (85,7%) als hochfrequent eingestuft werden konnten. 14 dieser 35 SNPs waren bisher nicht in den Datenbanken verzeichnet. Beim MT-Protocadherin-Gen fanden sich ebenfalls 35 SNPs, wobei 80% eine hohe Frequenz des selteneren Allels aufwiesen. In diesem Fall handelte es sich bei 23 der insgesamt 35 SNPs um bisher unbekannte Allele. Diese SNPs bilden den Ausgangspunkt zur Konstruktion der häufigsten Haplotypen der genannten Gene. Mit der Charakterisierung der Einzel-Nukleotid Polymorphismen der Kandidatengene wurde die Grundlage zur Durchführung von Fall/Kontrollstudien gelegt, in deren Rahmen die Bedeutung der jeweiligen Kandidatengene in der Pathogense der AMD untersucht werden kann. KW - Senile Makuladegeneration / Pigmentepithel / Genexpression KW - RPE KW - AMD KW - RPE specific genes Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7053 ER - TY - THES A1 - Nedvetsky, Pavel I. T1 - Regulation of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase T1 - Regulation des Rezeptor des Stickstoffoxides löslicher Guanylylcyclase N2 - Soluble guanylyl cyclase (sGC) is the best established receptor for nitric oxide (NO) and regulates a great number of important physiological functions. Surprisingly, despite the wellappreciated roles of this enzyme in regulation of vascular tone, smooth muscle cell proliferation, platelet aggregation, renal sodium secretion, synaptic plasticity, and other functions, extremely little is known about the regulation of sGC activity and protein levels. To date, the only well-proven physiologically relevant sGC regulator is NO. In the present study, some additional possibilities for sGC regulation were shown. Firstly, we evaluated the ability of different NO donors to stimulate sGC. Significant differences in the sGC stimulation by SNP and DEA/NO were found. DEA/NO stimulated sGC much stronger than did SNP. Interestingly, no correlation between the sGC protein and maximal activity distribution was found in rat brain regions tested, suggesting the existence of some additional regulatory mechanisms for sGC. The failure of SNP to stimulate sGC maximally might be one of the reasons why the lack of correlation between the distribution of sGC activity and proteins in brain was not detected earlier. Prolonged exposure of endothelial cells to NO donors produced desensitization of the cGMP response. This desensitization cannot be explained by increased PDE activity, since PDE inhibitors were not able to prevent the NO donor-induced decrease of the maximal cGMP response in endothelial cells. The failure of SH-reducing agents to improve the cGMP response after its desensitization by NO suggests that a SH-independent mechanism mediates NO effects. Demonstration that the potency of the recently described activator of oxidized (heme-free) sGC, BAY58-2667, to stimulate sGC increases after prolonged exposure of the cells to an NO donor, DETA/NO, suggests that oxidation of heme may be a reason for NOinduced desensitization of sGC and decrease in sGC protein level. Indeed, the well-known heme-oxidizing agent ODQ produces a dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells and BAY58-2667 prevents this effect. Although the mechanism of sGC activation and stabilization by BAY58-2667 is unknown, this substance is an interesting candidate to modulate sGC under conditions where sGC heme iron is oxidized. Very little is known about regulation of sGC by intracellular localization or translocation between different intracellular compartments. In the present study, an increase in sGC sensitivity to NO under membrane association was demonstrated. Treatment of isolated lung with VEGF markedly increased sGC in membrane fractions of endothelial cells. Failure of VEGF to stimulate sGC membrane association in cultured endothelial cells allows us to propose a complex mechanism of regulation of sGC membrane association and/or a transient character of sGC membrane attachment. A very likely mechanism for the attachment of sGC to membranes is via sGCinteracting proteins. These proteins may participate also in other aspects of sGC regulation. The role of the recently described sGC interaction partner, Hsp90, was investigated. Shortterm treatment of endothelial cells with an Hsp90 inhibitor does not affect NO donor or calcium ionophore-stimulated cGMP accumulation in the cells. However, inhibition of Hsp90 results in a rapid and dramatic decrease in sGC protein levels in endothelial cells. These effects were unrelated to changes in sGC transcription, since inhibition of transcription had much slower effect on sGC protein levels. In contrast, inhibitors of proteasomes abolished the reduction in sGC protein levels produced by an Hsp90 inhibitor, suggesting involvement of proteolytic degradation of sGC proteins during inhibition of Hsp90. All these data together suggest that Hsp90 is required to maintain mature sGC proteins. In conclusion, in the present study it was demonstrated that multiple mechanisms are involved in the regulation of sGC activity and its sensitivity to NO. Oxidation of sGC heme by NO seems to be one of the mechanisms for negative regulation of sGC in the presence of high or prolonged stimulation with NO. Another possible means of regulating sGC sensitivity to NO is via the intracellular translocation of the enzyme. It has been also demonstrated here that attachment of sGC to the membrane fraction results in an apparent increase in the enzyme sensitivity to NO. Additionally, Hsp90 was required to maintain sGC protein in endothelial and other cell types. However, we could not find any acute affect of Hsp90 on sGC activity, as reported recently. All these findings demonstrate that the regulation of sGC activity and protein level is a much more complex process than had been assumed earlier. N2 - Lösliche Guanylylcyclase (sGC) ist der Hauptrezeptor für Stickstoffmonooxid (NO), der sich an der Regulation zahlreicher physiologischer Funktionen beteiligt. Trotz ihrer sehr gut untersuchten Rolle in der Regulation der Blutgefässenrelaxation, synaptische Plastizität, Aggregation der Trombozyten, renale Sekretion und anderen wichtigen Funktionen, ist die Regulation der sGC selber noch nicht ausreichend verstanden. Der einzige, zur Zeit bekannte, physiologische Regulator der sGC ist NO. In der vorgelegten Arbeit wurde die Existenz anderer Möglichkeiten der sGC Regulation gezeigt. Zuerst, wurde die Fähigkeit verschiedener NO Donoren sGC zu stimulieren untersucht. DEA/NO stimulierte sGC viel stärker als SNP. Interessanterweise, wurde keine Korrelation zwischen der Verteilung des sGC Proteins und der Enzymaktivität unter Vmax- Bedingungen in verschiedenen Rattenhirnregionen gefunden. Das deutet auf zusätzliche Regulationsmechanismen hin. Die fehlende Fähigkeit von SNP sGC maximal zu stimulieren könnte ein Grund dafür sein, warum dieses Phänomen nicht schon früher gezeigt wurde. Langfristige Behandlung von Endothelzellen mit NO Donoren produzierte eine Desensitisierung der nachfolgenden cGMP Antwort. Diese Desensitisierung kann nicht durch erhöhte Phosphodiesterase-Aktivität erklärt werden, da Phosphodiesterasenhemmer die durch NO Donor verursachte Abnahme der cGMP Antwort nicht rückgängig macht. SHreduzierende Substanzen waren nicht in der Lage die cGMP Antwort zu verbessern, was zur Annahme führt, dass SH-Gruppenoxidation keine wichtige Rolle bei der Wirkung von NO auf sGC spielt. Es müssen daher andere Regulationsmechanismen vorhanden sein. Oxidation des Häms scheint ein möglicher Mechanismus der NO-induzierten sGC Desensitisierung. Einkürzlich beschriebener Aktivator der oxidierten (bzw. Häm-freien) sGC, BAY58-2667, stimulierte sGC nach Vorbehandlung mit NO Donoreb stärker als ohne Vorbehandlung. Es wird vermutet, dass oxidierte sGC verstärkt abgebaut wird was die durch NO oder Häm oxidierende Substanzen induzierte sGC Proteinabnahme erklären würde. Tatsächlich, nahm sGC Proteinlevel nach der Behandlung mit der Häm oxidierenden Substanz, ODQ, ab. BAY58-2667 verhinderte diesen Effekt. Ferner erhöht die Membranassoziation von sGC derer Empfindlichkeit gegenüber NO. Die Membranassoziation der sGC in Endothelzellen ist reguliert. Behandlung isolierter Lunge mit VEGF erhöht den Anteil an membrangebundener sGC in Endothelzellen dramatisch. In kultivierten Endothelzellen könnte VEGF die Membranassoziation jedoch nicht stimulieren, was einen komplexen Mechanismus der Membranassoziation der sGC in vivo vermuten lässt. Wenig ist bekannt über die Interaktionen von sGC mit anderen Protein und der möglichen Rolle dieser Interaktionen bei der Regulation des Enzyms. Proteininteraktionen scheinen aber ein möglicher Mechanismus für die Membranassoziation der sGC zu sein. Aus diesem Grund wurde die Rolle eines vor kurzem beschriebenen sGC-bindenden Proteins, Hsp90, auf die sGC Regulation untersucht. Kurzfristige Behandlung der Endothelzellen mit Hsp90 Inhibitoren hat keine Auswirkung auf NO Donor- und Calciumionophore-stimulierte cGMP-Produktion. Langfristige Hemmung von Hsp90 führte dagegen zur schnellen und deutlichen Abnahme des sGC Proteins. Dieser Effekt ist nicht durch eine Veränderung der Translation zu erklären, weil Tranlationshemmer einen viel langsameren sGC Abfall verursachten. Im Gegenteil, konnte ein Proteasomeninhibitor, MG132, die Effekte von Hsp90 Hemmern rückgängig machen. Das lässt eine proteolytische Abbau der sGC für die Effekte von Hsp90 Hemmer verantwortlich machen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Hsp90 für Aufrechterhaltung des Enzyms notwendig ist. Zusammenfassend, wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass sGC Aktivität und ihre Empfindlichkeit gegenüber ihren Aktivator NO durch multiple Faktoren beeinflusst werden kann. Oxidation des Häms durch NO könnte ein Mechanismus der negativen Regulation der sGC bei dauernd erhöhter Konzentration von NO sein. Ein zusätzlicher Mechanismus der Regulation der Empfindlichkeit der sGC gegenüber NO scheint die intrazellulare Translokation zu sein. Wir konnten hier zeigen, das die Membranassoziation der sGC ihre Empfindlichkeit gegenüber NO erhöht. Auch dieProteinlevel der sGC scheinen unter Kontrolle verschiedener Faktoren zu sein. Einer davon ist Hsp90, der für die Aufrechterhaltung des sGC Proteins sowohl in Endothelzellen als auch in anderen Zelltypen notwendig ist. Alle diese Daten zeigen, dass Regulation der sGC ein viel komplexerer Vorgang ist als bis her angenommen wurde und eröffnen interessante neue Forschungsrichtungen innerhalb dieses wichtigen Signalweges. KW - Guanylatcyclase KW - Regulation KW - lösliche Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Häm KW - Hsp90 KW - soluble guanylyl cyclase KW - cGMP KW - heme KW - Hsp90 Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7046 ER - TY - THES A1 - Fadl El Mola, Faisal Mohamed T1 - Bioinformatic and molecular approaches for the analysis of the retinal pigment epithelium (RPE) transcriptome N2 - There is substantial interest in the identification of genes underlying susceptibility to complex human diseases because of the potential utility of such genes in disease prediction and therapy. The complex age-related macular degeneration (AMD) is a prevalent cause of legal blindness in industrialized countries and predominantly affects the elderly population over 75 years of age. Although vision loss in AMD results from photoreceptor cell death in the central retina, the initial pathogenesis likely involves processes in the retinal pigment epithelium (RPE) (Liang and Godley, 2003). The goal of the current study was to identify and characterize genes specifically or abundantly expressed in the RPE in order to determine more comprehensively the transcriptome of the RPE. In addition, our aim was to assess the role of these genes in AMD pathogenesis. Towards this end, a bovine cDNA library enriched for RPE transcripts was constructed in-house using a PCR-based suppression subtractive hybridization (SSH) technique (Diatchenko et al., 1996, 1999), which normalizes for sequence abundance and achieves high enrichment for differentially expressed genes. CAP3 (Huang and Madan, 1999) was used to assemble the high quality sequences of all the 2379 ESTs into clusters or singletons. 1.2% of the 2379 RPE-ESTs contains vector sequences and was excluded from further analysis. 5% of the RPE-ESTs showed homology to multipe chromosomes and were not included in further assembly process. The rest of the ESTs (2245) were assembled into 175 contigs and 509 singletons, which revealed approximately 684 unique genes in the dataset. Out of the 684, 343 bovine RPE transcripts did not align to their human orthologues. A large fraction of clones were shown to include a considerable 3´untranslated regions of the gene that are not conserved between bovine and human. It is the coding regions that can be conserved between bovine and human and not the 3’ UTR (Sharma et al., 2002). Therefore, more sequencing from the cDNA library with reclustering of those 343 ESTs together with continuous blasting might reveal their human orthologoues. To handle the large volume of data that the RPE cDNA library project has generated a highly efficient and user-friendly RDBMS was designed. Using RDBMS data storage can be managed efficiently and flexibly. The RDBMS allows displaying the results in query-based form and report format with additional annotations, links and search functions. Out of the 341 known and predicted genes identified in this study, 2 were further analyzed. The RPE or/and retina specificity of these two clones were further confirmed by RT-PCR analysis in adult human tissues. Construction of a single nucleotide polymphism (SNP) map was initiated as a first step in future case/control association studies. SNP genotyping was carried out for one of these two clones (RPE01-D2, now known as RDH12). 12 SNPs were identified from direct sequencing of the 23.4-kb region, of which 5 are of high frequency. In a next step, comparison of allele frequencies between AMD patients and healthy controls is required. Completion of the expression analysis for other predicted genes identified during this study is in progress using real time RT-PCR and will provide additional candidate genes for further analyses. This study is expected to contribute to our understanding of the genetic basis of RPE function and to clarify the role of the RPE-expressed genes in the predisposition to AMD. It may also help reveal the mechanisms and pathways that are involved in the development of AMD or other retinal dystrophies. N2 - Es besteht ein grosses medizinisches Interesse an der Identifizierung von Genen, welche an der Entstehung komplexer, häufiger Krankheiten des Menschen beteiligt sind. Eine solche Krankheit ist die alters-korrelierte Makuladegeneration (AMD). Die AMD ist eine der häufigsten Ursachen für den Verlust der Sehfähigkeit im Alter von über 75 Jahren. Obwohl die Erblindung bei der AMD letztlich durch das Absterben von Photorezeptor-Zellen in der zentralen Retina bedingt wird, gibt es genügend Hinweise dafür, dass die Pathogenese der AMD ihren Ausgang vom retinalen Pigmentepithel (RPE) nimmt (Liang and Godley, 2003). Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von RPE-spezifischen Genen als Beitrag zur umfassenden Charakterisierung des RPE-Transkriptoms. Darüberhinaus war es Ziel der Arbeit, die mögliche Rolle der RPE-spezifischen Gene bei der Entstehung der AMD zu explorieren. Ausgangspunkt der Arbeit war eine RPE-spezifische, bovine cDNA Bibliothek, welche in der Arbeitsgruppe auf der Grundlage der SSH-Technik (Diatchenko et al, 1996, 1999) hergestellt worden war. Die SSH-Technik gestattet die Anreicherung von differentiell exprimierten Genen bei gleichzeitiger Normalisierung redundanter Sequenzen. Mit Hilfe des Software-Programms CAP3 (Huang and Madan, 1999) wurden insgesamt 2379 ESTs gruppiert und geordnet. 1,2% der 2379 RPE-ESTs enthielten Vektor Sequenzen und wurden daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen. 5% der RPE-ESTs wiesen Homologien zu multiplen Chromosomen auf und wurden daher ebenfalls von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die übrigen 2245 ESTs wurden in 175 Contigs und 509 Singletons gruppiert, woraus sich Hinweise auf insgesamt 684 putative Einzelgene ergaben. 343 dieser 684 Klone zeigten jedoch keine Homologien zu humanen orthologen Sequenzen. Ursache für die fehlende Homologie muss in der grossen Zahl der Klone gesehen werden, bei welchen nur die 3´untranslatierten verglichen wurden. Im Gegensatz zu den kodierenden Sequenzabschnitten kommt es in den nicht-kodierenden Regionen in der Regel zu einer relativ raschen evolutionären Divergenz und damit zum Verlust der Homologie (Sharma et al, 2002). Durch zusätzliche Sequenzierung und Sequenzvergleiche der kodierenden Bereiche dieser 343 Klone lassen sich möglicherweise weitere RPE-spezifische Gene finden. Um die grosse Anzahl der im Rahmen des RPE-Projektes generierten Daten bearbeiten zu können wurde eine sehr effiziente und Benutzer-freundliche Datenbank auf Grundlage des RDBMS-Moduls etabliert. Dieses System gestattet die interaktive Bearbeitung der gespeicherten Daten im Query-Format. Darüberhinaus können die Daten in beliebiger Weise annotiert und verbunden werden. Nach Abzug der 343 nicht-homologen cDNA Klone von den 684 putativen Einzelsequenzen verblieben 341 Kandidaten-Sequenzen. 2 dieser Sequenzen wurden als putative neue RPE-spezifische Gene einer weiteren Analyse zugeführt. Dabei wurde zunächst die RPE- bzw. Retina-Spezifität dieser Kandidaten-Sequenzen mit Hilfe der RT-PCR Analyse bestätigt. Als Basis für zukünftige Fall-Kontroll- und Assoziationsstudien wurde eine SNP-Genotypisierung eines dieser zwei Klone (ursprüngliche Bezeichnung: RPE01-D2; derzeitige Bezeichnung: RDH12) durchgeführt. Die direkte Sequenzanalyse umfasste 23.4 kb und ergab insgesamt 12 SNPs, von denen sich 5 als hoch-informativ erwiesen. Auf dieser Grundlage können zukünftig Allel-Frequenzen zwischen Kontrollpersonen und AMD-Patienten ermittelt und verglichen werden. Zukünftig werden darüberhinaus real-time PCR Methoden zur Expressionsanalyse der verbliebenen Kandidaten-Klone eingesetzt. Zusammenfassend liefert die vorliegende Arbeit einen Beitrag zum Verständnis der genetischen Grundlagen der RPE-Funktionen und trägt zur Aufklärung der Rolle von RPE-spezifischen Genen bei der Disposition zur AMD bei. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf Kandidatengene, welche möglicherweise in der Pathogenese der AMD eine Rolle spielen. KW - Senile Makuladegeneration KW - Netzhaut KW - Pigmentepithel KW - Molekulargenetik KW - RPE KW - Bioinformatics KW - Age-related macular degeneration KW - Molecular approaches Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6877 ER - TY - THES A1 - Kittisak Sripha, T1 - NOVEL HETEROCYCLIC RING SYSTEMS DERIVED FROM CARACURINE V AS LIGANDS FOR THE ALLOSTERIC SITE OF MUSCARINIC M 2 RECEPTORS T1 - Neue heterozyklische Ringsysteme abgeleitet von Caracurine V als Liganden für die allosteriche Bindungstelle der Muscarin-M2-Rezeptoren N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Gebiet allosterischer Modulation des muscarinischen M2 Rezeptors. Allosterische Liganden beeinflussen das Bindungsverhalten eines orthosterischen Liganden (Agonisten oder Antagonisten) an die klassische Bindungsstelle des muscarinischen Rezeptors, indem sie seine Affinität entweder erhöhen(positive Kooperativität) oder erniedrigen (negative Kooperativität). Die allosterische Bindungsstelle befindet sich extrazellulär am Eingang der Rezeptor-Bindungstasche. Sie ist weniger konserviert als die orthosterische Bindungsdomäne, die tiefer im Rezeptorkanal zwischen den sieben transmembranalen Domänen lokalisiert ist. Demzufolge ist die Entwicklung subtyp-spezifischer allosterisch wirkenden Liganden leichter als subtypspezifischer Agonisten oder Antagonisten. Die Subtypselektivität kann darüber hinaus über unterschiedliche Kooperativitäten zwischen dem orthosterischen und allosterischen Liganden an verschiedenen muscarinischen Subtypen erreicht werden. Ein am M1-Rezeptor mit Acetylcholin positiv kooperativer allosterer Modulator, der sich an anderen muscarinischen Subtypen neutral kooperativ verhält, könnte z.B. für die Therapie von Morbus Alzheimer eingesetzt werden. Bisquartäre Ammoniumsalze des Strychnos-Alkaloids Caracurin-V gehören zu den potentesten allosterischen M2-Liganden. Die relative Stellung der aromatischen Indolringe und der Abstand zwischen den positiv geladenen Stickstoffatomen (ca. 10) in dem sehr starren Caracurin-V-Ringsystem definieren den Pharmakophor für potente allosterische Modulatoren. Caracurin-V-Salze sind strukturell sehr verwandt mit den starken Muskelrelaxantien Toxiferin-I und Alcuronium und besitzen vermutlich selbst neuromuskulär-blockierende Eigenschaften, was ihre Anwendung in der pharmakologischen Forschung einschränken würde. Reduktion des Caracurin-V-Ringsystems auf die wesentlichen Pharmakophorelemente könnte zu allosterisch wirksamen Verbindungen mit vernachlässigbarer muskelrelaxierender Wirkung führen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese und pharmakologische Testung von Derivaten eines neuen, von Caracurin V abgeleiteten, heterocyclischen Ringsystems. Das neue gewünscht 6,7,14,15-Tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole-Ringsystem(6) wurde in einer intermolekularen N-Alkylierung von zwei Molekülen Bromethylindol 5 aufgebaut. Die Ausgangsverbindung 5 konnte aus dem Indolylessigsäuremethylester 3 durch Reduktion der Estergruppe zum Alkohol und anschließende Substitution durch Brom dargestellt werden. Der bekannte Ester 3 wurde ausgehend von Tryptamin erhalten. Die dreistufige Synthese umfasste N-Dibenzylierung, Einführung der Malonestergruppe am C-2 von Indol und anschließende Demethoxycarbonylierung. Die Totalsynthese des neuen Pentacyclus ist im Schema 24 dargestellt. Die 3D-Struktur des neuen Ringgerüstes konnte mit Hilfe von NMR-Spektroskopie und semiempirischen Rechnungen (AM1) aufgeklärt werden. Verbindung 6 liegt in Lösung in einer verdrehten Wanne-Konformation mit unsymmetrisch angeordneten Seitenketten vor. Um den Einfluss der Seitenkettenlänge des neuen Ringsystems auf die allosterische Wirksamkeit zu untersuchen, war es geplannt, die Ethylamin-Gruppen durch Methylamin-Einheiten zu ersetzen. Der entsprechende Syntheseplan bestand darin, das unsubstituierte Ringsystem in einer doppelten Mannich-Reaktion zu aminomethylieren. Der Ausgangsstoff für die Dimerisierung, Bromethylindol 32, wurde aus Indol-2-carbonsäure hergestellt. Die Synthese umfasste folgende Reaktionsschritte: Reduktion der Carboxylgruppe und Benzoylierung des resultierenden Alkohols, nucleophile Substitution mit Kaliumcyanid, alkalische Hydrolyse des Cyanids zu Indolacetessigsäure, erneute Reduktion zum Alkohol und abschließende Substitution mit Brom. Da Dimerisierungsversuche von 32 nur zur Bildung des HBr-Eliminierungsproduktes 33 führten, wurde das entsprechende Tosylat als Ausgangsstoff eingesetzt. Überraschenderweise entstand nicht das erwartete Diazocinodiindol-Ringgerüst, sondern ausschließlich ein isomeres, noch nicht bekanntes 6,7,14,15-Tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindol-Ringsystem 35. Die Bildung des neuen unsymmetrischen Ringsystems ist auf den ambidenten Charakter des Indolylanions zurückzuführen, das entweder am Sticksoff oder an C3 alkyliert werden kann. Umsetzung von 35 nach Mannich lieferte das bisaminoalkylierte Produkt 37, neben einer kleinen Menge der monoalkylierten Verbindung 36. Die Totalsynthese des zweiten Ringsystems ist im Schema 25 dargestellt. Um potentere Verbindungen zu erhalten, wurden beide Endstufen 6 bzw. 37 mit Methyliodid zu 14 bzw. 38 quaternisiert. 37 wurde zusätzlich mit Allylgruppen zu 39 substituiert. Die pharmakologische Testung von 14, 37, und 38 erfolgte über Radioligandbindungsstudien an Membransuspensionen der Herzventrikel des Hausschweins. Der allostere Effekt der Testverbindungen wurde über die Hemmung der Dissoziation von [3H]-N-Methylscopolamin([3H]-NMS) von den damit gesättigten Rezeptoren gemessen. Die erhaltenen EC50,diss-Werte geben die Konzentration des allosteren Modulators an, bei der die [3H]-NMS-Dissoziation auf die Hälfte des Kontrollwertes reduziert ist. Sie sind ein Maß für die Affinität der Testsubstanzen zur allosterischen Bindungsstelle des M2 Rezeptors. Für die einzige Verbindung mit dem Diazocinodiindole-Ringsystem 14 wurde ein EC50,diss-Wert von 54 nM gemessen. Da 14 über vier Benzylsubstituenten verfügt, kann seine Bindungsaffinität am besten mit der von Dibenzylcaracurinium-Dibromid verglichen werden, die ganz ähnlich ist (69 nM). Aufgrund der Tatsache, dass die Verkleinerung des NSubstituenten am Caracurin-V-Gerüst zur erheblichen Steigerung der allosterischen Potenz führte, ist zu erwarten, dass der Austausch der voluminösen Benzylgruppen von 14 durch z.B. Methyl- oder Allylsubstituenten, eine deutliche Affinitätssteigerung bewirken würde. Damit scheint die allosterische Potenz des neuen Ringsystems mindestens genauso gut zu sein, wie die von Caracurin V. Die beiden Vertreter des Azocinodiindol-Ringsystems, 38 und 39, sind bereits mit den Gruppen substituiert, die die beste allosterische Potenz bei dem Caracurin-V-Ringsystem zeigten (Methyl- und Allyl). Ihre EC50,diss-Werte (35 nM für 38, 48 nM für 39) sprechen jedoch für eine ca. 4-fach schwächere Bindungsaffinität als die der entsprechenden Caracurine, was vermutlich auf einen anderen Abstand zwischen den quartären Stickstoffatomen und eine andere relative Stellung der Indolaromaten in den beiden Ringsystemen zurückzuführen ist. Anders als die entsprechenden Caracurin-V-Salze, sind 38 und 39 negativ kooperativ mit dem Antagonisten [3H]NMS. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass von den beiden neu synthetisierten heterocyclischen Ringsystemen das direkt von Caracurin V abgeleitete Tetrahydro- [1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]diindol eine bessere und vielversprechende Leitstruktur für die Entwicklung neuer potenter allosterischen Liganden des M2-Rezeptors darstellt. Weitere synthetische Arbeiten an dem Ringsystem wie z.B. Variation des Sticksstoffsubstituenten und der Seitenkettenlänge sollten zu einer Steigerung der Bindungsaffinität in den subnanomolaren Bereich führen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse der pharmakologischen Testung an dem muskulären Typ des nicotinischen Acetylcholinrezeptors abzuwarten. N2 - The study deals with the area of the allosteric modulation of the muscarinic M2 receptors. The allosteric modulators have an influence on binding of orthosteric ligands (agonists and antagonists) to the classical orthosteric binding site of the muscarinic M2-receptors. The modulators are able to enhance (positive cooperativity) or decrease (negative cooperativity)the affinity of ligands to the orthosteric binding site. The allosteric binding site is located at the entrance of the receptor binding pocket. It is less conserved than the orthosteric binding site which is located in a narrow cavity created by the seven transmembrane domains. Consequently, development of subtype selective allosteric ligands is easier than subtypeselective muscarinic agonists or antagonists. Furthermore, subtype selectivity can be achieved by differently cooperative interactions between the allosteric and orthosteric ligand at different receptor subtypes. For example, the allosteric modulators that are positively cooperative with ACh at M1 receptors and neutrally cooperative at the other receptor subtypes could be beneficial for treatment of the Alzheimer’s disease. Bisquaternary analogues of the Strychnos alkaloid caracurine V are among the most potent allosteric modulators of muscarinic M2-receptors. The very rigid ring skeleton comprises the pharmacophoric elements of two positively charged nitrogens at an approximate distance of 10 surrounded by two aromatic ring systems in a distinct spatial arrangement. Owing to the close structural relationship of caracurine V salts to the strong muscle relaxants toxiferine and alcuronium, they are likely to exhibit neuromuscular blocking activity, which would limit their usefulness as research tools and make the therapeutical use impossible. Reduction of the caracurine V ring skeletons to structural features responsible for good allosteric potency could possibly lead to compounds with negligible neuromuscular blocking activity and very high affinity to the allosteric binding site at M2 receptor. Thus, the aim of this study was to synthesize and pharmacologically evaluate analogues of a novel heterocyclic ring system, which comprises the pharmacophoric elements mentioned previously. The key step of the synthesis of the desired 6,7,14,15-tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole ring system (6) involved the intermolecular double N-alkylation of the bromoethylindole (5), which was prepared from the known indolyl methylacetate (3) by reduction of the ester group to alcohol and subsequent substitution by bromine. 3 could be prepared in three steps involving N,N-dibenzylation of tryptamine followed by introduction of the dimethyl malonate moiety at C-2 of indole ring and a subsequent demethoxycarbonylation. The total synthesis of 6,7,14,15-tetrahydro[1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]diindole ring system (6) is shown in Scheme 24. In order to examine the influence of the length of the side-chain on muscarinic activity,exchange of the ethylamine moieties of 14 by the methylamino groups was planned. This should be accomplished by dimerization of the unsubstituted 2-bromoethylindole (32), and subsequent Mannich aminomethylation of the resulting unsubstituted pentacyclic ring. The total synthesis of the 6,7,14,15-tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindole ring system(35) is shown in Scheme 25. 32 was prepared from indole-2-carboxylic acid in six steps involving reduction of the acid to the corresponding alcohol 26, benzoylation of 26 followed by nucleophilic substitution with KCN, hydrolysis of the cyanide 28 to indolyl acetic acid 29,reduction of 29 to the corresponding alcohol 30, and finally bromination of 30 to give the bromide 32. Since dimerization attempts of 32 provided only 2-vinylindole (33), the tosylate 34 was used as starting material for the intermolecular alkylation to give exclusively an isomeric pentacyclic ring system, 7,14,15-tetrahydro-15aH-azocino[1,2-a:6,5-b]diindole (35). The formation of the novel, asymmetric ring skeleton can be explained by the ambident nucleophilic character of the indolyl anion that can be alkylated either at nitrogen or at C-3 of indole ring. 35 was subjected to a Mannich reaction to give 2,13-dimethylaminoalkylated product 37 as well as small amounts of the 13-monosubstituted compound (36). The geometry of novel ring systems 6 was elucidated by means of NMR spectroscopy and semiempirical calculations. The diazocinodiindole ring skeleton of 6 exists in chloroform solution at room temperature in a twisted-boat conformation, as indicated by 600 MHz ROESY experiment, vicinal coupling constants within the eight-membered ring, and AM1 calculations. In order to obtain potent allosteric ligands, the new heterocycles 6 and 37 were quarternized with methyliodide to the corresponding ammonium salts 14 and 38, respectively. Additionally, the N,N -diallylsalts of 37 (compound 39) was prepared. The allosteric effect of 14, 38, and 39 on the dissociation of the orthosteric radioligand [3H]Nmethylscopolamine([3H]NMS) and their effects on [3H]NMS equilibrium binding were studied in homogenates of porcine heart ventricles. The concentration of an allosteric agent for a half-maximum effect on orthosteric ligand dissociation (EC50,diss) corresponds to a 50 % occupancy of the liganded receptors by the respective allosteric test compounds. Due to the presence of two benzyl groups on each nitrogen in the side chains of 14, its binding affinity can be best compared with that of N,N -dibenzylcaracurinium V dibromide (EC50,diss = 69 nM). Compound 14 exhibited the comparable affinity to N,N -dibenzylcaracurinium V dibromide with EC50,diss = 54 nM. This result suggested that replacement of the bulky benzyl groups of 14 by smaller substitutents will probably increase the allosteric potency, since dimethyl- and diallylcaracurinium salts showed a 5-fold increase of binding affinity relative to the dibenzyl analogue. Even though the new azocinodiindole ring system of 38 and 39, is not included in the caracurine V ring skeleton, it comprises the essentially pharmacophoric elements of allosteric potency. Due to the different spatial arrangements of the aromatic rings, as well as to different internitrogen distances in both ring systems, compound 38 and 39 exhibited 4-fold lower M2 binding affinity (EC50,diss = 35 and 48 nM, respectively) than the corresponding caracurine V analogues. This study deals with the synthesis of the first representative (Compound 6) of a novel pentacyclic ring system derived from caracurine V. The high allosteric potency of its dimethyl analogue reveals the [1,5]diazocino[1,2-a:6,5-a]-diindole ring system as a new promising lead structure for allosteric modulators of muscarinic M2 receptors. Future research will be focused on structural modifications of the new ring system in order to increase the affinity to the muscarinic receptors. Furthermore, the binding affinities of the new synthesized compounds to the muscle type of nicotinic ACh-receptor should reveal structural features responsible for the muscarinic/nicotinic selectivity. KW - Muscarinrezeptor KW - Allosterischer Effektor KW - Strychnosalkaloide KW - Analoga KW - Chemische Synthese KW - Allosterisch Modurator KW - Muscarinrezeptor KW - Tetrahydro[1 KW - 5]diazocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-a']diindol KW - Tetrahydro-15aH-azocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-b']diindol KW - Allosteric Modulator KW - Muscarinic receptor KW - Tetrahydro[1 KW - 5]diazocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-a']diindole KW - Tetrahydro-15aH-azocino[1 KW - 2-a:6 KW - 5-b']diindole Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6841 ER - TY - THES A1 - García Arguinzonis, Maísa Inés T1 - Analysis of signal transduction pathways and the cytoskeleton in VASP-deficient cell lines and mouse models N2 - The mammalian Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) is a founding member of the Ena/VASP family of proteins that includes Drosophila Enabled (ena), the mammalian Ena homologue (Mena) and the Ena-VASP-like protein (Evl). VASP was initially discovered and characterized as a substrate for cGMP- and cAMP-dependent protein kinases (cGKs and cAKs). Ena/VASP proteins are involved in Actin-filament formation, plasma membrane protrusion, acceleration of Actin-based motility of Listeria and the establishment of cell-cell adhesion. Moreover, Ena/VASP proteins have been implicated as inhibitory factors in repulsive axon guidance and inhibition of plasma membrane activity and random motility in fibroblast. In order to study the physiological function of VASP, VASP-deficient mice had been generated in the laboratory by homologous recombination. VASP-/- mice showed hyperplasia of megakaryocytes in the bone marrow and spleen and a two-fold increase in thrombin- and collagen-induced platelet activation. To further investigate the cellular function of VASP, I established cardiac fibroblast cell lines derived from both wild type and VASP-/- mice. Both cell lines presented similar growth rates and normal contact dependent-growth inhibition but showed differences in morphology, migration and adhesion. Adherent VASP-/- cells, despite normal Mena and Evl expression levels, were highly spread. VASP-/- cells covered about twice the substrate surface area as wild type cells, while the cell volumes were unchanged. This shape difference suggests that VASP is involved in the regulation of spreading. Since the small GTPases Rac and Cdc 42 and their effector p21-activated kinase (Pak) are key regulators of lamellipodia formation and cell spreading, I analyzed this signalling pathway in VASP-/- cells stimulated with Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) or fetal calf serum. In wild type cells Rac and Pak were rapidly and transiently activated by PDGF or serum; however, in the absence of VASP both Rac and Pak activation was dramatically prolonged. The Rac/Pak pathway is known to play an essential role in cell motility. VASP deficient cells showed compromised migration and reorientation in a wound healing assay, probably due to enhanced Rac activity. The spreading phenotype, compromised migration and the effect observed on the Rac and Pak activities were reverted in VASP-/- cells stably transfected with full lenght human VASP, indicating a VASP dependent modulation of the Rac/Pak pathway and Rac/Pak regulated processes. Moreover, adhesion and detachment of VASP-deficient cells were significantly slower when compared to wild type cells. Preincubation of VASP+/+ cells with a cGMP analog accelerated adhesion. This acceleration did not take place in the VASP-/- cells, suggesting a VASP dependent effect. The second part of this work focused on VASP function in platelets. On the one hand I investigated the possibility of VASP-dependent Rac regulation in mouse platelets. Murine platelets are a good model for studying Rac regulation since they express high levels of VASP but not Mena/Evl and since VASP-deficient platelets show an increased platelet activation. Rac was activated by platelet agonists which was inhibited by preincubation with cGMP and cAMP analogs. Initial results which need to be extended showed that the cGMPcaused inhibition of Rac activation was VASP-dependent. Finally, in vivo platelet adhesion (platelet-vessel wall interactions) was studied using VASP-deficient mice. These studies demonstrated in-vivo that VASP down regulates platelet adhesion to the vascular wall under both physiological and pathophysiological conditions. N2 - Das Säugerprotein Vasodilator Stimulated Phosphoprotein (VASP) ist ein Gründungsmitglied der Ena/VASP Proteinfamilie, die das Drosophila Enabled (ena), das homologe Säugerprotein ena (Mena) und das Ena-VASP-like Protein (Evl) einschließt. VASP wurde ursprünglich als ein Substrat von cGMP- und cAMP abhängigen Proteinkinasen (cGKs und cAKs) entdeckt und charakterisiert. Ena/VASP Proteine sind bei der Polymerisation von Aktinfilamenten, bei der Protrusion von Plasmamembranen, der Beschleunigung von Aktinbasierter Beweglichkeit von Listerien und bei der Ausbildung von Zell-Zell-Adhäsionen beteiligt. Außerdem wurde gezeigt, dass Ena/VASP-Proteine hemmende Faktoren bei der repulsiven Axonführung sind und sowohl die Plasmamembranaktivität als auch die ungerichtete Fibroblastenbeweglichkeit hemmen. Um die physiologische Funktion von VASP zu untersuchen, wurden VASP-defiziente Mäuse im Labor durch homologe Rekombination generiert. VASP-/- Mäuse zeigten eine Hyperplasie der Megakaryozyten im Knochenmark und in der Milz sowie eine zweifache Erhöhung der durch Thrombin und Kollagen induzierten Plättchen-Aktivierung. Um die zelluläre Funktion von VASP weiter aufzuklären, etablierte ich kardiale Fibroblasten- Zelllinien sowohl von Wildtyp als auch von VASP-/- Mäusen. Beide Zelllinien zeigten gleiche Wachstumsraten und eine normale, kontaktabhängige Wachstumshemmung, hatten aber Unterschiede in ihrer Morphologie, Wanderung und Adhäsion. Adhärente VASP-/- Zellen waren trotz normaler Mena und Evl Expression stark ausgebreitet. VASP-/- Zellen bedeckten eine ungefähr zweimal so große Substratoberfläche wie Wildtyp-Zellen, während das Zellvolumen unverändert war. Diese Formunterschiede lassen vermuten, dass VASP bei der Regulation der Ausbreitung involviert ist. Da die kleinen GTPasen Rac und Cdc 42 und ihr Effektorsystem p21-aktivierte Kinase (Pak) Schlüsselregulatoren der Lamellipodienformierung und der Zellausdehnung sind, untersuchte ich diesen Signalweg in VASP-/- Zellen, die mit Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) oder fetalem Kälberserum stimuliert wurden. In Wildtypzellen wurden Rac und Pak schnell und transient durch PDGF oder Serum aktiviert, in der Abwesenheit von VASP war die Aktivierung von Rac und Pak jedoch dramatisch verlängert. Der Rac/Pak Signalweg ist dafür bekannt, dass er eine essentielle Rolle bei der Zellbeweglichkeit spielt. VASP defiziente Zellen zeigten, wahrscheinlich wegen der erhöhten Rac Aktivität, eine veränderte Wanderung und Reorientierung in einem Wundheilungs-Versuch. Der ausgebreitete Phänotyp, die veränderte Wanderung und die beobachteten Effekte bei den Rac und Pak Aktivitäten wurden in VASP-/- Zellen, die stabil mit humanem VASP transfiziert wurden, normalisiert, was eine VASP abhängige Steuerung des Rac/Pak Signalwegs und der Rac/Pak regulierten Prozesse vermuten läßt. Weiterhin waren die Adhäsion und die Ablösung von VASP-defizienten Zellen signifikant langsamer als in den Wildtyp-Zellen. Die Vorinkubation von VASP+/+ Zellen mit einem cGMP-Analog beschleunigte die Adhäsion. Diese Beschleunigung fand in VASP-/- Zellen nicht statt, was einen VASP-abhängigen Effekt vermuten läßt. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die VASP Funktion in Thrombozyten. Einerseits untersuchte ich die VASP-abhängige Regulation von Rac in murinen Thrombozyten. Diese sind dafür besonderes gut geeignet, da sie VASP aber nicht Mena/Evl exprimieren und da VASP-defiziente Thrombozyten verstärkt aktiviert werden. Rac wurde durch Thrombozyten-Agonisten aktiviert, was durch eine Präinkubation mit cGMP- und cAMP-Analoga gehemmt wurde. Erste Ergebnisse, die noch einer weiteren Bestätigung bedürfen, zeigten, daß die cGMP-vermittelte Hemmung der Rac-Aktivierung VASP-abhängig war. Abschließend wurde auch die in-vivo Plättchen-Adhäsion (Thrombozyten-Gefäßwand- Interaktion) unter Einsatz von VASP-defizienten Mäusen untersucht. Diese Ergebnisse zeigten für in-vivo-Bedingungen, daß VASP die Thrombozyten-Adhäsion an die Gefäßwand sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen unterdrückt. KW - Vasodilatator-stimuliertes Phosphoprotein KW - Maus Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6195 ER - TY - THES A1 - Jovcic, Alexander T1 - Applications of aerobic and anaerobic bacteria in the fields of biological degradation of contaminants and biological wastewater treatment T1 - Applikation von aeroben und anaeroben Bakterien in den Bereichen biologischer Schadstoffabbau und biologische Abwasserreinigung N2 - In the work here presented four distinctly different problems were investigated. The first problem was an investigation into the degradation of Dichloroethylene (DCE) and 1,1-bis (p-Chlorophenyl)-2-dichloroethylene (DDE) utilising pure bacterial cultures. The second investigation dealt with the degradation of DDE and polychlorinated Biphenyl’s (PCB’s) utilising anaerobic sediments and soils from New Zealand. The third investigation worked on the Granulation of anaerobic River-sediments in Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) Reactors. The last investigation describes the commissioning of an industrial aerobic Wastewater Treatment Plant and the Implementation of biological Nitrogen- and Phosphate removal in this Wastewater Treatment Plant. Since the chemical Structure of DCE and DDE have certain similarities, Bacteria that were capable of degrading DCE, were tested here, whether they would also be able to degrade DDE utilising a co-metabolic pathway. In the experiments the aerobic bacteria Methylosinus trichosporium and Mycobacterium vaccae and the anaerobic bacteria Acetobacterium woodii and Clostridium butyricum were used. Approximately 60% of the added DCE was degraded by M. vaccae, while M. trichosporium degraded approximately 50%. A. woodii and C. butyricum degraded 40% and 30% respectively of the added DCE. Further experiments with these cultures and DDE lead to a microbial degradation of DDE to an extent of 34.6% for M. vaccae, 14.1% for C. butyricum, 2.2% for A. woodii and 10.5% for M. trichosporium. Additional experiments, utilising [14C]-DDE, showed that the DDE had not been degraded but were attached to the bacterial cells. The second investigation utilised anaerobic soils and sediments from New Zealand to study the anaerobic co-metabolic degradation of DDE and PCB’s. The soils and sediments originated from the River Waikato, from Wastewater Ponds in Kinleith, Marine-Sediments from Mapua, and a variety of soils comtaminated with Pentachlorophenyl (PCP). The cultures from these soils and sediments were raised on a variety of Carbon- and Energy-sources. Beside DDE, Aroclor 1260, and a mix of four pure PCB-Congeneres (one Tetra-, one Hexa, one Hepta- and one Deca-Chlorobiphenyl) were used to test for the reductive dechlorination. The cultivation process of the baceria lasted six months. Samples of the cultures were taken after zero, three and six months. These samples were tested for the increase of cell-protein, the degradation of carbon- and energy-sources, and the removal of the added polychlorinated chemicals. The organochlorines were analysed using reversed phase HPLC and FID-GC. When a change in the Chromatogram was detected the respective cultures were further analysed using ECD-GC and GC-MS. The results showed that the culutres grew under these conditions, but no degradation of DDE and the PCB-Mix could be detected, and only small changes in the composition/chromatograms of Aroclor 1260 were found. The third investigation worked on the Granulation of River-Sediments in UASB-Reactors. Sediments from the River Waikato in New Zealand and the River Saale in Germany were used. In both cases the Granulation process was successful, which was demonstrated by microscopic comparisons of the Sediments and the resulting Granules. The two main bacterial cultures detected were Methanosarcina- and Methanothrix-like cultures. The main carbon- and energy-source was Lactic Acid, which was used at a concentration of 21,8 g COD/L. The Granulation-Process was a combination of using high a COD-Concentration combined with a low Volumetric Loading-Rate. Comparisons of the specific degradation-rates of a variety of carbon- and energy-sources between the Sediments and the Granules, showed no increased degradation rates in regard to the same cell-mass, but the increased bio-mass in the Granules allowed for higher degradation-rates within the UASB-reactors. The fourth investigation describes the commissioning of an industrial Wastewater Treatment Plant for a Dairy-Site in Edendale, Southland, New Zealand. This Plant consists of a DAF-Unit (Dissolved Air Flotation), two Extended Aeration Lagoons with Activated Sludge and two Clarifiers, one for the Activated Sludge and the second for the dosing of Aluminium-Sulphate and the removal of Phosphat-Sulphate. Biological processes for the removal of carbon- and energy-sources were optimised and biological processes for the reduction of Nitrogen- and Phosphate-Concentrations within the wastewater were implemented and optimised. Bilogical removal rates for COD of 95% and above, for Nitrogen of 85-92% and Phosphate of 64-83% were achieved. N2 - In der hier vorgelegten Arbeit wurden vier distinkt verschiedene Probleme untersucht. Das erste Problem war die Untersuchung in den Abbau von Dichloroethylene (DCE) und 1,1-bis (p-chlorophenyl)-2-dichloroethylene (DDE) mithilfe von reinen bakteriellen Kulturen. Die zweite Untersuchung beschaeftigte sich mit dem Abbau von DDE und polychlorinierten Biphenylen (PCB’s) mithilfe von anaeroben Sedimenten und Erden aus New Zealand. Die dritte Untersuchung behandelt die Granulation von anaeroben Fluss-sedimenten in Upflow Anaerobic Sludge Blanket (UASB) Reaktoren. Die letzte Untersuchung behandelt das Anfahren einer industriellen aeroben Abwasser-anlage und die Implementierung von biologischem Stickstoff- und Phosphat-abbau in dieser Abwasser-anlage. Da die chemische Struktur von DCE und DDE gewisse Aehnlichkeiten besitzt, wurden hier wurden Bakterien untersucht, die in der Lage sind DCE abzubauen, ob diese DDE in einer cometabolischen Reaktion abbauen koennen. In den Experimenten wurden die aeroben Bakterien Methylosinus trichosporium und Mycobacterium vaccae und die anaeroben Bakterien Acetobacterium woodii und Clostridium butyricum benutzt. Ungefaehr 60% des hinzugefuegten DCE’s wurde von M. vaccae abgebaut, whaerend M. trichosporium ca 50% abbaute. A. woodii und C. butyricum bauten jeweils 40% und 30% des zugefuegten DCE’s ab. Weiterfuehrenden Experimente mit den obigen Kulturen und zugefuegtem DDE fuehrte zu einem mikrobiologischen Abbau von DDE in den Kulturen von 34.6% fuer M. vaccae, 14.1% fuer C. butyricum, 12.2% fuer A. woodii und 10.5% fuer M. trichosporium. Weitere Experimente, bei denen [14C]-DDE benutzt wurde, ergaben, dass das DDE nicht abgebaut worden war, sondern es stellte sich heraus, dass das DDE an die Bakterienzellen angelagert worden war. Die zweite Untersuchung benutzte anaerobe Erden und Sedimente aus New Zealand um den anaeroben cometabolischen Abbau von DDE und PCB’s zu studieren. Die Erden und Sedimente stammten von dem Fluss Waikato, aus Abwasser-Teichen in Kinleith, Meeresboden-Sedimenten aus Mapua, und verschiedene Erden die mit Pentachlorophenyl (PCP) kontaminiert waren. Die Kulturen aus diesen Erden und Sedimenten wurde mit verschiedenen Kohlenstoff- und Energie-Quellen aufgezogen. Neben DDE wurden Aroclor 1260 und ein Mix aus vier reinen PCB-Congeneren (ein Tetra-, ein Hexa, ein Hepta- und ein Deca-Chlorobiphenyl) fuer die reduktive Dechlorinierung benutzt. Die Aufzucht der Bakteria dauert sechs Monate, Proben wurden am Start der Kultivierung, nach drei und nach sechs Monaten genommen. Diese Proben wurden fuer die Veraenderung des Zellproteins, den Abbau der Kohlenstoof- und Energie-Quellen, und das Verschwinden der zugefuegten polychlorinierten Chemikalien ananlysiert. Die Organochlorine wurden mithilfe von reversed HPLC und dann FID-GC untersucht. Wenn eine Veraenderung in den Chromatogrammen auftrat wurden die entsprechenden Kulturen mithilfe von ECD-GC und GC-MS weitergehend untersucht. Die Resultate zeigten ein wachsen der Kulturen an, aber keinen Abbau von DDE und dem PCB-Mix, und nur geringe Veraenderungen der Komposition von Aroclor 1260. Die dritte Untersuchung befasste sich mit der Granulierung von anaeroben Fluss-sedimenten in UASB Reaktoren. Dafuer wurden Sedimente von dem Waikato in New Zealand und der Saale in Deutschland benutzt. In beiden Faellen war die Granulation erfolgreich, was durch mikroskopische Vergleiche von den Sedimenten und den Granules festgestellt werden konnte. Die zwei hauptsaechlichen Bakterien Kulturen waren Methanosarcina und Methanothrix aehnliche Kulturen. Die Haupt-Kohlenstoff- und Energie-Quelle war Lactic Acid und wurde mit einer Konzentration von 21,8 g COD/L verwendet. Der Granulations-Prozess war eine Kombination von einer hohen COD-Konzentration verbunden mit einer niedrigen volumetrischen Ladungs-Rate. Vergleiche der spezifischen Abbauraten von verschiedenen Kohlenstoff- und Energie-Quellen zwischen den Sedimenten und den Granules, ergab keine erhoehten Abbauraten in Bezug auf die gleiche Zellmasse, aber die erhoehte Biomasse in den Granules sorgt fuer groessere Abbauraten in den UASB Reaktoren. Die vierte Untersuchung befasste sich mit dem Anfahren einer industriellen Abwasser-Anlage fuer eine Molkerei in Edendale, Southland, New Zealand. Diese Anlage besteht aus einer DAF-Unit (Dissolved Air Flotation), zwei Abwasser-Teichen mit aktiver Schlammbehandlung und zwei Klaerbecken, eines fuer die Aktiv-Schlamm-Beseitigung und das zweite fuer die Dosierung von Aluminiumsulphat und die Entfernung von Phosphat-Sulphat. Biologische Verfahren zum Abbau von Kohlenstoff-Verbindugen wurden optimiert und biologische Verfahren zur Verringerung von Stickstoff- und Phospaht-Konzentrationen im Abwasser wurden implementiert und optimiert. Biologische Abbau-Raten fuer COD von ueber 95%, fuer Stickstoff 85-92% und Phosphat 64-83% wurden erreicht. KW - Biologische Abwasserreinigung KW - Bakterien Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6702 ER - TY - THES A1 - Groß, Michaela T1 - Genomic changes in Fanconi anemia: implications for diagnosis, pathogenesis and prognosis T1 - Genomische Veränderungen bei Fanconi-Anämie N2 - Fanconi anemia (FA) is a genetically and phenotypically heterogenous autoso- mal recessive disease associated with chromosomal instability, progressive bone marrow failure, typical birth defects and predisposition to neoplasia. The clinical phenotype is similar in all known complementation groups (FA-A, FA-B, FA-C,FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G). The cellular phenotype is characterized by hypersensitivity to DNA crosslinking agents (MMC,DEB), which is exploited as a diagnostic tool. Alltogether, the FA proteins constitute a multiprotein pathway whose precise biochemical function(s) remain unknown. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF and FANCG interact in a nuclear complex upstream of FANCD2. Complementation group FA-D1 was recently shown to be due to biallelic mutations in the human breast cancer gene 2 (BRCA2). After DNA damage, the nuclear complex regulates monoubiquitylation of FANCD2, result- ing in targeting of this protein into nuclear foci together with BRCA1 and other DNA damage response proteins. The close connection resp. identity of the FA genes and known players of the DSB repair pathways (BRCA1, BRCA2, Rad51) firmly establishs an important role of the FA gene family in the maintenance of genome integrity. The chapter 1 provides a general introduction to the thesis describing the current knowledge and unsolved problems of Fanconi anemia. The following chapters represent papers submitted or published in scientific literature. They are succeeded by a short general discussion (chapter 7). Mutation analysis in the Fanconi anemia genes revealed gene specific mutation spectra as well as different distributions throughout the genes. These results are described in chapter 1 and chapter 2 with main attention to the first genes identified, namely FANCC, FANCA and FANCG. In chapter 2 we provide general background on mutation analysis and we report all mutations published for FANCA, FANCC and FANCG as well as our own unpublished mutations until the year 2000. In chapter 3 we report a shift of the mutation spectrum previously reported for FANCC after examining ten FA-patients belonging to complementation group C. Seven of those patients carried at least one previously unknown mutation, whereas the other three patients carried five alleles with the Dutch founder mu- tation 65delG and one allele with the Ashkenazi founder mutation IVS4+4A>T, albeit without any known Ashkenazi ancestry. We also describe the first large deletion in FANCC. The newly detected alterations include two missense mu- tations (L423P and T529P) in the 3´-area of the FANCC gene. Since the only previously described missense mutation L554P is also located in this area, a case can be made for the existence of functional domain(s) in that region of the gene. In chapter 4 we report the spectrum of mutations found in the FANCG gene com- piled by several laboratories working on FA. As with other FA genes, most muta- tions have been found only once, however, the truncating mutation, E105X, was identified as a German founder mutation after haplotype analysis. Direct compar- ison of the murine and the human protein sequences revealed two leucine zipper motifs. In one of these the only identified missense mutation was located at a conserved residue, suggesting the leucine zipper providing an essential protein-protein interaction required for FANCG function. With regard to genotype-phenotype correlations, two patients carrying a homozygous E105X mutation were seen to have an early onset of the hematological disorder, whereas the missense mutation seems to lead to a disease with later onset and milder clinical course. In chapter 5 we explore the phenomenon of revertant mosaicism which emerges quite frequently in peripheral blood cells of patients suffering from FA. We de- scribe the types of reversion found in five mosaic FA-patients belonging to com- plementation groups FA-A and FA-C. For our single FA-C-patient intragenic crossover could be proven as the mechanism of self-correction. In the remaining four patients (all of them being compound heterozygous in FANCA), either the paternal or maternal allele has reverted back to WT sequence. We also describe a first example of in vitro phenotypic reversion via the emergence of a compensat- ing missense mutation 15 amino acids downstream of the constitutional mutation explaining the MMC-resistance of the lymphoblastoid cell line of this patient. In chapter 6 we report two FA-A mosaic patients where it could be shown that the spontaneous reversion had taken place in a single hematopoietic stem cell. This has been done by separating blood cells from both patients and searching for the reverted mutation in their granulocytes, monocytes, T- and B-lymphocytes as well as in skin fibroblasts. In both patients, all hematopoietic lineages, but not the fibroblasts, carried the reversion, and comparison to their increase in erythrocyte and platelet counts over time demonstrated that reversion must have taken place in a single hematopoietic stem cell. This corrected stem cell then has been able to undergo self-renewal and also to create a corrected progeny, which over time repopulated all hematopoietic lineages. The pancytopenia of these patients has been cured due to the strong selective growth advantage of the corrected cells in vivo and the increased apoptosis of the mutant hematopoietic cells. N2 - Fanconi Anämie (FA) stellt eine sowohl genetisch als auch phänotypisch hetero- gene, autosomal rezessive Erkrankung dar. Charakteristische Merkmale dieser Erkrankung sind die chromosomale Instabilität, ein fortschreitendes Knochen- marksversagen, multiple kongenitale Abnormalitäten und eine Prädisposition zu diversen Neoplasien. Dieser klinische Phänotyp ist bei allen bisher bekannten Komplementationsgruppen (FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F and FA-G) ähnlich, ebenso wie der zelluläre Phänotyp, der durch Hy- persensitivität zu DNA-quervernetzenden Substanzen, wie MMC und DEB, gekennzeichnet ist. Diese Hypersensitivität wird dementsprechend in der FA-Diagnostik verwandt. Alle FA-Proteine arbeiten in einem "Multiprotein- Pathway" zusammen, dessen exakte biochemische Funktion noch nicht geklärt ist. FANCA, FANCC, FANCE, FANCF und FANCG interagieren in einem nukleären Komplex, der nach DNA-Schädigung die Monoubiquitylierung von FANCD2 reguliert, woraufhin man FANCD2 zusammen mit BRCA1 und anderen DNA-Reparaturproteinen in nukleären Foci detektieren kann. Die Komplemen- tationsgruppe FA-D1 wurde kürzlich biallelischen Mutationen im menschlichen Brustkrebsgen BRCA2 zugeordnet. Die enge Verbindung zwischen den FA- Genen und den Doppelstrangbruch(DSB)-Reparaturgenen (BRCA1, BRCA2, Rad51) deutet auf eine wichtige Rolle der FA-Genfamilie in der Erhaltung der genomischen Stabilität hin. Kapitel 1 gibt eine allgemeine Einleitung dieser Promotionsarbeit. Es liefert Hintergrundinformationen zu Fanconi Anämie basierend auf Publikationen bis einschließlich Mai 2002. In den darauffolgenden Kapiteln 2-6 sind eigene Veröf- fentlichungen zur Fanconi Anämie wiedergegeben, die entweder schon publiziert oder zur Veröffentlichung eingereicht worden sind. Zusätzlich zu den Diskussionsabschnitten in den einzelnen Veröffentlichungen werden diese fünf Arbeiten in Kapitel 7 kurz gemeinsam diskutiert. Die Mutationsanalyse in den diversen FA-Genen lieferte genspezifische Mutations- spektren sowie genspezifische Mutations-Verteilungen. Diese werden in Kapitel 1 und 2 beschrieben, wobei Kapitel 2 nur auf die zuerst entdeckten FA-Gene, FANCC, FANCA und FANCG, eingeht. In Kapitel 2 werden allgemeine Hinter- grundinformationen zur Mutationsanalyse geliefert und alle bis zum Jahr 2000 für FANCA, FANCC und FANCG publizierten Mutationen sowie unsere eigenen bis dato unveröffentlichten Veränderungen dargestellt. In Kapitel 3 berichten wir über eine bemerkenswerte Verschiebung des bisher beschriebenen FANCC-Mutationsspektrums. Von den zehn von uns untersuchten FA-C-Patienten trugen acht zumindest eine neue Mutation, wohingegen die drei restlichen Patienten fünf 65delG-Allele und ein IVS4+4A>T-Allel besaßen. Inter- essanterweise fanden wir auch erstmals große Deletionen im FANCC-Gen, deren Existenz bisher nur für FANCA beschrieben war. Weiterhin werden zwei bisher nicht bekannte Missense Mutationen (L423P und T529P) im 3´-Bereich des Gens beschrieben. In dieser Region findet sich auch der bisher einzige pathogene Aminosäureaustausch, L554P, was auf die Existenz einer funktionellen Domäne in dieser Genregion hindeutet. Außerdem scheinen unsere neu detektierten Muta- tionen vielmehr verstreut im Gen vorzuliegen als dies bisher angenommen worden war. Denn die bisher beschriebenen Veränderungen betreffen vor allem den Exon-bereich 5-6 sowie das amino- und carboxyterminale Ende von FANCC. Kapitel 4 beschreibt das Mutationsspektrum für FANCG, zusammengetragen von verschiedenen FA-Arbeitsgruppen. Wie in den anderen FA-Genen traten die meisten Mutationen auch hier nur einmal auf. Allerdings konnte die trunkierende Mutation, E105X, nach einer Haplotyp-Analyse als deutsche Gründermutation beschrieben werden. Ein direkter Vergleich der Proteinsequenzen von Men- sch und Maus ergab Hinweise auf konservierte Genabschnitte sowie auf zwei Leuzin-Zipper-Motive. Die einzige beschriebene Missense Mutation befindet sich in einem konservierten Bereich eines dieser beiden Leuzin-Zipper, was auf eine wichtige Rolle dieses Motivs für FANCG in Bezug auf Protein-Protein- Interaktionen schließen läßt. Obwohl die Anzahl der Patienten mit vergleichbaren Mutationen zu gering für statistisch signifikante Aussagen war, so fiel doch auf, dass bei den beiden Patienten mit einer homozygoten E105X-Mutation wesentlich früher hämatologische Probleme auftraten als bei dem Patienten mit der heterozygoten Missense Mutation, für den ein milder klinischer Verlauf sowie ein späteres Einsetzen hämatologischer Probleme berichtet wurde. Kapitel 5 und 6 behandeln das Phänomen des reversen Mosaizismus, der sehr häu- fig im Blut von FA-Patienten zu diagnostizieren ist. In Kapitel 5 beschreiben wir die Reversionsmechanismen von fünf Patienten, von denen einer der Komplemen- tationsgruppe C und die anderen vier der Komplementationsgruppe A angehören. Der Mechanismus, welcher der Selbstkorrektur des FA-C-Patienten zugrunde lag, konnte als intragene Rekombination definiert werden. Bei den verbleibenden vier compound heterozygoten FA-A-Patienten war jeweils eine Rückmutation zum Wildtyp auf dem mütterlichen bzw. väterlichen Allel ursächlich für die phäno- typische Gesundung der Blutzellen. Desweiteren beschreiben wir eine in vitro-Reversion in der lymphoblastoiden Linie eines unserer Patienten erstmals den Mechanismus einer sekundären Missense Mutation 15 Aminosäuren nach der kon- stitutionellen Mutation. Diese "kompensatorische" Mutation ist für die MMC- Resistenz der Zellinie verantwortlich. 4 von 5 der untersuchten Mosaik-Patienten zeigten eine eindeutige Verbesserung ihrer Blutwerte. Die Diagnose "Mosaizis-mus" verbessert offenbar die Prognose des Krankheitsbildes vor allem dann, wenn die Reversion eines Allels in einem frühen Stadium der Hämatopoiese auftritt. In Kapitel 6 berichten wir von zwei Mosaik-Patienten, bei denen untersucht wurde, wann in der Hämatopoiese die Reversion stattgefunden haben muss. Es konnte gezeigt werden, dass die Reversion in einer einzelnen hämatopoietischen Stammzelle erfolgte. Der Nachweis wurde durch die Isolierung einzelner Blutzell- typen, wie Granulozyten, Monozyten, T- und B-Zellen, aus dem peripheren Blut unserer Patienten sowie durch das Vorhandensein bzw. Nichtvorhanden- sein der Reversion in diesen Zellen geführt. Zum Vergleich wurden Hautfibrob- lasten herangezogen, da diese bei Mosaizismus im Blut nicht revertiert sind. In beiden Patienten trugen alle isolierten Blutzellen, nicht jedoch die Hautzellen, die Reversion. Dies und ein zusätzlicher Vergleich mit den zu diesem Zeit- punkt angestiegenen Erythrozyten- und Thrombozytenzahlen zeigten, dass die Reversion in einer einzigen hämatopoietischen Stammzelle stattgefunden haben muss. Dieser revertierten Stammzelle sind alle jeweils phänotypisch korrigierten Blutzellen zuzuschreiben, die dann die gesamte Hämatopoiese übernahmen und aufgrund eines in vivo Wachstumsvorteils sowie der erhöhten Apoptoserate der mutierten Zellen die Panzytopenie beider Patienten im Sinne einer "natürlichen" oder "spontanen" Gentherapie zur Ausheilung brachten. KW - Fanconi-Anämie KW - Genmutation KW - Fanconi Anämie KW - Mutationen KW - Mosaizismus KW - Reversion KW - Fanconi anemia KW - mutations KW - mosaicism KW - reversion Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6579 ER - TY - THES A1 - Schulte, Valerie T1 - In vitro and in vivo studies on the activating platelet collagen receptor glycoprotein VI in mice T1 - Glykoprotein VI, der aktivierende Kollagenrezeptor auf Blutplättchen - In vitro und in vivo Studien im Mausmodell N2 - The work summarized here focused on the characterization of the murine platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI and was performed to evaluate its potential as an antithrombotic target. The first mAb against (mouse) GPVI, JAQ1, was generated and used to demonstrate that GPVI requires the FcRgamma-chain for its expression and function and that this receptor is the central molecule in collagen-induced platelet activation. Blocking the major collagen binding site on GPVI with JAQ1 revealed the presence of a second activatory epitope within collagen. Additionally, the collagen receptor integrin alpha2beta1 was found to be required for activation via this second pathway but not to be essential for collagen-induced activation of normal platelets. In studies with mice expressing reduced levels of the GPVI-FcRgamma-complex, differential responses to GPVI ligands were observed. Most importantly, the striking difference between platelet responses to collagen and the GPVI specific synthetic collagen related peptide (CRP) confirmed the supportive role of other collagen receptor(s) on platelets. Irrespective of yet undefined additional receptors, studies with mice deficient in GPVI (FcRgamma-chain) or alpha2beta1 showed that GPVI, but not alpha2beta1 is essential for platelet-collagen interaction. Based on these results, the model of platelet attachment to collagen was revised establishing GPVI as the initial activating receptor which upregulates the activity of integrins, thus enabling firm attachment of platelets to the ECM. While the mAb JAQ1 had only limited inhibitory effects on collagen-induced activation in vitro, its in vivo application to mice resulted in completely abolished platelet responses to collagen and the GPVI specific agonists CRP and convulxin. This effect was found to be due to antibody-induced irreversible down-regulation of GPVI on circulating platelets for at least two weeks. Further studies revealed that GPVI depletion occurs independently of the targeted epitope on the receptor and does not require the divalent form of IgG as it was also induced by mAbs (JAQ2, JAQ3) or the respective Fab fragments directed against epitopes distinct from the major collagen binding site. The internalization of GPVI in vivo resulted in a long-term protection of the mice from lethal collagen-dependent thromboembolism whereas it had only moderate effects on the bleeding time, probably because the treatment did not affect other activation pathways. These results establish GPVI as a potential pharmacological target for the prevention of ischemic cardiovascular diseases and may open the way for a completely new generation of antithrombotics. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob der thrombozytäre Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP) VI eine geeignete Zielstruktur für neue Antithrombotika darstellt. Dazu wurden monoklonale Antikörper (mAk) gegen murines GPVI hergestellt (JAQ1, 2 und 3) und deren in vitro und in vivo Effekte im Maussystem untersucht. Es wurde erstmals gezeigt, dass die Expression und Funktion von GPVI auf Thrombozyten von der Assoziation mit der signaltransduzierenden Fc Rezeptor gamma-Kette abhängt. Obwohl GPVI als zentraler Kollagenrezeptor auf Thrombozyten identifiziert wurde, hat die Blockade der Hauptbindestelle für Kollagen mit JAQ1 die Aktivierung nicht vollständig inhibiert, was erstmals die Existenz zweier unabhängiger aktivierender Motive im Kollagen zeigte. Der Kollagenrezeptor Integrin alpha2beta1 ist essentiell für eine Aktivierung durch diesen alternativen Signalweg, nicht jedoch für die Kollagen-induzierte Aktivierung normaler Thrombozyten. Die Präsenz anderer Kollagenrezeptoren neben GPVI wurde in Untersuchungen an Thrombozyten mit reduzierten Expressionsraten des GPVI-FcRgamma-Komplexes bestätigt. Unabhängig davon wurde jedoch anhand von GPVI-, FcRgamma- und alpha2beta1-defizienten Mäusen belegt, dass GPVI, nicht aber wie zuvor angenommen alpha2beta1 der zentrale Kollagenrezeptor auf Thrombozyten ist. Diese Ergebnisse wurden in einem veränderten Modell der Thrombozyten-Kollagen Interaktion zusammengefasst, in dem GPVI als der initiale Rezeptor zur Integrinaktivierung und somit zur festen Adhäsion der Thrombozyten an die EZM etabliert wird. Im Gegensatz zu den in vitro Resultaten mit JAQ1 waren Thrombozyten von anti-GPVI-behandelten Mäusen weder durch Kollagen noch durch andere GPVI Liganden aktivierbar. Es zeigte sich, dass die Antikörper in vivo die Internalisierung sowie den proteolytischen Abbau des Rezeptors induzierten. Dieser Effekt war unabhängig von der Bindungsstelle auf GPVI und konnte auch mit monovalenten anti-GPVI Fab Fragmenten erzielt werden. Während der mindestens zweiwöchigen GPVI-Defizienz der zirkulierenden Thrombozyten waren die JAQ1-behandelten Mäuse vor Kollagen-induzierter Thromboembolie geschützt. Darüber hinaus hatte die GPVI-Depletion nur geringe Effekte auf die Blutungszeit, wahrscheinlich weil diese Behandlung keine anderen Aktivierungswege beeinflusste. Diese Ergebnisse zeigen, dass GPVI ein viel versprechendes pharmakologisches Zielprotein für die prophylaktische Therapie kardiovaskulärer Krankheiten ist, das als Grundlage zur Entwicklung neuer Antithrombotika dienen kann. KW - Maus KW - Kollagen KW - Rezeptor KW - Antithrombotikum KW - Kollagen KW - Glykoprotein VI KW - Maus KW - Plättchen KW - Antithrombotika KW - Collagen KW - Glycoprotein VI KW - Mouse KW - Platelets KW - Antithrombotics Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6564 ER -