TY - THES A1 - Werthmann, Ruth T1 - Echtzeit-Untersuchungen zur Thrombin-abhängigen Änderung der cAMP-Konzentration in lebenden Endothelzellen T1 - Real-time monitoring of thrombin-dependent changes of the cAMP concentration in living endothelial cells N2 - Das Endothel bildet eine einschichtige Zellbarriere zwischen Blut und interstitiellem Gewebe, deren Durchlässigkeit entscheidend durch die sekundären Botenstoffe Ca2+ und cAMP reguliert wird. Während Ca2+ durch eine verstärkte Kontraktion der Endothelzellen die Permeabilität erhöht, fördert cAMP die Adhäsion der Zellen und unterstützt somit die Barrierefunktion. Es ist bekannt, dass Thrombin durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und vermutlich auch durch eine Hemmung der cAMP-Konzentration zu einer Permeabilitätserhöhung führt. Ziel dieser Arbeit war es, Thrombin-induzierte Änderungen der cAMP-Konzentration in Echtzeit in lebenden Endothelzellen mittels Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer (FRET) zu untersuchen. Hierfür wurden Human-Umbilical-Vein-Endothelial-Cells (HUVECs) mit dem FRET-basierten cAMP-Sensor Epac1-camps transfiziert. Die Bindung von cAMP an Epac1-camps führt zu einer Konformationsänderung des Sensors und damit zu einer Abschwächung des FRET. Mit Hilfe dieses Sensors kann die cAMP-Konzentration mit hoher zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden Zellen gemessen werden. Untersucht wurde der Effekt von Thrombin auf die cAMP-Konzentration in Endothelzellen, deren cAMP-Konzentration durch Stimulierung endogener β-Rezeptoren erhöht war. Thrombin erniedrigte Ca2+-abhängig die cAMP-Konzentration um ca. 30 %. Dieser Abfall der cAMP-Konzentration folgte zeitlich verzögert dem Thrombin-induzierten Ca2+-Signal. Die cAMP-Konzentration erreichte ca. 30 s nach der Thrombinzugabe ein Minimum und stieg danach wieder an. Durch die Herunterregulierung der durch Ca2+ direkt inhibierten Adenylatzyklase 6 (AC6) mittels siRNA wurde die Thrombin-induzierte Abnahme der cAMP-Konzentration vollständig aufgehoben. Dies bestätigte, dass Thrombin durch die Ca2+-vermittelte Inhibierung der AC6 eine Abnahme der cAMP-Konzentration verursacht. Ohne β-adrenerge Stimulation führte die Applikation von Thrombin zu einem langsamen Anstieg der cAMP-Konzentration, der mehrere Minuten anhielt. Dieser cAMP-Konzentrationsanstieg beruhte auf der Ca2+-abhängigen Aktivierung der Phospholipase A2 (PLA2). Diese setzt Arachidonsäure aus Membranphospholipiden frei, die als Substrat für die Synthese verschiedener Prostaglandine dient. Durch die pharmakologische Beeinflussung von Zyklooxygenasen und Prostazyklinrezeptoren konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Prostazyklin und die anschließende Stimulation Gs-gekoppelter Prostazyklinrezeptoren zum Thrombin-induzierten Anstieg der cAMP-Konzentration führte. Da die Physiologie der Endothelzellen im Gefäß stark von Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung beeinflusst wird, ist die Messung der Änderungen der cAMP-Konzentration in Endothelzellen, die sich innerhalb eines Gewebes befinden, von sehr großer Bedeutung. Deshalb war die Generierung transgener Mäuse mit einer gewebespezifischen Expression des FRET-Sensors Epac1-camps in Endothelzellen ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Durch Anwendung eines Cre-Rekombinase/loxP-Ansatzes konnten transgene Mäuse generiert werden, die Epac1-camps spezifisch in Endothelzellen exprimierten. An isolierten pulmonären Endothelzellen konnte die Funktionalität des transgen exprimierten Sensors Epac1-camps nachgewiesen werden. Die Echtzeitmessung der Thrombin-induzierten Änderungen der cAMP-Konzentration verdeutlichte ein zeitlich sehr komplexes Wechselspiel zwischen Ca2+- und cAMP-Signalen, das die Barrierefunktion des Endothels maßgeblich beeinflussen wird. Die transgene Expression von Epac1-camps in Endothelzellen ermöglicht in Zukunft die Untersuchung der Thrombin-verursachten Änderungen der cAMP-Konzentration und der Permeabilität innerhalb eines intakten Gefäßes. N2 - Endothelial cells form a semi permeable barrier between blood and interstitial tissues. The permeability of this barrier is mainly regulated by the second messengers Ca2+ and cAMP. While Ca2+ increases the permeability by inducing cell contraction, cAMP increases the adherence of the cells and, thereby, supports the barrier function. The Ca2+-elevating agent thrombin was demonstrated to increase endothelial permeability and to decrease cAMP levels. The aim of this thesis was to investigate thrombin-induced changes of the cAMP concentration in real time in living endothelial cells via fluorescence resonance energy transfer (FRET). Therefore, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were transfected with the FRET-based cAMP sensor Epac1-camps. Binding of cAMP to the binding domain of Epac1-camps induces a conformational change of the sensor that results in a decrease of FRET. With help of this sensor, changes in cAMP concentration can be monitored with high temporal resolution. First, the influence of thrombin on cAMP levels was investigated after elevating cAMP levels by stimulation of β-adrenergic receptors. Thrombin led to a Ca2+-dependent decrease of cAMP levels by approximately 30 %. The decrease of cAMP levels was delayed compared to the thrombin-induced Ca2+ signal. This decrease was also transient and reached a minimum value 30 s after thrombin stimulation. A siRNA-mediated downregulation of the Ca2+-inhibited adenylyl cyclase 6 (AC6) completely abolished the thrombin-induced decrease of cAMP concentration. This provided the first direct evidence that the Ca2+-mediated inhibition of AC6 accounts for the thrombin-induced decrease in cAMP levels. In the absence of a β-adrenergic-mediated increase of cAMP concentration, thrombin led to a slow increase in cAMP concentration that lasted for several minutes. This increase in cAMP concentration was caused by the Ca2+-dependent activation of phospholipase A2 (PLA2). PLA2 releases arachidonic acid, which represents the substrate for prostaglandin synthesis. It was confirmed by pharmacological interference of cyclooxygenases and prostacyclin receptors that the synthesis of prostacyclin and subsequent stimulation of Gs-protein-coupled prostacyclin receptors caused the thrombin-induced increase in cAMP concentration. The real time monitoring of changes in cAMP concentration in endothelial cells within the vascular system is highly important as the physiology of endothelial cells in vivo is strongly influenced by factors contained in the surrounding blood or tissue. Therefore, a further aim of this thesis was the generation of transgenic mice expressing the FRET-based sensor Epac1-camps specifically in endothelial cells. Using a Cre-recombinase/loxP-approach transgenic mice were generated that specifically expressed Epac1-camps in endothelial cells, and the functionality of the transgenic sensor was proven in isolated pulmonary endothelial cells. Real time monitoring of thrombin-induced changes of cAMP concentration in endothelial cells revealed a temporally complex crosstalk between Ca2+ and cAMP signals that will affect endothelial barrier function. The transgenic expression of Epac1-camps opens the door for the investigation of thrombin-induced changes of cAMP levels and of endothelial permeability within intact vessels. KW - Cyclo-AMP KW - Endothelzelle KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Thrombin KW - cyclo-AMP KW - endothelial cells KW - fluorescence resonance energy transfer KW - thrombin Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46066 ER - TY - THES A1 - Tulke, Moritz T1 - Grundlegende Arbeiten zum bio-artifiziellen renalen Tubulus aus ko-kultivierten adipozytären mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen auf einer synthetischen Kapillarmembran T1 - Fundamental work on a bio-artificial renal tubule consisting of co-cultivated adipose-derived mesenchymal stem cells and endothelial cells on a synthetic capillary membrane N2 - Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind. N2 - Progressing chronic kidney disease results in the accumulation of uremic toxins and, if left untreated in end-stage kidney disease, death due to the developing uremic syndrome. The most common renal replacement therapy is hemodialysis. It is a life-prolonging therapy but only delivering inadequate blood purification, which is associated with excess morbidity and mortality of the patients. In hemodialysis, only uremic toxins with a molecular size of up to 20 kDa are removed by diffusion or convection. Solutes are eliminated by semi-selective size exclusion across a hollow fiber dialysis membrane in a dialyzer. Binding of certain uremic toxins to carrier proteins, such as albumin, results in an increased effective size, which excludes them from passing through dialysis membranes. In the native kidney, these protein-bound uremic toxins are eliminated from blood by secretory transport in the proximal tubule, a specific part of the tubular filtration apparatus of the nephron. The present doctoral thesis evaluated the first steps towards a so-called bio-artificial tubule. The intended biohybrid filter was supposed to consist of a co-culture of functional human proximal tubule cells and human endothelial cells on synthetic hollow fiber membranes. In its final form, it would be implemented during hemodialysis as an additional purification step to more efficiently remove protein-bound uremic toxins from the patients’ blood by active transport. The proximal tubule cells were differentiated from adipose-derived mesenchymal stem cells, which facilitates a later autologous treatment. The co-culture with endothelial cells should further promote the expression of transporters for organic anions and, thereby, potentially increase the secretion of protein-bound uremic toxins. In the present study, the differentiation from ASCs to a CK18-expression lineage, which confirmed successful epithelial differentiation, was induced by a combination of the soluble differentiation factors all-trans-retinoic acid, activin A and BMP-7. The expression of functional proteins, i.e., of aquaporin 1, which is relevant for water transport, and Na+-/K+-ATPase, was shown already before differentiation. Additionally, the present work demon-strated a high-quality co-culture of ASCs and HUVECs on the inner- and outer membrane surfaces of synthetic polypropylene- or polyethersulfone-based hollow fiber membranes, which initially were surface-modified with the extracellular matrix protein fibronectin. The viability of both cell types was thereby ensured by the application of a specific co-culture medium, which further increased the proliferation of ASCs intensely while maintaining their stem-cell character. The results of the present approach represent a promising basis for a bio-artificial renal tubule. The further development requires the differentiation of ASCs into proximal tubule cells on the 3D-bioreactor membrane and their characterization by verifying tubulusepithel-specific transporters. Finally, subsequent functional experiments have to precede an upscaling to clinically applicable modules. KW - Hohlfaserreaktor KW - Stammzelle KW - Endothelzelle KW - Adipozytäre mesenchymale Stammzelle KW - Bio-artifizieller Tubulus KW - Ko-Kultur Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216896 ER - TY - THES A1 - Schwarz, Ulrike T1 - Biochemische und Molekularbiologische Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Humanen Thrombozyten und Endothelzellen T1 - Biochemical and Molecular Characterization of Interactions Between Human Platelets and Endothelial Cells N2 - Der Blutkreislauf ist als wichtigstes Transportsystem im menschlichen Körper essentiell für die Versorgung der Gewebe und Organe mit Sauerstoff, Nährstoffen, Hormonen etc. Zwei Zelltypen, die eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung eines funktionell intakten Blutgefäßsystems spielen, sind Thrombozyten, die zentralen Mediatoren der Blutgerinnung, und Endothelzellen, welche die luminale Seite der Gefäßwände auskleiden. Diese beiden Zellen sind aber auch wesentlich an der Pathologie der Atherosklerose und kardiovaskulärer Erkrankungen beteiligt. Durch direkte und indirekte Interaktionen beeinflussen sich diese beiden Zelltypen gegenseitig und regulieren ihre Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Analysenmethode entwickelt, welche den Funktionszustand der Thrombozyten quantitativ erfaßt. Sowohl die Aktivierung als auch die Hemmung humaner Thrombozyten wird durch die Phosphorylierung spezifischer Signalproteine reguliert. Basierend auf der Verwendung phosphorylierungsspezifischer Antikörper und der Durchflußzytometrie wurde eine Methode etabliert, welche die Proteinphosphorylierung auf Einzelzellebene erfaßt, schnell quantifizierbare Ergebnisse liefert und für die Analyse im Vollblut geeignet ist. Da die Sekretion von Endothelfaktoren den Phosphorylierungszustand dieser Proteine in den Thrombozyten beeinflußt, kann die Methode auch dazu verwendet werden, indirekt Rückschlüsse auf den Funktionszustand der Endothelzellen zu gewinnen. In einer ersten klinischen Anwendung wurde die Methode eingesetzt, um den Therapieverlauf der antithrombotischen Medikamente Ticlopidin und Clopidogrel, welche gezielt die ADP-induzierte Thrombozytenaktivierung hemmen, zu verfolgen und das Antwortverhalten von Patienten auf diese Medikamente zu messen. Mehrere Personen, bei denen Ticlopidin und Clopidogrel keine Wirkung zeigten, wurden gefunden, ein Hinweis darauf, daß eine Resistenz gegen Thienopyridine vorkommt. Es ist bekannt, daß Endothelfaktoren bestimmte Aspekte der Thrombozytenaktivierung hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der p38 und p42 Mitogen-aktivierten Proteinkinasen, die im Verlauf der Thrombozytenaktivierung von zahlreichen Agonisten induziert wird, ebenfalls durch die endothelialen Vasodilatatoren NO (Stickstoffmonoxid) und Prostaglandin gehemmt wurde. Außerdem hemmten diese Substanzen die Translokation der inflammatorischen Moleküle P-Selektin und CD40 Ligand (CD40L) aus intrazellulären Speicherorganellen auf die Thrombozytenoberfläche. P-Selektin und CD40L werden auf aktivierten Thrombozyten exprimiert und sind direkt an der Interaktion von Thrombozyten mit Leukozyten und Endothelzellen beteiligt. Um die Auswirkung von CD40L, P-Selektin und weiteren Faktoren aktivierter Thrombozyten auf humane Endothelzellen zu untersuchen, wurde mit Hilfe von cDNA-Arrays die differentielle Genexpression in Endothelzellen nach Koinkubation mit aktivierten Thrombozyten analysiert. Neben einer bereits bekannten Hochregulierung von Faktoren, die an inflammatorischen Prozessen beteiligt sind, wurde eine verstärkte Expression von Transkriptionsfaktoren (c-Jun, Egr1, CREB2), Wachstumsfaktoren (PDGF) sowie von Adhäsionsrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine (Integrin av, Integrin b1) gefunden. Diese Faktoren weisen darauf hin, daß aktivierte Thrombozyten die Migration und Proliferation der Endothelzellen anregen und damit die Wundheilung, aber auch pathophysiologische Prozesse wie die Ausbildung atherosklerotischer Plaques induzieren könnten. N2 - The blood circulation is the human body's main transport system and is essential for supplying tissues and organs with oxygen, nutrients, hormones, etc. Blood platelets, the central mediators of coagulation, and endothelial cells which line the inner wall of blood vessels, play important roles in the maintenance of functionally intact blood vessels. On the other hand, these cells also participate in the pathogenesis of atherosclerosis and cardiovascular diseases. These two cell types mutually influence each other and regulate their activity via direct and indirect interactions. In this work, a method which allows quantitative analysis of platelet function was developed. Platelet activation and inhibition is regulated by phosphorylation of specific signaling proteins. Based on the use of phosphorylation-specific antibodies and flow cytometry, a method was established which measures protein phosphorylation in single cells, gives fast and quantitative results, and is also suitable for analysis of whole blood samples. Since secretion of endothelial cell factors influences the phosphorylation state of these proteins, the method may also be used to get indirect information about the functional integrity of endothelial cells. In a first clinical application, this method was used to monitor the progression of a therapy with the anti-thrombotic drugs ticlopidine and clopidogrel which selectively inhibit ADP-induced platelet activation, and to determine the patients' responsiveness to these drugs. Several non-responders were identified, indicating the existence of a thienopyridine resistance. Endothelial cell factors are known to inhibit different aspects of platelet activation. In this work, phosphorylation of platelet p38 and p42 mitogen-activated protein kinases, which is induced by various platelet activators, was found to be inhibited by the endothelium-derived vasodilators nitric oxide (NO) and prostacyclin. Furthermore, these endothelial cell factors inhibited translocation of the inflammatory molecules P-selectin and CD40 ligand (CD40L) from intracellular granules to the platelet surface membrane. P-selectin and CD40L are expressed on activated platelets and are directly involved in the interaction of platelets with leukocytes and endothelial cells. To study effects of P-selectin, CD40L, and other parameters of activated platelets on human endothelial cells, cDNA Arrays were used to analyze differential gene expression in endothelial cells after coincubation with activated platelets. Besides the already known up-regulation of certain inflammatory factors, a number of additional genes which belong mainly to the group of transcription factors (c-Jun, Egr1, CREB2) and growth factors (PDGF) and of adhesion receptors for extracellular matrix proteins (integrin av, integrin b1) was found to be up-regulated by activated platelets. Expression of these genes indicates that activated platelets may induce migration and proliferation of endothelial cells and thereby initiate wound healing, but may also have pathophysiological effects like the development of atherosclerotic plaques. KW - Thrombozyt KW - Endothelzelle KW - Genexpression KW - Phosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Endothelzellen KW - Durchflußzytometrie KW - Proteinphosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - Genexpression KW - cDNA-Arrays KW - Atherosklerose KW - platelets KW - endothelial cells KW - flow cytometry KW - protein phosphorylation KW - signal transduction KW - gene expression KW - cDNA arrays KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2030 ER - TY - THES A1 - Schleider, Elisa T1 - Angiogenese-Modellsysteme zur Funktionsanalyse des humanen CCM3 Proteins T1 - Angiogenesis in vitro modeling of human CCM3 function N2 - Zerebrovaskuläre kavernöse Malformationen (CCM) sind Blutgefäßfehlbildungen, welche hauptsächlich im Gehirn vorkommen. Sie sind gekennzeichnet durch stark dilatierte kapillarähnliche Gefäße mit niedriger Flussrate („slow-flow lesions“). Intervenierendes Gehirnparenchym fehlt ebenso wie Perizyten oder glatte Gefäßmuskelzellen. Die klinischen Symptome reichen von starken Kopfschmerzen über Epilepsie bis hin zum Schlaganfall. Dennoch bleiben viele Kavernomträger aufgrund unvollständiger Penetranz ihr Leben lang asymptomatisch. Die Prävalenz beträgt ca. 0,5% in der Gesamtbevölkerung. Es gibt sowohl sporadische als auch dominant vererbte Krankheitsformen. In den letzten Jahren konnten 3 Gene ursächlich mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden. Mutationen in CCM1, CCM2 oder CCM3 führen zu einem nicht unterscheidbaren klinischen Phänotyp. Alle drei Proteine bilden einen ternären Komplex in vitro, was eine Beteiligung an einem gemeinsamen molekularen Signalweg bekräftigt. Während die Proteine CCM1 und CCM2 in den letzten Jahren umfangreich erforscht wurden, ist über das CCM3-Protein bis heute wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CCM3 eine wichtige Rolle in der Angiogenese spielt und diese bei Überexpression in humanen Endothelzellen stark negativ reguliert: die Migration, die Proliferation und die Fähigkeit, kapillarähnliche Strukturen in Matrix-Gelen zu bilden kommt nahezu zum Erliegen. Ein gegenläufiger Effekt nach siRNA induziertem Knock-down von CCM3 war weniger stark ausgeprägt. Einzig die Fähigkeit, gefäßähnliche Strukturen in Matrigelen zu bilden, war erhöht. Um weiterhin Klarheit über die intrazellulären, von CCM3 beeinflussten Signalwege zu schaffen, wurden Tyrosin Kinase Arrays durchgeführt, bei welchen CCM3-überexprimierende HUVEC Lysate mit Kontrolllysaten verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass 5 Substrate signifikant erhöht phosphoryliert wurden: der Discoidin Domänen Rezeptor 1 (discoidin domain receptor; DDR1), die duale spezifitätstyrosinphosphorylierungsregulierte Kinase 1A (dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A; DYR1A), die Protoonkogen Tyrosin- Protein Kinase FER (proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER; FER), die fynbezogene Kinase (Fyn-related kinase; FRK) und die phosphoinositolabhängige Kinase 1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1, PDPK-1). Im Folgenden bestätigten Western Blot, dass die Überexpression von CCM3 in Endothelzellen die phosphoinositolabhängige Kinase 1 und die nachgeschaltete Serin-Threonin Kinase Akt/PBK aktiviert, welche ein bedeutsames Überlebenssignal der Zelle darstellt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass CCM3 nicht nur antiangiogen, sondern auch antiapoptotisch wirkt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass CCM3 für die Integrität des ruhenden, adulten Endothelbettes wichtig ist. N2 - Cerebral cavernous malformations are slow-flow vascular lesions, mainly located in the brain. They consist of blood-filled dilated capillary-like vessels without brain parenchyma or mural cells. Clinical symptoms include intense headaches, epilepsy and stroke. However, about 40% of lesion carriers live without any symptoms throughout their lives due to incomplete penetrance. The disease prevalence is 0.5% in the population. Sporadic as well as autosomal-dominantly inherited familial forms exist. In recent years, 3 disease-related genes have been identified. Mutations within CCM1, CCM2 or CCM3 lead to indistinguishable clinical phenotypes. All three proteins form a ternary complex in vitro, confirming their participation in one main signaling pathway. While CCM1 and CCM2 have been explored to a great extent over the past years, little is known about CCM3 and its function so far. In this study, we show that CCM3 plays an important role in angiogenesis. Upon overexpression it has strong negative effects in endothelial cells. The ability to migrate, proliferate and to form capillary-like structures in matrix gels is significantly impaired. Knockdown experiments with siRNA against CCM3 did not reveal such distinct effects. Only the ability to form capillary-like structures was elevated. To identify signaling pathways modulated by CCM3, tyrosine kinase arrays were conducted. Lysates from HUVECs overexpressing CCM3 were compared with control lysates. Five substrates revealed significantly increased phosphorylation: the discoidin domain receptor 1 (DDR1), the dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A (DYR1A), the proto-oncogene tyrosine-protein kinase FER (FER), the fyn-related kinase (FRK) and the Phosphoinositidedependent kinase 1 (PDPK-1). The candidate 3-Phosphoinositide-dependent protein kinase- 1 is an important upstream activator of the serine-threonine kinase Akt/PKB. Subsequent experiments confirmed and demonstrated that p-PDPK-1 and p-Akt are activated in lysates overexpressing CCM3. In agreement with the fact that Akt is important for cell survival, we could finally show that CCM3 is both antiangiogenic and antiapoptotic. Our data suggest that CCM3 plays a role in maintaining quiescence of adult vascular endothelial cells. KW - Blutgefäß KW - Missbildung KW - Gehirn KW - Genanalyse KW - Endothelzelle KW - Angiogenese KW - CCM3 KW - Endothelzellen KW - CCM3 KW - endothelial cells KW - angiogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51504 N1 - Includes articles: - Stahl, S., Gaetzner, S., Voss, K., Brackertz, B., Schleider, E., Sürücü, O., Kunze, E., Netzer, C., Korenke, C., Finckh, U., Habek, M., Poljakovic, Z., Elbracht, M., Rudnik-Schöneborn, S., Bertalanffy, H., Sure, U., Felbor, U. (2007) Novel CCM1, CCM2, and CCM3 mutations in patients with cerebral cavernous malformations: in-frame deletion in CCM2 prevents formation of a CCM1/CCM2/CCM3 protein complex. Hum Mutat, 29, 709-717. - Voss, K., Stahl, S., Reinders, J., Hogan, B.M., Schleider, E., Schulte-Merker, S., Felbor, U. (2009) Functional analysis of human and zebrafish 18 amino acid in-frame deletion pave the way for domain mapping of the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Hum Mutat, 30, 1003-1011. - Schleider, E., Stahl, S., Wüstehube, J., Walter, U., Fischer, A., Felbor, U. (2010) Evidence for anti-angiogenic and pro-survival functions of the cerebral cavernous malformation protein 3. Neurogenetics, submitted ER - TY - THES A1 - Obojes, Karola T1 - Untersuchung der Infizierbarkeit von Endothelzellen mit Masernviren und des Interferon-induzierten antiviral wirksamen Mechanismus T1 - Investigation of the infection of endothelial cells with measles viruses and the antiviral mechanism induced by interferon N2 - Das Masernvirus (MV) gehört zu den negativ-strängigen RNA-Viren der Familie der Paramyxoviridae und verursacht beim Menschen akute und subakute Enzephalitiden. Es wurde beschrieben, dass sich MV-RNA in den Endothelzellen von SSPE (subakute sklerosierende Panenzephalitis)-Gehirnen nachweisen lässt (Cosby & Brankin, 1995). In dieser Arbeit konnte ich eine CD46- und CD150-unabhängige Infektion von Endothelzellen durch Wildtyp-MV nachweisen. Ferner wurde beschrieben, dass das Typ II-Interferon (IFN-g) im Serum von Patienten mit akuten Masern und nach einer Masernimpfung erhöht ist (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) und dieses Zytokin lässt sich auch in Gehirnläsionen von SSPE-Patienten detektieren (Nagano et al., 1994). Basierend auf diesen Erkenntnissen, konnte ich eine durch das Enzym Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) vermittelte antivirale Aktivität von IFN-g gegen MV nachweisen. Endothelzellen (EZ) sind bei der akuten Masernerkrankung oder nachfolgenden Komplikationen, die auf einer persistierenden Infektion basieren, wichtige Zielzellen. CD46 und CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) wurden als zelluläre Rezeptoren für MV beschrieben (Dörig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). Es konnte gezeigt werden, dass humane EZ aus dem Gehirn und aus der Nabelschnurvene (HBMECs und HUVECs) zwar CD46, aber auf RNA- und auf Proteinebene kein SLAM exprimieren. Diese Zellen konnten jedoch mit den Wildtyp-MV, die CD46 nicht als Rezeptor benutzen, infiziert werden. Diese Untersuchungen deuten auf die Präsenz eines zusätzlichen Rezeptors für die Aufnahme und Verbreitung von MV in humanen EZ hin. Der antivirale Effekt von Interferonen spielt bei der MV-Vermehrung eine entscheidende Rolle und variiert jedoch in Abhängigkeit von der Wirtszelle (Schnorr et al., 1993). Im Gegensatz zu den attenuierten MV-Impfstämmen können Wildtyp-MV den antiviralen Effekt von Typ I-IFN blockieren, indem sie die Induktion von IFNa/b hemmen und die Sensivität gegenüber dem antiviralen Effekt vermindern. Dabei spielen die V- und C-Proteine des MV eine Rolle (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003), die mit zellulären STAT-Proteinen und IRF-9 interagieren (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-g die Replikation aller MV-Stämme vorwiegend in Endo- und Epithelzellen hemmen kann und, dass diese durch IFN-g induzierte, antivirale Aktivität mit der Induktion der Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) korreliert. IDO ist ein Enzym, welches in Anwesenheit von Sauerstoff den Abbau von Tryptophan zu Kynurenin katalysiert (Hirata et al., 1975) und hauptsächlich antiparasitäre, antibakterielle und antivirale (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004) Effekte vermittelt. Im Zusammenhang mit Masern wurde beschrieben, dass die Tryptophan Katabolite in SSPE-Patienten erhöht sind (Kurup & Kurup, 2002). Die Daten in dieser Arbeit zeigen, dass die durch IFN-g-induzierte antivirale Aktivität durch Zugabe von L-Tryptophan nahezu aufgehoben werden kann und daher IDO im Zuge der anti-MV Aktivität eine entscheidende Rolle spielt. N2 - Measles virus (MV) belongs to the negative-stranded RNA-viruses of the family Paramyxoviridae and causes acute and subacute encephalitis in humans. It has been described that MV-RNA can be detected in endothelial cells of SSPE (subacute sclerosing panencephalitis)-brains (Cosby & Brankin, 1995). In this work I could show a CD46- and CD150-independent endothelial cell infection with wild-type measles viruses. Furthermore it has been described that after acute infections and vaccinations, the type II-interferon (IFN-g) concentrations are increased (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) and this cytokine can also be detected in brain lesions of patients suffering from SSPE (Nagano et al., 1994). Based upon this findings I could detect an indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) mediated anti-MV activity of gamma interferon. Endothelial cells (ECs) are important target cells during acute measles and complications following the infection. CD46 and CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) have been described as cellular receptors for MV (Dörig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). It has been shown that human ECs from brain and umbilical vein (HBMECs and HUVECs) were CD46-positive, but did not express SLAM neither at RNA- nor at protein level. However, these cells could be infected with the wild-type MV strains, which do not use CD46 as a receptor. These findings suggest the presence of an additional receptor for MV uptake and spread in human ECs. The antiviral effect of interferons plays an important role for the MV-replication. However, this effect depends from the host cell (Schnorr et al., 1993). Attenuated MV strains are more sensitive to type I-interferons than wild-type strains, because wild-type strains can block the induction of IFN-a/b. The V- and C-proteins of MV play a role in this process (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003). They interact with STAT proteins and IRF-9 (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In this work it could be shown, that IFN-g can inhibit the replication of all MV strains preferably in endo- and epithelial cells. Furthermore it could be demonstrated that the antiviral activity induced by IFN-g correlates with the induction of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). IDO is an enzyme which in the presence of oxygen catalyses the degradation of tryptophan (Hirata et al., 1975) and is known to mediate antiparasitic as well as antibacterial and antiviral effects (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004). In the context with measles it has been described that the tryptophan catabolites were increased in SSPE-patients (Kurup & Kurup, 2002). The data in this work show that the IFN-g-induced antiviral activity can be overcome by the addition of L-tryptophan which indicates a decisive role of IDO in the anti-MV activity. KW - Masernvirus KW - Endothelzelle KW - Interferon KW - Masernvirus KW - Interferon KW - Indolamin 2 KW - 3-Dioxygenase KW - Endothelzellen KW - measles virus KW - interferon KW - indoleamine 2 KW - 3-dioxygenase KW - endothelial cells Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14936 ER - TY - THES A1 - Nowak, Eva T1 - Expression und Funktion von Integrin α-4 in humanen zerebralen Endothelzellen - Analysen unter Zuhilfenahme des therapeutisch eingesetzten Antikörpers Natalizumab T1 - Expression and function of integrin α-4 in human brain endothelial cells - analysis using theantibody Natalizumab N2 - Natalizumab ist ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen das Oberflächenadhäsionsmolekül Integrin α-4, der zur Therapie von schweren Verlaufsformen der Multiplen Sklerose (MS) zugelassen ist. Integrin α-4/β-1 wird durch Leukozyten exprimiert und steuert deren Extravasation über die Bindung an VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) auf Endothelzellen. Natalizumab wirkt über eine Blockade der Leukozytenadhäsion. In einigen Publikationen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass Integrin α-4 auch auf zerebralen Endothelzellen von Mäusen und Ratten exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression und Funktion von Integrin α-4 in kultivierten primären humanen zerebralen Endothelzellen untersucht. Die im Rahmen dieser Arbeit an verschiedenen Einzelspenderpräparationen durchgeführten FACS-Analysen zeigten, dass Integrin α-4 in unterschiedlicher Ausprägung auf primären zerebralen Endothelzellisolationen nachzuweisen war. Mit Hilfe immunzytochemischer Färbungen konnte ein spezifisches Verteilungsmuster des Integrin α-4 in Form eines feinen, granulären Musters im Bereich des Zellleibes dokumentiert werden. In Adhäsionsversuchen zeigten Integrin α-4-exprimierende Endothelzellen nach Zugabe von Natalizumab in niedriger Konzentration eine verminderte Fähigkeit zur Haftung an Fibronectin, einem Bindungspartner in der extrazellulären Matrix. In hohen Konzentrationen dominierte im eingesetzten experimentellen System ein unspezifischer Blockadeeffekt, der auch mit Kontrollantikörpern zu beobachten war. In MS-Läsionen findet sich auch die lösliche Form des VCAM-1 (sVCAM-1), die möglicherweise mit endothelialem Integrin α-4 interagiert. Daher wurde mit Hilfe von Western-Blot-Untersuchungen die intrazelluläre Signaltransduktion unter Stimulation mit sVCAM-1 untersucht. Es zeigte sich wie in anderen Endothelarten vorbeschrieben eine Aktivierung des p38-MAP-Kinase-Signalweges. Zusammenfassend wurde demonstriert, dass primäre humane zerebrale Endothelzellen Integrin α-4 exprimieren und dass dieses wahrscheinlich nicht nur für die mechanische Verankerung in der Extrazellulärmatrix eine Bedeutung besitzt, sondern auch als Induktor intrazellulärer Signaltransduktion fungiert, welche die Schrankeneigenschaften zerebraler Endothelzellen beeinflussen könnte. N2 - Expression and function of integrin α-4 in human brain endothelial cells - analysis using theantibody Natalizumab KW - Integrin KW - Endothelzelle KW - VCAM KW - Integrin alpha-4 KW - zerebrale Endothelzelle KW - Natalizumab KW - cerebral endothelial cell KW - vascular cell adhesion molecule-1 Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99300 ER - TY - THES A1 - Müller, Verena T1 - Candida albicans-induzierte Genexpression in primären humanen Endothelzellen - Mechanismen der Signaltransduktion und Möglichkeiten der Intervention T1 - Candida albicans-induced gene expression in primary human endothelial cells - mechanisms of signal transduction and possibilities of intervention N2 - Endothelzellen sind ein aktiver Bestandteil der angeborenen Immunabwehr des Menschen gegen mikrobielle Pathogene. Unter ungünstigen Bedingungen kann die Abwehrreaktion sogar zu einer lebensbedrohlichen Sepsis führen. Hier wurde die bislang wenig bekannte Endothelantwort auf den fakultativ humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, einem der häufigsten Verursacher von letaler Sepsis beim Menschen, näher untersucht. Mittels Oligonukleotid-Mikroarray-Analyse von HUVEC nach Exposition mit C. albicans konnten 56 hochregulierte Gene identifiziert werden, während 69 Gene herunterreguliert wurden. Ein bedeutender Anteil der regulierten Gene ist an Prozessen der angeborenen Immunantwort beteiligt und dient hauptsächlich der Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen ergaben eine zentrale Rolle des proinflammatorischen NF-kappaB-Weges bei der Regulation des Candida-induzierten Transkriptoms von Endothelzellen. Es konnte gezeigt werden, dass C. albicans diesen Signalweg sequenziell aktiviert. Zusätzlich konnte durch die Expression einer dominant-negativen Mutante einer Signalkomponente des NF-kappaB-Signalwegs die Candida-vermittelte Induktion von kappaB-abhängigen Genen gehemmt werden. Mit einem pharmakologischen Ansatz wurde der p38 MAP Kinase-Signalweg als weiterer bedeutsamer Signalweg identifiziert, der die Expression einzelner Candida-Zielgene wie CXCL8/IL-8 moduliert. Schließlich wurde gezeigt, dass die Candida-induzierte NF-kappaB-Aktivierung im untersuchten endothelialen Zellsystem unabhängig von den Toll-like Rezeptoren TLR2 und TLR4 geschieht, die üblicherweise an der Erkennung mikrobieller Pathogene beteiligt sind. Durch RNA-Interferenz-Experimente konnte jedoch dargelegt werden, dass das Adaptermolekül MyD88 und die Kinase IRAK1, die beide entscheidend an der TLR-vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind, essentiell für die Weiterleitung des Signals in Endothelzellen sind. Nachfolgend konnte mit TLR3 zumindest einer der signaltransduzierenden Rezeptoren identifiziert werden. Als erste umfassende Untersuchung der endothelialen Antwort auf Candida albicans erlaubt die vorliegende Arbeit neue Einblicke in die komplexen Signalmuster von Endothelzellen, die dieser klinisch bedeutende Krankheitserreger auslöst. N2 - Endothelial cells (ECs) actively participate in the innate defence against microbial pathogens. Under unfavourable conditions defence reactions can even turn into life-threatening responses resulting in sepsis. Here the so far largely unknown EC reaction patterns to Candida albicans were studied. C. albicans is a facultative human pathogenic fungus and a major cause of lethality in septic patients. Oligonucleotide microarray analysis revealed 56 genes that were transcriptionally up-regulated and 69 that were suppressed upon exposure of ECs to C. albicans. A major portion of these genes is involved in defence mechanisms of the innate immune system with a high representation of genes serving the recruitment of neutrophils to sites of infection. Further examination of candidate signalling cascades established a central role of the proinflammatory NF-kappaB pathway in the regulation of the Candida-modulated transcriptome of ECs. It was shown that the NF-kappaB signalling pathway becomes activated at various levels. In addition, expression of a dominant negative mutant of a NF-kappaB signalling pathway compound blocked the Candida-induced kappaB-dependent gene expression. Using a pharmacological approach the stress-activated p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway was identified as a second major regulatory pathway which critically contributes to the regulation of selected Candida target genes such as CXCL8/IL-8. Candida-induced NF-kappaB activation is mediated independently of Toll-like receptors (TLR) 2 and 4 that commonly have been implicated with microbial pattern recognition. Nevertheless, knock-down of the adapter molecule MyD88 and the essential downstream kinase of TLR-, IL-1R- and IL-18R-signalling, IRAK1, suggested that recognition and signalling via a TLR apart from TLR2/TLR4 is crucial for Candida-induced gene expression in primary ECs. Finally, RNAi experiments indicate that most likely TLR3 represents this receptor. These data provide the first comprehensive analysis of endothelial gene responses to Candida albicans and present novel insights into the complex signalling patterns triggered by this important pathogen. KW - Angeborene Immunität KW - Endothelzelle KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Candida albicans KW - Entzündung KW - innate immunity KW - endothelial cell KW - toll-like receptors KW - Candida albicans KW - inflammation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26224 ER - TY - JOUR A1 - McCarron, R. M. A1 - Wang, L. A1 - Sirén, Anna-Leena A1 - Spatz, M. A1 - Hallenbeck, J. M. T1 - Adhesion molecules on normotensive and hypertensive rat brain endothelial cells N2 - The intercellular adhesion of circulating leukocytes to vascular endothellum ls a prerequisite for leukocyte emigration from the blood to extravascular tlssues. This process is facllltated by adhesion molecules on the surfaces of both the vascular endothelial cells and the leukocytes. The experiments presented here demonstrate for the first time that the leukocyte adhesion receptor, intercellular adhesion molecule-1, is constitutively expressed on cultured cerebromicrovascular endothelial cell lines derived from both spontaneously hypertensive (SHR) rats and normotensive WistarKyoto (WKY) rats. Both cultures contained simliar numbers of cells constitutively expressing this adhesion molecule (31.4% and 29.6%, respectlvely). Adhesion molecule expression was up-regulated by interleukin-1 ß, tumor necrosis factor-a, interferon-y and lipopolysaccharide in a dose- and time-dependent manner. Both cultures exhibited similar maximum levels of adhesion molecule up-regulation to optimal concentrations of all three cytokines. However, SHR endothelial cells were moresensitive to all three cytokines; significantly higher levels of intercellular adhesion molecule-1 expresslon were seen on SHR as opposed to WKY endothelial cells cultured with sub-optimal cytokine concentrations. It was also observed that lipopolysaccharide up-regulated intercellular adhesion molecule-1 expression on SHR endothelial cells to a greater extent than on WKY endothelial cells. The findings that intercellular adhesion molecule-1 can be up-regulated to a greater degree on SHR endothelial cells may have important implications for in vivo perivascular leukocyte accumulation under hypertensive conditions. These observations indicate a possible mechanism by which hypertension may predispose to the development of disorders such as atherosclerosis and stroke. KW - Endothelzelle KW - Zell-Adhäsionsmolekül Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86819 ER - TY - THES A1 - Laug, Roderich T1 - Funktionsaufklärung von CYR61 und CTGF in mesenchymalen Stammzellen und Lungenendothelzellen T1 - Functional examination of CYR61 and CTGF in mesenchymal stem cells and endothelial lung cells N2 - Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) und Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) stellen aufgrund ihrer Multifunktionalität zwei sehr interessante Vertreter aus der derzeit sechs Mitglieder umfassenden Familie der CCN-Proteine (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) dar. Seit der Entdeckung von CYR61 und CTGF konnten die überlappenden, aber meist nicht redundanten zellspezifischen Effekte in verschiedenen Zellsystemen nachgewiesen werden. Die Einflüsse auf zahlreiche Prozesse wie Proliferation und Migration, aber auch Angiogenese und das Überleben von Zellen lassen eine weitreichende Bedeutung im Zusammenhang mit vielen Entwicklungsprozessen vermuten, so auch der des muskuloskelettalen Systems und der Entwicklung der Lunge. In der vorliegenden Arbeit wurden für die nähere Charakterisierung von CYR61 und CTGF humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) und die humane primäre Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells) gewählt. Beide Zellsysteme sind für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit in den verschiedenen Kompartimenten bestens geeignet. So ist die Zelllinie HPMEC-ST1.6R den primären Endothelzellen, im Vergleich mit anderen in der Forschung eingesetzten Zelllinien, in Bezug auf spezifische Oberflächenmarker am nächsten. Mesenchymale Stammzellen bilden als multipotente Zellen das Rückrat des muskuloskelettalen Systems und sind an der Homöostase des menschlichen Stütz- und Bewegungsapparates maßgeblich beteiligt. Um experimentell nutzbare Konzentrationen an rekombinanten Proteinen zu erhalten, wurde ein Baculovirus-Expressionsystems gewählt. Nach der erfolgreichen Klonierung der CTGF/Fc-Tag Sequenz in einen Expressionsvektor konnte dies auch durch Produktion in SF21-Insektenzellen erreicht und erstmalig rekombinantes CTGF/Fc von hoher Reinheit gewonnen werden. Allerdings konnte eine beständige Funktionsfähigkeit der aufgereinigten Proteine mittels eines Proliferationstestes nachfolgend nur bedingt bestätigt werden. Für die weitere Versuchsplanung, einer Untersuchung der Auswirkung von rekombinantem CTGF (rCTGF) bzw. CYR61 (rCYR61) auf die Zielzellen, musste zunächst die zelleigene ctgf bzw. cyr61 Expression herunterreguliert werden, um einen endogenen Störeffekt auszuschließen. Durch den Einsatz spezifischer shRNAs konnte ctgf/CTGF sowohl in den hMSC-, wie auch den HPMEC-ST1.6R-Zielzellen deutlich herunterreguliert und nachfolgend eine markant reduzierte Proliferation beobachtet werden. Ein Effekt für die Regulation von cyr61 blieb aus. In dieser Arbeit wurden anschließend erstmals mittels Microarray-Analysen Veränderungen im Genexpressionsmuster der ctgf herunterregulierten hMSC- bzw. Lungenendothelzellen gegenüber Kontrollzellen untersucht. Des Weiteren war die Auswirkung einer Behandlung von ctgf herunterregulierten Zielzellen mit rCTGF gegenüber unbehandelten Kontrollzellen von Interesse. Für beide Zellsysteme konnten signifikante Genregulationen nach der Behandlung mit CTGF spezifischen shRNAs gegenüber den Kontrollzellen detektiert werden, mit interessanten Genclustern im Bereich der TGF-beta (transforming growth factor ß) Signalgebung, sowie der fokalen Adhäsion (z.B. VEGF). Eine Behandlung mit rCTGF hingegen zeigte gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen in der Auswertung der Microarray-Analyse keine signifikante Veränderung im Genexpressionsmuster. In dieser Arbeit wurden, neben einer effektiven Gewinnung von rekombinantem CTGF und der Herunterregulation der endogenen ctgf Expression, wichtige Erkenntnisse zur Biologie von CTGF (und CYR61) in mesenchymalen Stammzellen hMSC und der Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R erlangt. Die erhaltenen Microarray-Daten bieten eine fundierte Grundlage für zahlreiche fortführende Untersuchungen. N2 - Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) and connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) are two very interesting members of the CNN family (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) consisting of six members so far. Since its discovery the overlapping, but mostly non-redundant effects of CYR61 and CTGF were shown in different cell systems. Both proteins are linked to many different processes like proliferation and migration, but also angiogenesis and survival. They seem to be involved in very fundamental biological processes, amongst other the development of the musculoskeletal system and the lung and were analyzed in this study. To distinguish the two proteins CYR61 and CTGF, primary human mesenchymal stem cells (hMSC) and a human pulmonary endothelial cell line (HPMEC-ST1.6R) were chosen. Both cell systems are suited very well for getting more information about the function in these different compartments. So the cell line HPMEC-ST1.6R is more related to primary endothelial cells in reference to the cell surface markers, compared to other cell lines used for experimental research. Mesenchymal stem cells form the backbone of the musculoskeletal system and are involved in the homeostasis of this complex system. Getting adequate concentrations of recombinant proteins for the upcoming experiments a baculovirus expression system was chosen. After successful cloning of the CTGF/Fc-Tag sequence into an expression vector, recombinant CTGF/Fc of high purity was obtained for the first time, produced in SF21 insect cells. However the stable functioning of the proteins was partly confirmed by proliferation tests. To study the effect of recombinant CTGF or CYR61 in further experiments, the endogenous ctgf or cyr61expression had to be downregulated to avoid negative effects. By using specific shRNAs ctgf/CTGF has been downregulated in hMSC as well as HPMEC-ST1.6R cells and subsequently a reduced proliferation was observed. No effect was detected for the regulation of cyr61. In this study for the first time changes in regulation of gene expression after downregulation of ctgf in hMSC and HPMEC-ST1.6R cells were studied by microarray analyses. Furthermore to discover the effect of treating ctgf downregulated cells with recombinant CTGF compared to control cells was another aim of this experimental series. For both cell systems, significant gene regulations were detected after treatment with CTGF specific shRNAs with interesting gene cluster for TGFß-signaling as well as focal adhesion (e.g. VEGF). In contrast, no significant change in gene regulation was detected by microarray analysis after treating the target cells with rCTGF compared to non-treated cells. In summary, besides the effective preparation of rCTGF and the marked downregulation of ctgf gene expression, this study provides fundamental information about CTGF and its biology in hMSC and HPMEC-ST1.6R cells, as well. Based on the numerous detected gene regulations in the microarray analyses the study provides a basis for further experiments.   KW - Connective Tissue Growth Factor KW - CYR61 KW - CTGF KW - Mesenchymzelle KW - Endothelzelle Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98711 ER - TY - THES A1 - Krümpel, Christian T1 - Die Rolle des Multidrug Resistance Associated Protein-1 bei der Tumornekrosefaktor-α vermittelten Apoptose in Endothelzellen T1 - Role of Multidrug Resistance Associated Protein-1 in Tumornecrosisfactor-α induced endothelial cell apoptosis N2 - Die endotheliale Dysfunktion stellt eine der Hauptursachen für die Entstehung von Atherosklerose an humanen Gefäßwänden dar und ist somit auch wesentlich an der Entstehung von kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt. Das proinflammatorische Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) gilt als einer der Hauptinduktoren der endothelialen Dysfunktion. Da bei der Endothelzellapoptose unter TNF-α diverse rezeptorvermittelte oxidative Prozesse innerhalb der Zelle ablaufen, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, inwiefern das Multidrug Resistance Associated Protein-1 (MRP-1) bei diesen oxidativen Prozessen und bei der Modulation der TNF-α-Signalkaskade involviert ist. N2 - Endothelial dysfunction is one of the main reasons for atherosclerosis in human vessels and is therefore also involved in the development of cardiovascular diseases. The proinflammatory cytokine TNF-α is a inductor of endothelial dysfunction. This thesis shows how the Multidrug Resistance Associated Protein-1 (MRP-1) is involved in TNF-α induced endothelial cell apoptosis. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - Endothelzelle KW - MRP-1 KW - TNF-alpha KW - Apoptose KW - Endothelzellen KW - reaktive Sauerstoffspezies Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93681 ER - TY - THES A1 - Krones, David T1 - The Role of Acid Sphingomyelinase in \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infection of Endothelial Cells T1 - Die Rolle der sauren Sphingomyelinase bei \(Staphylococcus\) \(aureus\) Infektionen von Endothelzellen N2 - Staphylococcus aureus is a human bacterial pathogen responsible for a variety of diseases including bacterial pneumonia and sepsis. Recent studies provided an explanation, how S. aureus and its exotoxins contribute to the degradation of endothelial junction proteins and damage lung tissue [4]. Previous findings were indicating an involvement of acid sphingomyelinase (ASM) activity in cell barrier degradation [5]. In the presented study the impact of singular virulence factors, such as staphylococcal α-toxin, on in vitro cell barrier integrity as well as their ability to elicit an activation of ASM were investigated. Experiments with bacterial supernatants performed on human endothelial cells demonstrated a rapid dissociation after treatment, whereas murine endothelial cells were rather resistant against cell barrier degradation. Furthermore, amongst all tested staphylococcal toxins it was found that only α-toxin had a significant impact on endothelial junction proteins and ASM activity. Ablation of this single toxin was sufficient to protect endothelial cells from cell barrier degradation and activation of ASM was absent. In this process it was verified, that α-toxin induces a recruitment of intracellular ASM, which is accompanied by rapid and oscillating changes in cytoplasmic Ca2+ concentration and an increased exposure of Lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP1) on the cell surface. Recruitment of lysosomal ASM is associated, among other aspects, to plasma membrane repair and was previously described to be involved with distinct pathogens as well as other pore forming toxins (PFT). However, with these findings a novel feature for α-toxin has been revealed, indicating that the staphylococcal PFT is able to elicit a similar process to previously described plasma membrane repair mechanisms. Increased exposure and intake of surface membrane markers questioned the involvement of ASM activity in S. aureus internalization by non-professional phagocytes such as endothelial cells. By modifying ASM expression pattern as well as application of inhibitors it was possible to reduce the intracellular bacterial count. Thus, a direct connection between ASM activity and S. aureus infection mechanisms was observed, therefore this study exemplifies how S. aureus is able to exploit the host cell sphingolipid metabolism as well as benefit of it for invasion into non-professional phagocytic cells N2 - Staphylococcus aureus ist ein bakterieller Erreger, der für eine Vielzahl von Erkrankungen des Menschen verantwortlich ist, darunter bakterielle Lungenentzündung und Sepsis. Neuere Studien konnten einen Ansatz dafür liefern, wie S. aureus und seine Exotoxine zur Degradation von endothelialen Verbindungsproteinen beitragen und das Lungengewebe schädigen. Weitere Befunde weisen auf eine Beteiligung der sauren Sphingomyelinase (ASM) bei der Degradation der Zellbarriere hin. In der vorliegenden Studie soll der Einfluss einzelner Virulenzfaktoren, wie z. B. Staphylokokkus α-Toxin, auf die Integrität der Zellbarriere in vitro sowie deren Fähigkeit, eine Aktivierung der ASM hervorzurufen, untersucht werden.Experimente mit bakteriellen Überständen die an humanen Endothelzellen durchgeführt wurden, zeigten eine rasche Dissoziation nach Behandlung, während murine Endothelzellen vorwiegend resistent gegen eine Degradation der Zellbarriere waren. Darüber hinaus wurde unter allen getesteten Staphylokokken-Toxinen festgestellt, dass nur α-Toxin einen signifikanten Einfluss auf endotheliale Verbindungssproteine und ASM-Aktivität hat. Die genetische Ablation des Toxins alleine reichte aus, um Endothelzellen vor einer Degradation der Zellbarriere zu schützen, und die Aktivierung von ASM blieb aus. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass α-Toxin eine Rekrutierung von intrazellulärem ASM induziert, die mit schnellen oszillierenden Veränderungen der zytoplasmatischen Ca2+-Konzentration und einer erhöhten Exposition von Lysosome associated membrane protein 1 (LAMP1) an der Zelloberfläche einhergeht. Die Rekrutierung lysosomaler ASM ist u.a. mit der Reparatur von Plasmamembran assoziiert und wurde bereits im Zusammenhang mit verschiedenen Pathogenen sowie anderer porenbildende Toxine (PFT) beschrieben. Mit diesen Befunden konnte jedoch eine neue Eigenschaft für α-Toxin beschrieben werden, die darauf hindeutet, dass das Staphylokokken-PFT einen ähnlichen Prozess auslösen kann wie zuvor beschriebene Plasmamembran-Reparaturmechanismen. Die vermehrte Exposition und Aufnahme von Oberflächenmembranmerkmalen stellte die Beteiligung der ASM-Aktivität an der Internalisierung von S. aureus durch nicht-professionelle Phagozyten wie Endothelzellen in Frage. Durch Modifikation des ASM-Expressionsmusters sowie Applikation von Inhibitoren war es möglich, die intrazelluläre Keimzahl zu reduzieren. Somit konnte ein direkter Zusammenhang zwischen ASM-Aktivität und den Infektionsmechanismen von S. aureus beobachtet werden. Diese Studie verdeutlicht somit, wie S. aureus den Sphingolipid-Stoffwechsel der Wirtszelle ausnutzen und für die Invasion in nicht-professionelle phagozytische Zellen nutzen kann KW - Staphylococcus aureus KW - Endothelzelle KW - Endothelial cells KW - Acid Sphingomyelinase KW - Plasma membrane repair Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290492 ER - TY - THES A1 - Ittner, Cora T1 - Veränderte Barriereeigenschaften der Blut-Hirn-Schranke durch Katecholamine und Entzündungsmediatoren bei Sauerstoff-Glucose-Entzug \(in\) \(vitro\) T1 - Altered barrier properties of the blood brain barrier caused by catecholamines and inflammatory mediators during oxygen glucose deprivation \(in\) \(vitro\) N2 - Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden. N2 - The simultaneous occurrence of ischemic stroke and Takotsubo syndrome (TTS) seems to be a relevant clinical constellation that is not yet sufficiently understood. The pathologies can be understood as being linked via the brain-heart axis, into which the blood-brain barrier (BBB) is integrated as a functional component. The clinical and neurological outcome of these patients appears to be significantly worse than after a solitary ischemic insult. It has been hypothesized that the BBB may be compromised. The predominantly female, postmenopausal patients presented elevated catecholamine levels and inflammatory markers. These conditions were simulated in vitro under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition. Resulting alterations were examined by using an established BBB model: cEND cells of the murine cerebral microcirculation. The BBB integrity was evaluated by investigating specific junction proteins and integrin subunits. All experiments were conducted parallel with estrogen application (E2) in order to investigate a possible BBB protection by the female sexhormone. The separate application of catecholamines (CAT) or inflammatory mediators (INF) led to less BBB damage compared to simultaneous application. This appeared to be time-bound being proportional to the duration of exposure. The effects of OGD and reoxygenation, in the sense of simulated reperfusion therapy, were potentiated by the effects of CAT/INF. Predominantly, OGD and KAT/INF compromised BBB integrity. “Recovery” or “reperfusion injury” occurred after reoxygenation. Protection by E2 was morphologically detectable, especially against OGD, CAT/INF and “reperfusion injury”. This could not be shown at the level of gene or protein expression, respectively. The homeostasis of the CNS would be impaired in vivo, catecholamines and inflammatory mediators would be able to reach the neuronal tissue that had already been damaged by ischemia. Overall, this work contributes to an understanding of the molecular changes in the BBB in the context of the simultaneous occurrence of TTS and ischemia. An experimental basis was created to enable further research into pathogenetic background. Based on this, clinical therapies could be optimized after further in vitro and in vivo research. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Endothelzelle KW - cEND-Zellen KW - Katecholamine KW - Takotsubo-Syndrom KW - Catecholamine KW - Entzündung KW - in vitro KW - Stress-Kardiomyopathie KW - Schlaganfall Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346497 ER - TY - THES A1 - Hayen, Wiebke T1 - Determinanten der Tumorzellmigration T1 - Determinants of tumor cell migration N2 - Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden. N2 - Hyaluronic acid (HA) is a glycosaminoglycan which is ubiquitously present in the extracellular matrix of many tissues and increased concentrations are found in the environment of solid tumors. In the first part of this work the role of HA in tumor cell migration based on a three-dimensional fibrin gel-sytem was investigated. The comparison of two- and threedimensional migration resulted in the conclusion that threedimensional migration mainly depends on the porosity of the matrix and not on specific HA-receptors. The HA-induced migration could be inhibited under two-dimensional conditions by antibodies to the HA-receptor CD44 while in three-dimensional systems the migration was unaffected by these antibodies. The structural properties of the fibrin gels were analyzed by turbidity measurement, confocal microscopy, compaction assay and liquid permeation. Further experiments resulted in perinuclear localization of this macromolecule. A direct mechanical influence of HA on actin polymerization could not be detected. The second part of this work concentrated on the directional migration of tumor cells to endothelial cells. In three-dimensional cocultures of tumor cells and endothelial cells it was found that the tumor cells were chemotactically attracted by endothelial cells. This effect could be verified in two-dimensional Boyden chamber assays. Endothelial-derived conditioned medium was further purified and possible chemotaxins for tumor cell migration could be identified by mass spectrometry. KW - Tumorzelle KW - Zellmigration KW - Hyaluronsäure KW - Endothelzelle KW - Tumorzellmigration KW - Hyaluronsäure KW - Fibrin KW - Tumor cell migration KW - hyaluronic acid KW - fibrin Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180784 ER - TY - THES A1 - Hahn, Niklas T1 - Auswirkungen physiologischer Konzentrationen von Beta-Hydroxybutyrat auf vaskuläre Endothelzellen T1 - Effects of physiological concentrations of Beta-Hydroxybutyrate on vascular endothelial cells N2 - Die endotheliale Dysfunktion beatmeter Intensivpatienten stellt ein signifikantes klinisches Problem dar. Flüssigkeitsaustritte durch die Gefäßwand können zur Bildung von lebensbedrohlichen Ödemen führen. Forschungsergebnisse zeigen einen Einfluss der lokalen Sauerstoffkonzentration sowie der Stoffwechsellage auf die endotheliale Zellhomöostase sowie die Angiogenesekapazität. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen sowie der Exposition gegenüber Ketonkörpern auf die Expression zentraler Stoffwechselenzyme, die Freisetzung von Zytokinen, die endotheliale Migrations- und Angiogenesekapazität sowie die Freisetzung von Angiogenesefaktoren an kultivierten humanen Nabelschnurendothelien (HUVEC) untersucht. Unterschiedliche Sauerstoffkonzentrationen führten zu keiner wesentlichen Änderung der mRNA- oder Proteinexpression von Stoffwechselenzymen. Im Hinblick auf die Zytokinfreisetzung zeigten sich hingegen deutliche Expressionsänderungen unter Hypoxie bzw. Hyperoxie, welche jedoch in der Zusammenschau kein eindeutig proangiogenetisches Profil zeigten. Hypoxie und Hyperoxie sowie die Exposition gegenüber Ketonkörpern (β-Hydroxybutyrat) verlangsamten die endotheliale Zellmigration; im Gegensatz hierzu führte die Ketose im Angiogeneseassay zu einer signifikant erhöhten Gefäßdichte und Anzahl an Verzweigungspunkten, einhergehend mit erhöhter Freisetzung des potenten Angiogenesefaktors Angiopoietin-1. Somit zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass eine ketogene Stoffwechsellage – mutmaßlich über eine gesteigerte endotheliale Zellproliferation – zu einer gesteigerten Angiogenese führt, wogegen eine Änderung der Sauerstoffkonzentration im Modell keine eindeutig positiven Effekte zeigte. Eine physiologische Ketose könnte somit bei Intensivpatienten der Entstehung einer endothelialen Dysfunktion mit Entwicklung eines Capillary-leak-Syndroms entgegenwirken. N2 - The endothelial Dysfunction of respirated Intensiv Care Patients poses a significant clinical Problem. Vascular leaks may cause life threatening edemas. Results of the research show an influence of the local oxygen concentration as well as the metabolism situation on endothelial homöostase and Angiogenesis. This work researched the influence of different Oxygen konzentrations and the Exposition of Ketone-bodies on the Expression of different metabolism enzymes, the Emission of zytokines, the endothelial Migration- and Angiogenese capacity as well as the Emission of Angiogenesefactors in HUVEC Cells. KW - Ketonkörper KW - Angiogenese KW - Endothelzelle KW - Beta-Hydroxybutyrat KW - Angiogenese KW - Capillary leak Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157286 ER - TY - THES A1 - Elsner, Clara Dorothea T1 - Ultrastructural analysis of biogenesis and release of endothelial extracellular vesicles T1 - Ultrastrukturelle Analyse der Biogenese und Freisetzung von endothelialen extrazellulären Vesikeln N2 - Extracellular vesicle (EV)-mediated intercellular communication through exosomes, microvesicles (MVs) and apoptotic bodies has been shown to be implicated in various physiological as well as pathological processes such as the development and progression of atherosclerosis. While the cellular machinery controlling EV formation and composition has been studied extensively, little is known about the underlying morphological processes. This study focuses on a detailed ultrastructural analysis of the different steps of EV formation and release in Myocardial Endothelial (MyEnd) and Aortic Endothelial (AoEnd) cells cultured under serum starvation and inflammatory stimulation with TNF-α. Detailed morphological analyses were conducted applying and comparing different high- resolution light and electron microscopic methods. In this study, we could depict all steps of MV biogenesis named in literature. However, during the study of exosome biogenesis, we discovered a yet undescribed process: Instead of a direct fusion with the plasma membrane, multivesicular bodies were incorporated into a new distinct cellular compartment bound by fenestrated endothelium first. This may present a novel step in exosome biogenesis and warrants further study. Regarding the conditions of cell cultivation, we observed that the commonly used serum starvation causes MyEnd cells, but not AoEnd cells, to enter apoptosis after 48 hours. When preparing functional EV studies, we therefore recommend assessing the morphological condition of the serum-starved cells at different cultivation points first. When evaluating MV production, a statistical analysis showed that the more time AoEnd cells spent in cultivation under serum starvation, the higher the percentage of MV producing cells. However, additional TNF-α stimulation induced a significantly higher MV production than serum starvation alone. Lastly, our results show that TNF-α stimulation of AoEnd cells in vitro leads to the upregulation of CD44, an adhesion molecule critical in the early stages of atherosclerosis. CD44 was then depicted on the surface of generated MVs and exosomes. We conclude that under inflammatory conditions, EVs can mediate the transfer of CD44 from endothelial cells to target cells. This could be a novel mechanism by which MVs contribute to the development and progression of atherosclerotic disease and should be clarified by further studies. N2 - Extrazelluläre Vesikel (EV), darunter Exosomen, Mikrovesikel (MV) und apoptotische Körperchen, werden von fast allen Zellen des Körpers freigesetzt, transportieren zellspezifische Informationen und sind von großer Bedeutung in der Zell-Zell-Kommunikation. Sie spielen eine zentrale Rolle in verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Vorgängen, wie etwa der Atherosklerose. Während die zellulären Mechanismen hinter der Entstehung und Komposition der EV bereits intensiv erforscht wurden, ist noch wenig über die zugrundeliegenden morphologischen Prozesse bekannt. Diese Arbeit präsentiert eine detaillierte ultrastrukturelle Analyse der Bildung und Freisetzung von EV in myokardialen (MyEnd) und aortalen Endothelzellen (AoEnd), die unter Serumentzug sowie inflammatorischer Stimulation mit TNF-α kultiviert wurden. Dazu wendeten wir verschiedene hochauflösende licht- und elektronenmikroskopische Techniken an. Wir konnten alle in der Literatur beschriebenen Schritte der MV-Biogenese darstellen. Bei der Untersuchung der exosomalen Biogenese entdeckten wir jedoch einen bisher unbekannten Prozess: Anstelle einer direkten Fusion der multivesikulären Körperchen mit der Plasmamembran, wurden diese zunächst in ein neues, von fenestriertem Endothel begrenztes, zelluläres Kompartiment integriert. Ferner stellten wir fest, dass der häufig durchgeführte Serumentzug während der Kultivierung bei MyEnd- – allerdings nicht AoEnd- – Zellen nach 48 Stunden zur Apoptose führte. Daher empfehlen wir, bei funktionellen Studien von EV zunächst eine morphologische Untersuchung der unter Serumentzug kultivierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten durchzuführen. Eine statistische Analyse der MV-Produktion zeigte, dass die Zellen umso mehr MV produzierten, je länger sie sich unter Serumentzug befanden. Jedoch induzierte eine zusätzliche Stimulation mit TNF-α eine signifikant höhere MV-Produktion als der alleinige Serumentzug. Wir konnten zeigen, dass eine TNF-α Stimulation von AoEnd Zellen in vitro zu einer vermehrten Expression von CD44 führte – einem vor allem in der Frühphase der Atherosklerose bedeutendem Adhäsionsmolekül. CD44 konnte ebenso auf der Oberfläche von produzierten MV und Exosomen nachgewiesen werden. Wir schließen daraus, dass MV unter inflammatorischen Bedingungen den Transfer von CD44 von Endothelzellen zu Zielzellen vermitteln und so zur Entstehung und Progression von Atherosklerose beitragen können. KW - Vesikel KW - Exosom KW - Endothelzelle KW - Zellkommunikation KW - Atherosklerose KW - Extracellular Vesicles KW - Microvesicles KW - Exosomes KW - Cell-cell communication KW - Electron microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288526 ER - TY - THES A1 - Appelt-Menzel, Antje T1 - Etablierung und Qualifizierung eines humanen Blut-Hirn-Schranken-Modells unter Verwendung von induziert pluripotenten und multipotenten Stammzellen T1 - Establishment and qualification of a human blood-brain barrier model by use of human induced pluripotent stemm cells an multipotent stem cells N2 - Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für weiterführende Studien ausgewählt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden. N2 - The blood-brain barrier (BBB) presents one of the tightest and most important barriers between the blood circulation and the central nervous system (CNS). The BBB consists of specialized endothelial cells, which line the cerebral capillaries and are connected through very dense tight junctions (TJs). Together with pericytes, astrocytes, neurons, microglial cells and the extracellular matrix of the basal membrane of the brain capillaries, they form a dynamic and complex regulatory system, the so-called neurovascular unit (Hawkins and Davis 2005). The main functions of the BBB can be divided into three subgroups, the physical-, metabolic- and transport-barrier (Neuhaus and Noe 2010). The BBB mainly serves to maintain the homeostasis of the CNS and for protection against neurotoxical substances and pathogens, such as bacteria and viruses. Moreover, the BBB ensures the supply of neurons with nutrients and regulatory substances. Furthermore, it is responsible for the efflux of CNS metabolism waste products. For the development of drugs applied for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Multiple Sclerosis or even brain tumors, the tightness of the BBB models towards substances and the high metabolic activity of the endothelial cells pose a problem. Numerous drugs cannot overcome the BBB in sufficient enough concentration to reach the target location or they are metabolized before transportation and thus become less effective. Moreover, defects of the BBB play a decisive role in the manipulation of the pathogenesis of numerous CNS diseases. Due to the high demand for test systems in basic and preclinical research of drug development and infection studies, a range of different BBB models have been developed. Besides the in silico, acellular in vitro and in vivo models, numerous cell-based BBB models have been developed. However, standardized models based on immortalized cell lines show only inhomogeneous TJ expression and possess low barrier integrity which is detected through transendothelial electrical resistance (TEER) below 150 · cm2 (Deli et al. 2005). In comparison, the TEER values in animal tests reached more than 1500 · cm2 at the BBB (Butt et al. 1990; Crone and Olesen 1982). The availability of human primary BBB cells is highly limited. Moreover, using human primary BBB cells is an extremely serious matter, not only in respect of ethical aspects. Human brain cells can, for instance, be isolated from biopsy or autopsy material obtained from patients suffering epilepsy or brain cancer. However, there is the risk that the isolated cells are altered due to disease, which may significantly change the features of the BBB models. An alternative to avoid such problems and to provide standardized human BBB models by the use of reproducible conditions, is the application of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). In this context, it has been successful to differentiate hiPSCs in vitro – under established and reproducible methods – into endothelial cells of the BBB (hiPS-ECs), neural stem cells (hiPS-NSCs) as well as astrocytes (hiPS-A) (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013; Reinhardt et al. 2013) and to use them for model establishment. The endothelial cells were examined for the existence and the functionality of endothelial-specific markers as well as specific transporters by protein- and gene-based methods. Within this work, the croypreservation of hiPS-EC progenitors was established. This will allow an increase of the spatial and temporal flexibility while working with the stem cell based models as well as the establishment of standardized cell banks. Furthermore, multipotent NSCs, isolated from fetal brain biopsies (fNSCs), were used as a control population for hiPSC-NSCs and for BBB modelling. In order to imitate the in vivo BBB in the best possible way and to optimize model characteristics, a set of ten different BBB models based on primary cells, hiPSCs and fNSCs was analyzed. Model establishment was done by the use of transwell systems. By the systematically analysis of the influence of the different neurovascular unit cell types on barrier integrity and on endothelial cell gene expression, the quadruple culture with pericytes, astrocytes and hiPS-NSCs was identified demonstrating the most physiological properties. Due to the significant increase of TEER results up to 2500 · cm2 as well as the at least 1.5-fold increase in gene expression of BBB relevant transporter and TJ markers compared to the mono-cultures, this model was selected for further studies. The presence of a complex in vivo-like TJ network, based on occludin, claudin 1, 3, 4 and 5 was detected by quantitative reale time PCR, Western blot analyses as well as on ultrastructural level by freeze fracture electron microscopy and transmission electron microscopy. Beside the limitation of the paracellular permeability, proven by the low permeation of FITC dextran (4 kDa and 40 kDa), fluorescein and Lucifer yellow, the BBB represents also a barrier for transcellular transported substances. A model evaluation, to assess the models qualification to be used for drug screenings, was proven by transport studies based on BBB relevant reference substances. The classification of the test substances was made analog their permeation rates: diazepam and caffeine are classified as fast, ibuprofen, celecoxib and diclofenac as medium, and loratadine and rhodamine 123 as slow permeating substances. Within our tests, this ranking based on literature data could be confirmed by using the quadruple-culture models, only caffeine was transported with a significantly decreased permeation coefficient compared to the mono-cultures. Furthermore, the implementation of the hiPSC technology allows the generation of a large quantity of human somatic cell types form only one single stem cell line and their provision for specific applications. Within this work it was shown, that by the use of an in-house constructed stirred tank bio-reactor, providing defined culture conditions, a reproducible expansion of hiPSCs was enabled. On this basis, a high throughput drug screening might be possible. The data presented within this work demonstrate the establishment of a stem cell based in vitro quadruple-model of the human BBB with in vivo-like characteristics. All minimal requirements for human BBB modeling, including the reproducibility of the results, adequate characterization with regard on the permeability of reference components, expression of BBB transporters as well as the robust and physiological morphology are fulfilled. The established BBB model can be used in pharmaceutical drug development. In preclinical research adequate qualified models are asked for toxicity and transport studies with new developed substances in order to allow a better in vitro-in vivo correlation of the results. Moreover, the model can be used to develop mechanisms to selectively overcome the barrier. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Stammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - In vitro KW - Endothelzelle KW - induziert pluripotente Stammzelle KW - multipotente Stammzelle KW - in vitro Modell KW - Neurovaskuläre Einheit KW - Neurale Stammzellen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134646 ER -