TY - THES A1 - Önal-Hartmann, Cigdem T1 - Emotional Modulation of Motor Memory Formation T1 - Emotionale Modulation des Motorischen Gedächtnises N2 - Hintergründe: Wie eine Vielzahl von Studien belegt, kann das explizite Gedächtnis, das die bewusste Erinnerung an enkodierte Informationen beinhaltet, durch Emotionen beeinflusst werden, und zwar über den Einfluss auf verschiedene Verarbeitungsebenen (Enkodierung, Konsolidierung, Abruf usw.). Bisher wenig untersucht ist, ob und wie Emotionen Vorgänge der motorischen Gedächtnisbildung, die nicht auf bewusster Erinnerung beruhen und sich stattdessen durch Veränderungen im Verhalten darstellen, modulieren. Experiment 1: Das Ziel des ersten Experimentes war es, den Einfluss von Emotionen auf motorisches Lernen zu untersuchen. Vier Gruppen von Probanden mussten in einer motorischen Lernaufgabe schnelle, seitliche Bewegungen mit dem Daumen ausführen. Während dieser Aufgabe hörten die Probanden emotionale Klänge, die in Valenz und Arousal variierten: 1. Valenz negativ/ Arousal niedrig (V-/A-), 2. Valenz negativ/ Arousal hoch (V-/A+), 3. Valenz positiv/ Arousal niedrig (V+/A-), 4. Valenz positiv/ Arousal hoch (V+/A+). Die deskriptive Analyse aller Daten sprach für beste Ergebnisse für das motorische Lernen in der Bedingung V-/A-, aber die Unterschiede zwischen den Bedingungen waren nicht signifikant. Die Interaktion zwischen Valenz und Arousal emotionaler Töne scheint demnach motorische Enkodierungsprozesse zu modulieren, jedoch müssen zukünftige Studien mit unterschiedlichen emotionalen Stimuli die Annahme weiter untersuchen, dass negative Stimuli mit niedrigem Arousal während der Enkodierung einen fördernden Effekt auf das motorische Kurzzeitgedächtnis haben. Experiment 2: Die Absicht des zweiten Experimentes war es, die Auswirkungen emotionaler Interferenzen auf die Konsolidierung beim Sequenzlernen zu untersuchen. Sechs Gruppen von Probanden trainierten zuerst in getrennten Sitzungen eine SRTT-Aufgabe (serial reaction time task). Um die Konsolidierung der neu erlernten Fertigkeit zu modulieren, wurden die Probanden nach dem Training einer von drei unterschiedlichen Klassen emotionaler Stimuli (positiv, negativ oder neutral) ausgesetzt. Diese bestanden aus einem Set emotionaler Bilder, die mit emotional kongruenten Musikstücken oder neutralen Klängen kombiniert waren. Bei den Probandengruppen wurde die emotionale Interferenz nach zwei unterschiedlichen Zeitintervallen realisiert, entweder direkt nach der Trainingssitzung oder sechs Stunden später. 72 Stunden nach der Trainingssitzung wurde jede Gruppe erneut mit der SRTT-Aufgabe getestet. Die Leistung in diesem Nachtest wurde mittels Reaktionszeit und Genauigkeit bei der Ausführung der Zielsequenz analysiert. Die emotionale Interferenz beeinflusste weder die Nachtestergebnisse für die Reaktionszeit noch die für die Genauigkeit. Allerdings konnte eine Steigerung der expliziten Sequenzerkennung durch erregende negative Stimuli festgestellt werden, wenn diese direkt nach der ersten Trainingseinheit (0h) dargeboten wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Konsolidierung der expliziten Aspekte prozeduralen Lernens in einer stärkeren Wechselwirkung mit emotionalen Interferenzen stehen könnte als die der impliziten Aspekte. Die Konsolidierung unterschiedlicher Ebenen des Fertigkeitserwerbs könnte demnach von unterschiedlichen Mechanismen gesteuert werden. Da Performanz und explizites Sequenzerkennen nicht korrelierten, vermuten wir, dass implizite und explizite Modalitäten bei der Durchführung der SRTT-Aufgabe nicht komplementär sind. Experiment 3: Es sollte untersucht werden, ob es eine Präferenz der linken Gehirnhemisphäre bei der Kontrolle von Flexionsreaktionen auf positive Stimuli gibt und der rechten Hemisphäre bei der Kontrolle von Extensionsreaktionen auf negative Stimuli. Zu diesem Zweck sollten rechtshändige Probanden einen Joystick zu sich ziehen oder von sich weg drücken, nachdem sie einen positiven oder negativen Stimulus in ihrem linken oder rechten Gesichtsfeld gesehen hatten. Die Flexionsreaktionen waren bei positiven Stimuli schneller, Extensionsreaktion hingegen bei negativen Stimuli. Insgesamt war die Performanz am schnellsten, wenn die emotionalen Stimuli im linken Gesichtsfeld präsentiert wurden. Dieser Vorrang der rechten Gehirnhemisphäre war besonders deutlich für negative Stimuli, wohingegen die Reaktionszeiten auf positive Bilder keine hemisphärische Differenzierung zeigten. Wir konnten keine Interaktion zwischen Gesichtsfeld und Reaktionstyp belegen, auch fand sich keine Dreifachinteraktion zwischen Valenz, Gesichtsfeld und Reaktionstyp. In unserem experimentellen Kontext scheint die Interaktion zwischen Valenz und Gesichtsfeld stärker zu sein als die Interaktion zwischen Valenz und motorischem Verhalten. Auf Grund dieser Ergebnisse vermuten wir, dass unter gewissen Bedingungen eine Hierarchisierung der asymmetrischen Muster Vorrang hat, die möglicherweise andere vorhandene Asymmetrien maskieren könnte. N2 - Background: There is extensive evidence that explicit memory, which involves conscious recall of encoded information, can be modulated by emotions; emotions may influence encoding, consolidation or retrieval of information. However, less is known about the modulatory effects of emotions on procedural processes like motor memory, which do not depend upon conscious recall and are instead demonstrated through changes in behaviour. Experiment 1: The goal of the first experiment was to examine the influence of emotions on motor learning. Four groups of subjects completed a motor learning task performing brisk isometric abductions with their thumb. While performing the motor task, the subjects heard emotional sounds varying in arousal and valence: (1) valence negative / arousal low (V-/A-), (2) valence negative / arousal high (V-/A+), (3) valence positive / arousal low (V+/A-), and (4) valence positive / arousal high (V+/A+). Descriptive analysis of the complete data set showed best performances for motor learning in the V-/A- condition, but the differences between the conditions did not reach significance. Results suggest that the interaction between valence and arousal may modulate motor encoding processes. Since limitations of the study cannot be ruled out, future studies with different emotional stimuli have to test the assumption that exposure to low arousing negative stimuli during encoding has a facilitating effect on short term motor memory. Experiment 2: The purpose of the second experiment was to investigate the effects of emotional interference on consolidation of sequential learning. In different sessions, 6 groups of subjects were initially trained on a serial reaction time task (SRTT). To modulate consolidation of the newly learned skill, subjects were exposed, after the training, to 1 of 3 (positive, negative or neutral) different classes of emotional stimuli which consisted of a set of emotional pictures combined with congruent emotional musical pieces or neutral sound. Emotional intervention for each subject group was done in 2 different time intervals (either directly after the training session, or 6 h later). After a 72 h post-training interval, each group was retested on the SRTT. Re-test performance was evaluated in terms of response times and accuracy during performance of the target sequence. Emotional intervention did not influence either response times or accuracy of re-testing SRTT task performance. However, explicit awareness of sequence knowledge was enhanced by arousing negative stimuli applied at 0 h after training. These findings suggest that consolidation of explicit aspects of procedural learning may be more responsive toward emotional interference than are implicit aspects. Consolidation of different domains of skill acquisition may be governed by different mechanisms. Since skill performance did not correlate with explicit awareness we suggest that implicit and explicit modes of SRTT performance are not complementary. Experiment 3: The aim of the third experiment was to analyze if the left hemisphere preferentially controls flexion responses towards positive stimuli, while the right hemisphere is specialized towards extensor responses to negative pictures. To this end, right-handed subjects had to pull or push a joystick subsequent to seeing a positive or a negative stimulus in their left or right hemifield. Flexion responses were faster for positive stimuli, while negative stimuli were associated with faster extensions responses. Overall, performance was fastest when emotional stimuli were presented to the left visual hemifield. This right hemisphere superiority was especially clear for negative stimuli, while reaction times towards positive pictures showed no hemispheric difference. We did not find any interaction between hemifield and response type. Neither was there a triple interaction between valence, hemifield and response type. In our experimental context the interaction between valence and hemifield seems to be stronger than the interaction between valence and motor behaviour. From these results we suppose that under certain conditions a hierarchy scaling of the asymmetry patterns prevails, which might mask any other existing asymmetries. KW - Motorisches Lernen KW - Gefühl KW - Motorisches Gedächtnis KW - Emotionen KW - Konsolidierung KW - Motor Memory KW - Emotion Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64838 ER - TY - THES A1 - Zundler, Matthias T1 - Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten T1 - Role of phosphoglycolate phosphatase in the metabolism of signaling, membrane and storage lipids in murine embryos and lymphocytes N2 - Die Phosphoglykolat-Phosphatase PGP (früher auch als AUM bezeichnet) wurde in unserem Labor als Mitglied der HAD-Typ-Phosphatasen identifiziert. Die genetische Inaktivierung des Enzyms im gesamten Mausorganismus führt ab E8.5 zu einer Wachstumsverzögerung muriner Embryonen und bis E12.5 schließlich zu deren Tod. Im Gegensatz dazu sind Mäuse mit einer PGP-Inaktivierung in hämatopoetischen Zellen und im Endothel lebensfähig und phänotypisch unauffällig. Neue Erkenntnisse schreiben dem Enzym neben einer Aktivität gegenüber Phosphoglykolat auch Aktivitäten gegenüber Glycerin-3-phosphat (G3P), P-Erythronat und P-Lactat zu. Da diese Phosphatase-Aktivitäten Auswirkungen auf den Lipidstoffwechsel nahelegen, wurde in der vorliegenden Arbeit mittels massenspektrometrischer Methoden der Einfluss der Phosphoglykolat-Phosphatase auf den Metabolismus von Signal-, Membran- und Speicherlipiden in murinen Embryonen und Lymphozyten untersucht. Nach Inaktivierung der PGP im gesamten Organismus wurden in E8.5-Embryonen erhöhte Diacylglycerin (DG)-, Triacylglycerin (TG)- und Sphingomyelin (SM)-Spiegel gemessen, während niedrigere Phosphatidylcholin (PC)-Level vorlagen. In PGP-inaktivierten Lymphozyten waren G3P-, DG-, TG-, PC- und SM-Level nicht verändert. Dafür kam es zu signifikanten Erhöhungen der Phosphatidylglycerol (PG*)- und Cardiolipin (CL)-Spiegel. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die PGP in unterschiedlichen Geweben differenzielle Effekte auf die Spiegel verschiedener Lipide hat. Dies deckt neue Funktionen der PGP für die Regulation des Lipidmetabolismus auf. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen über die genauen Ursachen und Folgen dieser Regulation dar und lässt auf eine wichtige Rolle der PGP als metabolische Phosphatase im Organismus schließen. N2 - Our laboratory has previously identified the mammalian phosphoglycolate phosphatase PGP (also referred to as AUM) as a member of the HAD-type superfamily of hydrolases. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpD34N/D34N embryos until E12.5. In contrast, mice with a deficiency of PGP activity in endothelial and hematopoietic cells were viable and phenotypically normal. Recent findings demonstrate catalytic activities of the PGP towards phosphoglycolate, glycerol-3-phosphate (G3P), P-erythronate and P-lactate. Since these catalytic activities suggest implications for the lipid metabolism, this thesis examined the PGP-dependent formation of signal-, membrane- and storage lipids in E8.5 embryos and adult lymphocytes of mice by means of mass spectrometry. Following whole-body inactivation of PGP increased diacylglycerol (DG)-, triacylglycerol (TG)- and sphingomyeline (SM)-levels were detected in E8.5 embryos, whereas lower phosphatidylcholine (PC)-levels were present. In PGP-deficient lymphocytes G3P-, DG-, TG-, PC- and SM-level were unaltered. However, levels of phosphatidylglycerol (PG*) and cardiolipine (CL) were significantly increased. Taken together this thesis reveals new and tissue-dependent functions of PGP in the regulation of the lipid metabolism and indicates an important role of PGP as a metabolic phosphatase. It constitutes the basis for further studies on the exact roots and the physiological effects of the metabolic regulation by PGP. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Glycerinphosphate KW - Lipidomics KW - Flugzeitmassenspektrometrie KW - Phosphoglykolat KW - Phosphatase KW - Glycerin-3-phosphat KW - Lipidom KW - Time-of-flight Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168442 ER - TY - THES A1 - Zugelder, Laurens T1 - Etablierung eines stabilen induzierbaren Multikassetten-Systems für shRNA-Knockdown-Konstrukte in Myelom Zelllinien und Anwendung zur Analyse des NFκB-Signalwegs T1 - Establishment of a stable and inducible Multicassette-shRNA-Knockdown System in Myeloma Cell Lines and Adaption to the Evaluation of the NFκB-Pathway in Multiple Myeloms N2 - Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verfügbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenität des MM zurückgeführt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen ermöglichen, eine wichtige Säule dar, für deren Durchführung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verfügung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors ermöglicht durch die vollständige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen für Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und bestätigen somit die Äquivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ansätzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Phänotyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realität einer medikamentösen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation näherungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug für die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen für molekulare Therapieansätze im Multiplen Myelom darstellt N2 - Despite steady progress concerning the therapeutic arsenal available to and the improved prognosis for newly diagnosed patients, multiple myeloma still has to be regarded as an incurable malignancy in the overwhelming majority of cases. This is mainly due to the disease’s high grade of inter- and intraindividual heterogeneity, which greatly complicates the development of molecular therapies. Loss-of-function studies, which enable researchers to identify individual or combinations of drug targets with a potential for clinical relevance by correlating the (combined) depletion of proteins with the resulting phenotype, represent an important cornerstone in the process of developing new molecular therapies, for the execution of which a broad variety of systems with their individual advantages and disadvantages is available. During this thesis project, the establishment of a stable and inducible knockdown system by way of electroporation of myeloma cell lines with single- and multiple-shRNA- expression vectors was successfully completed. Transfecting cell lines which constitutively express the tet-repressor protein with a single plasmid vector carrying one or multiple shRNA expression cassettes allows for the selection of successfully transposed cells without any effect mediated bias and the creation of large amounts of cells for experiments in a comparatively short time, thanks to the full repression of the transcription of the transfected shRNA genes in an un-induced state. Inducing their transcription by adding doxycycline to the cell suspension resulted in strong and specific knockdowns for all single and multiple constructs against different (combinations of) targets in the Ras/MAPK- and the NFκB-pathway which were tested in the experiments shown in this thesis. Results regarding knockdowns, functional readouts and alterations in cellular metabolism mirrored with experiments conducted previously with both transiently expressed shRNAs and pharmacological inhibitors and therefore attest to the universal applicability of the system. The resulting polyclonal cell population with a hypomorphic phenotype depicts the reality conveyed by a pharmacological inhibition of one or more targets within a heterogenic myeloma tumour rather well and therefore this stable and inducible system represents a useful, economical and easily applicable tool for the identification of potentially relevant targets for the development of new molecular therapies in multiple myeloma. KW - Plasmozytom KW - Multiples Myelom KW - shRNA KW - reverse genetics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188377 ER - TY - THES A1 - Zude, Ingmar T1 - Characterization of virulence-associated traits of Escherichia coli bovine mastitis isolates T1 - Charakterisierung Virulenz-assozierter Eigenschaften von Escherichia coli Isolaten boviner Mastitis N2 - Bacterial mastitis is caused by invasion of the udder, bacterial multiplication and induction of inflammatory responses in the bovine mammary gland. Disease severity and the cause of disease are influenced by environmental factors, the cow’s immune response as well as bacterial traits. Escherichia coli (E. coli) is one of the main causes of acute bovine mastitis, but although pathogenic E. coli strains can be classified into different pathotypes, E. coli causing mastitis cannot unambiguously be distinguished from commensal E. coli nor has a common set of virulence factors been described for mastitis isolates. This project focussed on the characterization of virulence- associated traits of E. coli mastitis isolates in comprehensive analyses under conditions either mimicking initial pathogenesis or conditions that E. coli mastitis isolates should encounter while entering the udder. Virulence-associated traits as well as fitness traits of selected bovine mastitis or faecal E. coli strains were identified and analyzed in comparative phenotypic assays. Raw milk whey was introduced to test bacterial fitness in native mammary secretion known to confer antimicrobial effects. Accordingly, E. coli isolates from bovine faeces represented a heterogeneous group of which some isolates showed reduced ability to survive in milk whey whereas others phenotypically resembled mastitis isolates that represented a homogeneous group in that they showed similar survival and growth characteristics in milk whey. In contrast, mastitis isolates did not exhibit such a uniform phenotype when challenged with iron shortage, lactose as sole carbon source and lingual antimicrobial peptide (LAP) as a main defensin of milk. Reduced bacterial fitness could be related to LAP suggesting that bacterial adaptation to an intramammary lifestyle requires resistance to host defensins present in mammary secretions, at least LAP. E. coli strain 1303 and ECC-1470 lack particular virulence genes associated to mastitis isolates. To find out whether differences in gene expression may contribute to the ability of E. coli variants to cause mastitis, the transcriptome of E. coli model mastitis isolates 1303 and ECC-1470 were analyzed to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction, fitness or even pathogenicity during bovine mastitis. DNA microarray analysis was employed to assess the transcriptional response of E. coli 1303 and ECC-1470 upon cocultivation with MAC-T immortalized bovine mammary gland epithelial cells to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction. Additionally, the cell adhesion and invasion ability of E. coli strain 1303 and ECC-1470 was investigated. The transcriptonal response to the presence of host cells rather suggested competition for nutrients and oxygen between E. coli and MAC-T cells than marked signs of adhesion and invasion. Accordingly, mostly fitness traits that may also contribute to efficient colonization of the E. coli primary habitat, the gut, have been utilized by the mastitis isolates under these conditions. In this study, RNA-Seq was employed to assess the bacterial transcriptional response to milk whey. According to our transcriptome data, the lack of positively deregulated and also of true virulence-associated determinants in both of the mastitis isolates indicated that E. coli might have adapted by other means to the udder (or at least mammary secretion) as an inflammatory site. We identified traits that promote bacterial growth and survival in milk whey. The ability to utilize citrate promotes fitness and survival of E. coli that are thriving in mammary secretions. According to our results, lactoferrin has only weak impact on E. coli in mammary secretions. At the same time bacterial determinants involved in iron assimilation were negatively regulated, suggesting that, at least during the first hours, iron assimilation is not a challenge to E. coli colonizing the mammary gland. It has been hypothesized that cellular iron stores cause temporary independency to extracellular accessible iron. According to our transcriptome data, this hypothesis was supported and places iron uptake systems beyond the speculative importance that has been suggested before, at least during early phases of infection. It has also been shown that the ability to resist extracytoplasmic stress, by oxidative conditions as well as host defensins, is of substantial importance for bacterial survival in mammary secretions. In summary, the presented thesis addresses important aspects of host-pathogen interaction and bacterial conversion to hostile conditions during colonization of the mastitis inflammatory site, the mammary gland. N2 - Bei der bakteriellen Mastitis handelt es sich um eine Infektion der bovinen Milchdrüse, ausgelöst durch Eintritt und Wachstum der Bakterien im Euter der Kuh. Krankheitsverlauf und Ursache werden beeinflusst durch Umweltfaktoren, das Immunsystem des Wirtes und die Eigenschaften des bakteriellen Erregers. Die Spezies Escherichia coli (E. coli) ist einer der häufigsten Erreger der akuten bovinen Mastitis. Generell können pathogene E. coli -Stämme entsprechend ihres Infektionsortes in verschiedene Pathotypen klassifiziert werden, die durch eine individuelle Kombination verschiedener Virulenzfaktoren gekennzeichnet sind. Eine eindeutige Unterscheidung von E. coli –Mastitiserregern und kommensalen E. coli -Stämmen ist bisher nicht beschrieben. Diese Studie befasst sich mit der Charakterisierung virulenz-assozierter Eigenschaften von E. coli –Isolaten der bovinen Mastitis. Dazu wurden Untersuchungen unter Bedingungen durchgeführt, die denen während der Anfangsphase der Mastitis entsprechen. Die Virulenz und Fitness-assoziierten Eigenschaften ausgewählter E. coli Mastitis- und Fäkalisolate wurden in vergleichenden phenotypischen Assays identifiziert und analysiert. Zur Untersuchung der bakteriellen Fitness in Milchdrüsensekreten wurde native Molke mit antimikrobiellen Eigenschaften von Rohmilch genutzt. Dabei stellte sich heraus dass E. coli Fäkalisolate eine heterogene Gruppe bilden. Innerhalb dieser Gruppe wiesen einige Isolate eine verminderte Überlebensrate auf. Andere Fäkalisolate zeigten eine höhere Überlebensrate, ähnlich der Überlebensrate von Mastitiserregern. Im Gegensatz zum ihrem grundsätzlich guten Überleben in Molke zeigten Mastitisisolate keine einheitlichen phänotypischen Merkmale bei Wachstum mit 1) Lactose als einziger Kohlenstoffquelle, 2) Eisenlimitierung, oder 3) unter Einfluss von lingualem antimikrobiellem Peptid (LAP), einem bedeutenden Defensin der Wirtsantwort im Euter. Die verminderte Fähigkeit in Milchdrüsensekreten zu überleben korrelierte mit der konzentrationsabhängigen Überlebensfähigkeit in Gegenwart von LAP. Dies lässt vermuten dass eine Anpassung der Bakterien an die Lebensbedingungen in der bovinen Milchdrüse der Resistenz gegenüber Defensinen (u.a. LAP) bedarf. Den Mastitis-isolaten E. coli 1303 und ECC 1470 fehlen diverse Virulenzgene die bereits mit Mastitis assoziiert werden konnten. Um zu bestimmen ob Unterschiede in der Genexpression beider E. coli Isolate dazu beitragen Mastitis auszulösen, wurden Transkriptomanalysen durchgeführt. Dabei sollten vor allem Kandidatengene bestimmt werden, die an der Wirt-Pathogen-Interaktion beteiligt sind oder zur bakteriellen Fitness oder Virulenz der Erreger beitragen. Auf der Basis von DNA Microarrays wurde die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Gegenwart von immortalisierten Zellen des bovinen Milchdrüsenepithels (MAC-T) bestimmt. Zusätzlich wurde die Fähigkeit zur Zelladhäsion und Internalisierung beider Isolate untersucht. Die bakterielle Transkriptionsantwort in Gegenwart der Wirtszellen ergab, dass Erreger und Wirtszellen eher um den Bedarf an Nährstoffen und Sauerstoff konkurrierten, anstatt deutliche Anzeichen der Zelladhäsion oder Invasion zu zeigen. Beide Isolate nutzten vornehmlich Fitnesseigenschaften, die auch bei der Besiedlung des Darms als dem primären Habitat von E. coli verwendet werden. In dieser Studie wurde außerdem die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Reaktion auf Molke aus Rohmilch mittels Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung (RNA Seq) untersucht. Die Transkriptomanalyse ergab keine wirklich deregulierten virulenz-assozierten Gene in einer der beiden E. coli Mastitis Isolate. Ferner konnten Eigenschaften identifiziert werden, die zum Wachstum und Überleben in nativer Molke beitragen. Die Fähigkeit, Citrat zu verwerten, begünstigt das erfolgreiche Überleben in Milchdrüsensekten und stellt einen wichtigen Fitnessfaktor dar. Unsere Transkriptomdaten bestätigen dass Lactoferrin nur geringen Einfluss auf das Wachstum, von E. coli in Milchdrüsensekreten, hat. Die Expression bakterieller Determinanten, die an der Aufnahme von Eisen beteiligt sind, wurde herunterreguliert. Dies lässt darauf schließen dass Eisenaufnahme in den ersten Stunden der Kolonisierung durch die Erreger keine essentielle Fitnesseigenschaft darstellt. Vermutlich reicht die intrazelluläre Menge an Eisen aus, um eine zeitweise Unabhängigkeit von extrazellular verfügbarem Eisen zu ermöglichen. Diese These konnte durch unsere Transkriptomdaten gestützt werden und stellt eine wichtige Entdeckung in Bezug auf die Verfügbarkeit von Eisen während der Kolonisierung der Milchdrüse dar. Unsere Daten zeigen, dass die Resistenz gegenüber extrazellulärem Stress durch oxidative Bedingungen und Defensine des Wirtes von großer Bedeutung für das bakterielle Überleben in Milchdrüsensekreten ist. Die vorliegende Thesis befasst sich mit wichtigen Aspekten der Wirt-Pathogen-Interaktion und der Anpassung an die antimikrobiellen Bedingungen während der Kolonisierung der Milchdrüse als Ort der Infektion. KW - Escherichia coli KW - mastitis KW - infection KW - virulence KW - transcriptome analysis KW - Kuh KW - Brustdrüsenentzündung KW - Virulenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100934 ER - TY - THES A1 - Zoran, Tamara T1 - Multilevel analysis of the human immune response to \(Aspergillus\) \(fumigatus\) infection: Characteristic molecular signatures and individual risk factors T1 - Analysen der humanen Immunantwort auf eine Infektion mit \(Aspergillus\) \(fumigatus\): Charakteristische molekulare Signaturen und individuelle Risikofaktoren N2 - Although the field of fungal infections advanced tremendously, diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis (IPA) in immunocompromised patients continues to be a challenge. Since IPA is a multifactorial disease, investigation from different aspects may provide new insights, helpful for improving IPA diagnosis. This work aimed to characterize the human immune response to Aspergillus fumigatus in a multilevel manner to identify characteristic molecular candidates and risk factors indicating IPA, which may in the future support already established diagnostic assays. We combined in vitro studies using myeloid cells infected with A. fumigatus and longitudinal case-control studies investigating patients post allogeneic stem cell transplantation (alloSCT) suffering from IPA and their match controls. Characteristic miRNA and mRNA signatures indicating A. fumigatus-infected monocyte-derived dendritic cells (moDCs) demonstrated the potential to differentiate between A. fumigatus and Escherichia coli infection. Transcriptome and protein profiling of alloSCT patients suffering from IPA and their matched controls revealed a distinctive IPA signature consisting of MMP1 induction and LGAL2 repression in combination with elevated IL-8 and caspase-3 levels. Both, in vitro and case-control studies, suggested cytokines, matrix-metallopeptidases and galectins are important in the immune response to A. fumigatus. Identified IPA characteristic molecular candidates are involved in numerous processes, thus a combination of these in a distinctive signature may increase the specificity. Finally, low monocyte counts, severe GvHD of the gut (grade ≥ 2) and etanercept administration were significantly associated with IPA diagnosis post alloSCT. Etanercept in monocyte-derived macrophages (MDM) infected with A. fumigatus downregulates genes involved in the NF-κB and TNF-α pathway and affects the secretion of CXCL10. Taken together, identified characteristic molecular signatures and risk factors indicating IPA may in the future in combination with established fungal biomarkers overcome current diagnostic challenges and help to establish tailored antifungal therapy. Therefore, further multicentre studies are encouraged to evaluate reported findings. N2 - Obwohl im Bereich der Erforschung invasiver Pilzinfektionen aktuell enorme Fortschritte erzielt wurden, stellt die Diagnose der Invasiven Pulmonalen Aspergillose (IPA) bei immunsupprimierten Patienten weiterhin eine grosse Herausforderung dar. Da es sich bei der IPA um eine multifaktorielle Erkrankung handelt, können Untersuchungen unter verschiedenen Fragestellungen neue Erkenntnisse liefern, die zur Verbesserung der IPA Diagnose beitragen. In dieser Arbeit wurde die humane Immunantwort auf Aspergillus fumigatus auf mehreren Ebenen untersucht, um charakteristische molekulare Kandidaten und Risikofaktoren zu identifizieren, die auf eine IPA hinweisen um so in Zukunft bereits etablierte diagnostische Tests unterstützen zu können. Wir kombinierten in vitro Studien mit A. fumigatus infizierten, myeloischen Zellen mit longitudinalen Case-Control-Studien, in denen an IPA erkrankte Patienten und ihre passenden Kontrollpatienten nach allogener Stammzelltransplantation (alloSZT) untersucht wurden. Charakteristische miRNA und mRNA Signaturen von A. fumigatus-infizierten Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) zeigten das Potenzial, zwischen A. fumigatus und Escherichia coli Infektionen zu unterscheiden. Transkriptom- und Protein- Analysen von alloSZT Patienten, die an einer IPA erkrankten, und den passenden Kontrollpatienten ergaben charakteristische IPA Signaturen, bestehend aus einer MMP1 Induktion und einer LGALS2 Repression, in Kombination mit erhöhten IL-8 und Caspase-3 Konzentrationen. Sowohl die in vitro Daten als auch die Fall-Kontroll- Studien zeigten, dass Zytokine, Matrix-Metallopeptidasen und Galectine eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf A. fumigatus spielen. Die in IPA identifizierten charakteristischen molekularen Kandidaten sind an mehreren Prozessen beteiligt, so dass eine Kombination dieser molekularen Kandidaten die Spezifität mittels charakteristischer Signatur erhöhen könnte. Schließlich waren niedrige Monozytenzahlen, eine schwere GvHD des Darms (Grad ≥ 2) und die Anwendung von Etanercept signifikant mit einer IPA Diagnose nach alloSZT assoziiert. Etanercept in Makrophagen, die mit A. fumigatus ko-kultiviert wurden, reguliert Gene herunter, die am NF-κB- und TNF-α-Signalweg beteiligt sind, und beeinflusst die Sekretion von CXCL10. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die identifizierten charakteristischen molekularen Signaturen und Risikofaktoren, die auf eine IPA hinweisen, in Zukunft in Kombination mit etablierten Pilz-Biomarkern die derzeitigen diagnostischen Limitationen überwinden könnten und dazu beitragen könnten, eine patientenindividuelle antimykotische Therapie zu etablieren. Es werden jedoch weitere multizentrische Studien notwendig sein, um diese Ergebnisse umfassend zu bewerten. KW - Aspergillus fumigatus KW - Immunantwort KW - Risikofaktoren KW - invasive pulmonary aspergillosis KW - immune response KW - risk factors KW - transcriptome profiling Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298512 ER - TY - THES A1 - Zink [geb. Sondergeld], Thomas Gerd T1 - Der Cofilin-Signalweg im Glioblastoma multiforme - Ursachen für den Verlust von Chronophin und Einfluss von LIM-Kinase-Inhibitoren T1 - The cofilin pathway in glioblastoma multiforme - Reasons for chronophin loss and effect of LIM-kinase inhibitors N2 - Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2. Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe. N2 - The invasive potential of malignant gliomas is the main reason for the dismal prognosis of this tumor entity. Migration and invasion of tumor cells is crucially determined by the cofilin dependent reorganization of the actin cytoskeleton regulated by the activity of antagonistic cofilin kinases and phosphatases. This study revealed a progressive loss of expression of the cofilin phosphatase chronophin with increasing malignancy grade of astrocytic glioma, accompanied by an increase of cofilin phosphorylation. Moreover, the analyzed glioma specimens were characterized by a simultaneous increase of expression of the cofilin kinase LIMK-2. Integrated genetic and epigenetic analysis of the chronophin locus identified an aberrant promoter methylation as a possible mechanism leading to chronophin down-regulation in glioblastoma tissue samples. In contrast, molecular alterations of the chronophin locus were undetectable in glioblastoma cell lines characterized by different chronophin expression levels. Analysis of glioblastoma cells demonstrated striking effects of ROCK and LIMK inhibitors on cell morphology, providing first evidence of the induction of a stellate cell-phenotype by the LIMK inhibitor BMS-5. While ROCK and LIMK inhibitors had no detectable effect on the 2D motility of the tumor cells, the inhibitors increased or decreased the 3D-invasiveness of the glioma cells depending on their basal cofilin activity. The findings of this study stress the importance of the cofilin signaling pathway as a key regulator of glioma migration and invasion, indicate novel targets for glioma therapy, but also warn against a noncritical use of new drugs. KW - Cofilin KW - Glioblastom KW - Chronophin KW - Actin KW - Rho-Proteine KW - PDXP KW - LIMK KW - BMS-5 KW - Signalkette KW - Rho-GTPasen Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127065 ER - TY - THES A1 - Zimniak, Melissa Maria T1 - Der Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Fluoxetin inhibiert die SARS-CoV-2-Replikation T1 - The serotonin reuptake inhibitor Fluoxetine inhibits SARS-CoV-2 replication N2 - Die COVID-19 Pandemie ist die bisher verheerendste Pandemie des 21. Jahrhunderts. Durch die Einführung neuer mRNA-basierter Impfstoffe sowie der hohen Rate natürlicher Infektionen konnte die weltweite SARS-CoV-2-Immunität gesteigert werden. Trotz aller Erfolge zur Eindämmung der Pandemie kann eine Infektion auch heute noch zu schweren Verläufen und Tod führen. Eine adäquate COVID-19-Therapie ist folglich auf potente Virostatika angewiesen. Eine durch Umgehung zeitaufwändiger klinischer Studien schnell verfügbare Alternative zu neu entwickelten Arzneimitteln ist die Anwendung etablierter Medikamente. Wir isolierten und charakterisierten ein von einem Patienten stammendes SARS-CoV-2-Virus. Dieses Virusisolat wurde bisher in elf Publikationen verwendet. Mittels quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion untersuchten wir eine Substanzbibliothek mit mehr als 300 neuen und bereits zugelassenen Wirkstoffen auf ihre Wirksamkeit gegen SARS-CoV-2. Dabei konnten wir zeigen, dass der selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Fluoxetin die SARS-CoV-2-Replikation ab einer Dosis von 0,8 μg/ml signifikant inhibiert, einer bei der Behandlung von Depressionen häufig angewandten Dosierung. Der EC50-Wert lag bei 387 ng/ml. Die Behandlung mit Fluoxetin resultierte in einer reduzierten Zahl an Virusprotein-produzierenden Zellen, was darauf hindeutet, dass es die virale Reinfektion und/oder Proteinexpression inhibiert. Fluoxetin ist ein racemisches Gemisch, wobei das (S)-Enantiomer der potentere Serotonin-Wiederaufnahmehemmer ist. Wir konnten zeigen, dass beide Enantiomere einen vergleichbaren antiviralen Effekt gegen SARS-CoV-2 aufweisen, wodurch das (R)-Enantiomer bei virologischer Indikation gegebenenfalls präferiert werden sollte. Fluoxetin hat keinen Einfluss auf die Replikation des Tollwut-Virus und des Humanen Respiratorischen Synzytial-Virus, was auf eine Virusspezifität hindeutet. Weitere aus der Bibliothek stammende signifikante Inhibitoren der SARS-CoV-2-Replikation sind die am Institut für Organische Chemie Würzburg entwickelten Substanzen AKS 232 und AKS 128. Neben der medikamentösen Therapie ist die akkurate Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen SARS-CoV-2 zur Quantifizierung des bestehenden (Re-) Infektionsschutzes sowie zur Planung zukünftiger Impfstrategien von großer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit entwickelten wir unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktion erfolgreich ein zuverlässiges Testverfahren zur Detektion neutralisierender anti-SARS-CoV-2 Antikörper. N2 - The COVID-19 pandemic is the most fatal pandemic of the 21st century. The introduction of new mRNA-based vaccines and the high rate of natural infections have increased global SARS-CoV-2 immunity. Despite the successes in containing the pandemic, infection can still lead to severe courses and death. COVID-19 treatment is therefore dependent on potent antivirals. The development of new antivirals is a prolonged process. By bypassing time-consuming clinical trials, repurposing established medication offers a quickly available alternative to newly developed drugs. We isolated and characterized a patient-derived SARS-CoV-2 virus. This virus isolate has been used in 11 publications so far. Using quantitative real-time polymerase chain reaction, we investigated a compound library with more than 300 new and already approved substances against SARS-CoV-2. We showed that the selective serotonin reuptake inhibitor Fluoxetine significantly inhibits SARS-CoV-2 replication at a concentration of 0.8 µg/ml, a dosage frequently used in the treatment of depression. The EC50 was determined with 387 ng/ml. Treatment with Fluoxetine resulted in a decrease in viral protein-expressing cells, indicating that it inhibits viral reinfection and/or protein expression. Fluoxetine is a racemate with the (S)-enantiomer being the dominant serotonin reuptake inhibitor. We have shown that both stereoisomers have a comparable antiviral effect against SARS-CoV-2, suggesting the (R)-enantiomer might be the preferred option for virological indications. Fluoxetine suppressed neither Rabies virus nor human Respiratory Syncytial Virus replication, indicating it is virus specific. Other significant inhibitors of SARS-CoV-2 replication originating in the compound library are AKS 232 and AKS 128, developed with the Institute of Organic Chemistry Würzburg. In addition to drug therapy, the accurate determination of neutralising antibodies against SARS-CoV-2 is of great importance for quantifying the existing (re)infection protection and for planning future vaccination strategies. In this work, we successfully developed a reliable test procedure for the detection of neutralising anti-SARS-CoV-2 antibodies using the quantitative real-time polymerase chain reaction. KW - Fluoxetin KW - SARS-CoV-2 KW - COVID-19 KW - Antivirale Substanzen KW - Selektiver Serotonin Wiederaufnahmehemmer / SSRI KW - Virusreplikation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-347190 ER - TY - THES A1 - Zimmermann [née Papp], Lena T1 - Platelets as modulators of blood-brain barrier disruption and inflammation in the pathophysiology of ischemic stroke T1 - Thrombozyten als Modulatoren der Blut-Hirn-Schrankenstörung und Inflammation in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls N2 - Ischemia-reperfusion injury (I/R injury) is a common complication in ischemic stroke (IS) treatment, which is characterized by a paradoxical perpetuation of tissue damage despite the successful re-establishment of vascular perfusion. This phenomenon is known to be facilitated by the detrimental interplay of platelets and inflammatory cells at the vascular interface. However, the spatio-temporal and molecular mechanisms underlying these cellular interactions and their contribution to infarct progression are still incompletely understood. Therefore, this study intended to clarify the temporal mechanisms of infarct growth after cerebral vessel recanalization. The data presented here could show that infarct progression is driven by early blood-brain-barrier perturbation and is independent of secondary thrombus formation. Since previous studies unravelled the secretion of platelet granules as a molecular mechanism of how platelets contribute to I/R injury, special emphasis was placed on the role of platelet granule secretion in the process of barrier dysfunction. By combining an in vitro approach with a murine IS model, it could be shown that platelet α-granules exerted endothelial-damaging properties, whereas their absence (NBEAL2-deficiency) translated into improved microvascular integrity. Hence, targeting platelet α-granules might serve as a novel treatment option to reduce vascular integrity loss and diminish infarct growth despite recanalization. Recent evidence revealed that pathomechanisms underlying I/R injury are already instrumental during large vessel occlusion. This indicates that penumbral tissue loss under occlusion and I/R injury during reperfusion share an intertwined relationship. In accordance with this notion, human observational data disclosed the presence of a neutrophil dominated immune response and local platelet activation and secretion, by the detection of the main components of platelet α-granules, within the secluded vasculature of IS patients. These initial observations of immune cells and platelets could be further expanded within this thesis by flow cytometric analysis of local ischemic blood samples. Phenotyping of immune cells disclosed a yet unknown shift in the lymphocyte population towards CD4+ T cells and additionally corroborated the concept of an immediate intravascular immune response that is dominated by granulocytes. Furthermore, this thesis provides first-time evidence for the increased appearance of platelet-leukocyte-aggregates within the secluded human vasculature. Thus, interfering with immune cells and/or platelets already under occlusion might serve as a potential strategy to diminish infarct expansion and ameliorate clinical outcome after IS. N2 - Eine häufig auftretende Komplikation in der Behandlung des ischämischen Schlaganfalls ist der Ischämie/Reperfusion Schaden (I/R Schaden), welcher trotz der erfolgreichen Wiederherstellung der zerebralen Durchblutung durch ein paradoxes Fortschreiten des entstandenen Gewebeschadens charakterisiert ist. Dieses Phänomen wird durch das schädigende Zusammenspiel von Thrombozyten und inflammatorischen Zellen am vaskulären Endothel verursacht. Allerdings sind die räumlich-temporalen und molekularen Mechanismen dieser zellulären Interaktionen und deren Beteiligung am Infarktwachstum noch nicht vollständig verstanden. Daraus folgend, beabsichtigte diese Arbeit eben diese temporalen Mechanismen des fortschreitenden Infarktwachstums nach der zerebralen Gefäßwiedereröffnung aufzuklären. Die hier vorgestellten Daten implizieren, dass das anhaltende Fortschreiten des Gewebeschadens durch die Schädigung der Bluthirnschranke verursacht wird und somit unabhängig vom Auftreten sekundär gebildeter Thromben ist. In vorangegangenen Studien konnte die Freisetzung von thrombozytären Granula als molekularer Mechanismus, mit welchem Thrombozyten zum I/R Schaden beitragen, aufgedeckt werden. Basierend auf diesen Studien wurde in dieser Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die Sekretion thrombozytärer Granula im Zusammenhang mit der Beeinträchtigung der endothelialen Barriere gelegt. Durch die Kombination eines in vitro Ansatzes mit einem murinen Model des ischämischen Schlaganfalls konnte gezeigt werden, dass α-Granula endothelialen Schaden verursachen, wohingegen deren Absenz (NBEAL2 Defizienz) zu einer verbesserten mikrovaskulären Integrität führte. Aufgrund dessen könnte das Adressieren der α-Granula als eine neuartige Therapieoption zum Erhalt der vaskulären Integrität und zur Verminderung des Infarktwachstums trotz Rekanalisation genutzt werden. Neuste Erkenntnisse enthüllten, dass die dem I/R Schaden zu Grunde liegenden Pathomechanismen bereits während des Verschlusses eines großen hirnversorgenden Gefäßes zu beobachten sind. Dies deutet darauf hin, dass der Verlust von penumbralem Gewebe unter Okklusion und I/R Schädigung während der Reperfusion im engen Zusammenhang stehen. Im Einklang hiermit konnten humane Daten eine Neutrophilen-dominierte Immunantwort und lokale Thrombozyten Aktivierung und deren Sekretion, anhand der Detektion der α-Granula Hauptkomponenten, im verschlossenen Gefäßsystem von ischämischen Schlaganfall Patienten nachweisen. Diese anfänglichen Beobachtungen konnten im Rahmen dieser Arbeit anhand durchflusszytometrischer Untersuchungen von lokal abgenommenen ischämischen Blutproben erweitert werden. Die Phänotypisierung von Immunzellen enthüllte eine bisher unbekannte Verschiebung der Lymphozyten Population hin zu CD4+ T-Zellen und bekräftigte zusätzlich das Konzept einer unmittelbaren intravaskulären Immunantwort, welche durch Granulozyten dominiert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Thesis das erste Mal das erhöhte Auftreten von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten in dem verschlossenen humanen Gefäßsystem nachgewiesen werden. Demzufolge könnte eine Beeinflussung von Immunzellen und/oder Thrombozyten bereits unter Okklusion als potentiell vielversprechende Strategie genutzt werden, um die Ausweitung des Infarktes einzuschränken und klinische Endpunkte nach einem ischämischen Schlaganfall zu verbessern. KW - Schlaganfall KW - Thrombozyt KW - Entzündung KW - Thrombo-inflammation KW - Ischemic stroke KW - Platelets KW - Inflamamtion KW - Immune cells KW - Vascular system Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302850 ER - TY - THES A1 - Zillig, Anna-Lena Christina T1 - Einfluss von Sicherheit auf die Schmerzverarbeitung T1 - The influence of safety on pain perception N2 - Im Rahmen des interdisziplinären Promotionsschwerpunkts Resilienzfaktoren der Schmerzverarbeitung des evangelischen Studienwerks in Zusammenarbeit mit der Julius-Maximilians-Universität Würzburg und der Otto-Friedrich-Universität Bamberg untersuche ich in diesem Promotionsprojekt den Einfluss von Sicherheit auf die Schmerzverarbeitung. Es ist bekannt, dass die Schmerzverarbeitung durch Emotionen moduliert werden kann. Man geht davon aus, dass negative Emotionen den Schmerz in der Regel verstärken, während positive Emotionen zu einer Schmerzreduktion führen. Frühere Studien fanden heraus, dass die Erwartung eines aversiven Ereignisses zu Bedrohung und stärkeren Schmerzen führt. Es stellt sich die Frage, ob das Gegenteil von Bedrohung, nämlich Sicherheit, zu einer Verringerung der Schmerzen führen kann. Um diese Hypothese zu untersuchen, habe ich drei Experimente an gesunden ProbandInnen durchgeführt. N2 - I am investigating the influence of safety on pain processing in the present dissertation project as part of the interdisciplinary doctoral program on resilience factors of pain processing of the Evangelisches Studienwerk in cooperation with the Julius-Maximilians-University of Würzburg and the Otto-Friedrich-University of Bamberg. It is known that pain processing is susceptible to an individual’s emotional state, such that negative emotions mostly increase pain while positive emotions lead to a pain decrease. Previous studies found that the anticipation of an aversive event induces threat and elevated pain. The question arises whether the exact opposite, namely safety, can lead to a reduction in pain. To investigate this hypothesis, I conducted three experiments in healthy volunteers. KW - Sicherheit KW - Schmerzverarbeitung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-359282 ER - TY - THES A1 - Ziegler, Christiane T1 - Epigenetic Mechanisms in the Pathogenesis and Therapy of Anxiety Disorders T1 - Epigenetische Mechanismen in der Pathogenese und Therapie von Angsterkrankungen N2 - Anxiety disorders (AD) are common, disabling mental disorders, which constitute the most prevalent mental health condition conveying a high individual and socioeconomic burden. Social anxiety disorder (SAD), i.e. fear in social situations particularly when subjectively scrutinized by others, is the second most common anxiety disorder with a life time prevalence of 10%. Panic disorder (PD) has a life time prevalence of 2-5% and is characterized by recurrent and abrupt surges of intense fear and anticipatory anxiety, i.e. panic attacks, occurring suddenly and unexpected without an apparent cue. In recent years, psychiatric research increasingly focused on epigenetic mechanisms such as DNA methylation as a possible solution for the problem of the so-called “hidden heritability”, which conceptualizes the fact that the genetic risk variants identified so far only explain a small part of the estimated heritability of mental disorders. In the first part of this thesis, oxytocin receptor (OXTR) gene methylation was investigated regarding its role in the pathogenesis of social anxiety disorder. In summary, OXTR methylation patterns were implicated in different phenotypes of social anxiety disorder on a categorical, neuropsychological, neuroendocrinological as well as on a neural network level. The results point towards a multilevel role of OXTR gene hypomethylation particularly at one CpG site (CpG3, Chr3: 8 809 437) within the protein coding region of the gene in SAD. The second part of the thesis investigated monoamine oxidase A (MAOA) gene methylation regarding its role in the pathogenesis of panic disorder as well as – applying a psychotherapy-epigenetic approach – its dynamic regulation during the course of cognitive behavioural therapy (CBT) in PD patients. First, MAOA hypomethylation was shown to be associated with panic disorder as well as with panic disorder severity. Second, in patients responding to treatment MAOA hypomethylation was shown to be reversible up to the level of methylation in healthy controls after the course of CBT. This increase in MAOA methylation along with successful psychotherapeutic treatment was furthermore shown to be associated with symptom improvement regarding agoraphobic avoidance in an independent replication sample of non-medicated patients with PD. Taken together, in the future the presently identified epigenetic patterns might contribute to establishing targeted preventive interventions and personalized treatment options for social anxiety disorder or panic disorder, respectively. N2 - Angsterkrankungen sind die häufigsten psychischen Erkrankungen, welche in hohem Maße den Alltag der Betroffenen beeinträchtigen und eine große sozioökonomische Belastung darstellen. Eine der häufigsten Formen von Angsterkrankungen bildet die soziale Phobie, d.h. die Angst vor sozialen Situationen, in denen man im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit steht, mit einer Lebenszeit-Prävalenz von circa 10%. Die Panikstörung, charakterisiert durch das wiederholte und unerwartete Auftreten von Panikattacken, ist eine weitere Form der Angsterkrankungen mit einer Lebenszeit-Prävalenz von circa 2-5%. Epigenetische Mechanismen, wie zum Beispiel die DNA Methylierung, rücken in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der psychiatrischen Forschung. Hier werden sie als eine mögliche Lösung für das Problem der „hidden heritability“ (versteckte Heritabilität) angesehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die DNA Methylierung des Oxytozinrezeptorgens (OXTR) hinsichtlich ihrer Rolle in der Pathogenese der sozialen Phobie untersucht. Hierbei konnte eine verringerte Methylierung des Gens, speziell an einem CpG-Dinukleotid (CpG3, Chr3: 8 809 437) innerhalb der protein-kodierenden Genregion, auf verschiedenen Ebenen mit der Erkrankung an sozialer Phobie, dimensionalen Maßen der Erkrankungsschwere sowie der Stressverarbeitung auf neuro-endokrinologischer und neuronaler Ebene in Verbindung gebracht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von DNA Methylierungsmustern des Monoaminooxidase A (MAOA) Gens in der Pathogenese und der Therapie der Panikstörung. Zum einen konnte gezeigt werden, dass eine verringerte MAOA Methylierung mit dem Auftreten von Panikstörung sowie mit einer erhöhten Symptomschwere assoziiert ist. Zum anderen zeigten Patienten, welche auf eine kognitive Verhaltenstherapie (KVT) ansprachen, eine signifikante Erhöhung der MAOA Methylierung nach der Therapie, welche zusätzlich in einer unabhängigen Stichprobe mit einer Verringerung der Symptomschwere assoziiert war. Diese Veränderung zeigte sich jedoch nicht in Patienten, welche nicht auf die KVT ansprachen. Zusammenfassend können beide im Rahmen dieser Arbeit untersuchten epigenetischen Muster und deren Rolle in der Pathogenese der sozialen Phobie sowie der Panikstörung zur Etablierung personalisierter Therapiemöglichkeiten wie auch targetierter präventiver Interventionen beitragen. KW - Angst KW - Psychische Störung KW - DNA-Methylierung KW - Panikstörung KW - Soziale Phobie KW - Angsterkrankungen KW - Epigenetische Mechanismen KW - Epigenetik KW - Methylierung KW - DNS KW - Angsterkrankungen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146815 ER - TY - THES A1 - Ziegenhals, Thomas T1 - The role of the miR-26 family in neurogenesis T1 - Die Rolle der miR-26 Familie in der Neurogenese N2 - For the differentiation of a embryonic stem cells (ESCs) to neuronal cells (NCs) a complex and coordinated gene regulation program is needed. One important control element for neuronal differentiation is the repressor element 1 silencing transcription factor (REST) complex, which represses neuronal gene expression in non-neuronal cells. Crucial effector proteins of the REST complex are small phosphatases such as the CTDSPs (C-terminal domain small phosphatases) that regulate polymerase II activity by dephosphorylating the C-terminal domain of the polymerase, thereby repressing target genes. The stepwise inactivation of REST, including the CTDSPs, leads to the induction of a neuron-specific gene program, which ultimately induces the formation of neurons. The spatio-temporal control of REST and its effector components is therefore a crucial step for neurogenesis. In zebrafish it was shown that the REST-associated CTDSP2 is negatively regulated by the micro RNA (miR) -26b. Interestingly, the miR-26b is encoded in an intron of the primary transcript of CTDSP2. This gives the fundament of an intrinsic regulatory negative feedback loop, which is essential for the proceeding of neurogenesis. This feedback loop is active during neurogenesis, but inactive in non-neuronal cells. The reason for this is that the maturation of the precursor miR (pre-miR) to the mature miR-26 is arrested in non neuronal cells, but not in neurons. As only mature miRs are actively repressing genes, the regulation of miR-26 processing is an essential step in neurogenesis. In this study, the molecular basis of miR-26 processing regulation in the context of neurogenesis was addressed. The mature miR is processed from two larger precursors: First the primary transcript is cleaved by the enzyme DROSHA in the nucleus to form the pre-miR. The pre-miR is exported from the nucleus and processed further through the enzyme DICER to yield the mature miR. The mature miR can regulate gene expression in association with the RNA-induced silencing complex (RISC). Multiple different scenarios in which miR processing was regulated were proposed and experimentally tested. Microinjection studies using Xenopus leavis oocytes showed that slowdown or blockage of the nucleo-cytoplasmic transport are not the reason for delayed pre-miR-26 processing. Moreover, in vitro and in vivo miR-processing assays showed that maturation is most likely regulated through a in trans acting factor, which blocks processing in non neuronal cells. Through RNA affinity chromatographic assays using zebrafish and murine lysates I was able to isolate and identify proteins that interact specifically with pre-miR-26 and could by this influence its biogenesis. Potential candidates are FMRP/FXR1/2, ZNF346 and Eral1, whose functional characterisation in the context of miR-biogenesis could now be addressed. The second part of my thesis was executed in close colaboration with the laboratory of Prof. Albrecht Müller. The principal question was addressed how miR-26 influences neuronal gene expression and which genes are primarily affected. This research question could be addressed by using a cell culture model system, which mimics ex vivo the differentiation of ESCs to NCs via neuronal progenitor. For the functional analysis of miR-26 knock out cell lines were generated by the CRISPR/Cas9 technology. miR-26 deficient ESC keep their pluripotent state and are able to develop NPC, but show major impairment in differentiating to NCs. Through RNA deep sequencing the miR-26 induced transcriptome differences could be analysed. On the level of mRNAs it could be shown, that the expression of neuronal gene is downregulated in miR-26 deficient NCs. Interestingly, the deletion of miR-26 leads to selectively decreased levels of miRs, which on one hand regulate the REST complex and on the other hand are under transcriptional control by REST themself. This data and the discovery that induction of miR-26 leads to enrichment of other REST regulating miRs indicates that miR-26 initiates neurogenesis through stepwise inactivation of the REST complex. N2 - Für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ESCs) zu Neuronen (NCs) bedarf es eines komplexen Genregulationsprogramms, welches sowohl zeitlich als auch räumlich reguliert werden muss. Ein wichtiger Faktor während der neuronalen Differenzierung ist der sogenannte „repressor element 1 silencing transcription factor“ (REST)-Komplex, welcher die Expression neuronaler Gene in nicht neuralen Zellen unterdrückt. Wichtige Effektorproteine im REST-Komplex sind kleine Phosphatasen (sog. CTDSPs), welche durch die Dephosphorylierung der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II deren Aktivität an Zielgenen reprimiert. Die schrittweise Inaktivierung von REST, einschließlich der CTDSPs, führt hingegen zur Einleitung des neuronalen Genprogramms und damit zur Entwicklung von neuronalen Zellen. Die zeitliche Regulierung des REST-Komplexes und seiner assoziierten Effektor-Komponenten ist daher auf molekularer Ebene das entscheidende Ereignis in der Neurogenese. Studien in Zebrafisch haben gezeigt, dass die REST-assoziierte Phosphatase CTDSP2 von der micro-RNA (miR) -26b negativ reguliert wird, was zu einer reduzierten REST Aktivität führt. Interessanterweise liegt diese miR in einem Intron von CTDSP2, also dem Gen, welches sie selbst repremiert. Diese Konstellation stellt die Basis für eine intrinsische negative Rückkopplungsschleife dar und ist essentiell für das Voranschreiten der Neurogenese. Diese Schleife ist aktiv während der Neurogenese, jedoch inaktiv in neuronalen Stammzellen. Der Grund hierfür ist, dass die Reifung der miR-26b auf der Stufe der Prozessierung des miR-Vorläufers (pre-miR) zur reifen miR in Stammzellen, nicht aber in Neuronen, angehalten ist. Da nur reife miR funktionell aktiv sein können, ist die Regulation der miR-26 Reifung ein essentieller Schritt im Rahmen der Neurogenese. In dieser Dissertation sollte der Frage nach der molekularen Basis der regulierten Prozessierung der miR-26 im Rahmen der Neurogenese nachgegangen werden. Die Prozessierung von miR erfolgt über zwei Intermediate: Zunächst wird aus dem primären Transkript im Zellkern die pre-miR durch das Enzym DROSHA gebildet. Diese wird dann aus dem Kern exportiert und durch das Enzym DICER zur reifen miR weiterverarbeitet, die im Kontext des „RNA-Induced Silencing Complex“ (RISC) die post-transkriptionale Genexpression reguliert. Mirkoinjektionsstudien an Xenopus leavis Oocyten zeigten, dass eine Verlangsamung bzw. Blockade des nukleo-zytoplasmatischen Transports nicht Ursache für die verzögerte Prozessierung der pre-miR-26 sein kann. Stattdessen haben in vitro und in vivo Prozessierungsexperimente gezeigt, dass die Reifung der miR-26 sehr wahrscheinlich durch einen in trans agierenden Faktor gesteuert wird, der die Prozessierung in nicht-neuronalen Zellen blockiert. Durch RNA affinitätschromatographische Versuche gelang es, Proteine aus Maus- und Zebrafischlysaten zu isolieren und diese zu identifizieren, die spezifisch mit der pre-miR-26b interagieren und deren Biogenese beeinflussen könnten. Vielversprechende Kandidaten sind die Proteine FMRP/FXR1/2, ZNF346 und Eral1, deren funktionelle Charakterisierung im Kontext der miR-Biogenese nun möglich ist. In einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Albrecht Müller wurde im zweiten Teil der Arbeit der prinzipiellen Frage nachgegangen, wie die miR-26 die neuronale Genexpression steuert und welche Gene hiervon primär betroffen sind. Diese Untersuchungen wurden durch die Etablierung eines Zellkultur-Protokolls ermöglicht, welches ex vivo die Differenzierung von ESC über neuronal Vorläufer Zellen (NPC) zu NCs erlaubte und so eine systematische Analyse dieses Prozess erlaubte. Für die Funktionsanalyse von miR-26 wurden über die CRISPR/Cas9 Technologie Zelllinien hergestellt, welche keine miR-26 mehr im Genom haben. miR-26 defiziente ESCs behalten ihren pluripotenten Status und ließen sich zu NPCs entwickeln. Die Weiterentwicklung von NPCs zu NCs war hingegen massiv eingeschränkt. Durch RNA Hochdurchsatzsequenzierung gelang es die miR-26 induzierten Genexpressionsunterschiede geanu zu identifizieren. Auf der Ebene der mRNA konnte gezeigt werden, dass die Expression von neuronalen Genen in miR-26 defizienten NCs herunterreguliert ist und dass unter diesen Bedingungen offensichtlich kein anderer Differenzierungsweg eingeschlagen werden konnte. Interessanterweise führte die Deletion von miR-26 zu einer selektiven Verminderung von miRs, die einerseits den REST Komplex regulieren, andererseits aber auch unter dessen transkriptionaler Kontrolle stehen. Diese Daten und die Entdeckung, dass die Induktion von miR-26 zur Anreicherung anderer REST regulierender miRs führt, lässt vermuten, dass miR-26 die Neurogenese durch die schrittweise Inaktivierung des REST Komplexe initiiert. KW - miRNS KW - Neurogenese KW - miR-26 KW - REST-Complex KW - miRNA Biogenesis KW - microrna KW - neurogenesis Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156395 ER - TY - THES A1 - Zhu, Mo T1 - Germination and differentiation of \(Blumeria\) \(graminis\) ascospores and effects of UV-C and white light irradiation on \(B.\) \(graminis\) conidial prepenetration T1 - Keimung und Differenzierung von \(Blumeria\) \(graminis\) Ascosporen und Effekte von UV-C und Weißlichtbestrahlung auf die Konidienpräpenetration von \(B.\) \(graminis\) N2 - Blumeria graminis, the obligate biotrophic grass powdery mildew, is a highly pathogenic fungus capable of inflicting foliar diseases and of causing severe yield losses. There is asexual and sexual propagation in the life cycle of B. graminis. In the epidemiological processes of this pathogen, both types of spores - asexual conidia and sexual ascospores – are crucial. Conidia of B. graminis are demonstrated to perceive cuticular very-long-chain aldehydes as molecular signal substances notably promoting germination and differentiation of the infection structure (the appressorium) – the prepenetration processes – in a concentration- and chain-length-dependent manner. Conidial germination and appressorium formation are known to be dramatically impeded by the presence of free water on the host surface. However, sexually formed ascospores are reported to easily germinate immersed in water. There are abundant assays on conidial prepenetration processes. However, with respect to the stimulating effects of very-long-chain aldehydes and to the influence of the presence of free water, ascosporic prepenetration processes are still obscure. In order to study the effects of very-long-chain aldehydes on the ascosporic prepenetration processes of wheat powdery mildew fungus B. graminis f. sp. tritici, Formvar®-based in vitro systems were applied to exclude the secondary host effects (such as host resistance) and to reproducibly provide homogeneous hydrophobic substratum surfaces. By the presence of even-numbered very-long-chain aldehydes (C22 - C30), the appressorium formation of the ascospores was notably triggered in a chain-length dependent manner. N-octacosanal (C28) was the most inducing aldehyde tested. Unlike conidia, ascospores could easily differentiate immersed in water and showed a more variable differentiation pattern even with a single germ tube differentiating an appressorium. To evaluate the alternative management against barley powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei, the suppressing effects of UV-C irradiation on the developmental processes of conidia on artificial surfaces (in vitro) and on host leaf surfaces (in vivo) were assayed. In vitro and in vivo, a single dose of 100 J m-2 UV-C was adequate to decrease conidial germination to < 20 % and to reduce appressorium formation to values < 5 %. UV-C irradiation negatively affected colony pustule size and vegetative propagation. Under photoperiodic conditions of 2h light/16h dark, 6h dark/12h light or 6h dark/18h light, UV-C-treated conidia showed photoreactivation (photo-recovery). White light-mediated photoreactivation was most effective immediately after UV-C irradiation, suggesting that a prolonged phase of darkness after UV-C application increased the efficacy of management against B. graminis. UV-C irradiation increased transcript levels of three putative photolyase genes in B. graminis, indicating those were probably involved in photoreactivation processes. However, mere white light or blue light (wavelength peak, 475 nm) could not induce the up-regulation of these genes. To determine whether visible light directly impacted the prepenetration and penetration processes of this powdery mildew pathogen, conidia of Blumeria graminis f. sp. hordei and Blumeria graminis f. sp. tritici were inoculated onto artificial surfaces and on host leaf surfaces. Samples were analyzed after incubation periods under light conditions (white light intensity and spectral quality). Increasing white light intensities directly impaired conidial prepenetration processes in vitro but not in vivo. Applying an agar layer under the wax membrane compensated for conidial water loss as a consequence of high white light irradiation. Light stimulated in vitro and in vivo the appressorium elongation of B. graminis in a wavelength-dependent manner. Red light was more effective to trigger the elongation of appressorium than blue light or green light assayed. Taken together, the findings of this study demonstrate that 1) a host surface recognition principle based on cuticular very-long-chain aldehydes is a common feature of B. graminis f. sp. tritici ascospores and conidia; 2) the transcriptional changes of three putative photolyase genes in B. graminis are mediated in a UV-C-dependent manner; 3) light directly affected the (pre)penetration processes of B. graminis. N2 - Blumeria graminis, der obligate biotrophe Grasmehltau, ist ein hochpathogener Pilz, der in der Lage ist, Blätter zu schädigen und in Getreidekulturen schwere Ertragsverluste zu verursachen. Im Lebenszyklus von B. graminis kommen sowohl sexuelle als auch asexuelle Reproduktion vor. In den epidemiologischen Prozessen dieses Erregers sind beide Arten von Sporen - asexuelle Konidien und sexuelle Ascosporen - von entscheidender Bedeutung. Conidien von B. graminis reagieren nachweislich auf kutikuläre, sehr langkettige Aldehyde als molekulare Signalstoffe, die insbesondere die Keimung und Differenzierung der Infektionsstruktur (das Appressorium) - die Präpenetrationsprozesse - konzentrations- und kettenlängenabhängig fördern. Es ist bekannt, dass die Konidienkeimung und Appressoriumbildung durch die Anwesenheit von freiem Wasser auf der Wirtsoberfläche dramatisch behindert wird, während sexuell gebildete Ascosporen unter diesen Bedingungen keimen. Es gibt zahlreiche Untersuchungen zu Konidien-Präpenetrationsprozessen. Im Hinblick auf die stimulierende Wirkung von langkettigen Aldehyden und den Einfluss von freiem Wasser sind die askosporischen Präpenetrationsprozesse jedoch noch unklar. Um die Effekte langkettiger Aldehydmoleküle auf die ascosporischen Präpenetrationsprozesse von Weizenmehltaupilz zu untersuchen, wurde B. graminis f. sp. tritici auf Formvar®-basierten In-vitro-Systemen angewendet. Dadurch konnten sekundäre Wirtseffekte (wie Wirtsresistenz) ausgeschlossen und homogene hydrophobe Substratoberflächen reproduzierbar bereitgestellt werden. Die Anwesenheit geradzahliger sehr langkettiger Aldehyde (C22 – C30) erhöhte deutlich die Ausbilung des Appressoriums von Ascosporen. Von den getesteten Aldehyden zeigte n-Octacosanal (C28) die größte Induktionskraft. Im Gegensatz zu Konidien konnten bei Ascosporen auch unteri Anwesenheit von freiem Wasser variable Differenzierungsmuster festgestellt werden, bei denen auch einzelne Keimröhren zur Differenzierung des Appressoriums führten. Zur Bewertung der alternativen Bekämpfung gegen Gerstenmehltaupilz Blumeria graminis f. sp. hordei wurde die Unterdrückungswirkung von UV-C-Strahlung auf die Entwicklungsprozesse von Konidien auf künstlichen Oberflächen (in vitro) und auf Wirtsblattoberflächen (in vivo) untersucht. In vitro und in vivo war eine Einzeldosis von 100 J m-2 UV-C ausreichend, um die Konidienkeimung auf < 20 % zu verringern und die Appressoriumsbildung auf Werte < 5 % zu reduzieren. Die UV-C-Bestrahlung beeinflusste die Größe der Kolonepusteln und die vegetative Vermehrung negativ. UV-C behandelte Konidien wurden unterschiedlichen Lichtverhältnissen ausgesetzt: 2 h hell / 16 h dunkel, 6 h dunkel / 12 h hell und 6 h dunkel / 18 h hell. Dabei zeigten sie unterschiedliche Photoreaktivierungsaktivitäten. Die Weißlicht-vermittelte Photoreaktivierung war unmittelbar nach der UV-C-Behandlung am effektivsten, was darauf hindeutet, dass eine verlängerte Phase der Dunkelheit nach der UV-C-Anwendung die Wirksamkeit des Managements gegen B. graminis erhöhte. UV-C-Bestrahlung erhöhte die Transkriptmengen von drei mutmaßlichen Photolyase-Genen in B. graminis, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich an Photoreaktivierungsprozessen beteiligt waren. Weißes oder blaues Licht (Wellenlängen-Peak, 475 nm) konnte die Hochregulation dieser Gene nicht induzieren. Um zu bestimmen, ob sichtbares Licht direkt auf die Präpenetrations- und Penetrationsvorgänge dieses Mehltau-Erregers einwirkt, wurden Konidien von Blumeria graminis f. sp. hordei und Blumeria graminis f. sp. tritici auf künstliche Oberflächen und auf Wirtsblattoberflächen inokuliert. Die Proben wurden nach Inkubationunter verschiedenen Lichtbedingungen (Weißlichtintensität und Spektralqualität) analysiert. Das Auftragen einer Agarschicht unter der Wachsmembran kompensierte den Wasserverlust der Konidien als Folge der Bestrahlung mit hoher Lichtintensität. Zunehmende Weißlichtintensitäten beeinträchtigten Konidienpräpenetrationsprozesse direkt in vitro, aber nicht in vivo. Eine wellenlängenabhängige Stimulation der Verlängerung des Appressoriums konnte sowohl in vitro als auch in vivo beobachtet werden. Dabei war rotes Licht wirksamer, um die Verlängerung des Appressoriums auszulösen, als blaues oder grünes Licht. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass 1) ein Prinzip der Wirtsoberflächenerkennung basierend auf kutikulären, sehr langkettigen Aldehyden ein gemeinsames Merkmal von B. graminis f sp. tritici Ascosporen und Konidien ist; 2) die Transkriptionsänderungen von drei putativen Photolyase-Genen in B. graminis in einer UV-C-abhängigen Weise vermittelt werden und 3) Licht direkt die (Vor-) Penetrationsvorgänge von B. graminis beeinflusste. KW - Powdery mildew fungus KW - Germination and differentiation KW - Cuticle KW - Irradiation KW - Blumeria graminis KW - Bestrahlung Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166470 ER - TY - THES A1 - Zheng, Peilin T1 - Ptpn22 silencing in the NOD model of type 1 diabetes indicates the human susceptibility allele of PTPN22 is a gain-of-function variant T1 - Ptpn22 knockdown im NOD Modell für Diabetes Typ 1 belegt einen Aktivitätsgewinn der humanen Krankheitsvariante N2 - PTPN22 encodes the lymphoid tyrosine phosphatase Lyp that can dephosphorylate Lck, ZAP-70 and Fyn to attenuate TCR signaling. A single-nucleotide polymorphism (C1858T) causes a substitution from arginine (R) to tryptophan (W) at 620 residue (R620W). Lyp-620W has been confirmed as a susceptible allele in multiple autoimmune diseases, including type 1 diabetes (T1D). Several independent studies proposed that the disease-associated allele is a gain-of-function variant. However, a recent report found that in human cells and a knockin mouse containing the R620W homolog that Ptpn22 protein degradation is accelerated, indicating Lyp-620W is a loss-of-function variant. Whether Lyp R620W is a gain- or loss-of-function variant remains controversial. To resolve this issue, we generated two lines (P2 and P4) of nonobese diabetic (NOD) mice in which Ptpn22 can be inducibly silenced by RNAi. We found long term silencing of Ptpn22 increased spleen cellularity and regulatory T (Treg) cell numbers, replicating the effect of gene deletion reported in the knockout (KO) B6 mice. Notably, Ptpn22 silencing also increased the reactivity and apoptotic behavior of B lymphocytes, which is consistent with the reduced reactivity and apoptosis of human B cells carrying the alleged gain-of-function PTPN22 allele. Furthermore, loss of Ptpn22 protected P2 KD mice from spontaneous and Cyclophosphamide (CY) induced diabetes. Our data support the notion that Lyp-620W is a gain-of-function variant. Moreover, Lyp may be a valuable target for the treatment of autoimmune diseases. N2 - PTPN22 kodiert die lymphoid tyrosine phosphatase Lyp, die Lck, ZAP-70 und Fyn dephosphorilieren kann, um T Zell Rezeptor Signale zu vermindern. Ein Polymorphismus (C1858T) verursacht einen Aminosäurenaustausch auf Position 620 von Arginin zu Tryptophan (R620W). Lyp-620W erhöht das Risiko einer Vielfalt von Autoimmunerkrankungen, darunter auch Diabetes Typ 1 (T1D). Mehrere Studien haben belegt, dass dieses Krankheitsallel die Funktion von Lyp verstärkt. Eine neuere Studie hat andererseits gezeigt, dass die R620W Variante schneller degradiert wird, was bedeuten würde, dass das C1858T Allel einen Funktionsverlust verursachen könnte. Ob Lyp R620W die Funktion dieser Phosphatase erhöht oder mindert bleibt demnach bis jetzt ungewiss. Um diese Frage zu klären haben wir zwei transgene Mauslinien (P2 und P4) im diabetischen Hintergrund der NOD Maus generiert, in denen Ptpn22 auf induzierbare Weise durch RNAi gehemmt werden kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die langfristige Hemmung von Ptpn22 zu einer Zunahme der Milzzellularität und der Anzahl regulatorischer T Zellen führt, was dem Phänotyp des Ptpn22 knockout im B6 Hintergrund entspricht. Bemerkenswert ist, dass die Hemmung von Ptpn22 auch zu einer Zunahme der Reaktivität und des apoptotischen Verhaltens von B Lymphozyten führt, also dem entgegengesetzten Phänotypen, der in menschlichen B Zellen beobachtet wurde, die das Krankheitsallel exprimierten. Zusätzlich konnte die Ptpn22 Inhibierung NOD Mäuse vor spontanem und Cyclophosphamid-induziertem Diabetes schützen. Unsere Daten unterstützen also die Hypothese, dass Lyp-620W eine stärkere Aktivität vorweist. Dies würde auch bedeuten, dass Ptpn22 möglicherweise zu therapeutischen Zwecken inhibiert werden könnte, um Autoimmunerkrankungen zu bekämpfen. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - Genexpression KW - Ptpn22 KW - Diabetes Typ 1 KW - Type 1 diabetes KW - PTPN22 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73869 ER - TY - THES A1 - Zhang, Tengyu T1 - Development of Modified polylysine based antibody conjugated nanoparticles with tumor-restricted, FcγR-independent stimulatory activity by targeting Fn14 T1 - Entwicklung modifizierter, mit Antikörpern konjugierter Nanopartikel auf Polylysinbasis mit tumorbeschränkter, FcγR- unabhängiger stimulierender Aktivität durch Ausrichtung auf Fn14 N2 - In this study, we developed an innovative nanoparticle formulation to facilitate the delivery of antitumor antibodies to tumor sites. The study commenced with the utilization of 13 bispecific antibody fusion proteins, which targeted the Fn14 receptor, thereby validating the pivotal role of crosslinking in Fn14 receptor activation. Subsequently, gold nanoparticles were activated using COOH-PEG-SH in combination with EDC/NHS, and subsequently conjugated with two Fn14-targeting antibodies, PDL192 and 5B6. Following this, a pH-sensitive shell was generated on the outer layer of the antibody-coupled gold nanoparticles through the application of chemically modified polylysine. The resultant complexes, termed MPL-antibody-AuNP, demonstrated a release profile reminiscent of the tumor microenvironment (TME). Notably, these complexes released antibody-AuNPs only in slightly acidic conditions while remaining intact in neutral or basic environments. Functionality analysis further affirmed the pH-sensitive property of MPL-antibody-AuNPs, demonstrating that the antibodies only initiated potent Fn14 activation in slightly acidic environments. This formulation holds potential for applicability to antibodies or ligands targeting the 80 TNFRSF family, given that gold nanoparticles successfully served as platforms for antibody crosslinking, thereby transforming these antibodies into potent agonists. Moreover, the TME disintegration profile of MPL mitigates the potential cytotoxic effects of antibodies, thereby circumventing associated adverse side effects. This study not only showcases the potential of nanoparticle formulations in targeted therapy, but also provides a solid foundation for further investigations on their clinical application in the context of targeting category II TNFRSF receptors with antibodies or ligands. N2 - In dieser Studie haben wir eine innovative Nanopartikel-Formulierung entwickelt, um die Auslieferung von Antitumor-Antikörpern an Tumorstellen zu erleichtern. Die Studie begann mit der Verwendung von 13 bispezifischen Antikörper-Fusionsproteinen, die auf den Fn14-Rezeptor abzielten, wodurch die entscheidende Rolle der Quervernetzung bei der Aktivierung des Fn14-Rezeptors bestätigt wurde. Anschließend wurden Goldnanopartikel unter Verwendung von COOH-PEG-SH in Kombination mit EDC/NHS aktiviert und danach mit zwei auf Fn14 abzielenden Antikörpern, PDL192 und 5B6, konjugiert. Daraufhin wurde eine pH-sensitive Schale auf der äußeren Schicht der mit Antikörpern gekoppelten Goldnanopartikel durch den Einsatz von chemisch modifiziertem Polylysin erzeugt. Die resultierenden Komplexe, bezeichnet als MPL-Antikörper-AuNP, zeigten ein Freisetzungsprofil, das an das Tumormikroumfeld (TME) erinnert. Bemerkenswert ist, dass diese Komplexe Antikörper-AuNP nur in leicht sauren Bedingungen freisetzten, während sie in neutralen oder basischen Umgebungen intakt blieben. Die Funktionalitätsanalyse bestätigte weiterhin die pH-empfindliche Eigenschaft der MPL-Antikörper-AuNPs, was zeigt, dass die Antikörper eine potente Fn14-Aktivierung nur in leicht sauren Bedingungen initiierten. Diese Formulierung hat Potenzial für die Anwendbarkeit auf Antikörper oder Liganden, die auf die Familie der TNFRSF abzielen, da die Goldnanopartikel erfolgreich als Plattformen für die Antikörpervernetzung dienten und diese Antikörper in potente Agonisten verwandelten. Darüber hinaus mildert das TME-Zerfallsprofil von MPL die potenziellen zytotoxischen Effekte der Antikörper, wodurch die damit verbundenen negativen Nebenwirkungen umgangen werden. Diese Studie zeigt nicht nur das Potenzial von Nanopartikel-Formulierungen in der gezielten Therapie auf, sondern bietet auch eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen zu ihrer klinischen Anwendung im Kontext der Zielrichtung auf Kategorie-II-TNFRSF-Rezeptoren mit Antikörpern oder Liganden. KW - Immuntherapie KW - Immunotherapy Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358650 ER - TY - THES A1 - Zhang, Guoliang T1 - Phytochemical Research on Two Ancistrocladus Species, Semi-Synthesis of Dimeric Naphthylisoquinoline Alkaloids, and Structure Optimization of Antitumoral Naphthoquinones T1 - Phytochemische Untersuchungen an zwei Ancistrocladus-Arten, Semi-Synthese dimerer Naphthylisochinolin-Alkaloide und Strukturoptimierung von antitumoralen Naphthochinonen N2 - Plant-derived natural products and their analogs continue to play an important role in the discovery of new drugs for the treatment of human diseases. Potentially promising representatives of secondary metabolites are the naphthylisoquinoline alkaloids, which show a broad range of activities against protozoan pathogens, such as plasmodia, leishmania, and trypanosoma. Due to the increasing resistance of those pathogens against current therapies, highly potent novel agents are still urgently needed. Thus, it is worthy to discover new naphthylisoquinoline alkaloids hopefully with pronounced bioactivities by isolation from plants or by synthesis. The naphthylisoquinoline alkaloids are biosynthetically related to another class of plant-derived products, the naphthoquinones, some of which have been recently found to display excellent anti-multiple myeloma activities without showing any cytotoxicities on normal blood cells. Multiple myeloma still remains incurable, although remissions may be induced with co-opted therapeutic treatments. Therefore, more potent naphthoquinones are urgently required, and can be obtained by isolation from plants or by synthesis. In detail, the results in this thesis are listed as follows: 1) Isolation and characterization of naphthylisoquinoline alkaloids from the stems of a Chinese Ancistrocladus tectorius species. Nine new naphthylisoquinoline alkaloids, named ancistectorine A1 (60), N-methylancistectorine A1 (61), ancistectorine A2 (62a), 5-epi-ancistectorine A2 (62b), 4'-O-demethylancistectorine A2 (63), ancistectorine A3 (64), ancistectorine B1 (65), ancistectorine C1 (66), and 5-epi-ancistrolikokine D (67) were isolated from the Chinese A. tectorius and fully characterized by chemical, spectroscopic, and chiroptical methods. Furthermore, the in vitro anti-infectious activities of 60-62 and 63-66 have been tested. Three of the metabolites, 61, 62a, and 62b, exhibited strong antiplasmodial activities against the strain K1 of P. falciparum without showing significant cytotoxicities. With IC50 values of 0.08, 0.07, and 0.03 μM, respectively, they were 37 times more active than the standard chloroquine (IC50 = 0.26 μM). Moreover, these three compounds displayed high antiplasmodial selectivity indexes ranging from 100 to 3300. According to the TDR/WHO guidelines, they could be considered as lead compounds. In addition, seven alkaloids, 69-74 (structures not shown here), were isolated from A. tectorius that were known, but new to the plant, together with another fourteen known compounds (of these, only the structures of the three main alkaloids, 5a, 5b, and 78 are shown here), which had been previously found in the plant. The three metabolites ancistrocladine (5a), hamatine (5b), and (+)-ancistrocline (78) were found to show no or moderate activities against the MM cell lines. 2) Isolation and characterization of naphthylisoquinoline alkaloids from the root bark of a new, botanically yet undescribed Congolese Ancistrocladus species. An unprecedented dimeric Dioncophyllaceae-type naphthylisoquinoline alkaloid, jozimine A2 (84), as first recognized by G. Bauckmann from an as yet undescribed Ancistrocladus species, was purified and characterized as part of this thesis. Its full structural assignment was achieved by spectroscopic and chiroptical methods, and further confirmed by an X-ray diffraction analysis, which had never succeeded for any other dimeric naphthylisoquinoline alkaloids before. Structurally, the dimer is composed of two identical 4'-O-demethyldioncophylline A halves, coupled through a sterically hindered central axis at C-3',3'' of the two naphthalene moieties. Pharmacologically, jozimine A2 (84) showed an extraordinary antiplasmodial activity (IC50 = 1.4 nM) against the strain NF54 of P. falciparum. Beside jozimine A2 (85), another new alkaloid, 6-O-demethylancistrobrevine C (84), and four known ones, ancistrocladine (5a), hamatine (5b), ancistrobrevine C (86), and dioncophylline A (6) were isolated from the Ancistrocladus species, the latter in a large quantity (~500 mg), showing that the plant produces Ancistrocladaceae-type, mixed-Ancistrocladaceae/Dioncophyllaceae-type, and Dioncophyllaceae-type naphthyl- isoquinoline alkaloids. Remarkably, it is one of the very few plants, like A. abbreviatus, and A. barteri, that simultaneously contain typical representatives of all the above three classes of alkaloids. 3) Semi-synthesis of jozimine A2 (85), 3'-epi-85, jozimine A3 (93) and other alkaloids from dioncophylline A (6). The dimeric naphthylisoquinoline alkaloids, jozimine A2 (85) and 3'-epi-85, constitute rewarding synthetic targets for a comparative analysis of their antiplasmodial activities and for a further confirmation of the assigned absolute configurations of the isolated natural product of 85. They were semi-synthesized in a four-step reaction sequence from dioncophylline A (6) in cooperation with T. Büttner. The key step was a biomimetic phenol-oxidative dimerization at C-3' of the N,O-dibenzylated derivative of 89 by utilizing Pb(OAc)4. This is the first time that the synthesis of such an extremely sterically hindered (four ortho-substituents) naphthylisoquinoline alkaloid – with three consecutive biaryl axes! – has been successfully achieved. A novel dimeric naphthylisoquinoline, jozimine A3 (93), bearing a 6',6''-central biaryl axis, was semi-synthesized from 5'-O-demethyldioncophylline A (90) by a similar biomimetic phenol-oxidative coupling reaction as a key step, by employing Ag2O. HPLC analysis with synthetic reference material of 3'-epi-85 and 93 for co-elution revealed that these two alkaloids clearly are not present in the crude extract of the Ancistrocladus species from which jozimine A2 (85) was isolated. This evidences that jozimine A2 (85) is very specifically biosynthesized by the plant with a high regio- and stereoslectivity. Remarkably, the two synthetic novel dimeric naphthylisoquinoline alkaloids 3'-epi-85 and 93 were found to display very good antiplasmodial activities, albeit weaker than that of the natural and semi-synthetic product 85. Additionally, the two compounds 3'-epi-85 and 93 possessed high or moderate selectivity indexes, which were much lower than that of 85. However, they can still be considered as new lead structures. Two unprecedented oxidative products of dioncophylline A, the diastereomeric dioncotetralones A (94a) and B (94b), were synthesized from dioncophylline A (6) in a one-step reaction. Remarkably, the aromatic properties in the “naphthalene” and the “isoquinoline” rings of 94a and 94b are partially lost and the “biaryl” axis has become a C,C-double bond, so that the two halves are nearly co-planar to each other, which has never been found among any natural or synthetic naphthylisoquinoline alkaloid. Their full structural characterization was accomplished by spectroscopic methods and quantum-chemical CD calculations (done by Y. Hemberger). The presumed reaction mechanism was proposed in this thesis. In addition, one of the two compounds, 94a, exhibited a highly antiplasmodial activity (IC50 = 0.09 μM) with low cytotoxicity, and thus, can be considered as a new promising lead structure. Its 2'-epi-isomer, 94b, was inactive, evidencing a significant effect of chirality on the bioactivity. Of a number of naphthylisoquinoline alkaloids tested against the multiple-myeloma cell lines, the three compounds, dioncophylline A (6), 4'-O-demethyldioncophylline A (89), and 5'-O-demethyldioncophylline A (90) showed excellent activities, even much stronger than dioncoquinones B (10), C (102), the epoxide 175, or the standard drug melphalan. 4) Isolation and characterization of bioactive naphthoquinones from cell cultures of Triphyophyllum peltatum. Three new naphthoquinones, dioncoquinones C (102), D (103), and E (104), the known 8-hydroxydroserone (105), which is new to this plant, and one new naphthol dimer, triphoquinol A (107), were isolated from cell cultures of T. peltatum in cooperation with A. Irmer. Dioncoquinone C (102) showed an excellent activity against the MM cells, very similar to that of the previously found dioncoquinone B (10), without showing any inhibitory effect on normal cells. The other three naphthoquinones, 103105, were inactive or only weakly active. 5) Establishment of a new strategy for a synthetic access to dioncoquinones B (10) and C (102) on a large scale for in vivo experiments and for the synthesis of their analogs for first SAR studies. Before the synthesis of dioncoquinone B (10) described in this thesis, two synthetic pathways had previously been established in our group. The third approach described here involved the preparation of the joint synthetic intermediate 42 with the previous two routes. The tertiary benzamide 135 was ortho-deprotonated by using s-BuLi/TMEDA, followed by transmetallation with MgBr2▪2Et2O, and reaction with 2-methylallyl bromide (139). It resulted in the formation of ortho-allyl benzamide 140, which was cyclized by using methyl lithium to afford the naphthol 42. This strategy proved to be the best among the established three approaches with regard to its very low number of steps and high yields. By starting with 136, this third strategy yielded the related bioactive natural product, dioncoquinone C (102), which was accessed by total synthesis for the first time. To identify the pharmacophore of the antitumoral naphthoquinones, a library of dioncoquinone B (10) and C (102) analogs were synthesized for in vitro testing. Among the numerous naphthoquinones tested, the synthetic 7-O-demethyldioncoquinone C (or 7-O-hydroxyldioncoquinone B) (145), constitutes another promising basic structure to develop a new anti-MM agent. Furthermore, preliminary SAR results evidence that the three hydroxy functions at C-3, C-5, and C-6 are essential for the biological properties as exemplarily shown through the compounds 10, 102, and 145. All other mixed OH/OMe- or completely OMe-substituted structures were entirely inactive. By a serendipity the expoxide 175 was found to display the best anti-MM activity of all the tested isolated metabolites from T. peltatum, the synthesized naphthoquinones, and their synthetic intermediates. Toxic effects of 175 on normal cells were not observed, in contrast to the high toxicities of all other epoxides. Thus, the anti-MM activity of 175 is of high selectivity. The preliminary SAR studies revealed that the 6-OMe group in 175 is required, thus differed with the above described naphthoquinones (where 6-OH is a requisite in 10, 102, and 145), which evidenced potentially different modes of action for these two classes of compounds. 6) The first attempted total synthesis of the new naturally occurring triphoquinone (187a), which was recently isolated from the root cultures of T. peltatum in our group. A novel naphthoquinone-naphthalene dimer, 187a (structure shown in Chapter 10), was isolated in small quantities from the root cultures of T. peltatum. Thus, its total synthesis was attempted for obtaining sufficient amounts for selected biotestings. The key step was planned to prepare the extremely sterically hindered (four ortho-substituents) binaphthalene 188 by a coupling reaction between the two 2-methylnaphthalene derivatives. Test reactions involving a system of two simplified 2-methylnaphthylboron species and 2-methylnaphthyl bromide proved the Buchwald ligand as most promising. The optimized conditions were then applied to the two true - highly oxygenated - coupling substrates, between the 2-methylnaphthylboron derivatives 210, 211, 213, or 214 and the 2-methylnaphthyl iodides (or bromides) 215 (206), 215 (206), 212 (205), or 212 (205), respectively. Unfortunately, this crucial step failed although various bases and solvent systems were tested. This could be due to the high electron density of the two coupling substrates, both bearing strongly OMOM/OMe-donating function groups. Therefore, a more powerful catalyst system or an alternative synthetic strategy must be explored for the total synthesis of 187a. 7) Phytochemical investigation of the Streptomyces strain RV-15 derived from a marine sponge. Cyclodysidins A-D (216-219), four new cyclic lipopeptides with a- and ß-amino acids, were isolated from the Streptomyces strain RV15 derived from a marine sponge by Dr. U. Abdelmohsen. Their structures were established as cyclo-(ß-AFA-Ser-Gln-Asn-Tyr-Asn-Ser-Thr) by spectroscopic analysis using 2D NMR techniques and CID-MS/MS in the course of this thesis. In conclusion, the present work contributes to the discovery of novel antiplasmodial naphthylisoquinoline alkaloids and antitumoral naphthoquinones, which will pave the way for future studies on these two classes of compounds. N2 - Naturstoffe pflanzlichen Ursprungs und deren Derivate waren seit jeher eine wichtige Quelle für die Entdeckung neuer Arzneistoffe. Darunter stellen die Naphthylisochinolin-Alkaloide eine besonders bedeutsame Klasse an Sekundärmetaboliten dar, die gegen eine breite Vielfalt an pathogenen Protozoen, wie z.B. Plasmodien, Leishmanien und Trypanosomen, aktiv sind. Die zunehmende Resistenz dieser Krankheitserreger gegen vorhandene Therapeutika macht die Erschließung neuer hochwirksamer Substanzen – durch direkte Isolierung aus Pflanzenmaterial oder chemische Synthese – zu einer lohnenswerten Aufgabe. Kürzlich wurde entdeckt, dass Naphthochinone, eine biosynthetisch eng mit den Naphthylisochinolin-Alkaloiden verwandte Naturstoffklasse, exzellente Aktivitäten gegen das Multiple Myelom aufweist. Diese Krebserkrankung ist mit gegenwärtigen Arzneimitteln nicht heilbar, wenngleich unterstützende Therapeutika zu einer Remission führen können. Die Suche nach pharmakologisch wirksamen Naphthochinonen, mittels Isolierung aus Pflanzen oder durch chemische Synthese, ist daher dringend geboten. Die Ergebnisse dieser Arbeit umfassen im Detail die folgenden Teilbereiche: 1) Isolierung diverser Naphthylisochinolin-Alkaloide aus dem Stamm der chinesischen Ancistrocladus tectorius Spezies. Es Wurch neun neue Naphthylisochinlin-Alkaloide aus der in China beheimateten Pflanze A. tectorius. Diese umfassten die sechs 5,1'-gekuppelten Verbindungen Ancistectorin A1 (60), N-Methylancistectorin A1 (61), Ancistectorin A2 (62a), 5-epi-Ancistectorin A2 (62b), 4'-O-Demethylancistectorin A2 (63), Ancistectorin A3 (64), das 7,1'-gekuppelte Ancistectorin B1 (65), das 7,8'-verknüpfte Ancistectorin C1 (66), sowie das 5,8'-verknüpfte 5-epi-Ancistrolikokin D (65) die allesamt vollständig charakterisiert und auf ihre antiplasmodiale Aktivität untersucht wurden. Drei dieser Metabolite, 61, 62a, und 62b, zeigten eine starke antiplasmodiale Aktivität gegen den Stamm K1 von P. falciparum und dennoch keine signifikante Cytotoxizität. Mit IC50-Werten von 0.08, 0.07 und 0.03 μM waren sie 37 mal aktiver als der Standard Chloroquin (IC50 = 0.26 μM). Darüber hinaus verfügten diese drei Verbindungen über einen hohen antiplasmodialen Index von 100 bis 300. Laut WHO-Richtlinien können diese erfolgversprechenden Antimalaria-Wirkstoffe als neue Leitstrukturen angesehen werden. Des Weiteren wurden sieben bekannte Alkaloide, 69-74 (nicht abgebildet), erstmals aus A. tectorius isoliert. 14 weitere, aus dieser Pflanze bereits bekannte, Verbindungen (z.B. 5a, 5b, und 78) wurden ebenfalls gefunden. Die drei Hauptalkaloide Ancistrocladin (5a), Hamatin (5b) und (+)-Ancistroclin (78) hatten jedoch keine bzw. nur mäßige Aktivitäten gegen MM-Zelllinien. 2) Isolierung der Naphthylisochinolin-Alkaloide aus der Stammrinde einer neuen und botanisch noch unbeschriebenen, kongolesichen Ancistrocladus Spezies. Ein beispielloses dimeres Naphthylisochinolin-Alkaloid aus der Klasse der Dioncophyllaceae, Jozimin A2 (85), wurde aus einer bis dahin noch nicht beschriebenen Ancistrocladus Spezies in Zusammenarbeit mit G. Bauckmann isoliert. Mithilfe von spektroskopischen und chiroptischen Methoden erfolgte die vollständige Strukturaufklärung. Zum ersten Mal bei einem dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloid wurde darüber hinaus dessen Struktur mittels Röntgenstrukturanalyse verifiziert. Die Struktur weist zwei identische miteinander verknüpfte 4'-O-Demethyldioncophyllin A Hälften auf, die in den Naphthalin-Einheiten an C-3' und C-3'' sterisch so stark gehindert sind, dass eine dritte rotationsstabile – und daher chirale – Achse vorliegt. Jozimin A2 (85) ragt pharmakologisch betrachtet durch die beste bis dahin gemessene antiplasmodiale Aktivität (IC50 = 1.4 nM, P. falciparum NF54) aller natürlichen monomeren und dimeren Naphthylisochinoline heraus. Neben Jozimin A2 (85) wurde ein weiteres neues Alkaloid, 6-O-Demethylancistrobrevin C (84), und die vier bekannten Monomere Ancistrocladin (5a), Hamatin (5b), Dioncophyllin A (6), und Ancistrobrevin C (86) aus dieser Ancistrocladus Spezies isoliert. Man konnte zeigen, dass die Pflanze Naphthylisochinolin-Alkaloide vom Ancistrocladaceae Typ, vom gemischten Ancistrocladaceae/Dioncophyllaceae Typ und vom Dioncophyllaceae Typ produziert. Dies ist umso bemerkenswerter, als dass nur wenige Pflanzen wie A. abbreviatus und A. barteri bekannt sind, die typische Vertreter aller drei Alkaloid-Klassen beinhalten. 3) Semi-Synthese des dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloids Jozimine A2 (85) und seiner Derivate. Aufgrund seiner exzellenten antiplasmodialen Aktivität stellte das Naphthylisochinolin-Alkaloid Jozimin A2 (85), eine lohneswerte Zielstruktur für eine Synthese dar. Die Verbindung wurde durch Semisynthese in vier Stufen aus Dioncophyllin A (6) in Zusammenarbeit mit T. Büttner erschlossen. Als Schlüsselschritt erwies sich die biomimetische, oxidative Kupplung von 89 an C-3’ unter Verwendung von Pb(OAc)4. Der Aufbau einer solch sterisch gehinderten, zentralen Achse mit vier ortho-Substituenten wurde zum ersten Mal an Naphthylisochinolin-Alkaloiden erfolgreich durchgeführt. Zusammen mit Jozimin A2 (85) erhielt man sein 3',3''-Atropisomer 3'-epi-85. Parallel dazu wurde Jozimine A3 (93) dargestellt, dessen 6',6''-Zentral-Achse ebenfalls ausgehend von Dioncophyllin A (6) in einer Schlüsselsequenz mittels Ag2O aufgebaut wurde. HPLC-Coelutionsexperimente der synthetisch erhaltenen Verbindungen 3'-epi-85 und 93 zeigten zweifelsfrei, dass die beiden Alkaloide nicht im Rohextrakt der bisher unbestimmten Ancistrocladus-Art, aus welcher Jozimin A2 (85) isoliert wurde, vorhanden waren. Die Biosynthese von 85 erfolgt in der Pflanze offensichtlich mit hoher Spezifität. Die neuen synthetisch hergestellten, dimeren Naphthylisochinolin-Alkaloide 3'-epi-85 und 93 zeigten sehr gute, wenn auch im Vergleich zum natürlichen und semi-synthetisch erhaltenen 85 schwächere, antiplasmodiale Aktivitäten. Desweiteren besitzen die beiden Verbindungen 3'-epi-85 und 93 hohe bzw. moderate Selektivitäts-Indices, welche allerdings weit unter dem Wert von 85 liegen. Nichtsdestotrotz können sie als neue Leitstrukturen betrachtet werden. Im Verlauf der Synthese von Jozimin A2-Derivaten wurden des weiteren die zwei unbekannten Diastereoisomere, Dioncophynon A (94a) and B (94b), synthetisiert. Man erhielt diese in einer Stufe aus Dioncophyllin A (6). Die Strukturen von 94a und 94b zeichneten sich durch einen partiellen Verlust der Aromatizität am Naphthalin-Ring und eine C,C-Doppelbindung an der früheren Biarylachse aus. Die gefundenen Strukturmotive waren bis dahin weder von natürlichen noch von synthetischen Naphthylisochinolinen bekannt. Die vollständige Charakterisierung gelang durch spektroskopische Methoden und quantenchemische CD-Berechnungen (Y. Hemberger). Ein möglicher Mechanismus zur Bildung dieser Moleküle wurde ebenfalls in dieser Arbeit vorgestellt. Darüber hinaus zeigte eine dieser Verbindungen, 94a, eine hohe antiplasmodiale Aktivität (IC50 = 0.09 μM) bei gleichzeitig nur geringer Toxizität und konnte daher als vielversprechende Leitstruktur betrachtet werden. Dagegen war 94b inaktiv, was den signifikanten Effekt stereogener Elemente auf die Bioaktivität unterstrich. Aus einer ganzen Reihe von Naphthylisochinolin-Alkaloiden, die bzgl. ihrer Aktivität gegen das Multiple Myelom getestet wurden, zeigten v.a. drei Verbindungen, nämlich Dioncophyllin A (6), 4'-O-Demethyldioncophyllin A (89) und 5'-O-Demethyldioncophyllin A (90), exzellente Wirksamkeiten und übertrafen dabei sogar die Dioncochinone B (10) und C (102), das Epoxid 175 und die Referenzsubstanz Melphalan. 4) Isolierung der bioaktiven Naphthochinone aus Zellkulturen von Triphyophyllum peltatum. Drei neue Dioncochinone C (102), D (103) und E (104), das für diese Pflanze noch unbekannte 8-Hydroxydroseron (105) und ein neues Naphthalin-Dimer 107 wurden aus Zellkulturen von T. peltatum in Kooperation mit A. Irmer isoliert. Dioncochinon C (102) wies eine ausgezeichnete Aktivität gegen MM-Zellen, ähnlich zu der von Dioncochinon B, auf, wobei jedoch kein inhibierender Effekt auf normale Zellen beobachtet wurde. Die anderen drei Naphthochinone 103105 waren inaktiv oder nur sehr schwach aktiv gegenüber MM-Zellen. 5) Etablierung neuer Strategien für einen Zugang zu den Dioncochinonen B und C im großen Maßstab für In-vivo-Biotests sowie Synthese von Dioncochinon B-Analoga für SAR-Untersuchungen. Vor Beginn dieser Arbeiten zur Synthese von Dioncochinon B (10) existierten bereits zwei, in unserem Arbeitskreis erschlossene, Synthesewege. Die hier beschriebene dritte Möglichkeit zur Darstellung von Dioncochinon B (10) etablierte einen neuen Zugang zu dem gemeinsamen Intermediat 42. Man ortho-deprotonierte zunächst das tertiäre Amid 135 mit sec-BuLiTMEDA, führte anschließend eine Transmetallierung mit MgBr2▪2Et2O durch und setzte das Intermediat mit 2-Methylallylbromid (139) zum ortho-Allylbenzamid 140 um, welches schließlich mit Methyllithium zum Naphthol 42 zyklisiert wurde. Diese Strategie war den beiden früheren Ansätzen hinsichtlich der hohen Ausbeute und der geringen Anzahl an Synthesestufen überlegen. Darauf aufbauend gelang die erste Totalsynthese des bioaktiven Naturstoffes Dioncochinon C (102). Zur Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehung und zur Identifizierung des Pharmakophors der antitumoralen Naphthochinone wurden ca. 30 Analoga von Dioncochinon B (10) und C (102) synthetisiert und auf ihre Anti-MM-Wirkung getestet. Unter den zahlreichen dabei untersuchten Derivaten stellte die synthetische Verbindung 7-O-Demethyldioncochinon C (oder 7-O-Hydroxyldioncochinon B) (145) eine weitere vielversprechende Leitstruktur für die Entwicklung neuer Anti-MM-Kandidaten dar. Als besonders bemerkenswert erwiesen sich die antitumoralen Eigenschaften der Verbindungen 10, 102, und 145. Diese besitzen drei Hydroxygruppen an C-3, C-5 und C-6, die für Ihre biologischen Eigenschaften essentiell zu sein scheinen, da alle anderen Strukturen mit einem gemischten OH/OMe-Muster und jene vollständig OMe-substituierten Verbindungen inaktiv waren. Das Expoxid 175, zeigte unter allen natürlich vorkommenden als auch synthetischen Naphthochinonen und deren Derivaten die beste Aktivität gegen das Multiple Myelom. Gleichzeitig wurde keine Toxizität gegenüber normalen Zellen festgestellt. Dies stand im Gegensatz zu anderen Epoxiden, die über recht hohe Toxizitäten verfügten, wenngleich bei sehr guten Anti-MM-Aktivitäten. Umso bemerkenswerter ist die hohe Selektivität von 175 gegenüber Multiple-Myelom-Zellen. Einleitende SAR Studien zu 175 zeigten, dass die O-Me-Gruppe unbedingt erforderlich ist. Dies lässt auf einen von den Naphthochinonen 10, 102 und 145 verschiedenen Wirkmechanismus schließen, da die drei genannten Verbindungen an C-6 eine OH-Funktionalität tragen. 6) Die erste Totalsynthese eines neuen natürlichen Dimers aus T. peltatum, bestehend aus einer Naphthalin- und einer 1,2-Naphthochinon-Einheit. Man isolierte nur in Spuren ein neuartiges Naphthochinon-Naphthalin-Dimer 187a aus Wurzelkulturen von T. peltatum. Die Totalsynthese von 187a sollte deshalb ausreichende Mengen für ausgewählte Biotests verfügbar machen. Den Schlüsselschritt stellte die Kupplung von zwei sterisch sehr stark gehinderten 2-Methylnaphthalin-Ringen mit jeweils zwei ortho-Substituenten dar. Die Kupplung der 2-Methylnaphthylboronsäure -Derivate mit 2-Methylnaphthylbromid führte unter Verwendung des von Buchwald entwickelten Liganden 196, Pd2(dba)3 und geeigneten Lösungsmitteln und Basen zum racemischen Produkt. Die für das oben beschriebene System optimierten Bedingungen wurden auf die beiden genuinen – hoch-oxygenierten – Substrate die 2-Methylnaphthyl boronsäure-Derivate 210, 211, 213, oder 214 und 2-Methylnaphthyliodide (oder -bromide) 215 (206), 215 (206), 212 (205) oder 212 (205) angewandt. Leider führten zahlreiche Versuche unter Erprobung diverser Basen- und Lösungsmittelsysteme nicht zum Erfolg. Eine mögliche Erklärung liegt in der hohen Elektronendichte der beiden Kupplungspartner, die von den zwei bzw. drei Sauerstoffsubstituenten herrührt. Eine alternative Synthesestrategie oder der Einsatz eines leistungsfähigeren Katalysatorsystems muss deshalb zur Totalsynthese von 187a in Erwägung gezogen werden. 7) Phytochemische Untersuchung des marinen Streptomyces-Stammes RV-15 aus Schwämmen. Die vier neuen cyclischen Lipopeptide Cyclodysidin A-D (216219), welche sowohl aus - als auch - Aminosäuren aufgebaut sind, wurden aus RV-15, einem Streptomyces- Stamm, der mit Schwämmen vergesellschaft ist, isoliert. In Zusammenarbeit mit Dr. U. Abdelmohsen identifizierte man deren Struktur als Cyclo-(ß-AFA-Ser-Gln-Asn-Tyr-Asn- Ser-Thr) mithilfe von 2D-NMR-Spektroskopie und CID-MS/MS. KW - Ancistrocladus KW - dimerer Naphthylisochinolin-Alkaloide KW - Naphthochinonen KW - Ancistrocladus KW - Dimeric Naphthylisoquinoline Alkaloids KW - Naphthoquinones Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72734 ER - TY - THES A1 - Zelman-Femiak, Monika T1 - Single Particle Tracking ; Membrane Receptor Dynamics T1 - Einzelpartikelverfolgung ; Dynamik der Membranrezeptoren N2 - Single-molecule microscopy is one of the decisive methodologies that allows one to clarify cellular signaling in both spatial and temporal dimentions by tracking with nanometer precision the diffusion of individual microscopic particles coupled to relevant biological molecules. Trajectory analysis not only enables determination of the mechanisms that drive and constrain the particles motion but also to reveal crucial information about the molecule interaction, mobility, stoichiometry, all existing subpopulations and unique functions of particular molecules. Efficacy of this technique depends on two problematic issues the usage of the proper fluorophore and the type of biochemical attachment of the fluorophore to a biomolecule. The goal of this study was to evolve a highly specific labeling method suitable for single molecule tracking, internalization and trafficking studies that would attain a calculable 1:1 fluorophore-to-receptor stoichiometry. A covalent attachment of quantum dots to transmembrane receptors was successfully achieved with a techinque that amalgamates acyl carrier protein (ACP) system as a comparatively small linker and coenzyme A (CoA)-functionalized quantum dots. The necessity of optimization of the quantum dot usage for more precise calculation of the membrane protein stoichiometries in larger assemblies led to the further study in which methods maximizing the number of signals and the tracking times of diverse QD types were examined. Next, the optimized techniques were applied to analyze behavior of interleukin-5 β-common chain receptor (IL-5Rβc) receptors that are endogenously expressed at low level on living differentiated eosinophil-like HL-60 cells. Obtained data disclosed that perused receptors form stable and higher order oligomers. Additionally, the mobility analysis based on increased in number (>10%) uninterrupted 1000-step trajectories revealed two patterns of confined motion. Thereupon methods were developed that allow both, determination of stoichiometries of cell surface protein complexes and the acquisition of long trajectories for mobility analysis. Sequentially, the aforementioned methods were used to scrutinize on the mobility, internalization and recycling dynamics characterization of a G protein-coupled receptor (GPCRs), the parathyroid hormone receptor (PTHR1) and several bone morphogenetic proteins (BMPs), a member of the TGF-beta superfamily of receptors. These receptors are two important representatives of two varied membrane receptor classes. BMPs activate SMAD- and non-SMAD pathways and as members of the transforming growth factor β (TGF-β) superfamily are entailed in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis, and apoptosis. For effective ligand induced and ligand independent signaling, two types of transmembrane serine/threonine kinases, BMP type I and type II receptors (BMPRI and BMPRII, respectively) are engaged. Apparently, the lateral mobility profiles of BMPRI and BMPRII receptors differ markedly, which determinate specificity of the signal. Non-SMAD signaling and subsequent osteoblastic differentiation of precursor cells particularly necessitate the confinement of the BMP type I receptor, resulting in the conclusion that receptor lateral mobility is a dominative mechanism to modulate SMAD versus non-SMAD signaling during differentiation. Confined motion was also predominantly observed in the studies devoted to, entailed in the regulation of calcium homeostasis and in bone remodeling, the parathyroid hormone receptor (PTHR1), in which stimulation with five peptide ligands, specific fragments of PTH: hPTH(1–34), hPTHrP(107–111)NH2; PTH(1–14); PTH(1–28) G1R19, bPTH(3–34), first four belonging to PTH agonist group and the last to the antagonist one, were tested in the wide concentration range on living COS-1 and AD293 cells. Next to the mobility, defining the internalization and recycling rates of the PTHR1 receptor maintained in this investigation one of the crucial questions. Internalization, in general, allows to diminish the magnitude of the receptor-mediated G protein signals (desensitization), receptor resensitization via recycling, degradation (down-regulation), and coupling to other signaling pathways (e.g. MAP kinases). Determinants of the internalization process are one of the most addressed in recent studies as key factors for clearer understanding of the process and linking it with biological responses evoked by the signal transduction. The internalization of the PTH-receptor complex occurs via the clathrin-coated pit pathway involving β-arrestin2 and is initiated through the agonist occupancy of the PTHR1 leading to activation of adenylyl cyclase (via Gs), and phosphatidylinositol-specific phospholipase Cβ (via Gq). Taken together, this work embodies complex study of the interleukin-5 β-common chain receptor (IL-5Rβc) receptors, bone morphogenetic proteins (BMPs) and the parathyroid hormone receptor with the application of single-molecule microscopy with the newly attained ACP-quantum dot labeling method and standard techniques. N2 - Die Einzelmolekül-Mikroskopie, das Verfolgen der Diffusion einzelner, mikroskopischer Partikel, welche an relevanten biologischen Molekülen gekoppelt sind, ist eine der entscheidenden Verfahren zur räumlichen und zeitlichen Quantifizierung der Zellsignalisierung und hat eine Genauigkeit im Nanometerbereich. Die so gewonnene Trajektorienanalyse ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Mechanismen, die der Bewegung der Partikel zugrunde liegen, sondern liefert auch wichtige Informationen über die molekulare Wechselwirkungen, Bewegungsfreiheit und Stöchiometrie sowie über alle existierenden Subpopulationen und besondere Funktionen der einzelnen Moleküle. Die Wirksamkeit dieser Technik hängt von der Verwendung des geeigneten Flurophors und der Art seiner biochemischen Anhaftung ab. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines hochspezifischen Markierungsverfahrens, das zur Verwendung der Einzelmolekül-Mikroskopie für Studien im Bereich Endozytose geeignet ist und gleichzeitig eine Fluorophore-Rezeptor Stöchiometrie von 1:1 erreicht. Eine kovalente Anhaftung von Quantenpunkten an Membranrezeptoren wurde erfolgreich in einer Methode realisiert, die ACP-Systeme (Engl. Acyl-Carrier-Protein) mit Koenzym A (CoA-) funktionalisierten Quantenpunkten amalgamiert. Die notwendige Optimierung der Verwendung von Quantenpunkten mit dem Ziel einer genaueren Berechnung der Stöchiometrie von Membranproteinen sehr großer Anzahl führte zu weiteren Studien. In diesem Zusammenhang wurden Methoden zur Maximierung der Signalanzahl und Beobachtungszeiten diverser Quantenpunktentypen untersucht. Im nächsten Schritt wurden die optimierten Verfahren angewendet, um das Verhalten von IL-5Rßc (Engl. Interleukin-5 ß-common chain receptor) Rezeptoren, die endogen auf niedriger Stufe auf lebende differenzierte eosinophile-ähnlichen HL-60 Zellen existieren, zu analysieren. Die gewonnenen Daten haben gezeigt, dass die Rezeptoren sich in stabilen Oligomeren hoher Ordnung bilden, was zusätzlich mit den Ergebnissen der Analyse der Mobilität, die auf einer hohen Anzahl unterbrochener 1000-Schritt Trajektorien basiert, zwei abgegrenzte Bewegungsmuster ergab. Daraufhin wurden Methoden entwickelt, die eine Bestimmung der Stöchiometrie von Zelloberflächen-Proteinkomplexen und die Erfassung umfangreicher Trajektorien zur Bewegungsanalyse ermöglichen. Im Weiteren wurden die zuvor genannten Methoden zur genauen Überprüfung der Mobilität, Endozytose und der Charakterisierung der rückläufigen Dynamik der repräsentativen Rezeptoren von zwei verschiedenen Membranrezeptoren Klassen, des Parathormon-Rezeptors (Engl. the parathyroid hormone receptor), der zu der G-Protein-gekoppelter Rezeptor Gruppe (GPCRs) gehört und der Rezeptoren der knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs) verwendet. BMPs aktivieren SMAD- und non-SMAD Signalkaskaden und als ein Bestandteil des TGF-β-Signalszstem sind sie in die Proliferation, die Differenyiation, die Chemotaxis und die Apoptose involviert. Zwei BMP Rezeptor Typen, BMP Typ I und BMP Typ II (BMPRI und BMPRII) sind nötig für die effektive Signalwirkung. Offenbar sind die Bewegungsmuster für BMPRI und BMPRII sehr unterschiedlich, was hier die Genauigkeit des Signals festlegt. Non-SMAD Kaskade und die nachfolgende Differenzierung von den Osteoblastenzellen benötigt das abgegrenzte Bewegungsmuster von BMPRI. Daraus folgert, dass die laterale Mobilität ein Hauptmechanismus in der SMAD gegen non-SMAD Signalwirkung während der Differenziation ist. Das abgegrenzte Bewegungsmuster war auch für den Parathormon Rezeptor (Engl. the parathyroid hormone receptor) (PTHR1), der in die Calcium Homeostase und den Knochenumbau involviert ist, in den Studien zu beobachten. In diesen Studien wurden fünf Peptide Ligande, spezifische Teile von dem PTH: hPTH(1–34), hPTHrP(107–111)NH2; PTH(1–14); PTH(1–28) G1R19, bPTH(3–34), von denen die ersten vier zu der Agonistengruppe und der Letzte zu der Antagonistengruppe gehören, in verschiedenen Konzentrationen mit lebenden COS-1 und AD293 Zellen verwendet. (oder aufgebracht) Eine der Hauptfragen war die Festlegung der Rate der PTHR1 Internalisierung und des Recycling in dieser Forschung. Im Allgemeinen reduziert Internalisierung die Stärke der Signale, die von den G Proteinen kommen und durch die Rezeptoren übermittelt (die Desensibilisierung) werden. Durch den Rücklauf werden die Rezeptoren wieder sensibilisiert, degradiert und können somit an anderen Signalkaskaden ankoppeln (zB. MAP-Kinase ). Die Determinanten der Internalisierung sind das Hauptthema in den aktuellen Studien, da sie der Schlüssel zum besseren Verständnis der Internalisierung und zu den nachfolgenden biologischen Antworten sind. Die Internalisierung von dem PTH Rezeptor verläuft entsprechend des Clathrin-coated Pit Weges mit der Teilnahme von β-arrestin2 und ist durch den Ligand eingeleitet, der zur Aktivierung von adenylyl cyclase (via Gs), und phosphatidylinositol-specific phospholipase Cβ (via Gq) führt. Zusammenfassend ist diese Arbeit unter Verwendung von Einzelmolekül-Mikroskopie mit der neuen ACP-Quantumpunktmethoden sowie standard Markierungsmethoden ein komplexes Studium über die IL-5Rßc Rezeptoren, die BMP Rezeptoren und den PTH Rezeptor. KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - Membranrezeptor KW - Dynamik KW - Einzelpartikelverfolgung KW - Dynamik von Membranrezeptoren KW - Mikroskopie KW - Single Particle Tracking KW - Membrane Receptor Dynamics KW - Microscopy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65420 ER - TY - THES A1 - Zeller, Mario T1 - Dichtegewichtete Magnetresonanz-Bildgebung mit Multi-Echo-Sequenzen T1 - Density Weighted Magnetic Resonance Imaging with Multi-Echo Sequences N2 - Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) stellt bei modernen Bildgebungstechniken in der Magnetresonanz-Tomographie heutzutage oftmals die entscheidende Limitation dar. Eine Verbesserung durch Modifikation der Hardware ist kostspielig und führt meistens zu einer Verstärkung anderer Probleme, wie zum Beispiel erhöhte Energiedeposition ins Gewebe. Im Gegensatz dazu ist Dichtegewichtung eine Methode, die eine SNR-Erhöhung durch Modifikation der Aufnahmetechnik ermöglicht. In der MR-Bildgebung erfolgt oftmals eine retrospektive Filterung des aufgenommenen Signalverlaufs, beispielsweise zur Artefaktreduktion. Damit einhergehend findet eine Veränderung der Modulationstransferfunktion (MTF) bzw. ihrer Fouriertransformierten, der räumlichen Antwortfunktion (SRF), statt. Optimales SNR wird nach dem Matched Filter-Theorem erzielt, wenn die nachträgliche Filterung dem aufgenommenen Signalverlauf proportional ist. Dies steht dem Ziel der Artefaktreduktion entgegen. Bei Dichtegewichtung steht durch nicht-kartesische Abtastung des k-Raums mit der k-Raum-Dichte ein zusätzlicher Freiheitsgrad zur Verfügung. Dieser ermöglicht es, im Falle eines konstanten Signalverlaufs eine gewünschte MTF ohne Filterung zu erreichen. Bei veränderlichem Signalverlauf kann ein SNR Matched Filter angewendet werden, dessen negative Einflüsse auf die MTF durch Dichtegewichtung kompensiert werden. Somit ermöglicht Dichtegewichtung eine vorgegebene MTF und gleichzeitig ein optimales SNR. In der vorliegenden Arbeit wurde Dichtegewichtung erstmals bei den schnellen Multi-Echo-Sequenzen Turbo-Spin-Echo und Echoplanar-Bildgebung (EPI) angewendet. Im Gegensatz zu bisherigen Implementierungen muss hier der Signalabfall durch T2- bzw. T2*-Relaxation berücksichtigt werden. Dies führt dazu, dass eine prospektiv berechnete dichtegewichtete Verteilung nur bei einer Relaxationszeit optimal ist. Bei Geweben mit abweichenden Relaxationszeiten können sich wie auch bei den kartesischen Varianten dieser Sequenzen Änderungen an SRF und SNR ergeben. Bei dichtegewichteter Turbo-Spin-Echo-Bildgebung des Gehirns konnte mit den gewählten Sequenzparametern ein SNR-Vorteil von 43 % gegenüber der kartesischen Variante erzielt werden. Die Akquisition wurde dabei auf die T2-Relaxationszeit von weißer Substanz optimiert. Da die meisten Gewebe im Gehirn eine ähnliche Relaxationszeit aufweisen, blieb der visuelle Gesamteindruck identisch zur kartesischen Bildgebung. Der SNR-Gewinn konnte in der dichtegewichteten Implementierung zur Messzeithalbierung genutzt werden. Dichtegewichtete EPI weist eine hohe Anfälligkeit für geometrische Verzerrungen, welche durch Inhomogenitäten des Hauptmagnetfeldes verursacht werden, auf. Die Verzerrungen konnten erfolgreich mit einer Conjugate Phase-Methode korrigiert werden. Dazu muss die räumliche Verteilung der Feldinhomogenitäten bekannt sein. Dazu ist zusätzlich zur eigentlichen EPI-Aufnahme die zeitaufwendige Aufnahme einer sogenannten Fieldmap erforderlich. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Methode entwickelt werden, welche die zur Erlangung einer Fieldmap notwendige Aufnahmedauer auf wenige Sekunden reduziert. Bei dieser Art der Fieldmap-Aufnahme müssen jedoch durch Atmung hervorgerufene Effekte auf die Bildphase berücksichtigt werden. Die Fieldmap-Genauigkeit kann durch Aufnahme unter Atempause, Mittelung oder retrospektiver Phasenkorrektur erhöht werden. Für die gewählten EPI-Sequenzparameter wurde mit Dichtegewichtung gegenüber der kartesischen Variante ein SNR-Gewinn von 14 % erzielt. Anhand einer funktionellen MRT (fMRI)-Fingertapping-Studie konnte demonstriert werden, dass die SNR-Steigerung auch zu einer signifikant erhöhten Aktivierungsdetektion in Teilen der Hirnareale führt, die bei der Fingerbewegung involviert sind. Die Verwendung von zusätzlicher EPI-Phasenkorrektur und iterativer Optimierung der dichtegewichteten k-Raum-Abtastung führt zu weiteren Verbesserungen der dichtegewichteten Bildgebung mit Multi-Echo-Sequenzen. N2 - Magnetic resonance imaging (MRI) is often limited by the signal to noise ratio (SNR). In standard Cartesian acquisition methods, the SNR can be improved by applying a so-called matched filter to the acquired raw data, which correlates with the anticipated signal profile. Unfortunately, this filter changes the spatial response function (SRF), which characterizes the imaging properties of the imaging method, in an undesired way. For example, a matched filter often amplifies undesired image artifacts and is thus normally omitted. In contrast, filters which change the SRF are typically applied, e.g., for artifact reduction. These however do not provide an optimal SNR. Density weighting is a method which allows a desired SRF and an optimal SNR at the same time. This is achieved by introducing a new degree of freedom to the SRF; the density of the acquisition steps in k-space. In this work, density weighting was adapted to turbo spin echo (TSE) and echo planar imaging (EPI). In contrast to earlier implementations of density weighting, signal relaxation has to be taken into consideration with these multi-echo sequences. As a result, the desired SRF and SNR are only obtained for one prospectively determined relaxation time. For deviating relaxation times, changes in SRF and SNR may occur. In density weighted TSE brain imaging, an average SNR gain of 43 % over Cartesian imaging could be achieved for the chosen sequence parameters. The density weighted acquisition was optimized for the T2 relaxation time of white matter. Since the relaxation times of most other tissues in the brain did not significantly differ, the overall visual impression of density weighted and Cartesian images was identical. The achieved SNR gain could be used to halve the acquisition time of the density weighted implementation. Density weighted EPI is especially prone to geometric distortions caused by inhomogeneities of the main magnetic field. The distortions could be successfully corrected with a conjugate phase method. For these methods, a time-consuming acquisition of a so-called field map is typically required. A method could be developed which greatly reduces the field map acquisition time to a few seconds. It was found that phase changes caused by respiration influence the field map accuracy of this and similar methods. A significantly higher accuracy could be achieved by an acquisition under breath-hold or by retrospective phase correction or averaging. It was demonstrated in an fMRI group study that an average SNR gain of 14 % for density weighted EPI resulted in an increased detection power in the activated brain areas. First results involving additional EPI phase correction and iterative k-space sampling optimization demonstrate further improvements of density weighted imaging with multi-echo sequences. KW - Kernspintomografie KW - Störabstand KW - Dichtegewichtung KW - Echoplanar-Bildgebung KW - Turbo Spin Echo KW - B0-Korrektur KW - Density Weighting KW - Point Spread Function KW - Echo Planar Imaging KW - Turbo Spin Echo KW - B0 correction KW - Echo planar imaging KW - NMR-Tomographie Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84142 ER - TY - THES A1 - Zanucco, Emanuele T1 - Role of oncogenic and wild type B-RAF in mouse lung tumor models T1 - Untersuchungen zur Rolle der onkogenen und wildtypischen B-RAF Kinase in Lungentumormodellen der Maus N2 - Von Wachstumsfaktoren regulierte Signalkaskaden sind Schlüsselelemente in der Gewebeentwicklung und Geweberegeneration. Eine Deregulation dieser Kaskaden führt zu Entwicklungsstörungen und neoplastischen Krankheiten. Für viele humane Krebsformen sind aktivierende Mutationen der Kinasen der RAF Familie verantwortlich. Das erste Projekt dieser Doktorarbeit fokussiert auf der Rolle des B-RAF V600E, welches als eine der am häufigsten vorkommenden Mutantionen in humanen Krebszellen identifiziert worden ist. Um die onkogene Funktion des B-RAF V600E zu untersuchen, haben wir transgene Mauslinien hergestellt, welche das aktivierte Onkogen spezifisch in alveolaren Lungenepithelzellen des Typ II exprimieren. Konstitutive Expression des B-RAF V600E führte zu einer abnormen alveolaren Epithelzellbildung und zu Emphysem-ähnlichen Läsionen. Diese Läsionen wiesen Zeichen einer Gewebsumstrukturierung auf, oft in Assoziation mit chronischer Inflammation und geringer Inzidenz von Lungentumoren. Die Infiltration der entzündlichen Zellen erfolgte erst nach der Entstehung von Emphysem-ähnlichen Läsionen und könnte zur späteren Tumorbildung beigetragen haben. Diese Ergebnisse unterstützen ein Modell, in welchem der kontinuierliche regenerative Prozess eine tumorfördernde Umgebung schafft. Dabei induziert die Aktivität des onkogenen B-RAF eine alveolare Störung, welche ursächlich verantwortlich ist für den kontinuierlichen regenerativen Prozess. Das zweite Projekt fokussiert auf die Rolle von endogenem (wildtypischen) B-RAF in einem durch onkogenes C-RAF induzierten Maus Lungentumormodell. Für unsere Untersuchungen haben wir eine Mauslinie geschaffen, in welcher B-RAF in den C-RAF Lungentumoren konditionell eliminiert werden kann. Eine konditionelle Eliminierung des B-RAF hat die Entstehung von Lungentumoren nicht blockiert, aber zu reduziertem Tumorwachstum geführt. Dieses reduzierte Tumorwachstum konnte auf eine reduzierte Zellproliferation zurückgeführt werden. Außerdem konnten wir durch die B-RAF Elimination eine Reduktion der Intensität der mitogenen Signalkaskade beobachten. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das onkogene Potential von C-RAF in vivo unabhängig von B-RAF ist und eine Kooperation von B-RAF und C-RAF jedoch für die vollständige Aktivierung der mitogenen Signalkaskade wichtig ist. N2 - Growth factor induced signaling cascades are key regulatory elements in tissue development, maintenance and regeneration. Deregulation of the cascades has severe consequences, leading to developmental disorders and neoplastic diseases. As a major function in signal transduction, activating mutations in RAF family kinases are the cause of many human cancers. In the first project described in this thesis we focused on B-RAF V600E that has been identified as the most prevalent B-RAF mutant in human cancer. In order to address the oncogenic function of B-RAF V600E, we have generated transgenic mice expressing the activated oncogene specifically in lung alveolar epithelial type II cells. Constitutive expression of B-RAF V600E caused abnormalities in alveolar epithelium formation that led to airspace enlargements. These lung lesions showed signs of tissue remodeling and were often associated with chronic inflammation and low incidence of lung tumors. Inflammatory cell infiltration did not precede the formation of emphysema-like lesions but was rather accompanied with late tumor development. These data support a model where the continuous regenerative process initiated by oncogenic B-RAF-driven alveolar disruption provides a tumor-promoting environment associated with chronic inflammation. In the second project we focused on wild type B-RAF and its role in an oncogenic-C-RAF driven mouse lung tumor model. Toward this aim we have generated compound mice in which we could conditionally deplete B-RAF in oncogenic-C-RAF driven lung tumors. Conditional elimination of B-RAF did not block lung tumor formation however led to reduced tumor growth. The diminished tumor growth was not caused by increased cell death instead was a consequence of reduced cell proliferation. Moreover, B-RAF ablation caused a reduction in the amplitude of the mitogenic signalling cascade. These data indicate that in vivo B-RAF is dispensable for the oncogenic potential of active C-RAF; however it cooperates with oncogenic C-RAF in the activation of the mitogenic cascade. KW - Lungenkrebs KW - Biochemie KW - Maus KW - Lung cancer KW - RAF Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69603 ER - TY - THES A1 - Zancolli, Giulia T1 - Amphibian diversity along the slope of Mount Kilimanjaro: from species to genes T1 - Diversität von Amphibien im Höhengradienten des Mount Kilimanjaro: von Arten zu Genen N2 - 1. Since the early nineteenth century describing (and understanding) patterns of distribution of biodiversity across the Earth has represented one of the most significant intellectual challenges to ecologists and biogeographers. Among the most striking patterns of species richness are: the latitudinal and elevational gradients, with peaks in number of species at low latitudes and somewhere at mid altitudes, although other patterns, e.g. declines with increasing elevation, are often observed. Even in highly diverse tropical regions, species richness is not evenly distributed but there are “hotspots” of biodiversity where an exceptional number of species, especially endemics, are concentrated. Unfortunately, such areas are also experiencing dramatic loss of habitat. Among vertebrate taxa, amphibians are facing the most alarming number of extinctions. Habitat destruction, pollution and emergence of infectious diseases such as chytridiomycosis, are causing worldwide population declines. Responses to these drivers can be multidirectional and subtle, i.e. they may not be captured at the species but at the genetic level. Moreover, present patterns of diversity can result from the influence of past geological, climatic and environmental changes. In this study, I used a multidisciplinary and multilevel approach to understand how and to which extent the landscape influences amphibian diversity. Mount Kilimanjaro is an exceptional tropical region where the landscape is rapidly evolving due to land use changes; additionally, there is a broad lack of knowledge of its amphibian fauna. During two rainy seasons in 2011, I recorded anurans from the foothills to 3500 m altitude; in addition, I focused on two river frog species and collected tissue samples for genetic analysis and swabs for detection of chytridiomycosis, the deadly disease caused by Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). 2. I analyzed how species richness and composition change with increasing elevation and anthropogenic disturbance. In order to disentangle the observed patterns of species diversity and distribution, I incorporated inferences from historical biogeography and compared the assemblage of Mt. Kilimanjaro and Mt. Meru (both recent volcanoes) with those of the older Eastern Arc Mountains. Species richness decreased with elevation and locally increased in presence of water bodies, but I did not detect effects of either anthropogenic disturbance or vegetation structure on species richness and composition. Moreover, I found a surprisingly low number of forest species. Historical events seem to underlie the current pattern of species distribution; the young age of Mt. Kilimanjaro and the complex biogeographic processes which occurred in East Africa during the last 20 million years prevented montane forest frogs from colonizing the volcano. 3. I focused on the genetic level of biodiversity and investigated how the landscape, i.e. elevation, topographic relief and land cover, influence genetic variation, population structure and gene flow of two ecologically similar and closely related river frog species, namely Amietia angolensis and Amietia wittei. I detected greater genetic differentiation among populations in the highland species (A. wittei) and higher genetic variation in the lowland species (A. angolensis), although genetic diversity was not significantly correlated with elevation. Importantly, human settlements seemed to restrict gene flow in A. angolensis, whereas steep slopes were positively correlated with gene flow in A. wittei. This results show that even ecologically similar species can respond differently to landscape processes and that the spatial configuration of topographic features combined with species-specific biological attributes can affect dispersal and gene flow in disparate ways. 4. River frogs of the genus Amietia seem to be particularly susceptible to chytridiomycosis, showing the highest pathogen load in Kenya and other African countries. In the last study, I collected swab samples from larvae of A. angolensis and A. wittei for Bd detection. Both species resulted Bd-positive. The presence of Bd on Mt. Kilimanjaro has serious implication. For instance, Bd can be transported by footwear of hikers from contaminated water and soil. Tourists visiting Mt. Kilimanjaro may translocate Bd zoospores to other areas such as the nearby Eastern Arc Mts. where endemic and vulnerable species may still be naïve to the fungus and thus suffer of population declines. 5. My study significantly contributed to the knowledge of the amphibian fauna of Mt. Kilimanjaro and of East Africa in general, and it represents a valuable tool for future conservation actions and measures. Finally, it highlights the importance of using a multidisciplinary (i.e. community ecology, historical biogeography, landscape genetics, disease ecology) and multilevel (i.e. community, species, population, gene) approach to disentangle patterns of biodiversity. N2 - Seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es eine der größten intellektuellen Herausforderungen für Ökologen und Biogeographen, die Verteilungsmuster der Biodiversität auf der Erde zu beschreiben und letztlich zu verstehen. Zu den auffälligsten Mustern des Artenreichtums gehören die Gradienten, die sich in Abhängigkeit von der geographischer Breite und der Höhe über dem Meeresspiegel ergeben. Dabei treten Maxima der Artenzahl in den niederen Breiten und stellenweise in mittleren Höhenregionen auf; es lassen sich aber auch andere Muster beobachten, z.B. eine Abnahme der Artenzahl mit zunehmender Höhe. Selbst in den hochdiversen Tropen sind Arten nicht gleichmäßig verteilt. So gibt es sog. „hotspots“ der Biodiversität mit einer außergewöhnlich großen Zahl von Arten (meist Endemiten). Gerade diese Regionen sind es, die heute dramatische 1. Seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es eine der größten intellektuellen Herausforderungen für Ökologen und Biogeographen, die Verteilungsmuster der Biodiversität auf der Erde zu beschreiben und letztlich zu verstehen. Zu den auffälligsten Mustern des Artenreichtums gehören die Gradienten, die sich in Abhängigkeit von der geographischer Breite und der Höhe über dem Meeresspiegel ergeben. Dabei treten Maxima der Artenzahl in den niederen Breiten und stellenweise in mittleren Höhenregionen auf; es lassen sich aber auch andere Muster beobachten, z.B. eine Abnahme der Artenzahl mit zunehmender Höhe. Selbst in den hochdiversen Tropen sind Arten nicht gleichmäßig verteilt. So gibt es sog. „hotspots“ der Biodiversität mit einer außergewöhnlich großen Zahl von Arten (meist Endemiten). Gerade diese Regionen sind es, die heute dramatische Habitatverluste verzeichnen. Unter den Wirbeltieren sind es die Amphibien, die dabei die höchsten Aussterberaten aufweisen. Ihre Populationen gehen weltweit zurück, wofür neben Lebensraumzerstörung auch Umweltverschmutzung und die Ausbreitung von Infektionskrankheiten, z.B. Chytridiomykose, verantwortlich sind. Reaktionen auf solche Faktoren können vielschichtig sein und fast unmerklich bleiben, was bedeutet, dass sie nicht auf Artniveau, sondern nur auf genetischer Ebene erfasst werden können. Hinzu kommt, dass die aktuellen Muster der Biodiversität auf den Einfluss vergangener Veränderungen hinsichtlich Geologie, Klima und Umwelt zurückgeführt werden können ... KW - Kilimandscharo KW - biodiversity KW - Amphibien KW - Lurche KW - Biodiversität KW - Vielfalt Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91792 ER - TY - THES A1 - Yurdadogan, Tino T1 - Endorganschaden und Gefäßalter bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit T1 - End organ damage and vascular age in patients with coronary artery disease N2 - Die nicht-invasive Gefäßdiagnostik stellt einen wichtigen Pfeiler in der Prävention von Herz-Kreislauferkrankungen dar. Während lange Zeit die sonographische Messung der cIMT, als morphologisches Korrelat der Gefäßalterung, als Goldstandard galt, ist in den letzten Jahren in Gestalt der Pulswellenanalyse/PWV-Messung eine Technik weiterentwickelt worden, die, als funktionelles Korrelat der Gefäßalterung, aufgrund der leichteren Durchführbarkeit und geringerer Untersucherabhängigkeit und Kosten vielversprechend ist. So erlaubt die Messung der Pulswelle mittels gewöhnlicher Blutdruckmanschetten, genau wie die cIMT, die Berechnung des individuellen Gefäßalters und die Diagnostik für das Vorliegen eines Endorganschadens der Blutgefäße. Um die Messergebnisse der beiden Untersuchungen miteinander zu vergleichen, wurden beide in der EUROASPIRE-IV Studie an Patienten mit koronarer Herzkrankheit durchgeführt. Die Auswertung der Messergebnisse der mit dem Vascular Explorer durchgeführten Pulswellenanalyse/PWV-Messung ergab überraschenderweise, dass die Mehrheit der herzkranken Patienten weder eine vaskuläre Voralterung noch einen Endorganschaden der Blutgefäße aufweisen. Im Falle der cIMT-Messung war Gegenteiliges der Fall, was trotz der medikamentösen Therapie der Patienten so zu erwarten war. Weiterhin zeigte sich lediglich eine geringe Korrelation zwischen den Messergebnissen beider Untersuchungen. Die Determinanten der einzelnen Messwerte aus cIMT und Pulswellenanalyse/PWV-Messung waren deckungsgleich mit den in der Literatur beschriebenen Faktoren, wenn auch viele der sonst signifikanten Regressoren das Signifikanzniveau in unserer Auswertung nicht unterschritten. Eine Limitation der funktionellen Gefäßdiagnostik liegt derzeit darin, dass die Messergebnisse stark von dem verwendeten Messgerät abhängen. Es liegen noch zu wenig Vergleichsstudien vor, um die Messergebnisse, speziell von neueren Geräten wie dem Vascular Explorer, auf andere zu übertragen. Bei der Berechnung des Gefäßalters sollten daher optimalerweise gerätespezifische Normwerte vorliegen, was beim Vascular Explorer nicht der Fall ist. Gleiches gilt für die Verwendung des PWVcf-Grenzwerts für die Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße. Analog hat auch die Messung der cIMT gewisse Einschränkungen. So wäre eine weitere Standardisierung der Messorte (A. carotis communis vs Bulbus vs A. carotis interna), zwischen denen sich die durchschnittliche cIMT erheblich unterscheidet, sowie der Messparameter (Minimal- vs Maximal- vs Mittelwert) wünschenswert. Die universelle Anwendung eines cIMT-Grenzwerts zur Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße ist daher kritisch zu sehen. Dies zeigt sich auch darin, dass in den neuesten Leitlinien der bislang geltende Grenzwert angezweifelt und kein aktuell gültiger Grenzwert mehr genannt wird. Wir interpretieren unsere Ergebnisse dahingehend, dass unsere Messung der cIMT die zu erwartende pathologische Gefäßalterung bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit besser widerspiegelt als die Messung der Pulswelle mit dem Vascular Explorer. Welche der beiden Untersuchungen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeit überlegen ist, muss im Rahmen von Längsschnittstudien geklärt werden. N2 - Non-invasive vascular diagnostics play an important role in the prevention of cardiovascular diseases. For a long time, sonographic measurement of the cIMT was considered the gold standard. Yet, by continually developing the PWA/PWV measurement, a promising technique is available, that is easy to handle and has better inter-examiner reproducibility at lower costs. Just like the cIMT examination, recording and analysing the pulse wave via blood pressure cuffs allows the determination of the individual vascular age and to diagnose end organ damage of the arteries. In order to compare the results of both examinations, they were performed during the EUROASPIRE IV-study in patients with coronary artery disease. Despite being under medication, we expected to find early vascular aging in most patients. Surprisingly, according to the results of the PWA/PWV measurement with the Vascular Explorer device, most of the study population neither showed early vascular aging nor met the criteria for end organ damage of the arteries. cIMT measurements delivered the opposite results. Moreover, we found only poor correlation between the measured values of both examinations. Regression analysis yielded determinants of cIMT and PWA/PWV measurement, which were largely congruent with those described in literature. The most apparent weakness of evaluating the vascular status by means of PWA/PWV measurement lies in the poor inter-device comparability. Due to a lack of comparative studies with large sample sizes, measured values of different devices are currently not transferable. Nonetheless, reference values used for vascular age determination with the Vascular Explorer are available in a study using a different device. Furthermore, the PWV threshold for diagnosing end organ damage is applied regardless of the technique/device used for measurement, although an adjustment is urgently needed. Similarly, the cIMT measurement has certain limitations as efforts can still be made to better standardise examination protocols (e.g. sites of measurement (Common Carotid Artery vs Bulb vs Internal Carotid artery), obtained values (minimum vs maximum vs mean)). The formerly valid cIMT threshold is currently being called into question by the latest guidelines, as there is evidence of its underestimation. Ultimately, cIMT measurement better reflects the expected early vascular aging in patients with coronary artery disease than PWA/PWV measurement with the Vascular Explorer. However, longitudinal studies are necessary to further evaluate the prognostic value of both examinations. KW - Arteriosklerose KW - Pulswelle KW - Koronare Herzkrankheit KW - Endorganschaden KW - Gefäßalter KW - Carotis Intima Media Dicke Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218469 ER -