TY - THES A1 - Ahles, Andrea T1 - Analyse der Aktivierung β-adrenerger Rezeptoren T1 - Analysis of β-adrenergic receptor activation N2 - Die Funktionalität β1- und β2-adrenerger Rezeptoren wird durch Polymorphismen in ihrer kodierenden Region moduliert. Wir haben uns die Technik des Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfers (FRET) zu Nutze gemacht, um den Einfluss der am häufigsten vorkommenden Polymorphismen (Ser49Gly und Gly389Arg im β1AR, Arg16Gly und Gln27Glu im β2AR) auf die Rezeptorkonformation nach Aktivierung zu untersuchen. Dafür wurden FRET-Sensoren für die beiden βAR-Subtypen mit einem gelb-fluoreszierenden Protein (YFP) sowie einem cyan-fluoreszierenden Protein (CFP oder Cerulean) in der dritten intrazellulären Schleife bzw. am C-Terminus verwendet. Nach Stimulierung der βARSensoren konnte die Aktivierung der polymorphen Rezeptorvarianten in lebenden Zellen in Echtzeit untersucht werden. Dabei behielten die FRET-Sensoren sowohl die Bindungsaffinitäten der nativen Rezeptoren als auch eine intakte Funktionalität hinsichtlich der Bildung von sekundären Botenstoffen. Der Vergleich der Aktivierungskinetiken der verschieden polymorphen Varianten des β1AR und β2AR ergab keine signifikanten Unterschiede nach einer einmaligen Stimulation. Es zeigte sich jedoch, dass Rezeptorpolymorphismen die Aktivierungskinetik vorstimulierter βAR erheblich beeinflussen. So konnten wir im Vergleich zur ersten Aktivierung eine schnellere Aktivierung der Gly16-Varianten des β2AR sowie des Gly49Arg389-β1AR feststellen, während die Arg16-β2AR-Variante und der Ser49Gly389-β1AR dagegen bei einer wiederholten Stimulation langsamer aktiviert wurden. Diese Ergebnisse lassen auf ein "Rezeptorgedächtnis" schließen, das spezifisch für bestimmte polymorphe Rezeptorvarianten ist und eine βAR-Subtyp-spezische Ausprägung zeigt. Die Ausbildung der unterschiedlichen Aktivierungskinetiken hing von der Interaktion des Rezeptors mit löslichen intrazellulären Faktoren ab und bedurfte einer Phosphorylierung intrazellulärer Serin- und Threonin-Reste durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen. Die Interaktion mit löslichen intrazellulären Faktoren scheint für den β1AR weniger stark ausgeprägt zu sein als für den β2AR. Die cAMP-Produktion war für die schneller werdenden, “hyperfunktionellen” Gly16-β2ARVarianten signifikant um mehr als 50% höher im Vergleich zur “hypofunktionellen” Arg16- Variante. Die unterschiedliche Funktionalität spiegelte sich im Therapieausgang bei Tokoysepatientinnen wider, dessen Erfolg mit dem Arg16Gly Polymorphismus verknüpft war. Die Daten implizieren eine intrinsische, polymorphismusabhängige Eigenschaft der βAR, die die Aktivierungskinetik der Rezeptoren bei wiederholten Stimulationen determiniert. Diese könnte auch für die zwischen Individuen variierende Ansprechbarkeit auf β-Agonisten und β-Blocker mitverantwortlich sein. N2 - Signaling through G protein-coupled receptors is known to be influenced by receptor polymorphisms, yet the molecular basis for the functional differences is unclear. To investigate the impact of the most frequent polymorphic sites of the β1- and the β2– adrenergic receptor (Ser49Gly and Gly389Arg for β1AR, Arg16Gly and Gln27Glu for β2AR) on receptor conformation we used a fluorescence resonance energy transfer (FRET) based approach. We made use of βAR-FRET sensors with a yellow fluorescent protein (YFP) inserted into the third intracellular loop and a cyan fluorescent protein (CFP or Cerulean) fused to the C-terminal tail of the βAR. These sensors retained key pharmacological and functional characteristics of the native receptors. Upon stimulation of the sensors we determined the activation characteristics of the polymorphic receptors in real time and in living cells and found that βAR respond to repeated activation with a change of their activation kinetics during subsequent stimulations. This phenomenon differed between polymorphic variants of the βAR. The “hyperfunctional” Gly16-β2AR variants as well as the Gly49Arg389-β1AR became faster in their activation kinetics, while the “hypofunctional” Arg16-β2AR and the Ser49Gly389-β1AR became slower compared to their initial activation. These differences depended on the interaction with soluble cytosolic factors that occurred after the initial activation, and on the phosphorylation of agonist-bound receptors through G protein-coupled receptor kinases. The “memory“ of previous activation is formed already after a first stimulation of only five seconds, whereas the β1AR memory necessitates prestimulation for five minutes and seems to be based on a less stable interaction with intracellular proteins compared to the β2AR. Assuming short-lived and repetitive receptor-ligand interaction under native conditions, we hypothesized that faster activation during single ligand-receptor interaction represents the basis for more effective signaling to downstream effectors. Indeed, the extent of cAMP formation was enhanced by 50% upon stimulation of the Gly16-β2AR compared to the Arg16 variant. The different functionality reflected the outcome of tocolysis treatment with the β2-agonist fenoterol whose success correlated with the Arg16Gly genotype of the patients. Our findings suggest an intrinsic, polymorphism-specific property of the βAR that alters activation kinetics upon continued stimulation and that might account for individual drug responses. KW - Beta-1-Rezeptor KW - Beta-2-Rezeptor KW - cell KW - biology KW - Polymorphismus KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Aktivierung KW - Zelle KW - Biologie Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85577 ER - TY - THES A1 - Polzien, Lisa T1 - BAD Phosphorylation: A Novel Link between Apoptosis and Cancer T1 - BAD Phosphorylierung: Eine Neue Verbindung zwischen Apoptose und Krebs N2 - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family that is regulated by phosphorylation in response to survival factors. Although much attention has been devoted to the identification of phosphorylation sites in murine BAD (mBAD), little data are available with respect to phosphorylation of human BAD (hBAD) protein. In this work, we investigated the quantitative contribution of BAD targeting kinases in phosphorylating serines 75, 99 and 118 of hBAD (Chapter 3.1). Our results indicate that RAF kinases phosphorylate hBAD in vivo at these established serine residues. RAF-induced phosphorylation of hBAD was not prevented by MEK inhibitors but could be reduced to control levels by use of the RAF inhibitor Sorafenib (BAY 43-9006). Consistently, expression of active RAF suppressed apoptosis induced by hBAD and the inhibition of colony formation caused by hBAD could be prevented by RAF. In addition, using surface plasmon resonance technique we analyzed the direct consequences of hBAD phosphorylation by RAF with respect to complex formation of BAD with 14-3-3 proteins and Bcl-XL. Phosphorylation of hBAD by active RAF promotes 14-3-3 protein association, whereby the phosphoserine 99 represents the major binding site. Furthermore, we demonstrate in this work that hBAD forms channels in planar bilayer membranes in vitro. This pore-forming capacity is dependent on phosphorylation status and interaction with 14-3-3 proteins. Additionally, we show that hBAD pores possess a funnel-shaped geometry that can be entered by ions and non-charged molecules up to 200 Da (Chapter 3.2). Since both lipid binding domains of hBAD (LBD1 and LBD2) are located within the C-terminal region, we investigated this part of the protein with respect to its structural properties (Chapter 3.3). Our results demonstrate that the C-terminus of hBAD possesses an ordered β-sheet structure in aqueous solution that adopts helical disposition upon interaction with lipid membranes. Additionally, we show that the interaction of the C-terminal segment of hBAD with the BH3 domain results in the formation of permanently open pores, whereby the phosphorylation of serine 118 proved to be necessary for effective pore-formation. In contrast, phosphorylation of serine 99 in combination with 14-3-3 association suppresses formation of channels. These results indicate that the C-terminal part of hBAD controls hBAD function by structural transitions, lipid binding and phosphorylation. Using mass spectrometry we identified in this work, besides the established in vivo phosphorylation sites at serines 75, 99 and 118, several novel hBAD phosphorylation sites (serines 25, 32/34, 97, 124 and 134, Chapter 3.1). To further analyze the regulation of hBAD function, we investigated the role of these newly identified phosphorylation sites on BAD-mediated apoptosis. We found that in contrast to the N-terminal phosphorylation sites, the C-terminal serines 124 and 134 act in an anti-apoptotic manner (Chapter 3.4). Our results further indicate that RAF kinases and PAK1 effectively phosphorylate BAD at serine 134. Notably, in the presence of wild type hBAD, co-expression of survival kinases, such as RAF and PAK1, leads to a strongly increased proliferation, whereas substitution of serine 134 by alanine abolishes this process. Furthermore, we identified hBAD serine 134 to be strongly involved in survival signaling in B-RAF-V600E containing tumor cells and found phosphorylation of this residue to be crucial for efficient proliferation in these cells. Collectively, our findings provide new insights into the regulation of hBAD function by phosphorylation and its role in cancer signaling. N2 - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) ist ein pro-apoptotisches Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie und wird in Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren durch Phosphorylierung reguliert. Obwohl der Identifizierung von Phosphorylierungsstellen in murinem BAD (mBAD) in den vergangenen Jahren viel Aufmerksamkeit gewidmet wurde, ist die Phosphorylierung des humanen BAD (hBAD) Proteins kaum charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wird der quantitative Beitrag unterschiedlicher Kinasen in Bezug auf die Phosphorylierung der etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118 von hBAD dargestellt (Kapitel 3.1). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass RAF-Kinasen hBAD in vivo an diesen etablierten Stellen phosphorylieren. Die RAF-bedingte Phosphorylierung konnte nicht durch MEK-Inhibitoren beeinflusst werden, dagegen bewirkte die Gabe des RAF-Inhibitors Sorafenib (BAY 43-9006) eine Reduktion der Phosphorylierung auf das Niveau der Kontrollproben. Übereinstimmend konnte durch die Expression von aktiven RAF-Kinasen die BAD-induzierte Apoptose sowie die BAD-bedingte Inhibierung der Koloniebildung unterdrückt werden. Zusätzlich verwendeten wir Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie um die Auswirkungen der RAF-bedingten BAD-Phosphorylierung auf die Komplexbildung von hBAD mit 14-3-3-Proteinen und Bcl-XL zu analysieren. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von hBAD durch aktive RAF-Kinasen die Assoziierung von 14-3-3 begünstigt, wobei Phosphoserin 99 die Hauptbindungsstelle darstellt. Weiterhin gelang der Nachweis, dass hBAD in vitro Poren in Lipid-Doppelschicht-Membranen bilden kann. Wir wiesen nach, dass die Fähigkeit von hBAD Poren zu bilden phosphorylierungsabhängig ist und durch die Interaktion mit 14-3-3-Proteinen beeinflusst wird. Außerdem demonstrieren wir in dieser Arbeit, dass die BAD-Poren eine zylinderförmige Geometrie aufweisen und sowohl für Ionen als auch für ungeladene Moleküle mit einer Größe von bis zu 200 Da zugänglich sind (Kapitel 3.2). Da beide Lipid-Bindungsstellen (LBD1 und LBD2) am C-Terminus des hBAD lokalisiert sind, charakterisierten wir des Weiteren diesen Teil des Proteins in Hinblick auf seinen strukturellen Aufbau (Kapitel 3.3). Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass der hBAD-C-Terminus in wässriger Lösung eine geordnete β-Faltblattstruktur aufweist und bei Eintritt in eine Lipidumgebung helikale Elemente ausbildet. Zusätzlich zeigen wir in dieser Arbeit, dass die Interaktion des C-terminalen hBAD-Segments mit der BH3-Domäne zur Ausbildung von permanent offenen Poren führt, wobei die Phosphorylierung an Serin 118 eine Notwendigkeit für effektive Porenbildung darstellt. In Gegensatz dazu bewirkte die Phosphorylierung von Serin 99 in Kombination mit der Assoziierung von 14-3-3-Protein eine Inhibierung der Porenbildung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der C-terminale Teil von hBAD durch strukturelle Veränderungen, Lipidbindung und Phosphorylierung entscheidend die Funktion von hBAD reguliert. Mit Hilfe von Massenspektroskopie konnten wir im Rahmen dieser Arbeit, zusätzlich zu den etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118, einige neue in vivo Phosphorylierungsstellen von hBAD identifizieren (Serin 25, 32/34, 97, 124 und 134, Kapitel 3.1). Um die Regulierung der Funktion von hBAD weiter zu analysieren, untersuchten wir die Rolle dieser neu identifizierten Phosphorylierungsstellen in Bezug auf die BAD-induzierte Apoptose (Kapitel 3.4). Wir fanden heraus, dass im Gegensatz zu den N-terminalen Phosphorylierungsstellen, die Phosphorylierungsstellen am C-Terminus an der Apoptoseregulation mitwirken. Weiterhin weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass RAF-Kinasen, neben PAK1, an der Phosphorylierung von Serin 134 von hBAD beteiligt sind. Interessanterweise bewirkte die Co-Expression von RAF oder PAK1 mit dem wildtypischen hBAD eine erhebliche Verstärkung der Zellproliferation. Diese verstärkte Proliferation konnte durch einen Serin-zu-Alanin-Austausch in hBAD an der Stelle 134 vollständig verhindert werden. Weiterhin entdeckten wir, dass die Phosphorylierung dieser Stelle in B-RAF-V600E enthaltenden Tumorzellen bei der Regulation der Zellproliferation mitwirkt und für eine effiziente Proliferation entscheidend ist. Zusammenfassend gewähren unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Regulierung der Funktion von hBAD durch Phosphorylierung sowie in die Rolle von hBAD bei der Krebsentwicklung. KW - Krebs KW - Apoptosis KW - Bcl-2-Proteinfamilie KW - Raf KW - BH3-only proteins KW - BAD KW - cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56919 ER - TY - THES A1 - Schlipp [verh.: Wölfel], Angela T1 - Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with Förster resonance energy transfer microscopy T1 - Charakterisierung von anti-beta1-Adrenozeptor Antikörpern mittels Förster Resonanz Energie Transfer Mikroskopie N2 - Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. N2 - Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Beta-1-Rezeptor KW - Antikörper KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Adrenergic receptor KW - Beta-1-receptor KW - Antibodies KW - Fluorescence-resonance-energy-transfer KW - Dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162 ER - TY - THES A1 - Salvador, Ellaine Riciel P. T1 - Characterization of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Isolates: virulence traits and host-pathogen interactions T1 - Charakterisierung der Virulenzeigenschaften und Wirt-Pathogen-Interaktionen von asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolaten N2 - Urinary tract infection (UTI) is one of the most serious health problems worldwide. It accounts for a million hospital visits annually in the United States. Among the many uropathogenic bacteria, uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the most common causative agent of UTI. However, not all E. coli that inhabit the urinary tract can cause UTI. Some of them thrive for long periods of time in the urinary bladder without causing overt symptoms of infection. This carrier state is called asymptomatic bacteriuria (ABU). E. coli ABU isolates can live in the host without inducing host response due to deletions, insertions and point mutations in the genome leading to the attenuation of virulence genes. They therefore behave in the same way as commensals. Since bacteria that inhabit the urinary tract are said to originate from the lower intestinal tract and ABU behave in a similar way as commensals, this study compared various phenotypic and genotypic characteristics of ABU and commensal E. coli fecal isolates. The two groups did not show a strict clustering with regards to phylogenetic lineage since there appears to be overlaps in their distribution in some clonal complexes. In addition, it was observed that the UPEC virulence genes were more frequently inactivated in ABU than in fecal isolates. Hence, ABU tend to have less functional virulence traits compared to the fecal isolates. The ABU model organism E. coli 83972 which is known not only for its commensal behavior in the urinary bladder but its ability to outcompete other bacteria in the urinary tract is currently being used as prophylactic treatment in patients who have recurrent episodes of UTI at the University Hospital in Lund, Sweden. The pilot studies showed that upon deliberate long-term colonization of the patients with E. coli 83972, they become protected from symptomatic UTI. In this study, the phenotypic and genotypic characteristics of eight re-isolates taken from initially asymptomatically colonized patients enrolled in the deliberate colonization study who reported an episode of symptoms during the colonization period were investigated. Two out of the eight re-isolates were proven to be a result of super infection by another uropathogen. Six re-isolates, on the other hand, were E. coli 83972. The urine re-isolates confirmed to be E. coli 83972 were phenotypically heterogeneous in that they varied in colony size as well as in swarming motility. Four of these re-isolates were morphologically homogenous and similar to the parent isolate E. coli 83972 whereas one of them appeared phenotypically heterogenous as a mixture of smaller and normal-sized colonies. Still another re-isolate phenotypically resembled small colony variants. Meanwhile, three of the six re-isolates did not differ from the parent isolate with regards to motility. On the other hand, three exhibited a markedly increased motility compared to the parent isolate. Transcriptome analysis demonstrated the upregulation of a cascade of genes involved in flagellar expression and biosynthesis in one of the three motile re-isolates. However, upon further investigation, it was found out that the expression of flagella had no effect on bacterial adhesion to host cells in vitro as well as to the induction of host inflammatory markers. Thus, this implies that the increased motility in the re-isolates is used by the bacteria as a fitness factor for its benefit and not as a virulence factor. In addition, among the various deregulated genes, it was observed that gene regulation tends to be host-specific in that there is no common pattern as to which genes are deregulated in the re-isolates. Taken together, results of this study therefore suggest that the use of E. coli 83972 for prophylactic treatment of symptomatic UTI remains to be very promising. N2 - Harnwegsinfektionen (HWI) sind weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem, auf welches allein in den USA jährlich ca. eine Million Krankenhausbesuche entfallen. Innerhalb der Gruppe uropathogener Bakterien stellen die uropathogenen Escherichia coli (UPEC) die wichtigsten Verursacher akuter Harnwegserkrankungen dar. Interessanterweise führen nicht alle E. coli Varianten, die den Harnweg besiedeln, zwangsläufig zu HWI. Einige von ihnen sind in der Lage, die Harnblase über einen langen Zeitraum zu kolonisieren ohne Symptome einer HWI auszulösen. Dieses Phänomen wird als asymptomatische Bakteriurie (ABU) bezeichnet. Die Eigenschaft von E. coli ABU-Isolaten innerhalb des Wirtsorganismus leben zu können, ohne eine deutliche Wirtsabwehrreaktion hervorzurufen, ist unter anderem bedingt durch Deletionen, Insertionen und Punktmutationen im bakteriellen Genom und der daraus resultierenden Inaktivierung einiger Virulenzgene. Ihre Lebensweise ist daher mit der kommensaler Organismen vergleichbar. Da die den Harnweg besiedelnden Bakterien mit hoher Wahrscheinlichkeit ihren Ursprung im unteren Darmtrakt haben und sich die ABU-Isolate ähnlich der Kommensalen verhalten, wurden in dieser Arbeit zahlreiche phäno- und genotypische Charakteristika von ABU-Isolaten mit denen kommensaler E. coli-Fäkalisolate verglichen. Für diese beiden Gruppen konnte hinsichtlich ihrer phylogenetischen Abstammung keine strikte Clusterbildung festgestellt werden, da ihre Verteilung in einigen klonalen Komplexen Überlappungen aufwies. Es zeigte sich jedoch, dass die UPEC-Virulenzgene in den ABU-Isolaten häufiger inaktiviert vorlagen als in den Fäkalisolaten. Demzufolge scheinen die ABU-Isolate weniger funktionale Virulenzeigenschaften zu besitzen als die Fäkalisolate. Der Modell-ABU Stamm E. coli 83972 ist sowohl für sein kommensales Verhalten in der menschlichen Blase bekannt, als auch für seine Fähigkeit, andere Bakterien aus dem Harntrakt zu verdrängen. Er wird gegenwärtig am Universitätsklinikum in Lund (Schweden) als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von Patienten mit rezidivierenden HWI eingesetzt. In Pilotstudien konnte gezeigt werden, dass eine vorsätzliche Langzeit-Kolonisierung von Patienten mit E. coli 83972 zum Schutz vor symptomatischen HWI führt. In der vorliegenden Arbeit wurden die phäno- und genotypischen Charakteristika von acht Patienten-Reisolaten dieser Langzeitstudie untersucht. Die Reisolate wurden aus zunächst asymptomatisch kolonisierten Patienten isoliert, die allerdings im Verlauf der Langzeit-Kolonisierung über eine Reihe von Symptomen klagten. Zwei dieser acht Reisolate waren nachweislich das Resultat einer Superinfektion mit einem anderen uropathogenen Bakterium. Die restlichen sechs Reisolate konnten jedoch als E. coli 83972 identifiziert werden. Für diese sechs Reisolate war eine phänotypische Heterogenität zu beobachten, die sich zum einen in variierender Koloniegröße, zum anderen in unterschiedlichem Schwärmverhalten zeigte: Vier der Reisolate entsprachen morphologisch dem Ausgangsstamm E. coli 83972, wohingegen ein Reisolat phänotypisch abweichend als Mischung von kleineren und normal-großen Kolonien in Erscheinung trat. Ein weiteres Reisolat ähnelte phänotypisch sogenannten „Small Colony Variants“. Das Schwärmverhalten betreffend unterschieden sich indessen drei der sechs Reisolate vom Ausgangsstamm. Sie zeigten im Vergleich eine erhöhte Motilität. In einem dieser drei motilen Reisolate konnte mittels Transkriptomanalyse die hochregulierte Expression einer Reihe von Genen, welche für die Flagellenexpression und -biosynthese verantwortlich sind, aufgezeigt werden. Weiterführende in vitro-Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese erhöhte Flagellenexpression weder einen verstärkenden Effekt auf die bakterielle Adhäsion an die Wirtszellen hat, noch in der Wirtszelle die Bildung von Entzündungsmarkern induziert. Dieses Ergebnis impliziert, dass die erhöhte Motilität der Reisolate als Fitnessfaktor und nicht als Virulenzfaktor zu betrachten ist. Ferner führte die genauere Analyse der deregulierten Gene zu der Annahme, dass die Genregulation in den Reisolaten wirtsspezifisch ist, da sich kein übereinstimmendes Muster bezüglich der Deregulation abzeichnete. Unter Berücksichtigung aller Ergebnisse dieser Studie lässt sich abschließend sagen, dass die Verwendung des E. coli Stammes 83972 als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von symptomatischen HWI weiterhin als sehr vielversprechend angesehen werden kann. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Virulenz KW - Escherichia coli KW - Urinary tract infection KW - asymptomatic bacteriuria Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71283 ER - TY - THES A1 - Eschbach, Claire T1 - Classical and operant learning in the larvae of Drosophila melanogaster T1 - Klassiches und operantes Lernen bei Larven der Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit studiere ich einige psychologische Aspekte im Verhalten der Drosophila, insbesondere von Drosophila Larven. Nach einer Einleitung, in der ich den wissenschaftlichen Kontext darstelle und die Mechanismen der olfaktorischen Wahrnehmung sowie des klassichen und operanten Lernens beschreibe, stelle ich die verschiedenen Experimente meiner Doktorarbeit vor. Wahrnehmung Das zweite Kapitel behandelt die Art, in der adulte Drosophila zwischen Einzeldüften und Duftgemischen generaliseren. Ich habe gefunden, daß die Fliegen eine Mischung aus zwei Düften als gleich verschieden von ihren beiden Elementen wahrnehmen; und daß die Intensität sowie die chemisch-physikalische Natur der Elemente das Ausmass der Generalisierung zwischen der Mischung und ihren beiden Elementen beeinflusst. Diese Entdeckungen sollten für die weitere Forschung anregend sein, wie zum Beispiel zum functional imaging. Gedächtnis Das dritte Kapitel stellt die Etablierung eines neuen Protokolls zur klassischen Konditionierung bei Drosophila Larven dar. Es handelt sich um Experimente, bei denen ein Duft mit einer mechanischen Störung als Strafreiz verknüpft wird. Das Protokoll wird einen Vergleich zwischen zwei Arten vom aversiven Gedächtnissen (Geschmack vs. mechanische Störung als Strafreize) ermöglichen, einschliesslich eines Vergleiches ihrer neurogenetischen Grundlagen; zudem kann nun geforscht werden, ob die jeweiligen Gedächtnisse spezifisch für die Art des verwendeten Strafreizes sind. Selbstgestaltung Das vierte Kapitel umfasst unsere Versuche, operantes Gedächtnis bei Drosophila Larven zu beobachten. Zumindest für die unmittelbar ersten Momente des Tests konnte ich zeigen, dass die Larven ihr Verhalten entsprechend dem Training ausrichten. Dieses Gedächtnis scheint jedoch im Laufe des Tests schnell zu verschwinden. Es ist daher geraten, diese Ergebnisse über operantes Lernen zu wiederholen, eventuell das experimentelle Protokoll zu verbessern, um so eine systematische Analyse der Bedingungen und Mechanismen für das operante Lernen bei der Drosophila Larve zu erlauben. Im fünften Kapitel verwende ich die im Rahmen des vierten Kapitels entwickelten Methoden für eine Analyse der Fortbewegung der Larven. Ich habe insbesondere die Wirkung des pflanzlichen ‚cognitive enhancers’ Rhodiola rosea untersucht, sowie die Auswirkungen von Mutationen in den Genen, welche für Synapsin und SAP47 kodieren; schliesslich habe ich getestet, ob die Geschmacksqualität der Testsituation lokomotorische Parameter verändert. Diese Dissertation erbringt also eine Reihe neuer Aspekte zur Psychologie der Drosophila und wird hoffentlich in diesem Bereich der Forschung neue Wege öffnen. N2 - In this thesis I studied psychological aspects in the behaviour of Drosophila, and especially Drosophila larvae. After an introduction where I present the general scientific context and describe the mechanisms of olfactory perception as well as of classical and operant conditioning, I present the different experiments that I realised during my PhD. Perception The second chapter deals with the way adult Drosophila generalise between single odours and binary mixtures of odours. I found that flies perceive a mixture of two odours as equally similar to the two elements composing it; and that the intensity as well as the physico-chemical nature of the elements composing a mixture affect the degree of generalisation between this mixture and one of its elements. These findings now call for further investigation on the physiological level, using functional imaging. Memory The third chapter presents a series of experiments in Drosophila larvae in order to define some characteristics of a new protocol for classical aversive learning which involves associating odours with mechanical disturbance as a punishment. The protocol and the first results should open new doors for the study of classical conditioning in Drosophila larvae, by allowing the comparison between two types of aversive memory (gustatory vs. mechanical reinforcement), including a comparison of their neurogenetic bases. It will also allow enquiries into the question whether these respective memories are specific for the kind of reinforcer used. Agency The fourth chapter documents our attempts to establish operant memory in Drosophila larvae. By analysing the first moments of the test, I could reveal that the larvae modified their behaviour according to their previous operant training. However, this memory seems to be quickly extinguished during the course of the test. We now aim at repeating these results and improving the protocol, in order to be able to systematically study the mechanisms allowing and underlying operant learning in Drosophila larvae. In the fifth chapter, I use the methods developed in chapter four for an analysis of larval locomotion. I determine whether larval locomotion in terms of speed or angular speed is affected by a treatment with the “cognitive enhancer” Rhodiola rosea, or by mutations in the Synapsin or SAP47 genes which are involved in the formation of olfactory memory. I also characterize the modifications induced by the presence of gustatory stimuli in the substrate on which the larvae are crawling. This thesis thus brings new elements to the current knowledge of Drosophila KW - Lernen KW - Taufliege KW - Neurobiologie KW - Drosophila KW - learning KW - Drosophila KW - neurobiology KW - behaviour Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70583 ER - TY - THES A1 - Gerold, Kay T1 - CTLA4 and CLEC16A in Type 1 Diabetes - Looking behind the association T1 - CTLA4 und CLEC16A in Typ 1 Diabetes - Ein Blick hinter die Assoziation N2 - Type 1 diabetes is an autoimmune disease that leads to the destruction of insulin-producing pancreatic beta cells and consequently to hyperglycemia. In the last 60 years, the prevalence of type 1 diabetes has been increasing constantly and is predicted to continue rising. About 80% of the disease risk is attributable to the genetic variation. Thanks to genome wide association studies the number of known disease-associated polymorphisms climbed from five to 53 in the last 10 years. As these studies reveal possible candidate genes but not underlying mechanisms we strove to take the next step and explore the association of two genes suggested by these studies with type 1 diabetes. As a method of choice we decided to use lentiviral RNAi in non obese diabetic (NOD) mice, a widely-used model for type 1 diabetes, introducing a shRNA directed against the target message into the genome of this mouse strain via a lentivirus. This allowed us to study the partial loss-of-function of the target gene within the context of diabetes, directly seeing its effect on autoimmune mechanisms. In this thesis we examined two different genes in this manner, Ctla4 and Clec16a. A type 1 diabetes associated polymorphism in the CTLA4 gene had been found to alter the splicing ratio of its variants soluble CTLA-4 (sCTLA-4) and full length CTLA-4, the associated allele producing less sCTLA-4 than the protective allele. We mimicked this effect by specifically targeting the sCtla4 mRNA via lentiviral RNAi in the NOD model. As a result we could confirm the reduction of sCTLA-4 to accelerate type 1 diabetes development. Furthermore we could show a function of sCTLA-4 in regulatory T cells, more specifically at least partly in their ability to modulate costimulation by antigen presenting cells. The second candidate gene, Clec16a was targeted with the shRNA in a way that was designed to knock down most splice variants. As the gene function and the effect of the associated SUMMARY 10 polymorphism was unknown, we reasoned this method to be feasible to investigate its role in type 1 diabetes. The knockdown of Clec16a in NOD mice resulted in an almost complete protection from diabetes development that could be attributed to T cells dysfunction. However, as expression patterns and a study of the Drospophila orthologue suggested a possible role of CLEC16A in antigen presentation we also examined antigen presenting cells in the thymus and periphery. Although we did not detect any effect of the knockdown on peripheral antigen presenting cells, thymic epithelial cells were clearly affected by the loss of CLEC16A, rendering them more activated and shifting the ratio of cortical to medullary epithelial cells in favor of cortical cells. We therefore suggest a role of CLEC16A in the selection of T cells, that needs, however, to be further investigated. In this thesis we provided a feasible and fast method to study function of genes and even of single splice variants within the NOD mouse model. We demonstrate its usefulness on two candidate genes associated with type 1 diabetes by confirming and unraveling the cause of their connection to the disease. N2 - Typ 1 Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, bei der es zur Zerstörung von pankreatischen beta-Zellen und daraus folgend zu einer Hyperglykämie kommt. In den letzten 60 Jahren stieg die Diabetes Prävalenz stetig an und Studien sagen voraus, dass sich dieser Trend in Zukunft noch stärker fortsetzen wird. Man geht davon aus, dass ca. 80% des Erkrankungsrisikos für autoimmunen Diabetes genetischer Natur sind. Dank Genom-weiter Assoziationsstudien wurde dieser Beitrag gerade in den letzten zehn Jahren immer weiter aufgeklärt und bis heute wurden 53 mit Typ 1 Diabetes assozierte Polymorphismen identifiziert. Da diese Studien es nur leisten können, mögliche Kandidatengene aufzuzeigen, allerdings keine Aussagen über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen machen können, haben wir es uns zum Ziel gesetzt diesen nächsten Schritt zu gehen und zwei der durch diese Studien vorgeschlagenen Gene auf ihre Rolle in der Typ 1 Diabetes Ätiologie zu untersuchen. Unsere Methode der Wahl war die lentivirale RNA Interferenz im Mausmodell der nonobese diabetic mouse (NOD). Via lentiviralen Vektoren wird die Information für eine shRNA, die an die mRNA des Zielgenes bindet, in das Empfängergenom integriert. Die daraus folgende Herabregulierung der Ziel-mRNA erlaubt es uns den Effekt dieser fehlenden Geninformation auf die Immunregulation zu analysieren. Auf diese Weise wurden in dieser Thesis zwei Kandidatengene untersucht, Ctla4 und Clec16a. Der mit Typ 1 Diabetes assoziierte Polymorphismus im CTLA4 Gen verursacht eine Verschiebung im Splice Verhältnis der beiden Isoformen im Menschen, soluble CTLA-4 (sCTLA-4) und full length CTLA-4, zu Gunsten der full length Variante. Im NOD Mausmodell konnte diese Verschiebung durch eine Einführung einer gegen sCtla4 gerichteten shRNA nachgeahmt werden. In Folge dessen konnten wir bestätigen, dass eine eduzierung der sCTLA-4 Variante die Typ 1 Diabetes Entwicklung beschleunigt. Zudem ZUSAMMENFASSUNG 12 konnten wir eine Rolle von sCTLA-4 in der Funktion von regulatorischen T Zellen, genauer in deren Fähigkeit die Kostimulation durch Antigen präsentierenden Zellen zu modulieren, zeigen. Bei dem zweiten Gen, das in dieser Thesis untersucht wurde handelte sich um Clec16a. Es wurde von einer shRNA herunterreguliert, die den Großteil der Varianten abdeckt, da die Funktion des Genes, sowie die Auswirkungen des assoziierten Polymorphismus unbekannt waren. Der Knockdown von Clec16a in der NOD Maus verursachte einen fast vollständigen Schutz vor Diabetes, der im weiteren Verlauf den T Zellen zugerechnet werden konnte. Allerdings hatten das Expressionsmuster, sowie eine Studie am Drosophila Ortholog ema eine Rolle von CLEC16A in Antigen präsentierenden Zellen impliziert. Folglich untersuchten wir die Möglichkeit, dass diese Zellgruppe in der Peripherie oder im Thymus durch den CLEC16A Mangel beeinträchtigt sein könnten. Tatsächlich wies die Zellgruppe, die im Thymus für die Selektion von T Zellen zuständig ist einen erhöhten Aktivierungsstatus auf, was auf eine modifizierte T Zell Selektion hindeuten könnte. Mit dieser Arbeit konnten wir eine praktikable und schnelle Methode, für die funktionelle Analyse von Genen und sogar einzelnen Splice Varianten, aufzeigen. Wir konnten ihren Nutzen weiterhin an zwei mit Typ 1 Diabetes assoziierten Kandidatengenen unter Beweis stellen, indem wir so die Assoziation bestätigen und Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen werfen konnten. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - Molekulargenetik KW - Type 1 Diabetes Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66617 ER - TY - THES A1 - Pletinckx, Katrien T1 - Dendritic cell maturation and instruction of CD4+ T cell tolerance in vitro T1 - Reifung der dendritischen Zelle und Instruktion der CD4+ T Zell Toleranz in vitro N2 - Effective T cell immunity was believed to occur by mature DC, whereas tolerogenicity was attributed strictly to immature DC phenotypes. However, intermediate DC maturation stages were identified conditioned by inflammatory mediators like TNF. Furthermore, the T cell tolerance mechanisms are dependent on distinct modes and intensities of co-stimulation. Therefore, in this study it was addressed how distinct DC maturation signatures instruct CD4+ T cell tolerance mechanisms. DC acquire antigens from apoptotic cells for self-peptide-MHC presentation and functionally adapt presumed tolerogenic DC phenotypes. Here, immature murine bone-marrow derived DC representing both inflammatory and conventional DC subsets adapted a maturationresistant DC signature upon apoptotic cell recognition but no additional tolerogenic features. Immature DC instruct CD4+ FoxP3+ regulatory T cells in a TGF-β prone micro-environment or generate anergic CD4+ T cells hampered in the TCR-induced proliferation and IL-2 secretion. Secondary stimulation of such anergic CD4+ T cells by immature DC increased primarily IL-10 production and conferred regulatory function. These IL-10+ regulatory T cells expressed high levels of CTLA-4, which is potently induced by immature DC in particular. Data in this work showed that anergic T cells can be re-programmed to become IL-10+ regulatory T cells upon ligation of CTLA-4 and CD28 signalling cascades by B7 costimulatory ligands on immature DC. In contrast, semi-mature DC phenotypes conditioned by the inflammatory mediator TNF prevented autoimmune disorders by induction of IL-10+ Th2 responses as demonstrated previously. Here, it was shown that TNF as an endogenous maturation stimulus and pathogenic Trypanosoma brucei variant-specific surface glycoproteins (VSG) induced highly similar DC gene expression signatures which instructed default effector Th2 responses. Repetitive administration of the differentially conditioned semi-mature DC effectively skewed T cell immunity to IL-10+ Th2 cells, mediating immune deviation and suppression. Collectively, the data presented in this work provide novel insights how immature and partially mature DC phenotypes generate T cell tolerance mechanisms in vitro, which has important implications for the design of effective DC-targeted vaccines. Unravelling the DC maturation signatures is central to the long-standing quest to break tolerance mimicked by malignant tumours or re-establish immune homeostasis in allergic or autoimmune disorders. N2 - Reife DC sind potente Induktoren von T Zell Immunität, wogegen unreife DC Stadien zur Induktion von Immuntoleranz befähigt sind. Zudem sind intermediäre semireife DC Entwicklungsstadien identifiziert worden, wie sie nach Behandlung mit inflammatorischen TNF entstehen. Die bekannten T Zell Toleranzmechanismen sind wiederum abhängig von unterschiedlicher Art und Intensität von Kostimulation. Hier wurde deshalb untersucht wie verschiedene DC Reifungsstadien CD4+ T Zelltoleranz induzieren können. DC nehmen apoptotisches Zellmaterial auf, was als Antigenquelle zur Präsentation von MHC/Selbstpeptid-Komplexen genutzt wird und tolerogene Funktionen in DC hervorrufen kann. Unsere Ergebnisse zeigten dass aus Knochenmark generierte DC der Maus, die sowohl inflammatorische als auch klassische DC Subtypen darstellen, nach Erkennung apoptotischen Zellmaterials reifungsresistent wurden, jedoch unverändert unreif und keine neuen tolerogenen Funktionen erwarben. Unreife DC induzierten in Gegenwart von TGF-β CD4+ FoxP3+ regulatorische T Zellen und in dessen Abwesenheit anergische CD4+ T Zellen. Wiederholte Stimulation anergischer CD4+ T Zellen durch unreife DC, induzierte deren IL-10 Produktion und regulatorische Eigenschaften. Diese IL-10+ regulatorischen T Zellen zeigten keine FoxP3 Expression, jedoch verstärkt CTLA-4, insbesondere nach Interaktion mit unreifen DC. Zusammen zeigten die hier erhaltenen Daten, dass das Reprogrammieren anergischer T Zellen zu IL-10+ regulatorischen T Zellen über CTLA-4 als auch über CD28 Signalkaskaden durch deren B7 Liganden auf der Zelloberfläche unreifer DC gesteuert wird. Frühere Arbeiten zeigten, dass repetitive Injektion semireifer DC, Autoimmunerkrankungen vorbeugen konnten durch die Induktion IL-10+ Th2 Antworten. Hier konnte gezeigt werden dass TNF als endogener Reifungsstimulus sowie pathogene T. brucei Varianten-spezifische Glykoproteine (VSG) sehr ähnliche semireife DC Reifungsqualitäten hervorrufen. Die entsprechend generierten Th2 Effektor Zellen unterschieden sich lediglich geringfügig in deren Zytokinproduktion. Repetitive Injektionen dieser semireifen DC induzierten ebenfalls IL-10+ Th2 Differenzierung und effektive Immundeviation in vivo. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit wichtige Erkenntnisse ergeben, wie unreife und semireife DC die Generierung unterschiedlicher T Zell Toleranzmechanismen in vitro unterstützen. Diese Erkenntnisse sind ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung effektiver DC-basierter Immunvakzinen. Die Definition der verschiedenen DC Reifungsstadien ist von großer Bedeutung bei der Optimierung von Behandlungsverfahren gegen infektiöse Erreger, Krebs oder Autoimmunerkrankungen. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Toleranz KW - Dendritic cell KW - tolerance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67375 ER - TY - THES A1 - Gassert, Evelyn T1 - Die Bedeutung von Ceramiden für die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung T1 - Impact of ceramide accumulation on T lymphocyte cytoskeletal reorganisation,immune synapse formation and activation N2 - Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zelluläre Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden für die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adhärenz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeinträchtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilität ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberflächenmolekülen und intrazellulärer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gestört. Überdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabhängige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandomänen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalität der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeinträchtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschränkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfläche mit DCs zu translozieren. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen möglichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeinträchtigen. N2 - Ceramides are sphingolipids regulating various signalling pathways mainly associated with the induction of apoptosis and cell cycle arrest. Besides their established role in these processes several lines of evidence suggest that ceramides also regulate cytoskeletal dynamics in non-hematopoietic cells, but their role in T lymphocyte function has not yet been addressed. In this study we show that accumulation of membrane ceramides affects several processes required for accurate T cell function. Treatment of T cells with bSMase or exogenously added ceramides interfered with T cell adhesion to FN and ICAM-1 as well as T cell polarisation, chemotaxis and motility in response to SDF-1. In line with the impairment to morphologically polarise, relocation of surface receptors as well as intracellular signalling molecules was also impaired upon ceramide treatment of T cells. Moreover, increase in cellular ceramide levels interfered with cellular signalling pathways as revealed by reduced phosphorylation levels of Akt and ERM proteins. T cell activation requires the formation of an IS with DCs. In this study we could show, that ceramides, although excluded from the DC/T cell interface, do not interfere with conjugate frequency or synapse organisation, since a normal distribution of CD3 and the MTOC was observed. Nevertheless, ceramide generation interfered with the translocation of Orai1 and Stim1 to the interface and in line with this observation a reduced calcium-influx in T cells was detected upon bSMase exposure. In addition to the decrease in cytosolic calcium levels ceramides also reduced the ability of T cells to proliferate in response to CD3/CD28 stimulation. Therefore the induction of ceramides by certain pathogens, including MV, might be a possible mechanism to interfere with essential processes required for T cell activation. KW - Ceramide KW - T-Lymphozyt KW - T-Zell-Aktivierung KW - Zytoskelettreorganisation KW - immunologische Synapse KW - Masernvirus KW - ceramide KW - T cell activation KW - cytoskeletal reorganisation KW - immunological synapse KW - measles virus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123 ER - TY - THES A1 - Frey, Monika T1 - Effects and mechanisms of a putative human pheromone T1 - Effekte und Mechanismen eines putativen menschlichen Pheromons N2 - There is evidence that pheromones are communicative signals in animals. However, the existence and function of human pheromones are still under discussion. During the last years several substances have been labeled as putative human pheromones and especially 4,16–androstadien-3-one (androstadienone), found in male and female sweat, became subject of intense investigation. In contrast to common odors androstadienone presumably modulates human physiological and psychological reactions. Data suggest that androstadienone might influence the processing of visual cues, specifically faces or affective stimuli, via projections from the fusiform gyrus and the amygdala. Moreover, attentional processes may be modulated, which is supported by explicit and implicit behavioral data. This thesis includes three experimental studies examining effects of androstadienone exposure on behavioral and cortical reactions to visual and emotional stimuli. The main hypotheses were that androstadienone might influence human behavior to and perception of visual cues. The first study sought to clarify androstadienone effects on attention-related reactions as well as on behavioral tendencies. Motoric approach-avoidance reactions in response to happy and angry facial expressions were investigated in 30 women and 32 men. Participants either inhaled androstadienone or a control solution, without knowing the real content, while performing the following task: they had to push away or to pull towards them a joystick as fast as possible in reaction to either an angry or a happy cartoon face, which was presented on a computer screen. Results showed that androstadienone modulated the participant´s task performance by accelerating the reaction speed compared to the control compound. Faster reactions were observed particularly when reacting to angry faces but not when reacting to happy faces. This might be explained by the finding that human body odors, the source of androstadienone, were found to activate the human fear system, i.e. modulating fear-related attentional processes. Therefore, the quicker reaction towards angry faces with exposure to androstadienone could be due to an enhanced allocation of attentional resources towards fear-related cues like angry faces. Results also showed that androstadienone enhanced men´s approach tendency towards faces independent of emotional expressions. This observation might be explained by androstadienone´s former shown ability to improve attractiveness ratings of other persons. In this regard, the endogenous odor might enhance evaluations of faces in men and, thus, might improve their willingness to approach social stimuli. In contrast to men, women already showed in the control condition higher approach tendency towards faces. Therefore, androstadienone might rather maintain than enhance the approach score in women. In the second study event-related brain potentials (ERPs) triggered by social and non-social visual stimuli were investigated by means of electroencephalography. In a double-blind between-subjects design 51 women participated. Twenty-eight women inhaled androstadienone, whereas 23 women inhaled a control solution. Four different picture categories, i.e. real faces, pictures with couples, pictures with social and non-social scenes, each including three different valence categories, i.e. positive, negative and neutral, should clarify the stimulus type or context androstadienone is acting on. The androstadienone compared to the control odor did not influence brain responses significantly. Explorative analyses, however, suggested that androstadienone influences the processing of faces. While in the control group angry faces elicited larger P300 amplitudes than happy faces, the androstadienone group showed similar P300 amplitudes concerning all emotional expressions. This observation tentatively indicates that the endogenous odor might indeed affect the neuronal responses to emotional facial stimuli, especially late components reflecting evaluative processes. However, this observation has to be verified and further investigated, in particular whether androstadienone caused reduced responses to angry faces or enhanced responses to happy faces. The third study investigated androstadienone effects on face processing especially in men. ERPs elicited by happy, angry and neutral cartoon faces, which were presented on a computer screen, were measured while 16 men, not knowing the applicated odor, inhaled either androstadienone or a control solution. Exposure to androstadienone significantly increased later neuronal responses, the P300 amplitude. This belated component of the ERP reflects attention allocation and evaluative processes towards important stimuli. Therefore, androstadienone might facilitate central nervous face processing by enhancing attention towards these stimuli. In sum, the current results corroborate the notion of androstadienone as an active social chemosignal. In minute amounts and not detectable as an odor it influenced cortical and motoric reactions. Therefore, it might be concluded that androstadienone indeed affects cognitive functions like attentional processes and in turn affects our behavior. The current results further support the notion that androstadienone acts like a human modulator pheromone, namely modulating ongoing behavior or a psychological reaction to a particular context, changing stimulus sensitivity, salience and sensory-motor integration. However, these conclusions remain tentative until further replication takes place, best in ecologically valid environments. Furthermore, one has to keep in mind that the current studies could not replicate several previous findings and could not verify some hypotheses assuming communicative effects of androstadienone. Thus, the main assumption of this thesis that androstadienone is an active chemosignal is still challenged. Also, whether the term “pheromone” is indeed suitable to label androstadienone remains open. N2 - Pheromone sind als Kommunikationssubstanzen im Tierreich unabkömmlich. Ob jedoch menschliche Pheromone tatsächlich existieren, wird noch immer diskutiert. Während der letzten Jahre wurden mehrere Substanzen als putative menschliche Pheromone bezeichnet. Unter diesen wurde v.a. 4,16–androstadien-3-on (Androstadienon), eine Komponente des männlichen und weiblichen Schweißes, intensiv untersucht. Bisherige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Androstadienon im Gegensatz zu herkömmlichen Duftstoffen die Verarbeitung visueller Stimuli, v.a. von Gesichtern und von affektiven Stimuli, vermutlich über eine Modulation der Aktivität des Gyrus fusiformis und der Amygdala beeinflussen kann. Außerdem könnten Aufmerksamkeitsprozesse durch Androstadienon beeinflusst sein, was durch explizite und implizite Verhaltensdaten angedeutet wird. Diese Doktorarbeit untersuchte in drei verschiedenen Studien die Effekte von Androstadienon auf kortikale Reaktionen und Verhalten bei Männern und Frauen, während diese mit visuellen, insbesondere emotionalen Stimuli konfrontiert wurden. Die Haupthypothesen waren, dass Androstadienon die Wahrnehmung visueller Stimuli und menschliches Verhalten gegenüber diesen beeinflussen könnte. Die erste Studie untersuchte Androstadienoneffekte auf aufmerksamkeitsabhängige, motorische Reaktionen sowie auf Verhaltenstendenzen. Motorisches Annäherungs- und Vermeidungsverhalten als Reaktion auf freudige und ärgerliche Gesichter wurden bei 30 Frauen und 32 Männern untersucht. Während diese entweder Androstadienon oder einen Kontrollduft inhalierten, ohne zu wissen welchen, mussten sie so schnell wie möglich einen Joystick jeweils wegdrücken oder zu sich heranziehen, sobald entweder ein freudiges oder ärgerliches Gesicht auf einem Computerbildschirm erschien. Im Vergleich zum Kontrollduft beschleunigte Androstadienon die Reaktionsgeschwindigkeit spezifisch auf ärgerliche Gesichter unabhängig von der Bewegungsrichtung. Dies könnte damit zusammenhängen, dass menschlicher Körpergeruch, die Quelle von Androstadienon, das Angstsystem im menschlichen Gehirn aktiviert. Die schnellere Reaktion auf ärgerliche Gesichter durch den endogenen Geruch könnte dementsprechend auf eine erhöhte Bereitstellung von Aufmerksamkeitsressourcen für angstverwandte Stimuli, wie ärgerliche Gesichter, zurückzuführen sein. Zusätzlich zeigten die Ergebnisse, dass Androstadienon unabhängig vom Emotionsausdruck die Annäherungstendenz bei Männern zu den Gesichtern erhöht. Diese Beobachtung könnte durch die in einer früheren Studie gezeigte Eigenschaft von Androstadienon, die Attraktivitätsbewertungen anderer Personen zu erhöhen, erklärt werden. Demnach könnte der endogene Duftstoff bei Männern die Bewertung von Gesichtern verbessern und folglich die Bereitschaft, sich sozialen Stimuli anzunähern, erhöhen. Im Gegensatz zu Männern zeigten Frauen schon in der Kontrollbedingung eine stärkere Annäherungstendenz zu Gesichtern. Folglich könnte Androstadienon diese verstärkte Tendenz bei Frauen eher aufrechterhalten als verstärken. In der zweiten Studie wurden kortikale Reaktionen, d.h. ereigniskorrelierte Gehirnpotentiale (EKPs), auf soziale und nicht-soziale visuelle Bilder bei 28 Frauen, die Androstadienon rochen, und bei 23 Frauen die einem Kontrollduft ausgesetzt waren, mit Elektroenzephalographie untersucht. Allen Teilnehmerinnen war der Inhalt des applizierten Duftstoffes nicht bewusst. Vier verschiedene Bildkategorien, d.h. echte Gesichter, Bilder mit Paaren, Bilder mit Gruppen von Menschen und Bilder ohne Personen, mit jeweils positiver, negativer und neutraler Valenz wurden verwendet, um den Wirkkontext von Androstadienon zu klären. Androstadienon beeinflusste die Hirnreaktionen auf diese Stimuli nicht signifikant. Explorative Analysen deuteten aber an, dass Androstadienon die späte EKP Komponente, P300, beeinflussen kann. Während in der Kontrollgruppe ärgerliche Gesichter größere P300 Amplituden auslösten als freudige Gesichter, erzeugten in der Androstadienongruppe alle emotionalen Ausdrücke ähnliche P300 Amplituden. Dies könnte andeuten, dass Androstadienon attentive oder evaluative Prozesse bei der Gesichtsverarbeitung beeinflusst, was aber durch weitere Studien bestätigt und präzisiert werden muss. Die dritte Studie untersuchte Androstadienoneffekte auf zentralnervöse Prozesse der Gesichtsverarbeitung von Männern. EKPs auf freudige, ärgerliche und neutrale Cartoongesichter wurden aufgezeichnet, während 16 Männer entweder Androstadienon oder den Kontrollduft inhalierten, ohne jeweils zu wissen welchen. Androstadienon verstärkte eine späte neuronale Reaktion, die P300 Komponente, auf alle Gesichter signifikant. Diese Komponente des ereigniskorrelierten Potenzials spiegelt die Bereitstellung von Aufmerksamkeit auf wichtige Stimuli wider. Androstadienon könnte folglich die zentralnervöse Verarbeitung von Gesichtern erleichtern, indem es Aufmerksamkeit auf diese Stimuli lenkt. Zusammenfassend stützen die genannten Ergebnisse die Annahme, dass Androstadienon ein aktives soziales Chemosignal ist. In winzigen, bewusst nicht wahrnehmbaren Mengen beeinflusste es kortikale und motorische Reaktionen. Demzufolge scheint Androstadienon tatsächlich auf kognitive Funktionen wie Aufmerksamkeit zu wirken und deshalb unser Verhalten beeinflussen zu können. Die aktuellen Ergebnisse unterstützen auch die Annahme, dass Androstadienon ein menschliches Modulatorpheromon ist, das in einem speziellen Kontext unser Verhalten und eine psychologische Reaktion moduliert und Stimulussensitivität und die Sensor-Motor-Integration ändert. Dennoch müssen diese Interpretationen als vorläufig betrachtet werden bis die dargestellten Ergebnisse auch unter ökologisch validen Bedingungen repliziert werden konnten. Außerdem muss berücksichtigt werden, dass in dieser Doktorarbeit einige frühere Ergebnisse und einige Hypothesen bezüglich kommunikativer Effekte von Androstadienone nicht bestätigt werden konnten. Deshalb kann die Annahme, dass Androstadienon ein aktives Chemosignal ist, immer noch in Frage gestellt werden. Auch ob Androstadienon tatsächlich als menschliches Pheromon bezeichnet werden sollte bleibt offen. KW - Pheromon KW - Aufmerksamkeit KW - Mensch KW - Androstadienon KW - ereigniskorreliertes Potential KW - Antwortverhalten KW - Geruchssinn KW - androstadienone KW - humans KW - olfaction KW - pheromone KW - behavior KW - attention Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72292 ER - TY - THES A1 - Simon, Christian Marc T1 - Effects of the neurotrophic factors CNTF and IGF-1 in mouse models for spinal muscular atrophy and diabetic neuropathy T1 - Effekte der neurotrophen Faktoren CNTF und IGF-1 in Mausmodellen für spinale Muskelatrophie und diabetische Neuropathie N2 - In this study I investigate the role of Schwann cell and axon-derived trophic signals as modifiers of axonal integrity and sprouting in motoneuron disease and diabetic neuropathy (DNP). The first part of this thesis focuses on the role of the Schwann-cell-derived ciliary neurotrophic factor (CNTF) for compensatory sprouting in a mouse model for mild spinal muscular atrophy (SMA). In the second part, the role of the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and its binding protein 5 (IGFBP-5) is examined in the peripheral nerves of patients with DNP and in two corresponding mouse models. Proximal SMA is caused by homozygous loss or mutation of the SMN1 gene on human chromosome 5. The different forms of SMA can be divided into four groups, depending on the levels of SMN protein produced from a second SMN gene (SMN2) and the severity of the disease. Patients with milder forms of the disease, type III and type IV SMA, normally reach adulthood and regularly show enlargement of motor units, signifying the reinnervation of denervated muscle fibers. However, the underlying mechanisms are not understood. Smn+/- mice, a model of type III/IV SMA, are phenotypically normal, but they reveal progressive loss of motor neurons and denervation of motor endplates starting at 4 weeks of age. The progressive loss of spinal motor neurons reaches 50% at 12 months but muscle strength is not reduced. The first evidence for axonal sprouting as a compensatory mechanism in these animals was the more than 2-fold increase in amplitude of single motor unit action potentials (SMUAP) in the gastrocnemius muscle. Confocal analysis confirmed pronounced sprouting of innervating motor axons. As CNTF is highly expressed in Schwann cells and known to be involved in sprouting, its role for this compensatory sprouting response and the maintenance of muscle strength in Smn+/- mice was investigated. Deletion of CNTF in this mouse model results in reduced sprouting and decline of muscle strength in Smn+/- Cntf-/- mice. These findings indicate that CNTF is necessary for a sprouting response and thus enhances the size of motor units in skeletal muscles of Smn+/- mice. DNP afflicting motor and sensory nerve fibers is a major complication in diabetes mellitus. The underlying cellular mechanisms of motor axon degeneration are poorly understood. IGFBP-5, an inhibitory binding protein for IGF-1, is highly upregulated in peripheral nerves in patients with DNP. The study investigates the pathogenic relevance of this finding in transgenic mice overexpressing IGFBP-5 in motor axons. These mice develop motor axonopathy similar to that seen in DNP. Motor axon degeneration is also observed in mice in which the IGF-1 receptor (IGF-1R) was conditionally depleted in motoneurons, indicating that reduced activity of IGF-1 on IGF-1R in motoneurons is responsible for the observed effect. These data provide evidence that elevated expression of IGFBP-5 in diabetic nerves reduces the availability of IGF-1 for IGF-1R on motor axons leading to progressive neurodegeneration, and thus offers novel treatment strategies. N2 - In dieser Arbeit habe ich die Rolle der neurotrophen Faktoren Ciliary neurotrophic factor (CNTF) und Insulin-like-growth factor 1 (IGF-1), die in Schwannzellen gebildet werden, als Modulatoren der axonalen Integrität bei einer degenerativen Motoneuronenerkrankung und bei diabetischer Neuropathie (DNP) untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass CNTF für ein kompensatorisches Sprouting von motorischen Axonen in einem Mausmodell für spinale Muskelatrophie (SMA) verantwortlich ist. Im zweiten Teil wird die Rolle von IGF-1 und dessen Bindeprotein, IGFBP-5, in Axonen motorischer Nerven bei Patienten mit DNP und zwei korrespondieren Mausmodellen gezeigt. Die proximale SMA wird durch einen homozygoten Verlust oder Mutation des SMN1 Gens auf dem Chromosom 5 verursacht. Bei der spinalen Muskelatrophie unterscheidet man verschiedene Schweregrade, abhängig von der Menge an SMN Protein, das vom zweiten SMN Gen (SMN2) produziert werden kann. Patienten mit einer milderen Form von SMA (Typ III und IV) erreichen das Erwachsenenalter und zeigen oft vergrößerte motorische Einheiten, im Gegensatz zu Patienten mit den schweren kindlichen Formen der Erkrankung. Smn+/- Mäuse, ein Modell für die leichten SMA Formen Typ II und IV, zeigen denervierte Endplatten bereits 4 Wochen nach der Geburt und einen fortschreitenden Verlust von Motoneuronen, der nach 12 Monaten mehr als 50% beträgt, ohne dass sich die Muskelkraft der Tiere verringert. Die Amplitude der Summenpotenziale von einzelnen motorischen Einheiten (Single motor unit action potential, SMUAP) im Wadenmuskel ist mehr als 2-fach erhöht. Konfokale Aufnahmen bestätigen ausgeprägtes Sprouting der noch innervierenden Axone. Smn+/- Mäuse ohne CNTF, das normalerweise stark in Schwann-Zellen exprimiert ist, zeigen reduziertes Sprouting und verringerte Muskelkraft. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass CNTF für das Sprouting und die vergrößerten motorischen Einheiten in Smn+/- Mäusen verantwortlich ist. Dieser kompensatorische Mechanismus könnte neue Behandlungs-möglichkeiten für Motoneuronerkrankungen eröffnen. Die Diabetische Neuropathie (DNP), eine der Hauptkomplikationen bei Diabetes Mellitus, betrifft sowohl motorische als auch sensorische Nervenfasern. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, die zur Degeneration motorischer Axone in Spätstadien der Erkrankung führen, sind größtenteils noch ungeklärt. IGFBP-5, ein IGF-1 hemmendes Bindeprotein, ist in peripheren Nervbiopsien von DNP Patienten stark überexprimiert. Diese potenzielle pathogene Relevanz wurde bei IGFBP-5 überexprimierenden transgenen Mäusen untersucht. Diese Mäuse entwickeln ähnlich wie die DNP Patienten eine motorische Axonopathie. Diese Axondegeneration zeigen auch Mäuse, bei denen der IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) neuronenspezifisch ausgeschaltet wurde. Das bedeutet, dass reduzierte Wirkung von IGF-1 am IGF-1R auf Axonen von Motoneuronen für die beobachtete Axonopathie verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass erhöhtes IGFBP-5 in diabetischen Nerven die Verfügbarkeit von IGF-1 für den IGF-1R reduziert und zu progressiver Neurodegeneration führt. Diese Erkenntnis könnte neue Behandlungsstrategien für Patienten mit DNP eröffnen. KW - Spinale Muskelatrophie KW - Ciliary neurotrophic factor KW - Insulin-like-Growth-Factor-Binding-Protein-5 KW - Diabetische Polyneuropathie KW - Insulin-like Growth KW - Spinal muscular atrophy KW - Ciliary neurotrophic factor KW - Insulin-like-Growth-Factor-Binding-Protein-5 KW - Diabetic polyneuropathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70207 ER - TY - THES A1 - Önal-Hartmann, Cigdem T1 - Emotional Modulation of Motor Memory Formation T1 - Emotionale Modulation des Motorischen Gedächtnises N2 - Hintergründe: Wie eine Vielzahl von Studien belegt, kann das explizite Gedächtnis, das die bewusste Erinnerung an enkodierte Informationen beinhaltet, durch Emotionen beeinflusst werden, und zwar über den Einfluss auf verschiedene Verarbeitungsebenen (Enkodierung, Konsolidierung, Abruf usw.). Bisher wenig untersucht ist, ob und wie Emotionen Vorgänge der motorischen Gedächtnisbildung, die nicht auf bewusster Erinnerung beruhen und sich stattdessen durch Veränderungen im Verhalten darstellen, modulieren. Experiment 1: Das Ziel des ersten Experimentes war es, den Einfluss von Emotionen auf motorisches Lernen zu untersuchen. Vier Gruppen von Probanden mussten in einer motorischen Lernaufgabe schnelle, seitliche Bewegungen mit dem Daumen ausführen. Während dieser Aufgabe hörten die Probanden emotionale Klänge, die in Valenz und Arousal variierten: 1. Valenz negativ/ Arousal niedrig (V-/A-), 2. Valenz negativ/ Arousal hoch (V-/A+), 3. Valenz positiv/ Arousal niedrig (V+/A-), 4. Valenz positiv/ Arousal hoch (V+/A+). Die deskriptive Analyse aller Daten sprach für beste Ergebnisse für das motorische Lernen in der Bedingung V-/A-, aber die Unterschiede zwischen den Bedingungen waren nicht signifikant. Die Interaktion zwischen Valenz und Arousal emotionaler Töne scheint demnach motorische Enkodierungsprozesse zu modulieren, jedoch müssen zukünftige Studien mit unterschiedlichen emotionalen Stimuli die Annahme weiter untersuchen, dass negative Stimuli mit niedrigem Arousal während der Enkodierung einen fördernden Effekt auf das motorische Kurzzeitgedächtnis haben. Experiment 2: Die Absicht des zweiten Experimentes war es, die Auswirkungen emotionaler Interferenzen auf die Konsolidierung beim Sequenzlernen zu untersuchen. Sechs Gruppen von Probanden trainierten zuerst in getrennten Sitzungen eine SRTT-Aufgabe (serial reaction time task). Um die Konsolidierung der neu erlernten Fertigkeit zu modulieren, wurden die Probanden nach dem Training einer von drei unterschiedlichen Klassen emotionaler Stimuli (positiv, negativ oder neutral) ausgesetzt. Diese bestanden aus einem Set emotionaler Bilder, die mit emotional kongruenten Musikstücken oder neutralen Klängen kombiniert waren. Bei den Probandengruppen wurde die emotionale Interferenz nach zwei unterschiedlichen Zeitintervallen realisiert, entweder direkt nach der Trainingssitzung oder sechs Stunden später. 72 Stunden nach der Trainingssitzung wurde jede Gruppe erneut mit der SRTT-Aufgabe getestet. Die Leistung in diesem Nachtest wurde mittels Reaktionszeit und Genauigkeit bei der Ausführung der Zielsequenz analysiert. Die emotionale Interferenz beeinflusste weder die Nachtestergebnisse für die Reaktionszeit noch die für die Genauigkeit. Allerdings konnte eine Steigerung der expliziten Sequenzerkennung durch erregende negative Stimuli festgestellt werden, wenn diese direkt nach der ersten Trainingseinheit (0h) dargeboten wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Konsolidierung der expliziten Aspekte prozeduralen Lernens in einer stärkeren Wechselwirkung mit emotionalen Interferenzen stehen könnte als die der impliziten Aspekte. Die Konsolidierung unterschiedlicher Ebenen des Fertigkeitserwerbs könnte demnach von unterschiedlichen Mechanismen gesteuert werden. Da Performanz und explizites Sequenzerkennen nicht korrelierten, vermuten wir, dass implizite und explizite Modalitäten bei der Durchführung der SRTT-Aufgabe nicht komplementär sind. Experiment 3: Es sollte untersucht werden, ob es eine Präferenz der linken Gehirnhemisphäre bei der Kontrolle von Flexionsreaktionen auf positive Stimuli gibt und der rechten Hemisphäre bei der Kontrolle von Extensionsreaktionen auf negative Stimuli. Zu diesem Zweck sollten rechtshändige Probanden einen Joystick zu sich ziehen oder von sich weg drücken, nachdem sie einen positiven oder negativen Stimulus in ihrem linken oder rechten Gesichtsfeld gesehen hatten. Die Flexionsreaktionen waren bei positiven Stimuli schneller, Extensionsreaktion hingegen bei negativen Stimuli. Insgesamt war die Performanz am schnellsten, wenn die emotionalen Stimuli im linken Gesichtsfeld präsentiert wurden. Dieser Vorrang der rechten Gehirnhemisphäre war besonders deutlich für negative Stimuli, wohingegen die Reaktionszeiten auf positive Bilder keine hemisphärische Differenzierung zeigten. Wir konnten keine Interaktion zwischen Gesichtsfeld und Reaktionstyp belegen, auch fand sich keine Dreifachinteraktion zwischen Valenz, Gesichtsfeld und Reaktionstyp. In unserem experimentellen Kontext scheint die Interaktion zwischen Valenz und Gesichtsfeld stärker zu sein als die Interaktion zwischen Valenz und motorischem Verhalten. Auf Grund dieser Ergebnisse vermuten wir, dass unter gewissen Bedingungen eine Hierarchisierung der asymmetrischen Muster Vorrang hat, die möglicherweise andere vorhandene Asymmetrien maskieren könnte. N2 - Background: There is extensive evidence that explicit memory, which involves conscious recall of encoded information, can be modulated by emotions; emotions may influence encoding, consolidation or retrieval of information. However, less is known about the modulatory effects of emotions on procedural processes like motor memory, which do not depend upon conscious recall and are instead demonstrated through changes in behaviour. Experiment 1: The goal of the first experiment was to examine the influence of emotions on motor learning. Four groups of subjects completed a motor learning task performing brisk isometric abductions with their thumb. While performing the motor task, the subjects heard emotional sounds varying in arousal and valence: (1) valence negative / arousal low (V-/A-), (2) valence negative / arousal high (V-/A+), (3) valence positive / arousal low (V+/A-), and (4) valence positive / arousal high (V+/A+). Descriptive analysis of the complete data set showed best performances for motor learning in the V-/A- condition, but the differences between the conditions did not reach significance. Results suggest that the interaction between valence and arousal may modulate motor encoding processes. Since limitations of the study cannot be ruled out, future studies with different emotional stimuli have to test the assumption that exposure to low arousing negative stimuli during encoding has a facilitating effect on short term motor memory. Experiment 2: The purpose of the second experiment was to investigate the effects of emotional interference on consolidation of sequential learning. In different sessions, 6 groups of subjects were initially trained on a serial reaction time task (SRTT). To modulate consolidation of the newly learned skill, subjects were exposed, after the training, to 1 of 3 (positive, negative or neutral) different classes of emotional stimuli which consisted of a set of emotional pictures combined with congruent emotional musical pieces or neutral sound. Emotional intervention for each subject group was done in 2 different time intervals (either directly after the training session, or 6 h later). After a 72 h post-training interval, each group was retested on the SRTT. Re-test performance was evaluated in terms of response times and accuracy during performance of the target sequence. Emotional intervention did not influence either response times or accuracy of re-testing SRTT task performance. However, explicit awareness of sequence knowledge was enhanced by arousing negative stimuli applied at 0 h after training. These findings suggest that consolidation of explicit aspects of procedural learning may be more responsive toward emotional interference than are implicit aspects. Consolidation of different domains of skill acquisition may be governed by different mechanisms. Since skill performance did not correlate with explicit awareness we suggest that implicit and explicit modes of SRTT performance are not complementary. Experiment 3: The aim of the third experiment was to analyze if the left hemisphere preferentially controls flexion responses towards positive stimuli, while the right hemisphere is specialized towards extensor responses to negative pictures. To this end, right-handed subjects had to pull or push a joystick subsequent to seeing a positive or a negative stimulus in their left or right hemifield. Flexion responses were faster for positive stimuli, while negative stimuli were associated with faster extensions responses. Overall, performance was fastest when emotional stimuli were presented to the left visual hemifield. This right hemisphere superiority was especially clear for negative stimuli, while reaction times towards positive pictures showed no hemispheric difference. We did not find any interaction between hemifield and response type. Neither was there a triple interaction between valence, hemifield and response type. In our experimental context the interaction between valence and hemifield seems to be stronger than the interaction between valence and motor behaviour. From these results we suppose that under certain conditions a hierarchy scaling of the asymmetry patterns prevails, which might mask any other existing asymmetries. KW - Motorisches Lernen KW - Gefühl KW - Motorisches Gedächtnis KW - Emotionen KW - Konsolidierung KW - Motor Memory KW - Emotion Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64838 ER - TY - THES A1 - Schubert, Sabrina T1 - Funktionelle Analyse des „Multidrug-Resistance“-Regulators MRR1 im humanpathogenen Hefepilz Candida albicans T1 - Functional analysis of the multidrug resistance regulator MRR1 in the pathogenic yeast Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans gehört zu den fakultativ pathogenen Infektionserregern und ist Teil der natürlichen Mikroflora der Schleimhäute des Verdauungs- und Urogenitaltraktes der meisten gesunden Menschen. Ist das Gleichgewicht der Flora gestört, kann es zu oberflächlichen Mykosen kommen, wie z.B. der oropharyngealen Candidiasis (Mundsoor), die in der Regel durch die Gabe eines Antimykotikums in wenigen Tagen zu behandeln sind. In seltenen Fällen kann es auch zu schwerwiegenden Infektionsverläufen bis hin zu lebensbedrohlichen systemischen Mykosen kommen. Hauptsächlich immunsupprimierte Patienten, wie z.B. AIDS-Patienten oder Personen, die kürzlich einer Organ- oder Knochenmarkstransplantation unterzogen wurden, leiden häufig an oberflächlichen C. albicans-Infektionen. Insbesondere bei wiederkehrenden Infektionen ist der Pilz in der Lage, gegen das häufig verabreichte Medikament Fluconazol eine Resistenz zu entwickeln. Ein wichtiger Mechanismus dieser Resistenzentwicklung ist die Überexpression von Effluxpumpen, die das Medikament aus der Zelle heraustransportieren. Zwei Arten von Effluxpumpen, die eine Rolle in der Resistenzentwicklung in C. albicans spielen, konnten bisher identifiziert werden, die ABC (ATP binding cassette)-Transporter Cdr1 und Cdr2 sowie der MFS (major facilitator superfamily)-Transporter Mdr1. Der Zinc-Cluster Transkriptionsfaktor Mrr1 spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der MDR1-E¬ffluxpumpe. Er kontrolliert die MDR1-Expression in Anwesenheit induzierender Substanzen und sogenannte "gain-of-function" Mutationen in MRR1 konnten als die Ursache der konstitutiven MDR1-Hochregulierung und der "Multidrug-Resistance" in C. albicans identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte ein Ortholog zu MRR1 aus C. albicans in Candida dubliniensis, einer zu C. albicans nahe verwandten Hefe, identifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass in den untersuchten klinischen und in vitro generierten Fluconazol-resistenten C. dubliniensis-Stämmen ebenfalls gain-of-funcion Mutationen in MRR1 die MDR1-Überexpression und eine Resistenz bewirken. Die Ergebnisse demonstrieren, dass der Transkriptionsfaktor Mrr1 eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Resistenz in diesen humanpathogenen Pilzen spielt. Bisher ist nicht bekannt, wie der Zinc-Cluster Transkriptionsfaktor MRR1 durch induzierende Substanzen oder gain-of-function Mutationen aktiviert wird. Um zu verstehen, wie die Mrr1- Aktivität reguliert wird, wurden in dieser Arbeit durch Deletionsstudien funktionelle Domänen des Transkriptionsfaktors identifiziert. Um einen besseren Einblick in die Regulation der MDR1-vermittelten Resistenz in C. albicans zu bekommen, wurde in dieser Arbeit die gegenseitige Abhängigkeit von Mrr1 und Cap1 bzw. Upc2 in Bezug auf die MDR1-Expression untersucht. Es wurden ChIP-on-chip Analysen und Transkriptionsprofile mit aktiviertem Mrr1 durchgeführt, um direkte Targets von Mrr1 zu identifizieren. Mit der vorliegenden Arbeit wurde ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der Entwicklung der Multidrug-Resistenz in C. albicans geleistet. E¬ffluxpumpen und deren Regulatoren stellen in der Bekämpfung von C. albicans-Infektionen ein interessantes Angriffsziel für die Entwicklung neuer Medikamente und die Weiterentwicklung bereits vorhandender Antimykotika dar. N2 - The yeast Candida albicans is a human fungal pathogen and is part of the microflora of mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in most healthy people. If the balance of the flora is disturbed C. albicans can cause super cial mycoses, e.g. oropharyngeal Candidiasis, also known as "thrush", which are usually easy to cure within a few days by treatment with antimycotic drugs. Infections with the yeast can also result in serious as well as life-threatening systemic mycoses. However, immunocompromised patients, e.g. AIDS patients, often suffer from super cial C. albicans infections and especially in recurrent infections the yeast can develop resistance to the commonly used antifungal drug fluconazole. An important mechanism of drug resistance is the overexpression of e¬ux pumps, which mediate the transport of toxic compounds out of the cell. Two types of e¬fflux pumps, which play a role in die development of resistance in C. albicans, have been described so far, the ABC (ATP binding cassette) transporters Cdr1 and Cdr2, and the MFS (major facilitator superfamily) transporter Mdr1. The zinc cluster transcription factor Mrr1 plays an important role in the regulation of the MDR1 gene. It controls the MDR1 expression in response to inducing chemicals and gain-of function mutations in MRR1 are responsible for the constitutive upregulation of MDR1 and fluconazole resistance. In this work a CaMRR1 ortholog was found in Candida dubliniesis, a yeast closely related to C. albicans. It could be shown that gain-of-function mutations in CdMRR1 were the cause of MDR1 overexpression and drug resistance in all investigated clinical and in vitro generated strains. The results showed that Mrr1 plays an important role in the development of drug resistence in these human fungal pathogens. Currently it is not understood how these zinc cluster transcription factors are activated under inducing conditions or by gain-of-function mutations. To better understand the regulation of Mrr1 activation, in this work deletion studies were performed to identify functional domains of the transcription factor. To gain better insight into the regulation of MDR1-mediated drug resistance in C. albicans, the interdependence of Mrr1 and two other MDR1 regulators, Cap1 and Upc2, was studied in this work. ChIP-on-chip analyses and transcriptional profiles with acitvated Mrr1 were performed to identify direct targets of Mrr1. This thesis contributes to the understanding of the development of multidrug resistance in C. albicans. Efflux pumps and their transcriptional regulators provide an interesting target for the development of new antifungal drugs or the further development of available drugs against C. albicans infections. KW - Candida albicans KW - Resistenz KW - Effluxpumpen KW - Candida albicans KW - resistance KW - efflux pump Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70916 ER - TY - THES A1 - Hintzsche, Henning T1 - Gentoxizität nichtionisierender Strahlung - Auswirkungen von Mobilfunk- und Terahertzstrahlung auf das Genom T1 - Genotoxicity of non-ionizing radiation - Effects of mobile phone and terahertz radiation on the genome N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob nichtionisierende elektromagnetische Strahlung verschiedener Frequenzbereiche Genomschaden hervorrufen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Biomonitoring-Studie zu dieser Thematik konzipiert und durchgeführt. Es wurden 131 Probanden detailliert zu ihrer Mobilfunknutzung befragt. Anschließend wurden Mundschleimhautzellen entnommen und für eine mikroskopische Untersuchung aufbereitet und angefärbt. In den Zellen wurden Mikrokerne und andere Kernanomalien quantifiziert. Es zeigte sich keine Erhöhung der Mikrokernfrequenz in Abhängigkeit von der Dauer der Mobiltelefonnutzung. Auch die anderen abgefragten Parameter hatten keinen Einfluss auf die Höhe des Genomschadens. Als Positivkontrollen wurden vier Patienten, die eine lokale Strahlentherapie (ionisierende Strahlung) erhielten, eingeschlossen. Hier zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Mikrokernfrequenz. Um festzustellen, ob die Mikrokerninduktion erst bei höheren Leistungsflussdichten als denen, die beim Mobilfunk verwendet werden, auftritt, wurden in-vitro-Versuche durchgeführt, bei denen verschiedene Zelllinien einer Strahlung von 900 MHz ausgesetzt wurden. Nach Exposition und einer Postinkubationsperiode wurden die Zellen fixiert und die Mikrokernfrequenz bestimmt. Neben den Leistungen wurden hier auch die Expositionszeiten und die Postinkubationsperioden variiert. In keinem Fall konnte eine Erhöhung der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Insgesamt konnte ein Einfluss elektromagnetischer Strahlung auf das Genom weder am Menschen im Rahmen einer Biomonitoring-Studie noch an verschiedenen Zelllinien im Rahmen von in-vitro-Versuchen festgestellt werden. Terahertzstrahlung ist elektromagnetische Strahlung im Bereich von 0,1 bis 10 THz, d. h. sie liegt zwischen Mikrowellen und Infrarotlicht. Derzeit wird sie hauptsächlich für spektroskopische Untersuchungen und zur Qualitätskontrolle im Herstellungs-prozess verschiedener Produkte verwendet. Anwendungen in der Sicherheitstechnik (z. B. Ganzkörperscanner) und in der Medizintechnik (z. B. Bildgebung) stehen kurz vor der Markteinführung bzw. sind bereits etabliert. Diese Anwendungen bringen eine Exposition der betroffenen Menschen mit sich. Außerdem wird an weiteren Techniken wie etwa der Datenübertragung gearbeitet. Die Wirkungen auf biologische Systeme sind im Gegensatz zum Mobilfunkbereich bisher nur unzureichend untersucht. Da bisher keine vollständigen Literaturübersichten vorlagen, wurde eine umfassende Literaturrecherche durchgeführt. Ziel war es, alle bisher durchgeführten Studien zu diesem Thema aufzulisten. Um diese Datenbasis zu verbreitern wurden in-vitro-Versuche bei verschiedenen Frequenzen durchgeführt. Als Strahlungsquellen wurden eine Frequenzvervielfacherkaskade (0,106 THz), ein Rückwärtswellen-Oszillator (0,380 THz) und ein Ferninfrarot-Laser (2,520 THz) eingesetzt. Die Strahlung wurde in einen modifizierten Inkubator geführt, so dass die Expositionen bei definierter Temperatur und konstantem CO2-Gehalt durchgeführt werden konnten. Da Terahertzstrahlung durch Wasser sehr stark absorbiert wird, sind bei einer Exposition des Menschen primär die obersten Hautschichten betroffen. Aus diesem Grund wurden primäre Hautfibroblasten und HaCaT-Zellen, eine Keratinozyten-Zelllinie, als biologische Systeme verwendet. Die Zellen wurden für unterschiedliche Zeitperioden mit verschiedenen Leistungsflussdichten exponiert. Anschließend wurden die Zellen für den Comet Assay aufbereitet und analysiert. Der Comet Assay ist eine Methode zur Quantifizierung von Einzel- und Doppelstrangbrüchen der DNA. Weiterhin wurden die Zellen nach einer Postinkubationsperiode für den Mikrokerntest aufbereitet. Neben unbehandelten Kontrollen und Sham-Expositionen wurden auch Positivkontrollen durchgeführt. Es konnte keine Erhöhung der Anzahl der DNA-Strangbrüche bzw. der Mikrokernfrequenz festgestellt werden. Da bekannt war, dass im Mobilfunkbereich unter bestimmten Bedingungen Störungen der Mitose, nicht aber Erhöhungen der Mikrokernfrequenz, auftreten, wurden Mitosestörungen nach Exposition bei 0,106 THz untersucht. Hierzu wurden AL-Zellen für 30 Minuten exponiert und anschließend ohne Postinkubation direkt fixiert. Analysiert wurden Störungen in allen Phasen der Mitose. Es zeigte sich, dass die Frequenz der Störungen in der Pro- und Metaphase unverändert blieb. Die Störungen in der Ana- und Telophase nahmen dagegen mit steigender Leistungsflussdichte zu. Insgesamt konnte im Terahertzbereich unter den gewählten Expositionsbedingungen kein DNA-Schaden beobachtet werden. Bei 0,106 THz konnten Mitosestörungen als Folge der Exposition gezeigt werden. Der Zusammenhang zwischen diesen Mitosestörungen und DNA-Schäden, insbesondere der Mikrokerninduktion, konnte bisher nicht abschließend geklärt werden und bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen. N2 - The aim of the present study was to investigate whether non-ionizing radiation of different frequencies can cause genomic damage. Within the course of the present work, a biomonitoring study was designed and performed. 131 participants were interviewed and asked for their mobile phone use customs. Subsequently buccal mucosa cells were retrieved, prepared and stained for microscopy analysis. Micronuclei and other nuclear anomalies indicating genomic damage were quantified. No increase in micronucleus frequency depending on mobile phone use or other retrieved parameters were observed. Four patients receiving radiation therapy (ionizing radiation) were included as positive controls. A clear increase in micronucleus frequency was observed here. To determine whether micronucleus induction only occurs at higher power densities, in vitro investigations with different cell lines exposed to 900 MHz radiation were carried out. After exposition and post-incubation, cells were fixed and the micronucleus frequency was determined. Besides power density also exposition times and post-incubation periods were varied. In no case an increase in micronucleus frequency could be observed. 7. Summary 108 All in all, no influence of electromagnetic radiation on the genome could be observed, neither on humans in the biomonitoring study nor on cell lines in the in vitro study. Terahertz radiation is electromagnetic radiation in the range from 0.1 to 10 THz, i. e. between microwaves and infrared light. Currently it is used in spectroscopy and for quality control procedures in manufacturing processes. Application in security technology (e. g. full body scanners) and medical technology (e. g. medical imaging) have recently been established or are about to enter the market. These applications also involve exposure of humans. Furthermore, other technologies such as data transfer are being developed. So far the effects on biological systems of this frequency range are investigated only insufficiently. A thorough literature search was conducted because no comprehensive literature review was available. The aim was to completely list all available studies on this topic. To enlarge this data basis, in vitro studies at different frequencies were conducted. Radiation sources were a frequency multiplier chain (0.106 THz), a backward wave oscillator (0.380 THz) and a far infrared laser (2.520 THz). The radiation beam was led into a modified incubator in order to perform expositions under controlled temperature and CO2 concentration conditions. Terahertz radiation is strongly absorbed by water, thus in case of exposure of humans the skin will be affected primarily. This is the reason why primary dermal fibroblasts and HaCaT cells, a keratinocyte cell line, were used as biological systems. The cells were exposed to different power densities for different time periods. Subsequently cells were prepared and analyzed using the comet assay which quantifies DNA single and double strand breaks. Also, after a post-incubation period cells were prepared for the micronucleus test. Besides untreated controls and sham expositions also positive controls were 7. Summary 109 performed. No induction of DNA damage, neither as strand breaks nor as micronucleus frequency elevation, was observed. Because it was known that under certain experimental conditions mitotic disturbances but not micronucleus formation occur after exposition to mobile phone radiation, these mitotic disturbances were analyzed after terahertz exposition. AL cells were exposed for 30 minutes with 0.106 THz and fixed directly after the exposition. All phases of mitosis were analyzed, but it turned out that primarily ana- and telophase were affected. These disturbances increased with increasing power density. All in all, no DNA damage could be observed under the applied experimental conditions. After exposition to 0.106 THz mitotic disturbances occurred in AL cells. The link between these mitotic disturbances and the DNA damage, particularly the micronucleus formation, could not be resolved completely and remains subject of further investigations. KW - Mutagenität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Terahertzbereich KW - Mobiles Endgerät KW - Gentoxizität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Terahertzstrahlung KW - Mobilfunkstrahlung KW - Angewandte Toxikologie KW - genotoxicity KW - non-ionizing radiation KW - terahertz radiation KW - mobil phone radiation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57684 ER - TY - THES A1 - Jacobs, Graeme Brendon T1 - HIV-1 resistance analyses from therapy-naïve patients in South Africa, Tanzania and the characterization of a new HIV-1 subtype C proviral molecular clone T1 - HIV-1 Resistenz-Analysen von nicht-therapierten Patienten aus Südafrika und Tansania und Charakterisierung eines neuen HIV-1 Subtyp C proviralen molekularen Klons N2 - The acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is currently the most infectious disease worldwide. It is caused by the human immunodeficiency virus (HIV). At the moment there are ~33.3 million people infected with HIV. Sub-Saharan Africa, with ~22.5 million people infected accounts for 68% of the global burden. In most African countries antiretroviral therapy (ART) is administered in limited-resource settings with standardised first- and second-line ART regimens. During this study I analysed the therapy-naïve population of Cape Town, South Africa and Mwanza, Tanzania for any resistance associated mutations (RAMs) against protease inhibitors, nucleoside reverse transcriptase inhibitors and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. My results indicate that HIV-1 subtype C accounts for ~95% of all circulating strains in Cape Town, South Africa. I could show that ~3.6% of the patient derived viruses had RAMs, despite patients being therapy-naïve. In Mwanza, Tanzania the HIV drug resistance (HIVDR) prevalence in the therapy-naïve population was 14.8% and significantly higher in the older population, >25 years. Therefore, the current WHO transmitted HIVDR (tHIVDR) survey that is solely focused on the transmission of HIVDR and that excludes patients over 25 years of age may result in substantial underestimation of the prevalence of HIVDR in the therapy-naïve population. Based on the prevalence rates of tHIVDR in the study populations it is recommended that all HIV-1 positive individuals undergo a genotyping resistance test before starting ART. I also characterized vif sequences from HIV-1 infected patients from Cape Town, South Africa as the Vif protein has been shown to counteract the antiretroviral activity of the cellular APOBEC3G/F cytidine deaminases. There is no selective pressure on the HIV-1 Vif protein from current ART regimens and vif sequences was used as an evolutionary control. As the majority of phenotypic resistance assays are still based on HIV-1 subtype B, I wanted to design an infectious HIV-1 subtype C proviral molecular clone that can be used for in vitro assays based on circulating strains in South Africa. Therefore, I characterized an early primary HIV-1 subtype C isolate from Cape Town, South Africa and created a new infectious subtype C proviral molecular clone (pZAC). The new pZAC virus has a significantly higher transient viral titer after transfection and replication rate than the previously published HIV-1 subtype C virus from Botswana. The optimized proviral molecular clone, pZAC could be used in future cell culture and phenotypic HIV resistance assays regarding HIV-1 subtype C. N2 - Das erworbene Immundefektsyndrom (“acquired immunodeficiency syndrome”, AIDS), verursacht durch das Humane Immundefizienzvirus (HIV), ist derzeit die häufigste Infektionskrankheit weltweit. Zirka 33,3 Millionen Menschen sind gegenwärtig mit HIV infiziert, wobei hiervon etwa 22,5 Millionen Infizierte (68%) in den Ländern südlich der Sahara leben. In den meisten dieser Länder ist die antiretrovirale Therapie (ART) in nur zwei standardisierten Medikamentenkombinationen verfügbar. In dieser Arbeit wurden nichttherapierte Patienten aus Kapstadt (Südafrika) und Mwanza (Tansania) auf resistenzassoziierte Mutationen (RAMs) gegen Protease Inhibitoren, nukleosidische- und nichtnukleosidische Reverse Transkriptase Inhibitoren analysiert. Meine Ergebnisse zeigten, dass in 3,6 % der Patienten RAMs gefunden wurden, obwohl diese nicht vortherapiert waren. In der Patientengruppe aus Tansania wurden sogar in 14,8 % der Patientenviren RAMs gefunden. Dieses Patientenkollektiv war signifikant älter als 25 Jahre und damit außerhalb der von der WHO beobachteten Altersgruppe. Meine Studie legt nahe, dass die WHO-Kriterien zur Überwachung der Übertragung von resistenten HIVs die Weitergabe von resistenten Viren unterschätzt, da Patienten über 25 Jahre ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden vif Sequenzen von HIV-1 infizierten Patienten aus Kapstadt charakterisiert, da bereits gezeigt wurde, dass das HIV Vif Protein die antiretrovirale Aktivität der Cytidin Deaminase APOBEC3G/F antagonisieren kann. Da jedoch keine Medikamenten induzierte Selektion auf diesen Sequenzen liegt, wurden diese zur Analyse der viralen Evolution verwendet. Phenotypische Resistenzanalysen basieren gegenwärtig meist auf dem HIV Subtyp B, jedoch sind die meisten Infizierten in Südafrika und sogar weltweit mit Subtyp C infiziert. Deshalb war es ein Ziel dieser Arbeit einen proviralen HIV Subtyp C Plasmid zu entwickeln. Dazu wurde das Virus aus einem frühen HIV Subtyp C Isolat kloniert. Das hier neu klonierte Virus (HIV-ZAC) zeigt sowohl einen höheren viralen Titer nach der Transfektion und auch eine höhere Replikationsrate als das zuvor publizierte HIV-1 Suptyp C Virus aus Botswana. Deshalb könnte der von mir optimierte und neu charakterisierte provirale molekulare Klon, pZAC, zukünftig in der Zellkultur und bei phenotypischen HIV Resistenztests als wildtypisches HIV-1 Suptyp C Virus eingesetzt werden. KW - HIV KW - Immunität KW - Südafrika KW - Tansania KW - HIV-1 KW - Subtyp C KW - HIV-1 KW - resistance KW - diversity KW - South Africa KW - Tanzania Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67319 ER - TY - THES A1 - Pahl, Mario T1 - Honeybee Cognition: Aspects of Learning, Memory and Navigation in a Social Insect T1 - Kognition bei Honigbienen: Aspekte zu Lernverhalten, Gedächtnis und Navigation bei einem sozialen Insekt N2 - Honeybees (Apis mellifera) forage on a great variety of plant species, navigate over large distances to crucial resources, and return to communicate the locations of food sources and potential new nest sites to nest mates using a symbolic dance language. In order to achieve this, honeybees have evolved a rich repertoire of adaptive behaviours, some of which were earlier believed to be restricted to vertebrates. In this thesis, I explore the mechanisms involved in honeybee learning, memory, numerical competence and navigation. The findings acquired in this thesis show that honeybees are not the simple reflex automats they were once believed to be. The level of sophistication I found in the bees’ memory, their learning ability, their time sense, their numerical competence and their navigational abilities are surprisingly similar to the results obtained in comparable experiments with vertebrates. Thus, we should reconsider the notion that a bigger brain automatically indicates higher intelligence. N2 - Honigbienen (Apis mellifera) furagieren an vielen verschiedenen Pflanzenarten, und navigieren über große Distanzen zu wichtigen Ressourcen. Die räumliche Lage von Futterquellen und potentiellen neuen Nistplätzen teilen sie ihren Nestgenossinnen mithilfe einer symbolischen Tanzsprache mit. Um all dies leisten zu können, haben sie ein reiches Repertoire von adaptiven Verhaltensweisen evolviert. Mehr und mehr Verhaltensweisen, die man nur bei Vertebraten vermutet hätte, werden auch bei der Honigbiene entdeckt. In meiner Dissertation habe ich einige der Mechanismen erforscht, die beim Lernverhalten, der Gedächtnisbildung, der numerischen Kompetenz und der Navigation eine wichtige Rolle spielen. Die Ergebnisse, die in meiner Dissertation erzielt wurden, zeigen dass Honigbienen keineswegs die einfachen, reflexgesteuerten Organismen sind, als die sie lange Zeit angesehen wurden. Die Komplexität die ich im Gedächtnis, der Lernfähigkeit, dem Zeitsinn, der numerischen Kompetenz und der Navigationsfähigkeit der Bienen gefunden habe, ist erstaunlich ähnlich zu den Ergebnissen, die in vergleichbaren Experimenten mit Vertebraten erzielt wurden. Deshalb sollten wir die allgemeine Annahme, dass ein größeres Gehirn automatisch höhere Intelligenz bedeutet, überdenken. KW - Biene KW - Visuelles Gedächtnis KW - Räumliches Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Navigation KW - Zählen KW - Kognitives Lernen KW - Kognition KW - Honigbiene KW - Gedächtnis KW - Zählen KW - Honeybee KW - Memory KW - Counting KW - Subitizing KW - Cognition Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66165 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - THES A1 - Jentzsch, Claudia T1 - Identifizierung und Charakterisierung funktionell relevanter kardialer Faktoren T1 - Identification and characterization of functionally relevant cardiac factors N2 - Die chronische Herzinsuffizienz stellt nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen weltweit dar. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht möglich die pathophysiologischen Prozesse aufzuhalten. Es wird nach neuen Strategien gesucht, hier therapeutisch eingreifen zu können. Kleine nicht-kodierende RNAs, sogenannte microRNAs (miRNAs), wurden als wichtige Faktoren bei verschiedenen Herzkrankheiten beschrieben. Die Mehrzahl der bisherigen Studien fokussierte sich dabei auf die am stärksten deregulierten miRNAs im erkrankten Herz. In einer automatisierten Analyse im 96 Well-Format untersuchten wir 230 miRNAs auf ihr Potential, in das Größenwachstum von primären Kardiomyozyten einzugreifen. Aus den miRNAs mit den größten Effekten selektierten wir diejenigen, die eine hohe endogene Expression aufwiesen, und unterzogen sie einem Validierungsprozess. Hier konnten wir die Effekte aller pro- (miR-22, miR-30c, miR-30d, miR-212, miR-365) und anti-hypertrophen (miR-27a, miR-27b, miR-133a) miRNAs bestätigen. Die Mehrzahl dieser miRNAs wurde hiermit erstmalig beschrieben, dass sie eine wichtige Rolle beim Größenwachstum von Kardiomyozyten spielen. Sie wären daher interessante Kandidaten für detaillierte funktionelle Studien mit dem Ziel ihr therapeutisches Potential zu evaluieren. In einem früheren genetischen Screen zur Identifizierung von kardialen, sezernierten Faktoren wurde der Protease Inhibitor 16 (PI16) entdeckt, der sich im insuffizienten Herz durch eine starke Akkumulation auszeichnet. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war es, eine Mauslinie zu generieren, in der PI16 global oder konditionell mit Hilfe des Cre/LoxP-Systems ausgeschaltet werden kann. Nach Elektroporation des Pi16floxneo Targeting Vektors in embryonale Stammzellen und Blastozysteninjektion erhielten wir eine Mauslinie, die Träger der zielgerichteten Modifikation des Pi16 Allels war. Mit der globalen genetischen Deletion des LoxP-flankierten Abschnitts von Exon 3 bis 4 konnten wir die Expression des Pi16 Gens komplett unterbinden. Die PI16 Defizienz führte weder im Herz noch in anderen Organen per se zu pathologischen Veränderungen. Zudem war unbekannt, dass PI16 in der gesunden Maus in der kardialen Fibroblastenfraktion enthalten sowie in den Zilien der Epididymis und der Trachea und im Lumen der Schilddrüse lokalisiert ist. Im insuffizienten Herz bestätigten wir eine Akkumulation von PI16, die sich vor allem auf die fibrotischen Bereiche beschränkte. Das lässt Grund zur Annahme, dass die kardiale Funktion von PI16 erst dann offensichtlich wird, wenn man die defizienten Mäuse zukünftig entsprechenden Stressmodellen aussetzt. Das wird zu einem umfassenden Verständnis der kardialen Funktion von PI16 und dessen Potential als therapeutisches Zielmolekül führen. N2 - Chronic heart failure is one of the main causes of death worldwide. Although the pathophysiological processes have been intensely studied within the past they are still detrimental. New therapeutic interventions have to be identified to interfere with these processes. Small non-coding RNAs, so-called microRNAs (miRNAs), have been described to be important factors in several cardiac diseases. The majority of these studies focussed on miRNAs that are deregulated under disease conditions. In an unbiased screening approach we investigated 230 miRNAs for their potential to either promote or inhibit hypertrophy of primary cardiomyocytes. Using an automated system and a 96 well format we identified several miRNAs with strong effects on hypertrophic growth. From these we selected five pro- (miR-22, miR-30c, miR-30d, miR-212, miR-365) and three anti-hypertrophic (miR-27a, miR-27b, miR-133a) miRNAs for validation experiments, all of which displayed strong expression. All of these selected miRNAs could be confirmed in independent validation experiments with the majority not yet been described to be involved in cardiomyocyte hypertrophy. Detailed analysis of these candidate miRNAs will provide insights into the understanding of cardiac hypertrophy and their therapeutic potential for treatment of cardiac disease. In a previous study that used a genetic yeast screen to identify cardiac secreted factors we had identified Protease Inhibitor 16 (PI16) that is strongly accumulating in failing myocardium. In the second part of this work we generated a mouse line where PI16 expression can be deleted globally or conditionally using the Cre/LoxP recombination system. After electroporation of the Pi16floxneo targeting vector in embryonic stem cells and successful injection into murine blastocysts we gained a mouse line that carried the targeted modification of the Pi16 allele. Upon global deletion of the floxed region from Exon 3 to 4 we could completely delete PI16 expression. PI16 deficiency per se led to a phenoytpe neither in the heart nor in other organs of these mice. Furthermore it was unknown that PI16 localizes to cardiac fibroblasts, the cilia of the epididymis and trachea as well as to the lumen of the thyroid gland in healthy tissue. In the failing heart we could confirm accumulation of PI16 preferentially in fibrotic areas. Therefore we assume that PI16s function could only become obvious as soon as one applies respective cardiac stress models. Applying such models will contribute to a broader understanding of the function of PI16 and its potential as a therapeutic target molecule. KW - miRNS KW - Herzhypertrophie KW - Sezernierte Faktoren KW - miRNA KW - cardiac hypertrophy KW - secreted factors Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66699 ER - TY - THES A1 - Beisser, Daniela T1 - Integrated functional analysis of biological networks T1 - Integrierte funktionelle Analyse biologischer Netzwerke N2 - In recent years high-throughput experiments provided a vast amount of data from all areas of molecular biology, including genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. Its analysis using bioinformatics methods has developed accordingly, towards a systematic approach to understand how genes and their resulting proteins give rise to biological form and function. They interact with each other and with other molecules in highly complex structures, which are explored in network biology. The in-depth knowledge of genes and proteins obtained from high-throughput experiments can be complemented by the architecture of molecular networks to gain a deeper understanding of biological processes. This thesis provides methods and statistical analyses for the integration of molecular data into biological networks and the identification of functional modules, as well as its application to distinct biological data. The integrated network approach is implemented as a software package, termed BioNet, for the statistical language R. The package includes the statistics for the integration of transcriptomic and functional data with biological networks, the scoring of nodes and edges of these networks as well as methods for subnetwork search and visualisation. The exact algorithm is extensively tested in a simulation study and outperforms existing heuristic methods for the calculation of this NP-hard problem in accuracy and robustness. The variability of the resulting solutions is assessed on perturbed data, mimicking random or biased factors that obscure the biological signal, generated for the integrated data and the network. An optimal, robust module can be calculated using a consensus approach, based on a resampling method. It summarizes optimally an ensemble of solutions in a robust consensus module with the estimated variability indicated by confidence values for the nodes and edges. The approach is subsequently applied to two gene expression data sets. The first application analyses gene expression data for acute lymphoblastic leukaemia (ALL) and differences between the subgroups with and without an oncogenic BCR/ABL gene fusion. In a second application gene expression and survival data from diffuse large B-cell lymphomas are examined. The identified modules include and extend already existing gene lists and signatures by further significant genes and their interactions. The most important novelty is that these genes are determined and visualised in the context of their interactions as a functional module and not as a list of independent and unrelated transcripts. In a third application the integrative network approach is used to trace changes in tardigrade metabolism to identify pathways responsible for their extreme resistance to environmental changes and endurance in an inactive tun state. For the first time a metabolic network approach is proposed to detect shifts in metabolic pathways, integrating transcriptome and metabolite data. Concluding, the presented integrated network approach is an adequate technique to unite high-throughput experimental data for single molecules and their intermolecular dependencies. It is flexible to apply on diverse data, ranging from gene expression changes over metabolite abundances to protein modifications in a combination with a suitable molecular network. The exact algorithm is accurate and robust in comparison to heuristic approaches and delivers an optimal, robust solution in form of a consensus module with confidence values. By the integration of diverse sources of information and a simultaneous inspection of a molecular event from different points of view, new and exhaustive insights into biological processes can be acquired. N2 - In den letzten Jahren haben Hochdurchsatz-Experimente gewaltige Mengen an molekularbiologischen Daten geliefert, angefangen mit dem ersten sequenzierten Genom von Haemophilus influenzae im Jahr 1995 und dem menschlichen Genom im Jahr 2001. Mittlerweile umfassen die resultierenden Daten neben der Genomik die Bereiche der Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik. Die Analyse der Daten mithilfe von bioinformatischen Methoden hat sich entsprechend mit verändert und weiterentwickelt. Durch neuartige, systembiologische Ansätze versucht man zu verstehen, wie Gene und die aus ihnen resultierenden Proteine, biologische Formen und Funktionen entstehen lassen. Dabei interagieren sie miteinander und mit anderen Molekülen in hoch komplexen Strukturen, welche durch neue Ansätze der Netzwerkbiologie untersucht werden. Das tiefgreifende Wissen über einzelne Moleküle, verfügbar durch Hochdurchsatz-Technologien, kann komplementiert werden durch die Architektur und dynamischen Interaktionen molekularer Netzwerke und somit ein umfassenderes Verständnis biologischer Prozesse ermöglichen. Die vorliegende Dissertation stellt Methoden und statistische Analysen zur Integration molekularer Daten in biologische Netzwerke, Identifikation robuster, funktionaler Subnetzwerke sowie die Anwendung auf verschiedenste biologische Daten vor. Der integrative Netzwerkansatz wurde als ein Softwarepaket, BioNet, in der statistischen Programmiersprache R implementiert. Das Paket beinhaltet statistische Verfahren zur Integration transkriptomischer und funktionaler Daten, die Gewichtung von Knoten und Kanten in biologischen Netzwerken sowie Methoden zur Suche signifikanter Bereiche, Module, und deren Visualisierung. Der exakte Algorithmus wird ausführlich in einer Simulationsstudie getestet und übertrifft heuristische Methoden zur Lösung dieses NP-vollständigen Problems in Genauigkeit und Robustheit. Die Variabilität der resultierenden Lösungen wird bestimmt anhand von gestörten integrierten Daten und gestörten Netzwerken, welche zufällige und verzerrende Einflüsse darstellen, die die Daten verrauschen. Ein optimales, robustes Modul kann durch einen Konsensusansatz bestimmt werden. Basierend auf einer wiederholten Stichprobennahme der integrierten Daten, wird ein Ensemble von Lösungen erstellt, aus welchem sich das robuste und optimale Konsensusmodul berechnen lässt. Zusätzlich erlaubt dieser Ansatz eine Schätzung der Variabilität des Konsensusmoduls und die Berechnung von Konfidenzwerte für Knoten und Kanten. Der Ansatz wird anschließend auf zwei Genexpressionsdatensätze angewandt. Die erste Anwendung untersucht Genexpressionsdaten für akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und analysiert Unterschiede in Subgruppen mit und ohne BRC/ABL Genfusion. Die zweite Anwendung wertet Genexpressions- und Lebenszeitdaten für diffuse großzellige B-Zell Lymphome (DLBCL) aus, beruhend auf molekularen Unterschieden zwischen zwei DLBCL Subtypen mit unterschiedlicher Malignität. In einer dritten Anwendung wird der integrierte Netzwerkansatz benutzt, um Veränderungen im Metabolismus von Tardigraden aufzuspüren und Signalwege zu identifizieren, welche für die extreme Anpassungsfähigkeit an wechselnde Umweltbedingungen und Überdauerung in einem inaktiven Tönnchenstadium verantwortlich sind. Zum ersten Mal wird dafür ein metabolischer Netzwerkansatz vorgeschlagen, der metabolische Veränderungen durch die Integration von metabolischen und transkriptomischen Daten bestimmt. Abschließend ist zu bemerken, dass die präsentierte integrierte Netzwerkanalyse eine adäquate Technik ist, um experimentelle Daten aus Hochdurchsatz-Methoden, die spezialisiert auf eine Molekülart sind, mit ihren intermolekularen Wechselwirkungen und Abhängigkeiten in Verbindung zu bringen. Sie ist flexibel in der Anwendung auf verschiedenste Daten, von der Analyse von Genexpressionsveränderungen, über Metabolitvorkommen bis zu Proteinmodifikationen, in Kombination mit einem geeigneten molekularen Netzwerk. Der exakte Algorithmus ist akkurat und robust in Vergleich zu heuristischen Methoden und liefert eine optimale, robuste Lösung in Form eines Konsensusmoduls mit zugewiesenen Konfidenzwerten. Durch die Integration verschiedenster Informationsquellen und gleichzeitige Betrachtung eines biologischen Ereignisses von diversen Blickwinkeln aus, können neue und vollständigere Erkenntnisse physiologischer Prozesse gewonnen werden. KW - Bioinformatik KW - differenzielle Genexpression KW - Bioinformatik KW - Netzwerkanalyse KW - differenzielle Genexpression KW - funktionelle Module KW - bioinformatics KW - networkanalysis KW - differential geneexpression KW - functional modules Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70150 ER - TY - THES A1 - Dieler, Alica Christina T1 - Investigation of variables influencing cognitive inhibition: from the behavioral to the molecular level T1 - Untersuchung der Einflussgrößen kognitiver Unterdrückung: Vom verhaltensorientierten zum molekularen Ansatz N2 - The present work investigated the neural mechanisms underlying cognitive inhibition/thought suppression in Anderson’s and Green’s Think/No-Think paradigm (TNT), as well as different variables influencing these mechanisms at the cognitive, the neurophysiological, the electrophysiological and the molecular level. Neurophysiological data collected with fNIRS and fMRI have added up to the existing evidence of a fronto-hippocampal network interacting during the inhibition of unwanted thoughts. Some evidence has been presented suggesting that by means of external stimulation of the right dlPFC through iTBS thought suppression might be improved, providing further evidence for an implication of this region in the TNT. A combination of fNIRS with ERP has delivered evidence of a dissociation of early condition-independent attentional and later suppression-specific processes within the dlPFC, both contributing to suppression performance. Due to inconsistencies in the previous literature it was considered how stimulus valence would influence thought suppression by manipulating the emotional content of the to-be-suppressed stimuli. Findings of the current work regarding the ability to suppress negative word or picture stimuli have, however, been inconclusive as well. It has been hypothesized that performance in the TNT might depend on the combination of valence conditions included in the paradigm. Alternatively, it has been suggested that inconsistent findings regarding the suppression of negative stimuli or suppression at all might be due to certain personality traits and/or genetic variables, found in the present work to contribute to thought inhibition in the TNT. Rumination has been shown to be a valid predictor of thought suppression performance. Increased ruminative tendencies led to worse suppression performance which, in the present work, has been linked to less effective recruitment of the dlPFC and in turn less effective down-regulation of hippocampal activity during suppression trials. Trait anxiety has also been shown to interrupt thought suppression despite higher, however, inefficient recruitment of the dlPFC. Complementing the findings regarding ruminative tendencies and decreased thought inhibition a functional polymorphism in the KCNJ6 gene, encompassing a G-to-A transition, has been shown to disrupt thought suppression despite increased activation of the dlPFC. Through the investigation of thought suppression at different levels, the current work adds further evidence to the idea that the TNT reflects an executive control mechanism, which is sensitive to alterations in stimulus valence to some extent, neurophysiological functioning as indicated by its sensitivity to iTBS, functional modulations at the molecular level and personality traits, such as rumination and trait anxiety. N2 - Diese Arbeit befasste sich mit der Untersuchung der neuronalen Grundlagen kognitiver Inhibition /Gedankenunterdrückung in Anderson’s und Green’s ‘Think/No-Think‘ Paradigma (TNT), sowie der Erfassung verschiedener Einflussgrößen auf der kognitiven, der neurophysiologischen, der elektrophysiologischen und der molekularen Ebene. Mit fNIRS und fMRT durchgeführte neurophysiologische Studien haben die Annahme der Beteiligung eines Fronto-Hippocampalen Netzwerkes an der Unterdrückung unerwünschter Gedanken bekräftigt. Hinweise auf eine Verbesserung der Unterdrückungsleistung mittels externer Manipulation der neuronalen Aktivität durch iTBS unterstützen die Annahme einer Beteiligung des dlPFC an den Mechanismen innerhalb des TNT weiter. Durch die Kombination von fNIRS und ERP wurde eine Dissoziation zwischen frühen bedingungsunabhängigen Aufmerksamkeits- und späteren unterdrückungsspezifischen Prozessen innerhalb des dlPFC aufgezeigt. Vor dem Hintergrund widersprüchlicher Resultate bezüglich des Einflusses der Stimulus-Valenz auf die kognitive Inhibition in der vorhandenen Literatur wurde dieser Aspekt auch in der vorliegenden Arbeit berücksichtigt. Auch in dieser Arbeit aufgetretene widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Unterdrückung negativer Stimuli führten zu der Hypothese, dass die Unterdrückungsleistung in dem TNT in Abhängigkeit der Valenz der weiteren eingeschlossenen Stimuli erfolgt. Alternativ wurde eine Abhängigkeit von Persönlichkeitsmerkmalen und/oder genetischen Variablen vorgeschlagen, welche in der vorliegenden Arbeit als Einflussgrößen nachgewiesen wurden. So konnte gezeigt werden, dass die Erhebung ruminativer Tendenzen eine zuverlässige Vorhersage der Unterdrückungsleistung zulässt. Höhere ruminative Tendenzen führten zu signifikant verschlechterter Unterdrückungsleistung. Dies konnte auf eine ineffektive Rekrutierung des dlPFC gefolgt von ungenügender Aktivierungsabnahme im Hippocampus während der Gedankeninhibition zurückgeführt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass mit der Zunahme ängstlicher Persönlichkeitsmerkmale die Unterdrückungsleistung trotz erhöhter Aktivität im dlPFC abnimmt. In Ergänzung zu den Ergebnissen bezüglich ruminativer Tendenzen und gestörter kognitiver Inhibition konnte ein störender Einfluss eines funktionellen genetischen Polymorphismus im KCNJ6 Gen unter Einbeziehung einer Punktmutation (G-A Transition) nachgewiesen werden. Durch die Untersuchung der Gedankenunterdrückung auf unterschiedlichen Ebenen, konnte die vorliegende Arbeit weitere Hinweise dafür liefern, dass mit dem TNT exekutive Kontrollfunktionen abgegriffen werden, welche durch Stimulusvalenz, neurophysiologische Prozesse (durch eine die iTBS betreffende Sensitivität angezeigt), funktionelle Modulationen auf der molekularen Ebene, sowie Persönlichkeitsmerkmale wie ruminative Tendenzen und Ängstlichkeit beeinflussbar sind. KW - Kognitiver Prozess KW - Inhibition KW - Kognitive Inhibition KW - Funktionelle Bildgebung KW - Think/No-Think KW - Emotion KW - Bildgebendes Verfahren KW - Molekulare Bildgebung KW - Genetik KW - cognitive inhibition KW - functional imaging KW - think/no-think KW - emotion KW - personality traits KW - genomic imaging Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65955 ER - TY - THES A1 - Gan, Qiang T1 - Investigation on Distinct Roles of Smad Proteins in Mediating Bone Morphogenetic Proteins Signals T1 - Untersuchung auf Unterschiedliche Rollen von Smad Proteinen in der Signalübertragung der Knochenmorphogenetischen Proteine N2 - Knochenmorphogenetische Proteine (engl. Bone morphogenetic Proteins, BMPs) sind eine Bestandteil von transforming growth factor-β (TGF-β)-Superfamilie und spielen wichtige Rollen in zahlreichen biologischen Ereignissen in der Entwicklung fast aller mehrzelligen Organismen. Fehlregulierte BMP-Signalweg ist die zugrunde liegenden Ursachen von zahlreichen erblichen und nicht erblichen Krankheiten wie Krebs. Die von BMP induziete breite Palette von biologischen Reaktionen konvergiert auf drei eng verwandten Smad Proteine. Sie vermitteln intrazelluläre Signale von BMP-Rezeptoren in den Zellkern. Die Spezifität des BMP-Signalwegs wurde intensiv auf der Ebene der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen erforscht, aber, wie die verschiedenen Smad Proteine die durch BMPs hervorgerufen differenziellen Signale beitragen, bleibt unklar. In dieser Arbeit haben wir die BMP / Smad Signalweg in verschiedenen Aspektenuntersucht. Auf der Suche nach einem geeigneten Fluoreszenz-Reporter im Zebrafisch, verglichen wir verschiedene photo-schaltbaren Proteine und fand EosFP der beste Kandidat für diesen Modellorganismus im Bezug auf seine schnelle Reifung und Fluoreszenz-Intensität. Wir haben durch molekulare Modifizierung geeignete Vektoren erstellt, die Tol2-Transposon basieren trangenesis im Zebrafisch zu ermöglichen. Damit wurden schließlich transgenzebrafisch-Linien erzeugt. Wir kombinierten Fluoreszenz-Protein-Tagging mit hochauflösender Mikroskopie und untersuchten die Dynamik der Smad-Proteine in Modellsystem Zebrafisch. Es wurde beobachteten, dass Smad5 Kern-Translokation erfährt, als BMP Signalgeber bei Zebrafisch Gastrulation. Wir erkundeten die Beteiligung der Smad Proteine während der Myogenese-zu-Osteogenese Umwandlung von C2C12 Zelllinie, die durch BMP4 induziert wurde. Mit siRNA versuchten wir die endogene Smad Proteine niederzuschlagen, wobei die Auswirkungen auf diesen gekoppelten noch unterschiedlichen Verfahren durch quantitative real-time PCR und Terminal-Marker Färbung ausgewertet. Wir spekulieren, dass verschiedene Smad-Komplex Stöchiometrie für unterschiedliche durch BMPs hervorgerufe zelluläre Signale verantwortlich sein könnte. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and play important roles in numerous biological events in the development of almost all multi-cellular organisms. Dysregulated BMP signaling is the underlying causes of numerous heritable and non-heritable human diseases including cancer. The vast range of biological responses induced by BMPs converges on three closely related Smad proteins that convey intracellular signals from BMP receptors to the nucleus. The specificity of BMP signaling has been intensively investigated at the level of ligand-receptor interactions, but how the different Smad proteins contribute to differential signals elicited by BMPs remains unclear. In this work, we investigated the BMP/Smad signaling in different aspects. In search for an appropriate fluorescence reporter in zebrafish, we compared different photo-switchable proteins and found EosFP the best candidate this model system for its fast maturation and fluorescence intensity. We modified and created appropriate vectors enabling Tol2-transposon based trangenesis in zebrafish, with which transgenic zebrafish lines were generated. We combined fluorescence protein tagging with high resolution microscopy and investigate the dynamics of Smad proteins in model system zebrafish. We observed that Smad5 undergoes nucleo-translocation as BMP signal transmitter during zebrafish gastrulation. We explored the Smad involvement during myogenic-to-osteogenic conversion of C2C12 cell line induced by BMP4. We created transient loss-of-function of Smads by siRNA-mediated knockdowns and analyzed the effects on these coupled yet distinct procedures by quantitative real-time PCR and terminal marker staining. We found that different Smad-complex stoichiometry might be responsible for distinct cellular signals elicited by BMPs. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Zebrabärbling KW - Signaltransduktion KW - Bone morphogenetic proteins KW - Smad KW - Signaling KW - Zebrafish KW - Cell line KW - Differentiation KW - Differenzierung KW - Zelllinie KW - Zebrafisch Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71127 ER -