TY  - THES
A1  - Münstermann, Marcel
T1  - The roles of the anaphylatoxin receptors during invasive disease as well as mucosal colonization caused by \(Neisseria\) \(meningitidis\)
T1  - Die Rolle der Anaphylatoxinrezeptoren während invasiver Infektion sowie  mukosaler Kolonisation verursacht durch \(Neisseria\) \(meningitidis\)
N2  - The human specific gram-negative bacterium Neisseria meningitidis (Nme, meningococci) is a common colonizer of the upper respiratory tract. Upon becoming invasive, Nme can cause meningitis and life-threatening sepsis. The most important immune defense mechanism in invasive meningococcal disease (IMD) is the complement mediated killing of bacteria. The complement cascade is activated through different pathogen associated patterns and finally leads to the lysis of the bacteria by the membrane attack complex. In addition to the direct bacterial killing, the complement system is also an important player in different inflammatory processes. A hallmark of IMD is an overreaction of the immune system and the release of the potent anaphylatoxins C3a and C5a by the complement system is an important factor hereby. There are three anaphylatoxin receptors (ATRs), the C3aR, the C5aR1 and the C5aR2, capable of detecting these anaphylatoxins. It has already been shown that blocking the ATR C5aR1 strongly benefitted the outcome of IMD in a murine sepsis model. However, the roles of ATRs C3aR and C5aR2 in IMD are still unclear. This work aims to analyze the role of these ATRs in meningococcal sepsis and to identify possible underlying mechanisms. Furthermore, a possible involvement of the complement system, the ATRs and the type II CRISPR/Cas system on nasopharyngeal colonization is analyzed.
In vivo depletion experiments showed that without neutrophils or monocytes/macrophages the complement system alone was not able to clear a low dose Nme infection, which highlights the importance of cellular components in IMD. Analyzing the role of the ATRs in knock-out mice with high dose Nme infections, revealed that the lack of C5aR2, like the lack of C5aR1, was beneficial for the outcome of meningococcal induced sepsis. In contrast, the lack of C3aR in knock-out mice was detrimental. The positive outcome associated with the C5aRs could be reproduced by using an antagonist against both C5aRs or an antagonist specifically against C5aR1 in WT mice. These findings are giving hope to future therapeutic applications. Next, a possible contribution of neutrophils to this positive outcome was analyzed. Absence of C5aR1 led to a decrease of degranulation by neutrophils in a murine whole blood model, while the other ATRs showed no effect. Neutrophil analysis in human whole blood, on the other hand, revealed a reduced oxidative burst and IL-8 secretion upon inhibition of all three ATRs. A functional difference between the C5aRs and the C3aR in neutrophils was observed in phagocytosis, which was reduced upon C3aR inhibition, but was unaltered with C5aR1 or C5aR2 inhibition. Possible underlying mechanisms in the phosphorylation of ERK1/2 were analyzed in bone marrow derived macrophages isolated from ATR knock-out mice. The later phosphorylation of ERK1/2 in macrophages without C5aR1 or C5aR2 expression might explain, why blocking the C5aRs is beneficial for the outcome of IMD in mice. In contrast to these findings, the colonization of the nasopharynx in huCEACAM 1 expressing mice by Nme did not seem to depend on the Complement system factors C3 and C5 nor the ATRs. Additionally, no difference in the colonization could be observed in this model using Nme mutants lacking different parts of the type 2 CRISPR/Cas system.
Conclusively, this work highlights the importance of the complement system, the ATRs and the cellular components in IMD. Contrariwise, these factors did not play a role in the analyzed nasopharyngeal infection model. The beneficial effects of C5aR1 and C5aR2 lack/inhibition in IMD might have medicinal applications, which could support the standard therapies of IMD in the future.
N2  - Das human spezifische pathogene Gram-negative Bakterium Neisseria meningitidis (Nme, Meningokokken) ist ein Kommensale angesiedelt im Nasopharynx. Bei invasiver Erkrankung können Nme Meningitis oder eine lebensbedrohliche Sepsis verursachen. Die wichtigste Verteidigung des Immunsystems in invasiver Meningokokken-Erkrankung (IMD) ist die Abtötung von Bakterien durch das Komplementsystem. Die Komplementkaskade wird durch verschiedene pathogenassoziierte Muster in Gang gesetzt und resultiert in dem Aufbau des Membranangriffskomplex, welcher die Bakterien schließlich lysiert. Darüber hinaus spielt das Komplementsystem auch eine wichtige Rolle in verschiedenen inflammatorischen Prozessen im Körper. Ein charakteristisches Merkmal von IMD ist eine übermäßige Reaktion des Immunsystems und dabei ist die Freisetzung der Anaphylatoxine C3a und C5a, durch das Komplementsystem, ein wichtiger Faktor. Es gibt drei Anaphylatoxin Rezeptoren (ATR), den C3aR, den C5aR1 und den C5aR2, welche die jeweiligen Anaphylatoxine erkennen. In murinen Modellen wurde bereits gezeigt, dass die Inhibition des C5aR1 einen positiven Einfluss auf den Verlauf von IMD hat. Im Kontrast dazu sind die Rollen der ATRs C3aR und C5aR2 in IMD weiter unklar. Diese Arbeit hat als Ziel, die Rolle der ATRs in Meningokokken induzierter Sepsis zu untersuchen und mögliche zugrundeliegende Mechanismen zu finden. Des Weiteren soll ein möglicher Einfluss des Komplementsystems, der ATRs und des Typ II CRISPR/Cas Systems auf die Kolonisation durch Nme im Nasopharynx untersuchen werden. 
In vivo Depletions-Versuche zeigten, dass ohne Neutrophile oder Monozyten/Makrophagen das Komplementsystem allein nicht in der Lage war eine Nme-Infektion mit einer niedrigen Infektionsdosis zu beseitigen. Dies zeigt die Wichtigkeit von Immunzellen neben dem Komplementsystem in IMD. Experimente mit hohen Nme-Dosen in ATR knock-out Mäusen zeigten, dass die fehlende Expression von C5aR2, wie die von C5aR1, sich positiv auf den Ausgang von IMD auswirkte. Im Gegensatz dazu, verschlimmerte das Fehlen des C3aR Rezeptors den Ausgang der IMD. Die positive Wirkung in den C5aR knock-out Mäusen, konnte auch mit der Gabe von einem gegen beide C5aRs oder einem spezifisch gegen C5aR1 gerichteten Antagonisten in WT Mäusen beobachtet werden. Diese Ergebnisse geben Hoffnung auf eine mögliche zukünftige therapeutische Applikation. Als nächstes wurde eine mögliche Beteiligung von Neutrophilen an dem positiven Ausgang von IMD in Abhängigkeit von den ATRs untersucht. Eine fehlende C5aR1 Expression führte zu einer verminderten Degranulation durch Neutrophile in dem verwendeten murinen Vollblutmodel, wohingegen die fehlende Expression der anderen ATRs keinen Effekt zeigte. Im Gegensatz dazu, zeigten Versuche mit humanem Vollblut einen verminderten Oxidativen Burst sowie eine verminderte Ausschüttung von IL-8 bei der Blockade von allen drei ATRs. Ein Unterschied zwischen den C5aRs und dem C3aR zeigte sich hingegen in der Phagozytose, welche mit C3aR Inhibierung reduziert war, aber unverändert nach der Inhibierung von C5aR1 oder C5aR2 blieb. Mögliche zugrundeliegende Mechanismen in der Phosphorylation von ERK1/2 wurden anschließend in Knochenmark-gereiften Makrophagen von ATR knock-out Mäusen untersucht. Ohne C5aR1 oder C5aR2 Expression wurde eine verzögerte Phosphorylierung von ERK1/2 in den Makrophagen beobachtet, was erklären könnte warum die Blockade von C5aRs den Ausgang von Meningokokken induzierter Sepsis in Mäusen positiv beeinflusst. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurde die Kolonisation des Nasopharynx durch Nme in huCEACAM-1 exprimierenden Mäusen, weder durch die Komplementfaktoren C3 und C5 noch durch die ATRs beeinflusst.
Zusätzlich konnte auch kein Unterschied in der Besiedelung des Nasopharynx durch Nme-Mutanten, die verschiedene Mutationen des Typ 2 CRISPR/Cas Systems besaßen, beobachtet werden.
Diese Arbeit zeigt die Wichtigkeit des Komplementsystems, der ATRs und der Immunzellen in IMD. Zusätzlich zeigt diese Arbeit, dass das Komplementsystem und die ATRs jedoch keine Auswirkungen auf die Kolonisation des Nasopharynx in Mäusen haben. Die äußerst positive Auswirkung auf IMD, wenn C5aR1 und C5aR2 nicht gebildet oder blockiert werden, könnte medizinisch von Bedeutung sein und eventuell in der Zukunft die Standarttherapie bei IMD unterstützen.
KW  - Anaphylatoxine
KW  - Komplement C3a
KW  - Komplement C5a
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Komplement <Immunologie>
KW  - anaphylatoxin receptors
KW  - invasive meningococcal diseases
KW  - Anaphylatoxinrezeptoren
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-269759
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bauriedl, Saskia Corinna
T1  - The influence of riboregulation on fitness and virulence in Neisseria meningitidis
T1  - Der Einfluss der Riboregulation auf Fitness und Virulenz von  Neisseria meningitidis
N2  - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is a human commensal that occasionally causes life-threatening infections such as bacterial meningitis and septicemia. Despite experi-mental evidence that the expression of small non-coding RNAs (sRNAs) as well as the RNA chaperone Hfq affect meningococcal physiology, the impact of RNA-based regula-tion (riboregulation) on fitness and virulence in N. meningitidis is only poorly understood. Therefore, this study addressed these issues using a combination of high-throughput tech-nologies. 
A differential RNA-sequencing (dRNA-seq) approach was applied to produce a single-nucleotide resolution map of the primary transcriptome of N. meningitidis strain 8013. The dRNA-seq analysis predicted 1,625 transcriptional start sites including 65 putative sRNAs, of which 20 were further validated by northern blot analysis. By Hfq RNA im-munopreci-pitation sequencing a large Hfq-centered post-transcriptional regulatory net-work comprising 23 sRNAs and 401 potential mRNA targets was identified. Rifampicin stability assays demonstrated that Hfq binding confers enhanced stability on its associat-ed sRNAs. Based on these data, the interactions of two paralogous sRNAs and their cog-nate target mRNA prpB were validated in vivo as well as in vitro. Both sRNAs directly repress prpB encoding a methylisocitrate lyse which was previously shown to be involved in meningococcal colonization of the human nasopharynx. 
Besides the well-described RNA chaperone Hfq, FinO-domain proteins have recently been recognized as a widespread family of RNA-binding proteins (RBPs) with regulatory roles in diverse bacteria. They display an intriguing bandwidth of target sites, ranging from a single RNA pair as recognized by plasmid-encoded FinO to the global RNA regu-lons of enterobacterial ProQ proteins. To better understand the intrinsic targeting mode of this RBP family, in vivo targets of the minimal ProQ protein of N. meningitidis were de-termined. In vivo UV crosslinking with RNA deep sequencing (UV-CLIP) identified as-sociations of ProQ with 16 sRNAs and 166 mRNAs encoding a variety of biological functions and thus revealed ProQ as another global RBP in meningococci. It could be shown that meningococcal ProQ predominantly binds to highly structured RNA regions including DNA uptake sequences (DUS) and rho-independent transcription terminators and stabilizes many of its RNA targets as proved by rifampicin stability experiments. As expected from the large suite of ProQ-bound RNAs, proQ deletion globally affects both gene and protein expression in N. meningitidis, changing the expression levels of at least 244 mRNAs and 80 proteins. Phenotypic analyses suggested that ProQ promotes oxida-tive stress tolerance and UV damage repair capacity, both of which are required for full virulence of N. meningitidis. 
Together, this work uncovers the co-existence of two major post-transcriptional regulons, one governed by ProQ, the other by Hfq, in N. meningitidis. It further highlights the role of these distinct RBPs and its associated sRNAs to bacterial virulence and indicates that riboregulation is likely to contribute to the way how meningococci adapt to different host niches.
N2  - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein kommensal lebendes Bakterium, welches unter nicht vollständig geklärten Bedingungen auch lebensbedrohliche Infektionen im Menschen wie bakterielle Meningitis und Sepsis verursachen kann. Obwohl experimentell nachgewiesen wurde, dass die Expression kleiner, nicht kodierender RNAs (sRNAs) so-wie des RNA-Chaperons Hfq in Meningokokken physiologisch relevant ist, blieb der Ein-fluss der RNA-basierten Genregulation (Riboregulation) auf die Fitness und Virulenz von N. meningitidis bisher unvollständig verstanden. Daher befasste sich diese Studie durch Kombination verschiedener Hochdurchsatz-Technologien mit dieser Fragestellung. 
Es wurde differentielle RNA-Sequenzierung (dRNA-seq) angewendet, um das primäre Transkriptom des N. meningitidis Stamms 8013 möglichst genau zu kartieren. Die durch-geführte dRNA-seq-Analyse detektierte 1.625 Transkriptionsstartstellen (TSS) einschließ-lich 65 potentieller sRNAs. Durch Anwendung von Northern-Blot-Analysen konnten an-schließend 20 sRNAs experimentell validiert werden. Darüber hinaus wurde durch Ko-Immunopräzipitation mit Hfq (RIP-seq) ein großes, Hfq-zentriertes, post-         transkripti-onelles regulatorisches Netzwerk identifiziert, welches 23 sRNAs und 401 mRNAs um-fasst. Rifampicin-Stabilitätsversuche zeigten, dass durch Hfq-Bindung die Stabilität die-ser sRNAs erhöht wird. Basierend auf diesen Daten konnte die Interaktion zwischen zweier Hfq-gebundener paraloger sRNAs und der prpB mRNA sowohl in vivo als auch in vitro bestätigt werden. Beide sRNAs reprimieren die Translation des PrpB-Genes, wel-ches für eine Methylisocitratlyase kodiert und wahrscheinlich die Kolonisation des menschlichen Nasopharynxs durch Meningokokken begünstigt. 
Neben dem ausführlich charakterisierten RNA-Chaperon Hfq wurden Proteine mit FinO-Domäne kürzlich als eine neue Familie von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit regula-torischen Funktionen in verschiedenen Bakterien identifiziert. Sie weisen eine große Bandbreite regulierter Gene auf: Während das Plasmid-kodierte FinO-Protein nur ein ein-zelnes RNA-Paar bindet, stellt das enterobakterielle ProQ-Protein ein globales RBP dar. Um die Wirkungsweise dieser RBP-Familie besser zu verstehen, wurde in vivo untersucht, wie viele RNAs mit dem minimalen ProQ-Protein in N. meningitidis assoziiert sind. Durch Kombination von UV-Crosslinken mit RNA-Sequenzierung (UV-CLIP) konnte die Bin-dung von 16 sRNAs und 166 biologisch diverser mRNAs mit ProQ identifiziert werden, welches daher ebenfalls ein globales RBP in Meningokokken darstellt. Es konnte gezeigt werden, dass ProQ vorwiegend RNA-Regionen mit ausgeprägter Sekundärstruktur bin-det, darunter DNA-Aufnahmesequenzen (DUS) und Rho-unabhängige Transkriptions-terminatoren. Die ProQ-Bindung führt dabei häufig zur Stabilisation der RNAs, was durch Rifampicin-Stabilitätsexperimente nachgewiesen wurde. Wie aufgrund der großen Zahl ProQ-gebundener RNAs zu erwarten, beeinflusste die Deletion des ProQ Proteins die zelluläre Expression von mindestens 244 mRNAs und 80 Proteinen. Phänotypische Analysen deuten darauf hin, dass ProQ sowohl die Toleranz gegenüber oxidativem Stress als auch die Reparatur von DNA-Schäden reguliert, die beide für die vollständige Viru-lenz von N. meningitidis von Bedeutung sind. 
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Koexistenz von zwei großen posttranskrip-tionellen Regulons in N. meningitidis, von denen eines von ProQ und das andere von Hfq kontrolliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle beider RBPs und ihrer assozi-ierten sRNAs für die bakterielle Virulenz verdeutlicht und hervorgehoben, dass Riboregu-lation sehr wahrscheinlich dazu beiträgt, wie sich Meningokokken an verschiedene Wirts-nischen anpassen.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Small non-messenger RNS
KW  - Hfq
KW  - ProQ
KW  - Non-coding RNA
KW  - High throughput screening
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192978
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hagmann, Hanns Antony
T1  - The impact of the CRISPR/Cas system on the interaction of Neisseria meningitidis with human host cells
T1  - Der Einfluss des CRISPR/Cas-Systems auf die Interaktion von Neisseria meningitidis mit menschlichen Wirtszellen
N2  - Neisseria meningitidis, a commensal β-proteobacterium residing exclusively in the human nasopharynx, is a leading cause of sepsis and epidemic meningitis worldwide. While comparative genome analysis was able to define hyperinvasive lineages that are responsible for most of the cases of invasive meningococcal disease (IMD), the genetic basis of their virulence remains unclear. Recent studies demonstrate that the type II C CRISPR/Cas system of meningococci is associated with carriage and less invasive lineages. CRISPR/Cas, an adaptive defence system against foreign DNA, was shown to be involved in gene regulation in Francisella novicida. This study shows that knockout strains of N. meningitidis lacking the Cas9 protein are impaired in the adhesion to human nasopharyngeal cells in a strain-dependant manner, which constitutes a central step in the pathogenesis of IMD. Consequently, this study indicates that the meningococcal CRISPR/Cas system fulfils functions beyond the defence of foreign DNA and is involved in the regulation of meningococcal virulence.
N2  - Neisseria meningitidis, ein ß-Proteobakterium, welches als Kommensale ausschließlich den humanen Nasopharynx besiedelt, ist ein weltweit führender Verursacher von Sepsis und epidemischer Meningitis. Auch wenn mittels vergleichender Genomanalysen hyperinvasive Stämme definiert werden konnten, welche für die meisten Fälle von invasiven Meningokokkenerkrankungen verantwortlich sind, bleibt die genetische Grundlage ihrer Virulenz ungeklärt. In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass das Typ II-C CRISPR/Cas-System der Meningokokken assoziiert ist mit Trägerstämmen. CRISPR/Cas ist ein adaptives Verteidigungssystem der Bakterien gegen fremde DNA, das darüber hinaus Aufgaben in der Genregulation von Francisella novicida erfüllt. Diese Arbeit zeigt, dass knockout Stämme von N. meningitidis, denen das Cas9-Protein fehlt, in Abhängigkeit von ihrem genetischen Hintergrund die Fähigkeit verlieren an Zellen des menschlichen Nasopharynx zu adhärieren. Die Adhäsion an den Wirtszellen stellt einen zentralen
Schritt in der Pathogenese der invasiven Meningokokkenerkrankungen dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass das CRISPR/Cas-System in Meningokokken neben seiner Funktion als bakterielles Immunsystem an der Regulation der bakteriellen Virulenz beteiligt sein könnte.
KW  - CRISPR/Cas-Methode
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Bacteria-Host Cell Interaction
KW  - Regulation of Gene Expression
KW  - Cas9
KW  - Type II-C CRISPR/Cas
KW  - Adhesion and Invasion
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199490
ER  - 
TY  - THES
A1  - Peters, Simon
T1  - The impact of sphingolipids on \(Neisseria\)  \(meningitidis\) and their role in meningococcal pathogenicity
T1  - Einfluss von Sphingolipiden auf \(Neisseria\)  \(meningitidis\) und deren Bedeutung für die Pathogenität
N2  - The obligate human pathogen Neisseria meningitidis is a major cause of sepsis and meningitis worldwide. It affects mainly toddlers and infants and is responsible for thousands of deaths each year. In this study, different aspects of the importance of sphingolipids in meningococcal pathogenicity were investigated. In a first step, the acid sphingomyelinase (ASM), which degrades membrane sphingomyelin to ceramide, was studied in the context of meningococcal infection. A requirement for ASM surface activity is its translocation from the lysosomal compartment to the cell surface, a process that is currently poorly understood.
This study used various approaches, including classical invasion and adherence assays, flow cytometry, and classical and super resolution immunofluorescence microscopy (dSTORM). The results showed that the live, highly piliated N. meningitidis strain 8013/12 induced calcium-dependent ASM translocation in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC). Furthermore, it promoted the formation of ceramide-rich platforms (CRPs). In addition, ASM translocation and CRP formation were observed after treating the cells with pili-enriched fractions derived from the same strain. The importance for N. meningitidis to utilize this pathway was shown by the inhibition of the calcium-dependent ASM translocation, which greatly decreased the number of invasive bacteria. 
I also investigated the importance of the glycosphingolipids GM1 and Gb3. The results showed that GM1, but not Gb3, plays an important role in the ability of N. meningitidis to invade HBMEC. By combining dSTORM imaging and microbiological approaches, we demonstrated that GM1 accumulated prolifically around bacteria during the infection, and that this interaction seemed essential for meningococcal invasion.  
Sphingolipids are not only known for their beneficial effect on pathogens. Sphingoid bases, including sphingosine, are known for their antimicrobial activity. In the last part of this study, a novel correlative light and electron microscopy approach was established in the combination with click chemistry to precisely localize azido-functionalized sphingolipids in N. meningitidis. The result showed a distinct concentration-dependent localization in either the outer membrane (low concentration) or accumulated in the cytosol (high concentration). This pattern was confirmed by mass spectrometry on separated membrane fractions. Our data provide a first insight into the underlying mechanism of antimicrobial sphingolipids.
N2  - Der obligate Humanpathogen Neisseria meningitidis ist weltweit einer der Hauptursachen für Sepsis und Meningitis. Er befällt vor allem Kleinkinder und Säuglinge und ist jedes Jahr für Tausende von Todesfällen verantwortlich. In dieser Studie wurden verschiedene Aspekte der Bedeutung von Sphingolipiden bei der Pathogenität von Meningokokken untersucht. In einem ersten Schritt wurde die saure Sphingomyelinase (ASM), die Membran-Sphingomyelin zu Ceramid abbaut, im Zusammenhang mit einer Meningokokken-Infektion untersucht. Eine Voraussetzung für die Oberflächenaktivität der ASM ist ihre Translokation vom lysosomalen Kompartiment auf die Zelloberfläche, ein Prozess, der derzeit noch wenig verstanden wird.
In dieser Studie wurden verschiedene Ansätze verwendet, darunter klassische Invasions- und Adhärenztests, Durchflusszytometrie sowie klassische und superauflösende Immunfluoreszenzmikroskopie (dSTORM). Die Ergebnisse zeigten, dass der lebende, hochpiliatisierte N. meningitidis Stamm 8013/12 eine kalziumabhängige ASM-Translokation in mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns (HBMEC) induzierte. Des Weiteren förderte er die Bildung Ceramid-reicher Plattformen (CRPs). Zusätzlich wurden ASM-Translokation und CRP-Bildung beobachtet, nachdem die Zellen mit pili-angereicherten Fraktionen desselben Stammes behandelt worden waren. Die Bedeutung für N. meningitidis in der Pathogenese zeigte sich durch die Hemmung der Calcium-abhängigen ASM-Translokation, wodurch die Zahl der invasiven Bakterien stark reduziert wurde. 
Ich untersuchte auch die Bedeutung der Glykosphingolipide GM1 und Gb3. Die Ergebnisse zeigten, dass GM1, aber nicht Gb3, eine wichtige Rolle bei der Fähigkeit von N. meningitidis spielt, in Gehirnendothelzellen einzudringen. Durch die Kombination von dSTORM-Bildgebung und mikrobiologischen Ansätzen konnten wir zeigen, dass sich GM1 während der Infektion vermehrt um die Bakterien herum anreicherte und dass diese Interaktion für die Invasion von Meningokokken essenziell ist.  
Sphingolipide sind nicht nur für ihre positive Wirkung auf Krankheitserreger bekannt. Sphingoidbasen, einschließlich Sphingosin, sind zusätzlich für ihre antimikrobielle Aktivität bekannt. Im letzten Teil dieser Studie wurde ein neuartiger korrelativer licht- und elektronenmikroskopischer Ansatz in der Kombination mit Click-Chemie etabliert, um azidofunktionalisierte Sphingolipide in N. meningitidis genau zu lokalisieren. Das Ergebnis zeigte eine deutliche konzentrationsabhängige Lokalisation entweder in der äußeren Membran (niedrige Konzentration) oder akkumuliert im Zytosol (hohe Konzentration). Dieses Muster konnte durch einen Massenspektrometrischen Ansatz bestätigt werden. Hierfür wurde eine Separation der inneren und äußeren Membran, nach Behandlung mit der niedrigen Konzentration, etabliert. Die verschiedenen Membranfraktionen wurden anschließend auf ihren Gehalt an funktionalisierten Sphingolipiden hin untersucht und bestätigten die lokalisierung in der äußeren Membran. Unsere Daten geben einen ersten Einblick in den zugrundeliegenden Mechanismus der antimikrobiellen Sphingolipide.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Sphingolipide
KW  - Infektion
KW  - Pathogenität
KW  - host-pathogen interaction
KW  - antimicrobial
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226233
ER  - 
TY  - THES
A1  - Herrmann, Johannes Bernd
T1  - Rolle des Komplement C5a-Rezeptors 1 in der Pathophysiologie der Meningokokken-Sepsis
T1  - Role of complement C5a-Receptor 1 in Pathophysiology of Meningococcal Sepsis
N2  - Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden.
N2  - The encapsulated, Gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is an asymp-tomatic commensal in the human upper respiratory tract. In rare cases and especially in children, this human-specific pathogen is able to invade into the blood stream and cause life-threatening disorders like meningoencephalitis and septicemia, which are subsumed as „invasive meningococcal disease“ (IMD). The estimated number of cases is about 1.2 mio per year worldwide. IMD is greatly feared because of its fulminant progression and its high lethality. It is very well known, that the human complement system holds an essential role to fight meningococcal sepsis. In this context, the protective effects of the lytic (membrane attack complex MAC) and opsonizing branches (opsonines iC3b and C1q) are well established. On the contrary, very little is known about the contribution of the inflammatory branch (anaphylatoxines C3a and C5a) in meningococcal sepsis. Therefore, this work focused on the role of the C5a-Receptor 1 (C5aR1) in pathophysi-ology of meningococcal sepsis in a murine model. After having established the para-mount role of complement in murine intraperitoneal infection model, we could observe a detrimental effect of C5aR1 in Meningococcal sepsis. The absence of C5aR1 resulted in a higher overall survival, ameliorated clinical status, lower bacteremia and lower levels of the proinflammatory mediators IL-6, CXCL-1, TNF-α. Particularly with regard to results about the cellular pathomechanism, the C5aR1 seems to cause an increased re-lease of proinflammatory mediators (cytokine storm) exerted by various cell populations. As a consequence, cellular paralysis, increasing bacterial burden and higher lethality rate seems to occur. In reference to depletion experiments and immunofluorescence stain-ings, we could observe protective overall effects of neutrophils and mono-cytes/macrophages, uncorrelated to C5aR1 presence. Ultimately, the cyclic C5aR1-antagonist PMX205 appeared to be a promising option to improve parameters in murine meningococcal sepsis. Further experiments are required to examine the potential of this compound in human meningococcal sepsis. Moreover, the murine, intraperitoneal infec-tion model could be used to clarify the role of C5aR2 in meningococcal sepsis.
KW  - Komplement C5a
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Meningokokken-Sepsis
KW  - Komplement C5a Rezeptor 1
KW  - C5aR1-Antagonist
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184533
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gomes, Sara Ferreira Martins
T1  - Induced Pluripotent Stem Cell-derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection
T1  - Induziert pluripotente Stammzellen-basierte Hirnendothelzellen als zelluläres Modell zur Untersuchung der Infektion mit Neisseria meningitidis
N2  - Bacterial meningitis occurs when blood-borne bacteria are able to penetrate highly specialized brain endothelial cells (BECs) and gain access to the meninges. Neisseria meningitidis (Nm) is a human-exclusive pathogen for which suitable in vitro models are severely lacking. Until recently, modeling BEC-Nm interactions has been almost exclusively limited to immortalized human cells that lack proper BEC phenotypes. Specifically, these in vitro models lack barrier properties, and continuous tight junctions. Alternatively, humanized mice have been used, but these must rely on known interactions and have limited translatability. This motivates the need to establish novel human-based in vitro BEC models that have barrier phenotypes to research Nm-BEC interactions. Recently, a human induced pluripotent stem cell (iPSC) model of BECs has been developed that possesses superior BEC phenotypes and closely mimics the in vivo blood vessels present at the blood-meningeal barrier.
Here, iPSC-BECs were tested as a novel cellular model to study Nm-host pathogen interactions, with focus on host responses to Nm infection. Two wild type strains and three mutant strains of Nm were used to confirm that these followed similar phenotypes to previously described models. Importantly, the recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, at distinct time points of infection, and the secretion of IFN γ and RANTES by iPSC-BECs. Nm was directly observed to disrupt tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5 at late time points of infection, which became frayed and/or discontinuous upon infection. This destruction is preceded by, and might be dependent on, SNAI1 activation (a transcriptional repressor of tight junction proteins). In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability was observed at late infection time points. Notably, bacterial transmigration correlated with junctional disruption, indicating that the paracellular route contributes for bacterial crossing of BECs. Finally, RNA-Sequencing (RNA-Seq) of sorted, infected iPSC-BECs was established through the use of fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques following infection. This allowed the detection of expression data of Nm-responsive host genes not previously described thus far to play a role during meningitidis. 
In conclusion, here the utility of iPSC-BECs in vitro to study Nm infection could be demonstrated. This is the first BEC in vitro model to express all major BEC tight junctions and to display high barrier potential. Altogether, here this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes and suggests that the paracellular route contributes to Nm traversal of BECs.
N2  - Eine bakterielle Meningitis tritt auf, wenn durch Blut übertragene Bakterien hochspezialisierte Hirnendothelzellen (BEC) durchdringen und Zugang zu den Meningen erhalten. Neisseria meningitidis (Nm) ist ein human-exklusiver Erreger, für dessen Untersuchung es an geeigneten In-vitro-Modellen mangelt. Bis vor kurzem war die Modellierung von BEC-Nm-Wechselwirkungen fast ausschließlich auf immortalisierte humane Zellen beschränkt, denen wichtige BEC-Phänotypen fehlen. Besonders hervorzuheben sind das Fehlen physiologischer Barriereeigenschaften durch unkontinuierliche dichte Zell-Zell-Verbindungen. Als alternative Modellorganismen können humanisierte Mäuse verwendet werden, die sich jedoch auf bekannte Wirt-Erreger-Wechselwirkungen stützen und durch Speziesunterschiede eine eingeschränkte Übersetzbarkeit aufweisen. Dies begründet die Notwendigkeit, neuartige humane In-vitro-BEC-Modelle zu etablieren, die physiologische Barrierephänotypen aufweisen, um Nm-BEC-Wechselwirkungen zu untersuchen. Kürzlich wurde ein humanes Modell entwickelt, welches auf aus induziert pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleiteten humanen BECs basiert und sich durch einen physiologischen Blut-Hirn-Schranken-Phänotyp auszeichnet.
Die iPSC-BECs wurden in dieser Arbeit als neuartiges zelluläres Modell getestet, um Nm-Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf Wirtsreaktionen auf Nm-Infektionen lag. Zwei Wildtypstämme und drei Mutantenstämme von Nm wurden verwendet, um zu bestätigen, dass diese ähnlichen Phänotypen wie in zuvor beschriebenen Modellen folgten. Hervorzuheben ist, dass die Rekrutierung des kürzlich veröffentlichten Pilus-Adhäsin-Rezeptors CD147 unter Meningokokken-Mikrokolonien in iPSC-BECs verifiziert werden konnte. Es wurde auch beobachtet, dass Nm die Expression der entzündungsfördernden und neutrophilen spezifischen Chemokine IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8 und CCL20 zu bestimmten Zeitpunkten der Infektion sowie die Sekretion von IFN-γ und RANTES durch iPSC-BECs signifikant erhöht. Es wurde zudem beobachtet, dass Nm die Tight Junction-Proteine ZO-1, Occludin und Claudin-5 zu späten Zeitpunkten der Infektion zerstört, verursacht durch die Infektion wurde ein ausgefranster und/oder diskontinuierlicher Tight Junction-Phänotyp beobachtet. Dieser Zerstörung geht die SNAI1-Aktivierung (ein Transkriptionsrepressor für Tight Junction-Proteine) voraus und könnte von ihr abhängig sein. In Übereinstimmung mit dem Verlust der Tight Junctions wurde zu späten Infektionszeitpunkten ein starker Verlust des transendothelialen elektrischen Widerstands und eine Zunahme der Natriumfluoreszein-Permeabilität beobachtet. Bemerkenswerterweise korrelierte die bakterielle Transmigration mit dem Verlust der Tight Junctions, was darauf hinweist, dass der parazelluläre Weg zur bakteriellen Überwindung von BECs eine entscheidende Rolle spielt. Schließlich wurde die RNA-Sequencing (RNA-Seq) von sortierten, infizierten iPSC-BECs durch die Verwendung von fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechniken (FACS) nach der Infektion durchgeführt. Dies ermöglichte erstmalig den Nachweis von Expressionsdaten von Nm-responsiven Wirtsgenen, welche bei der Meningitidis eine Rolle zu spielen scheinen.
Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Nutzen von iPSC-BECs In-Vitro-Modellen zur Untersuchung von Nm-Infektionen gezeigt werden. Dies ist das erste BEC-In-vitro-Modell, das alle wichtigen BEC-Tight Junctions exprimiert und ein hohes Barrierepotential aufweist. Insgesamt liefert das eingesetzte Modell neue Einblicke in die Nm-Pathogenese, einschließlich der Beeinflussung der Barriereeigenschaften und der Tight Junction-Komplexe durch Nm, und gibt erste Hinweise darauf, dass die parazelluläre Route zum Nm-Übertritt von BEC-Barrieren eine entscheidende Rolle spielt.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - endothelial cells
KW  - blood brain barrier
KW  - blood cerebrospinal fluid barrier
KW  - cellular model
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - endothelial cells
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188550
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krüger, Sören
T1  - Unterschiedliche Einflüsse von Komplement auf Reaktionen neutrophiler Granulozyten auf die Infektion mit \(Neisseria\) \(meningitidis\)
T1  - Differential influences of complement on neutrophil responses to \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection
N2  - The gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is a frequent human-specific, commensal bacterium of the upper respiratory tract. Under certain conditions especially in infants, meningococci can translocate into the bloodstream and cause invasive meningococcal disease (IMD) manifesting as meningitis or sepsis or a combination of both. IMD is feared for its rapid progression and high fatality rate if it remains untreated. IMD affects up to one million people annually causing substantial morbidity and mortality worldwide. It is well-established that the complement system is an important protective factor in meningococcal disease through opsonization of bacteria with C3b and the lytic activity of the membrane attack complex although the inflammatory C5a/C5aR1 axis can aggravate IMD. The role of neutrophil granulocytes in meningococcal infection is less clear despite their abundant recruitment throughout the course of disease. This study aimed to characterize neutrophil responses to Nme in vitro and the influence of complement on these responses. In infection assays with whole blood and isolated PMNs, effective binding, internalization and killing of Nme by neutrophils was demonstrated. A significant complement-dependence of neutrophil phagocytosis and oxidative burst was observed. The opsonizing and lytic pathway of the complement cascade were found to be most relevant for these responses since blockade of C3 using inhibitor Compstatin Cp20 reduced phagocytosis and oxidative burst significantly more than the blockade of the inflammatory branch with C5aR1-antagonist PMX53. Opsonization with specific antibodies could not replicate the effect of complement activation indicating that engagement of neutrophil complement receptors, particularly complement receptor 3, is involved. Other neutrophil effector functions such as degranulation and IL-8 release were activated in a complement-independent manner implying activation by other inflammatory signals. Considering existing evidence on the overall protective effect of PMNs, further studies investigating the contribution of each neutrophil effector function to infection survival in vivo are required. Ideally, this should be studied in a murine meningitis or sepsis model in the context of complement activation.
N2  - Der Gram-negative Diplokokkus Neisseria meningitidis (Nme) ist ein weit verbreitetes, human-spezifisches, kommensales Bakterium des oberen Respirationstraktes. Unter bestimmten Bedingungen, insbesondere bei Kleinkindern, können Meningokokken in die Blutbahn translozieren und eine invasive Meningokokkenerkrankung (IMD) auslösen, die sich als Meningitis, Sepsis oder eine Kombination beider Krankheitsbilder manifestiert. IMD werden aufgrund ihrer raschen Progression und ohne Behandlung hohen Letalität gefürchtet. IMD betreffen jährlich bis zu einer Million Menschen weltweit mit substanzieller Morbidität und Mortalität. Es ist bekannt, dass das Komplement-system bei IMD als protektiver Faktor durch die Opsonisierung von Nme mit C3b und Lyse mittels Membranangriffskomplex wirkt, obwohl die inflammatorische C5a/C5aR1-Achse die Erkrankung aggravieren kann. Die Rolle neutrophiler Granulozyten (PMNs) bei IMD bleibt hingegen kontrovers, obwohl eine starke Rekrutierung dieser Zellen stattfindet. Diese Studie charakterisiert die Reaktionen neutrophiler Granulozyten auf Nme in vitro und deren Modulation durch Komplement. In Infektionsassays mit Vollblut und isolierten PMNs konnte die Bindung, Internalisierung und Elimination von Nme durch PMNs demonstriert werden. Oxidativer burst und Phagozytose zeigten dabei eine ausgeprägte Abhängigkeit von Komplement. Die opsonisierende und lytische Wirkung von Komplement erwiesen sich dabei als relevant für diese Funktionen, da die Blockade von C3 durch den Inhibitor Compstatin Cp20 Phagozytose und oxidativen Burst signifikant stärker reduzierte als die Blockade der Inflammation durch C5a mittels C5aR1-Antagonist PMX53. Die Opsonisierung mit spezifischen Antikörpern konnte den Effekt der Komplementaktivierung nicht replizieren, was auf eine Signalvermittlung durch Komplementrezeptoren insbesondere CR3 hindeutet. Andere Effektorfunktionen wie Degranulation und IL-8 Freisetzung waren komplementunabhängig, was auf deren Initiierung durch andere inflammatorische Signale hindeutet. In Anbetracht bestehender Evidenz für einen insgesamt protektiven Effekt von PMN sind weitere Studien nötig, die den Effekt der einzelnen Effektorfunktionen auf das Outcome in vivo untersuchen. Besonders geeignet wäre dafür ein murines Sepsis oder Meningitis-Modell.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Neutrophiler Granulozyt
KW  - Komplement
KW  - Complement system
KW  - Neutrophil granulocyte
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249697
ER  - 
TY  - THES
A1  - Endres, Leo Maximilian
T1  - Development of multicellular \(in\) \(vitro\) models of the meningeal blood-CSF barrier to study \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection
T1  - Entwicklung multizellulärer \(in\) \(vitro\) Modelle der meningealen Blut-Liquor Schranke zur Untersuchung der \(Neisseria\) \(meningitidis\) Infektion
N2  - Neisseria meningitidis (the meningococcus) is one of the major causes of bacterial meningitis, a life-threatening inflammation of the meninges. Traversal of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier (mBCSFB), which is composed of highly specialized brain endothelial cells (BECs), and subsequent interaction with leptomeningeal cells (LMCs) are critical for disease progression. Due to the human-exclusive tropism of N. meningitidis, research on this complex host-pathogen interaction is mostly limited to in vitro studies. Previous studies have primarily used peripheral or immortalized BECs alone, which do not retain relevant barrier phenotypes in culture. To study meningococcal interaction with the mBCSFB in a physiologically more accurate context, BEC-LMC co-culture models were developed in this project using BEC-like cells derived from induced pluripotent stem cells (iBECs) or hCMEC/D3 cells in combination with LMCs derived from tumor biopsies. 
Distinct BEC and LMC layers as well as characteristic expression of cellular markers were observed using transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining. Clear junctional expression of brain endothelial tight and adherens junction proteins was detected in the iBEC layer. LMC co-culture increased iBEC barrier tightness and stability over a period of seven days, as determined by sodium fluorescein (NaF) permeability and transendothelial electrical resistance (TEER). Infection experiments demonstrated comparable meningococcal adhesion and invasion of the BEC layer in all models tested, consistent with previously published data. While only few bacteria crossed the iBEC-LMC barrier initially, transmigration rates increased substantially over 24 hours, despite constant high TEER. After 24 hours of infection, deterioration of the barrier properties was observed including loss of TEER and altered expression of tight and adherens junction components. Reduced mRNA levels of ZO-1, claudin-5, and VE-cadherin were detected in BECs from all models. qPCR and siRNA knockdown data suggested that transcriptional downregulation of these genes was potentially but not solely mediated by Snail1. Immunofluorescence staining showed reduced junctional coverage of occludin, indicating N. meningitidis-induced post-transcriptional modulation of this protein, as previous studies have suggested. Together, these results suggest a potential combination of transcellular and paracellular meningococcal traversal of the mBCSFB, with the more accessible paracellular route becoming available upon barrier disruption after prolonged N. meningitidis infection. Finally, N. meningitidis induced cellular expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-8 in all mBCSFB models. Overall, the work described in this thesis highlights the usefulness of advanced in vitro models of the mBCSFB that mimic native physiology and exhibit relevant barrier properties to study infection with meningeal pathogens such as N. meningitidis.
N2  - Neisseria meningitidis (der Meningokokkus) ist einer der Hauptursachen bakterieller Meningitis, einer lebensbedrohlichen Entzündung der Hirnhäute. Entscheidend für das für das Voranschreiten der Krankheit ist die Fähigkeit des Erregers, die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB), bestehend aus spezialisierten Hirnendothelzellen (BECs) und leptomeningealen Zellen (LMCs), zu überwinden und in den submeningealen Raum einzudringen. Da es sich bei N. meningitidis um ein rein humanes Pathogen handelt, beschränkt sich die Erforschung dieser speziellen Interaktion primär auf die Verwendung von in vitro Modellen. Bisher wurden hierfür hauptsächlich periphere oder immortalisierte BECs verwendet, welchen jedoch wichtige Barriere-Eigenschaften fehlen. Um die Interaktion von N. meningitidis mit der mBCSFB in einem physiologisch relevanteren Umfeld zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit neuartige BEC-LMC Kokulturmodelle entwickelt. 
Dabei wurden sowohl BEC-ähnliche Zellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen generiert wurden (iBECs), als auch hCMEC/D3 Zellen verwendet und zusammen mit LMCs aus Tumorbiopsien kultiviert. Mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung konnten die unterschiedlichen Zellschichten und deren Expression charakteristischer zellulärer Marker dargestellt werden. Durchgängige Expression von wichtigen Bestandteilen Barriere-formender Zellverbindungen, sogenannter Tight und Adherens Junctions, wurde in der iBEC-Schicht beobachtet. Die Integrität der zellulären Barriere wurde mittels transendothelialer elektrischer Resistenz (TEER) und Permeabilität gegenüber Natrium-Fluorescein (NaF) bestimmt. Erhöhte TEER-Werte und verringerte NaF-Permeabilität, gemessen über einen Zeitraum von sieben Tagen, zeigten eine durch die Kokultur mit LMCs ausgelöste Steigerung der Dichtigkeit und Stabilität der iBEC-Barriere. 
Infektionsexperimente mit N. meningitidis zeigten in allen Modellen vergleichbare bakterielle Adhäsion und Invasion der BEC-Schicht. Bakterielle Transmigration durch die gesamten Zellbarriere war im iBEC-LMC Modell kurz nach Infektion nur in geringem Maße detektierbar, nahm jedoch innerhalb von 24 Stunden deutlich zu. Interessanterweise wurde bis zu 24 Stunden nach Infektion noch eine hohe Integrität der Barriere gemessen, welche allerdings im weiteren Verlauf verloren ging. Neben signifikantem TEER-Verlust wurde eine verringerte Expression der Tight und Adherens Junction Proteine ZO-1, claudin-5, und VE-cadherin mittels qPCR festgestellt. qPCR und siRNA Knockdown Experimente deuteten darauf hin, dass dies möglicherweise, aber nicht ausschließlich, auf den Transkriptionsfaktor Snail1 zurückzuführen war. Zusätzlich zu den beobachteten Effekten auf die zelluläre Transkription von Tight Junction Genen, zeigten Immunfluoreszenzfärbungen eine verringerte Expression von Occludin an den Zell-Zell-Verbindungen, was auf eine post-translationale Modulation schließen lässt. Zusammen deuten die Ergebnisse dieser Infektionsstudien auf eine mögliche Kombination aus trans- und parazellulärer bakterieller Transmigration der mBCSFB hin. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch die Immunaktivierung von BECs nach N. meningitidis Infektion in den neuen BEC-LMC Kokulturmodellen untersucht. Hierbei wurde eine erhöhte Expression von Zytokinen, insbesondere Interleukin-8, beobachtet. 
Insgesamt konnten in dieser Arbeit neue, fortschrittlicher in vitro Modelle der mBCSFB entwickelt werden, welche die humane Physiologie besser widerspiegeln und daher für Infektionsstudien mit Meningitis-verursachenden Erregern wie N. meningitidis von besonderem Nutzen sind.
KW  - Bakterielle Hirnhautentzündung
KW  - Blut-Liquor-Schranke
KW  - Induzierte pluripotente Stammzelle
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - In-vitro-Kultur
KW  - Brain endothelial cells
KW  - Leptomeningeal cells
KW  - Hirnendothelzellen
KW  - Leptomeningealzellen
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346216
ER  -