TY - THES A1 - Leikeim, Anna T1 - Vascularization Strategies for Full-Thickness Skin Equivalents to Model Melanoma Progression T1 - Vaskularisierungsstrategien für Vollhautäquivalente zur Modellierung der Melanom-Progression N2 - Malignant melanoma (MM) is the most dangerous type of skin cancer with rising incidences worldwide. Melanoma skin models can help to elucidate its causes and formation or to develop new treatment strategies. However, most of the current skin models lack a vasculature, limiting their functionality and applicability. MM relies on the vascular system for its own supply and for its dissemination to distant body sites via lymphatic and blood vessels. Thus, to accurately study MM progression, a functional vasculature is indispensable. To date, there are no vascularized skin models to study melanoma metastasis in vitro, which is why such studies still rely on animal experimentation. In the present thesis, two different approaches for the vascularization of skin models are employed with the aim to establish a vascularized 3D in vitro full-thickness skin equivalent (FTSE) that can serve as a test system for the investigation of the progression of MM. Initially, endothelial cells were incorporated in the dermal part of FTSEs. The optimal seeding density, a spheroid conformation of the cells and the cell culture medium were tested. A high cell density resulted in the formation of lumen-forming shapes distributed in the dermal part of the model. These capillary-like structures were proven to be of endothelial origin by staining for the endothelial cell marker CD31. The established vascularized FTSE (vFTSE) was characterized histologically after 4 weeks of culture, revealing an architecture similar to human skin in vivo with a stratified epidermis, separated from the dermal equivalent by a basement membrane indicated by collagen type IV. However, this random capillary-like network is not functional as it cannot be perfused. Therefore, the second vascularization approach focused on the generation of a perfusable tissue construct. A channel was molded within a collagen hydrogel and seeded with endothelial cells to mimic a central, perfusable vessel. The generation and the perfusion culture of the collagen hydrogel was enabled by the use of two custom-made, 3D printed bioreactors. Histological assessment of the hydrogels revealed the lining of the channel with a monolayer of endothelial cells, expressing the cell specific marker CD31. For the investigation of MM progression in vitro, a 3D melanoma skin equivalent was established. Melanoma cells were incorporated in the epidermal part of FTSEs, representing the native microenvironment of the tumor. Melanoma nests grew at the dermo-epidermal junction within the well stratified epidermis and were characterized by the expression of common melanoma markers. First experiments were conducted showing the feasibility of combining the melanoma model with the vFTSE, resulting in skin models with tumors at the dermo-epidermal junction and lumen-like structures in the dermis. Taken together, the models presented in this thesis provide further steps towards the establishment of a vascularized, perfusable melanoma model to study melanoma progression and metastasis. N2 - Das maligne Melanom (MM) ist die gefährlichste Form von Hautkrebs mit weltweit steigender Inzidenz. Melanom-Hautmodelle können helfen, seine Ursachen und Entstehung aufzuklären oder neue Behandlungsstrategien zu entwickeln. Den meisten bisherigen Hautmodellen fehlt jedoch ein Gefäßsystem, was ihre Funktionalität und Anwendbarkeit einschränkt. Das MM ist auf das Gefäßsystem angewiesen, sowohl für die eigene Versorgung als auch für die Ausbreitung über Lymph- und Blutgefäße zu entfernten Körperstellen. Um die Entwicklung des MM genau zu studieren, ist daher eine funktionelles Gefäßsystem unabdingbar. Bislang gibt es keine vaskularisierten Hautmodelle, um die Melanommetastasierung in vitro zu untersuchen, weshalb solche Studien immer noch auf Tierversuche angewiesen sind. In der vorliegenden Arbeit werden zwei unterschiedliche Ansätze zur Vaskularisierung von Hautmodellen mit dem Ziel verfolgt, ein vaskularisiertes 3D in vitro Vollhautmodell (full-thickness skin equivalent, FTSE) zu etablieren, das als Testsystem zur Untersuchung der Entwicklung des MM dienen kann. Einerseits wurden Endothelzellen in den dermalen Teil von FTSEs integriert. Die optimale Aussaatdichte, eine sphäroidale Konformation der Zellen und das Zellkulturmedium wurden getestet. Eine hohe Zelldichte führte zur Bildung von lumenbildenden Formen, die im dermalen Teil des Modells verteilt waren. Diese kapillarähnlichen Strukturen wurden durch Färbung für den Endothelzellmarker CD31 als endothelialen Ursprungs nachgewiesen. Das etablierte vaskularisierte FTSE (vFTSE) wurde nach 4 Wochen Kultur histologisch charakterisiert und zeigte eine der menschlichen Haut in vivo ähnliche Architektur mit einer geschichteten Epidermis, die vom dermalen Äquivalent durch eine Basalmembran, gezeigt durch Kollagen Typ IV, getrennt ist. Dieses zufällige kapillarartige Netzwerk ist jedoch nicht funktional, da es nicht durchblutet werden kann. Daher konzentrierte sich der zweite Vaskularisierungsansatz auf die Erzeugung eines perfundierbaren Gewebekonstrukts. Ein Kanal wurde in einem Kollagenhydrogel geformt und mit Endothelzellen besiedelt, um ein zentrales, perfundierbares Gefäß zu imitieren. Die Erzeugung und die Perfusionskultur des Kollagenhydrogels wurde durch die Verwendung von zwei speziell angefertigten, 3D-gedruckten Bioreaktoren ermöglicht. Die histologische Beurteilung der Hydrogele zeigte die Auskleidung des Kanals mit einer Einzelschicht von Endothelzellen, die den zellspezifischen Marker CD31 exprimieren. Für die Untersuchung der MM-Progression in vitro wurde ein 3D-Melanom-Hautäquivalent hergestellt. Melanomzellen wurden in den epidermalen Teil von FTSEs integriert, was die native Mikroumgebung des Tumors darstellt. Die Melanomnester wuchsen an der dermo-epidermalen Grenzfläche innerhalb der gut stratifizierten Epidermis und wurden durch die Expression gängiger Melanommarker charakterisiert. Zusätzlich konnte die Kombination des Melanom-Modells mit dem vFTSE gezeigt werden, was zu Hautmodellen mit Tumoren an der dermo-epidermalen Grenzfläche und lumenartigen Strukturen in der Dermis führte. Alles in allem bieten die in dieser Arbeit vorgestellten Modelle weitere Schritte hin zur Entwicklung eines vaskularisierten, perfundierbaren Melanommodell zur Erforschung der Melanomprogression und Metastasierung. KW - Tissue Engineering KW - In-vitro-Kultur KW - Melanom KW - skin model KW - vascularization KW - in vitro-Testsystem KW - perfused hydrogel Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272956 ER - TY - THES A1 - Kremer, Antje T1 - Tissue Engineering of a Vascularized Meniscus Implant T1 - Tissue Engineering eines vaskularisierten Meniskus-Implantates N2 - The knee joint is a complex composite joint containing the C-shaped wedge-like menisci composed of fibrocartilage. Due to their complex composition and structure, they provide mechanical resilience to the knee joint protecting the articular cartilage. Because of the limited repair potential, meniscal injuries do not only affect the meniscus itself but also lead to altered joint homeostasis and inevitably to secondary osteoarthritis. The meniscus was characterized focusing on its anatomy, structure and meniscal markers such as aggrecan, collagen type I (Col I) and Col II. The components relevant for meniscus tissue engineering, namely cells, Col I scaffolds, biochemical and biomechanical stimuli were studied. Meniscal cells (MCs) were isolated from meniscus, mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow and dermal microvascular endothelial cells (d-mvECs) from foreskin biopsies. For the human (h) meniscus model, wedge-shape compression of a hMSC-laden Col I gel was successfully established. During three weeks of static culture, the biochemical stimulus transforming growth factor beta-3 (TGF beta-3) led to a compact collagen structure. On day 21, this meniscus model showed high metabolic activity and matrix remodeling as confirmed by matrix metalloproteinases detection. The fibrochondrogenic properties were illustrated by immunohistochemical detection of meniscal markers, significant GAG/DNA increase and increased compressive properties. For further improvement, biomechanical stimulation systems by compression and hydrostatic pressure were designed. As one vascularization approach, direct stimulation with ciclopirox olamine (CPX) significantly increased sprouting of hd-mvEC spheroids even in absence of auxiliary cells such as MSCs. Second, a cell sheet composed of hMSCs and hd-mvECs was fabricated by temperature triggered cell sheet engineering and transferred onto the wedge-shaped meniscus model. Third, a biological vascularized scaffold (BioVaSc-TERM) was re-endothelialized with hd-mvECs providing a viable vascularized network. The vascularized BioVaSc-TERM was suggested as wrapping scaffold of the meniscus model by using two suture techniques, the all-inside-repair (AIR) for the posterior horn, and the outside-in-refixation (OIR) for the anterior horn and the middle part. This meniscus model for replacing torn menisci is a promising approach to be further optimized regarding vascularization, biochemical and biomechanical stimuli. N2 - Das Knie ist ein komplex zusammengesetztes Gelenk mit zwei C-förmigen Keilen aus Bindegewebsknorpel, die Menisken. Sie sorgen für die mechanische Belastbarkeit des Knies, wodurch der Gelenksknorpel geschützt wird. Aufgrund des limitierten Heilungspotentials beeinträchtigen Meniskusverletzungen nicht nur den Meniskus selbst, sondern schädigen auch das Gelenksgleichgewicht und führen zu sekundärer Osteoarthritis. Der Meniskus wurde in seiner Anatomie, Struktur und Meniskusmarkern wie Aggrekan, Kollagen I und Kollagen II charakterisiert. Die Komponenten von Meniskus Tissue Engineering, Zellen, Kollagen I Materialien, biochemische und biomechanische Stimuli wurden untersucht. Meniskuszellen (MCs) wurden aus Meniskus isoliert, mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Knochenmark und dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (d-mvECs) aus Vorhautbiopsien. Für das humane (h) Meniskus-Modell wurde die keilförmige Kompression eines hMSC-beladenen Kollagen I Gels erfolgreich etabliert. Während drei Wochen statischer Kultur führte der biochemische Stimulus transformierender Wachs-tumsfaktor beta-3 (TGF beta-3) zu einer kompakten Kollagenstruktur. An Tag 21 zeigte dieses Meniskus-Modell eine hohe metabolische Aktivität und Matrixumbau durch die Detektion von Matrix-Metalloproteasen. Der Bindegewebsknorpel wurde durch immunhistochemische Detektion der Meniskusmarker, einem signifikanten GAG/DNA Anstieg und erhöhter Kompressionseigenschaften bestätigt. Für weitere Verbesserungen wurden biomechanische Stimulierungssysteme mittels Kompression und hydrostatischen Druck aufgebaut. Als Vaskularisierungsansatz führte die direkte Stimulierung mit Ciclopirox Olamine (CPX) sogar in Abwesenheit von Helferzellen wie MSCs zu einem erhöhten Sprouting der hd-mvEC Spheroide. Zweitens wurde ein hMSC/hd-mvEC Sheet mithilfe eines Temperatur-abhängigen Verfahrens produziert und auf das keilförmige Meniskus-Modell transferiert. Drittens wurde ein vaskularisiertes Biomaterial (BioVaSc-TERM) mit hd-mvECs besiedelt, wodurch ein vitales Gefäßystem bereitgestellt wurde. Die vaskularisierte BioVaSc-TERM wurde als Hülle des Meniskus-Modells unter der Verwendung von zwei Nahttechniken vorgeschlagen: die All-Inside-Repair (AIR) für das Hinterhorn und die Outside-In-Refixation (OIR) für das Vorderhorn und den mittleren Teil. Dieses Meniskus-Modell ist ein vielversprechender Ansatz für den Meniskusersatz, um in Vaskularisierung, biochemischer und biomechanischer Stimuli weiter optimiert zu werden. KW - Meniskus KW - Tissue Engineering KW - Regenerative Medizin KW - Meniskusimplantat KW - meniscus implant KW - Tissue Engineering KW - tissue engineering KW - vascularization KW - Vaskularisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184326 ER - TY - THES A1 - Lodes, Nina Theresa T1 - Tissue Engineering für seltene Erkrankungen mit Störungen des mukoziliären Transports T1 - Tissue engineering for rare diseases with impaired mucociliary transport N2 - Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann. N2 - Cystic fibrosis (CF) and primary ciliary dyskinesia (PCD) are two rare diseases which,among others, impair the mucociliary transport. CF is one of the most common in-herited metabolic diseases with patients suffering from a defect in theCystic FibrosisTransmembrane Conductor Regulator(CFTR) gene, which is characterized by the pro-duction of highly viscous secretions in mucin-producing organs such as the gastrointestinaltract and lungs. Patients suffering from PCD have defects in currently approximately 38known and PCD-associated genes resulting in structural defects of the ciliary appara-tus and thus in dysfunctional cilia. Since neither CF nor PCD have any chance of beingcured so far, the main focus is on alleviating the symptoms. The basic goal is the long-term preservation of lung function and the prevention of microbial infections. Previousmodel systems for exploring possible therapeutic options have been animal models thatcan never completely represent the human phenotype due to species diversity. Humanintestinal organoid cultures are considered as a promising test system for cystic fibro-sis. However, since respiratory symptoms are mainly responsible for patient mortality,CF respiratory models provide better test systems for future therapeutics. Respiratoryorganoid cultures have been used to study CFTR functionality, but do not completelyrepresent thein vivosituation. In order to develop new therapeutic strategies, patient-specific 3Din vitrotest systems for the human respiratory tract expressing functionalkinocilia are required, which can be used in particular with regard to personalized medi-cine.In the present thesis, a new method for obtaining cells from nasal mucosal brush biop-sies was established, that guarantees a standardised supply of human primary materi-al. In order to generate a disease-specific cell line, such as a PCD cell line, using theCRISPR/Cas9 system, a respiratory cell line that fully represents thein vivosituation isrequired. Hence, four different respiratory epithelial cell lines (HBEC3-KT, Calu-3, VA10and Cl-huAEC) were investigated with regard to their mucociliary phenotype, wherebyonly the cell line HBEC3-KT differentiated into ciliated cells. However, these showed ki-nocilia only on approx. 5 % of the model’s surface, thus the human respiratory mucosacould not be completely modelled and HBEC3-KT cell line is no suitable cell line for geneediting experiments.Tissue engineering made it possible to build 3Din vitrotest systems based on two differentmatrices, the biological SIS (small intestine submucosa) and synthetic PET (polyethyleneterephthalate) membranes. 3D airway test systems were generated using human primarynasal and tracheobronchial epithelial cells. In addition to histological investigations and the characterization of specific markers of the respiratory system by immunofluorescence,the ultrastructure of the models was analyzed with a special focus on ciliary structures.In order to gain insight into the ciliary functionality and thus to achieve a highin vivocorrelation, the method of high-speed video microscopy was established within the scopeof this work at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, which allowsthe analysis of ciliary beat frequency as well as mucociliary transport. The influence ofisotonic saline solution and salbutamol, aβ2-adrenergic agonist mainly used as broncho-dilator in asthma patients, on ciliary beat frequency was also analyzed. It could be shownthat both substances increased the ciliary beat of the primary respiratory mucosa models.In order to generate test systems for the two rare diseases CF and PCD, epithelial cellsof the affected patients were first examined by non-invasive Raman spectroscopy for apotential biomarker that could be used in diagnostic approaches. However, no biomarkerfor CF or PCD could be detected, with PCD cells showing a low separation to non-PCDcells. Subsequently, 3D test systems based on patient cells were developed. The phenotypeof the CF models was verified by immunohistological staining and analysis of impairedmucociliary transport. Ultrastructural ciliary defects could be identified by ultrastructuralanalysis of cilia cross sections in three donor-specific PCD models. Additionally, ciliaryfunctionality could not be detected using high speed video microscopy analysis.In summary, this work succeeded in establishing a new method for the complete characte-rization of 3D airway test systems, which allows the analysis of ciliary beating frequencyand mucociliary transport. It has been shown for the first time that tissue engineering canbe used to generate a personalized disease model for PCD using a decellularized poricinejejunum as a scaffold. Both, PCD and CF disease models could in future be regarded astest systems for potential therapeutics. KW - In-vitro-Kultur KW - Tissue Engineering KW - Gewebekultur KW - Individualisierte Medizin KW - Respiratorisches System KW - Primäre Ziliendyskinesie KW - airways KW - primary ciliary dyskinesia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200178 ER - TY - THES A1 - Weyhmüller Reboredo, Jenny T1 - Tissue Engineering eines Meniskus - Vom Biomaterial zum Implantat T1 - Tissue Engineering of a meniscus - from a biomaterial to the implant N2 - Der Meniskus, ein scheibenförmiger Faserknorpel, spielt im Kniegelenk eine bedeutende Rolle, weil er Kräfte und Druck im Kniegelenk gleichmäßig verteilt, Stöße dämpft sowie der Kraftübertragung und Stabilisierung dient. Durch die Entfernung des Gewebes, der sogenannten Totalmeniskektomie, nach einer Meniskusverletzung oder einem Riss, verändern sich die mechanischen Eigenschaften des Gelenks stark und verursachen durch die erhöhte Belastung der Gelenkflächen Arthrose. Arthrose ist weltweit die Häufigste aller Gelenkerkrankungen. Der Erhalt der körperlichen Leistungsfähigkeit und Mobilität bis ins hohe Alter sowie die Bewahrung der Gesundheit von Herz-Kreislauf- und Stoffwechselorganen zählen aufgrund des demografischen Wandels zu den großen medizinischen Herausforderungen. Die Erkrankung des muskuloskelettalen Systems stellte 2010 im Bundesgebiet die am häufigsten vorkommende Krankheitsart dar. Während Risse in den äußeren Teilen des Meniskus aufgrund des Anschlusses an das Blutgefäßsystem spontan heilen können, können sie dies in tieferen Zonen nicht. Durch die begrenzte Heilungsfähigkeit des Knorpels bleibt langfristig der Einsatz eines Ersatzgewebes die einzige therapeutische Alternative. In der vorliegenden Arbeit wurde als therapeutische Alternative erfolgreich ein vaskularisiertes Meniskusersatzgewebe mit Methoden des Tissue Engineering entwickelt. Es soll in Zukunft als Implantat Verwendung finden. Tissue Engineering ist ein interdisziplinäres Forschungsfeld, in dem Gewebe außerhalb des Körpers generiert werden. Schlüsselkomponenten sind Zellen, die aus einem Organismus isoliert werden, und Trägerstrukturen, die mit Zellen besiedelt werden. Die Biomaterialien geben den Zellen eine geeignete Umgebung, die die Extrazelluläre Matrix (EZM) ersetzen soll, um die Funktion der Zellen beizubehalten, eigene Matrix zu bilden. Zum Erhalt eines funktionelles Gewebes werden oftmals dynamische Kultursysteme, sogenannte Bioreaktoren, verwendet, die natürliche Stimuli wie beispielsweise den Blutfluss oder mechanische Kompressionskräfte während der in vitro Reifungsphase des Gewebes, zur Verfügung stellen. Das Gewebekonstrukt wurde auf Basis natürlicher Biomaterialien aufgebaut, unter Verwendung ausschließlich primärer Zellen, die später direkt vom Patienten gewonnen werden können und damit Abstoßungsreaktionen auszuschließen sind. Da der Meniskus teilvaskularisiert ist und die in vivo Situation des Gewebes bestmöglich nachgebaut werden sollte, wurden Konstrukte mit mehreren Zelltypen, sogenannte Ko-Kulturen aufgebaut. Neben mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ) und Meniskuszellen (MZ) erfolgten Versuche mit mesenchymalen Stammzellen (MSZ). Zur Bereitstellung einer zelltypspezifischen Matrixumgebung, diente den mvEZ ein Stück Schweinedarm mit azellularisierten Gefäßstrukturen (BioVaSc®) und den MZ diente eine geeig- nete Kollagenmatrix (Kollagen Typ I Hydrogel). Die Validierung und Charakterisierung des aufgebauten 3D Meniskuskonstrukts, welches in einem dynamischen Perfusions-Bioreaktorsystem kultiviert wurde, erfolgte mit knorpeltypischen Matrixmarkern wie Aggrekan, Kollagen Typ I, II und X sowie mit den Transkriptionsfaktoren RunX2 und Sox9, die in der Knorpelentstehung von großer Bedeutung sind. Zusätzlich erfolgten Auswertungen mit endothelzellspezifischen Markern wie vWF, CD31 und VEGF, um die Vaskularisierung im Konstrukt nachzuweisen. Analysiert wurden auch die Zellvitalitäten in den Konstrukten. Aufgrund einer nur geringen Verfügbarkeit von MZ wurden Kulturansätze mit alternativen Zellquellen, den MSZ, durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst deren Isolation und Charakterisierung und die Auswahl einer geeigneten 3D Kollagenmatrix. Die beste Zellintegration der MSZ konnte auf einer eigens hergestellten elektrogesponnenen Matrix beobachtet werden. Die Matrix besteht aus zwei unterschiedlichen Kollagentypen, die auf insgesamt fünf Schichten verteilt sind. Die Fasern besitzen weiter unterschiedliche Ausrichtungen. Während die Kollagen Typ I Fasern in den äußeren Schichten keiner Ausrichtung zugehören, liegen die Kollagen Typ II Fasern in der mittleren Schicht parallel zueinander. Der native Meniskus war für den Aufbau einer solchen Kollagen-Trägerstruktur das natürliche Vorbild, das imitiert werden sollte. Nach der Besiedelung der Matrix mit MSZ, konnte eine Integration der Zellen bereits nach vier Tagen bis in die Mittelschicht sowie eine spontane chondrogene Differenzierung nach einer insgesamt dreiwöchigen Kultivierung gezeigt werden. Das Biomaterial stellt in Hinblick auf die Differenzierung der Zellen ohne die Zugabe von Wachstumsfaktoren eine relevante Bedeutung für klinische Studien dar. Zur Kultivierung des 3D Meniskuskonstrukts wurde ein Bioreaktor entwickelt. Mit diesem können neben Perfusion der Gefäßsysteme zusätzlich Kompressionskräfte sowie Scherspannungen auf das Ersatzgewebe appliziert und die Differenzierung von MZ bzw. MSZ während der in vitro Kultur über mechanische Reize stimuliert werden. Ein anderes Anwendungsfeld für den neuartigen Bioreaktor ist seine Verwendung als Prüftestsystem für die Optimierung und Qualitätssicherung von Gewebekonstrukten. N2 - The meniscus, a disk-shaped fibrous cartilage, plays an important role in the equal distribution of pressure, shock absorption, power transmission and stability within the knee joint. After a meniscus injury or a meniscus tear, a total meniscectomy is done where the complete tissue is removed. This leads to a change of mechanical properties in the joint and causes arthrosis by an increased strain on the joint surfaces. Wordwide arthrosis is the most frequent of all joint diseases. Due to the demographic change, maintaining physical fitness and mobility up to an old age are the main challenges besides ensuring health of the heart and circulatory system and of the metabolic organs. Musculoskeletal disorders represented the most frequent type of disease in Germany in 2010. While tears in the outer zone of the meniscus heal spontaneously because of its connection to the blood vessel system, tears in the deeper zones do not heal. Due to the limited healing capacity of cartilage the use of a replacement tissue is the only therapeutic alternative in the long run. In the present work a vascularized meniscus construct as therapeutic alternatives has been developed with the Tissue Engineering method for the further use as an implant. Tissue En- gineering is an interdisciplinary research field to generate tissues outside the body. The key components are isolated cells from an organism, and scaffolds, which are seeded with cells. Biomaterials provide a suitable environment that replaces the extracellular matrix (ECM) to maintain cell functionality to let cells build up their own matrix. To maintain a functional tissue during in vitro dynamic culture, bioreactor systems are used to provide natural stimuli such as blood flow or mechanical compression forces. The tissue construct is based on natural biomaterials and solely on primary cells, which later can be isolated directly from the patient and thereby exclude repulsion reactions. Due to its limited vascularity of the meniscus and the aim to build up at its best the in vivo situation more than one cell type is used to generate constructs, so called co-culture systems. Mesen- chymal stem cells (MSZ) besides microvascular endothelial cells (mvEZ) and meniscus cells (MZ) were used in the experiments. To supply a cell type specific matrix environment, a segment of a porcine jejunum with decellularized vascular structures (BioVaSc®) for the mvEZ and a collagen based matrix (collagen type I hydrogel) for the MZ were employed. The validation and characterization of the de- veloped 3D meniscus construct, that was cultured in a dynamic perfusion bioreactor system, was performed by using cartilage matrix specific markers, such as aggrecan, collagen type I, II and X, as well as the transcription factors RunX2 and Sox9 that are of major importance for cartilage development. Further analysis with endothelial cell specific markers, such as vWF, CD31 and VEGF were performed to evaluate the vascularization of the construct. Furthermore, cell vitality tests of the construct were made. Because of the limited availability of primary MZ, culture approaches with MSZ as an alter- native cell source were investigated. Cell isolation and characterization were performed and a suitable 3D collagen matrix was selected. The best cell integration of the MSZ could be observed on a specifically engineered electrospun matrix. The matrix consists of two different collagen types that are arranged in a total of five layers. The fibers are further orientated in different directions. While outer layers consist of randomly-aligned collagen type I fibers, the collagen type II fibers in the middle layer are aligned parallel to each other. The native meniscus tissue serves as natural example and its structure is replicated in such a collagen scaffold. After seeding the scaffold with MSZ, cell integration into the middle layer could be observed after four days, as well as a spontanous chondrogenic differentation after three weeks of culture. The biomaterial developed in this work has to be considered as relevant for clinical studies with regard to cell differentiation without adding growth factors to the culture. For the culture of 3D meniscus construct a bioreactor was successfully developed, that can apply compressive strength and shear stress to the tissue model in addition to perfusing the vascular system. With these measures the differentiation of MZ or MSZ could be induced with mechanical strains during the in vitro culture. Another field of application for the new bioreactor is its use as a test system for the optimization and quality control of the tissue models. KW - Tissue Engineering KW - Meniskustransplantation KW - Bioreaktor KW - Gewebekultur KW - Biomaterial KW - Elektrospinning KW - Implantatentwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108477 ER - TY - THES A1 - Lennartz, Simon T1 - Tissue Engineering der menschlichen Speicheldrüse unter Verwendung von Epithel- und mikrovaskulären Endothelzellen auf einer Matrix aus dezellularisiertem Schweinedarm T1 - Tissue engineering of human salivary gland using epithelial and microvascular endothelial cells on a decellularized porcine matrix N2 - Eine ausgeprägte Mundtrockenheit, Xerostomie, entsteht häufig durch eine irreversible Funktionseinschränkung der Speicheldrüsen. Diese ist unter anderem durch die Einnahme bestimmter Medikamente, Autoimmunerkrankungen, fortgeschrittenes Alter oder die Bestrahlungstherapie von Tumoren der Kopf-Hals-Region bedingt, wobei letztere eine der häufigsten Ursachen darstellt. Konsequenzen der eingeschränkten Drüsenfunktion sind herabgesetzte Speichelflussraten, eine Reduktion des Mund-pH-Werts, eine veränderte Elektrolyt- und Immunglobulin-Zusammensetzung des Speichels und somit eine Verringerung des Infektionsschutzes. Die resultierenden Komplikationen erstrecken sich von Karies und rezidivierenden Infektionen bis hin zu Pilzbesiedelungen der Mundschleimhaut. Diese schränken die Lebensqualität der Patienten stark ein und führen häufig zu Therapieunterbrechungen. Fast die Hälfte der Patienten leidet unter Depressionen oder psychischen Belastungszuständen. Es gibt wenige Therapieansätze zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie: Pilocarpin erhöht zwar die Speichelflussraten, hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Lebensqualität. Die operative Translokation der Glandula submandibularis hat den Weg in die klinische Routine noch nicht gefunden, während die intensitätsmodulierte Bestrahlung (IMRT) nicht für jeden Patienten geeignet ist; beide zeigen jedoch einen positiven Effekt auf die Lebensqualität. Gentechnische und stammzellbasierte Ansätze zur Regeneration des Drüsengewebes befinden sich im Experimentalstadium. Somit ergibt sich ein dringender Bedarf an innovativen Optionen zur Behandlung der postradiogenen Xerostomie. Das Tissue Engineering, die Erstellung einer künstlichen Speicheldrüse aus körpereigenen Zellen, böte hier ein potentielles Behandlungskonzept. Diese Studie soll deshalb untersuchen, ob humane Speicheldrüsenepithelzellen (hSEZ) auf einer Matrix aus dezellularisiertem, porzinem Jejunum, der sogenannten Small intestinal submucosa + mucosa (SIS-muc), kultiviert werden können. Können die Zellen innerhalb der Wachstumsperiode wichtige physiologische Differenzierungsmarker beibehalten? Kann die Produktion von α-Amylase, einem der wichtigsten Enzyme des menschlichen Speichels, erhalten werden? Welchen Einfluss hat die Kokultur mit mikrovaskulären Endothelzellen (mvEZ)? Und zuletzt: Ist dezellularisierter Schweinedarm eine potentiell geeignete Matrix für das Tissue Engineering der menschlichen Speicheldrüse? Zunächst erfolgte die Entnahme von humanem Speicheldrüsengewebe, woraus hSEZ isoliert wurden. Diese wurden dann sowohl in Mono- als auch in Kokultur mit mvEZ auf die SIS-muc aufgebracht und auf dieser kultiviert. Die SIS-muc wurde aus kurzen Schweinedarm-Segmenten gewonnen, die in einem mehrstufigen Verfahren dezellularisiert wurden. Die besiedelte SIS-muc wurde mittels konventioneller sowie Immunfluoreszenzfärbungen, Raster- und Transmissionsektronenmikroskopie (REM/TEM) sowie quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) untersucht, darüber hinaus erfolgte die Messung der α-Amylase-Enzymaktivität. Histologisch sowie in der REM zeigte sich sowohl in der Mono- als auch in der Kokultur eine konfluente Besiedelung der SIS-muc mit hSEZ. In der Kokultur formten mvEZ einen Monolayer auf der serosalen Matrixseite. Bei der Charakterisierung der hSEZ zeigte sich in den Immunfluoreszenzaufnahmen eine starke Ausprägung von Zytokeratin, α-Amylase und Aquaporin-5 und eine moderate Ausprägung von Claudin-1. Bei der Untersuchung der Funktion der α-Amylase konnte in der Kokultur von hSEZ mit mvEZ eine im Gegensatz zur Mono- und 2D-Kultur signifikant erhöhte Enzymaktivität der α-Amylase nachgewiesen werden. In der qPCR-Analyse der α-Amylase-Genexpression war die 3D-Kultur der 2D-Kultur überlegen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Kultur von hSEZ auf der SIS-muc möglich ist. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zellen in 3D-Kultur spezifische Differenzierungsmerkmale beibehalten, die in der 2D-Kultur teils verloren gehen und dass hSEZ in Kokultur mit mvEZ eine gegenüber der Monokultur signifikant erhöhte Produktion von α-Amylase aufweisen. Diese Arbeit liefert die Datengrundlage für zukünftige Studien im dynamischen Bioreaktor-Modell (BioVaSc), die auf dem Weg zur klinischen Translation notwendig sind. Somit stellt sie einen wichtigen Schritt in Richtung einer auf Tissue Engineering basierten Therapie der belastenden Xerostomie dar. N2 - Xerostomia or dryness of the mouth often results from irreversible loss of function of the salivary glands. This medical condition can either be induced by certain drugs, autoimmune diseases, high age or radiotherapy of head and neck cancer with the latter being one of the most common causes. Impaired glands lead to a decrease in saliva flow rate as well as pH level inside the mouth and cause an alteration in the composition of saliva (e.g. electrolytes, immunoglobulins) lowering its anti-inflammatory capacity. Complications imply caries and recurring infections as well as mycosis of the oral cavity which negatively impact the patients’ quality of life, often leading to therapy interruptions. Moreover, almost half of the patients suffer from depression or other mental disorders. The treatment of radiogenic xerostomia is based on only a few therapeutic approaches currently available: Pilocarpin increases saliva flow rate yet does not significantly improve the patiens’ quality of life or reduce mucositis. Although indicating positive effects on quality of life, operative translocation of the submandibular gland has not yet been established in the clinical routine, while intensity modulated radiotherapy (IMRT) is not suitable for every patient. On the other hand, genetic or stem-cell-based approaches for regeneration of salivary gland tissue are still at an experimental stage. Thus, there is a strong demand for innovative options for the treatment of radiation-induced xerostomia which could potentially be supplied by an approach based on the tissue engineering of the salivary gland using autologous cells. The aim of this study is to investigate, whether human salivary gland epithelial cells (hSGEs) can be cultured on a scaffold made from decellularized porcine jejunum, the so-called small intestinal submucosa (SIS-muc). Do the cells maintain the expression of certain cellular markers over the given cell culture time? Can the production of α-amylase, a key enzyme of human saliva, be perpetuated? And lastly: Is the SIS-muc an appropriate scaffold for the tissue engineering (TE) of the human salivary gland? To examine this, human salivary gland tissue was obtained and salivary gland epithelial cells were isolated. The cells were cultured both in mono- and co-culture with microvascular endothelial cells (mvECs) on the SIS-muc. Colonized SIS-muc was analyzed in H&E and immunofluorescence stainings, scanning- and transmission electron microscopy as well as quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Furthermore, enzyme activity of α-amylase was quantified. H&E stainings as well as scanning electron microscopy (SEM) revealed a confluent cell layer of hSGECs on the scaffold both in mono-and co-culture. Immunofluorescence stainings indicated a strong expression of cytoceratin, α-amylase and aquaporin-5 and a moderate expression of claudin-1. Enzyme assay revealed that SGECs co-cultured with mvECs yielded a significantly increased activity of α-amylase compared to the monocultured cells. Quantitative PCR (qPCR) indicated an increase in α-amylase gene expression in 3D-culture compared to 2D-culture. This study shows that hSGECs can successfully be cultured on the SIS-muc and maintain important cellular markers which partly vanish in 2D-culture. Moreover, co-culture with mvECs increased α-amylase enzyme activity of hGECs compared to monoculture. Those results significantly contribute to the base of evidence needed for following studies focusing on dynamic cell culture using the BioVaSc which are necessary to evaluate the possibilities for clinical translation. Thus, this study takes an important step towards a tissue engineering-based therapy of the burdensome xerostomia. KW - Tissue Engineering KW - Xerostomie KW - Speicheldrüse KW - postradiogene Xerostomie KW - SIS-muc KW - 3D-Kultur KW - BioVaSc Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164116 ER - TY - THES A1 - Wiesner, Miriam T1 - Stem Cell-based Adipose Tissue Engineering - Engineering of Prevascularized Adipose Tissue Constructs In Vitro & Investigation on Gap Junctional Intercellular Communication in Adipose-derived Stem Cells T1 - Stammzellbasiertes Tissue Engineering von Fettgewebe - Entwicklung eines prävaskularisierten Fettgewebekonstrukts in vitro & Untersuchung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in Stammzellen aus dem Fettgewebe N2 - In reconstructive and plastic surgery, there exists a growing demand of adequate tissue implants, since currently available strategies for autologous transplantation are limited by complications including transplant failure and donor site morbidity. By developing in vitro and in vivo autologous substitutes for defective tissue sites, adipose tissue engineering can address these challenges, although there are several obstacles to overcome. One of the major limitations is the sufficient vascularization of in vitro engineered large constructs that remains crucial and demanding for functional tissues. Decellularized jejunal segments may represent a suitable scaffolding system with preexisting capillary structures that can be repopulated with human microvascular endothelial cells (hMVECs), and a luminal matrix applicable for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (hASCs). Hence, co-culture of these cells in jejunal segments, utilizing a custom-made bioreactor system, was characterized in terms of vascularization and adipose tissue development. Substantial adipogenesis of hASCs was demonstrated within the jejunal lumen in contrast to non-induced controls, and the increase of key adipogenic markers was verified over time upon induction. The development of major extracellular matrix components of mature adipose tissue, such as laminin and collagen IV, was shown within the scaffold in induced samples. Successful reseeding of the vascular network with hMVECs was demonstrated in long-term culture and co-localization of vascular structures and adipogenically differentiated hASCs was observed. Therefore, these results represent a novel approach for in vitro engineering of vascularized adipose tissue constructs that warrants further investigations in preclinical studies. Another still existing obstacle in adipose tissue engineering is the insufficient knowledge about the applied cells, for instance the understanding of how cells can be optimally expanded and differentiated for successful engineering of tissue transplants. Even though hASCs can be easily isolated from liposuction of abdominal fat depots, yielding low donor site morbidity, huge numbers of cells are required to entirely seed complex and large 3D matrices or scaffolds. Thus, cells need to be large-scale expanded in vitro on the premise of not losing their differentiation capacity caused by replicative aging. Accordingly, an improved differentiation of hASCs in adipose tissue engineering approaches remains still desirable since most engineered constructs exhibit an inhomogeneous differentiation pattern. For mesenchymal stem cells (MSCs), it has been shown that growth factor application can lead to a significant improvement of both proliferation and differentiation capacity. Especially basic fibroblast growth factor (bFGF) represents a potent mitogen for MSCs, while maintaining or even promoting their osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation potential. As there are currently different contradictory information present in literature about the applied bFGF concentration and the explicit effect of bFGF on ASC differentiation, here, the effect of bFGF on hASC proliferation and differentiation capacity was investigated at different concentrations and time points in 2D culture. Preculture of hASCs with bFGF prior to adipogenic induction showed a remarkable effect, whereas administration of bFGF during culture did not improve adipogenic differentiation capacity. Furthermore, the observations indicated as mode of action an impact of this preculture on cell proliferation capacity, resulting in increased cellular density at the time of adipogenic induction. The difference in cell density at this time point appeared to be pivotal for increased adipogenic capacity of the cells, which was confirmed in a further experiment employing different seeding densities. Interestingly, furthermore, the obtained results suggested a cell-cell contact-mediated mechanism positively influencing adipogenic differentiation. As a consequence, subsequently, studies were conducted focusing on intercellular communication of these cells, which has hardly been investigated to date. Despite the multitude of literature on the differentiation capacity of ASCs, little is reported about the physiological properties contributing to and controlling the process of lineage differentiation. Direct intercellular communication between adjacent cells via gap junctions has been shown to modulate differentiation processes in other cell types, with connexin 43 (Cx43) being the most abundant isoform of the gap junction-forming connexins. Thus, in the present study we focused on the expression of Cx43 and gap junctional intercellular communication (GJIC) in hASCs, and its significance for adipogenic differentiation of these cells. Cx43 expression in hASCs was demonstrated histologically and on the gene and protein expression level and was shown to be greatly positively influenced by cell seeding density. Functionality of gap junctions was proven by dye transfer analysis in growth medium. Adipogenic differentiation of hASCs was shown to be also distinctly elevated at higher cell seeding densities. Inhibition of GJIC by 18α-glycyrrhetinic acid significantly compromised adipogenic differentiation, as demonstrated by histology, triglyceride quantification, and adipogenic marker gene expression. Flow cytometry analysis showed a lower proportion of cells undergoing adipogenesis when GJIC was inhibited, further indicating the importance of GJIC in the differentiation process. Altogether, these results demonstrate the impact of direct cell-cell communication via gap junctions on the adipogenic differentiation process of hASCs and may contribute to further integrate direct intercellular crosstalk in rationales for tissue engineering approaches. N2 - In der rekonstruktiven und plastischen Chirurgie besteht ein wachsender Bedarf an adäquaten Gewebetransplantaten, da die derzeit verfügbaren Strategien für autologe Transplantationen von Geweben durch Komplikationen wie beispielsweise Transplantatversagen sowie Morbiditäten an der Entnahmestelle beeinträchtigt werden. Das Tissue Engineering kann dieser Problematik jedoch durch die Entwicklung von in vitro und in vivo gezüchtetem, autologen Gewebeersatz für defekte Gewebestellen begegnen, wobei es dabei noch mehrere Hindernisse zu überwinden gilt. Eine der größten Limitationen ist die ausreichende Vaskularisierung der in vitro hergestellten, großen Konstrukte, welche für die Funktion des Gewebes entscheidend ist. Hierfür können dezellularisierte, jejunale Segmente ein geeignetes Gerüstsystem darstellen, deren bereits vorhandene Kapillarstrukturen mit humanen, mikrovaskulären Endothelzellen (hMVECs) und deren luminale Matrix mit humanen Stammzellen aus dem Fettgewebe (hASCs), mit anschließender adipogen Differenzierung, besiedelt werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden diese Konstrukte mit Hilfe eines maßgeschneiderten Bioreaktorsystems kultiviert und die Kokultur der Zellen in der jejunalen Matrix hinsichtlich der Fettgewebeentwicklung untersucht. Im Gegensatz zu nicht-induzierten Kontrollen wurde nach adipogener Induktion innerhalb des jejunalen Lumens eine substanzielle Fettgewebebildung der hASCs, sowie ein Anstieg wichtiger adipogener Marker im zeitlichen Verlauf nachgewiesen. Die Bildung wesentlicher extrazellulärer Matrixkomponenten des reifen Fettgewebes, wie beispielsweise Laminin und Kollagen IV, wurde innerhalb der Matrix bei induzierten Proben ebenso beobachtet. Die erfolgreiche Neubesiedlung des Gefäßnetzes mit hMVECs konnte in der Langzeitkultur gezeigt und eine Kolokalisation von Gefäßstrukturen und differenzierten hASCs beobachtet werden. Somit stellen diese Ergebnisse einen vielversprechenden, neuen Ansatz für die in vitro Entwicklung von vaskularisierten Fettgewebekonstrukten dar, welcher jedoch noch weitere Untersuchungen in präklinischen Studien erfordert. Eine weitere Limitation in der Entwicklung von Fettgewebe ist das unzureichende Wissen über die verwendeten Zellen – so zum Beispiel wie Zellen optimal expandiert und differenziert werden können, um einen Gewebeersatz erfolgreich herzustellen. Auch wenn hASCs leicht aus abdominalen Liposuktionen, welche zu einer relativ geringen Morbidität an der Entnahmestelle führen, isoliert werden können, ist eine sehr große Anzahl an Zellen erforderlich, um komplexe und große 3D-Matrizes vollständig mit Zellen zu besiedeln. So müssen Zellen in vitro im großen Maßstab expandiert werden, wobei auf die Erhaltung ihrer Differenzierungskapazität und die Vermeidung des replikativen Alterns geachtet werden muss. Da viele der entwickelten Konstrukte des Weiteren ein inhomogenes Differenzierungsmuster aufweisen, ist eine Verbesserung der adipogenen Differenzierung von ASCs im Rahmen von Tissue Engineering Ansätzen wünschenswert. Für mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurde bereits gezeigt, dass die Anwendung von Wachstumsfaktoren zu einer deutlichen Verbesserung der Proliferations- und Differenzierungskapazität führen kann. Insbesondere der Wachstumsfaktor bFGF (basic fibroblast growth factor) stellt ein starkes Mitogen für MSCs dar, wobei er das osteogene, chondrogene und adipogene Differenzierungspotenzial der Zellen aufrechterhält und sogar fördert. Da es in der Literatur derzeit unterschiedliche und teilweise widersprüchliche Informationen über die verwendeten bFGF Konzentrationen und den expliziten Effekt von bFGF auf die Differenzierung von ASCs gibt, wurde der Effekt von bFGF auf die Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit mit unterschiedlichen Konzentrationen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der 2D Kultur untersucht. Die Vorkultur der hASCs mit bFGF vor der adipogenen Induktion hatte einen beachtlichen Effekt auf die Differenzierung, während die Verabreichung von bFGF während der Kultur, die adipogene Differenzierungsfähigkeit der Zellen nicht verbesserte. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse einen Einfluss der Vorkultur auf die Zellproliferation, was zu einer erhöhten Zelldichte zum Zeitpunkt der adipogenen Induktion führte. Der Unterschied in der Zelldichte zu diesem Zeitpunkt schien entscheidend für die gesteigerte Differenzierungskapazität der Zellen zu sein, was sich in einem weiteren Experiment mit unterschiedlichen Aussaatdichten bestätigte. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse außerdem darauf hin, dass ein Zell-Zell-Kontakt-vermittelter Mechanismus die adipogene Differenzierung positiv beeinflusst. Daher wurden anschließend Untersuchungen zur interzellulären Kommunikation dieser Zellen durchgeführt, welche bisher kaum erforscht wurde. Trotz der Vielzahl an Literatur über die Differenzierungsfähigkeit von ASCs ist wenig über die physiologischen Prozesse bekannt, die zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen beitragen und diese kontrollieren. So wurde gezeigt, dass die direkte interzelluläre Kommunikation zwischen benachbarten Zellen über Gap Junctions Differenzierungsprozesse moduliert. Connexin 43 (Cx43) stellt dabei die häufigste Isoform der Gap Junction-bildenden Connexine dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von Cx43 und die interzelluläre Kommunikation durch Gap Junctions (gap junctional intercellular communication; GJIC) in hASCs, sowie ihre Bedeutung für die adipogene Differenzierung untersucht. Die Cx43 Expression in hASCs wurde histologisch und auf Gen- und Proteinexpressionsebene nachgewiesen und wurde durch die Zellaussaatdichte nachweislich stark beeinflusst. Die Funktionalität der Gap Junctions konnte mit Hilfe eines Assays zur Übertragung von Farbstoffen untersucht werden. Es zeigte sich hierbei eine zelldichteabhängige, adipogene Differenzierungkapazität der hASCs. Die Hemmung der GJIC durch 18α-Glycyrrhetinsäure beeinträchtigte die adipogene Differenzierung deutlich, wie sich durch die Histologie, die Triglyceridquantifizierung und die adipogene Markergenexpression beobachten ließ. Bei Hemmung der GJIC zeigte sich mit Hilfe der Durchflusszytometrie, dass weniger Zellen adipogen differenzieren konnten, was die Bedeutung von GJIC im Differenzierungsprozess hervorhebt. Zusammenfassend veranschaulichen diese Ergebnisse den Einfluss direkter Zell-Zell-Kommunikation über Gap Junctions auf den adipogenen Differenzierungsprozess von hASCs und könnten somit in Zukunft dazu beitragen, direkte interzelluläre Kommunikation in Tissue Engineering Ansätze zu integrieren. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Gap Junction KW - Adipose Tissue Engineering Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185005 ER - TY - THES A1 - Gensler, Marius E. T1 - Simultaneous printing of tissue and customized bioreactor T1 - Simultanes Drucken von Gewebe und angepasstem Bioreaktor N2 - Additive manufacturing processes such as 3D printing are booming in the industry due to their high degree of freedom in terms of geometric shapes and available materials. Focusing on patient-specific medicine, 3D printing has also proven useful in the Life Sciences, where it exploits the shape fidelity for individualized tissues in the field of bioprinting. In parallel, the current systems of bioreactor technology have adapted to the new manufacturing technology as well and 3D-printed bioreactors are increasingly being developed. For the first time, this work combines the manufacturing of the tissue and a tailored bioreactor, significantly streamlining the overall process and optimally merging the two processes. This way the production of the tissues can be individualized by customizing the reactor to the tissue and the patient-specific wound geometry. For this reason, a common basis and guideline for the cross-device and cross-material use of 3D printers was created initially. Their applicability was demonstrated by the iterative development of a perfusable bioreactor system, made from polydimethylsiloxane (PDMS) and a lignin-based filament, into which a biological tissue of flexible shape can be bioprinted. Cost-effective bioink-replacements and in silico computational fluid dynamics simulations were used for material sustainability and shape development. Also, nutrient distribution and shear stress could be predicted in this way pre-experimentally. As a proof of functionality and adaptability of the reactor, tissues made from a nanocellulose-based Cellink® Bioink, as well as an alginate-based ink mixed with Me-PMeOx100-b-PnPrOzi100-EIP (POx) (Alginate-POx bioink) were successfully cultured dynamically in the bioreactor together with C2C12 cell line. Tissue maturation was further demonstrated using hMSC which were successfully induced to adipocyte differentiation. For further standardization, a mobile electrical device for automated media exchange was developed, improving handling in the laboratory and thus reduces the probability of contamination. N2 - Additive Fertigungsverfahren wie der 3D-Druck boomen in der Industrie aufgrund ihres hohen Freiheitsgrads in Bezug auf geometrische Formen und verfügbare Materialien. Mit Blick auf die patientenspezifische Medizin hat sich der 3D-Druck auch in den Biowissenschaften bewährt, wo er die Formtreue für individualisierte Gewebe im Bereich des Bioprinting nutzt. Parallel dazu haben sich auch die derzeitigen Systeme der Bioreaktortechnologie an die neue Fertigungstechnologie angepasst, und es werden zunehmend 3D-gedruckte Bioreaktoren entwickelt. In dieser Arbeit werden erstmals die Herstellung des Gewebes und ein maßgeschneiderter Bioreaktor kombiniert, wodurch der Gesamtprozess erheblich gestrafft und beide Verfahren optimal zusammengeführt werden. Auf diese Weise kann die Herstellung der Gewebe individualisiert werden, indem der Reaktor an das Gewebe und die patientenspezifische Wundgeometrie angepasst wird. Aus diesem Grund wurde zunächst eine gemeinsame Basis und Leitlinie für den Geräte- und Materialübergreifenden Einsatz von 3D-Druckern geschaffen. Deren Anwendbarkeit wurde durch die iterative Entwicklung eines perfundierbaren Bioreaktorsystems aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und einem Lignin-basierten Filament demonstriert, in das ein biologisches Gewebe mit flexibler Form gedruckt werden kann. Kostengünstige Biotintenalternativen und emph in silico Computational Fluid Dynamics Simulationen wurden für eine materialschonende Formentwicklung verwendet. Nährstoffverteilung und Scherspannung konnten auf diese Weise präexperimentell vorhergesagt werden. Als Beweis für die Funktionalität und Anpassbarkeit des Reaktors wurden Gewebe aus einer Cellink® Bioink auf Nanocellulosebasis sowie einer Tinte auf Alginatbasis, welche mit Me-PMeOx100-b-PnPrOzi100-EIP (POx) gemischt wurde (Alginat-POx-Bioink), erfolgreich zusammen mit C2C12-Zelllinie dynamisch im Reaktor kultiviert. Die Gewebereifung wurde außerdem mit hMSC demonstriert, die erfolgreich zur adipozyten Differenzierung induziert wurden. Zur weiteren Standardisierung wurde ein mobiles elektrisches Gerät für den automatischen Medienwechsel entwickelt, welches die Handhabung im Labor verbessert und damit die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination deutlich verringert. KW - 3 D bioprinting KW - Tissue Engineering KW - Bioreactor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280190 ER - TY - THES A1 - Böck, Thomas T1 - Multifunctional Hyaluronic Acid / Poly(glycidol) Hydrogels for Cartilage Regeneration Using Mesenchymal Stromal Cells T1 - Multifunktionale Hyaluronsäure / Poly(glycidol) Hydrogele für die Knorpelregeneration mit Mesenchymalen Stromazellen N2 - Improved treatment options for the degenerative joint disease osteoarthritis (OA) are of major interest, since OA is one of the main sources of disability, pain, and socioeconomic burden worldwide [202]. According to epidemiological data, already 27 million people suffer from OA in the US [23]. Moreover, the WHO expects OA to be the fourth most common cause of disability in 2020 [203], illustrating the need for effective and long-lasting therapy options of severe cartilage defects. Despite numerous clinically available products for the treatment of cartilage defects [62], the development of more cartilage-specific materials is still at the beginning. Hyaluronic acid (HA) is a major component of the cartilaginous extracellular matrix (ECM) and inherently creates a cell-friendly niche by providing cell attachment and migration sites. Furthermore, it is known that the functional groups of HA are well suited for chemical modification. These characteristics render HA an attractive material for hydrogel-based tissue engineering approaches. Poly(glycidol) (PG) as chemical crosslinker basically features similar chemical characteristics as the widely used poly(ethylene glycol) (PEG), but provides additional side groups at each repeating unit that can be further chemically functionalized. With the introduction of PG as multifunctional crosslinker for HA gels, a higher cross-linking density and, accordingly, a greater potential for biomimetic functionalization may be achieved. However, despite the mentioned potential benefits, PG has not been used for cartilage regeneration approaches so far. The initial aim of the study was to set up and optimize a HA-based hydrogel for the chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs), using different amounts and variations of cross-linkers. Therefore, the hydrogel composition was optimized by the utilization of different PEG diacrylate (PEGDA) concentrations to cross-link thiol-modified HA (Glycosil, HA-SH) via Michael addition. We aimed to generate volumestable scaffolds that simultaneously enable a maximum of ECM deposition. Histological and biochemical analysis showed 0.4% PEGDA as the most suitable concentration for these requirements (Section 5.1.2). In order to evaluate the impact of a differently designed cross-linker on MSC chondrogenesis, HA-SH was cross-linked with PEGTA (0.6%) and compared to PEGDA (0.4%) in a next step. Following this, acrylated PG (PG-Acr) as multifunctional cross-linker alternative to acrylated PEG was evaluated. It provides around five times more functional groups when utilized in PG-Acr (0.6%) HA-SH hydrogels compared to PEGTA (0.6%) HA-SH hydrogels, thus enabling higher degrees of biomimetic functionalization. Determination of cartilage-specific ECM components showed no substantial differences between both cross-linkers while the deposition of cartilaginous matrix appeared more homogeneous in HA-SH PG-Acr gels. Taken together, we were able to successfully increase the possibilities for biomimetic functionalization in the developed HA-SH hydrogel system by the introduction of PG-Acr as cross-linker without negatively affecting MSC chondrogenesis (Section 5.1.3). The next part of this thesis focused extensively on the biomimetic functionalization of PG-Acr (0.6%) cross-linked HA-SH hydrogels. Here, either biomimetic peptides or a chondrogenic growth factor were covalently bound into the hydrogels. Interestingly, the incorporation of a N-cadherin mimetic (HAV), a collagen type II binding (KLER), or a cell adhesion-mediating peptide (RGD) yielded no improvement of MSC chondrogenesis. For instance, the covalent binding of 2.5mM HAV changed morphology of cell nuclei and reduced GAG production while the incorporation of 1.0mM RGD impaired collagen production. These findings may be attributed to the already supportive conditions of the employed HA-based hydrogels for chondrogenic differentiation. Most of the previous studies reporting positive peptide effects on chondrogenesis have been carried out in less supportive PEG hydrogels or in significantly stiffer MeHA-based hydrogels [99, 101, 160]. Thus, the incorporation of peptides may be more important under unfavorable conditions while inert gel systems may be useful for studying single peptide effects (Section 5.2.1). The chondrogenic factor transforming growth factor beta 1 (TGF-b1) served as an example for growth factor binding to PG-Acr. The utilization of covalently bound TGF-b1 may thereby help overcome the need for repeated administration of TGF-b1 in in vivo applications, which may be an advantage for potential clinical application. Thus, the effect of covalently incorporated TGF-b1 was compared to the effect of the same amount of TGF-b1 without covalent binding (100nM TGF-b1) on MSC chondrogenesis. It was successfully demonstrated that covalent incorporation of TGF-b1 had a significant positive effect in a dose-dependent manner. Chondrogenesis of MSCs in hydrogels with covalently bound TGF-b1 showed enhanced levels of chondrogenesis compared to hydrogels into which TGF-b1 was merely mixed, as shown by stronger staining for GAGs, total collagen, aggrecan and collagen type II. Biochemical evaluation of GAG and collagen amounts, as well as Western blot analysis confirmed the histological results. Furthermore, the positive effect of covalently bound TGF-b1 was shown by increased expression of chondrogenic marker genes COL2A1, ACAN and SOX9. In summary, covalent growth factor incorporation utilizing PG-Acr as cross-linker demonstrated significant positive effects on chondrogenic differentiation of MSCs (Section 5.2.2). In general, PG-Acr cross-linked HA hydrogels generated by Michael addition represent a versatile hydrogel platform due to their high degree of acrylate functionality. These hydrogels may further offer the opportunity to combine several biological modifications, such as the incorporation of biomimetic peptides together with growth factors, within one cell carrier. A proof-of-principle experiment demonstrated the suitability of pure PG gels for studying single peptide effects. Here, the hydrogels were generated by the utilization of thiol-ene-click reaction. In this setting, without the supportive background of hyaluronic acid, MSCs showed enhanced chondrogenic differentiation in response to the incorporation of 1.0mM HAV. This was demonstrated by staining for GAGs, the cartilage-specific ECM molecules aggrecan and type II collagen, and by increased GAG and total collagen amounts shown by biochemical analysis. Thus, pure PG gels exhibit the potential to study the effects and interplay of peptides and growth factors in a highly modifiable, bioinert hydrogel environment. The last section of the thesis was carried out as part of the EU project HydroZONES that aims to develop and generate zonal constructs. The importance of zonal organization has attracted increased attention in the last years [127, 128], however, it is still underrepresented in tissue engineering approaches so far. Thus, the feasibility of zonal distribution of cells in a scaffold combining two differently composed hydrogels was investigated. A HA-SH(FMZ) containing bottom layer was generated and a pure PG top layer was subsequently cast on top of it, utilizing both times thiol-ene-click reaction. Indeed, stable, hierarchical constructs were generated that allowed encapsulated MSCs to differentiate chondrogenically in both zones as shown by staining for GAGs and collagen type II, and by quantification of GAG amount. Thus, the feasibility of differently composed zonal hydrogels utilizing PG as a main component was successfully demonstrated (Section 5.4). With the first-time utilization and evaluation of PG-Acr as versatile multifunctional cross-linker for the preparation of Michael addition-generated HA-SH hydrogels in the context of cartilage tissue engineering, a highly modifiable HA-based hydrogel system was introduced. It may be used in future studies as an easily applicable and versatile toolbox for the generation of biomimetically functionalized hydrogels for cell-based cartilage regeneration. The introduction of reinforcement structures to enhance mechanical resistance may thereby further increase the potential of this system for clinical applications. Additionally, it was also demonstrated that thiol-ene clickable hydrogels can be used for the generation of cell-laden, pure PG gels or for the generation of more complex, coherent zonal constructs. Furthermore, thiol-ene clickable PG hydrogels have already been further modified and successfully been used in 3D bioprinting experiments [204]. 3D bioprinting, as part of the evolving biofabrication field [205], offers the possibilities to generate complex and hierarchical structures, and to exactly position defined layers, yet at the same time alters the requirements for the utilized hydrogels [159, 206–209]. Since a robust chondrogenesis of MSCs was demonstrated in the thiol-ene clickable hydrogel systems, they may serve as a basis for the development of hydrogels as so called bioinks which may be utilized in more sophisticated biofabrication processes. N2 - Es ist von großem Interesse die Therapieoptionen für die degenerative Gelenkerkrankung Osteoarthrose (OA) zu verbessern, da OA als eine der weltweit häufigsten Ursachen von Bewegungseinschränkungen und Schmerzen gilt und somit eine sozioökonomische Belastung darstellt [202]. Laut epidemiologischen Studien leiden bereits 27 Millionen Menschen in den USA an OA [23]. Darüber hinaus geht die WHO davon aus, dass OA bereits im Jahr 2020 die vierthäufigste Ursache von körperlichen Behinderungen sein wird [203], was die Notwendigkeit für effektive und langanhaltende Therapien von schweren Knorpeldefekten zeigt. Obwohl sich bereits eine Vielzahl von Therapien in klinischer Anwendung für die Behandlung von Knorpeldefekten befindet [62], ist die Entwicklung von knorpelspezifischen Produkten noch nicht weit fortgeschritten. Hyaluronsäure (HA), als Hauptbestandteil der Extrazellulären Matrix (ECM) von Knorpel, stellt eine generell zytokompatible Umgebung dar, die Zellen von Natur aus Bindungsstellen zur Adhäsion und Fortbewegung bietet. Zudem ist bekannt, dass die funktionellen Gruppen von HA besonders gut für chemische Modifikationen geeignet sind. Aufgrund dieser Eigenschaften wird HA häufig als Material für das hydrogelbasierte Tissue Engineering verwendet. Durch die Verwendung von Poly(glycidol) (PG) als Cross-linker stehen die gleichen chemischen Eigenschaften wie bei der Verwendung des gängigen Cross-linkers Poly(ethylene glycol) (PEG) zur Verfügung, allerdings bietet es zusätzliche Seitenketten an jeder Wiederholungseinheit. Durch die Einführung von PG als multifunktionalem Cross-linker zur Herstellung von HA-Gelen ergibt sich letztlich eine höhere Vernetzungsdichte und damit auch ein größeres Potenzial für biomimetische Funktionalisierungen. Trotz dieser genannten Vorteile wird PG bisher noch nicht im Bereich der Knorpelregeneration verwendet. Das erste Ziel dieser Arbeit beinhaltete die Etablierung und Optimierung eines HA-basierten Hydrogels für die chondrogene Differenzierung von Mesenchymalen Stromazellen (MSCs). Hierzu wurden verschiedene Mengen und Derivate von Cross-linkern eingesetzt. Zunächst wurde die Hydrogelzusammensetzung mithilfe von verschiedenen PEG-Diacrylat (PEGDA)-Konzentrationen zur Vernetzung von thiolmodifizierter HA (Glycosil, HASH) mittels Michael-Addition optimiert. Das Ziel war hierbei die Herstellung eines volumenstabilen Konstrukts, das gleichzeitig die größtmögliche Ablagerung von ECM erlaubt. Histologische und biochemische Analysen zeigten in Bezug darauf, dass eine Konzentration von 0,4% PEGDA die zuvor genannten Anforderungen am besten erfüllte (Abschnitt 5.1.2). Um im weiteren Verlauf den Einfluss von verschiedenen Cross-linkern auf die chondrogene Differenzierung von MSCs zu untersuchen, wurde die HA-SH vergleichend mit PEGTA (0,6%) und PEGDA (0,4%) vernetzt. Nachfolgend wurde acryliertes PG (PG-Acr) als eine Alternative zu acrylierten PEG-Derivaten evaluiert. Der Vorteil in der Verwendung von PG-Acr (0,6%) im Vergleich zu PEGTA (0,6%) liegt darin, dass es eine ca. fünfmal höhere Anzahl an funktionellen Gruppen bietet, was wiederum ein deutlich höheres Maß an biomimetischer Funktionalisierung ermöglicht. Hierbei zeigte die Untersuchung der knorpelspezifischen ECM-Bestandteile keine grundlegenden Unterschiede zwischen beiden Cross-linkern, wobei durch die Verwendung von PG-Acr eine gleichmäßigere Ablagerung von Knorpelmatrix in die entsprechenden Gele zu erkennen war. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Möglichkeiten für eine biomimetische Funktionalisierung durch die Verwendung von PG-Acr deutlich erhöht wurden, ohne dabei die Chondrogenese von MSCs negativ zu beeinträchtigen (Abschnitt 5.1.3). Der nächste Teil dieser Arbeit befasste sich mit der umfangreichen biomimetischen Funktionalisierung von mit PG-Acr (0,6%) vernetzten HA-SH Hydrogelen. Hierzu wurden entweder biomimetische Peptide oder ein chondrogener Wachstumsfaktor kovalent in das Hydrogel eingebunden. Interessanterweise führte weder das Einbringen des N-Cadherin-mimetischen (HAV), des Kollagen II-bindenden (KLER), noch des Zelladhäsions-vermittelnden (RGD) Peptids zu einer Verbesserung der chondrogenen Differenzierung der MSCs. Beispielsweise führte das kovalente Anbinden von 2,5mM HAV zu einer Veränderung der Zellkernmorphologie und einer Verringerung der Glykosaminoglykan (GAG)-Produktion, wohingegen das Einbringen von 1,0mM RGD die Kollagenproduktion hemmte. Diese Ergebnisse könnten möglicherweise darauf zurückzuführen sein, dass die hier verwendeten HA-SH-Hydrogele selbst bereits ausreichend effizient für die chondrogene Differenzierung von MSCs sind. Im Vergleich dazu wurden die vorherigen Studien, die positive Effekte von Peptiden nachweisen konnten, entweder in neutralen PEG-Hydrogelen oder in wesentlich festeren MeHA-Hydrogelen durchgeführt [99, 101, 160]. Daraus lässt sich folgern, dass die Verwendung von Peptiden gerade unter ungünstigen Bedingungen von Bedeutung sein könnte und ein neutrales Gelsystem für die Untersuchung von einzelnen Peptideffekten geeignet scheint (Abschnitt 5.2.1). Als nächstes wurde exemplarisch der chondrogene Wachstumsfaktor Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-b1) kovalent an PG-Acr angebunden. Durch die Verwendung von kovalent gebundenem TGF-b1 könnte somit die Notwendigkeit einer wiederholten Zugabe von TGF-b1 bei in vivo-Anwendungen vermieden werden, was wiederum bei einer potentiellen klinischen Anwendung von Vorteil sein könnte. Deshalb wurde der Einfluss von kovalent gebundenem TGF-b1 auf die Chondrogenese von MSCs mit der gleichen Menge ungebundenem TGF-b1 (100nM TGF-b1) verglichen. Hierbei wurde ein signifikant positiver, dosisabhängiger Effekt von kovalent gebundenem TGF-b1 erfolgreich nachgewiesen. Die Chondrogenese von MSCs in Hydrogelen mit kovalent gebundenem TGF-b1 war dabei der Chondrogenese von MSCs in Hydrogelen, in die TGF-b1 lediglich gemischt wurde, deutlich überlegen. Dies wurde anhand von stärkeren Färbungen für GAGs, Gesamtkollagen, Aggrecan und Kollagen II in den TGF-b1-modifizierten Gelen gezeigt. Darüber hinaus bestätigten sowohl biochemische Analysen des GAG- und Kollagengehalts, als auch Western Blot-Analysen die histologischen Daten. Zusätzlich wurde der positive Effekt von kovalent gebundenem TGF-b1 durch erhöhte Expressionsraten der chondrogenen Markergene COL2A1, ACAN und SOX9 nachgewiesen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass durch die kovalente Bindung des Wachstumsfaktors TGF-b1 ein signifikant positiver Effekt auf die chondrogene Differenzierung von MSCs entsteht (Abschnitt 5.2.2). Generell stellen die auf Basis von Michael-Addition hergestellten PG-Acr-HA-SH-Hydrogele aufgrund ihrer hohen Acrylat-Funktionalität eine vielseitige Hydrogelplattform dar. So bieten diese Hydrogele zahlreiche Möglichkeiten für das Einbringen von verschiedensten biologischen Modifikationen wie die kovalente Bindung von biomimetischen Peptiden zusammen mit Wachstumsfaktoren in ein und demselben Zellträger. Anhand eines Proof-of-principle-Experiments wurde die generelle Eignung von reinen PG-Hydrogelen für die Evaluation von einzelnen Peptideffekten demonstriert. Dazu wurden die Hydrogele unter Verwendung der Thiol-ene-click-Reaktion hergestellt. In diesem Hydrogelsystem, ohne den unterstützenden Effekt von HA, zeigten MSCs eine verstärkte chondrogene Differenzierung in Anwesenheit von 1,0mM HAV. Diese ließ sich anhand von stärkeren Färbungen für GAGs, Aggrecan und Kollagen II nachweisen. Außerdem waren die GAG- und Gesamtkollagen-Werte deutlich erhöht. Hiermit wurde gezeigt, dass sich die vielseitig modifizierbaren, reinen PG-Hydrogele für die Analyse von Peptideffekten und deren Interaktion mit Wachstumsfaktoren eignen (Abschnitt 5.3). Der letzte Teil dieser Arbeit wurde im Rahmen des EU-Projektes HydroZONES durchgeführt, welches an der Entwicklung und Herstellung von zonalen Konstrukten arbeitet. Der Aspekt der zonalen Organisation von Knorpel rückte in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus [127, 128], jedoch findet er im Bereich des Tissue Engineering noch immer wenig Beachtung. Deshalb wurde im Folgenden die zonale Verteilung von Zellen innerhalb eines Zellträgers realisiert. Dazu wurden zwei unterschiedlich zusammengesetzte Hydrogele mithilfe der Thiol-ene-click-Reaktion hergestellt: eine aus HA-SH(FMZ) bestehende untere Lage und eine darauf liegende Lage aus reinem PG. Hierbei gelang es stabile, zonale Konstrukte herzustellen, in denen MSCs in beiden Zonen chondrogen differenzierten, was anhand von GAG- und Kollagen II-Färbungen, sowie durch die Quantifizierung des GAG-Gehalts bestätigt wurde. Hiermit konnte ein aus zwei verschiedenen Hydrogelen zusammengesetztes zonales Konstrukt erfolgreich hergestellt werden (Abschnitt 5.4). Durch den erstmaligen Einsatz des multifunktionalen Cross-linkers PG-Acr für das Tissue Engineering von Knorpel wurde ein auf Michael-Addition basierendes, vielseitiges HA-SH-Hydrogelsystem etabliert. Das hier vorgestellte Hydrogelsystem besitzt das Potenzial zukünftig als eine einfach anwendbare und vielseitige Toolbox zur Herstellung von biomimetischen Hydrogelen für die zellbasierte Knorpelregeneration verwendet zu werden. Vor allem könnte dabei der Einsatz von Stützstrukturen von entscheidender Bedeutung sein, um die mechanische Widerstandskraft der Zellträger zu erhöhen und somit das Potenzial für klinische Anwendungen zu vergrößern. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Thiol-ene-click-Hydrogele sowohl zur Herstellung von zellbeladenen, reinen PG-Gelen, als auch zur Herstellung von deutlich komplexeren, zonalen Konstrukten geeignet sind. Diese Thiol-ene-click-Hydrogele wurden bereits erfolgreich weiterentwickelt und für 3D-Bioprinting-Prozesse verwendet [204]. 3D-Bioprinting ist eine Teildisziplin des sich immer weiter entwickelnden Feldes der Biofabrikation [205]. Die Verwendung in diesem Bereich verändert zwar die Anforderungen an die hierfür verwendeten Hydrogele, ermöglicht es aber gleichzeitig deutlich komplexere sowie hierarchische Strukturen herzustellen und kleinere Lagen noch exakter zu positionieren [159, 206–209]. Da in den hier vorgestellten Thiol-ene-click-Hydrogelen eine deutliche chondrogene Differenzierung von MSCs nachgewiesen wurde, ist es vorstellbar, dass sie als Basis für die Herstellung sogenannter Bioinks dienen, welche in zukünftigen, anspruchsvollen Biofabrikationsprozessen Anwendung finden sollen. KW - Hyaluronsäure KW - Hydrogel KW - Knorpel KW - Tissue Engineering KW - Hyaluronic acid KW - Poly(glycidol) KW - Hydrogel KW - Cartilage Regeneration KW - Mesenchymal Stromal Cells Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155345 ER - TY - THES A1 - Berberich, Oliver T1 - Lateral Cartilage Tissue Integration - Evaluation of Bonding Strength and Tissue Integration \(in\) \(vitro\) Utilizing Biomaterials and Adhesives T1 - Laterale Knorpelintegration - Beurteilung der Adhäsionskraft und der Gewebeintegration \(in\) \(vitro\) unter Verwendung verschiedener Biomaterialien und Gewebekleber N2 - Articular cartilage defects represent one of the most challenging clinical problem for orthopedic surgeons and cartilage damage after trauma can result in debilitating joint pain, functional impairment and in the long-term development of osteoarthritis. The lateral cartilage-cartilage integration is crucial for the long-term success and to prevent further tissue degeneration. Tissue adhesives and sealants are becoming increasingly more popular and can be a beneficial approach in fostering tissue integration, particularly in tissues like cartilage where alternative techniques, such as suturing, would instead introduce further damage. However, adhesive materials still require optimization regarding the maximization of adhesion strength on the one hand and long-term tissue integration on the other hand. In vitro models can be a valuable support in the investigation of potential candidates and their functional mechanisms. For the conducted experiments within this work, an in vitro disc/ring model obtained from porcine articular cartilage tissue was established. In addition to qualitative evaluation of regeneration, this model facilitates the implementation of biomechanical tests to quantify cartilage integration strength. Construct harvesting for histology and other evaluation methods could be standardized and is ethically less questionable compared to in vivo testing. The opportunity of cell culture technique application for the in vitro model allowed a better understanding of cartilage integration processes. Tissue bonding requires chemical or physical interaction of the adhesive material and the substrate. Adhesive hydrogels can bind to the defect interface and simultaneously fill the gap of irregularly shaped defect voids. Fibrin gels are derived from the physiological blood-clot formation and are clinically applied for wound closure. Within this work, comparisons of different fibrin glue formulations with the commercial BioGlue® were assessed, which highlighted the need for good biocompatibility when applied on cartilage tissue in order to achieve satisfying long-term integration. Fibrin gel formulations can be adapted with regard to their long-term stability and when applied on cartilage disc/ring constructs improved integrative repair is observable. The kinetic of repairing processes was investigated in fibrin-treated cartilage composites as part of this work. After three days in vitro cultivation, deposited extracellular matrix (ECM) was obvious at the glued interface that increased further over time. Interfacial cell invasion from the surrounding native cartilage was detected from day ten of tissue culture. The ECM formation relies on molecular factors, e.g., as was shown representatively for ascorbic acid, and contributes to increasing integration strengths over time. The experiments performed with fibrin revealed that the treatment with a biocompatible adhesive that allows cartilage neosynthesis favors lateral cartilage integration in the long term. However, fibrin has limited immediate bonding strength, which is disadvantageous for use on articular cartilage that is subject to high mechanical stress. The continuing aim of this thesis was to further develop adhesive mechanisms and new adhesive hydrogels that retain the positive properties of fibrin but have an increased immediate bonding strength. Two different photochemical approaches with the advantage of on-demand bonding were tested. Such treatment potentially eases the application for the professional user. First, an UV light induced crosslinking mechanism was transferred to fibrin glue to provide additional bonding strength. For this, the cartilage surface was functionalized with highly reactive light-sensitive diazirine groups, which allowed additional covalent bonds to the fibrin matrix and thus increased the adhesive strength. However, the disadvantages of this approach were the multi-step bonding reactions, the need for enzymatic pretreatment of the cartilage, expensive reagents, potential UV-light damage, and potential toxicity hazards. Due to the mentioned disadvantages, no further experiments, including long-term culture, were carried out. A second photosensitive approach focused on blue light induced crosslinking of fibrinogen (RuFib) via a photoinitiator molecule instead of using thrombin as a crosslinking mediator like in normal fibrin glue. The used ruthenium complex allowed inter- and intramolecular dityrosine binding of fibrinogen molecules. The advantage of this method is a one-step curing of fibrinogen via visible light that further achieved higher adhesive strengths than fibrin. In contrast to diazirine functionalization of cartilage, the ruthenium complex is of less toxicological concern. However, after in vitro cultivation of the disc/ring constructs, there was a decrease in integration strength. Compared to fibrin, a reduced cartilage synthesis was observed at the defect. It is also disadvantageous that a direct adjustment of the adhesive can only be made via protein concentration, since fibrinogen is a natural protein that has a fixed number of tyrosine binding sites without chemical modification. An additional cartilage adhesive was developed that is based on a mussel-inspired adhesive mechanism in which reactivity to a variety of substrates is enabled via free DOPA amino acids. DOPA-based adhesion is known to function in moist environments, a major advantage for application on water-rich cartilage tissue surrounded by synovial liquid. Reactive DOPA groups were synthetically attached to a polymer, here POx, to allow easy chemical modifiability, e.g. insertion of hydrolyzable ester motifs for tunable degradation. The possibility of preparing an adhesive hybrid hydrogel of POx in combination with fibrinogen led to good cell compatibility as was similarly observed with fibrin, but with increased immediate adhesive strength. Degradation could be adjusted by the amount of ester linkages on the POx and a direct influence of degradation rates on the development of integration in the in vitro model could be shown. Hydrogels are well suited to fill defect gaps and immediate integration can be achieved via adhesive properties. The results obtained show that for the success of long-term integration, a good ability of the adhesive to take up synthesized ECM components and cells to enable regeneration is required. The degradation kinetics of the adhesive must match the remodeling process to avoid intermediate loss of integration power and to allow long-term firm adhesion to the native tissue. Hydrogels are not only important as adhesives for smaller lesions, but also for filling large defect volumes and populating them with cells to produce tissue engineered cartilage. Many different hydrogel types suitable for cartilage synthesis are reported in the literature. A long-term stable fibrin formulation was tested in this work not only as an adhesive but also as a bulk hydrogel construct. Agarose is also a material widely used in cartilage tissue engineering that has shown good cartilage neosynthesis and was included in integration assessment. In addition, a synthetic hyaluronic acid-based hydrogel (HA SH/P(AGE/G)) was used. The disc/ring construct was adapted for such experiments and the inner lumen of the cartilage ring was filled with the respective hydrogel. In contrast to agarose, fibrin and HA-SH/P(AGE/G) gels have a crosslink mechanism that led to immediate bonding upon contact with cartilage during curing. The enhanced cartilage neosynthesis in agarose compared to the other hydrogel types resulted in improved integration during in vitro culture. This shows that for the long-term success of a treatment, remodeling of the hydrogel into functional cartilage tissue is a very high priority. In order to successfully treat larger cartilage defects with hydrogels, new materials with these properties in combination with chemical modifiability and a direct adhesion mechanism are one of the most promising approaches. N2 - Gelenkknorpeldefekte stellen eines der größten klinischen Probleme für orthopädische Chirurgen dar, und Knorpelschäden nach einem Trauma können zu starken Gelenkschmerzen, Funktionseinschränkungen und langfristig zur Entwicklung von Arthrose führen. Die laterale Knorpel-Knorpel-Integration ist entscheidend für den langfristigen Behandlungserfolg, um eine weitere Degeneration des Gewebes zu verhindern. Gewebekleber und -versiegelungen erfreuen sich zunehmender Beliebtheit und können einen vorteilhaften Ansatz zur Förderung der Gewebeintegration darstellen. Insbesondere bei einem avaskulären Gewebe wie Knorpel können alternative Fixierungstechniken wie Nähte eher zu weiteren Schäden führen. Aktuelle Klebstoffe bedürfen jedoch noch der Optimierung im Hinblick auf die Maximierung der Klebekraft einerseits und der langfristigen Gewebsintegration andererseits. In vitro Modelle können eine wertvolle Unterstützung bei der Untersuchung potenzieller Kleber-Kandidaten und derer Funktionsmechanismen sein. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente wurde ein in vitro Disc/Ring-Modell aus porcinem Gelenkknorpel hergestellt. Neben der qualitativen Bewertung der Regeneration erleichtert dieses Modell die Durchführung biomechanischer Tests zur Quantifizierung der Knorpelintegrationskraft. Die Herstellung von Konstrukten für die Histologie und anderer analytischer Verfahren ist standardisierbar und ist im Vergleich zu in vivo Versuchen ethisch weniger bedenklich. Die Möglichkeit der Anwendung von Zellkulturtechniken mit dem in vitro Modell ermöglicht eine bessere Untersuchung von Knorpelintegrationsprozessen. Das Verkleben von Gewebe erfordert eine chemische oder physikalische Wechselwirkung zwischen dem Klebstoff und dem Substrat. Adhäsive Hydrogele können sich an die Defektoberfläche binden und gleichzeitig die Lücke unregelmäßig geformter Defekthohlräume füllen. Fibrin-Gele sind von der physiologischen Blutgerinnung abgeleitet und werden seit langem klinisch zum Wundverschluss eingesetzt. Innerhalb dieser Arbeit wurden Vergleiche verschiedener Fibrinkleberformulierungen mit dem kommerziellen BioGlue® durchgeführt, welche gezeigt haben, dass bei der Anwendung auf Knorpelgewebe eine gute Biokompatibilität erforderlich ist, um eine zufriedenstellende Langzeitintegration zu erreichen. Fibrinformulierungen können im Hinblick auf ihre Langzeitstabilität angepasst werden, und bei der Anwendung auf Knorpel Disc/Ring-Konstrukten ist eine verbesserte integrative Reparatur zu beobachten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Kinetik der Reparaturprozesse in fibrinbehandelten Knorpelkompositen untersucht. Nach dreitägiger in vitro-Kultivierung war eine Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) an der verklebten Grenzfläche zu erkennen, welche mit der Zeit weiter zunahm. Ab dem zehnten Tag der Gewebekultur wurde das Einwandern von Zellen aus dem umgebenden nativen Knorpel an der Grenzfläche festgestellt. Die ECM-Bildung hängt von Stoffwechselfaktoren ab, wie es beispielhaft für Ascorbinsäure gezeigt wurde. Dabei trug neue ECM zu einer mit der Zeit zunehmenden Integrationsstärke bei. Die mit Fibrin durchgeführten Experimente haben gezeigt, dass der Ansatz mit einem biokompatiblen Klebstoff und dem Potenzial zur Knorpelneosynthese die laterale Knorpelintegration langfristig begünstigt. Allerdings hatte Fibrin nur eine begrenzte anfängliche Klebekraft, was für den Einsatz auf mechanisch stark belastetem Gelenkknorpel nachteilig ist. Das weiterführende Ziel dieser Arbeit war es unter anderem Haftmechanismen und neue adhäsive Hydrogele zu entwickeln, welche die positiven Eigenschaften von Fibrin beibehalten, aber eine höhere Klebekraft aufweisen. Es wurden zwei verschiedene photochemische Ansätze getestet, die den Vorteil einer zeitlich festlegbaren Verklebung haben und somit dem Anwender eine einfache Applizierung ermöglichen. Zunächst wurde ein UV-Licht-induzierter Vernetzungsmechanismus zur Bereitstellung zusätzlicher Klebestellen zum Fibrinkleber entwickelt. Die Knorpeloberfläche wurde dabei mit hochreaktiven, lichtempfindlichen Diazirin-Molekülen funktionalisiert, die zusätzliche kovalente Bindungen an die Fibrinmatrix ermöglichten und damit die direkte Adhäsionskraft erhöhten. Die Nachteile dieses Ansatzes waren jedoch die mehrstufigen Vernetzungsreaktionen, die Notwendigkeit einer enzymatischen Vorbehandlung des Knorpels, teure Reagenzien, eine mögliche Schädigung durch UV-Licht und potentielle toxikologische Risiken. Wegen den erwähnten Nachteilen wurde auf zusätzliche Untersuchungen verzichtet und der Fokus auf die Alternativenfindung gelegt. Ein weiterer Ansatz konzentrierte sich auf die Vernetzung von Fibrinogen durch blaues Licht (RuFib) mittels eines Photoinitiaor-Moleküls statt über Thrombinzugabe wie bei gewöhnlichen Fibrinklebern. Der verwendete Rutheniumkomplex ermöglichte die inter- und intramolekulare Dityrosinbindung von Fibrinogenmolekülen. Der Vorteil war dabei die einstufige lichtinduzierte Vernetzung von Fibrinogen mit höheren Haftkräften als bei Fibrin. Im Gegensatz zur Diazirin-Funktionalisierung von Knorpel ist der Rutheniumkomplex auch toxikologisch weniger bedenklich. Nach in vitro Kultivierung der RuFib geklebten Disc/Ring-Konstruktes kam es jedoch zu einer Abnahme der Integrationskraft. Im Vergleich zu Fibrin wurde eine verminderte Knorpelsynthese am Defekt beobachtet. Nachteilig ist auch, dass eine Modifizierung des Klebers einzig über die Proteinkonzentration erfolgen kann, da Fibrinogen als natürliches Protein eine feste Anzahl von Tyrosin-Bindungsstellen hat und alternativ chemisch verändert werden müsste. Ein zusätzlich entwickelter Klebstoff basiert auf einem von Muscheln inspirierten Haftmechanismus, bei dem die Reaktivität zu einer Vielzahl von Substraten über freie DOPA-Aminosäuren ermöglicht wird. Es ist bekannt, dass die DOPA-basierte Adhäsion in einer feuchten Umgebung funktioniert, ein großer Vorteil für die Anwendung auf stark wasserhaltigem Knorpelgewebe und im feuchten Synovium. Reaktive DOPA-Gruppen wurden synthetisch an ein Polymer, in diesem Fall POx, gebunden, um eine einfache chemische Modifizierbarkeit zu ermöglichen. Mögliche Anpassungen sind z.B. das Einfügen von hydrolysierbaren Esterbindungen um veränderte Degradationsraten zu erreichen. Die Möglichkeit der Herstellung eines adhäsiven Hybridhydrogels aus POx in Kombination mit Fibrinogen führte zu einer erhöhten Zellkompatibilität, wie sie bereits bei Fibrin beobachtet wurde, jedoch mit erhöhter direkter Klebekraft. Die angepasste Degradationskinetik über die Menge an Esterbindungen am POx hatte einen direkten Einfluss auf die Entwicklung der Integration im in vitro Modell gezeigt. Hydrogele sind gut geeignet, um Defektlücken zu füllen. Bei intrinsischen Adhäsionseigenschaften kann eine gewisse sofortige Integration erreicht werden. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass für den Erfolg einer langfristigen Integration eine gute Fähigkeit des Klebstoffs zur Aufnahme von synthetisierten ECM-Komponenten und Zellen erforderlich ist. Die Abbaukinetik des Klebstoffs muss dabei mit dem Umbauprozess im Gleichgewicht sein, um einen zwischenzeitlichen Verlust der Integrationskraft zu vermeiden und eine langfristige feste Adhäsion an das native Gewebe zu ermöglichen. Hydrogele sind nicht nur als Klebstoffe für kleinere Defekte wichtig, sondern auch als Tissue-Engineering Material um große Defektvolumina aufzufüllen und mit Zellen zu besiedeln. In der Literatur werden verschiedene Hydrogelarten für die Knorpelsynthese berichtet. Eine langzeitstabile Fibrinformulierung wurde in dieser Arbeit nicht nur als Klebstoff, sondern auch als größeres Hydrogelkonstrukt getestet. Agarose ist ebenfalls ein im Knorpel-Tissue-Engineering häufig verwendetes Material, das bereits eine gute Knorpelneosynthese gezeigt hat. Darüber hinaus wurde ein synthetisches Hyaluronsäure-basiertes Hydrogel (HA-SH/P(AGE/G)) untersucht. In durchgeführten Experimenten wurde das Disc/Ring Modell adaptiert und das innere Lumen des Knorpelrings mit dem jeweiligen Hydrogel gefüllt. Im Gegensatz zu Agarose verfügen Fibrin und das HA-SH/P(AGE/G)-Gel über einen Vernetzungsmechanismus, der beim Kontakt mit dem Knorpel während der Aushärtung zu einer sofortigen Bindung führte. Die verstärkte Knorpelneosynthese in Agarose im Vergleich zu den anderen Hydrogeltypen führte zu einer erhöhten Integration während der in vitro Kultur. Dies zeigt, dass für den langfristigen Erfolg eines Therapieansatzes der Umbau des Hydrogels in funktionelles Knorpelgewebe eine sehr hohe Priorität hat. Um größere Knorpeldefekte erfolgreich mit Hydrogelen behandeln zu können, sind neue Materialien mit diesen Eigenschaften in Kombination mit chemischer Modifizierbarkeit und einem direkten Adhäsionsmechanismus einer der vielversprechendsten Ansätze. KW - Knorpel KW - Hyaliner Knorpel KW - Gelenkknorpel KW - Arthrose KW - Kniegelenkarthrose KW - Cartiage Integration KW - Adhesive Hydrogels KW - in vitro Testmodell KW - Cartilage defect KW - Biomechanics KW - Tissue Engineering Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346028 ER - TY - THES A1 - Wallstabe, Julia T1 - Induktion von GvHD-artigen Gewebeschäden an humanen artifiziellen Hautmodellen T1 - Induction of GvHD-like tissue damage in human artificial skin models N2 - Graft-versus-Host Disease (GvHD) stellt einen häufigen, den Gesamterfolg einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation limitierenden Faktor dar. Bei dieser Komplikation attackieren vor allem alloreaktive T-Lymphozyten des Stammzellspenders gesunde Körperzellen des Patienten. Infolgedessen kommt es zu Gewebeschäden in den Zielorganen Haut, Leber und Darm. Die Behandlung der GvHD erfordert eine effektive Immunsuppression, was wiederum Graft-versusTumor-Effekte kompromittiert und den Rückfall der malignen Grunderkrankung bedingen kann. Viele Patienten sprechen aus bisher ungeklärten Gründen nicht auf die klassische immunsuppressive Therapie mit Steroiden oder second-line Therapien an. Neue zelluläre Therapien zur Behandlung der refraktären GvHD sind auf dem Vormarsch, bedürfen aber einer weiterführenden klinischen Testung, auch um die exakten Wirkungsmechanismen zu verstehen. Idealerweise könnten neue Testsysteme das GvHD-Potential von allogenen Stammzellpräparaten oder aber das immunsuppressive Potential von neuen GvHD-Therapien vorhersagen, bevor diese in klinischen Studien eingesetzt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein erstes, in multiplen Replikaten einsetzbares, humanes organotypisches Gewebemodell zur Simulation einer GvHD-Reaktion am Beispiel der Haut zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden artifizielle humane Hautmodelle unter statischen (KollagenHautmodelle) und dynamischen Kulturbedingungen (vaskularisierte Hautmodelle) generiert. Die Injektion unstimulierter PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cells) führte zu keinen histomorphologischen Veränderungen in den KollagenHautmodellen. Im Gegensatz dazu hatte die Injektion vorstimulierter allogener PBMCs eine Zerstörung der epidermalen Strukturen der Kollagen-Hautmodelle zur Folge, welche vergleichbar waren mit Gewebeschäden bei einer akuten GvHD der Haut. Dieselben Schädigungen der Epidermis wurden durch die Injektion von Mediumüberständen vorstimulierter PBMCs in die Kollagen-Hautmodelle erreicht. Im Kulturmedium der Kollagen-Hautmodelle wurden hohe Konzentrationen von Interleukin 2 und 17, Interferon gamma sowie Tumornekrosefaktor alpha gemessen, wodurch auf die Beteiligung von Zytokinen an der inflammatorischen Reaktion geschlossen werden konnte. Auch im komplexeren vaskularisierten Hautmodell verursachte die Injektion vorstimulierter PBMCs histomorphologische Veränderungen entsprechend einer akuten Haut-GvHD sowie einen zeitabhängigen Anstieg proinflammatorischer Zytokine. Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Induktion einer starken Inflammations- und Immunreaktion in artifiziellen humanen Hautmodellen, welche histomorphologisch eine GvHD imitiert, möglich ist. Dieses Modell könnte als Grundlage für die Entwicklung eines klinisch relevanten Testsystems zur Bestimmung des GvHD-Restpotentials oder zur Festlegung der immunsuppressiven Kapazität innovativer Zellpräparate dienen. Somit könnten humane artifizielle GvHDModelle in klinischen Studien eingesetzt werden und die Erfahrungen aus Tiermodellen ergänzen sowie erste in vitro Ergebnisse im humanen System liefern, welche dann mit dem tatsächlichen klinischen Resultat verglichen werden könnten. N2 - Graft-versus-Host Disease (GvHD) remains the most important limiting factor for the success of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. This major complication is caused by alloreactive donor T-lymphocytes that attack healthy tissues of the recipient leading to severe tissue damage within the target organs skin, liver and gut. Treatment of GvHD requires effective immunosuppression, which in turn impairs Graft-versus-Tumor activity and enhances the risk for relapse of the malignant disease. However, for still unknown reasons many patients do not respond to standard immunosuppressive therapy with steroids or to second-line therapies. Development of novel cellular therapies that gain more and more clinical relevance due to their high anti-tumor potency lead to a strong demand for advanced test platforms to further investigate their underlying functional mechanisms and exclude off-tumor effects against healthy tissues. Ideally, new test systems could be used for the prediction of the GvHD potential of allogeneic stem cell products or for prediction of an immunosuppressive potential of novel GvHD therapies before entering clinical studies. The aim of this study was to establish a GvHD test system based on human organotypic skin models allowing the simulation of GvHD reactions in the skin in multiple replicates. To this end, artificial human skin models were generated under static (collagen skin model) and dynamic culture conditions (vascularized skin model). Injection of unstimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) did not cause histomorphological changes in collagen skin models. In contrast, injection of prestimulated PBMCs resulted in disruption of the epidermis of collagen skin models mimicking acute skin GvHD. The same disruption of the epidermal layer was observed using cell culture supernatants of prestimulated PBMCs, suggesting the involvement of proinflammatory cytokines. Indeed, measurement of cytokine levels in culture supernatants revealed an increase of interleukin 2 and 17, interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. In addition, injection of prestimulated PBMCs into more complex vascularized skin models also caused disruption of the epidermal layer and an increase of proinflammatory cytokine levels in a time dependent manner. Taken together, these findings demonstrate that it is possible to induce a strong immune reaction and inflammatory tissue damage in artificial human skin models mimicking histomorphological patterns of acute skin GvHD. Therefore, this model could contribute to the development of a clinically relevant GvHD test platform for prediction of the GvHD potential or immunosuppressive capacity of innovative cell products. Thus, artificial human GvHD models may be employed in clinical studies in order to gain first in vitro results in a human system and to extend information from animal models, which can then be compared to the actual clinical outcome. KW - Graft-versus-host-disease KW - Tissue Engineering KW - inflammatorische Gewebeschäden KW - artifizielle Hautmodelle Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153966 ER - TY - THES A1 - Massih, Bita T1 - Human stem cell-based models to analyze the pathophysiology of motor neuron diseases T1 - Humane Stammzell-basierte Modelle zur Analyse der Pathophysiologie von Motoneuronerkrankungen N2 - Motor neuron diseases (MNDs) encompass a variety of clinically and genetically heterogeneous disorders, which lead to the degeneration of motor neurons (MNs) and impaired motor functions. MNs coordinate and control movement by transmitting their signal to a target muscle cell. The synaptic endings of the MN axon and the contact site of the muscle cell thereby form the presynaptic and postsynaptic structures of the neuromuscular junction (NMJ). In MNDs, synaptic dysfunction and synapse elimination precede MN loss suggesting that the NMJ is an early target in the pathophysiological cascade leading to MN death. In this study, we established new experimental strategies to analyze human MNDs by patient derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and investigated pathophysiological mechanisms in two different MNDs. To study human MNDs, specialized cell culture systems that enable the connection of MNs to their target muscle cells are required to allow the formation of NMJs. In the first part of this study, we established and validated a human neuromuscular co-culture system consisting of iPSC derived MNs and 3D skeletal muscle tissue derived from myoblasts. We generated 3D muscle tissue by culturing primary myoblasts in a defined extracellular matrix in self-microfabricated silicone dishes that support the 3D tissue formation. Subsequently, iPSCs from healthy donors and iPSCs from patients with the progressive MND Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) were differentiated into MNs and used for 3D neuromuscular co-cultures. Using a combination of immunohistochemistry, calcium imaging, and pharmacological stimulations, we characterized and confirmed the functionality of the 3D muscle tissue and the 3D neuromuscular co-cultures. Finally, we applied this system as an in vitro model to study the pathophysiology of ALS and found a decrease in neuromuscular coupling, muscle contraction, and axonal outgrowth in co-cultures with MNs harboring ALS-linked superoxide dismutase 1 (SOD1) mutation. In summary, this co-culture system presents a human model for MNDs that can recapitulate aspects of ALS pathophysiology. In the second part of this study, we identified an impaired unconventional protein secretion (UPS) of Sod1 as pathological mechanisms in Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-associated MND. Sod1 is a leaderless cytosolic protein which is secreted in an autophagy-dependent manner. We found that Plekhg5 depletion in primary MNs and NSC34 cells leads to an impaired secretion of wildtype Sod1, indicating that Plekhg5 drives the UPS of Sod1 in vitro. By interfering with different steps during the biogenesis of autophagosomes, we could show that Plekhg5-regulated Sod1 secretion is determined by autophagy. To analyze our findings in a clinically more relevant model we utilized human iPSC MNs from healthy donors and ALS patients with SOD1 mutations. We observed reduced SOD1 secretion in ALS MNs which coincides with reduced protein expression of PLEKHG5 compared to healthy and isogenic control MNs. To confirm this correlation, we depleted PLEKHG5 in control MNs and found reduced extracellular SOD1 levels, implying that SOD1 secretion depends on PLEKHG5. In summary, we found that Plekh5 regulates the UPS of Sod1 in mouse and human MNs and that Sod1 secretion occurs in an autophagy dependent manner. Our data shows an unreported mechanistic link between two MND-associated proteins. N2 - Motoneuronerkrankungen (MNE) umfassen eine Vielzahl klinisch und genetisch heterogener Erkrankungen, die zur Degeneration von Motoneuronen (MN) und zu beeinträchtigten motorischen Funktionen führen. MN koordinieren und steuern Muskelbewegungen, indem sie ihr Signal an eine Zielmuskelzelle übertragen. Die synaptischen Endungen des MN-Axons und die Kontaktstelle der Muskelzelle bilden dabei die präsynaptischen und postsynaptischen Strukturen der neuromuskulären Endplatte (NME). Bei MNE zeichnen sich synaptische Dysfunktion und Synapseneliminierung bereits vor dem Verlust von MN ab, was darauf hindeutet, dass die NME ein frühes Ziel in der pathophysiologischen Kaskade ist, die zum MN-Tod führt. In dieser Studie haben wir neue experimentelle Strategien zur Analyse humaner MNE mithilfe von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSZ) entwickelt und pathophysiologische Mechanismen bei zwei verschiedenen MNE untersucht. Um humane MNE zu untersuchen sind Zellkultursysteme erforderlich, die die Verbindung von MN mit ihren Zielmuskelzellen ermöglichen, um NME zu bilden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir ein humanes neuromuskuläres Co-Kultursystem etabliert und validiert, das aus iPSZ abgeleiteten MN und 3D Skelettmuskelgewebe aus Myoblasten besteht. Wir haben 3D Muskelgewebe erzeugt, indem wir primäre Myoblasten in einer definierten extrazellulären Matrix in selbst gefertigten Silikonschalen kultivierten, die die 3D-Gewebebildung unterstützen. Anschließend wurden iPSZ von gesunden Spendern und iPSZ von Patienten mit der MNE Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) in MN differenziert und für neuromuskuläre 3D Co-Kulturen verwendet. Mithilfe von immunhistochemischen Untersuchungen, Calcium-Imaging und pharmakologischen Stimulationen konnten wir die Funktionalität des 3D Muskelgewebes und neuromuskulären 3D Co-Kulturen charakterisieren und validieren. Anschließend wurde das System als in vitro Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie von ALS verwendet. ALS Co-Kulturen mit MN, die eine Superoxid Dismutase 1 (SOD1)-Genmutation aufwiesen, zeigten eine Abnahme der neuromuskulären Verbindung, der Muskelkontraktion und des axonalen Wachstums. Zusammenfassend stellt dieses Co-Kultursystem ein humanes Modell für die Untersuchung von MNE dar, das Aspekte der ALS-Physiologie rekapitulieren kann. Im zweiten Teil dieser Studie konnten wir eine Beeinträchtigung der unkonventionellen Proteinsekretion (UPS) von Sod1 als pathologischen Mechanismus bei Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-assoziiertem MNE identifizieren. Sod1 ist ein cytosolisches Protein ohne Signalsequenz für konventionelle Sekretion. Stattdessen wird die UPS über sekretorische Autophagie-Mechanismen reguliert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Plekhg5-Depletion in primären MN und NSC34-Zellen zu einer beeinträchtigten Sekretion von Wildtyp-Sod1 führt, was darauf hinweist, dass die UPS von Sod1 Plekgh5 abhängig ist. Indem verschiedene Schritte während der Biogenese von Autophagosomen gestört wurden, konnten wir nachweisen, dass die Plekhg5-regulierte Sod1-Sekretion Autophagie abhängig ist. Um unsere Ergebnisse in einem klinisch relevanteren Modell zu analysieren, wurden humane iPSZ-MN von gesunden Spendern und ALS-Patienten mit SOD1-Mutationen untersucht. Hier fand sich, dass die Sekretion von mutiertem SOD1 in ALS-MN im Vergleich zu gesunden und isogenen Kontrollen verringert ist. Dabei konnten wir zeigen, dass eine verringerte SOD1 Sekretion in ALS-MNs mit einer verringerten Expression von PLEKHG5 einhergeht. Um diese Korrelation zu bestätigen, wurden Kontroll-MN nach PLEKHG5-Depletion untersucht und eine verminderte SOD1-Sekretion dokumentiert, was auf eine PLEKHG5 Abhängigkeit hindeutet. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass Plekh5 die UPS von Sod1 in Maus MN und humanen MN reguliert und dass die Sod1-Sekretion Autophagie abhängig erfolgt. Unsere Daten belegen eine bislang noch nicht gezeigte mechanistische Verknüpfung zwischen zwei MNE-assoziierten Proteinen. KW - Tissue Engineering KW - NMJ (neuromuscular junction) KW - MND KW - SOD1 KW - ALS KW - PLEKHG5 KW - Co-culture KW - 3D muscle KW - Motoneuron KW - Stammzellen KW - Neuromuskuläre Endplatte KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Motoneuron-Krankheit KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - Zellkultur KW - Motorische Endplatte KW - Induced pluripotent stem cells KW - Motor neuron disease KW - Amyotrophic lateral sclerosis KW - Cell culture Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346374 PB - Frontiers in Cell and Developmental Biology ER - TY - THES A1 - Göttlich, Claudia T1 - Etablierung eines humanen 3D Lungentumor-Testsystems zur Analyse von Behandlungseffekten T1 - Establishment of a human 3D lung tumor test system for the analysis of treatment effects N2 - Lungenkrebs ist weltweit für die meisten krebsassoziierten Tode verantwortlich. Ursache dafür ist unter anderem, dass viele Medikamente in der klinischen Anwendung, aufgrund nicht übertragbarer Ergebnisse aus der Präklinik, scheitern. Zur Entwicklung neuer Therapiestrategien werden deshalb Modelle benötigt, welche die in vivo Situation besser widerspiegeln. Besonders wichtig ist es dabei, zu zeigen, für welche Fragestellungen ein neues Testsystem valide Ergebnisse liefert. In dieser Arbeit ist es mit Hilfe des Tissue Engineering gelungen, ein humanes 3D in vitro Lungentumor-Testsystem weiter zu entwickeln und für verschiedene Fragestellungen zu validieren. Zudem konnten sowohl für die Herstellung als auch für die Behandlung der Tumormodelle SOPs etabliert werden. Hier wurde zunächst beobachtet, dass die Auswerteparameter für die Beurteilung von Behandlungseffekten eine geringe Varianz aufweisen und das 3D Modell deshalb als Testsystem geeignet ist. Ein Vergleich der Morphologie, des EMT-Status und der Differenzierung der Tumorzelllinien im 3D Modell mit Tumorbiopsaten von Adenokarzinompatienten verdeutlichte, dass die 3D Modelle tumorrelevante Merkmale besitzen. So sind die Zelllinien auf der biologischen Matrix, verglichen mit der jeweiligen 2D Kultur, durch eine reduzierte Proliferationsrate gekennzeichnet, welche eher der in vivo Situation entspricht. Für die Etablierung und Validierung des 3D Modells als Testsystem war es notwendig, klinisch relevante Therapien in dem Modell anzuwenden und die Ergebnisse der Behandlung in vitro mit denen im Patienten zu vergleichen. Dabei konnte zunächst bestätigt werden, dass eine zielgerichtete Therapie gegen den EGFR in dem 3D System zu einer verstärkten Induktion der Apoptose im Vergleich zu 2D führt. Dies entspricht klinischen Beobachtungen, bei denen EGFR-mutierte Patienten gut auf eine Therapie mit Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) ansprechen. Anschließend wurde in dieser Arbeit erstmals in vitro gezeigt, dass die Behandlung mit einem HSP90-Inhibitor bei KRAS-Mutation wie in behandelten Patienten keine eindeutigen Vorteile bringt, diese jedoch in Experimenten der 2D Zellkultur mit den entsprechenden Zelllinien vorhergesagt werden. Die Ergebnisse aus dem in vitro Modell spiegeln damit verschiedene klinische Studien wider und unterstreichen das Potenzial des 3D Lungentumor-Testsystems die Wirkung zielgerichteter Therapien vorherzusagen. Durch die Messung von Signalwegsaktivierungen über Phospho-Arrays und Western Blot konnten in dieser Arbeit Unterschiede zwischen 2D und 3D nach Behandlung gezeigt werden. Diese lieferten die Grundlage für bioinformatische Vorhersagen für Medikamente. Mit fortschreitender Erkrankung und dem Entstehen invasiver Tumore, die möglicherweise Metastasen bilden, verschlechtert sich die Prognose von Krebspatienten. Zudem entwickeln Patienten, die zunächst auf eine Therapie mit TKI ansprechen, bereits nach kurzer Zeit Resistenzen, die ebenfalls zur Progression des Tumorwachstums führen. Zur Wirkungsuntersuchung von Substanzen in solchen fortgeschrittenen Erkrankungsstadien wurde das bestehende Testsystem erweitert. Zum einen wurde mit Hilfe des Wachstumsfaktors TGF-β1 eine EMT ausgelöst. Hier konnte beobachtet werden, dass sich die Expression verschiedener EMT- und invasionsassoziierter Gene und Proteine veränderte und die Zellen vor allem in dynamischer Kultur verstärkt die Basalmembran der Matrix überquerten. Zum anderen wurde die Ausbildung von Resistenzen gegenüber TKI durch die Generierung von resistenten Subpopulationen aus einer ursprünglich sensitiven Zelllinie und anschließender Kultivierung auf der Matrix abgebildet. Dabei zeigte sich keine der klinisch bekannten Mutationen als ursächlich für die Resistenz, sodass weitere Mechanismen untersucht wurden. Hier konnten Veränderungen in der Signaltransduktion sowie der Expression EMT-assoziierter Proteine festgestellt werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine neuartige Behandlung im Bereich der Immuntherapie erfolgreich in dem 3D Modell angewendet. Dafür wurden T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, in statischer und dynamischer Kultur zu den Tumorzellen gegeben und der Therapieeffekt mittels histologischer Färbung und der Bestimmung der Apoptose evaluiert. Zusätzlich konnten Eigenschaften der T-Zellen, wie deren Proliferation sowie Zytokinausschüttung quantifiziert und damit eine spezifische Wirkung der CAR transduzierten T-Zellen gegenüber Kontroll-T-Zellen nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Lungentumor-Testsystem für die Anwendung in der präklinischen Entwicklung von Krebsmedikamenten sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Dieses Testsystem ist in der Lage relevante Daten zu Biomarker-geleiteten Therapien, zur Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien und zur Verbesserung neuartiger Therapiestrategien zu liefern. N2 - Lung cancer is the most common cause of cancer related deaths worldwide. One reason for this is that many drugs fail in the clinical application due to inefficient transferability of preclinical results. Consequently, for the development of new treatment strategies tumor models that better reflect the in vivo situation are required. It is of special significance to show for which questions a new test system provides valid results. In the here presented work, a human 3D in vitro lung tumor test system was refined and validated for different interrogations using tissue engineering methods. The generation of the model as well as its treatment were defined in SOPs. First, it was shown that the variance of the analysis parameters was low, demonstrating the 3D model to be suitable as a test system. A comparison of the morphology, the EMT status and the differentiation of the tumor cell lines in the 3D model with tumor biopsies from adenocarcinoma patients revealed that the 3D tumor models exhibit tumor relevant characteristics. The cells on the matrix had a lower proliferation rate compared to the respective 2D culture that better mimic the in vivo situation. For the establishment and validation of the test system, clinically relevant therapies were applied and the results of the treatment in vitro were compared to those in patients. By doing so, it was confirmed that a targeted therapy against the EGFR led to an increased apoptosis induction in the 3D system compared to 2D. This resembles clinical observations, in which EGFR-mutated patients respond to the therapy with tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Next, it was shown for the first time in vitro in the 3D model that the treatment with a HSP90 inhibitor in the context of a KRAS mutation has no clear advantages as observed in patients, but which had been predicted in 2D cell culture. The results from the in vitro model match several clinical studies and emphasize the potential of the 3D lung tumor test system to predict the effect of targeted treatments. By measuring the activation of signal transduction pathways using phospho-arrays and western blots, differences between 2D and 3D after treatment were shown. These provided the basis for bioinformatic drug predictions. With the progress of the disease and the development of invasive tumors that might form metastases, the prognosis of patients worsens. Additionally, patients that initially respond to a therapy with TKIs develop resistances that also lead to the progression of tumor growth. To evaluate the effect of substances in these life-threatening disease stages, the existing test system was enhanced. On the one hand EMT was induced by addition of the growth factor TGF-β1. Here, it was observed that the expression of several EMT- and invasion-associated genes and proteins changed and the cells crossed the basement membrane to a higher extent, especially in the dynamic culture. On the other hand, the development of resistances against TKIs was represented by the generation of resistant subpopulations from an initial sensitive cell line and subsequent culture on the matrix. In the course of this experiment, none of the known mutations could be attributed to the resistance, so that other potential mechanisms were investigated. Here, changes in the signal transduction as well as in the expression of EMT-associated proteins were found. In the last part of the thesis, a new treatment strategy in the field of immune therapies was successfully tested in the 3D model. For that, T cells bearing a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 were added to the tumor cells in static and dynamic culture. The therapy effect was determined by histological staining and apoptosis meas-urement. Moreover, the characteristics of the T cells, such as proliferation or cytokine release, were quantified and exhibited a specific effect of the CAR transduced T cells compared to the control T cells. In summary, in this thesis a human 3D lung tumor test system was established for the application in preclinical testing of cancer drugs as well as for basic research in tumor biology. It was shown that the test system can provide relevant data on biomarker-driven therapies, the treatment of advanced tumor stages and the improvement of new treatment strategies. KW - Tissue Engineering KW - Lungentumor KW - 3D Tumormodell KW - zielgerichtete Therapien KW - Resistenz KW - EMT KW - CAR T-Zelltherapie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164132 ER - TY - THES A1 - Fey, Christina T1 - Establishment of an intestinal tissue model for pre-clinical screenings T1 - Etablierung eines Darmgewebemodells für Präklinische Screenings N2 - The small intestine represents a strong barrier separating the lumen from blood circulation thereby playing a major role in the absorption and the transport of pharmacological agents prior to their arrival on the respective target site. In order to gain more knowledge about specialized uptake mechanisms and risk assessment for the patient after oral admission of drugs, intestinal in vitro models demonstrating a close similarity to the in vivo situation are needed. In the past, cell line-based in vitro models composed of Caco-2 cells cultured on synthetic cell carriers represented the “gold standard” in the field of intestinal tissue engineering. Expressive advantages of these models are a reproducible, cost-efficient and standardized model set up, but cell function can be negatively influenced by the low porosity or unwanted molecular adhesion effects of the artificial scaffold material. Natural extracellular matrices (ECM) such as the porcine decellularized small intestinal submucosa (SIS) are used as alternative to overcome some common drawbacks; however, the fabrication of these scaffolds is time- and cost-intensive, less well standardized and the 3Rs (replacement, reduction, refinement) principle is not entirely fulfilled. Nowadays, biopolymer-based scaffolds such as the bacterial nanocellulose (BNC) suggest an interesting option of novel intestinal tissue engineered models, as the BNC shows comparable features to the native ECM regarding fiber arrangement and hydrophilic properties. Furthermore, the BNC is of non-animal origin and the manufacturing process is faster as well as well standardized at low costs. In this context, the first part of this thesis analyzed the BNC as alternative scaffold to derive standardized and functional organ models in vitro. Therefore, Caco-2 cells were cultured on two versions of BNC with respect to their surface topography, the unmodified BNC as rather smooth surface and the surface-structured BNC presenting an aligned fiber arrangement. As controls, Caco-2 in vitro models were set up on PET and SIS matrices. In this study, the BNC-based models demonstrated organ-specific properties comprising typical cellular morphologies, a characteristic tight junction protein expression profile, representative ultrastructural features and the formation of a tight epithelial barrier together with a corresponding transport activity. In summary, these results validated the high quality of the BNC-based Caco-2 models under cost-efficient conditions and their suitability for pre-clinical research purposes. However, the full functional diversity of the human intestine cannot be presented by Caco-2 cells due to their tumorigenic background and their exclusive representation of mature enterocytes. Next to the scaffold used for the setup of in vitro models, the cellular unit mainly drives functional performance, which demonstrates the crucial importance of mimicking the cellular diversity of the small intestine in vitro. In this context, intestinal primary organoids are of high interest, as they show a close similarity to the native epithelium regarding their cellular diversity comprising enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, paneth cells, transit amplifying cells and stem cells. In general, such primary organoids grow in a 3D Matrigel® based environment and a medium formulation supplemented with a variety of growth factors to maintain stemness, to inhibit differentiation and to stimulate cell migration supporting long term in vitro culture. Intestinal primary spheroid/organoid cultures were set up as Transwell®-like models on both BNC variants, which resulted in a fragmentary cell layer and thereby unfavorable properties of these scaffold materials under the applied circumstances. As the BNC manufacturing process is highly flexible, surface properties could be adapted in future studies to enable a good cell adherence and barrier formation for primary intestinal cells, too. However, the application of these organoid cultures in pre-clinical research represents an enormous challenge, as the in vitro culture is complex and additionally time- and cost-intensive. With regard to the high potential of primary intestinal spheroids/organoids and the necessity of a simplified but predictive model in pre-clinical research purposes, the second part of this thesis addressed the establishment of a primary-derived immortalized intestinal cell line, which enables a standardized and cost-efficient culture (including in 2D), while maintaining the cellular diversity of the organoid in vitro cultures. In this study, immortalization of murine and human intestinal primary organoids was induced by ectopic expression of a 10- (murine) or 12 component (human) pool of genes regulating stemness and the cell cycle, which was performed in cooperation with the InSCREENeX GmbH in a 2D- and 3D-based transduction strategy. In first line, the established cell lines (cell clones) were investigated for their cell culture prerequisites to grow under simplified and cost-efficient conditions. While murine cell clones grew on uncoated plastic in a medium formulation supplemented with EGF, Noggin, Y-27632 and 10% FCS, the human cell clones demonstrated the necessity of a Col I pre coating together with the need for a medium composition commonly used for primary human spheroid/organoid cultures. Furthermore, the preceding analyses resulted in only one human cell clone and three murine cell clones for ongoing characterization. Studies regarding the proliferative properties and the specific gene as well as protein expression profile of the remaining cell clones have shown, that it is likely that transient amplifying cells (TACs) were immortalized instead of the differentiated cell types localized in primary organoids, as 2D, 3D or Transwell®-based cultures resulted in slightly different gene expression profiles and in a dramatically reduced mRNA transcript level for the analyzed marker genes representative for the differentiated cell types of the native epithelium. Further, 3D cultures demonstrated the formation of spheroid-like structures; however without forming organoid-like structures due to prolonged culture, indicating that these cell populations have lost their ability to differentiate into specific intestinal cell types. The Transwell®-based models set up of each clone exhibit organ-specific properties comprising an epithelial-like morphology, a characteristic protein expression profile with an apical mucus-layer covering the villin-1 positive cell layer, thereby representing goblet cells and enterocytes, together with representative tight junction complexes indicating an integer epithelial barrier. The proof of a functional as well as tight epithelial barrier in TEER measurements and in vivo-like transport activities qualified the established cell clones as alternative cell sources for tissue engineered models representing the small intestine to some extent. Additionally, the easy handling and cell expansion under more cost-efficient conditions compared to primary organoid cultures favors the use of these newly generated cell clones in bioavailability studies. Altogether, this work demonstrated new components, structural and cellular, for the establishment of alternative in vitro models of the small intestinal epithelium, which could be used in pre-clinical screenings for reproducible drug delivery studies. N2 - Der Dünndarm bildet eine starke Barriere aus, welche das Lumen vom Blutkreislauf trennt, und dadurch maßgeblich an der Absorption und dem Transport von pharmakologischen Wirkstoffen beteiligt ist, bevor diese ihren Wirkort erreichen. Um ein detaillierteres Wissen über die speziellen Aufnahmemechanismen zu erlangen und zur Risikoabschätzung für den Patienten nach oraler Aufnahme dieser Medikamente, sind intestinale in vitro Modelle erforderlich, die eine große Ähnlichkeit mit der Situation in vivo aufweisen. In der Vergangenheit stellten Caco-2 Zelllinien-basierte in vitro Modelle, die auf synthetischen Trägerstrukturen aufgebaut sind, den „Goldstandard“ auf dem Gebiet der intestinalen Geweberekonstruktion dar. Bedeutende Vorteile dieser Modelle sind der reproduzierbare, kosteneffiziente und standardisierte Modellaufbau, jedoch können die zellulären Funktionen durch die geringe Porosität oder die unerwünschten molekularen Adhäsionseffekte des künstlichen Trägermaterials negativ beeinflusst werden. Um einige häufige Nachteile zu überwinden werden natürliche extrazelluläre Matrizen (ECM) wie die porzine dezellularisierte Dünndarm-submukosa (SIS) verwendet, jedoch ist die Herstellung dieser Trägerstrukturen zeit- und kostenintensiv, weniger gut standardisiert und entspricht nicht ganzheitlich dem 3R-Prinzip (Replace = Vermeiden, Reduce = Verringern, Refine = Verbessern). Heutzutage ermöglichen biopolymer-basierte Trägerstrukturen wie die bakterielle Nanozellulose (BNC) die Entwicklung von neuartigen intestinalen Gewebemodellen, da die BNC eine große Ähnlichkeit hinsichtlich der Faseranordnung und der hydrophilen Eigenschaften mit der nativen ECM aufweist. Darüber hinaus ist die BNC nicht tierischen Ursprungs und der Herstellungsprozess schneller, gut standardisiert als auch kostengünstig. In diesem Zusammenhang wurde im ersten Teil dieser Arbeit nachgewiesen, dass die BNC als alternative Trägerstruktur für standardisierte und funktionelle Organmodelle in vitro geeignet ist. Dafür wurden Caco-2 Zellen auf zwei Varianten der BNC kultiviert, die sich in ihrer Oberflächentopographie unterscheiden, wobei die nicht-modifizierte BNC eine glatte Oberfläche und die oberflächen-strukturierte BNC eine ausgerichtete Faseranordnung aufweist. Als Kontrollen dienten Caco 2 zellbasierte in vitro Modelle, die auf PET- oder SIS Matrizes aufgebaut wurden. In dieser Studie wiesen die BNC-basierten Modelle die wichtigsten organ-spezifischen Eigenschaften auf, darunter eine typische zelluläre Morphologie, ein charakteristisches Expressionsprofil der Tight Junction Proteine, repräsentative ultrastrukturelle Merkmale und die Bildung einer dichten epithelialen Barriere verbunden mit einer entsprechenden Transportaktivität. Zusammenfassend bestätigten diese Ergebnisse die hohe Qualität der BNC-basierten Caco-2 Modelle unter kosteneffizienten Herstellbedingungen und ihre Eignung für präklinische Forschungszwecke. Allerdings kann die volle Funktionsvielfalt des menschlichen Darms durch Caco-2 Zellen aufgrund ihres kanzerogenen Ursprungs und der exklusiven Repräsentanz von Enterozyten nicht abgebildet werden. Neben der Trägerstruktur die für den Aufbau der in vitro Modelle verwendet wird, trägt auch die zelluläre Einheit zur Etablierung von funktionalen Modellen bei, weshalb es von großer Bedeutung ist, die zelluläre Vielfalt des Dünndarms in diesen Modellen in vitro nachzuahmen. In diesem Zusammenhang sind die primären intestinalen Organoide, die sich hauptsächlich aus Enterozyten, Becherzellen, enteroendokrinen Zellen, Paneth Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen zusammensetzen, von großem Interesse, da die zelluläre Komponente eine große Ähnlichkeit zum nativen Epithel aufweist. Derartige primäre Organoide werden üblicherweise in einer 3D-Matrigel® Umgebung und einer speziellen Formulierung des Mediums, die mit einer Vielzahl an Wachstumsfaktoren ergänzt wird, um das Stammzellpotenzial zu erhalten, die Differenzierung zu hemmen, die Zellmigration zu stimulieren und somit eine langfristige in vitro-Kultivierung zu unterstützt. Intestinale primäre Sphäroid-/Organoidkulturen wurden auf beiden BNC Varianten als Transwell®-ähnliche Modelle aufgebaut. Dabei zeigte sich eine fragmentierte Zellschicht was darauf schließen lässt, dass die Matrix unter diesen Bedingungen für den Modellaufbau ungeeignet ist. Da der BNC-Herstellungsprozess sehr flexibel ist, könnten die Oberflächen-eigenschaften in zukünftigen Studien angepasst werden, um so eine gute Zelladhäsion auch für primäre Darmzellen zu ermöglichen. Die Anwendung dieser Organoid-basierten Kulturen stellt jedoch für die präklinische Forschung eine enorme Herausforderung dar, da die Kultivierung komplex und zudem sehr zeit- und kosten-intensiv ist. Im Hinblick auf das hohe Potenzial der primären intestinalen Sphäroide/Organoide und der Notwendigkeit eines vereinfachten aber prädiktiven Modells für präklinische Forschungs-zwecke, befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Etablierung einer primären immortalisierten intestinalen Zelllinie, die eine standardisierte und kosteneffiziente Kultur ermöglicht, wobei die zelluläre Vielfalt der in vitro Organoid-Kulturen erhalten bleibt. In dieser Studie wurden primäre Organoide aus dem murinen und dem menschlichen Dünndarm durch die ektopische Expression eines 10- (murin) bzw. 12 Komponenten (human) Pools von Genen, welche im Hinblick auf die Regulation der Stammzellen und dem Zellzyklus bekannt sind, in Zusammenarbeit mit der InSCREENeX GmbH in einer 2D- und 3D-basierten Transduktionsstrategie immortalisiert. In erster Linie wurden die etablierten Zelllinien (Zellklone) auf ihren Bedarf an Wachstumsfaktoren für die Kultivierung unter vereinfachten und kosteneffizienten Bedingungen hin untersucht. Während die murinen Zellklone auf unbeschichteten Kunststoff in einer Mediumformulierung mit hEGF, mNoggin, Y-27632 und 10% FCS wuchsen, zeigten die humanen Zellklone eine Notwendigkeit für eine Col I-Vorbeschichtung zusammen mit einer Zusammensetzung des Mediums, wie sie üblicherweise für primäre humane Sphäroide/Organoide verwendet wird. Darüber hinaus führten diese vorangegangenen Analysen dazu, dass nur ein humaner Zellklon und drei murine Zellklone umfänglich charakterisiert wurden. Studien zu proliferativen Eigenschaften und spezifischen Gen- sowie Proteinexpressionsprofilen dieser Klone haben gezeigt, dass vermutlich Vorläuferzellen (TACs) anstelle der differenzierten Zelltypen der primären Organoide immortalisiert wurden, da die Kultivierung in 2D, 3D oder in Transwell®-basierten Modellen zu einem geringfügig veränderten Genexpressionsprofil im Vergleich untereinander und zudem zu einem stark reduzierten mRNA-Transkriptionswert für die analysierten Markergene, welche die differenzierten Zelltypen des nativen Epithels repräsentieren, die Folge war. Weiterhin zeigte die 3D-Kultivierung die Bildung von Sphäroid-ähnlichen Strukturen, jedoch keine Organoid-ähnlichen Strukturen unter verlängerten Kultur-bedingungen, was darauf hinweist, dass diese Zellpopulationen ihre Eigenschaft zur Differenzierung hin zu spezifischen intestinalen Zelltypen eingebüßt haben. Die Transwell®-basierten Modelle, welche für jeden Klon etabliert wurden, weisen zudem Organ-spezifische Eigenschaften auf, wie eine epitheliale Morphologie, ein charakteristisches Protein-expressionsprofil mit einer apikalen Schleimschicht, welche den Villin-1 positiven Zelllayer bedeckt und somit den Nachweis erbringt, dass die entstandenen immortalisierten Zellpopulationen zu einem gewissen Anteil aus Becherzellen und Enterozyten bestehen. Zudem konnten repräsentative Tight-Junction Komplexe, die auf eine dichte epitheliale Barriere hinweisen, in entsprechenden Proteinexpressionsprofilanalysen nachgewiesen werden. Der Nachweis einer sowohl dichten als auch funktionellen epithelialen Barriere konnte weitergehend durch TEER-Messungen und in vivo-ähnliche Transportmechanismen für die etablierten Zellklone qualifiziert werden, wodurch diese Zellen als alternative Zellquelle für in vitro Modelle des Dünndarms verwendet werden können. Darüber hinaus begünstigt die einfache Handhabung und Zellexpansion unter kostengünstigeren Bedingungen im Vergleich zu primären Organoidkulturen den Einsatz dieser neu-generierten Zellklone für Bioverfügbarkeits-Studien. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit neue Komponenten, strukturelle und zelluläre, für die Etablierung alternativer in vitro-Modelle des Dünndarmepithels, die in präklinischen Screenings für reproduzierbare Studien hinsichtlich der Medikamententestung verwendet werden können. KW - Dünndarm KW - In vitro KW - Tissue Engineering KW - intestinal in vitro model KW - bacterial nanocellulose KW - primary-cell-derived immortalized cell line KW - in vitro Modelle KW - Bakterielle Nanocellulose KW - Primär-basierte immortalisierte Zelllinie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244107 ER - TY - THES A1 - Däullary, Thomas T1 - Establishment of an infection model of the human intestinal epithelium to study host and pathogen determinants during the \(Salmonella\) Typhimurium infection process T1 - Etablierung eines Infektionsmodells des menschlichen Darmepithels zur Untersuchung von Wirts- und Erregerdeterminanten während des \(Salmonella\) Typhimurium-Infektionsprozesses N2 - According to the WHO, foodborne derived enteric infections are a global disease burden and often manifest in diseases that can potentially reach life threatening levels, especially in developing countries. These diseases are caused by a variety of enteric pathogens and affect the gastrointestinal tract, from the gastric to the intestinal to the rectal tissue. Although the complex mucosal structure of these organs is usually well prepared to defend the body against harmful agents, specialised pathogens such as Salmonella enterica can overcome the intestinal defence mechanism. After ingestion, Salmonella are capable of colonising the gut and establishing their proliferative niche, thereby leading to inflammatory processes and tissue damage of the host epithelium. In order to understand these processes, the scientific community in the last decades mostly used cell line based in vitro approaches or in vivo animal studies. Although these approaches provide fundamental insights into the interactions between bacteria and host cells, they have limited applicability to human pathology. Therefore, tissue engineered primary based approaches are important for modern infection research. They exhibit the human complexity better than traditional cell lines and can mimic human-obligate processes in contrast to animal studies. Therefore, in this study a tissue engineered human primary model of the small intestinal epithelium was established for the application of enteric infection research with the exemplary pathogen Salmonella Typhimurium. To this purpose, adult stem cell derived intestinal organoids were used as a primary human cell source to generate monolayers on biological or synthetic scaffolds in a Transwell®-like setting. These tissue models of the intestinal epithelium were examined for their comparability to the native tissue in terms of morphology, morphometry and barrier function. Further, the gene expression profiles of organotypical mucins, tight junction-associated proteins and claudins were investigated. Overall, the biological scaffold-based tissue models showed higher similarity to the native tissue - among others in morphometry and polarisation. Therefore, these models were further characterised on cellular and structural level. Ultrastructural analysis demonstrated the establishment of characteristic microvilli and tight-junction connections between individual epithelial cells. Furthermore, the expression pattern of typical intestinal epithelial protein was addressed and showed in vivo-like localisation. Interested in the cell type composition, single cell transcriptomic profiling revealed distinct cell types including proliferative cells and stem cells, progenitors, cellular entities of the absorptive lineage, Enterocytes and Microfold-like cells. Cells of the secretory lineage were also annotated, but without distinct canonical gene expression patterns. With the organotypical polarisation, protein expression, structural features and the heterogeneous cell composition including the rare Microfold-like cells, the biological scaffold-based tissue model of the intestinal epithelium demonstrates key requisites needed for infection studies with Salmonella. In a second part of this study, a suitable infection protocol of the epithelial tissue model with Salmonella Typhimurium was established, followed by the examination of key features of the infection process. Salmonella adhered to the epithelial microvilli and induced typical membrane ruffling during invasion; interestingly the individual steps of invasion could be observed. After invasion, time course analysis showed that Salmonella resided and proliferated intracellularly, while simultaneously migrating from the apical to the basolateral side of the infected cell. Furthermore, the bacterial morphology changed to a filamentous phenotype; especially when the models have been analysed at late time points after infection. The epithelial cells on the other side released the cytokines Interleukin 8 and Tumour Necrosis Factor α upon bacterial infection in a time-dependent manner. Taken together, Salmonella infection of the intestinal epithelial tissue model recapitulates important steps of the infection process as described in the literature, and hence demonstrates a valid in vitro platform for the investigation of the Salmonella infection process in the human context. During the infection process, intracellular Salmonella populations varied in their bacterial number, which could be attributed to increased intracellular proliferation and demonstrated thereby a heterogeneous behaviour of Salmonella in individual cells. Furthermore, by the application of single cell transcriptomic profiling, the upregulation of Olfactomedin-4 (OLFM4) gene expression was detected; OLFM4 is a protein involved in various functions including cell immunity as well as proliferating signalling pathways and is often used as intestinal stem cell marker. This OLFM4 upregulation was time-dependent, restricted to Salmonella infected cells and seemed to increase with bacterial mass. Investigating the OLFM4 regulatory mechanism, nuclear factor κB induced upregulation could be excluded, whereas inhibition of the Notch signalling led to a decrease of OLFM4 gene and protein expression. Furthermore, Notch inhibition resulted in decreased filamentous Salmonella formation. Taken together, by the use of the introduced primary epithelial tissue model, a heterogeneous intracellular bacterial behaviour was observed and a so far overlooked host cell response – the expression of OLFM4 by individual infected cells – could be identified; although Salmonella Typhimurium is one of the best-studied enteric pathogenic bacteria. This proves the applicability of the introduced tissue model in enteric infection research as well as the importance of new approaches in order to decipher host-pathogen interactions with higher relevance to the host. N2 - Nach Angaben der WHO stellen lebensmittelbedingte Darminfektionen eine globale Krankheitslast dar und äußern sich häufig in Krankheiten, die potenziell lebensbedrohliche Ausmaße annehmen können, insbesondere in Entwicklungsländern. Diese Krankheiten werden durch eine Vielzahl von enterischen Erregern verursacht und betreffen den Magen-Darm-Trakt, vom Magen über den Darm bis zum Enddarm. Obwohl die komplexe Schleimhautstruktur dieser Organe in der Regel gut darauf vorbereitet ist, den Körper vor schädlichen Reagenzien zu schützen, können spezialisierte Erreger wie Salmonella enterica den Abwehrmechanismus des Darms überwinden. Nach der Nahrungsaufnahme sind Salmonellen in der Lage, den Darm zu kolonisieren und ihre proliferative Nische zu etablieren, was letztlich zu entzündlichen Prozessen und Gewebeschäden des Wirtsepithels führt. Um diese Prozesse zu verstehen, hat die Wissenschaft in den letzten Jahrzehnten hauptsächlich auf Krebslinien basierende in vitro-Ansätze oder in vivo-Tierstudien verwendet. Obwohl diese Ansätze grundlegende Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Wirtszellen lieferten, sind sie nur begrenzt auf die Pathologie des Menschen übertragbar. Daher sind Tissue engineering und primärzellbasierte Ansätze für die moderne Infektionsforschung wichtig. Sie spiegeln die menschliche Komplexität besser wider als Ansätze mit Krebszellen und können im Gegensatz zu Tierversuchen human-obligate Prozesse nachbilden. Daher wurde in dieser Studie ein tissue engineered humanes Primärmodell des Dünndarmepithels für die Anwendung in der enterischen Infektionsforschung am Beispiel des Erregers Salmonella Typhimurium etabliert. Zu diesem Zweck wurden aus adulten Stammzellen gewonnene Darmorganoide als primäre humane Zellquelle verwendet, um 2D-Monolayer auf biologischen oder synthetischen Trägestrukturen in einer Transwell®-ähnlichen Umgebung zu erzeugen. Die so erzeugten Gewebemodelle des Darmepithels wurden auf ihre Vergleichbarkeit mit dem nativen Gewebe in Bezug auf Morphologie, Morphometrie und Barrierefunktion untersucht. Weiterhin wurde die Genexpression von organtypischen Muzinen, Tight Junction-assoziierten Proteinen und Claudinen sowie das Expressionsmuster der Tight Junction-Proteine untersucht. Insgesamt wiesen die auf biologischen Matrizes basierenden Gewebemodelle eine größere Ähnlichkeit mit dem nativen Gewebe auf - unter anderem in Bezug auf Morphometrie und Polarisation -, weshalb diese Modelle auf zellulärer und struktureller Ebene tiefgehender charakterisiert wurden. Die ultrastrukturelle Analyse zeigte die Ausbildung charakteristischer Mikrovilli und Tight-Junction-Verbindungen zwischen einzelnen Epithelzellen. Darüber hinaus wurden die Expressionsmuster typischer Darmepithelproteine untersucht, die eine in vivo ähnliche Lokalisation aufwiesen. Im Hinblick auf die Zelltypenzusammensetzung ergab die Analyse des Transkriptoms auf Einzel-Zell-Ebene definierte Zelltypen. Dies waren Zellen mit proliferativem Profil, Stammzellen und Vorläuferzellen, und Zellen der absorptiven Linie, Enterozyten und Microfold-Zellen. Zellen der sekretorischen Linie wurden ebenfalls annotiert, jedoch ohne eindeutige kanonische Genexpression. Mit der organotypischen Polarisierung, der Proteinexpression, den strukturellen Merkmalen und der heterogenen Zellzusammensetzung, einschließlich der seltenen Microfold-Zellen, weist das auf einer biologischen Matrix basierende Gewebemodell des Darmepithels die wichtigsten Voraussetzungen für Infektionsstudien mit Salmonellen auf. Im zweiten Teil dieser Studie wurde ein geeignetes Infektionsprotokoll für das Epithelgewebemodell mit Salmonella Typhimurium erstellt, gefolgt von der Untersuchung der wichtigsten Merkmale des Infektionsprozesses. Salmonella hafteten an den epithelialen Mikrovilli und verursachten während der Invasion das typische Membran-Kräuseln; interessanterweise konnten die Schritte der Invasion einzeln beobachtet werden. Nach der Invasion zeigte die Zeitverlaufsanalyse der Infektion, dass die Salmonellen intrazellulär lokalisierten und replizierten, während sie gleichzeitig von der apikalen zur basolateralen Seite der infizierten Zelle migrierten. Darüber hinaus veränderte sich die Morphologie der Bakterien in der Spätphase der Infektion zu einem filamentösen Phänotyp. Die Epithelzellen auf der anderen Seite setzten nach der bakteriellen Infektion zeitabhängig die Zytokine Interleukin 8 und Tumor-Nekrose-Faktor-α frei. Insgesamt rekapituliert die Salmonelleninfektion des intestinalen Epithelgewebemodells wichtige Schritte des Infektionsprozesses, wie sie in der Literatur beschrieben sind und stellt somit eine valide in vitro Plattform für die Untersuchung des Salmonelleninfektionsprozesses in einem menschlichen Kontext dar. Interessanterweise variierten die intrazellulären Salmonellenpopulationen während des Infektionsprozesses in ihrer Bakterienzahl, was auf eine erhöhte intrazelluläre Proliferation zurückgeführt werden konnte und somit ein heterogenes Verhalten der Salmonellen in einzelnen Zellen demonstriert. Darüber hinaus wurde durch die Anwendung von Einzel-Zell-Transkriptom-Analysen die Hochregulierung der Genexpression von Olfactomedin-4 (OLFM4) nachgewiesen; OLFM4 ist ein Protein mit verschiedenen Funktionen, darunter Prozesse der Zellimmunität sowie proliferierende Signalwege, und es wird häufig als Darmstammzellmarker verwendet. Diese OLFM4-Hochregulierung war zeitabhängig, auf mit Salmonella infizierten Zellen beschränkt und schien mit der intrazellulären Bakterienmasse zuzunehmen. Bei der Untersuchung der OLFM4-Regulationsmechanismen konnte eine nuclear factor κB-induzierte Hochregulierung ausgeschlossen werden, während die Hemmung der Notch-Signalübertragung zu einem Rückgang der OLFM4-Gen- und Proteinexpression führte. Darüber hinaus führte die Hemmung von Notch zu einer verminderten Bildung von filamentösen Salmonella. Insgesamt konnte durch die Verwendung des hier eingeführten primären Epithelgewebemodells ein heterogenes intrazelluläres bakterielles Verhalten beobachtet und eine bisher übersehene Wirtszellantwort - die Expression von OLFM4 durch einzelne infizierte Zellen - bei einem der am besten untersuchten enterischen Pathogene identifiziert werden. Dies beweist die Anwendbarkeit des vorgestellten Gewebemodells in der enterischen Infektionsforschung sowie die Bedeutung neuer Ansätze zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen-Interaktionen mit höherer Relevanz für den Wirt. KW - Salmonella typhimurium KW - Tissue Engineering KW - Darmepithel KW - Infektion KW - Infektionsmodell KW - menschliches Darmepithel KW - Infektionsprozess KW - Gewebemodell KW - Wirt-Erreger Interaktion KW - infectionmodel KW - human intestinal epithelium KW - infectionprocess KW - Host-pathogen interaction KW - tissue model Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311548 ER - TY - THES A1 - Malkmus, Christoph T1 - Establishment of a 3D \(in\) \(vitro\) skin culture system for the obligatory human parasite \(Onchocerca\) \(volvulus\) T1 - Etablierung eines 3D-\(in\)-\(vitro\)-Hautkultursystems für den obligat humanen Parasiten \(Onchocerca\) \(volvulus\) N2 - Onchocerciasis, the world's second-leading infectious cause of blindness in humans –prevalent in Sub-Saharan Africa – is caused by Onchocerca volvulus (O. volvulus), an obligatory human parasitic filarial worm. Commonly known as river blindness, onchocerciasis is being targeted for elimination through ivermectin-based mass drug administration programs. However, ivermectin does not kill adult parasites, which can live and reproduce for more than 15 years within the human host. These impediments heighten the need for a deeper understanding of parasite biology and parasite-human host interactions, coupled with research into the development of new tools – macrofilaricidal drugs, diagnostics, and vaccines. Humans are the only definitive host for O. volvulus. Hence, no small-animal models exist for propagating the full life cycle of O. volvulus, so the adult parasites must be obtained surgically from subcutaneous nodules. A two-dimensional (2D) culture system allows that O. volvulus larvae develop from the vector-derived infective stage larvae (L3) in vitro to the early pre-adult L5 stages. As problematic, the in vitro development of O. volvulus to adult worms has so far proved infeasible. We hypothesized that an increased biological complexity of a three-dimensional (3D) culture system will support the development of O. volvulus larvae in vitro. Thus, we aimed to translate crucial factors of the in vivo environment of the developing worms into a culture system based on human skin. The proposed tissue model should contain 1. skinspecific extracellular matrix, 2. skin-specific cells, and 3. enable a direct contact of larvae and tissue components. For the achievement, a novel adipose tissue model was developed and integrated to a multilayered skin tissue comprised of epidermis, dermis and subcutis. Challenges of the direct culture within a 3D tissue model hindered the application of the three-layered skin tissue. However, the indirect coculture of larvae and skin models supported the growth of fourth stage (L4) larvae in vitro. The direct culture of L4 and adipose tissue strongly improved the larvae survival. Furthermore, the results revealed important cues that might represent the initial encapsulation of the developing worm within nodular tissue. These results demonstrate that tissue engineered 3D tissues represent an appropriate in vitro environment for the maintenance and examination of O. volvulus larvae. N2 - Onchozerkose, die weltweit zweithäufigste infektionsbedingte Ursache für Erblindung von Menschen, wird durch Onchocerca volvulus (O. volvulus) verursacht, ein parasitärer Fadenwurm. Die allgemein als Flussblindheit bekannte Onchozerkose wird mit dem Medikament Ivermectin bekämpft, das jedoch nicht die adulten Parasiten tötet, die im Menschen mehr als 15 Jahre lang leben und sich vermehren. Ein tieferes Verständnis der Biologie des Parasiten und dessen Interaktionen im menschlichen Wirt ist für die Erforschung und Entwicklung neuer Instrumente – makrofilarizide Medikamente, Diagnostika und Impfstoffe – erforderlich. Da der Mensch der einzige Endwirt für O. volvulus ist, gibt es keine Tiermodelle für dessen Vermehrung. Zu Forschungszwecken werden adulte Würmer daher chirurgisch aus subkutanen Knoten erkrankter Individuen gewonnen. Ein zweidimensionales (2D) Kultursystem ermöglicht die Entwicklung von aus dem Vektor isolierten infektiösen O. volvulus-Larven (L3) bis zu einem frühen präadulten Stadium. Als problematisch erwies sich bisher die in vitro Entwicklung von O. volvulus bis zum adulten Wurm. Unsere Hypothese ist, dass eine erhöhte biologische Komplexität des Kultursystems die Entwicklung von O. volvulus-Larven in vitro unterstützt. Daher wurden entscheidende Faktoren der in vivo-Umgebung entwickelnder Larven – die menschliche Haut – auf ein dreidimensionales (3D) Kultursystem übertragen. Dieses Kultursystem sollte 1. Haut-spezifische extrazelluläre Matrix enthalten, 2. hautspezifische Zellen und 3. einen direkten Kontakt zwischen Larven und Gewebekomponenten ermöglichen. Dafür wurde ein neuartiges Fettgewebemodell entwickelt, das in ein mehrschichtiges Hautgewebe integriert wurde – bestehend aus Epidermis, Dermis und subkutanem Fettgewebe. Die Anwendung des dreischichtigen Hautgewebes als direktes Kultursystem wurde durch technische Herausforderungen verhindert. Jedoch unterstützte die indirekte Ko-Kultur von Hautmodellen das Wachstum der Larven (L4) in vitro. Die direkte Kultur mit dem Fettgewebemodell verbesserte die Viabilität der Larven signifikant. Darüber hinaus konnten Anzeichen für eine beginnende Verkapselung der Larven durch humane Zellen und Matrix gezeigt werden kann. Die Ergebnisse demonstrieren, dass humane Gewebemodelle eine angemessene in vitro-Umgebung für die Kultur und die Erforschung von O. volvulus darstellen. KW - Tissue Engineering KW - Humanparasitologie KW - In-vitro-Kultur KW - Onchozerkose KW - Multilayered skin tissue model KW - Onchocerca volvulus KW - Skin Tissue Engineering KW - Parasitology Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317171 ER - TY - THES A1 - Nelke, Lena T1 - Establishment and optimization of 3-dimensional mamma carcinoma models for therapy simulation and drug testing T1 - Etablierung und Optimierung 3-dimensionaler Mammakarzinommodelle für die Therapiesimulation und die Wirkstofftestung N2 - Breast cancer is the most common cancer among women worldwide and the second most common cause of cancer death in the developed countries. As the current state of the art in first-line drug screenings is highly ineffective, there is an urgent need for novel test systems that allow for reliable predictions of drug sensitivity. In this study, a tissue engineering approach was used to successfully establish and standardize a 3-dimensional (3D) mamma carcinoma test system that was optimized for the testing of anti-tumour therapies as well as for the investigation of tumour biological issues. This 3D test system is based on the decellularised scaffold of a porcine small intestinal segment and represents the three molecular subsets of oestrogen receptor-positive, HER2/Neu-overexpressing and triple negative breast cancer (TNBC). The characterization of the test system with respect to morphology as well as the expression of markers for epithelial-mesenchymal transition (EMT) and differentiation indicate that the 3D tumour models cultured under static and dynamic conditions reflect tumour relevant features and have a good correlation with in vivo tumour tissue from the corresponding xenograft models. In this respect, the dynamic culture in a flow bioreactor resulted in the generation of tumour models that exhibited best reflection of the morphology of the xenograft material. Furthermore, the proliferation indices of 3D models were significantly reduced compared to 2-dimensional (2D) cell culture and therefore better reflect the in vivo situation. As this more physiological proliferation index prevents an overestimation of the therapeutic effect of cytostatic compounds, this is a crucial advantage of the test system compared to 2D culture. Moreover, it could be shown that the 3D models can recapitulate different tumour stages with respect to tumour cell invasion. The scaffold SISmuc with the preserved basement membrane structure allowed the investigation of invasion over this barrier which tumour cells of epithelial origin have to cross in in vivo conditions during the process of metastasis formation. Additionally, the data obtained from ultrastructural analysis and in situ zymography indicate that the invasion observed is connected to a tumour cell-associated change in the basement membrane in which matrix metalloproteinases (MMPs) are also involved. This features of the model in combination with the mentioned methods of analysis could be used in the future to mechanistically investigate invasive processes and to test anti-metastatic therapy strategies. The validation of the 3D models as a test system with respect to the predictability of therapeutic effects was achieved by the clinically relevant targeted therapy with the monoclonal antibody trastuzumab which induces therapeutic response only in patients with HER2/Neu-overexpressing mamma carcinomas due to its specificity for HER2. While neither in 2D nor in 3D models of all molecular subsets a clear reduction of cell viability or an increase in apoptosis could be observed, a distinct increase in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) was detected only in the HER2/NEU-overexpressing 3D model with the help of an ADCC reporter gene assay that had been adapted for the application in the 3D model in the here presented work. This correlates with the clinical observations and underlines the relevance of ADCC as a mechanism of action (MOA) of trastuzumab. In order to measure the effects of ADCC on the tumour cells in a direct way without the indirect measurement via a reporter gene, the introduction of an immunological component into the models was required. This was achieved by the integration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), thereby allowing the measurement of the induction of tumour cell apoptosis in the HER2/Neu-overexpressing model. Hence, in this study an immunocompetent model could be established that holds the potential for further testing of therapies from the emergent field of cancer immunotherapies. Subsequently, the established test system was used for the investigation of scientific issues from different areas of application. By the comparison of the sensitivity of the 2D and 3D model of TNBC towards the water-insoluble compound curcumin that was applied in a novel nanoformulation or in a DMSO-based formulation, the 3D test system was successfully applied for the evaluation of an innovative formulation strategy for poorly soluble drugs in order to achieve cancer therapy-relevant concentrations. Moreover, due to the lack of targeted therapies for TNBC, the TNBC model was applied for testing novel treatment strategies. On the one hand, therapy with the WEE1 kinase inhibitor MK 1775 was evaluated as a single agent as well as in combination with the chemotherapeutic agent doxorubicin. This therapy approach did not reveal any distinct benefits in the 3D test system in contrast to testing in 2D culture. On the other hand, a novel therapy approach from the field of cellular immunotherapies was successfully applied in the TNBC 3D model. The treatment with T cells that express a chimeric antigen receptor (CAR) against ROR1 revealed in the static as well as in the dynamic model a migration of T cells into the tumour tissue, an enhanced proliferation of T cells as well as an efficient lysis of the tumour cells via apoptosis and therefore a specific anti-cancer effect of CAR-transduced T cells compared to control T cells. These results illustrate that the therapeutic application of CAR T cells is a promising strategy for the treatment of solid tumours like TNBC and that the here presented 3D models are suitable for the evaluation and optimization of cellular immunotherapies. In the last part of this work, the 3D models were expanded by components of the tumour stroma for future applications. By coculture with fibroblasts, the natural structures of the intestinal scaffold comprising crypts and villi were remodelled and the tumour cells formed tumour-like structures together with the fibroblasts. This tissue model displayed a strong correlation with xenograft models with respect to morphology, marker expression as well as the activation of dermal fibroblasts towards a cancer-associated fibroblast (CAF) phenotype. For the integration of adipocytes which are an essential component of the breast stroma, a coculture with human adipose-derived stromal/stem cells (hASCs) which could be successfully differentiated along the adipose lineage in 3D static as well as dynamic models was established. These models are suitable especially for the mechanistic analysis of the reciprocal interaction between tumour cells and adipocytes due to the complex differentiation process. Taken together, in this study a human 3D mamma carcinoma test system for application in the preclinical development and testing of anti-tumour therapies as well as in basic research in the field of tumour biology was successfully established. With the help of this modular test system, relevant data can be obtained concerning the efficacy of therapies in tumours of different molecular subsets and different tumour stages as well as for the optimization of novel therapy strategies like immunotherapies. In the future this can contribute to improve the preclinical screening and thereby to reduce the high attrition rates in pharmaceutical industry as well as the amount of animal experiments. N2 - Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen und die zweithäufigste Todesursache bei Krebserkrankungen in den Industrienationen. Aufgrund der Ineffizienz der derzeit verwendeten Modelle für die Identifizierung neuer Therapeutika herrscht ein hoher Bedarf an neuartigen Testsystemen, welche aussagekräftige Vorhersagen über die Wirksamkeit ermöglichen. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe des Tissue Engineerings erfolgreich ein 3-dimensionales (3D) Mammakarzinom-Testsystem etabliert, standardisiert und für die Testung von anti-tumoralen Therapien sowie weitere tumorbiologische Fragestellungen optimiert. Dieses 3D Testsystem basiert auf der dezellularisierten Gerüststruktur eines porcinen Dünndarmsegments und repräsentiert die drei molekularen Subtypen des Östrogen-Rezeptor-positiven, HER2/Neu-überexprimierenden sowie des tripel-negativen Brustkrebses (TNBC). Die Charakterisierung des Testsystems anhand der Morphologie sowie der Expression von Markern zur Bestimmung der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) und der Differenzierung zeigte, dass die statisch und dynamisch kultivierten 3D Modelle Tumor-relevante Charakteristika widerspiegeln und eine deutliche Ähnlichkeit zu in vivo Tumormaterial aus entsprechenden Xenograft-Modellen aufweisen, wobei die dynamische Kultivierung in einem Flussreaktor zur Generierung von Tumormodellen führte, welche die Morphologie des Tumorgewebes aus Xenograft-Modellen am besten repräsentierten. Des Weiteren war die Proliferationsrate in den 3D Modellen im Vergleich zu 2-dimensionalen (2D) Zellkulturen signifikant reduziert und entspricht daher eher der Situation in vivo. Dies ist ein entscheidender Vorteil des Testsystems gegenüber der 2D Zellkultur, da durch die physiologischere Proliferationsrate eine Überschätzung des Therapieeffekts zytostatischer Medikamente vermieden wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der 3D Modelle unterschiedliche Tumorstadien in Bezug auf die Tumorzellinvasion abgebildet werden können. Die Gerüststruktur SISmuc mit erhaltener Basalmembranstruktur ermöglichte eine Untersuchung der Invasion über diese Barriere, welche Tumorzellen epithelialen Ursprungs unter in vivo-Bedingungen beim Prozess der Metastasierung überwinden müssen. Zudem deuten die durch ultrastrukturelle Analysen und in situ Zymographie gewonnenen Daten darauf hin, dass die beobachtete Invasion mit einer Tumorzell-assoziierten Veränderung der Basalmembran, an der auch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) beteiligt sind, einhergeht. Diese Eigenschaften des Modells in Kombination mit den erwähnten Untersuchungsmethoden könnten in Zukunft dazu eingesetzt werden, Invasionsprozesse mechanistisch zu untersuchen sowie neue anti-metastatisch wirkende Therapiestrategien zu testen. Die Validierung der 3D Modelle als Testsystem bezüglich der Vorhersagbarkeit von Therapieeffekten erfolgte mit Hilfe der klinisch relevanten, zielgerichteten Therapie mit dem monoklonalen Antikörper Trastuzumab, welcher aufgrund seiner Spezifität für HER2/Neu nur in Patienten mit HER2/Neu-überexprimierendem Mammakarzinom einen Therapieerfolg erzielt. Während weder in 2D noch in den 3D Modellen aller molekularer Subtypen eine eindeutige Reduktion der Zellviabilität oder ein Anstieg der Apoptose gemessen werden konnte, zeigte sich mit Hilfe eines ADCC-Reportergenassays, der in dieser Arbeit für die Anwendung im 3D Modell angepasst wurde, ein deutlicher Anstieg der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) lediglich für das HER2/Neu-überexprimierende Modell. Dies entspricht den klinischen Beobachtungen und unterstreicht die Relevanz der ADCC als Wirkmechanismus des Antikörpers. Um die direkten Effekte einer ADCC auf die Tumorzellen im 3D Testsystem direkt – ohne den Umweg über ein Reportergen – messbar zu machen, war die Einführung einer immunologischen Komponente notwendig. Dies gelang mit Hilfe der Integration von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), wodurch die Induktion der Apoptose im HER2/Neu-überexprimierenden Modell messbar war. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit ein immunkompetentes Modell etabliert werden, welche das Potenzial für weitere Testungen aus dem aufstrebenden Bereich der Krebsimmuntherapien bietet. Anschließend wurde das etablierte Testsystem zur Untersuchung von Fragestellungen aus unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt. Durch den Vergleich der Sensitivität von Tumorzellen in 2D und im 3D Modell des TNBC gegenüber des wasserunlöslichen Wirkstoffs Curcumin, welcher in einer neuartigen Nanoformulierung bzw. in einer DMSO-basierten Formulierung appliziert wurde, konnte das 3D Testsystem für die Evaluation einer innovativen Formulierungsstrategie für unlösliche Wirkstoffe angewendet werden, um für die Krebstherapie relevante Dosierungen zu erreichen. Weiterhin wurden aufgrund des Mangels an zielgerichteten Therapien für das tripel-negative Mammakarzinom neuartige Therapiestrategien anhand des 3D Modells getestet. Zum einen wurde die Therapie mit dem WEE1-Kinase Inhibitor MK 1775 als Monotherapie sowie in Kombination mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin evaluiert. Diese zeigte im Gegensatz zu Testungen in 2D Kultur keinen eindeutigen Therapieeffekt im 3D Testsystem. Zum anderen wurde eine neuartige Behandlung aus dem Bereich der zellulären Immuntherapie erfolgreich im TNBC 3D Modell angewendet. Die Behandlung mit T-Zellen, welche einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) gegen ROR1 tragen, zeigte sowohl im statischen als auch im dynamischen Modell eine Migration der T-Zellen in das Tumorgewebe, eine erhöhte Proliferation der T-Zellen sowie eine effiziente Lyse der Tumorzellen mittels Apoptose und damit eine spezifische anti-tumorale Wirkung der CAR-transduzierten T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-T-Zellen. Diese Ergebnisse verdeutlichen einerseits, dass die therapeutische Anwendung von CAR-T-Zellen eine vielversprechende Strategie für die Behandlung von soliden Tumoren wie des TNBC ist, zum anderen, dass die hier vorgestellten 3D Modelle als Testsystem für die Evaluierung und Optimierung von zellulären Immuntherapien geeignet sind. Im letzten Teil der Arbeit wurde das 3D Modell für die zukünftige Anwendung um Komponenten des Tumorstromas erweitert. Durch die Kokultur mit Fibroblasten wurden die natürlichen Strukturen der Darmmatrix, bestehend aus Krypten und Villi, umgebaut und die Krebszellen bildeten zusammen mit den Fibroblasten tumorartige Strukturen aus. Das so erzeugte Gewebemodell zeigte sowohl in morphologischer Hinsicht als auch bezogen auf die Markerexpression und die Aktivierung der dermalen Fibroblasten hin zu Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) starke Ähnlichkeit mit Xenograft-Modellen. Für die Integration von Adipozyten, welche ein wichtiger Bestandteil des Stromas in der Brust sind, wurde eine Kokultur mit humanen, aus dem Fettgewebe stammenden Stroma-/Stammzellen (hASCs) etabliert, welche sowohl im statischen als auch im dynamischen 3D Modell erfolgreich adipogen differenziert werden konnten. Diese Modelle eignen sich aufgrund des komplexen Differenzierungsprozesses vor allem für die mechanistische Untersuchung der Interaktionen zwischen Tumorzellen und Adipozyten. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, ein humanes 3D Mammakarzinom-Testsystem zur Anwendung in der präklinischen Entwicklung und Testung anti-tumoraler Therapien sowie der Grundlagenforschung im Bereich der Tumorbiologie zu etablieren. Mit Hilfe dieses modularen Testsystems können relevante Daten zur Wirksamkeit von Therapien in Tumoren unterschiedlicher molekularer Subtypen sowie unterschiedlich fortgeschrittener Tumorstadien und zur Optimierung neuartiger Therapiestrategien wie Immuntherapien gewonnen werden. Dies kann in Zukunft dazu beitragen das präklinische Screening zu verbessern und somit die hohen klinischen Ausfallraten in der pharmazeutischen Industrie und die Zahl von Tierversuchen zu reduzieren. KW - Brustkrebs KW - Mamma carcinoma KW - Tissue Engineering KW - Drug testing KW - 3D model KW - therapy simulation KW - Mammakarzinom KW - Wirkstofftestung KW - 3D Modell KW - Therapiesimulation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172280 ER - TY - THES A1 - Schürlein, Sebastian T1 - Entwicklung von Technologien zur Optimierung von Tissue Engineering Prozessen am Beispiel der Herstellung von kardialem Gewebe T1 - Development of technologies to optimize tissue engineering processes, documented on the example of the generation of cardiac tissue N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern. Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen. Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden. N2 - Cardiovascular diseases as myocardial infarction are the most frequent cause of death worldwide. During a myocardial infarction, areas of the heart are being damaged because of an insufficient nutrient supply. Heart tissue is a terminal differentiated tissue, this means that it can’t be regenerated by itself. The consequence of this characteristic is a heart insufficiency or the death of the patient. An alternative treatment to heart transplantation is promised by tissue engineering. By using the methods of tissue engineering, cells can be cultured on a scaffold to generate a mature tissue, which can be used to replace the damaged areas of the heart. In the present work systems for the generation of tissues have been developed and first experiments to build up a functional cardiac patch were performed. To generate three-dimensional tissues, scaffolds colonized with cells are necessary. These scaffolds can be produced with biological or synthetic polymers or even decellularized tissues can be used. A computer controlled decellularization platform was designed to ensure a standardized, reproducible decellularization of complex organs like hearts. Furthermore, an electrospinning device was developed for the production of nanofiber scaffolds. On such matrices, seeded cells grow along the fibers. Most cell-matrix-constructs are cultured under dynamic conditions in tissue engineering. A stand alone incubator system containing the required periphery to apply different culture conditions was developed. As further development a compact modular bioreactor platform consisting of a heat exchanger, a bag pump and a gas exchanger was established. All kinds of bioreactors can be enclosed to the system via standard Luer Lock Connectors. Due to the compactness of the system, it is possible to parallelize and run experiments easily on narrow space. The functionality of the platform was demonstrated by a tissue culture of a native porcine carotid artery. The small intestinal submucosa without serosa (SISser) was employed as matrix for the development of a functional cardiac patch. In different experiments diverse cell types were used to generate a cardiac construct. Cardiosphere derived cells (CDC) seeded on the SISser showed an equal distribution all over the surface of the matrix, but no expression of specific cardiac markers. Constructs consisting of a mono culture of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (CM iPS cells) or a co culture of CM iPS cells, mesenchymal stem cells and cells isolated form a heart biopsy showed a contraction of the whole matrix after a few days in culture. Furthermore, cardiac markers like cardiac troponin T, cardiac troponin C and alpha actinin could be observed by immunohistological staining. Regarding the morphology of the different tissues, the mono culture of the CM iPS cells formed agglomerates on the surface of the matrix whereas the co culture showed a well distribution of the cells all over the surface of the matrix. Consequently, the co culture on the SISser is the most promising approach for the development of a functional cardiac patch. However, the combination of cell types within the co culture and their ratio has to be optimized. KW - Tissue Engineering KW - Herzmuskel KW - Bioreaktorplattform KW - Elektrospinning KW - kardiales Tissue Engineering KW - kardiales Gewebe KW - bioreactor plattform KW - electrospinning KW - cardiac tissue engineering KW - Biomaterial KW - Gewebekultur Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142432 ER - TY - THES A1 - Lotz, Christian T1 - Entwicklung eines Augenirritationstests zur Identifikation aller GHS-Kategorien für den Endpunkt Augenreizung T1 - Development of an eye irritation test to identify all GHS categories of eye irritation N2 - Die Risikobewertung von Chemikalien ist für die öffentliche Gesundheit von entschei-dender Bedeutung, weshalb strenge Testverfahren zu deren toxikologischer Begutach-tung angewandt werden. Die ursprünglich tierbasierten Testverfahren werden aufgrund von neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen und wegen ökonomischer Ineffizienz sowie ethischer Fragwürdigkeit immer mehr durch alternative Methoden ohne Tiermodelle ersetzt. Für den toxikologischen Endpunkt der Augenreizung wurden bereits die ersten alternativen Testsysteme auf der Basis von ex vivo- oder in vitro-Modellen entwickelt. Jedoch ist bis dato kein alternatives Testsystem in der Lage, das gesamte Spektrum der verschiedenen Kategorien der Augenreizungen nach dem global harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) vorherzusagen und damit den tierbasierten Draize-Augenreizungstest vollends zu ersetzen. Gründe hierfür sind fehlende physiologische Merkmale im Modell sowie eine destruktive Analysemethode. Aufgrund dessen wurden in dieser Studie die Hypothesen getestet, ob ein verbessertes In-vitro-Modell oder eine zerstörungsfreie, hochsensitive Analysemethode die Vorher-sagekraft des Augenreizungstests verbessern können. Dafür wurden zunächst neue Mo-delle aus humanen Hornhaut- und Hautepithelzellen entwickelt. Die Modelle aus pri-mären cornealen Zellen zeigten eine gewebespezifische Expression der Marker Zytokera-tin 3 und 12 sowie Loricrin. In beiden Modellen konnte durch die Verkürzung der Kul-turdauer die Ausbildung einer Hornschicht verhindert werden. Die Modelle wiesen dadurch eine sensiblere Barriere vergleichbar der nativen Cornea auf. Darüber hinaus konnte durch die chemische Quervernetzung mit Polyethylenglykolsuccinimidylglutara-tester ein transparentes, nicht kontrahierendes Stroma-Äquivalent etabliert werden. Der Stroma-Ersatz konnte zur Generierung von Hemi- und Voll-Cornea-Äquivalenten einge-setzt werden und lieferte somit erste Ansatzpunkte für die Rekonstruktion der nativen Hornhaut. Parallel dazu konnte ein zerstörungsfreies Analyseverfahren basierend auf der Impe-danzspektroskopie entwickelt werden, das wiederholte Messungen der Gewebeintegri-tät zulässt. Zur verbesserten Messung der Barriere in dreidimensionalen Modelle wurde hierfür ein neuer Parameter, der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) bei der Frequenz von 1000 Hz, der TEER1000 Hz definiert, der eine genauere Aussage über die Integrität der Modelle zulässt. Durch die Kombination der entwickelten cornealen Epithelzellmodelle mit der TEER1000 Hz-Messung konnte die Prädikitivität des Augenrei-zungstests auf 78 - 100 % erhöht werden. Von besonderer Bedeutung ist dabei, dass die nicht destruktive Messung des TEER1000 Hz zum ersten Mal erlaubte, die Persistenz von Irritationen durch wiederholte Messungen in einem in vitro-Modell zu erkennen und somit die GHS-Kategorie 1 von GHS-Kategorie 2 zu unterscheiden. Der wissenschaftli-che Gewinn dieser Forschungsarbeit ist ein neues Testverfahren, das alle GHS-Kategorien in einem einzigen in vitro-Test nachweisen und den Draize-Augenreizungstest gänzlich ersetzen kann. N2 - The assessment of the risk of chemicals is of crucial importance for public health. Hence, strict test procedures have been developed for toxicological evaluation of consumer products. The original animal-based test methods are being replaced by alternative methods due to new scientific findings, economic inefficiency and ethical doubts. For the toxicological endpoint of eye irritation, the first alternative test systems based on ex vivo or in vitro models have been developed. However, to date no alternative test meth-od has been able to predict the entire spectrum of eye irritation categories specified in the globally harmonized system for the classification and labelling of chemicals (GHS). Thus, no stand-alone test methods can replace the animal-based Draize eye irritation test resulting in the need of complex integrated testing strategies. Reasons for this are the lack of key physiological characteristics of the implemented models, species specific differences and the employed destructive analysis method. Therefore, this study tested whether a refinement of the used models or a more sensitive analytical method could improve the predictive power of the eye irritation test. First, new models of human corneal and skin epithelial cells were developed. Since a key fea-ture of the human cornea is a lack of cornification, several parameters such as calcium and retinoic acid to reduce the cornification were investigated. In both models the for-mation of a stratum corneum could be prevented most effectively by shortening the cul-ture time. Hence, the models had a more sensitive barrier comparable to the native cor-nea. However, only the model based on primary cornea cells showed a cornea-specific expression of the markers cytokeratin 3 and 12 as well as loricrin. Models based on skin keratinocytes retained a skin-specific phenotype. In addition, a stromal matrix was de-veloped to allow for the generation of a full-thickness cornea model. For this a cell-seeded collagen hydrogel was chemically cross-linkined via a polyethylene glycol suc-cinimidyl glutarate generating a transparent, non-contracting stroma equivalent. In parallel, a non-destructive highly sensitive analysis method based on impedance spec-troscopy was developed that allows repeated measurements of the tissue integrity. To improve the measurement of the barrier in three-dimensional models, a new parameter, the transepithelial electrical resistance (TEER) at the frequency of 1000 Hz, the TEER1000 Hz was defined. By combining the developed corneal epithelial cell models with the TEER1000 Hz measurement, the predictivity of the eye irritation test could be increased to 78 - 100 %. Moreover, the TEER1000 Hz allowed for the first time to detect the persistence of irritative effects by repeated measurements in an in vitro model and thus to distinguish between all GHS categories. The scientific yield of this research work is therefore a new test method that can detect all GHS categories in a single in vitro test and holds the possibility to completely replace the Draize eye irritation test. KW - Tissue Engineering KW - Eye irritation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170126 ER - TY - THES A1 - Weigel [geb. Schneider], Verena T1 - Entwicklung eines \(in\) \(vitro\) Modells für Verbrennungen ersten Grades zur Testung einer zellbasierten Wundauflage T1 - Development of an \(in\) \(vitro\) model for first degree burn wounds to test a cell based wound dressing N2 - Mit jährlich circa 11 Millionen Fällen weltweit, stellen schwere Brandwunden bis heute einen großen Anteil an Verletzungen dar, die in Kliniken behandelt werden müssen. Während leichte Verbrennungen meist problemlos heilen, bedarf die Behandlung tieferer Verbrennungen medizinischer Intervention. Zellbasierte Therapeutika zeigen hier bereits große Erfolge, aufgrund der eingeschränkten Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen ist jedoch sowohl die Testung neuer Produkte, als auch die Erforschung der Wundheilung bei Brandwunden noch immer schwierig. Aufgrund dessen wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt: Die Etablierung von Methoden, um ein zellbasiertes Therapeutikum produzieren zu können und die Entwicklung eines Modells zur Untersuchung von Verbrennungswunden. Zunächst wurden hierfür die Kulturbedingungen und -protokolle zur Isolation und Expansion von Keratinozyten so angepasst, dass sie gängigen Regularien zur Produktion medizinischer Produkte entsprechen. Hier zeigten die Zellen auch in anschließenden Analysen, dass charakteristische Merkmale nicht verloren hatten. Darüber hinaus gelang es, die Zellen mithilfe verschiedener protektiver Substanzen erfolgreich einzufrieren und zu konservieren. Des Weiteren konnte ein Modell etabliert werden, das eine Verbrennung ersten Grades widerspiegelt. Über einen Zeitraum von zwei Wochen wurde seine Regeneration hinsichtlich verschiedener Aspekte, wie der Histomorphologie, dem Metabolismus und der Reepithelialisierungsrate, untersucht. Die Modelle zeigten hier viele Parallelen zur Wundheilung in vivo auf. Um die Eignung der Modelle zur Testung von Wirkstoffen zu ermitteln wurde außerdem eine Behandlung mit 5% Dexpanthenol getestet. Sie resultierte in einer verbesserten Histomorphologie und einer erhöhten Anzahl an proliferativen Zellen in den Modellen, beschleunigte jedoch die Reepithelialisierung nicht. Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit zunächst Methoden etabliert werden, um ein medizinisches Produkt aus Keratinozyten herzustellen und zu charakterisieren. Außerdem wurde ein Modell entwickelt, anhand dessen die Wundheilung und Behandlung von Verbrennungen ersten Grades untersucht werden kann und welches als Basis zur Entwicklung von Modellen von tieferen Verbrennungen dienen kann. N2 - With approximately 11 million cases annually worldwide, severe burns still represent a large proportion of injuries requiring hospital treatment. While minor burns usually heal without problems, the treatment of deeper burns requires medical intervention. Cell-based therapeutics have already shown great success in this area, but due to the limited transferability of results from animal models, both the testing of new products and research into wound healing in burn wounds is still difficult. Due to this, two objectives were pursued in this work: The establishment of methods to enable the production of a cell-based therapeutic and the development of a model to study burn wounds. First, the culture conditions and protocols for the isolation and expansion of keratinocytes were adapted to meet common regulations for the production of medical products. The cells showed in subsequent analyses that characteristic features had not been lost. In addition, the cells were successfully frozen and preserved with the use of different protective substances. Furthermore, it was possible to establish a model that reflects a first-degree burn wound. Over a period of two weeks, the regeneration of the models was investigated with regard to various aspects, such as histomorphology, metabolism and the rate of reepithelialization. Here, the models showed many parallels to wound healing in vivo. In addition, to determine the suitability of the models for testing active ingredients, a treatment with 5% dexpanthenol was tested. It resulted in an improved histomorphology and increased numbers of proliferative cells in the models, but did not accelerate overall reepithelialization. In summary, this work initially established methods to produce and characterize a medical product from keratinocytes. In addition, an in vitro model was developed that can be used to study wound healing and treatment of first-degree burns and can serve as a basis for developing models of deeper burns. KW - Tissue Engineering KW - In-vitro-Kultur KW - Wundheilung KW - Hautverbrennung KW - Kryokonservierung KW - skin equivalent KW - in vitro model KW - burn wound KW - wound healing KW - cryokonservation Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261514 ER - TY - THES A1 - Schmidt [geb. Schmid], Freia Florina T1 - Ein dreidimensionales kutanes Melanommodell für den Einsatz in der präklinischen Testung T1 - A three-dimensional cutaneous melanoma model for use in preclinical testing N2 - Das maligne Melanom nimmt als Tumorerkrankung mit hoher Metastasierungsrate und steigenden Inzidenzraten bei höchster Mortalität aller Hauttumoren eine zunehmende Bedeutung in der modernen Onkologie ein. Frühzeitige Diagnosemöglichkeiten und moderne Behandlungen konnten das Überleben der Patienten bereits erheblich verbessern. Jedoch besteht nach wie vor Bedarf an geeigneten Modellen, um die Melanomprogression vollständig zu verstehen und neue wirksame Therapien zu entwickeln. Hierfür werden häufig Tiermodelle verwendet, diese spiegeln jedoch nicht die menschliche Mikroumgebung wider. Zweidimensionalen Zellkulturen fehlen dagegen entscheidende Elemente der Tumormikroumgebung. Daher wurde in dieser Arbeit ein dreidimensionales epidermales Tumormodell des malignen Melanoms, welches aus primären humanen Keratinozyten und verschiedenen Melanomzelllinien besteht, entwickelt. Die eingesetzten Melanomzelllinien variieren in ihren Treibermutationen, wodurch das Modell in der Lage ist, Wirkstoffe zu untersuchen, die spezifisch auf diese Mutationen wirken. Mit Techniken des Tissue Engineerings konnte ein dreidimensionales Hautmodell aufgebaut werden, das alle charakteristischen Schichten der Epidermis aufweist und im Bereich des stratum basale Melanomcluster ausbildet. Diese reichen je nach Größe und Ausdehnung bis in suprabasale Epidermisschichten hinein. Die Tumor-Histopathologie, der Tumorstoffwechsel sowie tumorassoziierte Proteinsekretionen ließen sich im in vitro Modell nachweisen. Darüber hinaus konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem einzelne Zellen aus den Modellen reisoliert werden können. Dies ermöglichte es, den Proliferationszustand innerhalb des jeweiligen Modells zu charakterisieren und die Wirkung von Antitumortherapien gezielt zu bewerten. Die Anwendbarkeit als Testsystem im Bereich der Tumortherapeutika wurde mit dem in der Klinik häufig verwendeten v-raf-Maus-Sarkom-Virus-Onkogen-Homolog B (BRAF)-Inhibitor Vemurafenib demonstriert. Der selektive BRAF-Inhibitor reduzierte erfolgreich das Tumorwachstum in den Modellen mit BRAF-mutierten Melanomzellen, was durch eine Verringerung der metabolischen Aktivität, der proliferierenden Zellen und des Glukoseverbrauchs gezeigt wurde. Für die Implementierung des Modells in die präklinische Therapieentwicklung wurde B-B-Dimethylacrylshikonin, ein vielversprechender Wirkstoffkandidat, welcher einen Zellzyklusarrest mit anschließender Apoptose bewirkt, im Modell getestet. Bei einer Anwendung der Modelle im Bereich der Testung topischer Behandlungen ist eine Barrierefunktion der Modelle notwendig, die der in vivo Situation nahe kommt. Die Barriereeigenschaften der Hautäquivalente wurden durch die Melanomzellen nachweislich nicht beeinflusst, sind aber im Vergleich zur in vivo Situation noch unzureichend. Eine signifikante Steigerung der Hautbarriere konnte durch die Bereitstellung von Lipiden und die Anregung hauteigener Regenerationsprozesse erreicht werden. Über den Nachweis des transepidermalen Wasserverlusts konnte eine Messmethode zur nicht-invasiven Bestimmung der Hautbarriere etabliert und über den Vergleich zur Impedanzspektroskopie validiert werden. Hierbei gelang es, erstmals die Korrelation der Hautmodelle zur in vivo Situation über ein solches Verfahren zu zeigen. Das entwickelte epidermale Modell konnte durch die Integration eines dermalen Anteils und einer Endothelzellschicht noch weiter an die komplexe Struktur und Physiologie der Haut angepasst werden um Untersuchungen, die mit der Metastierung und Invasion zusammenhängen, zu ermöglichen. Die artifizielle Dermis basiert auf einem Kollagen-Hydrogel mit primären Fibroblasten. Eine dezellularisierte Schweinedarmmatrix ließ sich zur Erweiterung des Modells um eine Endothelzellschicht nutzen. Dabei wanderten die primären Fibroblasten apikal in die natürliche Schweindarmmatrix ein, während die Endothelzellen basolateral eine geschlossene Schicht bildeten. Die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle sind in der Lage, die Vorhersagekraft der in vitro Modelle und die in vitro - in vivo Korrelation zu verbessern. Durch die Kombination des Melanommodells mit einer darauf abgestimmten Analytik wurde ein neuartiges Werkzeug für die präklinische Forschung zur Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen geschaffen. N2 - Malignant melanoma, as a tumor disease with a high metastasis rate and rising incidence rates with the highest mortality of all skin tumors, is assuming increasing importance in modern oncology. Early diagnosis and modern treatments significantly improved patient survival. There is still an unmet need for appropriate models to fully understand melanoma progression and to develop new effective therapies. Animal models are widely used but do not reflect the human microenvironment, while two-dimensional cell cultures lack crucial elements of this tumor microenvironment. Therefore, a three-dimensional epidermal tumor model of malignant melanoma consisting of primary human keratinocytes and various melanoma cell lines was developed in this work. The melanoma cell lines vary in their driver mutations, enabling the model to investigate compounds specifically designed to target one mutation. Tissue engineering techniques were used to generate a three-dimensional skin model that shows all characteristic layers of the epidermis and forms melanoma clusters in the stratum basale. Depending on size and extension, these extend into suprabasal epidermal layers. Tumor histopathology, tumor metabolism, and tumor-associated protein secretions could be demonstrated in the in vitro model. In addition, a protocol could be developed to reisolate single cells from the models. This made it possible to characterize the proliferation state within the respective model and to specifically evaluate the effect of antitumor therapies. Applicability as a test system in the field of tumor therapeutics was demonstrated with the v-raf mouse sarcoma virus oncogene homolog B (BRAF) inhibitor commonly used in the clinic. This selective BRAF inhibitor successfully reduced tumor growth in models with BRAF-mutated melanoma cells, indicated by a reduction in metabolic activity, proliferating cells, and glucose consumption. For the implementation of the model in preclinical development, B-B-dimethylacrylshikonin, a promising drug candidate, which induces cell cycle arrest followed by apoptosis, was tested in the model. An application of the models in the field of testing topical treatments requires a barrier function of the models close to the in vivo situation. The barrier properties of the skin equivalents were demonstrably not influenced by the melanoma cells, but are still insufficient compared to the in vivo situation. A significant increase in the skin barrier could be achieved by providing lipids and stimulating the skin's own regeneration processes. A measurement method for the non-invasive determination of the skin barrier was established by detection of transepidermal water loss and validated by comparison with impedance spectroscopy. For the first time, the correlation of the skin models to the in vivo situation was demonstrated by such a method. The developed epidermal model could be further adapted to the complex structure and physiology of the skin by integrating a dermal portion and an endothelial cell layer to allow studies related to metastasis and invasion. The artificial dermis is based on a collagen hydrogel with primary fibroblasts. A decellularized porcine intestinal matrix could be used to extend the model with an endothelial cell layer. Here, the primary fibroblasts migrated apically into the natural porcine intestinal matrix, while the endothelial cells formed a closed layer basolaterally. The tissue models developed in this work are able to improve the predictive power of the in vitro models and the in vitro - in vivo correlation. By combining the melanoma model with matched analytics, a novel tool for preclinical research for testing of pharmaceutical agents was established. KW - Tissue Engineering KW - Melanom KW - Hautmodell KW - Alternative zum Tierversuch Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329255 ER -