TY - THES A1 - Tiwarekar, Vishakha Rakesh T1 - The APOBEC3G-regulated host factors REDD1 and KDELR2 restrict measles virus replication T1 - Die durch APOBEC3G-regulierten Wirtsfaktoren REDD1 und KDELR2 restringieren die Masernvirus Replikation N2 - Measles is an extremely contagious vaccine-preventable disease responsible for more than 90000 deaths worldwide annually. The number of deaths has declined from 8 million in the pre-vaccination era to few thousands every year due to the highly efficacious vaccine. However, this effective vaccine is still unreachable in many developing countries due to lack of infrastructure, while in developed countries too many people refuse vaccination. Specific antiviral compounds are not yet available. In the current situation, only an extensive vaccination approach along with effective antivirals could help to have a measles-free future. To develop an effective antiviral, detailed knowledge of viral-host interaction is required. This study was undertaken to understand the interaction between MV and the innate host restriction factor APOBEC3G (A3G), which is well-known for its activity against human immunodeficiency virus (HIV). Restriction of MV replication was not attributed to the cytidine deaminase function of A3G, instead, we identified a novel role of A3G in regulating cellular gene functions. Among two of the A3G regulated host factors, we found that REDD1 reduced MV replication, whereas, KDELR2 hampered MV haemagglutinin (H) surface transport thereby affecting viral release. REDD1, a negative regulator of mTORC1 signalling impaired MV replication by inhibiting mTORC1. A3G regulated REDD1 expression was demonstrated to inversely correlate with MV replication. siRNA mediated silencing of A3G in primary human blood lymphocytes (PBL) reduced REDD1 levels and simultaneously increased MV titres. Also, direct depletion of REDD1 improved MV replication in PBL, indicating its role in A3G mediated restriction of MV. Based on these finding, a new role of rapamycin, a pharmacological inhibitor of mTORC1, was uncovered in successfully diminishing MV replication in Vero as well as in human PBL. The ER and Golgi resident receptor KDELR2 indirectly affected MV by competing with MV-H for cellular chaperones. Due to the sequestering of chaperones by KDELR2, they can no longer assist in MV-H folding and subsequent surface expression. Taken together, the two A3G-regulated host factors REDD1 and KDELR2 are mainly responsible for mediating its antiviral activity against MV. N2 - Masern ist eine extrem ansteckende, durch Impfung verhinderbare Infektionskrankheit, die für mehr als 90000 Todesfälle jährlich weltweit verantwortlich ist. Die Zahl der Todesfälle nahm von ca. 8 Millionen in der Prä- Impf-Ära auf wenige Tausend pro Jahr aufgrund dieses effizienten Impfstoffs ab. Dieser ist jedoch aufgrund mangelnder Infrastruktur in vielen Entwicklungsländern nicht ausreichend verfügbar, oder die Impfung wird – vor allem in entwickelten Ländern – verweigert. Spezifische antivirale Substanzen sind noch nicht verfügbar. So könnte nur eine extensive Impfkampagne zu einer Masern-freien Zukunft führen. Um antivirale Substanzen zu generieren wird detailiertes Wissen über Virus-Wirt-Interaktionen benötigt. Diese Studie wurde unternommen um Interaktionen zwischen Masernviren (MV) und dem zellulären Restriktionsfaktor APOBEC3G (A3G), der allgemein bekannt für seine antivirale Wirkung gegen das humane Immundefizienzvirus (HIV) ist, zu charakterisieren. A3G hemmt die MV-Replikation nicht aufgrund seiner Cytidin-Desaminase-Funktion, sondern wir entdeckten eine neue Funktion des A3G, nämlich dass es die Expression zellulärer Faktoren reguliert. Wir fanden, dass unter den A3G-regulierten Wirtszellfaktoren REDD1 die MV-Replikation reduzierte, während KDELR2 den Transport des MV-Hämagglutinins (H) zur Zelloberfläche, und somit die Virusfreisetzung, inhibierte. REDD1, ein negativer Regulator des mTORC1-Signalübertragungswegs, reduzierte die MV-Replikation indem es mTORC1 inhibiert. Die Expression des durch A3G regulierten REDD1 korrelierte umgekehrt mit der MV Replikation. SiRNA-vermittelte Reduktion des A3G in primären humanen Lymphozyten des Bluts (PBL) führte zu einer Abnahme des REDD1 und gleichzeitig zu einer Zunahme des MV-Titers. Ebenso führte direktes Silencing des REDD1 zu einer verstärkten MV-Replikation in PBL, was seine Rolle bei der A3G-vermittelten Restriktion der MV-Replikation unterstreicht. Aufgrund dieser Befunde wurde auch eine neue Funktion des mTORC1-Inhibitors Rapamycin als Inhibitor der MV-Replikation in Vero-Zellen und primären PBL aufgedeckt. Der ER- und Golgi-residente Rezeptor KDELR2 wirkte sich indirekt auf die MV-Replikation aus, indem er mit dem MV-H um die Interaktion mit Chaperonen kompetiert. KDELR2 bindet Chaperone und verhindert so deren Interaktion mit MV-H und den Transport zur Zelloberfläche. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beiden A3G-regulierten Wirtszellfaktoren REDD1 und KDELR2 hauptsächlich für die antivirale Aktivität des A3G gegen MV verantwortlich sind. KW - measles virus KW - restriction factors KW - APOBEC3G KW - REDD1 KW - KDELR2 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179526 ER - TY - THES A1 - Nowotny, Boris T1 - Etablierung von zellulären Testsystemen für die Identifizierung von neuartigen Inhibitoren des HIV-1 Vif-induzierten APOBEC3G-Abbaus T1 - Establishment of cellular test systems for the identification of novel inhibitors of the HIV-1 Vif-induced APOBEC3G- degradation N2 - Als einer der ersten gegen HIV gerichteten Restriktionsfaktoren konnte die Cytidindeaminase APOBEC3G isoliert werden. Dieses zelluläre Enzym hemmt äußerst effizient die Replikation von HIV. Weiterführende Untersuchungen konnten demonstrieren, dass die Hemmung der Virusreplikation hauptsächlich auf einer Deaminase-katalysierten G zu A-Hypermutation des viralen Genoms während der Reversen Transkription beruht. Als Gegenstrategie zur antiretroviralen Wirkung von A3G kodiert HIV-1 das Protein Vif (virion infectivity factor), welches durch eine direkte Wechselwirkung den Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau von A3G bewirkt. Vor diesem Hintergrund wird der Inhibition des Vif induzierten A3G- Abbaus großes Potential als neuartiges Wirkstoffziel bei der Behandlung von HIV Infektionen vorhergesagt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand deshalb in der Etablierung von zellulären Screening-Assays für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt vier fluoreszenzbasierte zelluläre Assays erfolgreich entwickelt und als Screeningsysteme für die Wirkstoffsuche etabliert werden. Drei dieser Assays basieren auf stabilen Zelllinien, von denen eine Vif und ein mit EYFP markiertes A3G ko-exprimiert. Dieser sogenannte A3G-Abbauassay stellt den primären Assay für die Identifizierung von Inhibitoren des Vif induzierten A3G-Abbaus dar und wird durch zwei weitere Zelllinien-basierte Assays ergänzt. Diese sekundäre Assays erlauben die Detektion von Substanzen, die falsch-positive oder falsch-negative Signale im A3G-Abbauassays generieren. Zusammengenommen ermöglichen die drei Assays die präzise Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch auf den A3G-Abbau wirken und stellen damit eine wesentliche Verbesserung bereits existierender Screeningsysteme dar. Weiterhin wurde ein auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) basierendes Testsystem entwickelt. Besagtes System misst die direkte Interaktion zwischen Vif und ElonginC in lebenden Zellen und repräsentiert damit ein weiteres Testsystem für die Identifizierung von Inhibitoren der Vif induzierten A3G-Degradation. Den zweiten Teil dieser Arbeit umfasste die Analyse von Derivaten des Vif Antagonisten RN-18 und neu entwickelten niedermolekularen Inhibitoren der Vif-ElonginC- Interaktion. Als ein wichtiges Ergebnis der Derivat-Analyse ergab sich, dass RN-18 zytotoxisch wirkt und im hier etablierten A3G-Abbauassay ein falsch-positives Signal generiert. Unter den analysierten Vif-ElonginC-Interaktionsinhibitoren fand sich eine Verbindung, die in einem initialen Screening, unter Verwendung des A3G-Abbauassays, eine deutliche Inhibition der Vif induzierten A3G-Degradation bewirkte. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Promotionsprojektes erfolgreich mehrere Screeningsysteme für die Identifizierung von spezifischen Inhibitoren des A3G-Abbaus etabliert werden. Diese Systeme werden zukünftig dazu beitragen, dass Auffinden von neuartigen Therapeutika für die Behandlung von HIV-Infektionen zu beschleunigen. N2 - One of the first cellular HIV restriction factors isolated was the cytosine deaminase APOBEC3G. This cellular enzyme was shown to efficiently inhibit the replication of HIV and other viruses. Further research revealed that restriction of the viral replication is primarily based on a deaminase-catalyzed G to A hypermutation of the viral genome during reverse transcription. As a mode of counteraction, the HIV-1 encoded accessory protein Vif (virion infectivity factor) binds to A3G leading to its ubiquitin-dependent proteasomal degradation. It has been hypothesized that inhibition of the A3G degradation rescues the antiviral properties of the APOBEC3 protein and thus represents an attractive target for novel antiretroviral drugs. Therefore, the goal of this study was to establish cellular screening assays for the identification of inhibitors of the Vif mediated A3G degradation. Four fluorescent based cellular assays have been established for the screening of small organic compounds. Three of these assays are based on stable cell lines, one of which co-expresses Vif and an EYFP tagged A3G protein. This so-called A3G degradation assay represents the primary assay for identification of degradation inhibitors and is complemented by two additional cell line based assays. These secondary assays enable the detection of compounds generating false-positive or false-negative signals in the A3G degradation assay. These systems allow the precise identification of true-positive A3G degradation inhibitors and thus representing a significant improvement of existing screening platforms. Furthermore, a cellular assay based on the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) was developed. The BiFC-assay measures the direct interaction between Vif and ElonginC in living cells and can be used as a new screening platform for identification of inhibitors targeting the Vif- ElonginC interaction, which is an essential step in the A3G degradation sequence. The aim of the second part of the project was the application of the established screening assays for testing of derivatives of the Vif antagonist RN-18 and rational designed inhibitors targeting the direct interaction between Vif and ElonginC. As a result of the compound testing it was shown, that RN-18 is cytotoxic and generates a false-positive signal in the A3G degradation assay. In case of the Vif-ElonginC interaction inhibitors one compound exhibited a strong inhibitory effect on A3G degradation in an initial screen. Taken together, screening assays for the precise identification of specific inhibitors of the A3G degradation were successfully established. These screening assays will accelerate the identification of novel anti-HIV agents. KW - Inhibitor KW - Screening KW - HIV KW - APOBEC3G KW - HIV-1 Vif KW - Inhibitor KW - Screening KW - APOBEC3G KW - HIV-1 Vif KW - Inhibitor KW - Screening KW - Restriktionsenzym Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70477 ER - TY - THES A1 - Fehrholz, Markus T1 - APOBEC3G-vermittelte Hemmung der Masernvirus-Replikation T1 - APOBEC3G-mediated Inhibition of Measles Virus Replication N2 - Das Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus aus der Familie der Paramyxovi-ridae und zählt immer noch zu den häufigsten Todesursachen bei Kindern in Entwicklungs-ländern. Nach dem Eintritt in den Körper führt eine Infektion von CD150-exprimierenden B- und T-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs) und Monozyten bzw. Makrophagen zu einer systemischen Infektion. Viele Mitglieder der Familie der APOBEC-Proteine („apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins“), u. a. auch APOBEC3G, werden als Teil der angeborenen Immunantwort in diesen Zellen und infizierten Geweben exprimiert. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass diese Proteine durch ihre RNA-bindenden Eigenschaften und ihre Fähigkeit zur Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu einer Inhibition von verschiedenen Retroelementen und Retroviren, wie beispielsweise den „long interspersed nuclear elements 1“ und dem humanen Im-mundefizienz-Virus (HIV) führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche antivirale Mechanismen von humanem APOBEC3G gegen das MV als Vertreter der negativ-strängigen RNA-Viren zu identifizieren. Hierzu wurden rekombinante MV-Wildtyp und -Impfstämme, sowie APOBEC3G-überexprimierende Vero-Zelllinien verwendet. Es zeigte sich, dass die Replikation des verwendeten rekombinanten Masern Wildtyp- und Impfvirus durch humanes APOBEC3G inhibiert wird. Diese Inhibition äußerte sich in einer reduzierten Synzytienbildung, einer mindestens 50 %igen Reduktion viral-exprimierter Proteine, sowie in einer 90-99 %igen Reduktion der auf APOBEC3G-exprimierenden Zellen entstandenen viralen Titer. Durch Sequenzanalysen konnte festgestellt werde, dass es zu einem Anstieg von 0,2 auf 0,95 unspezifischer Mutationen pro 1.000 Basenpaaren in MV-Transkripten kam, deren Muster mit dem in Kontrollzellen vergleichbar war, wohingegen typische C zu U(T) bzw. G zu A Hypermutationen nicht auftraten. Eine Kolokalisation von humanem APOBEC3G mit MV-spezifischen Proteinen konnte ebenfalls nicht eindeutig beobachtet werden. Es zeigte sich allerdings, dass APOBEC3G an virale RNA binden konnte. Außerdem wurde APOBEC3G in aufgereinigten viralen Partikeln um etwa den Faktor 4 angereichert. Versuche mit einem MV-Minireplikon-System ergaben, dass APOBEC3G eine Inhibition der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase bewirkt, vermutlich aufgrund der Fähigkeit des Proteins an virale RNA zu binden. Immunfluoreszenzfärbungen mit mutierten APOBEC3G-Proteinen haben auch in die-ser Arbeit erneut belegt, dass der RNA-bindenden Desaminase-Domäne bei der zellulären Lokalisation des Proteins eine besondere Rolle zukommt, da einige Mutationen innerhalb dieses Bereiches zu einem hohen Verlust der Proteinexpression sowie zu einer Ansammlung der mutierten Proteine am rauen endoplasmatischen Retikulum führen. Die in dieser Arbeit gezeigte Inhibition der Replikation von MV durch humanes APO-BEC3G lässt eine generelle antivirale Aktivität von Mitgliedern der APOBEC-Familie gegen negativ-strängige RNA-Viren vermuten, welche auf der Fähigkeit des Proteins beruht RNA zu binden. Weitere Untersuchungen bezüglich der Inhibition anderer Vertreter der Mononegavirales durch verschiedene APOBEC-Proteine könnten Aufschluss über die beteiligten Mechanismen geben. N2 - Measles virus (MV) is a negative-strand RNA virus which belongs to the family Para-myxoviridae and remains one of the leading causes of morbidity and mortality in the develop-ing world. Following entry of MV into the body, infection of CD150-positive B- and T-cells as well as dendritic cells and monocytes/macrophages leads to a systemic infection. Members of the APOBEC-protein family (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins), such as APOBEC3G, are expressed in these cells and infected tissues and form an important component of the innate immune response to viral infections. A number of studies have previously demonstrated that these proteins are able to inhibit various retroelements and retroviruses, such as long interspersed nuclear elements 1 and human immunodeficiency virus (HIV). This inhibition is based on their ability to bind RNA and to deaminate cytosine to uracil. The goal of this thesis was to identify possible antiviral mechanisms of human APOBEC3G against MV as an example for negative-strand RNA viruses. This was achieved through the use of recombinant wild-type and vaccine strains of MV and Vero cell lines overexpressing APOBEC3G. We could show that the replication of recombinant wild-type and vaccine strains of MV was inhibited by APOBEC3G, resulting in a 50 % reduction in the expression of viral proteins and syncytia formation, and a 90 to 99 % reduction in viral titers produced following infection of APOBEC3G expressing cells. Sequence analysis revealed that random mutations in viral transcripts increased from 0.2 to 0.95 mutations per 1000 bp and that the pattern of mutations was similar to that in control cells. Although typical C to U(T) or G to A hypermutations and co-localization of APOBEC3G and MV-specific proteins were not observed, APOBEC3G was able to bind viral RNA and was found to be enriched approximately 4-fold in viral particles. Further studies with a MV-specific minireplicon-system revealed that APOBEC3G led to an impairment of the viral RNA-dependent RNA-polymerase, probably due to the ability of the protein to bind RNA. Immunofluorescence immunostaining of mutated APOBEC3G-proteins showed that the RNA binding deaminase domain plays an important role in determining the cellular localization of the protein. Amino-acid changes in this domain led to a considerable loss of protein expression and to accumulation of the mutated proteins at the rough endoplasmic reticulum. The inhibition of MV replication described here suggests a general antiviral activity of members of the APOBEC family against negative-strand RNA viruses, based on the ability of these proteins to bind RNA. Further examinations including other members of the Mononegavirales may provide novel insights into the underlying mechanisms leading to inhibition of viral replication. KW - RNS-Bindung KW - Masern KW - Desaminierung KW - APOBEC3G KW - Masern KW - Desaminase KW - RNA-Virus KW - APOBEC3G KW - Measles KW - Deaminase KW - RNA-Virus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56143 ER - TY - JOUR A1 - Libre, Camille A1 - Seissler, Tanja A1 - Guerrero, Santiago A1 - Batisse, Julien A1 - Verriez, Cédric A1 - Stupfler, Benjamin A1 - Gilmer, Orian A1 - Cabrera-Rodriguez, Romina A1 - Weber, Melanie M. A1 - Valenzuela-Fernandez, Agustin A1 - Cimarelli, Andrea A1 - Etienne, Lucie A1 - Marquet, Roland A1 - Paillart, Jean-Christophe T1 - A conserved uORF regulates APOBEC3G translation and is targeted by HIV-1 Vif protein to repress the antiviral factor JF - Biomedicines N2 - The HIV-1 Vif protein is essential for viral fitness and pathogenicity. Vif decreases expression of cellular restriction factors APOBEC3G (A3G), A3F, A3D and A3H, which inhibit HIV-1 replication by inducing hypermutation during reverse transcription. Vif counteracts A3G at several levels (transcription, translation, and protein degradation) that altogether reduce the levels of A3G in cells and prevent its incorporation into viral particles. How Vif affects A3G translation remains unclear. Here, we uncovered the importance of a short conserved uORF (upstream ORF) located within two critical stem-loop structures of the 5′ untranslated region (5′-UTR) of A3G mRNA for this process. A3G translation occurs through a combination of leaky scanning and translation re-initiation and the presence of an intact uORF decreases the extent of global A3G translation under normal conditions. Interestingly, the uORF is also absolutely required for Vif-mediated translation inhibition and redirection of A3G mRNA into stress granules. Overall, we discovered that A3G translation is regulated by a small uORF conserved in the human population and that Vif uses this specific feature to repress its translation. KW - HIV-1 KW - APOBEC3G KW - Vif KW - mRNA KW - translation KW - uORF Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252147 SN - 2227-9059 VL - 10 IS - 1 ER -