TY - THES A1 - Karch, Katharina T1 - Mapping and Neutralization of Antibodies against Neurofascin, Contactin 1, Contactin associated protein 1 and Cortactin T1 - Kartierung und Neutralisation von Antikörpern gegen Neurofascin, Contactin 1, Contactin assoziiertes Protein 1 und Cortactin N2 - Immune-mediated polyneuropathies like chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy or Guillain-Barré syndrome are rare diseases of the peripheral nervous system. A subgroup of patients harbors autoantibodies against nodal or paranodal antigens, associated with a distinct phenotype and treatment response. In a part of patients with pathologic paranodal or nodal immunoreactivity the autoantigens remain difficult or impossible to determine owing to limitations of the used detection approach - usually ELISAs (enzyme-linked-immunosorbent-assays) - and incomplete knowledge of the possible autoantigens. Due to their high-throughput, low sample consumption and high sensitivity as well as the possibility to display many putative nodal and paranodal autoantigens simultaneously, peptide microarray-based approaches are prime candidates for the discovery of novel autoantigens, point-of-care diagnostics and, in addition, monitoring of pathologic autoimmune response. Current applications of peptide microarrays are however limited by high false-positive rates and the associated need for detailed follow-up studies and validation. Here, robust peptide microarray-based detection of antibodies and the efficient validation of binding signals by on-chip neutralization is demonstrated. First, autoantigens were displayed as overlapping peptide libraries in microarray format. Copies of the biochips were used for the fine mapping of antibody epitopes. Next, binding signals were validated by antibody neutralization in solution. Since neutralizing peptides are obtained in the process of microarray fabrications, neither throughput nor costs are significantly altered. Similar in-situ validation approaches could contribute to future autoantibody characterization and detection methods as well as to therapeutic research. Areas of application could be expanded to any autoimmune-mediated neurological disease as a long-term vision. N2 - Immunvermittelte Polyneuropathien wie die chronisch-inflammatorische demyelinisierende Polyradikuloneuropathie oder das Guillain-Barré-Syndrom sind seltene Erkrankungen des peripheren Nervensystems. Bei einem Teil dieser Patienten lassen sich Autoantikörper gegen nodale oder paranodale Antigene nachweisen, was mit einem bestimmten Phänotyp und Therapienansprechen assoziiert ist. Aufgrund der Einschränkungen verwendeter Detektionsansätze – üblicherweise ELISAs (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) – sowie der unvollständigen Kenntnis potenzieller Autoantigene bleibt es bisher zum Teil schwierig bis unmöglich bei nachgewiesener pathologischer paranodaler bzw. nodaler Immunreaktivität die entsprechenden Autoantigene zu identifizieren. Die hohe Durchsatzleistung, der geringe Verbrauch an Probenmaterial, die hohe Sensitivität sowie die Möglichkeit zahlreiche mutmaßliche nodale und paranodale Autoantigene zeitgleich darzustellen machen Peptid-Microarray-basierte Ansätze zu wesentlichen Kandidaten für die Entdeckung neuer Autoantigene, für Point-of-Care-Diagnostik und darüber hinaus für das Monitoring pathologischer Autoimmunantworten. Durch die hohe Rate falsch positiver Ergebnisse sowie die damit verbundene Notwendigkeit detaillierter Folgestudien und Validierungen sind die gegenwärtigen Anwendungen von Peptid-Microarrays jedoch limitiert. In dieser Arbeit wird eine robuste, Peptid-Microarray-basierte Detektion von Antikörpern sowie eine effiziente Validierung der Bindungssignale mittels On-chip Neutralisation demonstriert. Zuerst wurden die Autoantigene als überlappende Peptidbüchereien im Microarray-Format dargestellt. Kopien der Biochips wurden für die Feinkartierung der Antikörper-Epitope verwendet. Mittels Antikörperneutralisation in Lösung wurden die Bindungssignale anschließend validiert. Da die neutralisierenden Peptide im Microarray- Herstellungsprozess gewonnen werden, ergeben sich weder beim Durchsatz noch bei den Kosten signifikante Änderungen. Vergleichbare In-situ-Validierungsansätze könnten zu künftigen Autoantikörper Charakterisierungen, Detektionsmethoden sowie zu therapeutischen Forschungsansätzen beitragen. Als langfristige Vision könnten die Anwendungsgebiete auf jede beliebige autoimmun-vermittelte neurologische Krankheit ausgeweitet werden. KW - Microarray KW - Antikörper KW - Autoantigen KW - Epitop KW - Neutralisation KW - antibody KW - autoantigen KW - epitope KW - neutralization KW - fine-mapping KW - Neurofascin KW - Contactin 1 KW - Caspr1 KW - Cortactin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280223 ER - TY - THES A1 - Nelke, Johannes T1 - Entwicklung multi‐funktioneller TNFRSF Rezeptorspezifischer Antikörper‐Fusionsproteine mit FcγR‐unabhängiger Aktivität T1 - Development of multi‐functional TNFRSF receptor‐specific antibody fusion proteins with FcγR‐independent activity N2 - Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen. N2 - Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists. KW - Antigen CD40 KW - Monoklonaler bispezifischer Antikörper KW - Antigen CD95 KW - Immunreaktion KW - B-Zell-Lymphom KW - BCMA KW - FcgR KW - Antikörper KW - bispezifisch KW - Antibody KW - bispecific KW - Multiple Myeloma KW - Baff Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279855 ER -