TY - THES A1 - Kramer, Thomas T1 - Übergangsmetall-Bor-Wechselwirkungen in Boryl- und Boridkomplexen T1 - Transitionmetal-Boron-Interactions in Boryl and Boride Complexes N2 - Durch Untersuchungen zur Reaktivität von Boryl- und Boridverbindungen konnten deren Bindungssituationen aufgeklärt und neuartige Koordinationsmotive von Übergangsmetall-Bor-Verbindungen erhalten werden. Die erhaltenen Verbindungen wurden mittels NMR-Spektroskopie, IR-Spektroskopie, Elementaranalyse und Röntgendiffraktometrie untersucht und zusätzlich wurden DFT-Rechnungen angefertigt. An verschieden substituierten Eisenborylkomplexen wurden Reaktivitätsuntersuchungen gegenüber Halogenidabstraktionsmitteln und Reduktionsmitteln durchgeführt und im Falle der Boridkomplexe wurden Verbindungen mit bis dato unbekanntem Strukturmotiv erhalten. N2 - Investigations into the reactivities of boryl and boride complexes provided insight into their bonding and led to previously unknown coordination motifs for transition-metal-boron complexes. The resulting compounds were analyzed via NMR spectroscopy, IR spectroscopy, elemental analyses and crystal structure analyses. Their electronic structures were investigated by theoretical calculations using DFT methods. The reactivities of substituted iron boryl complexes toward halogenide abstracting and reducing reagents were studied and, in case of the boride complexes, novel structural motifs were dentified. KW - Übergangsmetall KW - Mehrkernige Komplexe KW - Borylgruppe KW - Dimerisierung KW - Übergangsmetall-Borverbindungen KW - Borchemie KW - Boridkomplexe KW - Isonitrilinsertion KW - Boride KW - Borylkomplexe Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112222 ER - TY - THES A1 - Kestler, Christian T1 - Untersuchungen über die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin T1 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin N2 - Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern. N2 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin KW - Dimerisierung KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Ortspezifische Mutagenese KW - Chronophin KW - Substratspezifitätsschleife Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777 ER - TY - THES A1 - Gruse, Tamara T1 - Untersuchung der Rolle der ERK-Dimerisierung bei der ERK1/2- vermittelten Proliferation von Tumorzellen T1 - Investigation of the role of ERK dimerization in the ERK1/2-mediated proliferation of tumor cells N2 - Bei vielen Erkrankungen wie z.B. Herzhypertrophie, Diabetes und Entzündungen spielt die Raf-MEK-ERK-Signalkaskade eine wichtige Rolle. ERK1/2 ist in vielen zellulären Prozessen, u.a. Proliferation, Differenzierung, Wachstum, Hypertrophie und Apoptose involviert. Auch in der Tumorentstehung besitzt dieser MAPK-Signalweg eine signifikante Funktion, da er bei ca. 50% aller Krebsarten deutlich aktiviert ist. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle einer neu entdeckten Phosphorylierungsstelle an Threonin188 an ERK2 bei der Entstehung und der möglichen Therapie von Tumoren zu erarbeiten. Dafür wurde ein Myc-ERK2309-357-Peptid verwendet, das 2013 in der Arbeitsgruppe Lorenz entwickelt wurde. Myc-ERK2309-357 zeigte in bisher unveröffentlichten Versuchen, dass es direkt an ERK2 bindet, eine Dimerisierung von ERK1/2 hemmen und eine vermehrte Lokalisation von ERK2 im Zellkern verhindern kann. Im Rahmen dieses Projekts konnten wir belegen, dass mit Hilfe des Myc-ERK2309-357-Peptids die Tumorzellproliferation von verschiedenen Krebszelllinien (Caco-2, SCC68, PC/1-1 und PC/13-1) um 60-80% vermindert werden konnte. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass Myc-ERK2309-357 keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 am TEY-Motiv besitzt. Die Aktivierung von ERK1/2 durch die Kinasen MEK1/2 wird somit nicht beeinflusst und die zytosolischen ERK-Funktionen, wie z.B. der anti-apoptotische Effekt, würden somit bestehen bleiben. Außerdem fanden wir heraus, dass Myc-ERK2309-357 im Vergleich zu den MEK-Inhibitoren U0126 und PD98059 und verglichen mit dem EGF-Rezeptor-Antikörper Cetuximab die Proliferation signifikant besser hemmt. N2 - The Raf-MEK-ERK signaling cascade plays an important role in many diseases, such as cardiac hypertrophy, diabetes and inflammation. ERK1/2 is involved in many cellular processes, i.a. proliferation, differentiation, growth, hypertrophy and apoptosis. This MAPK signaling pathway also has a significant function in tumorigenesis because it is clearly activated in about 50% of all cancers. The aim of this work was to investigate the role of a newly discovered phosphorylation site on threonine188 in ERK2 in the genesis and possible therapy of tumors. For this, a Myc- ERK2309-357 peptide was used, which was developed in the research group Lorenz in 2013. It has previously been shown that Myc-ERK2309-357 binds directly to ERK2, inhibits ERK1/2 dimerization, and prevents increased localization of ERK2 in the nucleus. In this project we demonstrated that the Myc-ERK2309-357 peptide reduces the tumor cell proliferation of various cancer cell lines (Caco-2, SCC68, PC / 1-1 and PC / 13-1) by 60-80%. Furthermore, we could show that Myc-ERK2309-357 has no influence on the phosphorylation of ERK1/2 on the TEY motif. The activation of ERK1/2 by the kinases MEK1/2 is thus unaffected and the cytosolic ERK functions, e.g. the anti-apoptotic effect, would thus persist. In addition, we discovered that Myc-ERK2309-357 inhibits proliferation of the tumor cells significantly better compared to the MEK inhibitors U0126 and PD98059 and compared to the EGFR antibody Cetuximab. KW - Dimerisierung KW - MAP-Kinase KW - Carcinogenese KW - ERK1/2 Dimerisierung KW - Tumorzellproliferation KW - Krebs Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159847 ER - TY - THES A1 - Bollmann, Stefan T1 - Structural Dynamics of Oligopeptides determined by Fluorescence Quenching of Organic Dyes T1 - Bestimmung struktureller Dynamiken von Oligopeptiden mittels Fluoreszenzlöschung von organischen Fluorophoren N2 - For determination of structures and structural dynamics of proteins organic fluorophores are a standard instrument. Intra- and intermolecular contact of biomolecular structures are determined in time-resolved and stationary fluorescence microscopy experiments by quenching of organic fluorophores due to Photoinduced Electron Transfer (PET) and dimerization interactions. Using PET we show in this work that end-to-end contact dynamics of serine-glycine peptides are slowed down by glycosylation. This slow down is due to a change in reaction enthalpy for end-to-end contact and is partly compensated by entropic effects. In a second step we test how dimerization of MR121 fluorophore pairs reports on end-to-end contact dynamics. We show that in aqueous solutions containing strong denaturants MR121 dimerization reports advantageously on contact dynamics for glycine-serine oligopeptides compared to the previously used MR121/tryptophane PET reporters. Then we analyze dimer interactions and quenching properties of different commercially available fluorophores being standards in Förster Resonance Energy Transfer (FRET) measurements. Distances in biomolecules are determinable using FRET, but for very flexible biomolecules the analysis of masurement data can be distorted if contact of the two FRET fluorophores is likely. We quantify how strong the quenching of fluorophore pairs with two different or two identical fluorophores is. Dimer spectra and association constants are quantified to estimate if fluophores are applicable in various applications, e.g. in FRET measurements with unstructured peptides and proteins. N2 - Zur Charakterisierung von Proteinen werden in der fluoreszenzbasierten Mikroskopie organische Farbstoffe benutzt, um strukturelle Informationen bzw. Informationen über dynamische Prozesse zu gewinnen. In der zeitaufgelösten und stationären Fluoreszenzmikroskopie können hiermit Kontaktprozesse durch photoinduzierten Elektronentransfer und auch Dimerisierung der Fluorophore analysiert werden. In dieser Arbeit wird mittels photoinduziertem Elektronentransfer PET gezeigt, dass Glykosylierung End-zu-End Kontaktkinetiken verändert. Sehr flexible Serin-Glycin Peptide zeigen glykosyliert langsamere Kinetiken durch Veränderung der Reaktionsenthalpie der Kontaktreaktion beider Peptidenden verglichen zu unglykosylierten. Diese enthalpischen Beiträge werden zum Teil von entropischen Beiträgen kompensiert. Außerdem wird gezeigt, dass Glycin-Serin Peptiddynamiken auch mittels Farbstoffpaaren gemessen werden können, die auf Löschwechselwirkungen durch Dimerisierung beruhen. Die Stärke dieser Löschwechselwirkungen hängt vom Farbstoffpaar ab. In Lösungen mit Denaturierungsmitteln können Farbstoffpaare des Fluoreszenzfarbstoffes MR121 vorteilhaft für Messungen von Dynamiken von Glycin-Serin Peptiden genutzt werden. Die Dimerwechselwirkungen können bei sehr flexiblen Biomolekülen und möglichem Kontakt von Fluorophoren die konventionelle Analyse von Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Messungen erschweren. Wir untersuchen an Glycin-Serin Oligopeptiden das Dimerisierungsverhalten kommerziell erhältlicher Fluorophore, die in FRET Messungen verwendet werden. Für gleiche und verschiedene Fluorophore wird die Löschung durch Dimerwechselwirkungen quantifiziert. Dabei werden Dimerspektren und Assoziationskonstanten für Dimerisierungsreaktionen bestimmt. Letztere helfen bei der Abschätzung, ob Fluorophorpaare für verschiedene Anwendungen geeignet sind, zum Beispiel in FRET-Messungen in unstrukturierten Peptiden und Proteinen. KW - Fluorophore KW - Fluoreszenzlöschung KW - h-dimerization KW - Lumineszenzlöschung KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Glykosylierung KW - Dimerisierung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92191 ER - TY - THES A1 - Dorsch, Sandra T1 - Rezeptor-Rezeptor-Interaktion ß-adrenerger Rezeptoren T1 - Receptor-Receptor Interaction of ß-adrenergic Receptors N2 - Viele Membranrezeptoren liegen als über Disulfidbrücken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen Fällen methodisch klar und einfach zu erbringen. Für die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopräzipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivität besitzen diese Methoden einige Grenzen und können je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilität der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverlässig ermittelt werden. Auch die Größe der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabhängige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu können. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching“ basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilität von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu können, müssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilität vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellulär mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antikörper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellulär mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellulären Antikörpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellulär-markierten Rezeptoren und den intrazellulär-markierten Rezeptoren durch eine Mobilitätsänderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellulär-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antikörper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellulär-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilität nicht durch die extrazellulären Antikörper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellulär-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellulär-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverhältnis unabhängige Mobilität. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellulär-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilität des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abhängig vom CFP–YFP-Expressionsverhältnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten für ein Dimer überein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere höherer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu überprüfen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren höherer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei höheren YFP-Rluc-Expressionsverhältnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverhältnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage über eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden. N2 - Many membrane receptors exist as disulfide-bond dimers. In these cases dimerization is methodological clearly and easily provable. However, for most G-protein coupled receptors the postulated existence of di- or oligomerization nor their function is definitely demonstrated. Mostly, methods like co-immunoprecipitation and resonance energy transfer techniques like BRET and FRET were used to investigate protein-protein interactions. Despite their high sensitivity these methods have some limits and reveal sometimes distinct results regarding the occurrence of a protein-protein interaction depending on experimental approach and use of different controls. Neither the stability of the interaction nor the fraction of interacting proteins are determinable using resonance energy transfer assays. Furthermore the size of complexes is not or only technically difficult determinable. Therefore in this work a novel independent approach was developed to allow a more detailed investigation of receptor-receptor interactions in living cells. This method based on fluorescence recovery after photobleaching microscopy allows to determine the mobility of proteins. In order to measure homo-interactions between proteins two protein fractions with different mobility have to be distinguishable. Therefore one receptor fraction was extracellularly tagged with YFP and specifically immobilized using polyclonal antibodies against YFP. The other receptor fraction was intracellularly labeled with CFP or Cerulean and therefore not recognized by the extracellular antibodies. In this way using dual-color FRAP potential interactions between immobilized extracellularly-tagged receptors and intracellularly-tagged receptors were detectable due to a change of mobility of the latter. This method was validated using monomeric (CD86) and covalent dimeric (CD28) receptors. A specific immobilization of extracellularly-tagged proteins was achievable only by using polyclonal but not monoclonal antibodies against YFP. Intracellularly tagged proteins were not influenced in their mobility by extracellular antibodies. After immobilization of the extracellularly-labeled CD86 the coexpressed intracellularly-tagged CD86-CFP was still fully mobile. Furthermore the monomeric CD86 showed a relative CFP–YFP expression ratio independent mobility. This result led to the conclusion that extra- and intracellularly labeled CD86 did not interact with each other and exist as a monomer. The mobility of the covalent dimer CD28 however was depending on the relative CFP-YFP expression ratio and was in good agreement with theoretically expected values for a dimer. The application of the dual-color FRAP approach for the investigation of interactions between ß1- and ß2-adrenergic receptors showed differences between both receptor subtypes. ß1-AR exhibited a specific transient interaction, however ß2-AR existed as stable higher order oligomers. The transient interaction between ß1-AR and the stable higher order oligomerization of ß2-AR were not only observed in HEK 293T cells but also in neonatal rat cardiac myocytes and at 37°C. Furthermore the activation state of the respective receptor had no influence on the extent of the interaction. Between ß1- and ß2-AR only a weak and unstable hetero-interaction was observed using the dual-color FRAP approach. In order to control if a direct interaction between the adrenergic receptors is occurring the BRET method was applied. Using BRET a direct interaction between ß2-AR was observed, but it was not possible to distinguish between dimers and higher order oligomers. For ß1-AR a specific energy transfer occurred at higher YFP-Rluc expression ratios. At lower expression ratios the signal was in the unspecific range. Also the investigation of hetero-interactions between ß1- and ß2-AR revealed no clear conclusion about a specific interaction between both receptor subtypes. KW - Dimerisierung KW - FRAP KW - GPCR KW - ß-adrenerge Rezeptoren KW - BRET KW - FRAP KW - GPCR KW - ß-adrenergic Receptors KW - BRET Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39712 ER - TY - THES A1 - Gentzsch, Christian T1 - Molecular Imaging of Opioid Receptors and Butyrylcholinesterase with Selective, Tailored Probes Using Positron Emission Tomography and Fluorescence Microscopy T1 - Molekulare Bildgebung von Opioidrezeptoren und Butyrylcholinesterase mit selektiven, maßgeschneiderten Verbindungen durch Positronen-Emissions-Tomographie und Fluoreszenzmikroskopie N2 - The present thesis concerns the molecular imaging of opioid receptors and human butyrylcholinesterase with the aid of tailored probes, which are suitable for the respective applied imaging techniques. The first part focusses on imaging of opioid receptors with selective probes using total internal reflection- and single molecule fluorescence microscopy. Design and synthesis of the ligands are presented and their pharmacological characterization and application in microscopy experiments are shown. The second part of this thesis focused on the development of 18F-labeled, selective radiotracers for imaging of butyrylcholinesterase via positron emission tomography. The design and synthesis of each a reversible and pseudoirreversible 18F-labeled tracer are presented. After evaluation of the binding properties of each tracer, their initial application in ex vivo autoradiography- and preliminary in vivo microPET studies is described and analyzed. N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularen Bildgebung von Opioidrezeptoren und der humanen Butyrylcholinesterase mithilfe von maßgeschneiderten Verbindungen, die jeweils optimal geeignet für die angewendeten Bildgebungstechniken sind. Der erste Teil behandelt die Bildgebung von Opioidrezeptoren durch selektive Liganden mittels interner Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie- und Einzelmolekül-Mikroskopie. Design und Synthese der Liganden werden beschrieben und ihre pharmakologische Charakterisierung und Anwendung in Mikroskopieexperimenten werden gezeigt. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von 18F-markierten, selektiven Radiotracern für die Bildgebung der Butyrylcholinesterase mittels Positronen-Emissions-Tomographie. Das Design und die Synthese jeweils eines reversiblen und pseudo-irreversiblen, 18F-markierten Tracers werden beschrieben. Nach der Bewertung der Bindungseigenschaften beider Tracer am Enzym, wird ihre erste Anwendung in ex vivo Autoradiographie- und vorläufigen in vivo microPET Studien beschrieben und ausgewertet. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Positronen-Emissions-Tomografie KW - Opiatrezeptor KW - Dimerisierung KW - Enzyminhibitor KW - Fluoreszenzliganden KW - Biodistribution KW - Autoradiographie Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247529 ER - TY - THES A1 - Kramer, Sofia T1 - Hemmung pathologischer kardialer Hypertrophie über das Dimer-Interface von ERK1/2 T1 - Inhibition of pathological cardiac hypertrophy by the dimer interface of ERK1/2 N2 - Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden. N2 - The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) have a central role in cardiac hypertrophy and cell survival. Hypertrophic stimuli activate ERK1/2, trigger ERK dimerization and subsequently ERKT188-autophosphorylation. This newly discovered autophosphorylation is a prerequisite for nuclear ERK1/2 translocation and leads to the development of pathological cardiac hypertrophy. As the ERK dimer interface is a potential target to selectively interfere with nuclear ERK1/2 signaling, we investigated whether the interference with ERK dimerization may serve as a therapeutic strategy to prevent pathological cardiac hypertrophy. For this, we generated ERK2 mutants and peptide constructs that interfere with ERK dimerization. These constructs were evaluated in various cell types by their effects on nuclear ERK translocation and dimerization by fluorescence microcopy, co-immunoprecipitation and Duolink proximity ligation assays. We showed that the peptides indeed prevented ERK-ERK interaction in response to phenylephrine and/or carbachol stimulation. In addition, the peptides prevented ERKT188-phosphorylation and interfered with all ERK1/2 effects that are associated with ERKT188-phosphorylation e.g. nuclear ERK translocation and cardiomyocyte hypertrophy. Interestingly, the peptide did not inhibit the general activation of ERK1/2. These data indicate that the ERK dimer interface is a valuable target for selective inhibition of nuclear ERK1/2 signaling, that is able to effectively attenuate ERK1/2 mediated cardiomyocyte growth but without impairing cell survival. KW - Dimerisierung KW - Herzhypertrophie KW - Interferenz KW - MAP-Kinase KW - ERK1/2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233739 ER - TY - THES A1 - Köhler, Rolf T1 - Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins T1 - Development of a GFP-Reportersystems in Legionella and molecular analysis of the Legionella Mip-protein N2 - Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist. N2 - The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms. KW - Legionella pneumophila KW - Bakterielle Infektion KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - In vivo KW - Legionella pneumophila KW - GFP-Reportergen KW - in vivo Monitoring KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - FACS-Analyse KW - MIP KW - PPIasen KW - Dimerisierung KW - Legionella pneumophila KW - GFP-reportersystem KW - in vivo monitoring KW - fluorescence microscopy KW - FACS-analysis KW - Mip KW - PPIases KW - dimerization Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594 ER - TY - THES A1 - Deiß, Katharina T1 - Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2) T1 - Regulation of the kinase modulator Raf kinase inhibitor protein (RKIP): Influence of phosphorylation and dimerization on its interaction with Raf1 and G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2) N2 - RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen. N2 - RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved. KW - Signaltransduktion KW - Dimerisierung KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Proteinkinase C KW - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) KW - G protein-gekoppelte Rezeptor Kinase 2 (GRK2) KW - Raf1 KW - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP) KW - G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) KW - Raf1 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884 ER - TY - THES A1 - Knobloch, Gunnar T1 - Biochemical and structural characterization of chronophin T1 - Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Chronophin N2 - The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency. N2 - HAD Phosphatasen gehören zu einer phylogenetisch alten Proteinfamilie, die in allen drei Domänen des Lebens vertreten ist. Enzyme dieser vergleichsweise wenig charakterisierten Familie von Phosphatasen erweisen sich zunehmend als biomedizinisch interessante Zielmoleküle, da immer mehr Krankheiten identifiziert werden, bei denen HAD Phosphatasen eine Rolle spielen. In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die HAD Phosphatase Chronophin biochemisch und strukturell charakterisiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass Chronophin die Proteine Cofilin-1, ein Schlüsselprotein in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts, und den Steroidrezeptor Coaktivator 3 (SRC-3) dephosphoryliert. Darüberhinaus ist bekannt, dass Chronophin eine spezifische Pyridoxal 5'-Phosphat (PLP, Vitamin B6) Phosphatase ist, und somit an der Regulation verschiedenster Signalwege beteiligt ist. Die hier beschriebene Analyse von Chronophin beinhaltet die Untersuchung intrinsischer Regulationsmechanismen, wie z.B. Determinanten der Substratspezifität, die allosterische Regulation über Dimerisierung, bis hin zur Kontrolle durch extrinsische Faktoren wie interagierende Proteine oder Inhibitoren. Die Interaktion von Chronophin mit den kürzlich in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartnern CIB1 (Kalzium- und Integrin-bindendes Protein 1) und Calmodulin wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter und gereinigter Proteine untersucht. Dabei kam heraus, dass sich die Assoziation von CIB1 und Calmodulin an Chronophin gegenseitig ausschließt, und dass dieser Prozess durch Kalzium reguliert wird. Dabei beeinflusst weder die Bindung an CIB1 noch an Calmodulin die Phosphataseaktivität von Chronophin gegenüber den Substraten PLP oder phosphoryliertem Cofilin-1. Möglicherweise regulieren die beiden interagierenden Proteine die Funktion von Chronophin auf eine andere, hier nicht weiter untersuchte Art und Weise. Der Einfluss der Chronophin-Dimerisierung wurde untersucht, indem wir eine konstitutiv monomere Variante des üblicherweise dimeren Chronophins geschaffen haben. Diese monomere Variante des Enzyms wies eine deutlich reduzierte Aktivität gegenüber PLP auf. Durch röntgenkristallographische Analysen des wild-typischen Proteins und der monomeren Variante konnten wir zeigen, dass die Dimerisierung von Chronophin notwendig ist, um ein Strukturelement, welches wichtig für die Substratspezifität ist, in einer korrekten Position zu halten. Dieser allosterische Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Substratspezifität war bisher unbekannt, und trifft möglicherweise auf alle Proteine der C2a Unterfamilie von HAD Phosphatasen zu, die strukturell mit Chronophin verwandt sind. Die Faktoren, welche auf die Substratspezifität von Chronophin Einfluss nehmen wurden untersucht, indem einzelne Proteindomänen mit dem paralogen Protein AUM ausgetauscht, und die so geschaffenen Protein-Hybride biochemisch untersucht wurden. Durch das Lösen der röntgenkristallographischen Struktur eines Protein-Hybrids, bestehend aus der katalytischen Domäne von Chronophin und der capping-Domäne von AUM, konnte die die erste partielle Struktur von AUM untersucht werden. Mit Hilfe dieser strukturellen Information und durch bioinformatische Analysen konnten anschließend die unterschiedliche Substratspezifitäten der beiden paralogen Phosphatasen Chronophin und AUM in einem evolutionsbiologischen Kontext untersucht werden. Zusätzlich wurden vier mögliche Chronophin-Inhibitoren auf der Basis der PLP-Struktur synthetisiert. Die biochemische Analyse der Substanzen als Chronophin-Hemmer ergab moderate inhibitorische Eigenschaften mit IC50-Werten im micromolaren Bereich. Jedoch stellen die hier charakterisierten Inhibitoren nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von Chronophin als PLP-Phosphatase dar. Die röntgenkristallographische Struktur von Chronophin mit einem der Inhibitoren liefert außerdem eine wichtge Grundlage für die zukünfitige Verbesserung der Inhibitoren bezüglich Effektivität und Spezifität. KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Dimerisierung KW - Inhibitor KW - Chronophin KW - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase KW - Haloacid dehalogenase KW - HAD phosphatase KW - PLP phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088 ER -