TY  - THES
A1  - Ehrhardt, Christina
T1  - Untersuchung Influenza Virus-induzierter Signalprozesse und deren Bedeutung in der Wirtszell-Abwehr
T1  - Investigation of Influenza virus induced signal-transduction processes and their role in host defense
N2  - Eine Influenza A Virus Infektion induziert die Expression zahlreicher Gene, einschließlich der TypI Interferone, die eine erste Abwehrlinie gegen virale Infektionen bilden. Hierbei ist IFNb das wichtigste Zytokin. IFNb wird durch einen multimeren Komplex, das Enhanceosom kontrolliert, das Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren AP-1, NF-kB und IRF-3 in seiner Promotorsequenz besitzt. In früheren Arbeiten konnten wir zeigen, dass die Influenza Virus-induzierte AP-1 abhängige Genexpression über den JNK/SAPK-Signalweg erfolgt (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001). Unter den, an DNA Elemente bindenden AP-1 Faktoren waren solche, die aufgrund von Phosphorylierung durch die JNKs reguliert werden, wie beispielsweise ATF-2. Weiterhin korrelierte die Induktion der AP-1 abhängigen Genexpression mit der starken Aktivierung von JNK und seiner upstream Regulatoren in permissiven Zellen. Die Virusmengen transfizierter und infizierter Zellen, in denen JNK inhibiert wurde, waren höher im Vergleich zu Virusmengen der Kontrollzellen. Demzufolge kann die Virus-induzierte Aktivierung von JNK und AP-1 nicht der Virusreplikation dienen, sondern gehört vielmehr zu einer antiviralen Immunantwort. Daten aus einem Virus-freien, auf Plasmiden basierenden vRNA Replikations-System deuten darauf hin, dass die JNK Aktivierung aus der Akkumulation viraler RNA resultiert. Entsprechend bewirkte die Infektion von Zellen mit einem Virus, dem das virale NS1 Protein fehlt, welches RNA binden und somit "wegfangen" kann, eine gesteigerte JNK Aktivität im Vergleich zu den Kontroll-Infektionen. Damit konnte das NS1 Protein als erstes virales Protein identifiziert werden, das der Virus- und dsRNA-induzierten Aktivierung des JNK/SAPK-Signalweges entgegen wirkt. Der Transkriptionsfaktor IRF-3 wird spezifisch infolge einer viralen Infektion aktiviert und ist daher ein potenter Kandidat, die schnelle und starke antivirale Genexpression zu regulieren. Infolge einer Influenza Virus Infektion wird IRF-3 phosphoryliert, wandert in den Kern und bindet dort an Promotoren, die die antivirale Genexpression steuern. Bislang sind die IRF-3 Kinase und zelluläre Signalwege, die eine IRF-3 Phosphorylierunge induzieren, unbekannt. Um in unserem Labor Signalmediatoren, die upstream von IRF-3 liegen, zu suchen, wurde ein IRF-3 responsives Promotor-Reportergen-Plasmid, aus dem IFNb Promotor stammend, konstruiert. Die kleine Rho-GTPase Rac1 wurde als erster nicht an RNA bindender, zellulärer Mediator identifiziert, der in die Influenza Virus-induzierte IRF-3 abhängige Genexpression involviert ist. Die Inaktivierung der Rho-GTPasen durch das spezifische Inhibitor Toxin B oder dominant negatives Rac1 resultierten in der Inhibierung der Virus- und dsRNA-induzierten IRF-3 Phosphorylierung und DNA Bindung, sowie der IRF-3 abhängigen Promotoraktivität, beispielsweise des IFNb Promotors. Damit konnten zwei wichtige Komponenten der Virus-induzierten Immunantwort identifiziert und charakterisiert werden.
N2  - Infection of cells with Influenza A virus induces the expression of a variety of genes, including the type I interferons which are a first line of defense against viral infections. IFNb, the most important cytokine, is controlled by a higher order complex, the enhanceosom, which contains binding sites for the transcription factors AP-1, NF-kB and IRF-3. We could show that the Influenza Virus induced AP-1 dependent gene expression occurs via the JNK/SAPK pathway (Ehrhardt, 1999; Ludwig et al., 2001). Among the AP-1 factors which were identified to bind their cognate DNA element during viral infection are those, that are regulated via phosphorylation by JNKs, such as ATF-2. Accordingly, the induction of AP-1 dependent gene expression correlates with a strong activation of JNK and its upstream activators MKK4 and 7 in permissive cells. Virus yields from transfected and infected cells in which JNK signaling was inhibited by different approaches were higher compared to the levels from control cells. Therefore we conclude that virus-induced activation of JNK and AP-1 is not exploited by the virus to support its replication but rather is required for the innate antiviral immune response. Data obtained with a virus-free plasmid-based vRNA replication system indicated that JNK activation is a cause of viral RNA accumulation during infection. This was supported by the observation, that infection of cells with a virus lacking viral NS1 protein, which is known to bind and to sequester RNA from cellular signaling intermediates, caused a strongly enhanced JNK activity compared to control infections. Furthermore, the NS1 protein was identified as the first viral protein that antagonizes virus- and dsRNA-induced activation of the stress response signaling pathway mediated through Jun N-terminal kinase. IRF-3 is specificially activated in response to viral infection and is therefore the most potent candidate to regulate the fast and strong antiviral gene expression. After an Influenza virus infection IRF-3 becomes phosphorylated and migrates to the nucleus where it binds to antiviral gene promoters. However, the IRF-3 kinase and the cellular signaling pathways leading to IRF-3 phosphorylation are unknown. To investigate signaling mediators upstream of IRF-3, we have constructed an IRF-3 responsive promoter-reporter gene plasmid derived from the IFNb promoter. The small Rho-GTPase Rac1 was identified as the first non-RNA binding cellular mediator involved in the Influenza virus-induced IRF-3 dependent gene expression. Inactivation of these Rho GTPases by the specific inhibitor toxin B or dominant negative Rac1 resulted in the inhibition of virus- and dsRNA-induced IRF-3 phosphorylation and DNA binding as well as of IRF-3 dependent promoter activity, e.g. of the IFNb promoter. Thus two important components of virus-mediated immune response were identified and characterised.
KW  - Influenza-A-Virus
KW  - Interferon <beta->
KW  - Genexpression
KW  - Influenza A Virus
KW  - JNK/SAPK
KW  - IRF3
KW  - Rac1
KW  - dsRNA
KW  - Influenza A virus
KW  - JNK/SAPK
KW  - IRF3
KW  - Rac1
KW  - dsRNA
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3870
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wurzer, Walter
T1  - Die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-KappaB in Influenza-A-Virus infizierten Zellen
T1  - The role of the transcriptionfactor NF-kB in influenza-A-virus infected cells
N2  - Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein übergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunität im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB für eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abhängige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erhöht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose während einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, nämlich Kaspase-3 zu interferieren. Überraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP überexprimiert wurde, rückläufig waren. Gegengleich führte Überexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erklärung dürfte in der Aktivität von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs ermöglichen dürfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese über die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus.
N2  - Activation of the transcription factor NF-kB is a hallmark of infections by viral pathogens including influenza-A-viruses (Hiscott J. et al., 2001). Since gene expression of many proinflammatory and antiviral cytokines, such as IFNb of TNF-a is controlled by NF-kB the concept emerged that NF-kB and its upstream regulator IKK are essential components of the innate antiviral immune response to infections with RNA viruses (Chu WM. et al., 1999). In contrast to this common view this work presents data that for efficient influenza virus production NF-kB activity is required. On a molecular level this is due to NF-kB-dependent viral induction of the proapoptotic factor TRAIL which enhances virus propagation in an auto- and parakrine fashion. Thus, NF-kB acts both proapoptotic and proviral in the context of an influenza virus infection. Induction of apoptosis is a hallmark observed upon infection with many viral pathogens, including influenza-A-virus. Since the consequences of apoptosis induction for the outcome of an influenza virus infection are not clear, we have addressed this issue by interfering with the function of a major virus-induced apoptosis effector, caspase-3. Surprisingly, influenza virus propagation was strongly impaired in the presence of a caspase-3 inhibitor in cultures cells. Consistent with these findings, virus yields are reduced in cells expressing XIAP and enhanced when procaspase-3 is overexpressed. Mechanistically, the block in virus propagation appears to be due to retention of the viral RNP complexes in the nucleus preventing formation of progeny virus particles. An explanation might given by an effect of caspase-3, which is involved in cleavage of protein of the nuclear pore complex in cells undergoing apoptosis, which results in fusion of the pores and might thus allow free diffusion of viral RNA complexes. Finally, this work presented here led to a new hypothesis concerning the role of the IKK-NF-kB-pathway, its influence on the regulation of apoptosis in influenza infected cells and the outcome for the virus.
KW  - Nuklearfaktor Kappa B
KW  - Influenza-A-Virus
KW  - Virusinfektion
KW  - NF-kB
KW  - Influenza A Virus
KW  - Apoptose
KW  - TRAIL
KW  - Export
KW  - NF-kB
KW  - influenza A virus
KW  - apoptosis
KW  - TRAIL
KW  - export
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5901
ER  -