TY - THES A1 - Zellner, Elisabeth T1 - Wechselwirkungen zwischen Replikationsproteinen und Origin-DNA während Proliferation und terminaler Differenzierung T1 - Interactions between replication proteins and origin DNA during proliferation and terminal differentiation N2 - Ein Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Fragestellung, ob beim Übergang von Proliferation zu Teilungsruhe und Differenzierung irreversible Veränderungen in der Zusammensetzung des präreplikativen Komplexes auftreten. Ein dafür geeignetes System ist die murine C2C12-Zell-Linie, die durch Kultivierung in Hungermedium zu Myotuben differenziert werden können. FACS-Analyse und BrdU-Einbau ergaben, dass in den Muskelzellen keine signifikante DNA-Synthese mehr stattfindet. Die Fluktuation von Replikationsproteinen wurde im Verlauf der terminalen Differenzierung untersucht. Gleiche Mengen an Kern- und Cytoplasma-Extrakten von proliferierenden, konfluenten und sich differenzierenden Zellen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunblot mit Antikörpern gegen Replikationsproteine untersucht ORC1, CDC6, MCM6 und Geminin konnten nach 132 h nicht mehr detektiert werden, während ORC2, ORC3, MCM3, CDT1 und CDC45 zwar noch vorhanden waren, jedoch in geringerer Menge als in proliferierenden Zellen. Weiterhin wurde die Menge an Replikationsproteinen in durch Serummangel transient aus dem Zellzyklus ausgetretenen G0-Phase-Zellen und Zellen, die durch Serum reaktiviert wurden, untersucht. Die Replikationsproteine waren in quieszenten C2C12- und 3T3-Zellen gleichermaßen wie in den terminal differenzierten Zellen in verringerter Menge vorhanden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Restimulierung von quieszenten, nicht aber terminal differenzierten Zellen, die erneute Expression von Replikationsproteinen zur Folge hat. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) mit proliferierenden und terminal differenzierten C2C12-Zellen durchgeführt. Eine preRC-Assemblierungsstelle befindet sich im OBR-Bereich der murinen rRNA-Gene von -2519 bis -2152 (Fragment B). In proliferierenden C2C12-Zellen konnte die Bindung von ORC1-5, CDC6, CDT1, MCM3, MCM6, CDC45 und HP1 an Fragment B nachgewiesen werden. Während der terminalen Differenzierung werden ORC1, CDC6, CDT1 und CDC45 von der preRC-Bindungsstelle entfernt, ORC2-5, MCM3, MCM6 und HP1 bleiben an Fragment B gebunden. Die Bindung von preRC-Proteinen an Fragment B sollte durch Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) in vitro detailliert untersucht werden. Dazu mussten zunächst preRC-Proteine nativ aus dem Kernextrakt proliferierender FM3A-Zellen durch Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie angereichert werden. Proteine in den Fraktionen B4 bis B12 bilden einen DNA-Protein-Komplex mit Fragment B. Die ATP-Abhängigkeit der Bildung des DNA-Protein-Komplexes wurde nachgewiesen. Die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes erfolgt sequenzspezifisch an Fragment B. Durch Zugabe spezifischer Antikörper gegen ORC3 und CDT1 zur Bindungsreaktion konnte die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung des DNA-Protein-Komplexes unabhängig von ATP-Hydrolyse erfolgt und dass Diadenosin-Tetraphosphat (Ap4A) die Bindung von preRC-Proteinen an die DNA nicht signifikant stimuliert. Zur Eingrenzung der preRC-Bindungsstelle wurden sowohl am 5´- als auch am 3´-Ende partiell deletierte B-Fragmente eingesetzt. Mit den um 100 bp verkürzten Fragmenten kann der DNA-Protein-Komplex weiterhin gebildet werden. Deletionen von 200 bp entweder vom 5´- oder 3´-Ende verhindern hingegen die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes. Auf einem 119 bp langen Fragment (-2365 bis -2247), das zentral in Fragment B gelegen ist, kann sich der DNA-Protein-Komplex in einer ATP-stimulierten Weise wiederum ausbilden. Die Analyse dieses Bereiches zeigte, dass sich darin zwei auffällige 9 bp-Sequenzen (CTCGGGAGA) befinden, die im Abstand von 63 bp wiederholt werden (-2343 bis -2335; -2280 bis -2272) und die durch die 200 bp-Deletionen ganz oder teilweise eliminiert wurden. Durch ortsgerichtete Mutagenese mittels PCR wurden innerhalb dieser 9 bp-Wiederholungen die Basen C zu A, T zu G und umgekehrt ausgetauscht. In vier sukzessiven Klonierungen wurden je 4 bp ersetzt (S1 bis S4), wobei die erhaltenen Konstrukte als Ausgangs-DNA für die nachfolgende Klonierung dienten. Die Substitutionen S1, S2 und S3 beeinträchtigten die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes im Wesentlichen nicht. Wurden jedoch 8 bp in beiden 9 bp-Wiederholungen ersetzt (S4), war die Ausbildung des DNA-Protein-Komplexes nahezu vollständig inhibiert. S4 hat außerdem eine leichte reduzierte elektrophoretische Mobilität der proteinfreien DNA-Fragmente zur Folge. Vermutlich stellen die 9 bp-Sequenzen jedoch keine Konsensus-Sequenz für die Bindung der preRC-Proteine per se dar, sondern haben vielmehr Effekte auf die Ausbildung spezifischer Sekundär-Strukturen, die wiederum das Binden der preRC-Proteine an diese Region im OBR der murinen rRNA-Gene erlauben könnten. N2 - One task of this work was to analyse the composition of preRCs in proliferating and terminally differentiated cells with the aim to monitor irreversible changes in the nature of preRCs upon transition from proliferation to differentiation. Murine C2C12 cells were used which can be triggered to become terminally differentiated myotubes by exposure to low mitogen medium. Differentiation was assessed by morphological examination. FACS analyses and BrdU incorporation showed the cessation of dna replication. Fluctuation of replication proteins during terminal differentiation was examined. Same amounts of nuclear and cytoplasmatic extracts, respectively, prepared from proliferating, confluent or differentiating C2C12 cells were resolved by SDS-PAGE. Immunoblot analyses were carried out using specific antibodies. After 132 h in DM ORC1, CDC6, MCM6 and geminin could not be detected in terminally differentiated myotubes at all, whereas ORC2, ORC3, MCM3, CDT1 and CDC45 were detectable, albeit at lower levels than in proliferating myoblasts. Levels of replication proteins in serum starved G0 phase cells and cells which were induced to reenter the cell cycle upon serum readdition, were investigated. Levels of replication proteins decreased in quiescent C2C12 and 3T3 cells, although different proteins were reduced to various extends. Reactivation of quiescent cells, but not terminally differentiated myotubes, resulted in reexpression of replication proteins. Chromatin immunoprecipitation analyses (ChIP) were performed comparing chromatin of proliferating cells to that of differentiated cells. A preRC binding site is localized within the OBR of the murine rRNA genes from position -2519 to -2152 (fragment B) upstream of the transcription start site. The in vivo binding of ORC1-5, CDC6, CDT1, MCM3, MCM6, CDC45 and HP1 to fragment B was observed in proliferating C2C12 cells. During terminal differentiation of C2C12 cells ORC1, CDC6, CDT1 and CDC45 are released. ORC2-5, MCM3, MCM6 and HP1, however, remain bound to fragment B. The removal of essential regulatory replication proteins like ORC1, CDC6, CDT1 and CDC45 from chromatin in terminally differentiated cells might contribute to the establishment and maintenance of an “out-of-cycle” state. One aim of the present work was to further characterize the binding of preRC proteins to fragment B in vitro by electrophoretic mobility shift assays (EMSAs). For that purpose, preRC proteins were enriched from nuclear extracts of proliferating FM3A cells by a combination of ion-exchange and gelfiltration chromatography. Purified proteins of fractions B4 to B12 caused a DNA/protein complex with fragment B. Purified preRC proteins bind exclusively to fragment B. When ORC3 and CDT1 antibodies were added to the DNA/protein binding reaction, formation of the DNA/protein complex was reduced, indicating that these proteins may play a role in formation of this DNA/protein complex. It was shown that this DNA/protein complex is formed independently of ATP hydrolysis and that diadenosine tetraphosphate (Ap4A) does not significantly stimulate binding of preRC proteins to DNA. In order to further narrow down the preRC binding site, EMSAs were performed using fragments shortened by 100 bp and 200 bp, respectively, at the 3´- or 5´-end. The DNA/protein complex is formed with both fragments truncated 100 bp at each end. However, if 200 bp are deleted, no shifts were observed, neither with fragment 5.200 nor with 3.200. On a central 119 bp fragment (-2365 to -2247) the DNA/protein complex is formed in an ATP-stimulated manner. Two conspicuous 9 bp sequence elements, CTCGGGAGA, were observed which are repeated at intervals of 63 bp (-2343 to -2335; -2280 to -2272). The sequence of these elements was altered by introducing C to A, T to G and vice versa substitutions. 4 successive substitutions of 4 bp each were constructed and the constructs were used as template DNA for subsequent mutageneses. Substitutions S1, S2 or S3 did not affect formation of the DNA/protein complex. If, however, 8 bp out of 9 bp in both sequence elements were substituted (S4), formation of the DNA/protein complex is abrogated. A naked S4 DNA fragment migrates distinctly slower than WT and S1-S3 suggesting that the secondary structure of the DNA is altered as a result of nucleotide substitutions. Probably, the 9 bp repeats do not constitute a consensus binding site per se, but rather have effects on formation of specific secondary DNA structures which in turn allow binding of preRC proteins to this region of murine rDNA. KW - Replikation KW - Proteine KW - Replikationsursprung KW - Proliferation KW - Zelldifferenzierung KW - DNA-Replikation KW - Proliferation KW - terminale Differenzierung KW - präreplikativer Komplex KW - Origin KW - DNA replication KW - proliferation KW - terminal differentiation KW - prereplicative complex KW - origin Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15263 ER - TY - THES A1 - Wagner, Martin T1 - Proliferationsverhalten kultivierter Mesangialzellen und glatter Gefäßmuskelzellen nach Stimulation mit Angiotensin II und atherogenen Lipoproteinen : Rezeptorbeteiligung T1 - Induction of proliferation by angiotensin II and atherogenic lipoproteins in mesangial cells and vascular smooth muscle cells N2 - Hintergrund: Atherogene Lipoproteine und Angiotensin II sind an der Entstehung von Athe-rosklerose und Glomerulosklerose maßgeblich beteiligt. Sowohl klinische Studien als auch experimentelle Beobachtungen weisen auf eine Interaktion beider Substanzen im Sinne ei-ner Potenzierung ihrer Einzeleffekte hin. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Auswirkun-gen von Angiotensin II und nativen und oxidierten Low Density Lipoproteinen (natLDL bzw. oxLDL) auf den Zellzyklus von kultivierten vaskulären Gefäßmuskelzellen (BSMC) und Me-sangiumzellen (NHMC) im Sinne einer Proliferationsänderung unter anderem durch eine Beeinflussung der beteiligten Rezeptoren. Ebenso wurde die Interaktion von oxidierten LDL mit der Zelle sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt. Methoden: Die Proliferation wurde sowohl mittels radioaktiv markiertem 3H-Thymidin-Einbau als auch durch den MTT-Assay, der auf der photometrisch messbaren Umwandlung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tetrazoliumbromid beruht, quantifiziert. Die Rezepto-ren wurden auf Proteinebene durch Western Blot Analysen nachgewiesen. Zum Nachweis der Interaktion von oxidierten LDL mit den inkubierten Zellen wurden die oxidierten LDL mit-tels 3,3’-Dioctadecyclindocarbocyanin (DiI) fluoreszenzmarkiert. Visualisiert werden konnte die Interaktion in der Histochemie, die quantitative Bestimmung der DiI-oxLDL-Aufnahme erfolgte durch fluorometische Messung. Ergebnisse: Sowohl native als auch oxidierte LDL steigerten die Proliferation in BSMC und NHMC. In Myozyten lag das Maximum im Tritiumeinbau bei ca. 450% bezogen auf die Kon-trollzellen bei 10 µg/ml natLDL, und bei ca. 350% bei 20 µg/ml oxLDL. In NHMC fiel der An-stieg der Proliferation weniger stark aus, ca. 150% bei 30 µg/ml natLDL und ca. 180% bei 3 µg/ml oxLDL. Im MTT-Assay konnten signifikante Dosis-Wirkungs-Beziehungen erstellt wer-den, die absolute Proliferationssteigerung war jedoch geringer: BSMC 120%, NHMC 140%. Fluoreszenzmarkierte oxLDL wurden über Endozytose in einem konzentrations- und zeitab-hängigen Prozess mit einer Sättigung nach ca. 14 Stunden in die Zellen aufgenommen. Der oxLDL-spezifische LOX-1-Rezeptor konnte jederzeit nachgewiesen werden. Durch Angiotensin II alleine und in Co-Inkubation mit atherogenen Lipoproteinen konnte kei-ne Proliferationsänderung gezeigt werden. Die spezifische Hemmung des AT1-Rezeptors mit Losartan bewirkte ebenfalls keine signifikanten Änderungen. Auch die Inkubation der Zellen mit Agenzien, die die AT1-Rezeptordichte erhöhen sollten, erbrachte im Western Blot keine Veränderungen. Im Vergleich unterschiedlich alter Zellpopulationen ließ sich in höheren Passagen der proliferationsvermittelnde AT1-Rezeptor kaum nachweisen, jedoch war in die-sen Zellpopulationen der antagonistisch wirkende AT2-Rezeptor stark exprimiert. Zusammenfassung: Atherogene Lipoproteine beeinflussen zeit- und konzentrationsabhängig möglicherweise über eine LOX-1 vermittelte Endozytose den Zellzyklus von kultivierten glat-ten Muskelzellen und Mesangiumzellen im Sinne einer Proliferationssteigerung. Die uneinheitlichen Effekte von Angiotensin II auf die Proliferationsrate können durch die starken Expressionsschwankungen der antagonistisch wirkenden Angiotensin II-Rezeptor-Subtypen (AT1 und AT2) vor allem in unterschiedlich alten Zellpopulationen erklärt werden. Wodurch diese Expressionsveränderungen verursacht sind, ist gegenwärtig noch unklar, ebenso, ob diese Effekte im atherosklerotischen Plaque in vivo nachweisbar und pathophy-siologisch bedeutsam. N2 - Background: Atherogenic lipoproteins and angiotensin II play important roles in the devel-opement of atherosclerosis and glomerulosclerosis. Experimental observations and clinical studies suggest that lipoproteins and Angiotensin II exhibit potentiated effects if incubated together. The current investigation examined the effects of Angiotensin II, native and oxi-dized low density lipoproteins (natLDL, oxLDL), and the receptors of Angiotensin II and oxLDL on the proliferation of vascular smooth muscle cells (BSMC) and mesangial cells (NHMC). Methods: Proliferation was quantified by 3H-thymidine incorporation and by a colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide assay. The expression of the in-volved receptors was determined by Western blot analysis. OxLDL were labeled with fluo-rescent 3,3’-Dioctadecyclindocarbocyanin (DiI) to visualize cell interaction in histochemistry and to quantify the internalisation process in a fluorometric assay. Results: Native and oxidized LDL lead to an increased proliferation in BSMC and NHMC. Maximum tritium incorporation in BSMC was 450% compared to control cells at 10 µg/ml natLDL and 350% at 20 µg/ml oxLDL. In NHMC the increased proliferation was lower, i.e. 150% at 30 µg/ml natLDL and 180% at 3 µg/ml oxLDL. In the colorimetric tetrazoliumbromide assay sensitive dose-effect responses with a maximum at 120% in BSMC and 140% in NHMC were observed. DiI-labeled oxLDL were internalised via endocytosis in a time and concentration dependent fashion with a saturation point after 14 hours. The oxLDL-specific LOX-1-receptor could be detected at all stages during the experiments. No consistant biological effects on proliferation were observed when angiotensin II was incu-bated alone or in combination with atherogenic lipoproteins. Similarly, the specific inhibition of the AT1 receptor with Losartan induced no changes in proliferation. Finally, the incubation with various agents reported previously to increase or decrease the expression of the AT1 receptor in the Western blot resulted in no significant changes. Younger and older cell popu-lations were compared and a high expression of the proliferation-inducing AT1-receptor in younger populations was found contrasting with high expression of the proliferation-inhibiting AT2-receptor in older populations. Conclusion: Atherogenic lipoproteins induce in a time and concentration dependent fashion an increased proliferation in smooth muscle cells and mesangial cells, presumably via LOX-1 mediated endocytosis. The heterogenous effects of Angiotensin II may be explained by the counterregulatory expression of the antagonistic angiotensin II receptor subtypes (AT1 and AT2), particularly in older cell populations. KW - Arteriosklerose KW - Glomerulosklerose KW - Proliferation KW - LDL KW - Angiotensin II KW - arteriosclerosis KW - glomerulosclerosis KW - proliferation KW - LDL KW - angiotensin II Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15589 ER -