TY - THES A1 - Schmitt, Ulrich T1 - Cyclodextrine als chirale Selektoren in der kapillarelektrophoretischen Enantiomerentrennung T1 - Cyclodextrins as chiral selectors in capillary electrophoretic separation of enaantiomers N2 - Die vielfältigen isomeren Substanzen, die in dieser Arbeit getrennt wurden, zeigen, dass die cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese eine sehr leistungsfähige Technik für die Trennung von Enantiomeren darstellt. Als kritisch erweist sich jedoch das Auffinden des richtigen Cyclodextrins bzw. dessen optimale Konzentration. Die Vorhersagbarkeit dieser Parameter ist noch zu gering, um hier vor den ersten Versuchen alleine anhand der Struktur des Moleküls sichere Aussagen machen zu können. So sind zur Zeit noch Versuchsreihen mit verschiedenen Cyclodextrinen und Bedingungen nötig, wie sie in dieser Arbeit durchgeführt wurden. Für die Zukunft wäre es wünschenswert, durch das Sammeln von mehr Erfahrungen und Ergebnissen, wie sie hier gezeigt wurden, schon möglichst direkt aus den Strukturen der zu trennenden Zielmoleküle eine Aussage über die Beschaffenheit des Cyclodextrins oder der CE-Methode machen zu können. Von sechs verschiedenen schwach basischen Thiobarbituratracematen konnten fünf erfolgreich in ihr Enantiomeren getrennt werden. Unter den fünf erfolgreich getrennt Barbituraten waren zwei am Stickstoff alkyliert und ein weiteres sowohl am Stickstoff als auch am Schwefel. Die Thiobarbiturate, die am Stickstoffatom keinen Substituenten tragen, konnten mit -CD am besten getrennt werden (RS > 6). Hingegen konnte für die beiden nur am Stickstoff alkylierten Barbituratemit mit -CD und HDMS jeweils Auflösungen über RS = 6 erzielt werden. Für den in der Erdbeere vorhandene Schlüsselaromastoff 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, Furaneol, konnte eine CE-Methode entwickelt werden, die es zum einen ermöglicht, die Enantiomere vollständig zu trennen, und zum anderen so beschaffen ist, dass es bei der Trennung selbst zu keiner Racemisierung kommt, wie es bei der bisher verwendeten Gaschromatographie der Fall war. Die CE-Methode machte es erstmalig möglich, die enantioselektive Biosynthese von Furaneol in Erdbeerproteinextrakten nachzuweisen. Zusätzlich wurde noch die Racemisierungsgeschwindigkeit von einem angereichertem Gemisch bei vier verschiedenen pH-Werte getestet, was für weitere Arbeiten mit Furaneol-Proben von Bedeutung ist. Die Racemisierungsgeschwindigkeit erwies sich für den pH-Bereich von 3.8 bis 5 am langsamsten. Im neutralen Bereich wurde die schnellste Racemisierung beobachtet. Bei den Experimenten mit Atropin und dem verwandten Homatropin sollte geprüft werden, ob der Einsatz sulfatierter Cyclodextrine von vier verschiedenen Herstellern zu identischen Ergebnissen führt. Es konnten anhand einer kritischen Trennung gezeigt werden, dass dies nicht der Fall ist. Die Trennleistung der Cyclodextrine in Bezug auf den Vergleich Atropin/Homatropin war hierbei sehr ähnlich. Ein bei diesen Arbeiten zusätzlich entstandener Peak konnte eindeutig einem Zerfallsprodukt des Atropins, der Tropasäure, zugeordnet werden. Mit Hilfe von Experimenten mit den Atropisomeren von 1,1′-Binaphthalin-2,2′-diyl-phosphat sollte erprobt werden, ob eine Charakterisierung von randomisiert substituierter CDs über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) ausreicht, um beim erneuten Einsatz eines vergleichbaren Produktes reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen. Die Trennleistung von unterschiedlich randomisiert substituierten acetylierten und methylierten Cyclodextrinen wurde hierzu getestet, und mit der von -CD und Heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)--cyclodextrin, bzw. deren Gemischen in Verhältnis von 1:9 bis 9:1 verglichen. Der Vergleich dieser Messergebnisse führte zu dem Schluss, dass eine einfache Charakterisierung randomisiert substituierter Cyclodextrine über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) nicht ausreicht, um reproduzierbare Ergebnisse beim Einsatz solcher Cyclodextrine zu erreichen. Die Aufnahme von Massenspektren ermöglichte es hingegen, randomisiert substituierte CDs aussagekräftig zu charakterisieren. Will man eine CE-Methode validieren, in der ein randomisiertes Cyclodextrin zu Einsatz kommt, so sollte man dieses mittels Massenspektroskopie charakterisieren und sich dessen bewusst sein, das die Validierung nur für diese eine Charge des Herstellers bzw. für Chargen mit vergleichbaren Massenspektren Gültigkeit besitzt. Für das im Arbeitskreis Bringmann racemisch synthetisierte 2-Hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin sollte eine Trennmethode für die Atropisomere entwickelt werden, da für die Zukunft eine enantioselektive Synthese geplant ist. Unter Einsatz der chiralen Selektoren Heptakis-(6-sulfato)--CD (HS) und Heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)--cyclodextrin (HDAS) konnten zwei Trennmethoden gefunden werden, die bei einer jeweiligen Cyclodextrinkonzentration von 15 mM zu einer guten Trennung der Enantiomeren führte. Dies ermöglicht eine Quantifizierung des Enantiomerenüberschuß (ee) für eine nicht-racemische Syntheseroute. N2 - The manifold of isomeric substances being separated within the frame of this thesis shows the power of cyclodextrin-modified capillary electrophoresis concerning to the separation of enantiomers. The major problem is still to find the appropriate cyclodextrin respectively the optimum concentration. The possibility to predict these parameters only on the basis of the molecule structure is still too small. Thus, it is still necessary, to perform experiments to find the suitable cyclodextrin. It would be desirable for the future, to make this possible by collecting more experiences and information. The enantiomers of five of six weakly basic thiobarbiturates could be successfully separated. Two of these five barbiturates were N-substituted, one N-substituted as well as S-substituted. The three N-substituted thiobarbiturates characterized by phenyl- and ethyl-substituent in five positions being the chiral centre. In the two other molecules the chiral centre is located in the side chain, bound at the five position. Furthermore the dependence of the cyclodextrin concentration on the resolution power of five commercial cyclodextrins could be shown. The concentration leading to the best resolution was varying from the smallest (1 mmol/l) to the highest (18 mmol/l) concentrations which were used. The thiobarbiturates without a substituent at the nitrogen atom could be separated best by using -CD (RS > 6). Whereas the two barbiturates carrying a N-alkyl substituent reach their best resolution with -CD and HDMS (both RS > 6). Beside the absolute maxima local maxima were observed. For the key flavouring substance of the strawberry, 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, furaneol, a CE-method was developed, which makes it possible to separate the enantiomers without racemisation, which happens when using gas chromatography. This makes it possible to verify enantioselective biosynthesis of furaneol in strawberry protein extract for the first time. Additional the rate of racemisation of enantiomeric enriched samples at four different pH-values were tested, which is important for further experiments with furaneol. The studies on atropine and the related homatropine were performed to show, whether four sulphated cyclodextrins of four different manufacturers lead to identical results. By means of a critical separation the differences of the resolution powers could be shown. It varies from no resolution over separation 1/3 of the peak to 2/3. The resolution power to the atropine enantiomeres was comparable to the one of homatropine. An additional peak, which was found in the tests, was assigned to a decomposition product of atropine being tropic acid. By means of a study with the atrop-isomers of 1,1′-binaphthalin-2,2′-diyl-phosphate it was checked, whether the characterisation of randomly substituted cyclodextrins via the average molecular degree of substitution (MS) is sufficient to obtain comparable results in CD-modified CE. The resolution power of different randomly substituted acetylated and methylated cyclodextrins were tested and compared to the one of -CD and heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)--cyclodextrin and their mixtures in a ratio of 1:9 to 9:1. The comparison of these results shows, that a simple classification of randomly substituted cyclodextrins by the average molecular degree of substitution (MS) is not sufficient to reproduce the results of measurements done with such kind of cyclodextrins. To validate a CE-method, in which a randomly substituted cyclodextrin is used, a mass spectrum of this cyclodextrin should be recorded and it should be clear, that the validation is effective only for this batch of the producer or for batches which have comparable mass spectra. For 2-hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin, which was racemically synthesized in the group of Prof. Bringmann, a separation method for the atop-isomers was developed, because a enantioselective synthesis is planed in the future. Using either heptakis-(6-sulfato)--CD (HS) or heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)--cyclodextrin (HDAS) as chiral selectors at a cyclodextrin concentration of 15 mM a good separation was obtained. This makes a quantification of the enantiomeric excess (ee) for enantioselective synthesis routes possible. KW - Enantiomerentrennung KW - Kapillarelektrophorese KW - Cyclodextrine KW - Kapillarelektrophorese KW - Cyclodextrin KW - Enantiomere KW - capillary electrophoresis KW - cyclodextrin KW - enantiomer Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10043 ER - TY - THES A1 - Eckstein, Susanne T1 - Stimulation humaner V-Gamma-9-V-Delta-2-T-Lymphozyten : Untersuchungen zur Wirkung Stickstoff-haltiger Bisphosphonate und zu bakteriellen Phosphoantigenen T1 - Stimulation of human Vgamma9 Vdelta2 T Lymphocytes: Effects of Nitrogen Containing Bisphosphonates and Phosphoantigens N2 - In der vorliegenden Arbeit werden Studien zu verschiedenen Aspekten der Stimulation von humanen Vg9Vd2-T-Lymphozyten vorgestellt. Ein Schwerpunkt war die Charakterisierung der Erkennung von Bisphosphonaten durch Vg9Vd2-T-Zellen. Weder die Alkylmonophosphonate Ethyl- und Propylphosphonat noch 3-Aminopropylphosphonat bewirkten eine Stimulation von Vg9Vd2 T-Lymphozyten. Anscheinend ist also für die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität von Aminobisphosphonaten das Vorhandensein sowohl der Methylenbisphosphonat-Gruppe als auch des Amino-Stickstoffs entscheidend. Es wurden verschiedene Pamidronat-Derivate untersucht, die sich durch Substituenten am Stickstoffatom unterscheiden. Die meisten dieser Verbindungen konnten Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren, die Art der Substituenten hatte aber großen Einfluss darauf, welche Konzentration des jeweiligen Bisphosphonats für eine gd-T-Zell-Antwort nötig war. Besonders negativ auf die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität wirkte sich aus, wenn das Stickstoffatom Teil einer Säureamidbindung war. Das lässt darauf schließen, dass die Gegenwart einer positiven Ladung (durch Protonierung des Stickstoffatoms) von Bedeutung für die Bioaktivität dieser Verbindungen ist. Beim Vergleich verschiedener Bisphosphonate mit stickstoffenthaltenden Heteroaromaten (Fünfringe mit ein bis drei Stickstoffatomen) zeigte sich, dass sowohl die Position des basischen Stickstoffatoms im Ring als auch Art und Position von Ringsubstituenten Einfluss auf deren gd-T-Zell-stimulierende Aktivität haben. Es ergaben sich Hinweise, dass sich eine gesteigerte Neigung eine positive Ladung in der Seitenkette zu tragen bei diesen Verbindungen genau wie bei Aminobisphosphonaten günstig auf das gd-T-Zell-aktivierende Potential auswirkt. Durch Behandlung mit Zoledronat wurde die monozytäre Zelllinie THP-1 stimulierend für Vg9Vd2-T-Zellen. Auch weitere Zelllinien und Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) konnten nach Vorinkubation mit Zoledronat Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren. Dabei genügten bei den PBL deutlich geringere Zoledronat-Konzentrationen um einen Effekt zu erzielen als bei den untersuchten Zelllinien. Für die indirekte Stimulation von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat mittels THP-1 Zellen oder PBL war Zell-Zell-Kontakt zwischen den präsentierenden Zellen und den gd-T-Zellen Voraussetzung. Die Anwesenheit von alkalischer Phosphatase hatte keine Auswirkungen auf die gd-T-Zell-Aktivierung durch Zoledronat. Dies spricht dafür, dass Vg9Vd2-T-Zellen Oberflächenstrukturen auf anderen Zellen erkennen und dass freie Phosphoantigene bei der gd-T-Zell-Stimulierung durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate keine Rolle spielen. Wurde die Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat in Gegenwart von Saponin, einem Detergenz das die Durchlässigkeit der Zellmembran reversibel erhöht, durchgeführt, reichten deutlich niedrigere Konzentrationen des Bisphosphonats aus, um die THP-1 Zellen stimulierend für gd-T-Lymphozyten zu machen. Das ist ein Hinweis darauf, dass für die Aktivierung von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat intrazelluläre Vorgänge in den „antigenpräsentierenden“ Zellen verantwortlich sein könnten. Beim Vergleich verschiedener N-BPs hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber gd-T-Zellen und ihrer antiresorptiven Potenz ergab sich eine erstaunlich gute Korrelation. Dies könnte darauf hinweisen, dass beide Effekte durch den gleichen Mechanismus – die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase – zustande kommen. Die Gegenwart von Farnesol oder Geranylgeraniol während der Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat verringerte deren gd-T-Zell-stimulierendes Potential nicht, so dass vielleicht nicht die Verarmung an längerkettigen Isoprenoiden sondern die Anreicherung von Vorläufern zu Veränderungen in den Zellen führt, die diese schließlich erkennbar für Vg9Vd2-T-Zellen machen. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit einige Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen durchgeführt. Mittels einer selektiven HPLC-MS/MS-Methode gelang uns in einer E. coli-Probe der Nachweis eines Vg9Vd2-T-Zell-stimulierenden Pyrophosphats mit der molekularen Masse von 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat, einem Phosphoantigen das in Mykobakterien gefunden worden war (Belmant und Mitarbeiter, 1999). Eine weitere Strukturaufklärung war aufgrund der äußerst geringen Konzentration des Phosphoantigens nicht möglich. 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP) ist ein Zwischenprodukt des 2-C-Methylerythritol-4-phosphat- (MEP) Wegs der Isoprenoidbiosynthese. Es wird in manchen Bakterien – z. B. Corynebacterium ammoniagenes – bei oxidativem Stress verursacht durch Benzylviologen (BV) akkumuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Extrakte aus C. ammoniagenes, die in Gegenwart von BV kultiviert wurden, in einem höherem Maße Vg9Vd2-T-Zellen stimulieren als Proben von Bakterien, die ohne BV-Zusatz wuchsen; MEcPP wirkte selbst nicht als Phosphoantigen. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass bakterielle Phosphoantigene mit dem MEP-Weg assoziiert sind. N2 - The present work focuses on different aspects of human Vg9Vd2 T lymphocyte stimulation. A main focus of this work was the characterisation of bisphosphonate recognition by Vg9Vd2 T cells. Neither the alkyl monophosphonates ethyl and propyl phosphonate nor 3-aminopropylphosphonate were able to stimulate Vg9Vd2 T lymphocytes. Apparently both the methylene bisphosphonate group and the amino group are crucial for the Vg9Vd2 T cell stimulating ability of aminobisphosphonates. We examined pamidronate derivates bearing different substituents at the nitrogen atom. Most of these compounds activated Vg9Vd2 T cells. But the nature of the substituent greatly influenced the bisphosphonate concentration necessary for gd T cell stimulation. When the nitrogen was part of an amide bond, there was a pronounced negative effect on the Vg9Vd2 T cell stimulating capacity. It can be concluded that the bioactivity of bisphosphonates depends on the presence of a positive charge (through protonation of the nitrogen atom). Comparing different bisphosphonates with nitrogen containing heteroaromatic side chains (five membered rings containing one to three nitrogen atoms) we found that the position of the basic nitrogen in the ring as well as the nature and position of ring substituents influenced their gd T cell stimulating activity. There was evidence that a higher tendency towards a positive charge in the side chain had a positive effect on the Vg9Vd2 T cell activating potential of these compounds, as we also found for aminobisphosphonates. Zoledronat pulsed cells of the monocytic cell line THP-1 stimulated Vg9Vd2 T cells. Other cell lines and peripheral blood lymphocytes (PBL) also activated Vg9Vd2 T cells after incubation with zoledronate. There was a distinctly lower concentration of zoledronate needed for PBL to become stimulatory as for the analyzed cell lines. Cell-cell-contact between the presenting cells and the Vg9Vd2 T cells was necessary for the indirect stimulation by zoledronate pulsed THP-1 cells or PBL. Alkaline phosphatase did not abolish the gd T cell activation by zoledronate. That points to the possibility that Vg9Vd2 T cells recognize surface structures on other cells and that free phosphoantigens are not involved in gd T cell stimulation by nitrogen containing bisphosphonates. When THP-1 cells were incubated with zoledronic acid in the presence of saponin, a detergent that reversibly enhances the permeability of the cell membrane, the bisphosphonate concentration needed for rendering THP-1 cells gd T cell stimulating was clearly reduced. That indicated that intracellular events caused by zoledronate (and other nitrogen containing bisphosphonates) in the “antigen presenting cells” could result in their stimulating activity. Comparing the gd T cell stimulating activity of various N-BPs with their antiresorptive potency produced an amazingly good correlation. This could indicate that both effects are based on the same mechanism – the inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase. The presence of farnesol or geranylgeraniol during the incubation of THP-1 cells with zoledronate did not diminish their gd T cell stimulating potential. So maybe not the depletion of longer chain isoprenoids but the accumulation of precursors results in changes that finally render the cells recognisable by Vg9Vd2 T lymphocytes. Within the scope of this work we also conducted experiments concerning bacterial phosphoantigens. Using a selective HPLC-MS/MS method we detected in Escherichia coli a Vg9Vd2 T cell stimulating pyrophosphate with the molecular mass of 3-Formyl-1-butyl pyrophosphate, a phopsphoantigen found in mycobacteria (Belmant et al., 1999). Due to the exceedingly low concentration of the phosphoantigen no further structure determination was possible. 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) is an intermediate of the 2-C-Methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway of isoprenoid biosyntheses. In some bacteria like Corynebacterium ammoniagenes this compound is accumulated under conditions of oxidative stress caused by benzyl viologen (BV). We showed that C. ammoniagenes extracts from bacteria cultivated in the presence of BV had a higher Vg9Vd2 T cell stimulating capacity than from bacteria growing without addition of BV. MEcPP itself was not a phosphoantigen. That was further evidence for the association of bacterial phosphoantigens with the MEP-pathway. KW - T-Lymphozyt KW - Diphosphonate KW - Antigen KW - gamma delta KW - T-Zellen KW - T-Lymphozyten KW - Bisphosphonate KW - Phosphoantigene KW - gamma delta KW - T cells KW - T lymphocytes KW - bisphosphonates KW - phosphoantigens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12140 ER - TY - THES A1 - Marquardt, Karin T1 - Untersuchungen zum Zerkleinerungsverhalten kristalliner Stoffe in einer Spriralstrahlmühle T1 - Investigations of the breakage behaviour of cristal materials in a spiral jet mill N2 - Die Feinheit von Mahlprodukten, die durch Beanspruchung in einer Luftstrahlmühle erreicht wird, ist immer das Resultat von Zerkleinerungs- und Sichtungsprozessen in der Mahlkammer. Bei hohem Eintrag von Mahlenergie und unter dem Einfluss von großen Zentrifugalkräften in der Mahlkammer können feinste Mahlprodukte mit enger Korngrößenverteilung erzielt werden. Es ist jedoch nicht nur entscheidend, dass sehr feine, eng verteilte Mahlprodukte durch Luftstrahlmahlung geschaffen werden können. Mindestens genauso wichtig ist es, dass die Korngrößenverteilungen der Mahlprodukte reproduzierbar sind. Reproduzierbar sind die Mahlergebnisse allerdings nur dann, wenn die Abläufe in der Mahlkammer konstant gehalten werden können. Bevor Aussagen über den Mahlvorgang in der Luftstrahlmühle getroffen werden, muss eine Prozessvalidierung vorgenommen werden. Ansonsten sind keine Modellberechnungen, die einen Zusammenhang zwischen Mahleinstellungen und Korngrößenverteilungen von Mahlprodukten herstellen, möglich. Alle Untersuchungen zum Bruchverhalten von Mahlgütern wurden durchgeführt an einer Luftstrahlmühle vom Typ Fryma JMRS 80, die bereits von Rief [40] optimiert worden war. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Mahl- und Injektordrücke auch zu hohen Kammerdrücken im stationären Betriebszustand führen. Große Gutaufgaben pro Zeiteinheit und ein breiter Mahlspalt sind dagegen mit niedrigeren Kammerdrücken verbunden. Diese Ergebnisse stimmen gut mit bereits von Muschelknautz [38, 39] und Bauer [34] gewonnenen Erkenntnissen überein. Bei hohen Mahl- und Injektordrücken sind die Strömungsgeschwindigkeiten in der Mahlkammer und damit auch der Mahlkammerdruck relativ groß. Wird dabei jedoch viel Mahlgut pro Zeiteinheit zugeführt, kommt es zu einer starken Abbremsung der Strömung, da das zirkulierende Gas durch Übertragung von Energie auf die Partikel in der Mahlkammer selbst an kinetischer Energie verliert; der Druck in der Mahlkammer sinkt. Die Größe des Mahlspalts hat Einfluss auf den Kammerdruck, da sie bestimmt, wie groß der Unterdruck und damit der Sogeffekt über dem Tauchrohr ist. Ist der Mahlspalt breit, nimmt der Sog aus der Mahlkammer ab. In der Folge verweilt das Mahlgut länger in der Kammer; die Feststoffmenge in der Mahlkammer nimmt zu. Dadurch wird die Strömung in der Mahlkammer stark abgebremst, der Druck in der Kammer sinkt. Harte Stoffe von hoher Dichte und mit elastischem Materialverhalten führen zu niedrigeren Kammerdrücken im konstanten Betriebszustand als weiche Stoffe von niedriger Dichte und mit inelastischem Materialverhalten. Mit Hilfe von Korngrößenanalysen konnte gezeigt werden, welchen Einfluss einzelne operative Parameter auf die Feinheit der Mahlprodukte haben. Am Beispiel von Ascorbinsäure, Natriumascorbat, Lactose und Natriumchlorid wurde untersucht, wie sich die Förderrate, der Mahl- und Injektordruck und die Größe des Mahlspalts auf die Produktfeinheit auswirken. Ein Vergleich der verschieden Mahlgüter ermöglichte es, abzuschätzen, inwieweit sich mechanische Eigenschaften auf den Verlauf des Mahlprozesses auswirken. Mit zunehmender Gutaufgabe pro Zeiteinheit werden die Korngrößenverteilungen der Mahlprodukte breiter und hin zu größeren Korngrößen verschoben. Steigender Mahl- und Injektordruck und ein größer werdender Mahlspalt führen dagegen zu feineren und enger verteilten Mahlprodukten. Während Förderrate und Mahl- bzw. Injektordruck die absolut zur Zerkleinerung verfügbare Energie bestimmen, nimmt die Größe des Mahlspalts eher Einfluss auf die Beanspruchungsdauer der Mahlgutpartikel. Da bei breitem Mahlspalt der Unterdruck über dem Tauchrohr und damit der Sog aus der Mahlkammer reduziert wird, nimmt mit wachsendem Mahlspalt die Verweildauer der Mahlgutpartikel in der Mahlkammer zu; das gewonnene Mahlprodukt wird feiner und enger verteilt. Experimente ergaben, dass sich Ascorbinsäure am leichtesten zerkleinern lässt, gefolgt von Natriumascorbat, Natriumchlorid und zuletzt Lactose. Je kleiner das Elastizitätsmodul und je größer die Härte und die Dichte eines Mahlguts, desto energieaufwändiger ist die Zerkleinerung. Mit Erfolg konnten die operativen Parameter Förderrate, Mahldruck und Mahlspalt mit den charakteristischen Größen der Mahlproduktverteilungen korreliert werden. Ebenso gelang es, die Materialeigenschaften Härte, Elatizitätsmodul und Dichte in die Korrelation mit einzubeziehen. Für alle mathematischen Rechenansätze wurden Modelle zweiter Ordnung gewählt, da diese nicht zu kompliziert sind und dennoch den Prozess sehr gut beschreiben. N2 - It was the aim of this study to investigate the breaking behaviour of different materials a spiral jet mill Type Fryma JMRS 80 modified by Rief. It has been shown that high grinding and high particle feed pressures result in high pressures inside the milling chamber in the stationary state. In contrary a high feed rate and a wide slit width lead to a lower pressure. These results agree to those of Muschelknautz [38, 39] and Bauer [34]. High milling and high feed pressures are connected with a high flow velocity. In consequence the pressure inside the milling chamber increases. The flow velocity is reduced, if the material to be ground is transported into the milling chamber by high feed rates. Under these circumstances the concentration of solid material inside the milling chamber is high and the circulating gas is decelerated enormously. The slit width influences the pressure inside the milling chamber because it determines the size of the outlet of the mill. If there is a large slit width, the underpressure at the outlet is low. Therefore only finest particles leave the mill and the concentration of solid material inside the milling chamber is high. In consequence the flow velocity and the static pressure decrease. In order to investigate the influence of material properties, the pressures inside the milling chamber measured at constant slit width, feed rate, milling and feed pressure but at different materials are compared. The following trend was recognized: When soft and inelastic materials of low specific density are ground the pressure inside the milling chamber drops less than when hard and elastic materials of high specific density are ground. The pressure indicates the amount of energy input not spent by the acceleration and at least by the fragmentation of particles. The higher is the pressure inside the mill, the finer is the product. Then there rests a high amount of energy not necessary for the acceleration of the material that can be ground at low mechanical load. With decreasing feed rate and with increasing milling pressure the mean particle sizes of all mill products become smaller. In addition the size distributions become narrower. In contrary high feed rates and low milling pressures lead to coarse product sizes with wide particle size distributions. Feed rate, grinding and feed pressure determine the amount of energy per particle available for breakage processes, whereas the slit width determins, how long particles to be ground are stressed in the milling chamber. The slit width at the vortx finder determines the pressure drop inside the milling chamber as well as the underpressure in the vortex. A wide slit width results in a low underpressure and a low suction effect. In consequence the material can be stressed for a longer time and therefore only fine particles are discharged. These results confirm earlier findings [40]. As materials to be ground differ in their hardness, Young’s modulus and specific gravity it is expected that they differ in their breakage behaviour. Experimentally the following phenomenon could be shown: ascorbic acid can be ground best followed by sodium ascorbat, sodium chloride and lactose. Lactose is a very elastic material compared to the other three substances. Sodium chloride excels as a soft and brittle material, but it is characterised by a high specific gravity. Ascorbic acid and sodium ascorbat take an intermediate position. The material properties of these two substances differ only little. Ascobic acid is a bit more elastic but also a bit softer and of a lower density than sodium ascorbat. That means: To reach a certain particle size distribution hard and elastic materials of high density require enormous grinding energies compared with soft and inelastic materials of low density. Two approaches were made: First of all the operational parameters, namely the feed rate, the grinding pressure and the slit width, were correlated to the characteristic values of the particle size distributions of the mill products. With success even material properties such as hardness, elasticity and specific gravity could be included into the statistical calculations. The bases of all calculations are models of second order. Models of second order were chosen for two reasons: they are not too complicated and describe the grinding process quite exaclty. In order to describe the processes in the spiral jet mill by a smaller number of parameters, a second approach was made. In order to reduce the number of influencing parameters dimensionless characteristics were introduced. It was possible to connect the dimensionless charcteristics to a mathematical model of second order. KW - Spiralstrahlmühle KW - Zerkleinerungsverhalten KW - Modellberechnungen KW - Laserbeugungsanalyse KW - spiral jet mill KW - breakage behaviour KW - modelling of a spiral jet mill KW - laser diffraction analysis Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8308 ER - TY - THES A1 - Deubner, Ralph T1 - Quantitative NMR-Spektroskopie zur Reinheitsbestimmung von Arzneistoffen T1 - Quantitative NMR spectroscopy for purity determination of active pharmaceutical ingredients N2 - Quantitative Bestimmungen Anhand verschiedener Substanzen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NMR-Spektroskopie in der Lage ist, Verunreinigungen von Arzneistoffen zu quantifizieren. Für das Antidepressivum Fluvoxamin ist im Arzneibuch eine Ionenpaarchroma-tographie vorgeschrieben, um die Verunreinigung des wirksamen E-Isomers durch das Z-Isomer zu quantifizieren. Ionenpaarchromatographischen Methoden mangelt es häufig an der Robustheit. Eine quantitative Auswertung der NMR-Spektren einer Mischung beider Isomere ist ohne aufwändige Probenvorbereitung möglich. In den 1H-NMR-Spektren der Mischung sind die Signale der Was-serstoffe beider Isomere an Position 2 gut voneinander getrennt. Werden diese quantitativ ausgewertet, dann ist es nach Optimierung insbesondere hinsichtlich der T1-Relaxationszeit möglich, den Anteil des Z-Isomers auf 0,2 % zu begrenzen. Auch für die Bestimmung der Abbauprodukte des Perphenazinenantats konnte gezeigt werden, dass die qNMR eine geeignete Methode darstellt. Perphenazine-nantat kann durch Esterhydrolyse gespalten werden. Zur Auswertung der 1H-NMR-Spektren wird der Vergleich der Integralflächen der Signale der Wasserstoffe an Position 21 des Perphenazins mit dem zusammenfallenden Signal der Wasserstoffe an Position 11 beider Substanzen herangezogen. Es konnte sowohl Perphenazin als Abbauprodukt des Esters als auch Perphena-zinenantat in Perphenazin quantifiziert werden. Zusätzlich kann der Bereich der aromatischen Wasserstoffe zu einer Aussage über die Oxidation genutzt werden. Bei der Oxidation des Schwefels im Phenothiazinring zum Sulfoxid und zum Sul-fon ändern sich die chemischen Verschiebungen der Wasserstoffkerne in diesem Ringsystem. Dadurch wird eine halbquantitative Aussage ermöglicht. Schließlich konnten die beiden Epimere Chinin und Chinidin jeweils als Verunrei-nigung des anderen Chinaalkaloides quantifiziert werden. Auch in diesem Fall lie-gen in den 1H-NMR-Spektren in DMSO-d6 von Mischungen dieser beiden Verbin-dungen Signale weit genug auseinander, um eine Quantifizierung zu ermöglichen. In beiden Fällen, der Bestimmung von Chinidin in Chinin und von Chinin in Chini-din konnte dies auf einem Niveau von 2,5% geschehen, was den Anforderungen der Arzneibücher entspricht. Gentamicinsulfat Die 1H-NMR-Spektroskopie wurde ebenfalls zur Charakterisierung der Zusam-mensetzung des Antibiotkums Gentamicin eingesetzt. Gentamicin, das fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen wird, besteht aus verschiedenen Haupt- und Nebenkomponenten, deren Zusammensetzung je nach Fermentationsbedingungen schwankt. Nach einer Reihe von Todesfällen im Zusammenhang mit der Anwendung des Antibiotikums Gentamicin in den USA wurde vermutet, dass diese auf verschiede-ne Verunreinigungen zurückzuführen sind. In der aktuellen Arzneibuch-Monographie wird eine HPLC-Methode beschrieben, die zwar die Hauptkomponenten quantifizieren kann, aber nicht alle Nebenkomponenten gut abtrennt. Auch ist die gesamte Elutionszeit sehr lang, so dass spät eluierende Substanzen breite Peaks zeigen. Außerdem ist der benutzte gepulste amperometrische Detektor sehr empfindlich und die Methode insgesamt daher wenig robust. Unter Zuhilfenahme von ein- und zweidimensionalen Standardmesstechniken sowie selektiver TOCSY-Messungen konnten alle Signale in den 1H- und 13C-NMR-Spektren der Haupt- und Nebenkomponenten von Gentamicin vollständig zugeordnet werden. Dabei zeigte sich, dass der Bereich der anomeren Wasserstoffe sehr gut geeignet ist, Aussagen über die Reinheit und über das Verhältnis der Hauptkomponenten zueinander treffen zu können. In dem in der Abbildung gezeigten Ausschnitt aus einem 400 MHz-1H-NMR-Spektrum ist eine Integration der H20-Signale der Hauptkomponenten aufgrund mangelnder Trennung nicht möglich. Diese ist jedoch in 600 MHz-Spektren möglich. Auf diese Weise können die Verhältnisse der Hauptkomponenten zueinander bestimmt werden. Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den aus einer MEKC-Trennung erhaltenen Daten. Das zeigt die sehr gute Ergänzung dieser beiden Methoden. Insgesamt wurden für diese Arbeit über 40 Gentamicin-Proben verschiedener Hersteller untersucht, miteinander verglichen und in verschiedene Gruppen einge-teilt. Als Leitverunreinigung hat sich dabei Sisomicin erwiesen. Daneben konnte der Vergleich der Verunreinigungsprofile Hinweise auf Handelswege geben. Unter den untersuchten Proben waren auch diejenigen, zu den Todesfällen führten. Die-se konnten den stark verunreinigten Gruppen zugeordnet werden. N2 - Quantitative analysis It could be shown on the basis of different substances that the NMR spectroscopy is able to quantify impurities of pharmaceuticals. For the quantification of impurities of the antidepressive drug fluvoxamine the pharmacopoeia describes an ion-pair chromatographic method. Since the antide-pressive activity resides on the E-isomer the content of the Z-isomer has to be lim-ited. Since ion-pair chromatography often lacks of robustness, qNMR is an alterna-tive. The quantitative evaluation of 1H NMR spectra of a mixture of the two isomers is possible without extensive sample preparation. The signals of the hydrogens at position 2 of both isomers are well separated in the spectrum. If these are quantitative evaluated, under optimized conditions, e.g. with respect to T1-relaxation time, it is possible to limit the content of the Z-isomer to 0.2%. For analysis of degradation products of perphenazine enantate qNMR is a suitable method. Perphenazine enantate can be cleaved by ester hydrolysis. Using the integral area of the signal of the hydrogens at position 21 of per-phenazine in comparison to the integral area of the overlapping signals of the hydrogens at position 11 of both substances perphenazine and perphenazine enan-tate it was possible to quantify perphenazine as a degradation product of per-phenazine as well perphenazine enantate in perphenazine. Additionally the area of the aromatic hydrogens can be used for the analysis of the oxidation. The oxidation of the sulfur of the the phenothiazine-moiety to the sulfoxide and the sulfone changes the chemical shifts of the corresponding hydrogens. This enables a half-quantitative assessment. Finally it was possible to quantify the two epimers quinine and quinidine as an impurity in either drug. Again signals of both substances could be identified to be used for quantification. In both cases quinine as impurity of quinidine and vice versa the impurity can be limited to 2.5 per cent as required by the pharmacopeias. Gentamicin sulfate 1H-NMR spectroscopy was also used as an analytical method to characterize the composition of gentamicin. Gentamicin is produced from Micromonospora purpurea by fermentation and consists of different main and side components. The composition varies when applying different fermentation conditions. A number of deaths in connection with the application of the antibiotic drug gen-tamicin in the USA were reported. Different impurities were suspected to be re-sponsible for these deaths. In the current pharmacopoeia monograph an HPLC method is described which is able to quantify all main components but does not separate all side components. In addition, the total elution time is long. Thus late eluting substances show very broad peaks. Furthermore the used pulsed am-perometric detector is very sensitive and the method is not very robust over all. Using one- and two-dimensional routine NMR techniques and selective TOCSY experiments it was possible to assign all signals in the 1H- and 13C-NMR spectra of all main and side components. The area of the anomeric hydrogens is appropriate to evaluate the purity of gentamicin and the proportions between the main compo-nents. In the part of the 400 MHz 1H-NMR spectrum integration of the H20 signals of the main components is impossible due to the missing baseline separation. However, using 600 MHz spectra integration is possible. In this way the proportions between the main components can be determined. The results achieved in this way show good accordance to the results obtained with an MEKC separation. More than 40 gentamicin samples from different manufactures were studied, com-pared and divided into several groups, based on their impurity profile. As a lead impurity sisimocin has been identified. Besides that, the comparison of the impurity profiles enables to trace the trade ways. Some of the samples which led to the deaths were among the samples being classified in the impure groups. KW - Arzneimittel KW - Qualitätskontrolle KW - NMR-Spektroskopie KW - Quantitative Analyse KW - NMR-Spektroskopie KW - quantitativ KW - Verunreinigungen KW - Arzneistoffe KW - NMR-spectroscopy KW - quantitative KW - impurities KW - active pharmaceutical ingredients Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8364 ER - TY - THES A1 - Eber, Marcus T1 - Wirksamkeit und Leistungsfähigkeit von nanoskaligen Fließregulierungsmitteln T1 - Effectiveness and efficiency of nanoscale glidants N2 - Zusammenfassend stellen sich die hydrophoben Nanomaterialien als die optimalen Fließregulierungsmittel dar (Ausnahme: Printex® G). Die Agglomerate des hochpotenten hydrophoben Ruß-Derivats Printex® 95 liegen von Herstellerseite bereits in genügend zerkleinerter Form vor, so daß keine weitere Zerkleinerung während des Mischvorganges erforderlich ist. Infolgedessen adsorbiert es mit höchster Geschwindigkeit an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und übernimmt dort die Funktion von Oberflächenrauhigkeiten. In der Folge der werden die interpartikulären Haftkräfte sehr schnell minimiert. Im Gegensatz zu den hydrophilen Nanomaterialien zeigt Printex® 95 keinen ausgeprägten Wiederanstieg der Zugspannungen selbst nach sehr langen Mischzeiten von 4320 Minuten. Durch die Verwendung des hydrophoben Ruß-Derivates Printex® 95 werden Pulvermischungen erhalten, die zudem weitestgehend unempfindlich sind gegenüber Kapillarkräften bei erhöhten Umgebungsfeuchten. Das hydrophobe Printex® 95 vereint damit praktisch alle gewünschten Eigenschaften eines optimalen Fließregulierungsmittels und es kann als Modellsubstanz für die Entwicklung noch potenterer Nanomaterialien dienen. Bisher stand das nicht abschließend beurteilte cancerogene Potential dieses Stoffes einer breiten Anwendung entgegen. N2 - Summing up it can be said that hydrophobic nanomaterials are highly potent glidants (with exception of Printex® G). The agglomerates of the top-rated hydrophobic Printex® 95 are already small enough because of the manufacturing process, so that they do not have to be broken up during the mixing process. As a consequence, Printex® 95 is adsorbed most quickly on the surface of corn starch to fulfill the function of surface asperities. Because of this increasing surface roughness the interparticle forces are rapidly diminished. In contrast to all the hydrophilic nanomaterials, Printex® 95 does not show a pronounced re-increase in tensile strength even after a blending time of 4320 minutes. Moreover the binary powder mixtures with Printex® 95 are very robust against capillary forces at higher moisture levels. Altogether, it can combine all the requested demands for a top-rated glidant and may also serve as a model nanomaterial in order to develop further glidants. So far it could not be applied broadly since its cancerigenous potential has not been finally evaluated. KW - Nanostrukturiertes Material KW - Hydrophobe Wechselwirkung KW - Fließverhalten KW - Schüttgut KW - AFM KW - Fließfähigkeit KW - intermolekulare Kräfte KW - Nanopartikel KW - SPM KW - flowability KW - intermolecular forces KW - nanoparticles Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9026 ER - TY - THES A1 - Muth, Mathias T1 - Synthese und Charakterisierung allosterer Modulatoren muscarinischer M2-Rezeptoren : Strukturvariationen der Bis(ammonium)alkan-Verbindung W84 T1 - Synthesis and characterisation of allosteric modulators of the muscarinic M2-receptor - structural variations of the bis(ammonio)alkane-compound W84 N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung allosterer Modulatoren muscarinischer Rezeptoren. Allostere Modulatoren binden an einer topographisch anderen Stelle am Rezeptor als klassische orthostere Liganden und sind so in der Lage, die Dissoziation und die Assoziation orthosterer Agonisten und Antagonisten zu beeinflussen. Die fünf Subtypen des Muscarinrezeptors M1-M5 unterscheiden sich vor allem in der Aminosäuresequenz der in den äußeren Bereichen des Rezeptorproteins vorhandenen Loops, während sie im Bereich des Rezeptorkanals, wo die orthostere Bindungsstelle lokalisiert ist, eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. Die gemeinsame Bindungsstelle allosterer Modulatoren des M2-Rezeptors befindet sich im weniger konservierten extrazellulären Bereich. Somit sind allostere Modulatoren in der Lage, spezifisch an einen der Rezeptorsubtypen zu binden. Als Leitstruktur zum Entwurf der im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen diente die Bis(ammonium)alkanverbindung W84. Über Weg A wurden Phthalsäure- bzw. Naphthalsäureanhydridderivate in einer Kondensationsreaktion mit dem entsprechenden N,N-Dimethylpropan-1,3-diaminderivat zum jeweiligen Phthalimidopropylaminderivat umgesetzt. Durch die Reaktion von zwei Äquivalenten des Amins mit einem Äquivalent 1,6-Dibromhexan wurden dann die symmetrischen W84-Derivate erhalten. Um die unsymmetrischen W84-Derivate zu erhalten, musste zunächst das jeweilige Phthalimidopropylamin einseitig durch 1,6-Dibromhexan alkyliert werden. Im letzten Schritt wurden äquimolare Mengen der alkylierten Verbindung und eines Phthalimidopropylamins umgesetzt. Da sich im Laufe der Arbeit die Methylierung an Position 2 der Propylketten als kritische Position zur Beeinflussung der Gleichgewichtsbindung herausstellte, wurden Verbindungen hergestellt, die an den Propylketten Alkylgruppen verschiedener Länge tragen. Aus diesem Grund wurde Syntheseweg B entwickelt. Zunächst wurden in mehreren Stufen, ausgehend von Malonsäurediethylester, einfach und zweifach mit Alkylgruppen substituierte 1,3-Dibrompropanderivate hergestellt. Diese wurden dann mit Kaliumphthalimid zu den jeweiligen 3-Brompropylphthalimidderivaten umgesetzt. Zwei Äquivalente dieser 3-Brompropylphthalimide reagierten mit einem Äquivalent N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,6-hexandiamin zu den entsprechenden symmetrischen W84-Derivaten. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, stark fluoreszierende W84-Derivate herzustellen. Die fluoreszierenden Eigenschaften N-substituierter Naphthalimide könnten zur direkten Charakterisierung allosterer Interaktionen oder zur Verfolgung des „Rezeptor-Traffickings“ mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie genutzt werden. Deshalb wurden in Position 3 und 4 des Naphthalimidringes des potentesten allosteren Modulators Aminogruppen eingeführt. Hexamethonio-Derivate beeinflussen in nennenswertem Maße bisher nur die Bindung von Antagonisten am M2-Rezeptor. Da die allostere und die orthostere Bindungsstelle räumlich nahe zusammenliegen, wurde der Versuch unternommen, einen orthosteren Agonisten und einen allosteren Modulator in einem Molekül miteinander zu verknüpfen. Es wurden zwölf Hybridmoleküle aus einem Teil des hochaffinen allosteren Modulators 3a und Derivaten des Muscarinagonisten Oxotremorin-M, verbunden durch aliphatische Spacer verschiedener Länge, hergestellt. In pharmakologischen Testungen soll aufgeklärt werden, ob es möglich ist, mit einem Agonist/Alloster-Hybridmolekül gleichzeitig die orthostere und die allostere Bindungsstelle zu besetzen. Die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte durch Radioligandbindungsstudien. Der allostere Effekt der Testsubstanzen wurde indirekt über die Verzögerung der Dissoziation des radioaktiv markierten orthosteren Antagonisten [3H]N-Methylscopolamin bestimmt. Alle bisquartären Testverbindungen weisen deutlich höhere Affinitätswerte als die Leitstruktur W84 auf. Die 1,8-Naphthalimid-substituierten Verbindungen mit gleichzeitiger zweifacher Methylierung erwiesen sich als hochaffin und zugleich positiv kooperativ. Die wirksamste Verbindung dieser Serie ist Verbindung 3a (Naphmethonium), deren Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor im einstelligen nanomolaren Bereich liegt (pEC50 = 8.36). Somit stellt Naphmethonium den potentesten in der Literatur bekannten allosteren Modulator des M2 Rezeptors dar. Mittels QSAR-Analysen wurden die ermittelten Affinitäten zum freien und zum NMS-besetzten Rezeptor in Zusammenhang mit verschiedenen physikochemischen Parametern gebracht. Die Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor der Verbindungen der Serie 2 lässt sich mit hoher Güte durch das Volumen eines lateralen N-Methylimids in Kombination mit der benachbarten Dimethylierung der Propylkette beschreiben. Somit wird deutlich, dass zur Erzielung von positiver Kooperativität die Kombination aus einem hochaffinen aromatischen Imid in direkter Nachbarschaft zu einer 2,2-Alkylpropylkette essentiell ist. N2 - The present work deals with the synthesis and characterization of allosteric modulators of muscarinic receptors. Allosteric modulators bind to a topographically different site than classical orthosteric ligands and, thus, are capable of influencing both the dissociation and the association of orthosteric agonists and antagonists. Allosteric modulators are capable of binding selectively to specific subtypes. The bis(ammonio)alkane-type compound W84 served as a lead for the compounds synthesized in this work. Via pathway A, phthalic- and naphthalic anhydride derivatives were converted with N,N-dimethylpropane-1,3-diamines to the phthalimidopropylamine derivatives. The symmetrical W84-derivatives were obtained by the conversion of two equivalents of the amine with one equivalent 1,6 dibromohexane. To obtain the non-symmetrical W84-derivatives the phthalimidopropylamines were unilaterally alkylated by 1,6-dibromohexane. In the last step equimolar amounts of the monoalkylated compound and a phthalimidopropylamine were connected. During our studies the methylation of position 2 of the propylene chains was identified as critical position for the influence on equilibrium binding. Therefore, compounds with varying alkyl substituents were synthesized. First, starting from malonic diethyl ester, 1,3-dibromo-propane derivatives carrying one or two ethyl-, propyl- or iso-butyl groups, respectively, were synthesized first. The latter were converted to the corresponding 3-bromopropylphthalimid derivatives with potassium phthalimide. In the last step two equivalents of the bromopropyl-phthalimides reacted with one equivalent tetramethyl-1,6-hexane-diamine to the symmetrical hexamethonio-derivatives. A further aim of the work was to synthesize highly fluorescent W84-derivatives. The fluorescent properties of N-substituted naphthalimides could be utilized for the direct characterization of allosteric interactions. Therefore, amino groups were introduced in positions 3 and 4 of the naphthalimide moiety. Until now, only the binding of antagonists of the M2 receptor was influenced by hexamethonio derivatives. Because of the spatial proximity of the orthosteric to the allosteric binding site it was tried to combine an agonist and an allosteric modulator in one molecule. Twelve hybride molecules consisting of a part of a highly affin allosteric modulator and of derivatives of the muscarinic agonist oxotremorine-M were synthesized. In the pharmacological evaluation it will be elucidated if it is possible for an agonist/alloster-hybride molecule to bind simultaneously to the orthosteric and the allosteric site. The pharmacological testing of the compounds was accomplished by radioligand binding studies . The allosteric effect of the compounds was determined by measurement of the inhibition of the dissociation of the radioactive marked orthosteric antagonist [3H]N-methylscopolamine. All compounds revealed higher affinitiy values than the lead structure W84. The most potent compound of that series is compound 3a (naphmethonium) that reveals an affinity to the NMS-occupied receptor in the low nanomolar range (pEC50 = 8.36). Taking all results together, the highest affinity values in combination with positive cooperativity were obtained for W84-derivatives carrying at least one naphthalimide moiety directly connected to a 2,2-dimethylpropyl chain. By the introduction of different alkyl groups in the propylene chains it was possible to verify the critical position with respect to the cooperative behaviour of W84-derivatives. QSAR-studies were performed in order to check whether the pharmacologically determined affinities to the free and to the NMS-occupied receptor can be explained by physicochemical properties of the compounds. The affinity to the NMS-occupied receptor of the compounds of series 2 can be described using the volume of one lateral N-methylimide in combination with the dimethylation of the neighbored propylene chain. Summarizing these results it can be concluded that the compounds feature a dominant side with regard to allosteric potency. To achieve positive cooperativity the combination of an affinity generating lateral aromatic imide moiety connected to a 2,2-alkylated propylene chain is essential. KW - Muscarinrezeptor KW - allosterischer Effektor KW - W84 KW - Analoga KW - Chemische Synthese KW - GPCR KW - allostere Modulation KW - Muscarinrezeptor KW - GPCR KW - allosteric modulation KW - muscarinic receptor Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8839 ER - TY - THES A1 - Teichgräber, Jürgen T1 - Aminosubstituierte Terphenyle als neue Leitstruktur für allostere Modulatoren muscarinischer M2-Acetylcholinrezeptoren T1 - Aminosubstituted terphenyls as new leadstructures for allosteric modulators of the muscarinic M2-acetylcholine receptors N2 - Die muscarinischen Rezeptoren sind ein wichtiger Bestandteil des parasympathischen Nervensystems. Sie gehören zur großen Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die nach ihrer Verwandtschaft in drei große Klassen eingeteilt werden können. Die muscarinischen Rezeptoren gehören zur Klasse A, den rhodopsinähnlichen Rezeptoren. Durch die im Jahr 2000 vorgenommene Aufklärung der hochauflösenden Röntgenkristallstruktur des Rinderrhodpsins und die hohe Aminosäuresequenzähnlichkeit der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren hat man eine sehr gute Modellvorstellung über den Aufbau der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Rezeptoren bestehen aus sieben transmembranalen Helices, die von drei intrazellulären und drei extrazellulären Loops stabilisiert werden. Bis heute konnten fünf Rezeptorsubtypen gentechnisch klassifiziert werden, die sich durch ihre Gewebeverteilung und Funktion unterscheiden. Allen Subtypen ist eine hohe Sequenzhomologie im Bereich der orthosteren Bindungsstelle gemeinsam, so dass die Entwicklung von subtyp-spezifischen orthosteren Liganden sehr schwierig ist. Außer der orthosteren Bindungsstelle konnte noch eine weitere Bindungsstelle am muscarinischen Rezeptor identifiziert werden. Diese befindet sich weiter außerhalb im Rezeptor in einem Bereich, der über die fünf Rezeptorsubtypen nicht sehr stark konserviert ist, so dass die Entwicklung von subtyp-spezifischen Liganden möglich ist. An dieser zweiten Bindungsstelle binden allostere Modulatoren. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die ohne den orthosteren Liganden keinen Effekt am Rezeptor auslösen, dafür aber die Gleichgewichtsbindung des orthosteren Liganden beeinflussen können. Der Einfluss auf die Gleichgewichtsbindung geschieht wechselseitig und kann positiv, neutral oder negativ kooperativ sein. Zusätzlich üben allostere Modulatoren einen Effekt auf die Dissoziation des orthosteren Liganden aus. Die meisten bisher gefunden allosteren Modulatoren erniedrigen die Dissoziationsgeschwindikeit des orthosteren Liganden vom Rezeptor. Die Summe dieser Eigenschaften machen die allosteren Modulatoren sehr interessant für die Arzneimitteltherapie. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese strukturell neuer allosterer Modulatoren des muscarinischen Rezeptors unter Anwendung des postulierten Pharmakophormodells. Als Ausgangspunkt sollten geländerhelicale Moleküle dienen, die strukturell abgewandelt dieses Pharmakophormodell sehr gut erfüllen. Die geländerhelicalen Moleküle ähneln in ihrem dreidimensionalen Aufbau dem Geländer einer Wendeltreppe. Sie sind durch die Brücken zwischen den aromatischen Bereichen sehr rigide Moleküle, so dass es nur wenige genau definierte Konformationen gibt. Grundsätzlich können drei Atropisomere unterschieden werden, wobei zwei zueinander enantiomer sind. Geplant war die Synthese eine Reihe von tertiären Aminen oder quartären Ammoniumsalzen. Die Synthese der Ausgangsverbindung konnte nach der Vorschrift von Kiupel erfolgen, war aber nur mit geringer Ausbeute möglich. Deshalb wurde dieser Syntheseweg nicht weiterverfolgt. Als Alternative bot sich an, auf die Brücken zwischen den aromatischen Ringen zu verzichten. Die so entstandenen Verbindungen sind weniger rigide und können sich deshalb gegebenenfalls besser an den Rezeptor anpassen. Grundsätzlich können je nach Substitutionsmuster zwei Synthesewege verfolgt werden. Beide Varianten erfüllen das postulierte Pharmakophormodell. Der Aufbau des Grundgerüstes erfolgt mittels einer nickelkatalysierten Grignard-Kupplung. Danach erfolgen eine Wohl-Ziegler-Seitenkettenbromierung und eine Verlängerung der Seitenkette im Sinne einer Alkylierung mittels Malonsäurediethylester und einer Hilfsbase. Anschließend erfolgen die Decarboxylierung und die Umsetzung zum Amid, das zum Amin reduziert werden kann. Betrachtet man die Lage der Pharmakophorelemente so variiert der Abstand der positiv geladenen Stickstoffe je nach Konformation zwischen 5 Å und 15 Å, so dass ein weiter Bereich abgedeckt werden kann. Der Abstand der aromatischen Bereiche bleibt relativ stabil. Die pharmakologische Testung der Verbindungen auf ihre allostere Potenz und Affinität zum muscarinischen Rezeptor erfolgte in der Arbeitsgruppe von Prof. Mohr in Bonn. Hierzu werden Membranhomogenate vom Herzventrikelgewebe des Hausschweines verwendet. Diese enthalten mit großer Prävalenz muscarinische M2-Rezeptoren. Es wurden Gleichgewichtsbindungs- und Dissoziationsexperimente durchgeführt. Bis jetzt sind noch nicht alle Verbindungen getestet worden. Die bisher getesteten Verbindungen weisen alle eine Affinität zum mit [3H]-N-Methylscopolamin besetzten muscarinischen M2-Rezeptor im mikro-molaren Bereich auf. Sie liegen damit im oberen Bereich der bisher synthetisierten allosteren Modulatoren. Das postulierte Pharmakophormodell konnte also mit Hilfe der synthetisierten Substanzen bestätigt werden. N2 - The muscarinic receptors are an important part of the parasympathic nervous system. They belong to the group of G protein-coupled receptors. Up to now about 1000 members of this group have been identified and were classified into three families. The muscarinic receptors belong to family A, the rhodopsine-like receptors, which is also the biggest family. Due to the high resolution X-ray crystallography analysis of bovine rhodopsine and the high similarity of the protein sequences of the G protein-coupled receptors, there is a good model describing the structure of the G protein-coupled receptors. The receptor consists of seven transmembranale helices which are stabilised by three extra- and three intracellular loops. Up to now five receptor subtypes are genetically classified which differ in tissue partitioning and function. All subtypes possess a high sequence similarity within the area of the orthosteric binding site. Therefore the development of subtypspecific orthosteric ligands is very difficult. Apart from the orthosteric site a second binding site at the muscarinic receptor could be identified located outside the receptor at a position which is not highly conserved over the five receptor subtypes. Due to this fact the development of subtypspecific ligands could be possible. At this second site allosteric modulators are able to bind. Allosteric modulators are substances which have no effect on the receptor without the binding of the orthosteric ligand, but affect the equilibrium binding of the orthosteric ligand. Influence on the equilibrium binding occurs mutual and is positively, neutral or negatively cooperative. Additionally allosteric modulators have an effect on the dissociation of the orthosteric ligand. Most of the known allosteric modulators reduce the dissociation rate of the orthosteric ligand from the receptor. These properties make allosteric modulators very interesting for medication. Their use could make a smooth and selective modulation of the orthosteric ligand´s effect on one special subtype within a wide therapeutic range possible. A positive cooperative allosteric modulator of the M2-receptor could enhance selectively the affinity of an orthosteric ligand to the receptor. The aim of this dissertation was the synthesis of structurally new allosteric modulators of the muscarinic receptor using the postulated pharmacophore model. Structurally modified “geländerhelicale” molecules served as starting point because they fit perfectly in the postulated pharmacophore model. The 3D structure of a “geländerhelical” molecule is similar to the banisters of a spiral staircase. Due to the bridges between the aromatic rings these molecules are very rigid so that there is a limited set of conformations. In principle three atropisomers can be distinguished, two of them are enantiomers. The synthesis of some tertiary amines or quartäry ammonia salts was intended. The first steps of the synthesis followed Kiupel´s synthesis scheme. Since the last-mentioned ring closure could only be performed with poor yields and a couple of reactions had to follow to obtain the pure product, the strategy was slightly changed. As an alternative the bridges between the aromatic rings were omitted. The compounds are less rigid and have the ability to adopt the receptor’s shape. Two synthesis strategies are possible. Both variations fulfil the postulated pharmacophore model. In case of pathway A the stereochemistry does not change. It could be distinguished between three atropisomers, two of them are enantiomers. In case of pathway B two atropisomers could be distinguished which are diastereomers. Due to higher yields pathway B was preferred. The skeleton was built up by means of a nickel catalysed Grignard coupling. After that the two side chains were brominated by a Wohl-Ziegler-bromination and alkylated by the use of diethyl malonate and a strong base. Afterwards the esters were decarboxylated and converted to the amide which could be reduced to the amine. Looking at the pharmacophoric elements the distance between the positive nitrogens varies due to the conformation between 5 Å and 15 Å, therefore a wide range is covered. The distance between the aromatic ring systems is nearly constant. The pharmacological testing of the compounds due to there allosterical potency and affinity to the muscarinic receptor were performed by the group of Prof. Mohr at Bonn using membrane suspensions of the guinea pig’s heart ventricle tissue. They contain muscarinic M2-receptors with high prevalence. Equilibrium binding and dissociation assays were performed. Up to now not all compounds are tested. The tested compounds show affinity to the [3H]NMS occupied muscarinic M2-receptor in a micro-molar range. The affinity falls into an upper range of the already synthesised compounds. All in all the postulated pharmacophore model could be confirmed by the synthesised compounds. KW - Muscarinrezeptor KW - Allosterischer Effektor KW - Terphenylderivate KW - Allosterer Modulator KW - Muscarinischer Rezeptor KW - Terphenyl Derivate KW - allosteric modulation KW - muscarinic receptors KW - terphenyl derivatives Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8571 ER - TY - THES A1 - Raab, Thomas T1 - Untersuchungen zur Erdbeerfruchtreifung : Biosynthese von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon und Enzymaktivitäten während des Reifungsprozesses T1 - Investigations on strawberry fruit ripening - Biosynthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone and enzymatic activities within the ripening process N2 - Die Fruchtreifung stellt einen hochkomplexen Prozess dar, der durch eine Reihe von biochemischen und physiologischen Veränderungen gekennzeichnet ist. Dies umfasst bedeutende Veränderungen von Textur, Farbe sowie die Bildung von geschmacks- und geruchsaktiven Verbindungen. Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (Furaneol®, HDMF), einer Schlüssel-Aromakomponente der Erdbeere (Fragaria x ananassa). Daneben lieferten die durchgeführten Versuche den Nachweis einer Reihe enzymatischer Aktivitäten in der Erdbeerfrucht und beleuchteten deren Entwicklung im Verlauf der Erdbeer-Fruchtreifung. Zum ersten Mal wurde ein Protein aus Erdbeerfrüchten isoliert, partiell sequenziert und seine Beteiligung an der enzymatischen Bildung von HDMF während der Fruchtreifung nachgewiesen. N2 - Fruit ripening represents a highly complex process, characterized by a series of biochemi-cal and physiological changes. This comprises significant changes in texture and colour as well as production of odor- and flavour-active compounds. The present work reveals new insight into the biosynthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (Furaneol®, HDMF), a key flavour compound of strawberry (Fragaria x ananassa). For the first time, a protein active in the enzymatic formation of this compound during strawberry fruit ripening was isolated from the fruit, partially sequenced and characterised. KW - Erdbeere KW - Fruchtreife KW - Furaneol KW - Biosynthese KW - Furaneol KW - Chinon-oxidoreduktase KW - Erdbeere KW - Aroma KW - HDMF KW - Furaneol KW - quinone oxidoreductase KW - strawberry KW - flavor KW - HDMF Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8640 ER - TY - THES A1 - Stiefl, Nikolaus Johannes T1 - Entwicklung, Validierung und Anwendung einer neuen translations- und rotationsinvarianten 3D-QSAR-Methodik T1 - Development, validation and application of a novel translational and rotational invariant 3D-QSAR-technique N2 - Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Validierung der neuartigen 3D-QSAR Technik Mapping Property Distributions of Molecular Surfaces (MaP). Die Methode ist gegenüber Translation und Rotation invariant, d. h. eine Überlagerung der Moleküle, wie sie zum Beispiel für CoMFA nötig ist, entfällt. MaP basiert auf der Charakterisierung der Moleküle nach ihrer Fähigkeit Wasserstoffbrücken auszubilden, sowie ihrer Hydrophobie / Hydrophilie. Dabei werden jedoch nicht nur die atombasierten Eigenschaften, sondern auch die Oberflächeneigenschaften der Moleküle zur Charakterisierung genutzt. Diese Loslösung von der chemischen Struktur der Verbindungen erlaubt es, die für die Ligand-Rezeptor-Interaktion (bzw. Substrat-Enzym-Interaktion) wichtigen Grenzflächen zu charakterisieren. Die wichtigsten methodischen Elemente der MaP-Technik, sowie die erhaltenen Ergebnisse der untersuchten Datensätze sollen hier noch einmal in kurzer Form dargestellt werden: Die theoretische Basis des MaP-Deskriptors bilden so genannte Radialverteilungsfunktionen. Mittels dieser selektiven Distanz-Zählstatistiken (SDZS) können sowohl die Form der Moleküle, als auch die Verteilung der einzelnen Oberflächeneigenschaften zueinander, in einem einzelnen Vektor beschrieben werden. Die MaP-Variablen kodieren dabei die Größe (absolute Anzahl an Einträgen), sowie die Orientierung (Distanz) verschiedener Oberflächeneigenschaften zueinander. Die Grundlage der Oberflächeneigenschaften stellen atomare Charakteristika wie das Wasserstoffbrückenbindungspotential sowie die atomare Hydrophobie / Hydrophilie dar. Diese Eigenschaften werden den Atomen mittels einfacher Regeln (Wasserstoffbrücken) bzw. einer Substruktursuche (Hydrophobie / Hydrophilie) zugewiesen und dann auf die Oberfläche projiziert. Um die mathematische Transformation der Rohdaten in die SDZS zu ermöglichen, muss die Moleküloberfläche durch gleichverteilte Oberflächenpunkte diskretisiert werden. Da diese Anforderung von gebräuchlichen analytischen Oberflächenberechnungsmethoden, wie zum Beispiel dem GEPOL-Algorithmus, nicht erfüllt wird, wurde der GEPOL-Algorithmus so modifiziert, dass ein Zusammenhang zwischen der Oberflächengröße und der Anzahl an Oberflächenpunkten gegeben ist. Da es aufgrund dieser Diskretisierung jedoch zum Verlust der Invarianz gegenüber Translation und Rotation kommen kann, wurde der Bestimmung der Moleküloberflächen eine spezielle Technik zur Ausrichtung der Moleküle im Koordinatensystem (Kanonisierung) vorgeschaltet. Dadurch wird ein identischer MaP-Deskriptor unabhängig von der Position der Moleküle im Raum garantiert. Um den Diskretisierungsfehler der Oberflächenbestimmung weiter zu reduzieren, wurde eine unscharfe Zählweise bei der Berechnung des MaP-Deskriptors adaptiert. Diese erlaubt es, Einträge die an den Kategoriengrenzen des MaP-Vektors liegen, auf die beiden nächsten Zentren zu verteilen. Dadurch werden kleine Schwankungen in den Distanzwerten kompensiert. Zur Modellbildung werden die infomativsten Variablen (MIV) mit Hilfe der ‚Reverse-Elimination-Method’-Tabu-Suche (REM-TS) identifiziert. Die so erhaltenen MIV’s können auf die Moleküle zurückprojiziert werden, was die Interpretation der berechneten Modelle stark vereinfacht. Zur Visualisierung der Ergebnisse können die Variablen unter Zuhilfenahme der unscharfen Zählweise nochmals gefiltert werden, um die Interpretation hoch besetzter Variablen zu vereinfachen. Da es aufgrund der Variablenselektion zu einer Zufallskorrelation in der Modellbildung kommen kann, werden die erhaltenen Modelle einer strengen Validierung unterzogen. Dabei werden neben der sehr anspruchsvollen ‚Lass-mehrere-Objekte-heraus’-Kreuzvalidierung als Gütefunktion der Variablenselektion auch ein Permutationstest der Modelle sowie eine Testdatenvorhersage angewandt. Durchläuft ein Modell all diese Validierungsschritte erfolgreich, so ist die Wahrscheinlichkeit einer Zufallskorrelation sehr gering. Um die Anwendbarkeit und die Güte des MaP-Deskriptors zu überprüfen, wurden verschiedene Datensätze untersucht. Diese können entsprechend ihrer Zielsetzung in unterschiedliche Gebiete aufgeteilt werden. Der erste Datensatz (Steroide) wird in der QSAR häufig als Vergleichsdatensatz eingesetzt. Ein weiterer Datensatz umfasst strukturell sehr heterogene Substanzen, die ein augenirritierendes Potential aufweisen (ECETOC). Inhibitoren des EndothelinA-Rezeptors (ETA) bildeten einen weiteren Datensatz. Die enthaltenen Moleküle sind im Datenraum stark in Untergruppen geklustert. Weiterhin wurden konformell sehr flexible, allostere Modulatoren des muskarinischen M2-Rezeptors (M2-Modulatoren) untersucht. Dieser Datensatz diente aufgrund der hohen Flexibilität der Moleküle auch zur Überprüfung der konformellen Abhängigkeit der Methode. Die Erweiterung des Standardparametersatzes wurde mit Hilfe von Naphthylisochinolin-Derivaten (NIQ) untersucht, die eine Aktivität gegen Plasmodium falciparum aufweisen. Ein weiterer Datensatz, deren Moleküle die Öffnungswahrscheinlickeit ATP-abhängiger Kalium-Kanäle erhöht (KCO), wurde herangezogen, um den Vorteil der mathematischen Transformation der MaP-Technik gegenüber der von GRIND benutzten MACC-2-Transformation herauszustellen. Inhibitoren des nicotinischen Acetylcholin-Rezeptors (CAR) bildeten einen weiteren Datensatz für den bisher keine QSAR-Studie vorlag. Zur strukturbasierten Validierung der Methode wurden Inhibitoren der Acetylcholinesterase (APZ-Datensatz) untersucht. Hierbei wurde geprüft, ob die aus der Kristallstruktur der Acetylcholinesterase wichtigen Ligand-Enzym-Wechselwirkungen durch MaP beschrieben werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen folgenden Rückschlüsse zu: Im Vergleich mit bereits etablierten 3D-QSAR-Techniken wie CoMFA, CoMSIA oder GRID/PLS führt die MaP-Technik zu vergleichbar guten Modellen (Steroide, ETA, M2-Modulatoren). Durch die Loslösung vom strukturellen Grundgerüst der Substanzen können auch strukturell diverse Datensätze gut modelliert und die relevante Information extrahiert werden (ECETOC). Dies ist mit Deskriptoren, die eine gemeinsame Ausrichtung der Moleküle benötigen (z.B. CoMFA), oft nicht möglich. Auch Datensätze, deren Objekte geklustert vorliegen, können mittels MaP gut modelliert werden. MaP ist dabei in der Lage die relevante Information sowohl zwischen, als auch innerhalb der einzelnen Gruppen zu extrahieren (ETA). Auch für Datensätze, deren Moleküle eine sehr hohe Flexibilität aufweisen, ist es möglich mit MaP gute Modelle zu erhalten (M2-Modulatoren, APZ). Hierbei ist es jedoch wichtig, zu beachten, dass MaP als 3D-QSAR-Technik gegenüber der Konformation der Moleküle nicht invariant ist. Bei der Anwendung der Methode zeigte sich jedoch, dass kleine konformelle Änderungen der Verbindungen oft einen sehr geringen Einfluss auf die Ergebnisse der Methode haben (M2-Modulatoren, APZ). Bei der Untersuchung der NIQ-Daten zeigte sich, dass unter Verwendung der MaP-Standardparameter bereits die relevanten Eigenschaften der Moleküle charakterisiert werden können. Allerdings führte eine Erweiterung dieser Parameter zu einer Vereinfachung der Interpretation der Ergebnisse. Hierbei ist jedoch darauf zu achten, dass die Modellvalidierung strikt eingehalten werden muss. Der Vorteil der mathematischen Transformation der Rohdaten (SDZS) gegenüber der von GRIND verwendeten MACC-2 Transformation konnte mittels der KCO-Daten aufgezeigt werden. Das erhaltene Modell spiegelte sehr schön die bereits bekannten Struktur-Wirkungs-Beziehungen wider. Leider ist die publizierte Datenlage in diesem Falle noch nicht ausreichend, um einen abschließenden Vergleich der beiden konkurrierenden Techniken zu ermöglichen. Beim CAR-Datensatz war MaP in der Lage, neben der bekannten, relevanten strukturellen Allylalkoholgruppe ein weiteres strukturelles Merkmal zu identifizieren. Abschließend konnte gezeigt werden, dass MaP in der Lage ist, die für die Wechselwirkung zwischen Acetylcholinesterase und Ligand wichtigen Interaktionsstellen und Charakteristika eindeutig zu identifizieren (APZ-Datensatz). Diese Eigenschaften wurden zur besseren Interpretation der Ergebnisse in die Bindetasche projiziert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass die entwickelte Technik ein weites Anwendungsspektrum besitzt, leicht zu interpretieren ist und sich dabei durch ihre Robustheit auszeichnet. Vor allem aber liefert MaP aussagekräftige 3D-QSAR-Modelle. Bei der MaP-Methode handelt es sich jedoch nicht nur um einen neuen Moleküldeskriptor, sondern um eine Kombination aus Deskriptor, mathematischer Modellierung, Modellvalidierung und Modellvisualisierung. Obwohl MaP in Hinsicht auf Modellqualität und Modellinterpretierbarkeit Techniken wie zum Beispiel CoMFA in nichts nachsteht, sind aufgrund der einfachen und trotzdem hocheffizienten mathematischen Grundlagen folgende Erweiterungen denkbar: (1) als dreidimensionale Technik ist MaP von den Ausgangskonformationen der Moleküle abhängig. Findet sich im untersuchten Datensatz ein starres Molekül (M2-Modulatoren) oder aber sind Informationen über einen möglichen Bindungsmodus vorhanden, so können diese Konformationen relativ leicht erhalten werden. Da dies jedoch nicht immer der Fall ist, ist eine Erweiterung der Technik in die vierte Dimension (konformelle Flexibilität) wichtig. Dass dies prinzipiell möglich ist, konnte Hopfinger bereits zeigen. Da die mathematische Grundlage der MaP-Technik sehr einfach ist, sollte diese Art der Erweiterung in die vierte Dimension auch für MaP möglich sein. (2) Momentan ist der MaP-Deskriptor auf Verknüpfungen zwischen zwei Oberflächenpunkten beschränkt. Diese Einschränkung könnte dazu führen, dass Inkremente ein und derselben Variablen aus verschiedenen Teilen des Moleküls stammen. Wenn nur ein Teil davon Eigenschaften kodieren, die relevant für die Ligand-Rezeptor-Interaktion sind, könnte dies theoretisch zu Inkonsistenzen in dem resultierenden Modell führen. Bei den bislang untersuchten Datensätzen konnte dies noch nicht beobachtet werden. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass die MaP-Variablen zu einem gewissen Grad redundant sind, d.h. das selbe Phänomen kann durch verschiedene Variablen beschrieben werden. Von diesen redundanten Variablen werden durch die strenge Validierung diejenigen vom Suchalgorithmus der Variablenselektion identifiziert, die am wenigsten mit anderen Eigenschaften vermengt sind. Prinzipiell ist eine solche Problematik jedoch denkbar. Um die Wahrscheinlichkeit eines derartigen Phänomens weiter zu reduzieren, sollten die bisher genutzten Zweipunktverknüpfungen auf drei Punkte erweitert werden. N2 - This thesis describes the development and validation of the novel 3D-QSAR technique Mapping Property Distributions of Molecular Surfaces (MaP). The method is invariant to translation and rotation. Hence a superimposition of the molecules prior to analysis is not necessary as opposed to field-based methods such as CoMFA. MaP characterises molecules with respect to their hydrogen bonding capabilities and their hydrophilicity / hydrophobicity. However, in contrast to atom-based approaches, MaP uses molecular surface properties for this description of the noncovalent binding forces relevant for receptor-ligand interaction. This property-based approach allows to describe the important interactions which form between the surfaces of receptor and ligand. In the following, the theoretical fundamentals of the MaP technique as well as the most important applications will be summarised. Radial distribution functions form the basis of the MaP descriptor. These are implemented as selective distance count statistics (SDCS) and allow the description of molecular shape as well as the distribution of different surface properties with a single vector. MaP variables themselves inherently encode the size of surface patches with particular properties in terms of the absolute number of counts and their relative position by the distance which separates the two properties under scrutiny. Surface properties are categorised based on atomic characteristics like the hydrogen bonding potential and the atomic hydrophobicity / hydrophilicity. Firstly, the atomic features are assigned by simple rules (hydrogen bonding) and substructure search routines (hydrophilicity / hydrophobicity), respectively. In a second step, they are projected onto the molecular surface. In order to make the mathematical transformation of the raw data into the SDCS possible, the molecular surface needs to be discretised by equally distributed surface points. Standard surface calculation algorithms like the GEPOL algorithm do not fulfil the requirement of equally distributed surface points. Consequently, the GEPOL algorithm was modified as to ensure a linear correlation between surface size and number of surface points. Unfortunately, this discretisation step bears the potential risk, that the translational and rotational invariance of the descriptor is lost. Hence, to avoid this undesirable feature of the descriptor, the molecules are canonicalised. When canonicalising a molecule its centre of mass is first translated into the origin of the coordinate system. Next a rotation matrix is computed which orients the molecules along their principal moments of inertia. These two steps render the surface (and thus the descriptor) translationally and rotationally invariant. To further reduce the discretisation error, the concept of fuzzy counts was introduced for the calculation of the MaP descriptor. Fuzzy counting means, that the two bins closest to the respective distance are incremented proportionally. That way, minor fluctuations due to the surface discretisation are compensated for. Identification of the most important variables (MIV) by variable selection is one of the key data modelling steps in the MaP procedure. For this task MaP employs a reverse-elemination-method tabu-search (REM-TS). For model interpretation these MIVs are back-projected onto the molecules. To further facilitate interpretation of the graphical output, fuzzy counts can be used to filter densely populated variables. One of the major drawbacks of variable selection in data modelling is the risk of chance correlations. Consequently, a strict validation procedure is applied to the MaP models. Apart from using the highly discriminative leave-multiple-out cross-validation as objective function in variable selection, permutation testing as well as test set prediction is applied. If a model passes all tests (validation steps), the risk of a chance correlation is very low. To validate the MaP descriptor and the quality of the models obtained with it, different data sets were investigated. Depending on the problem investigated, these data sets reflect different aspects of research. The first data set comprises structurally rigid compounds (steroids). It is frequently used as a ‘benchmark’ data set for novel QSAR techniques. The molecules of the second data set are structurally very heterogenous compounds with an eye-irritating potential (ECETOC). Members of the third data set include inhibitors of the endothelin-A receptor, that are highly clustered in data space (ETA). Another set of compounds comprises conformationally very flexible allosteric modulators of the muscarinic M2 receptors (M2-modulators). Due to this high flexibility of the compounds the data set is also used to validate the conformational dependence of the method. The NIQ data set which comprises naphthylisoquinolin derivatives with an antimalarial activity against Plasmodium falciparum was used to investigate the extension of the standard parameter set. To compare the mathematical transformation used by MaP with to the one used by GRIND (MACC-2 transformation), a set of compounds which increase the opening probability of ATP dependent potassium channels (KCO) was used. Another data set consisted of inhibitors of the nicotinic acetylcholine receptor (CAR), for which hitherto no QSAR study was performed. The last data set presented (APZ) was utilised to carry out a structure-based validation of the MaP method. Here it was examined, if the important ligand-enzyme interactions can be correctly identified by MaP. For this task, inhibitors of the actylcholine esterase (AChE) were used since a broad knowledge of the actual interactions are known from the different crystal structures available for AChE. From the obtained results the following conclusions can be drawn. When compared to already established 3D-QSAR techniques like CoMFA, CoMSIA, or GRID/PLS the models obtained with the MaP technique are of similar quality (steroids, ETA, M2-modulators). With the pursued property-based approach, even data sets comprising structurally highly diverse compounds can easily be modelled and the relevant information can be extracted (ECETOC). This is in contrast to techniques that need a superpositioning step of the molecules under study (e.g. CoMFA), for which these kind of data sets are hardly accessible. Furthermore, data sets with highly clustered objects can be modelled with MaP. Here MaP is able to extract not only intercluster, but also relevant intracluster information (ETA). Data sets with conformationally highly flexible molecules can also be modelled with good results employing MaP. However, it is important to keep in mind, that MaP, as every 3D-QSAR technique, is still sensitive to the molecular conformation. Nevertheless, it was found, that minor conformational changes of the molecules under study have a low impact on the results obtained with MaP (M2-modulators, APZ). Studying the NIQ data set it was found, that when applying the default parameters, MaP is already able to characterise the most relevant properties of the molecules under study. Yet, an extension of this parameter set resulted in a simplified interpretation of the obtained models. A necessity when using such an extension, however, is the strict model validation applied within MaP. The advantage of the mathematical transformation of the raw data using SDCS (MaP) over the MACC-2 transformation (GRIND) could be highlighted with the KCO data. Here, the model obtained was in full agreement with the available structure–activity relationships. Unfortunately, a complete comparison of the two techniques is currently not possible owing to comparatively few papers published. For the CAR data set, beside the important allyl alcohol group that was already known to be relevant for biological activity, it was possible to identify an additional important structural feature of the compounds under scrutiny. Finally, MaP is able to identify the relevant features as well as the interaction sites between the AChE and the respective ligand (APZ). To make the latter results easily understandable, a projection into the binding pocket of the enzyme was performed. The findings of these studies allow the conclusion, that MaP is widely applicable, easy to interpret and very robust. Most notably however, MaP produces meaningful and sensible 3D-QSAR models. Additionally, it should be emphasised, that MaP is not just yet another molecular descriptor, but a combination of molecular descriptor, mathematical modelling procedure, model validation and model visualisation. Even though MaP is comparable to standard 3D-QSAR techniques like CoMFA in terms of model quality and model interpretability, the following extension are conceivable owing to MaP’s simple but highly efficient fundamental mathematical principles: (1) As a three-dimensional technique, MaP is dependent on the molecular conformations employed. If the data set includes a rigid molecule (M2-modulators) or if information on a possible binding mode of the molecules is available, these conformations can be obtained comparatively easy. However, since these prerequisites are not always available, an extension of MaP to the fourth dimension (conformational flexibility) is important. Hopfinger showed, that in principle such an extension is possible. With the simple mathematical fundamentals of MaP, making use of this fourth dimension should be an achievable development step. (2) Currently, MaP is restricted to connections between two surface points. A numerical artefact of this constraint is, that the same variable might be incremented by surface areas of completely different parts of the molecule. Theoretically, if only a part of these encode properties that are relevant for the ligand-receptor interactions, this could lead to inconsistencies of the resulting model. One explanation why this was not the case thus far is, that MaP-variables are redundant up to a certain degree. Put differently, the same phenomena is explained by different variables. With the strict validation criteria applied within MaP, the search algorithm currently seems to select those variables, which exhibit the lowest confounding with others. Nevertheless, the aforementioned difficulties are possible. To further reduce the probability of such a situation, the two-point approach should extended to three points. KW - QSAR KW - translations- und rotationsinvariant KW - TRI KW - Chemometrie KW - Validierung KW - QSAR KW - translationally and rotationally invariant KW - TRI KW - chemometrics KW - validation Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8230 ER - TY - THES A1 - Kavvadias, Dominique T1 - Liganden des Benzodiazepin-Rezeptors: Studien über Benzodiazepine in pflanzlichen Geweben sowie über Hispidulin T1 - Ligands of the benzodiazepine receptor. Studies of benzodiazepines in plant tissues and of hispidulin. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden Liganden des zentralen Benzodiazepin-Rezeptors (BZD-R) aus pflanzlichen Geweben untersucht. Der erste Teil war dem Studium „natürlicher“ Benzodiazepine (BZD) gewidmet. Deren Vorkommen ist vielfach belegt; an ihrer Biogenese sind möglicherweise Mikroorganismen beteiligt. Es war nun zu prüfen, ob BZD auch unter Sterilbedingungen, d.h. nach Ausschluss mikrobieller Aktivität auftreten können. Hierzu wurden steril kultivierte pflanzliche Kalli und Regenerate, unter anderem von Kartoffelkraut und Estragon untersucht. Methanolische Extrakte wurden auf ihre Aktivität am zentralen BZD-R im Radiorezeptorbindungsassay (RRA) geprüft und mittels Festphasenextraktion bzw. präparativer HPLC-Fraktionierung gereinigt. Nach erneuter Prüfung im RRA erfolgte die Analyse aktiver Fraktionen mit Hilfe der online HPLC-ESIpos-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESIpos-MS/MS) im SRM-Modus. Auf diese Weise gelang es, die BZD Delorazepam und Temazepam in Sterilkulturen von Estragon (Artemisia dracunculus), sowie Diazepam und Temazepam in Kartoffelkraut (Solanum tuberosum), nachzuweisen. Der zweite Teil der Arbeit war der Suche nach natürlichen Nicht-BZD-artigen Liganden des BZD-R gewidmet. Hierzu wurden methanolische Extrakte verschiedener in der Volksmedizin als Sedativa genutzter Pflanzen im RRA auf BZD-R-Aktivität getestet. Für die Isolierung von Nicht-BZD-artigen Liganden wurde der Salbeiblätterextrakt (Salvia officinalis L.) ausgewählt. In einer RRA-begleiteten chromatographischen Fraktionierung des Extraktes wurden fünf aktive Komponenten, drei Flavone und zwei Diterpene, isoliert. Die BZD-R-aktiven Flavone wurden als Apigenin (5,7,4’-Trihydroxyflavon), Hispidulin (5,7,4’-Trihydroxy-6-methoxyflavon)und Cirsimaritin (5,4’-Dihydroxy-6,7-dimethoxyflavon identifiziert. Bei den diterpenoiden BZD-R-Liganden handelte es sich um 7-Methoxyrosmanol und Galdosol. Hispidulin sowie die Diterpene erwiesen sich mit IC 50-Werten von 1.3, 7.2 und 0.8 µM als die BZD-R-aktivsten Komponenten. Apigenin und Cirsimaritin zeigten mit IC50-Werten von 30 bzw. 350 µM geringere Affinitäten zum BZD-R. Die hohe BZD-R-Aktivität von Hispidulin im RRA veranlasste uns, Untersuchungen zum pharmakologischen Profil sowie zur in vivo-Wirksamkeit dieser Substanz durchzuführen. Da die Isolierung aus pflanzlichem Material sehr zeit- und materialaufwendig ist, wurde Hispidulin durch chemische Synthese bereitgestellt. Diese erfolgte in Anlehnung an die Baker-Venkataraman-Methode aus 4-Benzyloxy-2,3-dimethoxy-6-hydroxyacetophenon und 4-Benzyloxybenzoesäurechlorid. Die Ausgangssubstanzen wurden in getrennten Syntheserouten, ausgehend von 2,4,6-Trihydroxyacetophenon und 4-Hydroxybenzoesäure, hergestellt. Danach wurde der Benzoylester aus dem Acetophenon- und dem Säurechlorid-Baustein gebildet. Der Ester wurde nach Baker-Venkataraman zum 1,3-Diketon in basischem Milieu umgelagert. Das 1,3-Diketon zyklisierte unter Säure-und Hitzeeinwirkung zum Flavon, das zur gleichzeitigen Entfernung der Schutzgruppen und der labilen C-5-Methylgruppe mit 1 M BCl3-Lösung bei etwa –70 °C behandelt worden ist. Mit dem chemisch synthetisierten Hispidulin erfolgten Studien zu dessen pharmakologischen Eigenschaften an rekombinanten GABAA-Rezeptoren im Xenopus laevis Oozyte-Modell. Hispidulin zeigte an allen untersuchten Rezeptor-Subtypen (alpha1-3,5,6beta2,gamma2) bereits in Konzentrationen ab 50 nM eine stark positive Stimulation des GABA-induzierten Ionenstromes. Maximale relative Stimulation wurde bei einer Konzentration von 10 µM erreicht, bei der Hispidulin 24 % der maximalen Diazepam-Wirkung aufwies. Da Hispidulin einen mit BZD-Agonisten vergleichbaren, jedoch geringeren Einfluss auf die GABA-induzierten Ströme zeigte, wurde das pharmakologische Profil als partiell agonistisch charakterisiert. Die weiteren Studien waren daher auf den Nachweis einer in vivo-Wirksamkeit von Hispidulin ausgerichtet. Das Modell der Mongolischen Wüstenrennmaus (Gerbil, Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung epileptiformer Krämpfe und wird eingesetzt, um die Wirkung potentieller Antiepileptika zu untersuchen. Es bot uns die Möglichkeit, erste in vivo-Studien mit Hispidulin durchzuführen. Hierzu sind mittelschwere bis schwere Anfälle mit einer Häufigkeit von etwa 90 % induziert worden. Nach siebentägiger Verfütterung von Hispidulin (10 mg/kg KG pro Tag) und Diazepam (2 mg/kg KG pro Tag) (als Positivkontrolle) wurde sowohl in der Hispidulin-, als auch in der Positivkontrollgruppe eine Reduzierung schwerer Anfälle auf 30 bzw. 25 % beobachtet. Hispidulin zeigte in vivo eine mit Diazepam vergleichbare antikonvulsive Wirkung und damit das Potential eines möglichen Antiepileptikums. N2 - In this study, ligands of the central benzodiazepine receptor (BZD-R) from plant tissues were investigated. The activity of the first part was devoted to investigations of “natural” benzodiazepines (BZD). Their occurrence has been observed in several studies; potentially, microorganisms contribute to their biogenesis. It was the aim of our studies to clarify whether BZD can be formed under sterile conditions, i.e. excluding any microbial activity. Thus, plant cell tissues and cell regenerates of Solanum tuberosum and Artemisia dracunculus, cultivated under sterile conditions, were checked for their binding affinity to the BZD-R. For this purpose, methanolic extracts were purified by solid phase extraction and preparative HPLC. Fractions with a significant displacing potency in the BZD radio receptor binding assay (RRA) were studied for their content of selected BZD by on-line HPLC-electrospray-tandem mass spectrometry (HPLC-ESIpos-MS/MS) in the ‘selected reaction monitoring’ (SRM) mode. Using this technique, delorazepam and temazepam were found in the extract of Artemisia dracunculus cell tissue, whereas Solanum tuberosum herb contained diazepam and temazepam. The second part of our work comprised studies on novel natural non-BZD-like ligands of the BZD-R. Thus, methanolic extracts from several plant species were screened for their activity in the RRA. We focused our interest on plants which are known for their sedative and anticonvulsive effects and , thus used in folkloric medicine. The extract from Salvia officinalis L. was chosen for subsequent RRA guided analyses. After several chromatographic purification steps, three flavones and two abietane diterpenes functioning as BZD-R active components were separated. The BZD-R active flavones were identified as apigenin (5,7,4’-trihydroxyflavone) (1), hispidulin (5,7,4’- trihydroxy-6-methoxyflavone) (2) and cirsimaritin (5,4’-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone) (3). The two diterpenes were characterized as 7-methoxyrosmanol (4) and galdosol (5). Hispidulin (2), 7-methoxyrosmanol (4) and galdosol (5) showed the strongest binding activities to the BZD-R with IC50 values of 1.3, 7.2 and 0.8 µM, respectively. The affinities measured for apigenin (1) and cirsimaritin (3) were lower, revealing IC 50 values of 30 and 350 µM, respectively. The high BZD-R activity of hispidulin in the RRA prompted us to investigate its pharmacological profile and in vivo efficiency. As the isolation from plant material is very time- and material-consuming, we provided hispidulin by chemical synthesis. This was realized in accordance with the method of Baker-Venkataraman, starting with 4-benzyloxy-2,3-dimethoxy-6-hydroxyacetophenone and 4-benzyloxybenzoic acid chloride. Reactants were prepared in separate routes from 2,4,6-trihydroxyacetophenone and 4-hydroxybenzoic acid, respectively. The benzoyl ester was built from the actophenone and acid chloride component and rearranged to the corresponding 1,3-diketone under basic conditions. The 1,3-diketone cyclized to the flavone in the presence of acid and heat. In the last step, the protection groups and the labile C-5-methoxy group were removed by reaction with 1 M BCl3 solution at -70 °C. Chemically synthesized hispidulin was investigated for its pharmacological properties with recombinant GABAA receptors in the Xenopus laevis oocyte model. Substance concentrations of 50 nM and higher strongly stimulated the GABA-induced chloride ion influx at all receptor subtypes (alpha1-3,5,6beta2gamma2). Maximum relative stimulation was achieved with 10 µM hispidulin. At this concentration, hispidulin showed 24 % of the maximum diazepam efficiency. Hispidulin therefore showed positive modulation of the GABAA receptor with lower efficiency compared to BZD. The pharmacological profile was thus characterized as partially agonistic. Consequently, further studies were focused on the in vivo efficacy of hispidulin. BZD agonists show antiepileptic effects in vivo. The mongolian gerbil model (Meriones unguiculatus) is a natural animal model to investigate epileptic seizures and effects of potential antiepileptics. It provided the possibility for a first in vivo experiment with hispidulin to simultaneously detect its biological relevance and in vivo efficiency. Strong seizures were induced in about 90 % of the animals. After oral application of hispidulin (10 mg/kg body weight per day; test group) and diazepam (2 mg/kg body weight per day; positive control group) for seven days, both groups showed reduction of strong seizures to 30 and 25 %, respectively. Hispidulin revealed anticonvulsive in vivo effects, which were comparable to diazepam. It therefore exhibits the potential of a putative antiepileptic drug. KW - Benzodiazepin-Rezeptor-Liganden KW - Artemisia dracunculus KW - Solanum tuberosum KW - Hispidulin KW - Benzodiazepine receptor ligands KW - Artemisia dracunculus KW - Solanum tuberosum KW - hispidulin Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5372 ER - TY - THES A1 - Machon, Christian T1 - Thermodynamische Untersuchungen und semiempirische Berechnungen an Dihydroxynaphthalinen und einfachen Naphthalinderivaten T1 - Thermodynamic investigations and semiempirical calculations on dihydroxynaphthalenes and derivatives of naphthalene N2 - Die Wirksamkeit eines Arzneistoffs hängt in entscheidendem Maße von seiner Wasserlöslichkeit ab. Schlechte Löslichkeit bedeutet eine große positive Änderung der Freien Energie während des Lösevorgangs. Hinweise zu finden, die zum besseren Verständnis des Lösungsprozesses führen, ist das Ziel dieser Arbeit. Auf der Grundlage des Hess’schen Satzes wird der Lösungsprozess in Ersatzprozesse zerlegt. Die Teilschritte der Ersatzprozesse werden thermodynamisch, kalorimetrisch und quantenchemisch beschrieben. Freie Energien, Standardenthalpien und Standardentropien der Teilschritte werden erfasst und beurteilt. Weitere physikochemische Größen werden gemessen oder berechnet, die mit den einzelnen Teilschritten in Zusammenhang stehen können. Einfache Naphthalinderivate dienen als Modellsubstanzen. Dies sind zwei einfach und sieben zweifach hydroxylierte Naphthaline, 1-Naphthylamin, 4-Chlor-1-naphthol und 2-Naphthalinthiol. Zum einen wird der Lösungsvorgang als Summe aus Sublimation und anschließender Solvatation betrachtet. Die Freien Sublimationsenergien werden aus dem experimentell ermittelten Sublimationsdampfdruck berechnet. Dies geschieht mittels einer Hochvakuumapparatur oder einer gaschromatographischen Methode. Je mehr polare Gruppen am Grundgerüst sind, desto höher ist der energetische Aufwand, das Molekül zu sublimieren. Die Freie Energie beträgt für Naphthalin 30,5 [kJ·mol-1], für einfach substituierte Naphthaline 40,1 und 45,3 [kJ·mol-1] und für zweifach hydroxylierte Naphthaline 51,8 bis 67,5 [kJ·mol-1]. In ähnlichem Verhältnis stehen auch die Freien Solvatationsenergien. Diese werden mittels AMSOL, eines quantenchemischen semiempirischen Rechenprogramm, für zwei Parametrisierungen AM1 und PM3 berechnet. Die Löslichkeit der Substanzen in Wasser wird ermittelt, und daraus die Freie Lösungsenergie berechnet. Der Unterschied in den Freien Lösungsenergien ist trotz des größeren Energieaufwandes der substituierten Derivate bei der Sublimation um ca. 10 [kJ·mol-1] je polarer Gruppe nicht deutlich. Die Ursache ist die Energiefreisetzung während der Solvatation, die mit zunehmenden polaren Gruppen mehr Energie freisetzt. Gründe dafür sind vermehrte Wasserstoffbrückenbindungen und stärkere Dipol-Dipol-Wechelswirkungen der höher substituierten Naphthaline. Ein den Freien Energien ähnliches Bild ergibt sich bei der Betrachtung der Standardenthalpien. Die Standardsublimationsenthalpie wird aus Sublimationsdrücken bei unterschiedlichen Temperaturen berechnet, die Standardlösungsenthalpie mittels Kalorimetrie und die Standardsolvatationsenthalpie aus der Differenz der beiden vorangegangenen. Adsorptionsmessungen werden durchgeführt, um kalorimetrische Falschmessungen durch Adsorption von Wasser an die Substanzen auszuschließen. Die Ursachen für ein den Freien Energien ähnliches Verhalten sind die gleichen. Eine Ausnahme bildet 1,3-Dihydroxynaphthalin, bei dem die Standardlösungsenthalpie um den Faktor 4 größer ist als bei den restlichen Dihydroxynaphthalinderivaten. Die Standardentropien werden aus den vorher gewonnenen Größen berechnet. Die Standardsublimationsentropien der untersuchten Substanzen liegen zwischen 162 und 350 [J·mol-1·K-1]. Ebenso steigen sie beim Lösevorgang mit Ausnahme von 2-Naphthalinthiol. Dort liegt die Ursache in der mangelnden Hydrophilie, so dass sowohl beim Lösen als auch beim Mischen der Ordnungszustand zunimmt. Bei der Solvatation sinkt die Entropiealler Substanzen mit Ausnahme von 1,3- Dihydroxynaphthalin. Eine Beurteilung aufgrund der Entropien zwischen den Naphthalinen zu machen, ist anhand der Messergebnisse nicht möglich. Die zweite Betrachtungsweise legt dem Lösungsprozess das Schmelzen und anschließende Mischen der Substanz mit dem Lösungsmittel zugrunde. Die Standardschmelzenthalpie wird kalorimetrisch aus Schmelzpunkt, Differenz der Wärmekapazitäten und der Schmelzwärme am Schmelzpunkt ermittelt. Die Standardmischungsenthalpien werden aus der Differenz von kalorimetrisch gemessener Standardlösungsenthalpie und Standardschmelzenthalpie berechnet. Die Standardschmelzenthalpien der Dihydroxynaphthaline sind geringer. Dies hat allerdings in den höheren Schmelzpunkten seine Ursache. Das chlorierte 1-Naphthol liegt mit seinem Schmelzverhalten im Bereich des einfachen 1-Naphthols, so dass das Chloratom scheinbar keine große Rolle im Schmelzprozess spielt. Die Änderungen der Entropien während des Schmelzprozesses werden aus den gleichen Größen wie die Standardschmelzenthalpie gewonnen. Die Mischungsentropie wird aus der Differenz von Schmelz- und Lösungsentropie berechnet. Die Ordnung während des Mischungsvorganges nimmt bei allen untersuchten Substanzen zu außer bei 2-Naphthalinthiol und Naphthalin. Beide hydrophoben Moleküle haben in wässriger Lösung weniger Möglichkeiten sich anzuordnen als in der Schmelze. In die Berechnung der Schmelzentropien gehen die Schmelztemperaturen mit ein. Je höher der Schmelzpunkt ist, desto niedriger ist die Standardschmelzentropie. Die Solvatationsenergien werden mittels AM1- und PM3-Parametrisierung in AMSOL berechnet und mit dem experimentell ermitteltem Wert verglichen. Die Berechnungsmethoden zeigen eine statistisch nicht unterscheidbare gleiche Korrelation von r2 = 0,97 für AM1 und r2 = 0,98 für PM3. Die Berechnung der Freien Solvatationsenergie setzt sich aus einzelnen Teilbeträgen zusammen. Ein Teil ist die freiwerdende Polarisationsenergie, die mit zunehmender Zahl polarer Substituenten ansteigt, da Partialladungen häufiger auftreten und polarisiert werden können. Auch die Oberflächenenergie trägt zur stärkeren Solvatation polar substituierter Naphthaline bei. Van der Waals-Oberflächen und –Volumina der untersuchten Moleküle werden mittels AMSOL berechnet. Die Oberflächen der Dihydroxynaphthaline liegen bei ca. 375 [Ǻ2], die einfach substituierten darunter. Die Volumina der Dihydroxynaphthaline werden zu ca. 146 [Ǻ3] berechnet. Berechnete logarithmierte Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten werden mit den experimentell ermittelten verglichen. Zur Berechnung wird eine AM1- und PM3-Parametrisierung verwendet. Beide Parametersätze können nur unzureichend Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten berechnen. Die Bestimmtheitsmaße r2 liegen unter 0,79. Modellrechnungen weisen als abschließende Beurteilung auf einzelne Größen hin, die mit Freier Sublimationsenergie, Freier Solvatationsenergie und Freier Lösungsenergie in engerem Zusammenhang stehen. Die Einflussgrößen werden auf maximal drei festgelegt, um eine Zufallskorrelation auszuschließen. Es lässt sich ein Modell für die Freie Sublimationsenergie berechnen, das für AM1-Berechnungen ein Bestimmtheitsmaß von r2 = 0,984 zeigt und die Moleküloberfläche, die Wechselwirkung von Polarisationsenergie und Molekülvolumen und das quadrierte Molekülvolumen mit einbezieht. Für PM3-Berechnungen werden das Molekülvolumen, das Dipolmoment in der Gasphase und die Wechselwirkung von Polarisationsenergie und Molekülvolumen herangezogen, wobei das Bestimmtheitsmaß r2 = 0,986 ist. Die experimentell ermittelte Freie Sublimationsenergie der untersuchten Substanzen kann durch drei berechnete Parameter beschrieben werden. Beim Modell zur Freien Solvatationsenergie werden Polarisationsenergie, Oberflächenenergie und Schmelztemperatur als die entscheidenden Einflussparameter herangezogen. Das Bestimmtheitsmaß r2 erreicht 0,979 für AM1-Berechnungen und 0,983 für PM3-Berechnungen. Das Modell zur Berechnung der Freien Lösungsenergie beruht auf der Polarisationsenergie, der Schmelztemperatur und dem Molekülvolumen bei AM1-Berechnungen. Statt des Molekülvolumens wird bei PM3-Berechnungen als dritte Größe die Schmelzwärme herangezogen. Die Korrelation ist mit r2 = 0,847 bei AM1-Berechnungen und r2 = 0,879 bei PM3-Berechnungen nicht zufällig, aber nicht so deutlich wie bei den beiden anderen Modellierungen. Ausblickend lässt sich festhalten, dass auch 13 Substanzen für eine umfassende theoretische Erfassung der Ersatzprozesse zum Lösungsvorgang nicht ausreichen. Ein wichtiger Schritt wird die Beschreibung der Kristallstruktur und der Gitterenergie sein, um befriedigende Löslichkeitsvorhersagen machen zu können. N2 - To a large extent the effectivity of a drug depends on its solubility in water. Poor solubility is characterised by a great positive change of the free energy associated with the dissolution process. It is the aim of this dissertation to contribute to a better understanding of the dissolution process. According to the Hess theorem the dissolution process can be split into a series of alternative processes having the same starting and end points as the direct dissolution. Some steps of these alternative processes can be described by means of thermodynamical, calorimetrical and quantum chemical methods. By standardisation the standard free energies, the standard enthalpies as well as the standard entropies are obtained from the corresponding experimentally determined values. Other physical-chemical parameters required to describe some of the alternative processes, e.g. vapour pressure or polarisation energies, were determined experimentally or calculated by quantum chemical methods. Simple naphthalene derivatives served as model substances: two mono- and seven bihydroxylated naphthalenes, 1-naphthylamine, 4-chloro-1-naphthol and 2-naphthalenethiole. In one of these alternative processes dissolution is considered as a sequence of sublimation and solvation. The standard free energies of sublimation were calculated from the vapour pressures of sublimation which were determined by means of a high-vacuum apparatus or by gaschromatography. The standard free energy of sublimation increases with an increasing number of polar groups in a molecule. For naphthalene a value of 30,5 [kJ·mol-1], for monohydroxylated naphthalenes values between 40,1 and 45,3 [kJ·mol-1] were observed. The corresponding values for bihydroxylated naphthalenes ranged from 51,8 to 67,5 [kJ·mol-1]. Similar relations were observed with the standard free energies of solvation. They were calculated using the semiempirical quantum chemical program package AMSOL with the AM1 as well as with the PM3 parametrisations. The standard free energies of dissolution of the various substances is calculated from their solubilities in water which are determined experimentally. Even considering the fact that the introduction of a polar group into a naphthalene molecule increases their free energies of sublimation by about 10 [kJ·mol-1], the differences in the standard free energies of dissolution are still difficult to explain. An increased number of hydrogen bonds and stronger dipole-dipole interactions observed in higher substituted naphthalenes may be potential explanations. The standard enthalpies behave in a similar way as the corresponding standard free energies. The standard dissolution enthalpy can be calculated by standardisation of the dissolution enthalpy determined calorimetrically. The experimentally determined solution enthalpies would be wrong if in the calorimetric cell the substances to be dissolved would adsorb water during the temperature equilibration time. In order to check for such a potential error, water adsorption isotherms were determined for all test substances. The magnitude of the various enthalpies can be explained by the same facts as in the case of the free energies. 1,3-dihydroxynaphthalene is an exception. Its standard dissolution enthalpy four times bigger than the ones of the other dihydroxynaphthalenes. The standard entropies are calculated from the standard free energies and standard enthalpies respectively. The standard sublimation entropies of the substances included in this study range from 162 to 350 [J·mol-1·K-1]. With the exception of 2-naphthalinthiole the standard dissolution entropies are significantly higher than the corresponding sublimation entropies. The sequence formed by the melting of a substance and the subsequent mixing of this melt with a solvent is a second alternative process according to the Hess theorem to describe the dissolution of a substance in a solvent. The standard melting enthalpy is calculated from the molar melting enthalpy determined by means of a calorimeter at the melting temperature of the substances and from the differences of the heat capacities at constant pressure of the solid substance and of its melt. The standard mixing enthalpy is calculated from the standard solution enthalpy and from the standard melting enthalpy. Due to their high melting temperatures the standard melting enthalpies of the dihydroxynaphthalenes are lower than expected. As the melting temperatures of the chlorinated 1-naphthol and of 1-naphthol do not differ markedly one can assume that the chlorine atom has no significant influence on the melting energy. The melting entropy is calculated from the melting enthalpy and the melting temperature. The higher the melting temperature the lower is the standard melting entropy. The mixing entropy is calculated as the difference of the entropies of melting and of solution respectively. With the exception of 2-naphthalenethiole and naphthalene for all substances included in this study the mixing process is associated with an increase in order. These two hydrophobic molecules have less possibilities to arrange themselves in aqueous solutions than in the melt. The solvation energies are calculated by means of AMSOL using the AM1 as well as the PM3 parametrisations. They are compared with the results obtained experimentally. For both sets of parameters the correlation coefficients determined for the results of the quantum chemical calculations are almost identical, r2 = 0,97 for AM1 and r2 = 0,98 for PM3. The solvation energy is considered as consisting of several terms. The total electrostatic energy increases with an increasing number of polar substituents as they allow for a greater number of partial charges and hence for more polarisations. The component accounts for the free energy of formation of a cavity in the solvent and for changes in dispersion interactions and solvent structure that accompany the solvation process. Its contribution to the solvation energy increases for naphthalenes with polar substituents. By means of AMSOL the van der Waals surfaces as well as the van der Waals volumes were calculated. For the dihydroxynaphthalenes surfaces of about 375 Å2 were obtained. The corresponding values for the monosubstituted compounds are somewhat smaller. For the dihydroxynaphthalenes van der Waals volumes of about 146 Å3 were calculated. Octanol-water partition coefficients were calculated using both sets of parameters, AM1 and PM3, as well as determined experimentally. The agreement between the partition coefficients obtained from the quantum chemical calculations and those determined experimentally is rather poor. The regression coefficients r2 are lower than 0,79. In order to gain a better understanding which of the following factors, e.g. polarisation energy, van der Waals surface, van der Waals volume or the melting temperature, take influence on parameters like free sublimation energy, free solvation energy and free solution energy, linear regressions were performed. Only three parameters were included in the linear models in order to avoid a good mathematical fit having no physical meaning. On the basis of the results obtained with AM1 parameters a linear model was found for the free sublimation energy including the interaction between polarisation energy and van der Waals volume, the van der Waals surface and the squared van der Waals volume. The correlation coefficient of this model is given by r2 = 0,984. If the results obtained from calculations with the PM3 are used the free sublimation energy can be described by a model including the interaction between the polarisation energy and the van der Waals volume, the van der Waals volume and the dipole moment in the gas phase. Its correlation coefficient is given by r2 = 0,986. The free sublimation energy as determined experimentally is in a good agreement with the results obtained with this linear model. The attempt to describe the free solvation energy by a linear model showed that good approximations can be obtained by including the polarisation energy, the surface energy as well as the melting point as crucial parameters. Using the results from calculations on a AM1 basis a correlation coefficient r2 = 0,979 was obtained. For corresponding calculations with results on a PM3 basis the correlation coefficient was given by r2 = 0,983. When using results from calculations on the basis of the AM1 parametrisation the free solution energy can be approximated by a linear model with the polarisation energy, the melting temperature and the van der Waals volume as parameters. The correlation coefficient is given by r2 = 0,847. With results obtained from calculations with the PM3 parametrisation in the linear model the van der Waals volume had to be replaced by the heat of melting to obtain a correlation coefficient of r2 = 0,879. Whereas the free energy of sublimation as well as the free energy of solvation could be satisfactorily approximated by a linear three parameter model the approximation is not as good as in the case of the free energy of solution. As a summary it has to be stated that the data gathered for thirteen substances still form a basis being too small for a detailed analysis of their poor water solubility. A closer consideration of the crystal structure and the corresponding lattice energies may contribute to a better understanding of this problem. KW - Dihydroxynaphthaline KW - Naphthalinderivate KW - Wasserlöslichkeit KW - Thermodynamik KW - Naphthaline KW - AMSOL KW - Lösungsprozess KW - Hess'scher Satz KW - naphthalenes KW - AMSOL KW - process of solution KW - Hess theorem Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7526 ER - TY - THES A1 - Wienen, Frank T1 - Kapillarelektrophoretische Trennung und Quantifizierung von Aminoglykosiden und Clotrimazol T1 - Separation and quantification of aminoglycosides and clotrimazole by means of capillary electrophoresis N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden kapillarelektrophoretische Methoden entwickelt, mit denen es möglich ist, Gentamicinsulfat in Haupt- und Nebenkomponenten zu trennen. Ausgelöst wurden die Untersuchungen im Jahr 2000, da in den USA über 60 Patienten durch Gentamicin starben. Es wurde vermutet, dass dies auf Verunreinigungen in gewissen Chargen zurückzuführen ist. Gentamicin wird fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen. Durch leichte Abweichungen im Herstellungsprozess können Produkte entstehen, die mit den bisher angewendeten Analysenmethoden nicht nachzuweisen sind. In der momentanen Arzneibuch-Monographie von Gentamicinsulfat wird zur Prüfung der verwandten Substanzen eine HPLC-Methode beschrieben, die Gentamicin ohne Derivatisierung mit einem gepulsten amperometrischen Detektor detektiert. Vorteil dieser Methode ist, dass Gentamicin nicht derivatisiert werden muss. Der große Nachteil dieser Methode ist aber, dass die einzelnen Peaks sehr lange Migrationszeiten haben (bis über 10 Minuten) und somit Verunreinigungen überdeckt werden können. Außerdem sind viele Bestandteile nicht von den Hauptkomponenten abgetrennt. Weiterhin ist diese Methode nicht sehr robust, da der Detektor sehr empfindlich ist. Eigene HPLC-Messungen an mehreren Gentamicin-Chargen zeigten die Probleme auf. Da Gentamicin kein chromophores System hat, kann es nicht mit einem UV/VIS-Detektor detektiert werden. Um dies dennoch zu ermöglichen, kann Gentamicin mit verschiedenen Reagenzien derivatisiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden alle Aminoglykoside mit ortho-Phthaldialdehyd und 2-Mercaptoessigsäure derivatisiert. Somit war eine Detektion bei 330 nm bzw. 340 nm möglich. Zur Trennung von Gentamicinsulfat wurde eine spezielle kapillarelektrophoretische Methode entwickelt. Die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) ist nach Derivatisierung in der Lage, nahezu alle in der Monographie beschriebenen aber auch einige nicht aufgeführte Verunreinigungen zu trennen. Die Trennung erfolgt in einer Kieselgelkapillare mit einer Gesamtlänge von 33.0 cm, einer effektiven Länge von 24.5 cm und einem Innendurchmesser von 50 µm. Als Hintergrundelektrolyt wird ein Natriumtetraborat-Puffer verwendet (100 mM, pH 10.0), zu dem Desoxycholsäure-Natrium als mizellbildendes Reagenz in einer Konzentration von 20 mM und weiterhin beta-Cyclodextrin in einer Konzentration von 15 mM zugegeben wird. Die Proben werden hydrodynamisch bei 5000 Pa innerhalb 5 Sekunden auf der Anodenseite injiziert. Die Trennung erfolgt bei einer Kapillartemperatur von 25 °C und einer Trennspannung von +12 kV. Pikrinsäure wird als Interner Standard benutzt. Die Detektion erfolgt UV-spektroskopisch bei 340 nm. Die Hauptpeaks konnten durch „spiken“ mit den Einzelkomponenten, die u.a. säulenchromatographisch gewonnen wurden, identifiziert werden. Die vier Hauptkomponenten Gentamicin-C1, C1a, C2 und C2a sind basisliniengetrennt ebenso wie Gentamicin-C2b, die Verunreinigungen Garamin, Desoxystreptamin und Sisomicin. Bei den Untersuchungen von über 40 Gentamicin-Chargen verschiedener Hersteller und Händler fielen sowohl deutliche Unterschiede bezüglich der einzelnen Gehalte der Hauptkomponenten auf, als auch verschiedene Grade der Verunreinigungen. Anhand der Menge der Verunreinigungen konnten die Chargen in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Die Verunreinigung Sisomicin kann als Leitsubstanz der Verunreinigungen bezeichnet werden, da bei allen stärker verunreinigten Chargen Sisomicin in beträchtlichen Mengen vorhanden ist. Unter den untersuchten Proben befanden sich auch die Proben, die in den USA die eingangs erwähnten Todesfälle verursacht haben. Diese Proben konnten der Gruppe der stärker verunreinigten Gentamicin-Chargen eindeutig zugewiesen werden. Die Richtigkeit aller Messungen wurde durch 1H-NMR-Messungen bestätigt. Die Anwendbarkeit der entwickelten MEKC-Methode wurde auch an weiteren Aminoglykosiden untersucht. Die Methode ist ohne Änderung auf Sisomicin übertragbar. Der Sisomicin-Peak ist deutlich abgetrennt vom OPA-Reagenzpeak. Selbst kleine Verunreinigungen der CRS-Substanz können mit dieser Methode erkannt werden. Netilmicin und Amikacin können nicht ohne Änderungen mit der Methode vermessen werden, da sie unter diesen Bedingungen mit dem OPA-Peak komigrieren. Eine Anhebung der Trennspannung von +12 kV auf +14 kV lassen die Peaks hervortreten. Eine Unterscheidung der beiden Substanzen ist im Elektropherogramm nicht möglich, allerdings können sie durch 1H-NMR-spektroskopische Messungen identifiziert und unterschieden werden. Netilmicin wurde in vielen Gentamicin-Proben nachgewiesen. Bei Kanamycin liegen mit dieser Methode im Elektropherogramm sehr viele kleine Peaks sehr nahe beieinander. Durch Absenkung der Kapillartemperatur auf 20 °C können diese Peaks etwas besser getrennt werden... N2 - The aim of this study was to separate gentamicin sulfate into its major and minor components by means of capillary electrophoresis. In May 2000 the death of 17 people and 60 people, respectively, was reported, following the administration of the commonly used broad spectrum antibiotic gentamicin sulfate. In addition hundreds of patients suffering from severe side effects were reported. Since this could not be explained by the pharmacological and toxicological properties of gentamicin, it was assumed that the side effects were related to impurities. Due to the fact that gentamicin is a fermentation product of Micromonospora purpurea, minor variations in the fermentation procedure may cause products, that cannot be detected by the analytical methods applied thus far. The current European Pharmacopoeia limits for related substance of gentamicin by means of an HPLC-method in combination with a pulsed amperometric detector. The advantage of this method is the fact, that it is not necessary to derivatize gentamicin. However, a major disadvantage of the method is the broadness of the main peaks (>10 minutes/peak). Hence, minor products could be covered by the main peaks. Furthermore, various peaks are not baseline separated and the method is not very robust owing to the highly sensitive detector. Due to the lack of a chromophore, gentamicin needs to be derivatized to allow detection by means of an UV-detector. In this study all aminoglycosides were labeled with orthophthaldialdehyde (OPA) in combination with 2-mercaptoacetic acid, which enabled detection at a wavelength of 340 nm. To separate gentamicin as OPA derivative, a method based on micellar electrokinetic chromatography (MEKC) was developed. This technique makes it possible to separate most of the impurities specified in the gentamicin monograph (garamine, deoxystreptamine, and sisomicin) and some additional, not further specified impurities such as paromamine and unknown products. The separation is carried out in a fused-silica capillary with a total length of 33.0 cm, an effective length of 24.5 cm and an inner diameter of 50 µm. Using sodium tetraborate buffer (100 mM, pH 10.0) as background electrolyte (BGE), deoxycholic acid sodium in a concentration of 20 mM as micelle forming agent and beta-cyclodextrin in a concentration of 15 mM are added. The samples are loaded hydrodynamically at 5000 Pa for 5 seconds on the anode side of the capillary and the separation is carried out at +12 kV and 25 °C. Picric acid is used as an internal standard and UV-detection is performed at 340 nm. Spiking experiments were performed using reference substances, obtained by column chromatography and commercially purchased reference substances for the impurities. The four major components gentamicin C1, C1a, C2, and C2a as well as the minor component C2b and the impurities garamine, deoxystreptamine, and sisomicin are baseline separated. Over 40 gentamicin batches of different pharmaceutical companies and producers were analyzed with respect to the content of the major components as well as the amount of the impurities. Varying levels of the major compounds as well as the impurities were identified, which allowed the grouping of the samples. All samples exhibiting a high amount of impurities were found to a high sisomicin concentration. Hence, sisomicin can be referred to as an impurity indicator. Some of the batches under scrutiny were responsible for the deaths found in the US. All these samples could be unambiguously assigned to the group which is characterized by a high number and a relatively high quantity of most unspecified impurities. All CE-measurements were verified by 1H NMR measurements. To investigate the applicability of the developed MEKC method, other aminoglycosides were also investigated. For sisomicin the standard method can be used without modification, since the sisomicin peak is separated from the OPA reagent peak and even small amounts of impurities of the CRS-substance can be detected with this method. For netilmicin and amikacin the developed method has to be modified. Under standard conditions the peaks of both substances co-migrates with the OPA reagent peak. Raising the voltage from +12 kV to +14 kV both peaks are separated. All Gentamicin samples were measured again using these new conditions. Netilmicin was often found in gentamicin samples. However, for these new conditions the migration time of netilmicin and amikacin are similar. Hence, they cannot be differentiated from each other in the same sample. Nevertheless, this differentiation can be carried out with 1H NMR measurements. Kanamycin samples show many peaks in a small zone of the electropherogram using the MEKC standard method. A slightly better separation can be obtained by using a lower temperature of the capillary of 20 °C instead of 25 °C... KW - Aminoglykoside KW - Micellare elektrokinetische Kapillarchromatographie KW - Gentamicin KW - Verunreinigung KW - Clotrimazol KW - Quantitative Analyse KW - Gentamicin KW - MEKC KW - Cyclodextrin KW - ortho-Phthaldialdehyd KW - Derivatisierung KW - gentamicin KW - MEKC KW - cyclodextrin KW - ortho-phthaldialdehyd KW - derivatisation Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7796 ER - TY - THES A1 - Hauck, Tobias T1 - Zuckerphosphate als Vorläufer von 4-Hydroxy-3(2H)-furanonen - Biochemische Transformation durch die Hefe Zygosaccharomyces rouxii und chemische Bildung unter physiologischen Bedingungen T1 - Sugar phosphates as precursors of 4-hydroxy-3(2H)-furanones - biochemical transformation by the yeast Zygosaccharomyces rouxii and chemical formation under physiological conditions N2 - In der vorliegenden Arbeit werden instrumentell-analytische Studien zur enzymatischen und chemischen Bildung von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF) und 4-Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) – zwei wichtigen Aromakomponenten zahl-reicher Früchte und verarbeiteter Lebensmittel – vorgestellt. Die Studien demonstrieren erstmals die Bildung dieser Verbindungen aus Zuckerphosphaten unter physiologischen Reaktionsbedingungen. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag dabei auf der Bildung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat (Fru-1,6-dP) durch den Hefestamm Zygosaccharomyces rouxii. Der Zusatz von 1-13C-Fru-1,6-dP bzw. 13C6-D-Glucose zum Nährmedium der Hefe Z. rouxii zeigte, dass ausschließlich exogen zugesetztes Fru-1,6-dP durch die Hefe zu HDMF transformiert wird. Untersuchungen, in denen der Einfluss verschiedener Wachstumsbedingungen auf die HDMF-Bildung durch Z. rouxii getestet wurde, zeigten bezüglich der HDMF-Bildung ein pH-Optimum bei pH 5.1 sowie eine maximale Produktivität der Zellen bei einer NaCl-Konzentration von 20%. Mittels einer neu entwickelten cKZE-Methode wurde für durch Z. rouxii gebildetes HDMF eine Enantiomerenanreicherung von 27%ee nachgewiesen, was eine enantioselektive Biosynthese durch Enzymsysteme der Hefe impliziert. Als Grundvoraussetzung für den Nachweis einer Enantiomerenanreicherung im HDMF-Molekül stellte sich ein schwach-saurer pH-Wert des wässrigen Mediums heraus. Dies konnte durch Ermittlung der Tautomerisierungsgeschwindigkeit des HDMF-Moleküls mittels 1H-NMR-Spektroskopie belegt werden. Anhand von HPLC-MS/MS-Analysen wurde die Bildung von HMF in zellfreien cytosolischen Rohproteinextrakte aus Z. rouxii, welche mit Fru-1,6-dP und Nicotinamidadenindinucleotiden (NAD, NADH, NADP, NADPH) inkubiert worden waren, nachgewiesen. In Substratstudien wurde HMF nach Applikation von Fru-1,6-dP, D-Fructose-6-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, D-Ribose-5-phosphat (Rib-5-P) und D-Ribulose-1,5-diphosphat an cytosolische Proteinextrakte nachgewiesen. Die für die Transformationen der Hexosephosphate zu D-Ribulose-5-phosphat (Ribu-5-P) benötigten Enzyme Fructose-1,6-diphosphatase, Phosphohexose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase konnten mittels spezifischer Enzymassays in den cytosolischen Extrakten nachgewiesen werden. Gebildetes Ribu-5-P wird im Folgenden spontan in HMF umgelagert (> 1%). Die Inkubation von Phosphoribose-Isomerase mit Rib-5-P in Gegenwart von o-Phenylendiamin (o-PD) führte zur Bildung von 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin, das anhand seiner UV-, MS- und NMR-Daten eindeutig identifiziert wurde. Daraus konnte die Bildung von 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) in den Reaktionsansätzen abgeleitet werden, was durch die Synthese der entsprechenden deuterierten bzw. unmarkierten Alditolacetat-Derivate und anschließende HRGC-MS-Analyse abgesichert wurde. Durch Inkubation von 1-13C-Ribu-5-P bzw. 5-13C-Ribu-5-P mit o-PD und HPLC-MS/MS-Analyse der entstandenen Quinoxalinderivate konnte gezeigt werden, dass die Methylgruppe des DPD-Moleküls infolge einer nicht-enzymatischen Phosphat-Eliminierung gebildet wird. Nach Applikation von o-PD an reife Tomaten wurde mittels HPLC-MS/MS ebenfalls 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin detektiert. Dieses Ergebnis impliziert ein genuines Vorkommen von DPD in Tomaten, in deren Aromaextrakten auch HMF nachgewiesen wurde. Somit ist in natürlichen Systemen ebenfalls von einer HMF-Bildung über diese Zwischenverbindung auszugehen. Anhand von HPLC-UV-MS/MS-Analysen wurde eine selektive Bildung von HDMF aus Fru-1,6-dP in Gegenwart von NADH unter milden Reaktionsbedingungen nachgewiesen. Durch Inkubation von 1-13C-Fru-1,6-dP mit [4R,S-2H2]-NADH und anschließender HRGC-MS-Analyse des gebildeten isotopen-markierten HDMF konnte gezeigt werden, dass HDMF infolge eines nicht-enzymatischen Hydrid-Transfers von NADH auf eine aus Fru-1,6-dP abgeleitete Zwischenverbindung gebildet wird. Das Hydrid-Ion wird hierbei selektiv auf C-5 oder C-6 des Kohlenhydratgrundgerüstes des Zuckerphosphates übertragen. Der Zusatz von o-PD und Fru-1,6-dP zum Z. rouxii-Nährmedium und anschließende HPLC-DAD-Analyse führte zur Detektion von drei Quinoxalinderivaten. Diese wurden anhand ihrer MS/MS-Daten und NMR-Spektren als phosphorylierte Quinoxalinderivate identifiziert, aus denen sich die Bildung von 2-Hexosulose-6-phosphat, 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat und 1,4-Dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat in den Nährmedien ableiten ließ. Somit gelang erstmals der Beweis der Bildung von 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat im Nährmedium, einem vielfach postulierten, aber bislang nicht nachgewiesenen Intermediat der HDMF-Bildung aus Fru-1,6-dP. Aufgrund der enantioselektiven Bildung von HDMF durch die Hefen wird daher bei der HDMF-Biosynthese durch Z. rouxii von einer Kombination aus nicht-enzymatischen Reaktionsschritten und einer durch Oxidoreduktasen der Hefezellen vermittelten Reduktion ausgegangen. N2 - The present work represents instrumental-analytical studies on the enzymatic and chemical formation of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (HDMF) and 4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone (HMF), two important flavour compounds in many fruits and processed food. The performed studies demonstrate for the first time the formation of these compounds from carbohydrate phosphates under physiological reaction conditions. Of special interest during these studies was the formation of HDMF from D-fructose-1,6-diphosphate (Fru-1,6-dP) by the yeast Zygosaccharomyces rouxii. The addition of 1-13C-D-Fru-1,6-dP and 13C6-D-glucose to the nutrient medium of Z. rouxii revealed the exclusive formation of HDMF by Z. rouxii from exogenously supplied Fru-1,6-dP. Studies dealing with the formation of HDMF by Z. rouxii under various culture conditions showed an optimal pH value of 5.1 with regard to the yield of HDMF and a maximum formation per yeast cell at 20 % sodium chloride in the nutrient medium. By means of a newly developed cKZE-method for HDMF formed by Z. rouxii an enantiomeric excess value of 27 % ee was demonstrated, implying an enantioselective biosynthesis catalysed by enzymes of the yeast. A slightly acidic pH value of the aqueous medium turned out to be essential for the detection of an enantiomeric enrichment in the HDMF molecule. This was unequivocally proved by the determination of the tautomerization velocity of the HDMF molecule by 1H-NMR spectroscopy. The formation of HMF in cell-free cytosolic protein extracts obtained from Z. rouxii incubated with Fru-1,6-dP and nicotinamide adenine dinucleotides (NAD, NADH, NADP and NADPH) was detected by means of HPLC-MS/MS analysis. HMF was formed from Fru-1,6-dP, D-fructose-6-phosphate, D-glucose-6-phosphate, 6-phosphogluconate, D-ribose-5-phosphate (Rib-5-P) and D-ribulose-1,5-diphosphate after application to cytosolic protein extracts. Specific enzyme assays revealed activity of fructose-1,6-diphosphatase, phosphohexose isomerase, glucose-6-phosphate dehydro-genase and 6-phosphogluconate dehydrogenase in the cytosolic extracts, enzymes required for the transformation of the hexose phosphates to D-ribulose-5-phosphate (Ribu-5-P). Formed Ribu-5-P is spontaneously converted to HMF (> 1 %). Incubation of ribosephosphate isomerase with Rib-5-P in presence of o-phenylenediamine (o-PD) led to the formation of 2-methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxaline, which was unequivocally identified by its UV-, MS- and NMR-data. Thus, the formation of 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD) in the incubation mixtures could be deduced. The formation of this compound was ensured by its conversion to the respective deuterium labelled or unlabelled alditol acetate derivatives and subsequent HRGC-MS analysis. By incubation of 1-13C-Ribu-5-P as well as 5-13C-Ribu-5-P with o-PD and analysis of the respective quinoxaline derivatives by means of HPLC-MS/MS analysis we demonstrated a formation of the methyl-group in the DPD molecule in consequence of a non-enzymatic phosphate elimination. Application of o-PD to ripe tomatoes led to the detection of 2-methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxaline as well, using HPLC-MS/MS analysis, implying the genuine occurrence of DPD in tomatoes. Since HMF was also detected in aroma extracts obtained from tomatoes of the same sample HMF formation in natural systems via DPD is quite possible as well. A selective chemical formation of HDMF from Fru-1,6-dP in the presence of NADH under mild reaction conditions was detected by means of HPLC-UV-MS/MS analysis. The incubation of 1-13C-Fru-1,6-dP with [4R,S-2H2]-NADH followed by HRGC-MS analysis of the formed isotopically labelled HDMF revealed, that HDMF is produced in consequence of a non-enzymatic hydride-transfer from NADH to an unknown intermediate derived from Fru-1,6-dP. The hydride-ion is selectively transferred to C-5 or C-6 of the carbohydrate skeleton of the sugar phosphate. The addition of o-PD and Fru-1,6-dP to a Z. rouxii culture medium and subsequent HPLC-DAD analysis revealed the formation of three quinoxaline derivatives. By means of their MS/MS-data and NMR-spectra these compounds were identified as phosphorylated quinoxaline derivatives derived from 2-hexosulose-6-phosphate, 1-deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphate and 1,4-dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphate in the culture medium. Thus, for the first time the chemical formation of 1-deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphate in the culture medium was demonstrated, a generally expected but up to now never identified intermediate in the formation pathway of HDMF from Fru-1,6-dP. Due to the enantioselective formation of HDMF by the yeast an HDMF biosynthesis by Z. rouxii consisting of non-enzymatic reaction steps and a reduction mediated by oxidoreductases of the yeast cells was anticipated. KW - Zygosaccharomyces rouxii KW - Furanone KW - Biosynthese KW - Aromastoff KW - Furanon KW - Zuckerphosphat KW - Zygosaccharomyces KW - Aroma KW - Dicarbonyl KW - furanone KW - sugar phosphate KW - Zygosaccharomyces KW - flavour KW - dicarbonyl Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5871 ER - TY - THES A1 - Seefelder, Walburga T1 - Fumonisine und deren Reaktionsprodukte in Lebensmitteln: Vorkommen, Bedeutung, biologische Aktivität und Metabolismus T1 - Fumonisins and their reaction products in food: occurence, biological activity and metabolism N2 - Im Rahmen der Arbeit werden Ergebnisse zu Untersuchungen an Fumonisinen, einer erts seit 1988 bekannten Gruppe von kanzerogenen Fusarium-Mykotoxinen, vorgestellt. Die Schwerpunkte liegen auf den Aspekten: 1)Qualitative und quantitative Erfassung von NCM-FB1, einem rektionsprodukt von FB1, in maishaltigen Lebensmitteln. 2)Charakterisierung weiterer Reaktionsprodukte der Fumonisine 3)Vorkommen von Fumonisisnen in Gemüse 4)Zellkuturstudien zur biologischen Aktivität der Fumonisine 5)Modellstudien zum Metabolismus von FB1 beim Menschen N2 - The work presents results of investigations on fumonisins, a class presents results of investigations on fumonisins, a class of carcinogenic Fusarium mycotoxins discovered in 1988. Studies focused on following aspects: 1) Qualitative und quantitative determination of N-(Carboxymethyl) fumonisin B1, a reaction product of fumonisin B1, in corn products 2) Characterisation of further fumonisin reaction products 3) Occurrence of fumonisins in vegetables 4) Cell culture studies on the biological activity of fumonisins 5) Model experiments on the metabolism of fumonisin B1 in humans KW - Fumonisine KW - Metabolit KW - Lebensmittel KW - Fumonisine KW - Mykotoxine KW - HPLC-MS/MS KW - Fumonisins KW - mycotoxins KW - HPLC-MS/MS Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5430 ER - TY - THES A1 - Janka, Andreas T1 - Genomische Unterschiede zwischen Shiga Toxin-Produzierenden Escherichia coli (STEC) O157:H7 und Sorbitol Fermentierenden (SF) STEC O157:H- -Stämmen T1 - Genomic Differences between Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157:H7 and sorbitol-fermenting (SF) STEC O157:H- -strains N2 - Sorbitol fermentierende (SF) Shiga Toxin-Produzierende Escherichia coli (STEC)-Stämme des Serotyps O157:H- stellen bedeutsame Auslöser für Durchfallerkrankungen und des lebensbedrohlichen Hämolytisch-Urämischen Syndroms (HUS) in Mitteleuropa dar. Die Virulenzfaktoren und Krankheitsbilder solcher Stämme ähneln denen von STEC O157:H7-Stämmen, welche weltweit am häufigsten innerhalb der O157-Serogruppe isoliert werden. Für zwei STEC O157:H7-Stämme ist die komplette Genomsequenz bereits veröffentlicht. Über SF STEC O157:H- sind hingegen nur einige genetische Unterschiede mit STEC O157:H7 bezüglich der Ausstattung an Virulenzfaktoren bekannt. Diese sind vorwiegend auf den Plasmiden beider Serotypen kodiert. In einem Modell, das die Entstehungsweise des O157-Komplexes zu erklären versucht, wird der nicht begeißelte, Sorbit fermentierende O157:H- -Serotyp als eigene phylogenetische Linie angesehen. Um einen tieferen Einblick in die genomische Diversität dieser beiden O157-Linien zu erhalten, wurden verschiedene molekularbiologische Methoden eingesetzt. Als Modellstamm für SF STEC O157:H- diente der Stamm 493/89, welcher von einem HUS-Patienten aus Deutschland isoliert wurde. Zum einen wurde eine Cosmid-Genbank des Stamms 493/89 sequenziert und mit dem STEC O157:H7-Referenzstamm EDL933 verglichen. Des weiteren wurde eine subtraktive suppressive Hybridisierung (SSH) mit beiden Stämmen des gleichen Serotyps durchgeführt. Ein Vergleich beider Genome mit dem kompletten Genom des apathogenen Laborstammes E. coli K-12 erfolgte über die Makroarraytechnik. Schließlich wurde der Stamm 493/89 mit Hilfe eines Makroarrays, auf dem bekannte Virulenz-assoziierte DNA-Sequenzen untergebracht sind (Pathoarray) untersucht. Nach Anwendung dieser Techniken konnten zwei weitere Gene in SF STEC O157:H- identifiziert werden, die für potentielle Virulenzfaktoren kodieren. Mit dem Gen für den ?EHEC factor for adherence? (Efa1), welcher gleichzeitig auch als Lymphostatin (LifA) beschrieben wird, ist in SF O157:H- ein multifunktionelles Gen vorhanden, welches nur fragmentiert in O157:H7 präsent ist. In 90 % der getesteten SF O157:H- -Stämme wurden außerdem die Gene für das ?Cytolethal Distending Toxin? (CDT) detektiert. Diese weisen die größte Ähnlichkeit zu cdt-III des E. coli O15:H21-Stammes S5 auf, welche dort auf einem Plasmid kodiert vorliegen. Im Gegensatz dazu sprechen die flankierenden Sequenzen von cdt in E. coli 493/89 für ein Gen, das durch einen temperenten Phagen aufgenommen wurde. So konnte cdt, wenn auch nur in geringem Ausmaß in STEC O157:H7-Stämmen durch PCR-Analyse gefunden werden. Die beiden Makroarrays lieferten für beide Serovare eine bemerkenswerte Anzahl spezifischer Sequenzen. Der E. coli K-12 Makroarray bekräftigt zudem die größere Ähnlichkeit des nicht pathogenen E. coli K-12 Genoms mit SF STEC O157:H- als mit STEC O157:H7. Mit Hilfe der Cosmid-Genbank wurde in SF STEC O157:H- eine 8,8 Kb große Sequenz ermittelt, die phagenhomologe Bestandteile der Shigella-Resistance Locus (SRL)-Pathogenitätsinsel (PAI) von Shigella flexneri 2a enthält. Diese Sequenz fehlt in STEC O157:H7 und deutet Gemeinsamkeiten für SF STEC O157:H- und Shigella flexneri 2a bezüglich ihrer Phagentransduktion an. Die Präsenz von efa1/lifA, cdt und der 8,8 Kb großen SRL-homologen Sequenz wurde auch bei E. coli O55:H- -Stämmen durch PCR überprüft. Diese werden als vermutliche Vorstufe des O157-Komplexes angesehen. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass efa1/lifA bereits in diesem E. coli O55-Vorläufer vorhanden war, die SRL-homologe Sequenz aber erst vor und cdt nach der Abzweigung in die O157:H- -Linie erhalten wurde. In O157:H7 wurden efa1/lifA und der SRL-homologe Genbereich teilweise oder vollständig deletiert. Die Ergebnisse bestätigen in ihrer Gesamtheit SF STEC O157:H- als ein eigenständig entwickeltes Pathogen mit klar erkennbaren Unterschieden zu STEC O157:H7 und bekräftigen damit seine bedeutsame Position innerhalb der epidemiologisch relevanten STEC-Serogruppen. N2 - Sorbitol-fermenting (SF) Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains of serotype O157:H- (nonmotile) are important causes of diarrhea and the life-threatening hemolytic uremic syndrome (HUS) in Europe. The virulence characteristics of these strains are similar to those of STEC O157:H7, which is the most frequently isolated STEC serotype causing human diseases worldwide. Recently, the complete genome sequences of two STEC O157:H7 strains have been published. In contrast, the sequences of SF STEC O157:H- remain largely uncharacterized. Therefore, differences in virulence characteristics of the two O157 pathogens are poorly understood and have been till now limited to genes encoded on a large plasmid. In a stepwise evolutionary model proposed for the STEC O157 complex, SF STEC O157:H- strains are classified as a unique phylogenetic lineage. In this work, we used different molecular approaches to gain more insight into the genomic diversity of the two O157 lineages. First, a cosmid gene library of a SF STEC O157:H- strain 493/89, which was isolated from an HUS patient in Germany, was sequenced and compared to the genomic sequences of the STEC O157:H7 reference strain EDL933. Second, a subtractive suppressive hybridization (SSH) between these two strains was performed. Third, the genomes of both O157 pathogens were compared to that of E. coli strain K-12 using a macroarray. Finally, the SF STEC O157:H- strain 493/89 was analyzed for DNA sequences of major virulence genes using a pathoarray. Using these techniques, two genes encoding potential virulence factors, which are specific for SF STEC O157:H-, have been identified. These include i) a 9669-bp open reading frame (ORF) encoding a multifunctional gene efa1/lifA, which is only rudimentarily present in STEC O157:H7; ii) the gene cluster enoding the cytolethal distending toxin (CDT). The cdt cluster of SF STEC O157:H- demonstrates a high similarity to cdt-III of E. coli O15:H21 strain S5, which was reported to be plasmid-encoded. In contrast, the flanking regions of cdt in strain 493/89 indicate the acquisition of cdt via a temperate bacteriophage. In accordance with this hypothesis, cdt could be detected, using a PCR strategy, in 90% of SF STEC O157:H-, but also in STEC O157:H7 strains, even though with a low frequency. Both macroarray methods identified a remarkable amount of specific differences between both O157 serotypes. Moreover, the E. coli K-12 macroarray confirmed a higher similarity of nonpathogenic E. coli K-12 to SF STEC O157:H- than to STEC O157:H7. By sequencing the cosmid library, an 8,8 kb long sequence could be detected in SF STEC O157:H-, which contains elements of the Shigella resistance locus (SRL) pathogenicity island (PAI). These elements are also homologous to bacteriophage sequences. This 8,8 kb sequence is missing in STEC O157:H7 and suggests a common acquisition of bacteriophage elements in SF STEC O157:H- and Shigella flexneri 2a. The presence of efa1/lifA, cdt and the 8,8 kb SRL-homologue sequence was also tested by PCR in E. coli O55:H7 strains which are proposed to be ancestors of the O157 complex. The results indicate, that efa1/lifA was already present in the O157 precursor, but the SRL-homologue sequence was received shortly before branching off the O157:H- lineage. Both sequences were completely or partially deleted in O157:H7. Based on the PCR results, cdt was acquired by the SF STEC O157:H- serotype after this lineage diverged from E. coli O157:H7. In conclusion, all results confirm that SF STEC O157:H- represent a distinct pathogenic group of STEC O157 which demonstrates remarkable genomic, virulence and evolutionary differences from STEC O157:H7. KW - STEC KW - Serogruppe KW - Genanalyse KW - STEC KW - O157 KW - Sorbitolfermentierer KW - Makroarray KW - Subtraktionsmethoden KW - STEC KW - O157 KW - sorbitol-fermenters KW - macroarray KW - subtractive-methods Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5526 ER - TY - THES A1 - Meyer, Kathrin T1 - Nanomaterialien als Fließregulierungsmittel T1 - Nanomaterials as glidants N2 - Die Fließeigenschaften von Pulvern spielen nicht nur in der pharmazeutischen Industrie, sondern auch in verschiedenen anderen Industriezweigen wie z.B. der Lebensmittelindustrie eine bedeutende Rolle. So werden Abfüllvorgänge durch schlechte Fließeigenschaften erschwert. Um die Fließeigenschaften zu verbessern werden Fließregulierungsmittel zugesetzt. Obwohl ihr Gebrauch weit verbreitet ist, ist über ihren Wirkungsmechanismus wenig bekannt. Deshalb sind im Rahmen dieser Arbeit 14 beliebige Nanomaterialien aus verschiedensten Einsatzgebieten auf ihre fließregulierende Wirkung hin untersucht und bewertet worden. Dafür wurden im Turbulamischer binäre Pulvermischungen hergestellt und mittels Zugspannungstester und Analyse von REM-Aufnahmen ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass die Fähigkeit eines Stoffes, als Fließregulierungsmittel zu wirken, in erster Linie unabhängig von seiner chemischen Natur ist. Auch seine Primärpartikelgröße erweist sich zur Bestimmung der fließregulierenden Wirkung als nicht aussagekräftig. Vielmehr werden die Agglomerate eines Nanomaterials wie künstliche Rauigkeiten an die Oberfläche des Trägermaterials adsorbiert. Die Arbeitshypothese konnte dadurch bestätigt werden: Die Reduktion der Zugspannung ist allein von zwei Faktoren abhängig: von der Größe der Agglomerate des Nanomaterials und von der Dichte, mit der diese Agglomerate die Oberfläche des Trägermaterials belegen. Ein Fließregulierungsmittel ist um so potenter, je kleiner seine Agglomerate sind und je dichter sie auf dem Trägermaterial angeordnet werden können. Theoretisch kann den Ergebnissen zufolge ein „freifließender“ Wirkstoff mit einem identischen Wirkstoff in Nanogröße als Fließverbesserer hergestellt werden. Die Auswirkungen der Einflussfaktoren wie die spezifische Oberfläche, die Oberflächenbeschaffenheit, die chemisch-physikalischen Eigenschaften wie Hydrophobie / Hydrophilie, die elektrostatische Aufladbarkeit und die Struktur können wie folgt zusammengefasst werden: Sie bestimmen die innerhalb eines Agglomerats wirksamen Kräfte (Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, formschlüssige Bindungen). Können diese schnell überwunden werden, lassen sich die Agglomerate leicht zerkleinern. Somit belegen sie die Oberfläche des Trägers dicht und senken die Zugspannung dementsprechend stark ab. Da in hydrophoben Produkten keine Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet werden, sondern nur Van-der-Waals-Kräfte die Agglomerate aufbauen, setzen diese Produkte die Zugspannung insgesamt schneller und stärker herab als hydrophile Produkte. Es hat sich herausgestellt, dass der Mischvorgang neben der homogenen Verteilung des Nanomaterials zusätzlich eine Zerkleinerung der Agglomerate der hochdispersen Substanzen bewirkt. Dabei agieren die groben Trägerpartikel wie Kugeln in einer Kugelmühle, die hochdispersen Substanzen wie das zu zerkleinernde Gut. Daher steigt die Belegung des Trägermaterials während des Mischvorgangs an. Die Zugspannung sinkt. Nach Rumpf reduzieren Rauigkeiten die interpartikulären Haftkräfte.[1] Mit der vorliegenden Arbeit wird nachgewiesen, dass dieser Ansatz auch auf den Wirkmechanismus von Fließverbesserern übertragbar ist. Fließregulierungsmittel bewirken als künstliche Oberflächenrauigkeiten eine Verringerung der Kontaktfläche und eine Vergrößerung des Abstands zwischen zwei Partikeln. Dies führt zur Abnahme der Van-der-Waals-Kräfte. Der Versuch, die Wirkungsweise eines Fließverbesserers über den Kugellager-Effekt zu erklären, ist daher abzulehnen. Da der Ansatz von Rumpf mit einer Rauigkeit mittig im Kontaktbereich für reale Systeme nicht umfassend genug ist, konzentriert sich die vorliegende Arbeit besonders auf die tatsächliche Dichte der Belegung des Trägermaterials mit fließregulierenden Partikeln. Rechnerisch kann mit dem 3-Rauigkeiten-Modell begründet werden, warum die Belegungsdichte von besonderer Bedeutung ist. Literatur: [1] H. Rumpf, Chemie-Ingenieur-Technik 1974, 1, 1-11 N2 - The flowability of powders plays an important role not only in the pharmaceutical industry, but also in various other industrial branches like the food-processing industry. Especially filling processes are rendered difficult by poor flow properties of powders. In order to improve them flow conditioners are added. Despite of their wide use only little is known about the mechanism of action of flow conditioners. Therefore in the context of this work 14 randomly chosen nanomaterials from different fields of application have been tested and evaluated according to their improvement of flow properties. In order to do so, binary powder mixtures were produced in a turbula mixer and evaluated by means of a tensile strength tester and the analysis of scanning electron micrographs. It has been shown that the ability of a material to act as a flow conditioner does not primarily depend on its chemical nature. Also its primary particle size does not offer relevant information for determining the effectiveness of a glidant. In fact the agglomerates of a nanomaterial are adsorbed on the surface of the carrier like artificial roughness. The working hypothesis could thus be validated: The reduction of tensile strength only depends on two factors: the size of the agglomerates of the nanomaterial and the density with which these agglomerates cover the surface of the carrier. A glidant is the more potent, the smaller its agglomerates are and the denser they cover the carrier. According to these results theoretically a “free flowing” active ingredient could be produced with the identical nano-sized active ingredient as a flow agent. The effects of the influencing factors like the specific surface, the surface properties, the chemical-physical properties like hydrophobia / hydrophilia, the electrostatic rechargability and the structure can be summarized as follows: they determine the forces within an agglomerate (Van-der-Waals-forces, hydrogen bonds, form-fitting bonds). If those can be overcome quickly the agglomerates can be broken up easily. Consequently they cover the surface of the carrier densely and correspondingly they reduce the tensile strength significantly. As no hydrogen bonds are formed in hydrophobic products, only Van-der-Waals-forces build up the agglomerates. On the whole these products lower the tensile strength faster than the hydrophilic products. It has been shown that the process of blending causes not only the homogeneous distribution of the nanomaterial, but also the breaking up of the agglomerates of the highly dispersive substances. Here the coarse carrier particles act like balls in a ball mill. The coverage of the carrier therefore rises during the blending process. The tensile strength decreases. According to Rumpf roughness reduces the interparticular forces.[1] In this work it will be demonstrated that this approach can also be transferred to the mechanism of glidants. Glidants acting as an artificial surface roughness cause a reduction of the contact area and an increase in the distance between two particles. This leads to a decrease of the Van-der-Waals-forces. The attempt to explain the mechanism of action of a flow conditioner by means of the ball bearing effect therefore has to be rejected. As Rumpf‘s concept of one roughness in the centre of the contact area of two particles is not extensive enough for real systems, this work focuses on the actual coverage density of the carrier with glidant’s particles. By means of the 3-roughness-model it could be demonstrated arithmetically why the density coverage is very important. Literatur: [1] H. Rumpf, Chemie-Ingenieur-Technik 1974, 1, 1-11 KW - Nanostrukturiertes Material KW - Fließverhalten KW - Fließregulierungsmittel KW - Fließeigenschaften KW - Maisstärke KW - interpartikuläre Haftkräfte KW - Zugpannung KW - glidants KW - flow properties KW - corn starch KW - interparticular forces KW - tensile strengths Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5594 ER - TY - THES A1 - Kretzler, Kai T1 - Eine neue Methode zur Bestimmung der Fließeigenschaften von Schüttgütern T1 - A new approach to characterize powder flow properties N2 - Die Fließeigenschaften von Schüttgütern spielen in vielen Industriezweigen eine entscheidende Rolle. Dies gilt speziell für die pharmazeutischen Industrie wo sie als Anfangs-, Zwischen- und Endprodukt vorkommen. Dort werden sie meist in Silos gelagert und müssen so durch Röhrensysteme fließen um verarbeitet zu werden. Dabei tritt das Problem der Brückenbildung häufig auf. Der Auslauftrichter stellt eine neue Methode dar, die Fließeigenschaften und speziell die Brückenbildung von Pulvern zu untersuchen. Das zu untersuchende Pulver wird in einen verschließbaren Trichter ohne angesetztes Rohr eingefüllt. Nach der Öffnung des Verschlusses fließt ein kohäsives Pulver wegen der Brückenbildung nicht aus dem Trichter. Dabei bestimmen die interpartikulären Kräfte die Stärke und die Dimensionen der Brücke. Es wird daher angenommen, dass eine Messung der zur Zerstörung der Brücken notwendigen Kräfte Rückschlüsse auf den Ort der Brückenbildung und der Fließeigenschaften des Schüttgutes erlaubt. Die Untersuchung der Brückenbildung mit dem modifizierten Auslauftrichter zeigte, dass die Brücken, die den Pulverfluss behindern, nur im unteren Viertel des Trichters auftreten. Diese Brücken können durch ein spezielles Rührwerkzeug zerstört werden und damit ein Pulver zum Ausfließen bringen. Die Messung des notwendigen Drehmoments lässt Rückschlüsse auf die Kohäsion des Pulvers zu. Während der Messung korrelieren der Drehmoment-Anstieg und -Abfall mit dem pulsierenden Ausflussverhalten der Pulver. Auch sehr langsame Rotationsgeschwindigkeiten können ein Pulver zum Ausfließen bringen. In einem Bereich von 0,5 bis 3 U/min ist ein fast linearer Zusammenhang zwischen Rotationsgeschwindigkeit und Ausflusszeit zu beobachten. Eine weitere Zunahme der Rotationsgeschwindigkeit führt aber nicht zu einer weiteren Verkürzung der Ausflusszeiten. Nach einer mathematischen Aufbereitung der Messkurven bei 10 bis 20 U/min konnte eine Korrelation zwischen der Umdrehungsgeschwindigkeit und dem Drehmoment gefunden werden. Ein bereits entwickelter Auslauftrichter war jedoch nicht in der Lage neue und für diese Arbeit relevante Fragen zu beantworten, da die Messtechnik und die Auflösung der Messsignale unzureichend war. Daher wurden zunächst einige technische Veränderungen vorgenommen. Am Ende jedoch musste der Auslauftrichter komplett neu aufgebaut werden. Um leichter reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten war es notwendig die Messungen unter klimatisierten Bedingungen (relative Feuchte und Temperatur) durchzuführen. Speziell die Feuchtigkeit hat einen entscheidenden Einfluss auf das Ausflussverhalten. Es wurde überprüft, ob die Rotationsgeschwindigkeit einen Einfluss auf das maximale Drehmoment zur Brückenzerstörung hat. Versuche zeigten jedoch, dass ein derartiger Zusammenhang nicht besteht. Das lawinenartige Fließen des Pulvers bei langsamen Rotationsgeschwindigkeiten warf die Frage auf, ob die Höhe der Massepeaks vom Rührwerkzeug abhängt. Ein Experiment konnte jedoch zeigen, dass ein derartiger Zusammenhang nicht besteht, wenn die Rührer eine Mindestgröße besitzen. Bis zu dieser Höhe ist die entleerte Masse proportional zum Volumen welches der Rührer als Rotationskörper besitzt. Es wird daher angenommen, dass diese Höhe mit der Brückenbildungszone identisch ist. Abschießend sollte untersucht werden, wo genau und wie stark die Brücken sind. Nach dem mathematisch physikalischen Zusammenhang, der anhand einer idealviskosen Flüssigkeit überprüft wurde, ergibt sich eine Abhängigkeit des Drehmoments von der dritten Potenz der Länge der Rührelemente. In Bezug auf diesen Zusammenhang wurden die Ergebnisse der Messungen von Starch® 1500 und als weitere Substanz Prosolv® SMCC 50 untersucht. Betrachtet man hierbei die Drehmomentmaxima so ist der relative Anstieg des Drehmomentes in der Brückenzone am größten. Pulver oberhalb der Brückenzone zeigt dabei das Verhalten einer idealviskosen Flüssigkeit. N2 - Powder flow properties are very important for many industries. Especially in pharmaceutical technology where powders are used as starting, intermediate and final products. They are mostly stored in hoppers and have to flow through funnels or tubes when processed. In this case arching is the problem occurring most often. The outflow-funnel is a new method of examining powder flow properties and especially arching. The powder to be characterised is filled into a funnel with a closable outlet which has no attached tube. Owing to arching a cohesive powder will not flow out after opening the funnel. The interparticular forces determine the strength and the thickness of the arches. Therefore it is assumed that measuring the forces needed to destroy these structures should allow for a simple characterisation of the height of the arches as well as the flow properties of powders. The examination of arching with the outflow-funnel showed, that the arches, which inhibit the flow of powder, occur at the lower quarter of the funnel only. These arches can be destroyed by a special stirrer which allows the powder to flow out of the funnel. Measuring the necessary forces (torque) leads to information about the cohesion of the powder. During measuring increasing and later decreasing forces correlate with a pulsating flow of the powder out of the funnel. Even a very slow rotating stirrer is able to bring the powder to flow. At a range of 0.5 to 3 rpm an almost linear connection between rotation speed and time of outflow occurs. But a further increase of rotation speed must not lead to a shorter time of outflow. With a mathematical transformation of the resulting curves a correlation between torque and forced flow was shown at a rotation speed between 10 and 20 rpm. An afore investigated outflow funnel could not be used to answer the new and different questions of this work because it had several limitations as regards measuring techniques. Therefore some technical modifications were necessary at the beginning of the work. At last the outflow funnel had to be completely reconstructed. The ability to measure under humidity and temperature conditioned atmosphere was key to get results which can be reproduced easily. Especially humidity has a substantial influence on flow behaviour. The question was investigated, if the rotation speed has an influence on the maximum torque needed to destroy the arches. Experiments showed, that no such connection exists. The flow like an avalanche of the powder at slow rotation speeds brought up the question if the height of the mass peaks depends on the art of the stirrer. An experiment showed, that there is no difference in the mass peaks when the stirrers exceed a definite height. Up to this critical height the mass of powder that leaves the funnel is proportional to the volume of the stirrer considered as a rotation body which seems to corroborate the fact that this zone is identical with the zone of arching. The last question to answer was where exactly the arches build up and how strong they are. As to the mathematical and physical context, which was proved with a liquid of ideal viscosity, a dependence of the torque, on the third power of the length of the stirrer bars, was found. Referring to this connection, the results of measuring Starch® 1500 and Prosolv® SMCC 50, as an additional other substance, were evaluated. Looking at the torque maximums the relative increase of torque in the zone of arching was greater than elsewhere. Powder above the zone of arching behaves like a liquid of ideal viscosity. KW - Schüttgut KW - Pulver KW - Fließverhalten KW - Trichter KW - Messung KW - Pharmazeutische Technologie KW - Brückenbildung KW - Auslauftrichter KW - Fließeigenschaften KW - Schüttgüter KW - Pulver KW - Kohäsion KW - arching KW - outflow funnel KW - flow properies KW - powder KW - cohesion KW - bridge Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182028 ER - TY - THES A1 - Weh, Barbara T1 - Permeationseigenschaften von Polydimethylsiloxan-Membranen in Abhängigkeit von der Netzbogenlänge T1 - Permeation properties of polydimethylsiloxane-membranes in dependence of the network chain length N2 - Für die definierte und konstante Wirkstofffreigabe aus therapeutischen Systemen sind Kenntnisse der Mikrostruktur vonKontrollmembranen von großer Bedeutung. Durch eine Additionsreaktion können Polydimethylsiloxan-Membranen ausvinylendgestoppten linearen Polydimethylsiloxanen und niedermolekularen Si-H-funktionalisierten Polydimethylsiloxanen unterEinfluss eines Platin- Katalysators hergestellt werden. Hierbei ist es durch den Einsatz genau charakterisierterAusgangspolymere möglich, Membranen mit einer statistisch definierten Mikrostruktur zu erhalten. Die Mikrostruktur kanndurch die Netzbogenlänge charakterisiert werden. Der Abschnitt zwischen zwei Verknüpfungspunkten in einem Netzwerk wirdals Netzbogenlänge (NBL) bezeichnet. Diese beschreibt die Anzahl der Dimethyl-siloxan-Einheiten zwischen zweiVerknüpfungen. Die Permeationseigenschaften wurden mit Hilfe des standardisierten Permeationskoeffizienten untersucht. Derstandardisierte Permeationskoeffizient ist von der mittleren Netzbogenlänge der Polydimethylsiloxan-Membranen abhängig. Dieser Zusammenhang wurde an elf Benzoesäure- und Naphthalinderivaten als Modellsubstanzen untersucht und bestätigt.Hierbei wurden Membranen mit den mittleren Netzbogenlängen 65, 99 und 122 Siloxan-Einheiten für die Untersuchungeneingesetzt. Bei allen untersuchten Substanzen stieg der Permeationskoeffizient mit größer werdender Netzbogenlänge derMembranen geringfügig an. Die Permeationskoeffizienten von Membranen mit der Netzbogenlänge 122 waren dabei - mitlediglich vier Ausnahmen - stets statistisch signifikant größer als von Membranen mit der Netzbogenlänge 65. Als mögliche weitere Einflussfaktoren auf die Permeationsgeschwindigkeit wurden der Membran/Wasser-Verteilungskoeffizient, dasDipolmoment und das van der Waals-Volumen der elf Modellsubstanzen untersucht. Es konnte ein Zusammenhang zwischendem Membran/Wasser-Verteilungskoeffizienten und dem Permeationskoeffizienten aufgezeigt werden. Das Volumen deruntersuchten permeierenden Moleküle hat jedoch nur bei Netzbogenlängen kleiner als 122 einen Einfluss auf diePermeationsgeschwindigkeit. Als neue Möglichkeit zur Untersuchung der Diffusionskinetik vor Erreichen des stationärenZustands in Polydimethylsiloxan-Membranen wurde die konfokale Raman-Spektroskopie eingesetzt. Bei derRaman-Spektroskopie wird das Probensystem während der Messung weder zerstört noch verändert. Weiterhin ist es möglich,durch das gekoppelte konfokale Mikroskop gezielt an einem bestimmten Punkt innerhalb der Membran zu messen. Damitkönnen nun dynamische Vorgänge wie der Aufbau eines Konzentrationsgradienten vor Erreichen des stationären Zustandes aneinem bestimmten Punkt in einer Membran über einen längeren Zeitraum gemessen werden. Anhand von Intensitätsänderungencharakteristischer Peaks oder der Verschiebung von Banden werden Konzentrations- und Strukturänderungen der Membranund der permeierenden Moleküle sichtbar. Die Untersuchungen mit der konfokalen Raman-Spektroskopie zeigten, dass dieseMethode geeignet ist, Diffusionskinetiken im nicht stationären Zustand innerhalb der Membranen zu beobachten. N2 - The knowledge of the microstructure of controlling membranes is very important in order to achieve a defined and constantdrug release from therapeutic systems. Poly(dimethylsiloxane) membranes can be prepared by an addition reaction of linearpoly(dimethylsiloxanes) with terminal vinyl groups and low molecular poly(dimethylsiloxanes) with Si-H functional groups. Forthis reaction a Platinum catalyst is used. By using well characterized starting polymers it is possible to get membranes with astatistically defined microstructure. The network chain length can characterize the microstructure. The distance between twopoints of cross-linking within the network is called network chain length (NCL). The network chain length describes the numberof the dimethyl- siloxane-units between two cross-linking points. The properties of permeation were investigated by using the stadardized permeation coefficient. The permeation coefficient is dependent on the average network chain length of thepoly(dimethylsiloxane) membranes. This relationship was confirmed for 11 benzoic acid and hydroxynaphthalene derivates.Membranes with network chain lengths of 65, 99 and 122 were used for these investigations. The permeation coefficient P*increases slightly with rising network chain length for all 11 model substances. The permeation coefficient of the membraneswith network chain length of 122 was found to be higher by a statistically significant amount than those of membranes with anetwork chain length of 65 - having only 4 exceptions. In order to find other factors which influence the permeation rate, the membrane/water-partition coefficient, the dipole moment and the van der Waals volume were investigated. There was amathematically relationship between the membrane/water-partition coefficient and the permeation coefficient. The volume of themoleculeshad only with membranes with a network chain length of 122 an influence on the permeation. ConfocalRaman-spectroscopy was taken as a pioneering method to investigate the kinetics of diffusion before reaching the steady statein poly(dimethylsiloxane) membranes. Up to now it was only possible to investigate the diffusion process in the steady state. The membrane was always taken as a whole. Raman-spectroscopic measurements do not destroy or change the probe system.Because of the coupled confocal microscope it is possible to measure selectively at a defined point in the membrane. Thereforedynamic processes e.g. can be investigated before reaching the steady state flux. The investigations with confocalRaman-spectroscopy show the possibility to observe diffusion processes in and before the steady state flux with this method. KW - Polydimethylsiloxane KW - Membran KW - Permeabilität KW - Polydimethylsiloxan KW - Membran KW - Permeation KW - Netzbogenlänge KW - konfokale Raman-Spektroskopie KW - poly(dimethylsiloxane) KW - membrane KW - permeation KW - network chain length KW - confocal Raman-spectroscopy Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2927 ER - TY - THES A1 - Hemmrich, Ulrike T1 - Beschreibung und Charakterisierung einer neuen Pathogenitätsinsel, integriert in das selC-Gen von "Locus of enterocyte effacement"-negativen, Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia coli T1 - Description and characterisation of a new pathogenicity island, integrated in selC of Locus of enterocyte effacement-negative Shiga Toxin-producing Escherichia coli N2 - Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli (STEC) verursachen Diarrhöen und hämorrhagische Colitis. Als lebensbedrohliche Komplikation können sie ein hämolytisch-urämisches Syndrom auslösen. Bisher identifizierte Virulenz-faktoren der STEC sind auf Bakteriophagen, Plasmiden und Pathogenitätsinseln kodiert. Bei der Mehrzahl der klinischen STEC-Isolate konnte die Pathogen-itätsinsel LEE (locus of enterocyte effacement) nachgewiesen werden. Der LEE ist stromabwärts des Gens für eine Selenocystein-tRNA (selC) ins Chromosom integriert. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von STEC, denen der LEE fehlt und die funktionelle Analyse von potentiellen Virulenz-assoziierten Genen. Dabei wurde eine Fokussierung auf Gene vorgenommen, die im Bereich der selC-Region vorkommen. Mittels PCR wurde zunächst überprüft, ob bei den LEE-negativen STEC-Stämmen Fremd-DNA in der selC-Region integriert ist. Hierzu wurden 35 LEE-negative STEC getestet. Bei 13 Stämmen konnte eine Insertion von Fremd-DNA gezeigt werden. Von einem dieser Stämme (E. coli 4797/97, Serovar O91:H-) wurde aus einer Genbank ein die selC-Region enthaltendes DNA-Fragment identifiziert. Ein 37,7 kb großes Fragment dieses Cosmids wurde vollständig sequenziert. Die Analyse der gesamten Sequenz ergab 30 offene Leserahmen mit Längen zwischen 95 und 4092 bp. Der G+C-Gehalt betrug 47,4%. An mehreren Stellen wurden Bereiche mit hoher Homologie zu verschiedenen Insertionssequenzen, inverted repeats und Integrasen gefunden. Drei Leserahmen hatten eine hohe Homologie zu bereits bekannten Genen. Hierbei handelt es sich um die iha- , btuB- und espP-Gene von E. coli. Das iha-Gen kodiert für ein Adhärenz-vermittelndes Protein, btuB für den Vitamin B12 Rezeptor und espP für eine Serinprotease. Bei den iha-Adhäsinen und Serinproteasen handelt es sich um potentielle Pathogenitätsfaktoren. Der sequenzierte Bereich hat somit die charakteristischen Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel: Die Präsenz von mehreren Pathogenitätsgenen und mobilen Elementen (Insertionselemente, Integrasen), die Lokalisation nahe an tRNA-Genen sowie ein veränderter G+C-Gehalt gegenüber dem Restgenom. Zur weiteren Charakterisierung des espI-Genprodukts wurde espI subkloniert. Bei der Untersuchung von Kulturüberständen zeigte sich, dass der Subklon DH5/pzh4 ein Protein von etwa 110 kDa sezernierte. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Serinprotease des Stammes 4797/97 als 140,8 kDa großes Vorläuferprotein synthetisiert und während des anschließenden Exportvorganges sowohl N-terminal als auch C-terminal prozessiert wird. Das C-terminale Ende wirkt als Translokator durch die äußere Membran, wo es nach Abspaltung des reifen EspI-Proteins verbleibt. Das reife Protein weist eine Größe von 110,5 kDa auf. Der hier gezeigte Transportmechanismus ist charakteristisch für sogenannte Autotransporter-Proteine. Trotz der hohen Sequenzhomologie zur IgA1-Protease von Neisseria gonorrhoeae, die als Prototyp der Autotransporter-Proteine gilt, konnte für EspI keine Proteaseaktivität gegenüber IgA gezeigt werden. EspI weist auch hohe Sequenzhomologie zu Exoproteinen von Shigella flexneri (SepA, Mucinase und SigA), EHEC (EspP) und vogelpathogenen E. coli (Tsh) auf, allerdings konnte keines der Substrate dieser Proteasen von EspI gespalten werden. Dagegen konnte eine proteolytische Aktivität gegenüber Schweine-Pepsin A und Apolipoprotein A1 nachgewiesen werden. Die putative Virulenz und räumliche Nähe der Gene espI, btuB und iha macht diese Region zum interessantesten Stück der im Rahmen dieser Arbeit identifizierten neuen Pathogenitätsinsel. Eine PCR-Untersuchung zur Verbreitung dieser Gene zeigte, dass diese Region bei LEE-negativen STEC weit verbreitet ist. Inwieweit diese Pathogenitätsinsel einen Einfluss auf die Virulenz von STEC hat, muss in weiteren Experimenten geklärt werden. N2 - Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) cause diarrhea and hemorrhagic colitis. As life-threatening disease they can trigger a hemolytic-uremic syndrome. Virulence factors of STEC identified so far are encoded on bacterio-phages, plasmids and pathogenicity islands. The majority of clinical STEC-isolates could be proven to harbour the pathogenicity island LEE (locus of enterocyte effacement). LEE is integrated in the chromosome downstream of the gene encoding a selenocystein-tRNA (selC). Target of this work was the characterisation of STEC lacking LEE and the functional analysis of potential virulence-associated genes. The focus was put on genes found in the selC-region. Using PCR analysis it was checked whether LEE-negative STEC-strains have integrated foreign DNA. Of 35 LEE-negative STEC 13 strains could be shown to have an insertion of foreign DNA. From one of these strains (E.coli 4797/97, serogroup O91:H-) a DNA-fragment was detected from a cosmid library that harboured the selC region. The sequence of a 37,7 kb long fragment of this cosmid was fully analysed. 30 open reading frames (ORF) between 95 and 4092 bp length were identified. The G+C-content was 47,4 %. In different parts the sequence shows a high homology to diverse insertion sequences, inverted repeats and integrase genes. Three ORF had high homology to already known genes, which are the iha- btuB- and espP-genes of E.coli. The iha-gene is encoding an adherence-conferring protein, btuB the receptor for vitamin B12 and espP a serine protease. Iha-adhesines and serine proteases are potential pathogenicity factors. Thus the sequenced area shows the character-istic attributes of a pathogenicity island: The presence of different pathogenicity genes and mobile elements (insertion elements, integrases), the localisation next to a tRNA-gene and a G+C-content different from that of the whole genome.We termed the espP-homologue espI for "extracellular serine protease encoded on an island". For further characterisation of its product, espI was subcloned. In the analysis of culture supernatants its size was about 110 kDa. In following experiments it could be proven that the serine protease of the strain 4797/97 is synthesised as a 140,8 kDa protein and cleaved on the N- and C-terminal part while its export through the cell membrane. The C-terminal part functions as a locater through the outer membrane, where it remains after the cleavage of the mature EspI-protein. The size of this mature protein is 110,5 kDa. The transport mechanism found here is characteristic for so called autotransporter-proteins. Despite the high sequence-homology to the IgA1-protease of Neisseria gonorrhoae, which is taken as prototype of autotransporter proteins, a proteolytic activity of EspI towards IgA could not be shown. There are also high sequence-homologies to exoproteins of Shigella flexneri (SepA, mucinase and SigA), EHEC (EspP) and avian pathogenic E.coli (Tsh). Nevertheless none of the substrates of these proteases could be cleaved by EspI. In contrast a pretolytic activity against swine pepsine A1 and apolipoprotein A1 could be shown.The putative virulence and the close location of the genes espI, btuB and iha make this region the most interesting part of the new pathogenicity island identified in this work. A PCR-analysis about the spreading of these genes showed, that this region is widespread amongst LEE-negative STEC. The influence of this pathogenicity island on the virulence of STEC has to be clarified in further experiments. KW - STEC KW - Pathogenität KW - Molekulargenetik KW - STEC KW - LPA KW - Protease KW - EspI KW - STEC KW - LPA KW - protease KW - EspI Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3678 ER - TY - THES A1 - Novatchev, Nikolai T1 - Untersuchung des Verunreinigungsprofils von Aminosäuren aus fermentativer Herstellung mittels Kapillarelektrophorese T1 - Evaluation of the impurity profile of amino acids of biotechnological origin by means of capillary electrophoresis N2 - Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchungen von Verunreinigungsprofilen von Aminosäuren aus biotechnologischer Herstellung. Dazu sollten die Aminosäuren Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser und Trp von verschiedenen Herstellern und aus unterschiedlichen Batches genauer unter die Lupe genommen werden. Mit der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen dünnschichtchromatographischen Methode (DC-Methode) für „mit Ninhydrin nachweisbare Substanzen“ können ausschließlich Fremdaminosäuren nachgewiesen werden und dies nur, wenn der jeweilige Gehalt relativ hoch ist. Andere Stoffgruppen, die aus der biotechnologischen Herstellung stammen, werden aufgrund der Trennbedingungen sowie der Detektionsart der DC-Methode nicht erfasst. Deshalb mussten neue Methoden entwickelt werden. Laut Vorschriften der International Conference of Harmonisation (ICH) müssen unbekannte Verunreinigungen in Wirkstoffen für orale Therapeutika auf 0,1 % w/w begrenzt werden können. In die Untersuchungen wurden neben den Fremdaminosäuren auch Peptide, Aminozucker und Nucleinsäuren als potentielle Verunreinigungen, die aus der Herstellung bzw. aus dem Reinigungsprozess kommen, einbezogen. Diese zusätzlichen Stoffgruppen können aus den „Nebenaktivitäten“ der Mikroorganismen entstehen. Aminosäuren, Peptide und Aminozucker wurden versucht, kapillarelektrophoretisch zu quantifizieren. Für die Bestimmung von Nucleinsäuren wurde zusätzlich die UV-Spektroskopie eingesetzt. N2 - Aim of the present work was to investigate the impurity profiles of amino acids of biotechnological origin. Eight amino acids were included: Arg, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Ser and Trp. The amino acid samples originating from different producers and different batches had to be studied in deeper detail. The thin-layer chromatographic method (TLC-method) of “ninhydrin-positive substances”, as described in the European Pharmacopoeia, is able to detect primarily other amino acids, if their respective content is relatively high. Other groups of substances of biotechnological origin cannot be detected due to the separation conditions and the detection principle of the TLC-method. Therefore new methods had to be developed. In accordance with the guidelines of the International Conference of Harmonisation (ICH), the content of unknown impurities in active ingredients for oral therapeutics should be limited to 0,1 % w/w. Apart from other amino acids, the study included peptides, amino sugars and nucleic acids as potential impurities, originating from production or purification processes. These additional groups of substances are byproducts of the biosynthesis pathways of microorganisms. An attempt was made to quantify the amino acids, peptides and amino sugars by means of capillary electrophoresis. UV-spectrophotometry was additionally used for the determination of nucleic acids. KW - Aminosäuren KW - Verunreinigung KW - Fermentation KW - Kapillarelektrophorese KW - Aminosäuren KW - Verunreinigugsprofil KW - Fermentation KW - Kapillarelektrophorese KW - amino acids KW - impurity profile KW - fermentation KW - capillary electrophoresis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4106 ER -