TY - THES A1 - Väth, Thomas T1 - Die Cerebrale Toxoplasmose bei AIDS : Untersuchungen zur Pharmakokinetik von Sulfadiazin unter Urinalkalisierung T1 - Cerebral Toxoplasmosis in AIDS : Studies of Sulfadiazine Pharmacokinetics under Urine Alkalinization N2 - Die cerebrale Toxoplasmose stellt eine wichtige opportunistische Infektion im Verlauf einer HIV-Infektion dar. Unter der Standardtherapie mit Sulfadiazin kommt es häufig zu nephrotoxischen Nebenwirkungen aufgrund einer Kristallisation des Sulfadiazin und seines Metaboliten N4-Acetylsulfadiazin im Harntrakt. Die Therapie dieser Nebenwirkung erfordert unter Anderem die Alkalisierung des Harns. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer Urinalkalisierung auf die Pharmakokinetik beider Stoffe in vivo untersucht. N2 - Cerebral toxoplasmosis is an important opportunistic infection in the course of a HIV-infection. Under standard therapy with sulfadiazine there are often nephrotoxic side-effects due to crystallisation of sulfadiazine and its metabolite N4-acetylsulfadiazine in the urinary tract. Therapy of this amongst others requires alkalinization of urine. In this study the influence of urine alkalinization on in-vivo pharmacokinetics of both substances was investigated. KW - AIDS KW - Toxoplasmose KW - Sulfadiazin KW - Pharmakokinetik KW - Urinalkalisierung KW - AIDS KW - toxoplasmosis KW - sulfadiazine KW - pharmacokinetics KW - urine alkalinization Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20042 ER - TY - THES A1 - Laubner, Katharina T1 - Leptin vermittelte Signalübertragung und Proinsulingenregulation in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas T1 - Signalling and proinsulin gene regulation by Leptin in pancreatic beta-cells N2 - Das Fettgewebshormon Leptin hemmt in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas die Insulinbiosynthese und –sekretion. Insulin dagegen als adipogenes Hormon fördert die Leptinproduktion, so dass ein Regelkreis, die so genannte “Adipoinsuläre Achse“ entsteht. Fehlregulationen dieser Achse werden vor allem bei übergewichtigen Menschen mit einer Hyperleptinämie im Rahmen der Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 diskutiert. Die genauen molekularen Mechanismen über die die transkriptionellen Effekte von Leptin auf die Proinsulingen Expression erfolgen sind bis dato nicht ausreichend verstanden. Die Signalübertragung von Leptin erfolgt über den JAK-STAT-Signalübertragungsweg. Dieser Signalübertragungsweg kann durch Moleküle aus der Familie der Suppressors of Cytokine Signalling (SOCS) gehemmt werden. Ziel dieser Arbeit war die Leptin vermittelte Signaltransduktion in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas sowie die Insulingen Expression näher zu charakterisieren. Stimulation mit Leptin führt zu einer JAK2 abhängigen Phosphorylierung und zeitabhängigen nukleären Translokation von STAT3 und STAT5b in INS-1 Zellen. Sowohl STAT3 als auch STAT5b aktivieren den Proinsulingen Promotor in INS-1 Zellen. Für STAT5b konnte in INS-1 Zellen gezeigt werden, dass diese Aktivierung durch Interaktion mit PDX-1, dem zentralen Regulator der -Zelldifferenzierung und –funktion, und Koaktivator CBP/p300 erfolgt. Diese synergistische Aktivierung ist abhängig von der PDX-1 Bindungsstelle, dem A3/A4 Element im Ratten-Insulingenpromotor 1. Weiterhin konnte in INS-1 Zellen in vitro gezeigt werden, dass Leptin die mRNA Expression von SOCS3 induziert. Eine Aktivierung des Ratten SOCS3 Promotors konnte sowohl durch Leptin, als auch durch STAT3 und STAT5b nachgewiesen werden. Diese Aktivierung erfolgt über spezifische Bindung von STAT3 und STAT5b an bekannte STAT-Bindungsstellen im SOCS3 Promotor, was durch EMSAs mit Kernextrakten von INS-1 Zellen demonstriert werden konnte. SOCS3 wiederum hemmt sowohl die basale als auch die STAT3 und STAT5b vermittelte Aktivierung des Ratten-Insulinpromotors 1 in INS-1 Zellen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass SOCS3 ein Leptin induzierter Inhibitor der Proinsulingen Expression in pankreatischen Beta-Zellen ist, im Sinne einer negativen Rückkoppelung. SOCS3 ist somit ein direkter Vermittler der Leptin Signalübertragung distal von JAK-STAT in Beta-Zellen des endokrinen Pankreas. N2 - Leptin is an adipocyte-derived hormone that inhibits insulin secretion and proinsulin gene expression in pancreatic beta cells. Insulin, in contrast, is adipogenic and stimulates leptin secretion from the adipose tissue thereby establishing an adipoinsular feedback loop, the so called adipoinsular axis. Dysregulation of this adiposinsular axis with the establishment of leptin resistance in pancreatic beta cells may lead to hyperinsulinemia, which could contribute to obesity and insulin resistance. The molecular mechanism by which leptin exerts transcriptional effects on proinsulin gene expression has yet to be shown. Leptin signal transduction through the leptin receptor is intracellularly coupled to the JAK-STAT signalling pathway. This pathway can be inhibited by a family of molecules, named suppressors of cytokine signalling (SOCS). Aim of this study was to analyse leptin mediated signal transduction and proinsulin gene regulation at the molecular level in pancreatic beta cells. Leptin stimulation lead to JAK2-dependent phosphorylation and time-dependent nuclear translocation of the transcription factors STAT3 and STAT5b in INS-1 beta cells. Both STAT3 and STAT5b activate the rat proinsulin promoter 1 in INS-1 beta cells. Furthermore STAT5b activates the rat proinsuin promoter 1 via interaction with PDX-1, a central regulator of beta cell differentiation and function, and the cofactor CBP/p300 in synergism. This synergism is dependent of the A3/A4 element in the rat insulin 1 promoter. The A3/A4 element is a PDX-1 binding site. In addition, leptin induced mRNA expression of the JAK-STAT inhibitor SOCS3 in vitro in INS-1 beta cells. Transcriptional activation of the rat SOCS3 promoter was observed with leptin, STAT3 and STAT5b. In EMSA´s Leptin induced STAT3 and STAT5b DNA binding to specific STAT responsive binding sites in the SOCS3 promoter was demonstrated. Finally, SOCS3 inhibited basal and both STAT3 and STAT5b-dependent rat insulin 1 gene promoter activity in INS-1 cells. These results suggest that SOCS3 is a leptin-induced inhibitor of proinsulin gene expression in pancreatic beta cells. SOCS3 is a mediator of leptin signalling distal of JAK-STAT in pancreatic beta cells. Leptin-mediated SOCS3 expression in pancreatic beta cells may contribute to the inhibitory effects of leptin on proinsulin gene expression and insulin biosynthesis that has been demonstrated previously. KW - Leptin KW - Pankreas KW - Beta-Zellen KW - Diabetes mellitus Typ 2 KW - Leptin KW - pancreas KW - beta-cells KW - diabetes mellitus type 2 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18817 ER - TY - THES A1 - Peter, Andreas T1 - Transkriptionelle Regulation des Homeo-Domänen-Transkriptionsfaktors Islet/Duodenum Homeobox-1 (IDX-1) in insulinproduzierenden Betazellen des endokrinen Pankreas T1 - Transcriptional Regulation of the homeodomain transcription factor Islet/Duodenum Homeobox-1 (IDX-1) in insulin producing beta-cells of the endocrine pancreas N2 - Die Betazellmasse wird durch Apoptose, Proliferation und Neogenese aus Vorläuferzellen an den Bedarf des Organismus angepasst. Fehlregulationen und Verlust der Anpassungsfähigkeit sind Ursachen für Diabetes mellitus Typ-2. IDX-1 ist sowohl ein Hauptentwicklungsfaktor des embryonalen Pankreas als auch an der Regulation von Neogenese und Proliferation der adulten Betazellen beteiligt. Betazellproliferation und Differenzierung werden durch Faktoren wie GLP-1 oder milde Hyperglykämie stimuliert und gehen mit einer Aktivierung von IDX-1 einher. In der Arbeit sollte der Einfluss von GLP-1 und milder Hyperglykämie auf die Expression, besonders die Transkription, des Transkriptionsfaktors IDX-1 in insulinproduzierenden Betazellen des endokrinen Pankreas untersucht werden. Ferner wurde eine mögliche Autoregulation des IDX-1 Promotors durch IDX-1 untersucht. Als Modell für adulte Betazellen wurden klonale Betazellen INS-1 und MIN6 verwendet. Die IDX-1 Expression wurde auf mRNA Ebene im Northern Blot und auf Proteinebene mittels Western Blot untersucht. Der Promotor des IDX-1 Gens wurde Mithilfe von Luziferasereportergenassays und EMSA untersucht. Die Expression von IDX-1 Protein und mRNA wird durch milde Hyperglykämie stimuliert. Dieser Effekt ist auf eine Aktivierung des IDX-1 Promotors zurückzuführen. Die Aktivierung innerhalb des Promotors konnte auf zwei Regionen eingeschränkt werden. Diese befinden sich im IDX Promotor in den -900 bp bis -300 bp und den 230 bp vor Beginn der kodierenden Sequenz des IDX-1 Gens. Im EMSA konnte ein glukoseabhängiger Komplex (-49 bp bis -44 bp) nachgewiesen werden, an den USF-1 und USF-2 binden. USFs sind für glukoseabhängige Genregulation in Leber und Pankreas bekannt. Eine Mutation der Bindungsstelle führte zum Verlust des Bindungskomplexes. In Luziferasereportergenassays beobachtete man eine Verringerung der glukoseinduzierten Aktivierung. Für GLP-1 konnte kein eindeutiger Einfluss auf die Expression von IDX-1 gezeigt werden. Als Anzeichen für eine mögliche Autoregulation des IDX-1 Promotors durch IDX-1 wurde bei Überexpression von IDX-1 in Betazellen eine verringerte Promotoraktivität festgestellt. Der in dieser Arbeit untersuchte Transkriptionsfaktor IDX-1 spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der Betazellmasse des endokrinen Pankreas. Es ist wichtig die molekularen Mechanismen der Regulation der Betazellmasse zu verstehen; Erkenntnisse darüber eröffnen einerseits ein besseres Verständnis der Pathogenese des Diabetes mellitus, andererseits stellen sie hoffnungsvolle neue Therapieansätze da. KW - IDX-1 KW - Diabetes mellitus KW - Transkription KW - Betazelle KW - Hyperglykämie KW - IDX-1 KW - Diabetes mellitus KW - Transcription KW - Beta-cell KW - Hyperglycemia Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16407 ER - TY - THES A1 - Neun, Tilmann Alexander T1 - Butyrateffekte auf die Adenom-Karzinom-Sequenz beim Kolonkarzinom - HDGF ("hepatoma derived growth factor") T1 - Effects of butyrate on adenom-carcinom-sequence in colon cancer - HDGF "hepatoma-derived growth factor") N2 - Untersuchung der Butyrateffekte auf die Genexpression von Zellkulturen während der Adenom-Karzinom-Sequenz mit Hilfe von Microarrays. Analyse des HDGF-Genclusters. Verwendete Zellkulturen Geki2, HT29 und SW620 N2 - Examination of butyrate effects on genexpression of cellculteres during adenom-carcinom-sequence by use of microarrays. Analysis of hdgf-gencluster. USed cellcultures Geki2, HT29 und SW620. KW - Butyrat KW - Kolonkarzinom KW - Adenom-Karzinom-Sequenz KW - Wachstumsfaktoren KW - HDGF KW - Hepatoma-derived growth factor KW - Adenom-carcinom-sequence KW - growthfactors KW - HDGF KW - butyrate KW - colon cancer Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49177 ER - TY - THES A1 - Kretzschmar, Eva T1 - Stimulation von humanen gamma delta T-Lymphozyten durch Poly-Inosin-: Poly-Cytidyl-Säure (Poly (I:C)) T1 - Stimulation of human gamma delta T lymphocytes by polyinosinic-polycytidylic acid (poly(I:C)) N2 - Humane gamma delta T-Zellen stellen eine Gruppe von T-Lymphozyten dar, die neben NKT- und NK-Zellen auch als lymphatische Effektorzellen der angeborenen Immunität beschrieben werden. Nach ihrer Stimulierung tragen sie, in Analogie zu den NK-Zellen, zur schnellen, unspezifischen Infektionsabwehr bei. In dieser Arbeit wurde erstmals der Einfluss von ds-RNS (Poly (I:C)) auf humane gamma delta T-Zellen untersucht. Diese Substanz simuliert in vivo und in vitro die Infektion mit einem Virus und übt pleiotrope Effekte auf eine Reihe von verschiedenen Zellen aus, u. a. auch auf NK-Zellen. Diese Arbeit beschreibt die potente kostimulierende Wirkung von Poly (I:C) auch auf gamma delta T-Zellen: Es induziert deren partielle Aktivierung, sichtbar am Oberflächenmolekül CD69. Daneben stimuliert die ds-RNS die Antigen-spezifische gamma delta T-Zell-Antwort, nachweisbar an einer Zunahme der Proliferation. Die Sekretion von IFN-gamma durch gamma delta T-Zellen ist jedoch nicht gesteigert. Die Wirkungsmechanismen von Poly (I:C) auf gamma delta T-Zellen sind, im Gegensatz zu den NK-Zellen, in erster Linie indirekt. Durch Depletion von CD11c-positiven dendritischen Zellen wird die Poly (I:C)-vermittelte Aktivierung der gamma delta T-Zellen vollständig aufgehoben. Ebenso kann durch Neutralisierung von Typ I Interferonen, die v. a. nach Poly (I:C)-vermittelter Stimulation dieser DCs sezerniert werden, größtenteils eine Aufhebung der Poly (I:C)-vermittelten CD69-Expression auf gamma delta T-Zellen erzielt werden. Diese Ergebnisse legen eine Antigen-unabhängige, schnelle Aktivierung von gamma delta T-Zellen im Rahmen viraler Infektionen nahe. N2 - Human gamma delta T cells are a subset of T lymphocytes, belonging to lymphatic effector cells of innate immunity beside NKT cells and NK cells. After stimulation they contribute in analogy of NK cells to rapid unspecific immune responses. This work investigated for the first time the effect of a double-stranded RNA (mimicked by poly (I:C)) to human gamma delta T cells. This substance simulates a virus infection in vivo and in vitro and exerts pleiotrophic effects on NK cells among a variety of different cells. The thesis states that poly (I:C) has potent gamma delta T cell co-stimulatory capacity: Within PBMCs gamma delta T cells are partially activated expressing increased levels of CD69. Beside this poly (I:C) co-stimulates an antigen-mediated proliferation in response to IPP. The secretion of IFN-gamma isn’t enhanced however. The effect of poly (I:C) on gamma delta T cells is mediated mainly indirectly, in contrast to NK cells. Depletion of CD11+ dendritic cells abrogates the poly (I:C)-mediated activation of gamma delta T cells completely. Neutralizing antibodies against interferons type I secreted by activated DCs almost completely prevent the poly (I:C)-mediated up-regulation of CD69 on gamma delta T cells. These results indicate an antigen independent rapid activation of gamma delta T cells during viral infections. KW - Poly (I:C) KW - gamma delta T-Zelle KW - dendritische Zelle KW - Typ I Interferon KW - Poly(I:C) KW - gamma delta T cell KW - dendritic cell KW - type I interferons Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22754 ER - TY - THES A1 - Katsounas, Antonios T1 - Therapeutisches Drug Monitoring von Efavirenz - Einfluß auf Protease-Hemmer-Konzentrationen und Anwendung bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung T1 - -Therapeutic Drug Monitoring of Efavirenz - Influence On PI-Concentrations And Use In Patients With Underlying Chronic Liver Disease N2 - 64 HIV-Patienten unter einer EFV-Therapie, darunter 30 Patienten im Stadium B2 und 20 im Stadium C3 wurden über bis zu 4 Jahre beobachtet. Ca. 80% aller EFV-Spiegel lagen während dieser Beobachtungszeit innerhalb des anzustrebenden Konzentrationsbereiches von 1000 - 4000 ng/ml. Bei den gemessenen EFV-Spiegeln fiel eine erhebliche inter- und intraindividuelle Schwankungsbreite auf. EFV-Spiegel im Serum waren tendenziell nicht signifikant niedriger als EFV-Spiegel im Plasma. Patienten mit einem Alter ≥40 Jahre zeigten tendenziell nicht signifikant höhere EFV-Spiegel als jüngere Patienten. Das Patientengewicht konnte als stärkster Einflussfaktor auf die interindividuelle Streuung der Efavirenzspiegel im Plasma identifiziert werden. Hohe EFV-Spiegel bei Patienten mit begleitender Lebererkrankung, die EFV zusammen mit PI´s (insbesondere Ritonavir) einnehmen oder bei Patienten mit einem unterdurchschnittlichen Körpergewicht (insbesondere Frauen) sind Indikationen für eine Dosisanpassung. Es gab keine signifikante Korrelation zwischen Grad der Therapieadhärenz und den EFV-Spiegeln. Die intraindividuelle Streuung der EFV-Spiegel war bei Patienten mit eingeschränkter Therapieadhärenz signifikant größer als bei Patienten mit guter Therapieadhärenz. Es lies sich ein Trend zu einer niedrigeren EFV-Konzentration im Verlauf nachweisen, der aber nicht statistisch signifikant war. NRTI´s nehmen keinen Einfluß auf EFV-Spiegel. Für Begleitmedikamente wie z.B. Methadon, Cotrimoxazol, Omeprazol und Statine ließ sich keine Wechselwirkung mit EFV nachweisen. Fluconazol zeigte einen leicht senkenden Einfluß auf die EFV-Spiegel. Ein Zusammenhang zwischen EFV-Plasmaspiegeln und Lebererkrankung war im Rahmen dieser Arbeit nicht nachweisbar. Raucher zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung der erzielten EFV-Plasmaspiegel gegenüber nicht rauchenden Patienten. Interaktionen zwischen EFV und PI´s wurden in Bezug auf die erzielten PI-Spiegel nachgewiesen. Hepatitis B- bzw. C- Koinfektion sowie alkoholtoxische Leberzirrhose haben Einfluss auf eine EFV-bedingte Leberwerterhöhung. Eine anhaltende Suppression der Viruslast und ein Anstieg der CD4-Zellzahl konnten nachgewiesen werden. Ein EFV-Spiegel <1000ng/ml hat einen hohen prädiktiven Wert bezüglich eines Therapieversagens. Frauen zeigten im Vergleich zu Männern ein 2-fach erhöhtes Risiko akute Nebenwirkungen zu entwickeln. Ein häufigeres Auftreten bei Patienten mit hoher CD4-Zahl am Therapiebeginn kam innerhalb unseren Kollektivs nicht vor. Das Therapeutische Drug Monitoring ist somit integraler Bestandteil der antiretroviralen Therapie, insbesondere bei chronischen Lebererkrankungen. KW - TDM KW - EFV KW - PI KW - Lebererkrankung KW - TDM KW - EFV KW - PI KW - liver disease Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18824 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Michael T1 - Troponin-I-Freisetzung bei kardiochirurgischen Bypassoperationen mit und ohne Herz-Lungen-Maschine T1 - Troponin-I-Release at cardiovascular bypassoperations with and without heart-lung-machine N2 - In dieser Studie wurden der Troponin-I-Verlauf, sowie die Serumwerte von Myoglobin, CK und CK-MB prä- und postoperativ nach einem Bypasseingriff am Herzen untersucht. Die Patienten wurden entweder mit Hilfe der Herz-Lungen-Maschine oder im sogenannten Off-Pump-Verfahren operiert. Bei den Patienten der Off-Pump-Gruppe wurde ebenfalls eine Koronarbypassoperation durchgeführt, jedoch am schlagenden Herzen ohne den Einsatz einer Herz-Lungen-Maschine. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass es deutliche Unterschiede in den postoperativen Troponin-I-Verläufen zwischen Koronarbypassoperationen mit Herz-Lungen-Maschine und Bypassoperationen am schlagenden Herzen ohne Herz-Lungen-Maschine (Off-Pump-Methode) gibt. Der Troponin-I-Verlauf zeigte in der HLM-Gruppe einen deutlich höheren Troponin-I-Anstieg im gesamten untersuchten postoperativen Verlauf im Vergleich zu den Konzentrationsverläufen des Troponin-I in der Off-Pump-Gruppe. Die weiteren untersuchten Parameter CK, CK-MB und Myoglobin zeigten diese deutlichen Unterschiede in den Konzentrationsverläufen zwischen den beiden Gruppen, wahrscheinlich aufgrund des Gewebeschadens durch die Operation z.B. durch Muskelverletzung, Mediastinaleröffnung, Perikarderöffnung, nicht. In Bezug auf den prozentualen CK-MB-Anteil der beiden Gruppen lag sogar ein annähernd deckungsgleicher Verlauf vor. N2 - Troponin-I-Release at cardiovascular bypassoperations with and without heart-lung-machine KW - Troponin I KW - kardiochirurgisch KW - Bypassoperation KW - Herz-Lungen-Maschine KW - Off-Pump KW - troponin-I KW - bypassoperation KW - heart-lung-machine KW - off-pump KW - cardiovascular Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16843 ER - TY - THES A1 - Strizek, Brigitte Sabine T1 - Assoziation der renalen Na+,K+-ATPase mit dem ERM-Protein Moesin T1 - Kidney Na+,K+-ATPase is associated with the ERM protein moesin N2 - Die Na+,K+-ATPase ist das wichtigste Na+ und K+ transportierende integrale Membranprotein des menschlichen Körpers. Es ist verantwortlich für die Ausbildung eines transmembranären Na+ und K+ Gradienten und die Aufrechterhaltung des Membranpotentials, das für die osmotische Stabilität der Zellen, Erregbarkeit von Nerven- und Muskelzellen und diverse Transportvorgänge unerlässlich ist. Die Beschränkung der Na+,K+-ATPase auf die basolateralen Zellwandabschnitte, ermöglichen den gerichteten Transport von NaCl und Wasser durch Epithelien von Darm und Niere. Die polare Verteilung der Na+,K+-ATPase scheint durch die Bindung über Ankyrin an das Spektrinzytoskelett zustande zu kommen. Außer mit Ankyrin konnte eine Assoziation der renalen Na+,K+-ATPase mit Aktin und zwei bis dahin unbekannten Proteinen Pasin 1 und 2 nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob es sich bei dem als Pasin 2 benannten Protein um Moesin, ein Mitglied der FERM Familie (Protein 4.1, Ezrin, Radixin, Moesin) handelt. Diese Proteine fungieren als Verbindungselemente zwischen integralen Membranproteinen und dem Aktinzytoskelett. Pasin 2 wurde aus Schweinenieren isoliert und massenspektrometrisch sequenziert. Anschließend wurde die Sequenz mit der von Moesin verglichen und die Identität der beiden Proteine bestätigt. Aus Schweinenieren isoliertes Pasin 2 reagierte zudem im Immunoblot spezifisch mit anti-Moesin Antikörpern und zeigte in der Immunfluoreszenz eine Kolokalisation mit der Na+,K+-ATPase. Anschließend konnte in vitro durch Kosedimentation eine direkte Bindung von rekombinantem Moesin an die Na+,K+-ATPase nachgewiesen werden. Da sich die Bindungsstelle für andere Membranproteine auf dem aminoterminalen Anteil der ERM Proteine befindet, wurde untersucht, ob dies auch für die Na+,K+-ATPase zutrifft. Durch Bindungsstudien mit rekombinanten N-terminalen Moesin konnte dies bestätigt werden. Dies legt die Vermutung nahe, dass die renale Na+,K+-ATPase neben Ankyrin auch über Moesin mit dem Zytoskelett verbunden ist. Zusätzlich zeigte sich, dass die Bindung von Moesin an die Na+,K+-ATPase durch einen Antikörper gegen die große zytoplasmatische Domäne der Na+,K+-ATPase verhindert werden kann, was die Moesinbindung an dieser Domäne wahrscheinlich macht. Da sich sowohl die Bindungsstelle für Ankyrin als auch das aktive Zentrum des Enzyms auf dieser Domäne befinden, könnte die Moesinbindung sowohl Einfluss auf die Aktivität als auch auf die Ankyrinbindung der Na+,K+-ATPase ausüben, wie auch die Bindung des erythrozytären Anionenaustauschers (AE1) an Ankyrin durch das Protein 4.1 verändert werden kann. N2 - Na+,K+-ATPase is a ubiquitous plasmalemmal membrane protein essential for generation and maintenance of transmembrane Na+ and K+ gradients in virtually all animal cell types. Activity and polarized distribution of renal Na+,K+-ATPase appears to depend on connection of ankyrin to the spectrinbased membrane cytoskeleton as well as on association with actin filaments. In a previous study we showed copurification and codistribution of renal Na+,K+-ATPase not only with ankyrin, spectrin and actin, but also with two further peripheral membrane proteins, pasin 1 and pasin 2. In this paper we show by sequence analysis through mass spectrometry as well as by immunoblotting that pasin 2 is identical to moesin, a member of the FERM (protein 4.1, ezrin, radixin, moesin) protein family, all members of which have been shown to serve as cytoskeletal adaptor molecules. Moreover, we show that recombinant full-length moesin as well as its FERM domain bind to Na+,K+-ATPase and that this binding can be inhibited by an antibody specific for the ATPase activity-containing cytoplasmic loop(domain 3) of the Na+,K+-ATPase α-subunit. This loop has previously been shown to be a site essential for ankyrin binding. These observations indicate that moesin might not only serve as a direct linker molecule of Na+,K+-ATPase to actin filaments but might also modify ankyrin binding at domain 3 of Na+,K+-ATPase in a similar way to protein 4.1 modifying the binding of ankyrin to the cytoplasmic domain of the erythrocyte anion exchanger AE1. KW - Moesin KW - ERM KW - Na+ KW - K+-ATPase KW - Aktin KW - Moesin KW - ERM KW - Na+ KW - K+-ATPase KW - actin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17842 ER - TY - THES A1 - Reiter, Constantin Wei-te Caspar T1 - Allelotypisierung und prognostische Relevanz der Regionen 1p32-36, 4p14-16 und 17p12 beim kolorektalen Karzinom T1 - Allelotyping and prognostic relevance of the regions 1p-36, 4p14-16 and 17p12 in colorectal carcinoma N2 - Die Karzinomentstehung im Kolon lässt sich entsprechend der Adenom-Karzinom-Sequenz u.a. auf die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen zurückführen. Loss of heterozygosity (LOH) in verschiedenen chromosomalen Bereichen konnten bereits mit einer signifikant schlechteren Patientenprognose oder einem schlechteren Ansprechen einer Chemotherapie korreliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 2 Multiplex-PCR Reaktionen zur Untersuchung von DNA-Proben etabliert. Anschließend wurden 100 Tumoren in den chromosomalen Regionen 1p32-36, 4p14-16 und 17p12 auf allelische Deletionen untersucht und diese mit der Patientenprognose korreliert. Es konnte ein signifikant schlechteres Überleben bei einem gleichzeitigen Vorliegen von LOH auf den Regionen 4p15.2 (D4S2397) und 17p12 (D17S1303) gefunden werden (p=0,0367). Ferner konnte ein Trend zur schlechteren Prognose bei einem gleichzeitigen Auftreten von LOH in den Regionen 17p12 (D17S1303) und 1p32-36 (HY-TM1) gezeigt werden (p=0,15). Um klinisch nutzbare Untersuchungsverfahren zur Prognosebestimmung bei Patienten mit Kolonkarzinom entwickeln zu können, werden noch weitere molekulargenetische Folgestudien nötig sein. N2 - According to the adenoma-carcinoma-sequence, the carcinogenesis of the colon can be ascribed among other things to the inactivation of tumor suppressor genes. Loss of heterozygosity (LOH) in various chromosomal areas were shown as being associated with a significant worse patient prognosis or a reduced response to chemotherapy. In this work 2 multiplex-PCRs were established to analyze DNA-samples. 100 tumor-samples were scanned for allelic deletions of the chromosomal regions 1p32-36, 4p14-16 and 17p12 and correlated with the prognosis of the patients. There was a significant worse survival when having a coexistent LOH at the regions 4p15.2 (D4S2397) and 17p12 (D17S1303) (p=0,0367). Furthermore there was a trend found for a worse prognosis for patients with a coexistent LOH at 17p12 (D17S1303) and 1p32-36 (HY-TM1) (p=0,15). There are further molecular genetic studies necessary to develop clinical useful tests to estimate the prognosis of a patient with colorectal cancer. KW - Colonkrebs KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Tumorsuppressor-Gen KW - Überlebenszeit KW - Loss of heterozygosity KW - Mikrosatelliten KW - Adenom-Karzinom-Sequenz KW - Multiplex-PCR KW - loss of heterozygosity KW - microsatellite KW - adenoma-carcinoma-sequence KW - multiplex-PCR Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24673 ER - TY - THES A1 - Lorenz, René T1 - Vergleichende Langzeitbeobachtung Zidovudin- und Stavudin-haltiger Therapieregime in der antiretroviralen Therapie HIV-positiver Patienten T1 - Long-term comparison of zidovudine- and stavudine-containing regimens in antiretroviral therapies of HIV-positive patients N2 - Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Hemmer (NRTI) Zidovudin (AZT) und Stavudin (d4T) sind häufig eingesetzte Bestandteile der antiretroviralen Kombinationstherapie. Die Behandlung erstreckt sich oft über viele Jahre, sodass neben der antiviralen und immunologischen Effektivität besonders das Auftreten von Langzeitnebenwirkungen von Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden retrospektiv die Langzeit-Therapieverläufe von 213 Patienten, die zwischen 1990 und 2003 mit Zidovudin oder Stavudin behandelt wurden, verglichen. Die Kombinationsegime unterschieden sich nicht in ihrer antiretroviralen Wirksamkeit oder Einnahmedauer, jedoch in ihrem Nebenwirkungsprofil. So traten hämatologische Nebenwirkungen (Anämien, Leukopenien, Neutropenien) signifikant häufiger unter AZT auf. Die Gabe von Stavudin kann die hämatotoxische Wirkung von Zidovudin zum Teil kompensieren. Nach Therapieumstellung von AZT auf d4T kam es zu einem Anstieg der absoluten Leukozyten, der neutrophilen Granulozyten und des Hämoglobins. Sowohl in Zidovudin- als auch Stavudin-haltigen Regimen trat nach Beginn der antiretroviralen Therapie eine Makrozytose auf. Patienten mit Noncompliance zeigten eine anhaltende Normozytose bzw. eine Normalisierung des MCV, falls nach Beginn der ART eine Makrozytose bestand. Das MCV kann als Compliancemarker genutzt werden. Unter d4T-haltigen Regimen traten häufiger metabolische Nebenwirkungen wie Hypercholesterinämien, Hypertriglyceridämien und Hepatotoxizität auf, v.a. in Kombination mit Proteaseinhibitoren. Lipodystrophien wurden unter Proteasehemmer-haltigen und –freien Regimen beobachtet. Unter Stavudin traten Veränderungen der Körperfettverteilung signifikant häufiger auf als unter Zidovudin. N2 - Zidovudine and stavudine, both NRTI, are frequently used drugs in antiretroviral therapies (ART). The ART will be given for many years, so long-term toxicities are an important limitating factor. In this study the antiretroviral therapies of 213 patients, who have been treated with zidovudine or stavudine between 1990 and 2003, were compared retrospectively. The regimens don’t differ from antiviral efficacy or time on ART but from adverse reactions. Hematologic complications (anemia, leucopenia, neutropenia) are common effects of zidovudine. Macrocytosis has been observed in zidovudine- and stavudine-containing regimens. Persons with noncompliance showed a normal mean corpuscular volume (MCV). It can be used to assess noncompliance. Under d4T-containing therapies metabolic complications like hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia and hepatotoxicity occurred more often than under zidovudine, especially in combination with PI. Lipodystrophy has been observed in PI-containing and sparing regimens. It occurred more often under stavudine than zidovudine. KW - Zidovudin KW - Stavudin KW - Hypercholesterinämie KW - Hypertriglyzeridämie KW - Hyperglykämie KW - Neutropenie KW - Leukopenie KW - Anämie KW - Hepatotoxizität KW - AZT KW - d4T KW - Lipodystrophie KW - AZT KW - d4T KW - anemia KW - hepatotoxicity KW - lipodystrophy Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25897 ER - TY - THES A1 - Weber-Weigand, Dorothee T1 - Herzminutenvolumenbestimmung nach dem Fickschen Prinzip : Vergleich von zwei Methoden in Ruhe und unter Belastung T1 - Cardiac Output measured by the Fick Principle. Comparison of two Methods at Rest and During Exercise N2 - Das Ficksche Prinzip gilt als der Goldstandard der Bestimmung des Herzminutenvolumens. Neben der invasiven Bestimmung über einen Pulmonaliskatheter steht die nicht-invasive Rückatmungsmethode (Rebreahting) zur Verfügung. Bereits 1996 ist von FW Schardt eine weitere nicht-invasive ergospirometrische Variante vorgestellt worden, die ohne Rückatmung auskommt. Hier wird der gemischt-venösen Kohlendioxidgehalt basierend auf den Kohlendioxidverbrauch berechnet. Ziel der Arbeit ist eine vergleichende Darstellung der Bestimmungsmethode nach Schardt mit dem als Referenzmethode dienenden Rückatmungsverfahren. Besonderes Augenmerk wird auf Messungen unter hohen Belastungen gelegt, denn hier neigt das Rebreathingverfahren zur Unterschätzung des Herzminutenvolumens, zudem wird die Rückatmung selbst für den Patienten unerträglich. Parallel wurde bei 36 Probanden das Herzminutenvolumen sowohl durch Rebreathing (Qt) wie auch nach Schardt (HMV) ergospirometrisch auf dem Fahrradergometer (in 50 Watt Stufen) bis maximal 350 Watt bestimmt. Ausgewertet wurde die absolute bzw. prozentuale Abweichung des HMV von Qt, sowie HMV vom Mittelwert beider Methoden nach Bland/Altman bzw. Critchley/Critchley. Unter Einbeziehung der Ergebnisse aller Belastungsstufen wird deutlich, dass die Werte für HMV bei niedrigeren Ausgangswerten unter den Werten der Rückatmungsmethode (Qt) liegen. Dagegen werden bei hohen Belastungen für HMV höhere Werte berechnet als für Qt. Die größten Abweichungen sind in Ruhe die zu erkennen. Die Abweichung des HMV vom Mittelwert beider Methoden liegt in Ruhe im Mittel bei 18,8%, unter niedriger Belastung bei 8,7-9,4%. Die Grenzen der Übereinstimmung überschreiten jedoch die Grenzen der Genauigkeit. Die niedrigsten Abweichungen sind bei mittelschwerer Belastung (150-200 Watt) zu verzeichnen, sowie geringe Abweichungen unter sehr hoher Belastung (1,2-4,0%). Die Grenzen der Übereinstimmung liegen innerhalb der Grenzen der Genauigkeit. Die prozentuale Abweichung der Ergebnisse für das Herzminutenvolumen nach Schardt vom Mittelwert beider Methoden liegt über allen Belastungsstufen innerhalb der von Critchley und Critchley geforderten +/- 20 Prozent. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die Methode nach Schardt eine Variante des Fickschen Prinzips liefert, die als einfache, nicht invasive Maßnahme auch unter hoher Belastung und bei wiederholten Messungen anwendbar ist und insbesondere unter mittleren und hohen Belastungen mit der Rebreathingmethode austauschbar ist. N2 - The Fick principle is known as the goldstandard for measuring the cardiac output. Apart from the invasiv measurements via a pulmonalis catheter there is another option for measuring the cardiac output by non-invasive rebreathing. FW Schardt already introduced another non-invasive ergospirometric alternative in 1996 working without rebreathing. Aim of the thesis is to compare the method according to Schardt to the well-known rebreathing method which is used as a reference method. Stress is laid on measurements at high strain because then the rebreahting method tends to underestimate the cardiac output, additionally the rebreathing itself then becomes unbearable. The cardiac output of 36 subjects was measured at the same time according to Schardt (HMV) as well as to Rebreahting (Qt) with incremental treadmill tests (50 watt steps) until a maximum of 350 watts. The absolute and the percentage deviation of the HMV from Qt as well as from the mean value of both methods was analysed. Afterwards the results were evaluated according to Bland/Altmann and Critchley/Critchley. Considering all the results of the various stress levels it became apparent that the HMV results were below the Qt results at low stress levels, in contrast to high stress levels where the HMV results are higher than the Qt results. The largest deviations are apparent at rest : The deviation of the HMV from the mean value of both methods is about 18.8%, at low stress levels (50-100 watts) about 8.7 – 9.4%. Here the limits of agreement exceed the limits of precision. The lowest deviations are found at medium stress levels (150-200 watts), as well as slight deviations at high stress-levels (250-350 watt).Here the limits of agreement are within the limits of precision. At all stress levels the percentage deviation for HMV from the mean value of both methods lies within the +/- 20 % demanded by Critchley/Critchly. The main conclusion of this thesis is that the method according to Schardt offers an alternative to the Rebreahting method expecially at high and middle stress levels. It is a simple, non-invasive method which can be easily applied under high stress levels and can be repeated several times. KW - Herzzeitvolumen KW - Rückatmungssystem KW - Fick-Prinzip KW - Fahrradergometer KW - Cardiac Output KW - Rebreathing KW - Fick principle Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26004 ER - TY - THES A1 - Palanichamy, Arumugam T1 - Influence of transient B cell depletion on recirculating B cells and plasma cells in rheumatoid arthritis T1 - Einfluss von passagerer B-Zelldepletion auf rezirkuliriende B-Zellen und Plasmazellen bei Rheumatoider Arthritis N2 - Die zentrale Rolle der B-Zellen in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen hat in den letzten Jahren zu unterschiedlichen therapeutischen Ansätzen geführt, B-Zellen direkt oder indirekt zu targetieren. Ein Beispiel hierfür stellt der monoklonale anti-CD20 Antikörper Rituximab dar. Derzeit ist wenig über das Regenerationsverhalten von B-Zellen nach Therapie mit Rituximab bekannt. Daher untersuchten wir die frühe Regnerationsphase und die Veränderungen des B-Zellrepertoirs. Am Beispiel der VH4 Familie der Immunglobulin schweren Ketten analysierten wir die Modulation des Immunglobulinrezeptor Repertoires durch die passagere B-Zelldepletion. Insgesamt wurden bei 5 Patienten 3 Zeitpunkte analysiert: vor Therapie, in der frühen Regenerationsphase (ERP- early regeneration period, mit einem B-Zellanteil > 1% im peripheren Blut) und in der späten Regenerationsphase (LRP- late regeneration period, 2-3 Monate nach der frühen Regenerationsphase). Bei 3 Patienten (A-C) wurden die Ig-VH4 Gene aus genomischer DNA amplifiziert und zu o.g. Zeitpunkten analysiert. Bei weiteren 2 Patienten (D und E) erfolgte die Analyse der Ig Gene in einzelnen B-Zellen mittels Einzelzellsortierung und Einzelzell RT-PCR. Die B-Zellregeneration nach Therapie mit Rituximab zeigte ein charakteristisches Regenerationsmuster mit einer Dominanz von unreifen CD10+ B-Zellen und CD38hi Plasmazellen während der frühen Phase der B-Zellrekonstitution. Im weiteren Verlauf kam es zu einer Abnahme dieser Zellen und einem Anstieg von naiven B-Zellen. Auf der molekularen Ebene zeigte sich vor und nach B-Zelldepletion eine unterschiedliche Nutzung der Ig-VH4 Gene. Mini Gene wie VH4-34 und VH4-39, die in Verbindung mit Autoimmunität stehen, waren vor Einleitung der Therapie überexprimiert. Durch die Behandlung mit Rituximab kam es zu einer Veränderung des Repertoires der regenerierenden B-Zellen mit einer reduzierten Benutzung der VH4-39 Gene im B-Zellpool. Tief greifende Veränderungen fanden sich im regenerierenden Repertoire, mit einem relativen Anstieg von stark mutierten (>=9 Mutationen / Ig Sequenz) B-Zellen.. Die Immunphänotypisierung zeigte, dass diese hochmutierten B-Zellen den Ig-klassengeswitchten Gedächtnis B-Zellkompartiment, insbesondere den Plasmazellen zughörig sind. Um diese Hypothese zu untermauern, erfolgte bei 2 Patienten eine Einzelzellsortierung dieser Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase, welche einen vergleichbaren Mutationsstatus zeigte. Da Plasmazellen kein CD20 Molekül exprimieren, werden sie durch eine Therapie mit Rituximab nicht direkt eliminiert. Allerdings zirkulieren sie nicht im peripheren Blut während der Phase der B-Zelldepletion. Während der frühen Regenerationsphase (ERP) lassen sie sich in der Peripherie erneut nachweisen. Es wurde deshalb untersucht ob auch Plasmazellen durch die Therapie moduliert werden, obwohl sie nicht direkt durch Rituximab targetiert werden. In diesem Zusammenhang erfolgte eine detaillierte Analyse des Mutationsmusters der Plasmazellen vor Therapie und während der frühen Regenerationsphase. Die Analyse der Mutationshäufigkeit in RGYW/WRCY Hotspot Motive (R=purine, Y=pyrimidine, W=A/T) erlaubt Abschätzung in wieweit die somatische Hypermutation der B-Zellen durch T-Zell abhängige Differenzierung erfolgte. Die Plasmazellen vor Therapie zeigten einem verminderten Targeting der RGYW/WRCY Motive. Im Gegensatz hierzu zeigte sich in den rezirkulierenden Plasmazellen während der frühen Regenerationsphase ein zunehmendes Targeting der RGYW/WRCY Motive. Dies spricht für einen Repertoire Shift zu mehr T-Zellabhängigen B-Zell Mutation. Ein Zusatand, wie er bei Gesunden beobachtet wird. Um die Hypothese der Rituximab-induzierten Plasmazell Modulation zu stützen wurde die R/S- Ratio (replacement to silent mutations ratio) der hypervariablen Regionen (CDRs) der Plasmazell Ig Sequenzen bestimmt. In unserer Studie war die mittlere R/S Ratio der CDRs der Plasmazellen vor Therapie entsprechend relativ niedrig (1.87). Interessanterweise kam es in der frühen und späten Regenerationsphase zu einer signifikant erhöhten R/S Ration in den rezirkulierenden Plasmazellen mit Werten von 2.67 bzw. 3.60. Die verminderte R/S Ratio in den CDRs der Plasmazellen kann als Entwicklung des Ig-Repertoires durch positive Antigenselektion interpretiert werden und weist damit eine Therapie induzierte Veränderung auf, die dem entspricht wie man sie bei Gesunden findet. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass die passagere B-Zelldepletion mit Rituximab zu einer Modulation des Plasmalzellkompartimentes führt, welches nicht direkt durch die Therapie targetiert wird. Die Modulation der Plasmazellen bei der RA kann eventuell auch als möglicher Biomarker entwickelt werden, um ein Ansprechen auf die Therapie vorherzusagen. Dies muss im Weiteren untersucht werden, um tiefer greifende Einblicke in Prozesse zu erlangen, die durch zukünftige Therapien beeinflussbar werden. N2 - B cells play diverse roles in the immunopathogensis of autoimmune diseases several approaches targeting B cell directly or indirectly are in clinical practice in the treatment of autoimmunity. In this regard, temporal B cell depletion by rituximab (anti CD20 antibody) is being appreciated and gaining more importance in recent years. To date, little is known about the regeneration profile of B cells following B cell depletion. We wanted to investigate the early replenishing B cells and examine the dynamic changes in the repertoire. we studied the immunoglobulin receptor (IgR) modulation of Ig-VH4 genes as representative of the heavy chain family. Five patients were included in the study and therapy induced alterations were assessed. Three time points namely before therapy, early regeneration phase (ERP- the early time point during regeneration where just above 1% B cells were found in the peripheral lymphocyte pool) and later regeneration phase (LRP- which commenced 2-3 months following ERP) were chosen. In three patients (A-C), Ig-VH4 genes were amplified from total genomic DNA during the above-mentioned all time points and in another two patients (D and E), Ig genes during ERP were studied by single cell amplification technique. Firstly, B cell regeneration followed the characteristic regeneration pattern as reported by several groups, with a predominant circulation of CD38hi expressing plasma cells and immature B cells in the ERP. During LRP, the proportion of these cells reduced relatively and the levels of naïve B cells rose gradually. On a molecular level, Ig-VH4 variable gene usage prior and post B cell depletion was determined and it was noticed that a diverse set of Ig-VH4 genes were employed in the repertoire before and after therapy. Mini gene segments such as VH4-34 and VH-4-39, which were reported to be connected with autoimmunity, were over expressed in the B cell repertoire before therapy. Profound changes were noticed in the early reemerging repertoire with a relatively increased population of intensely mutated B cells. These B cells acquired >=9 mutations in the Ig genes. Immunophenotyping with specific surface markers revealed that these highly mutated B cells evolve from the isotype-switched memory compartment especially the plasma cells. To support the hypothesis that the highly mutated B cells observed during ERP were plasma cells we carried out single cell amplification of individual plasma cells in another two patients during ERP and compared the mutational load, which remained similar. Actually plasma cells do not express CD20 on their surface and are not eliminated by rituximab therapy. However they were not observed in the peripheral blood following B cell depletion. The earliest time point when plasma cells are found again in peripheral circulation is the early recovery period (ERP). Therefore, it was intriguing to ascertain if the plasma cells were also modulated by rituximab therapy although they were not directly targeted by the therapy. We investigated if there is a therapy mediated mutational modulation of the plasma cells though these are not directly targeted by the therapy. We examined the confinement of mutations to the pre-defined RGYW/WRCY hotspot motifs (R=purine, Y=pyrimidine, W=A/T) in the plasma cells, which provides information on the involvement of T cells in B cell somatic hypermutation (SHM). Plasma cells before rituximab manifested the characteristics of active disease, which was revealed by restricted mutational targeting to the RGYW/WRCY motifs. The reemerging plasma cells during ERP had an increased targeting of the RGYW/WRCY motifs which indicated for a more pronounced T cell mediated B cell mutations which is the scenario observed in the healthy subjects. To further support the hypothesis of rituximab-mediated plasma cell modulation, we delineated the replacement to silent mutations ratio (R/S) in the hypervariable regions (CDRs) of the plasma cell Ig sequences. Within our study, the mean R/S ratio in the plasma cell CDRs of the patient group was relatively low (1.87) before rituximab treatment and interestingly this ratio increased significantly in the recirculating plasma cells to values of 2.67 and 3.60 in ERP and LRP status respectively. The increase in R/S ratios in reemerging plasma cells can be interpreted as a shaping of the Ig-repertoire by positive antigen selection as seen in healthy individuals. To conclude, our study demonstrates temporal B cell depletion by rituximab therapy seems to modulate also the plasma cell compartment, which is not directly targeted by the therapy. Modulation of plasma cells in RA could be also used as a potential biomarker in studying the effective response in RA treatment. This needs to be further explored to gain deeper insights into the underlying processes, which may be influenced by future therapies. KW - B-zellen KW - Rituximab KW - Gelenkrheumatismus KW - B cells KW - Rituximab KW - Rheumatoid arthritis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25132 ER - TY - THES A1 - Meyer, Thomas Hans-Georg T1 - Entwicklung neuer Strategien zur Isolation, Expansion und Differenzierung von adulten Stammzellen aus humanen Pankreasinseln T1 - New strategies for the isolation, expansion and differntiation of adult stem cells in human pancreatic islets N2 - Die Zelltherapie stellt einen neuen Ansatz zur Therapie des Diabetes mellitus Typ 1 dar und ist eine Alternative zur exogenen Insulinsubstitution. Um diese Therapieoption zu etablieren und zu optimieren benötigt man jedoch ausreichend Material, was angesichts des Mangels an Spenderorganen problematisch ist. Als potentieller unlimitierter Zellpool sind embryonale und adulte Stammzellen in den Fokus der Forschung gerückt. Da gegenüber der Verwendung embryonaler Stammzellen in Deutschland ethische Bedenken bestehen und die Forschung an ihnen rechtlich untersagt ist, konzentriert sich diese Arbeit auf die Etablierung einer Strategie zur Expansion und Differenzierung gewebsspezifischer adulter Stammzellen. Nestin als Stammzellmarker spielt hierbei eine zentrale Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Vektoren konstruiert, welche die zellspezifische Expression eines Reportergens in Nestin-positiven Zellen selektiv ermöglichen. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, daß im weiteren Schritte folgen könnten, um die Proliferation adulter Stammzellen voranzutreiben und somit einen unlimitierten Zellpool zu generieren. Nach dessen Differenzierung in Insulin produzierende ß-Zellen und deren Präparation könnte der substantielle Mangel an Spenderorganen ausgeglichen und die Optimierung und Etablierung der ß-Zell-Ersatztherapie entscheidend vorangebracht werden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist noch wenig über die molekularen Mechanismen, welche die Expansion und Differenzierung von ß-Zellen bzw. Stammzellen kontrollieren, bekannt. Ebenso unklar ist, ob die in Tiermodellen oder Zelllinien erarbeiteten Ergebnisse auf humane Zellen übertragbar sind. Dennoch geht man davon aus einen Punkt erreicht zu haben, an dem man mit Bestimmtheit davon ausgehen kann, in der Zukunft voll funktionelle Insulin produzierende ß-Zellen generieren zu können. Vor der Einführung in die Klinik werden jedoch noch mehrere Jahre vergehen. Inzwischen ist es notwendig, die derzeit bereits vorhandenen Therapiemöglichkeiten des Diabetes mellitus auszubauen und zu verfeinern. Denn bereits jetzt ist absehbar, dass auf den Großteil der derzeit zur Verfügung stehenden Behandlungsmöglichkeiten - selbst bei der optimalen Entwicklung einer Stammzell-basierten Therapie - nicht verzichtet werden kann. KW - Adulte Stammzelle KW - Stammzelle KW - Bauchspeicheldrüse KW - Zelldifferenzierung KW - Expansion KW - Diabetes KW - Diabetes mellitus KW - Genklonierung KW - Fluoreszenzakti KW - Nestin KW - adulte Stammzelle KW - Pankreas KW - Isolation KW - Zelldifferenzierung KW - Expansion Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25202 ER - TY - THES A1 - Graf, Tilmann T1 - Differentielle Effekte einer PPARgamma-Aktivierung mit Pioglitazon in der Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 in vitro und in vivo T1 - Differential effects of PPARgamma activation with pioglitazone on the barrett´s adenocarcinoma cell line OE33 in vitro and in vivo N2 - Der intrazelluläre Hormonrezeptor PPARgamma spielt eine Rolle in vielen Differenzierungsprozessen. Zudem konnte in multiplen malignen Tumoren verschiedenen Ursprungsgewebe gezeigt werden, dass sowohl Proliferation als auch Apoptose beeinflusst werden können und so eine neuartige antiproliferative Therapieoption bestehen könnte. Im Barrettadenokarzinom des distalen Ösophagus, einer malignen Neoplasie auf dem Boden von Magensäure- und Dünndarmsekretreflux, sind diese Zusammenhänge bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Studie sollte eine Untersuchung von Proliferation und Apoptose des Barrettadenokarzinoms unter dem Einfluss von einer PPARgamma-Aktivierung durch den synthetischen Agonisten Pioglitazon sein. Dazu wurden in vitro Zelllinien von Barrettadenokarzinomen und von Plattenepithelkarzinomen sowie humane Barrettgewebeproben auf Expression von PPARgamma untersucht. Zudem wurde nach Stimulation mit Pioglitazon die Wirkung auf Proliferation und Apoptose gemessen. Nach Generierung von soliden Tumoren in immundepletierten balb/c nu/nu Mäusen wurden diese mit Pioglitazon-haltigem Actos® stimuliert und das Tumorwachstum mit einer Kontrollgruppe verglichen. Zudem wurden nach Explantation der Tumore histologisch Apoptose- und Proliferationsverhalten bestimmt. Wir konnten zeigen, dass PPARgamma in humaner Barrettmukosa und in der humanen Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 überexprimiert ist. PPARgamma-Aktivierung inhibiert das Wachstum von OE33-Barrett-Adenokarzinomzellen in vitro durch eine Induktion von Apoptose, während das Wachstum von transplantierten Tumoren, die von OE33-Zellen abgeleitet wurden, in vivo durch systemische PPARgamma-Aktivierung auf dem Boden einer gesteigerten Proliferation und einer Hemmung der Apoptose verstärkt wurde. Diese Ergebnisse charakterisieren PPARgamma als einen potentiellen molekularen Mediator, der in die Entwicklung eines Barrettepithels mit Metaplasie aus normalem Plattenepithel in dem gastro-ösophagealen Übergang involviert ist. N2 - Backround&Aims: The nuclear hormone receptor peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARgamma) is a key transcription factor regulating a broad spectrum of target genes involved in adipogenesis, glucose homeostasis and cell differentiation. In addition, PPARgamma has been demonstrated to control proliferation and apoptosis in various types of cancer cells. The objective of this study was to characterize the biological effects of PPARgamma activation in Barrett’s esophagus and Barrett’s adenocarcinoma. Methods: PPARgammaexpression was investigated in endoscopic biopsies of the gastroesophageal junction and in Barrett’s epithelium as well as cancer cell lines derived from Barrett’s adenocarcinoma and squamous epithelium cancer of the esophagus by Western blot, fluorescence immunocytochemistry and semiquantitative competitive RT-PCR. Effects of PPARgamma activation by the thiazolidinedione pioglitazone on cell proliferation and apoptosis were assessed in cell culture in vitro and in mice bearing transplantable Barrett´s adenocarcinoma tumors in vivo. Results: PPARgamma mRNA and protein were overexpressed in both Barrett’s epithelium and in the Barrett’s adenocarcinoma derived cell line OE33. PPARgamma activation by pioglitazone induced apoptosis in OE33 cells resulting in reduced tumor growth in vitro. Unexpectedly, enhanced growth of OE33 derived transplantable adenocarcinomas was observed in Balb/c nu/nu mice in vivo upon systemic thiazolidinedione treatment due to increased cell proliferation. Conclusions: PPARgamma seems to be involved in the molecular pathogenesis of Barrett’s epithelium and Barrett’s adenocarcinoma. PPARgamma activation exerts differential effects on growth of Barrett’s adenocarcinoma cells in vitro and after transplantation in vivo emphasizing the importance of cell context specific factors and signal transduction pathways modulating PPARgamma action. KW - Barrett KW - PPARgamma KW - Ösophagus KW - Apoptose KW - Proliferation KW - Barrett KW - PPARgamma KW - esophagus KW - apoptosis KW - proliferation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23497 ER - TY - THES A1 - Butters, Marlene T1 - Etablierung und Evaluierung von quantitativen RT-PCR- und ELISA-Verfahren zur Bestimmung muriner Zytokinspiegel bei der Immunantwort gegenüber Aspergillus fumigatus T1 - Establishment and evaluation of quantitative RT-PCR- and ELISA-methods for identifycation of murine zytikin levels regarding the immune reaction against Aspergillus fumigatus N2 - In unserer Studie sollte die Genauigkeit der PCR zur Bestimmung von Zytokinspiegeln ermittelt werden. Mittels Blutproben von mit A. Fumigatus infizierten Mäusen, sollte eine Aussage bezüglich der Immunantwort getroffen werden. Wir griffen TNFα, IL-12p40 und IL-10 heraus, um einschätzen zu können, ob die Immunantwort eher humoral oder zellvermittelt abläuft. Zur möglichen Bestimmung der Sensitivität und Genauigkeit, wurden die crossing points der Standardverdünnungsreihen jeweils einmal in einem Lauf dreifach, ausserdem jeweils in drei unabhängigen Läufen von einander einfach eingesetzt, und miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen aktueller Literatur und Etablierungen anderer Zytokine. Die Etablierung des ELISAs sollte dem Vergleich zwischen mRNA-Ebene und Proteinebene dienen. Zur richtigen Einordnung unserer Arbeiten mit dem Immunoassay müssen die Limitierungen der Ergebnisse beachtet werden. Die Versuche zur Quantifizierung der mRNA murinen TNFαs aus den Versuchsserien misslang. Auch die erzielten Ergebnisse mit Protein-basierten Nachweisverfahren konnten letztendlich nicht suffizient beurteilt werden. Die großen Schwankungen in der Konzentration und die Widersprüchlichkeit im Vergleich der Ergebnisse aktueller Literatur, machen eine Verfälschung durch Kontamination mit Proteinen aus lysierten Zellen sehr wahrscheinlich. Die erzielten Ergebnisse der RT-PCR anhand der Inter- und Intra-Assay- Vergleiche jedoch können nachfolgenden Projekten dazu dienen, hauptsächlich das Instrument LightCycler in seiner Sensitivität und Genauigkeit einschätzen zu können, und so die ermittelten Daten besser verarbeiten zu können. N2 - In this study we analysed the accuracy of PCR for identification of murine cytokine levels. Using blood samples of with A. Fumigatus infected mice, we wanted to reach a conclusion concerning the immune reaction. We picked TNFα, IL-12p40 and IL-10 to decide if the immune reaction is humoral or cell mediated. For determination of sensitivity and accuracy we compared the crossing points of the dilution standard series. We used the standard series once three times in one run and on the other hand in three independent runs. Our results correspond with the results in current literature. The establishment of the ELISA should have served for comparing the mRNA level with the protein level. But the tests failed. We couldn´t find mRNA of murine TNFα, and there was big variability in the concentration of protein. Probably the falsification happend because of the contamination with proteins from lysis of cells. But the conclusions from the RT-PCR inter- and intra-assay comparison could be helpful to assess the LightCycler instrument in its sensitivity and its accuracy and so facilitate the assessment of the results. KW - Aspergillus fumigatus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Immunreaktion KW - Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Real time quantitative PCR KW - Aspergillose KW - murin KW - IL 10 KW - IL 12 KW - IL 12p40 KW - ELISA KW - Mausmodell KW - invasive Aspergillose KW - aspergillus fumigatus KW - TNF a KW - immune reaction KW - RT-PCR KW - PCR KW - aspergillosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38890 ER - TY - THES A1 - Möller, Dorothee T1 - Zelladhäsionsmodifikation durch doppelt glykosylierte humane Lysozymmutanten T1 - Recombinant glycoproteins that modify cell adhesion N2 - Die Zelladhäsion von Leukozyten/ Metastasenzellen an Endothelzellen bei Entzündungsreaktionen/ Arteriosklerose und Tumormetastasierung ist ein mehrstufiger Prozess. Im ersten Schritt kommt es zu einer Interaktion zwischen E-Selektin-Rezeptoren auf den Endothelzellen und komplexen Kohlenhydraten, den Polylaktosaminen und ihren Derivaten, den Lewis-Antigenen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch transiente Transfektion fünf rekombinante Glykoproteine erzeugt (hLysII/IV-FucTIII-VII). Durch hLysII/IV-FucTVI konnte die Zelladhäsion von U937 an HUVEC Zellen signifikant gehemmt werden. Fukosyltransferase VI scheint in der Lage zu sein, die Bildung von endständigen sLex-Antigenen an den Polylaktosaminketten von hLys zu ermöglichen. Auch durch eine Transfektion der Kolonkarzinomzelllinie SW480 und Colo 206 konnten Lysozymmutanten hergestellt werden, mit denen eine signifikante Adhäsionblockade möglich ist. Man kann sich hLysII/IV-FucTVI- SW480 und- Colo206 als potentielle therapeutische Substanzen vorstellen, die zum Beispiel zur Entzündungs- oder Metastasierungshemmung eingesetzt werden. N2 - The initial step in diapedesis is the interaction between e-selectin and its ligand, the lewis antigen. In this study we examine the possibility to block this interaction to reduce metastasis and inflammatory processes. The plasmid hLysII/IV is expressed in CHO cells with active alpha1,3fucosyltransferases (III-VII). The resulting five recombinant glycoproteins are purified from cultur supernatants and static cell binding assays are performed. hLysII/IV-FucTVI was shown to bind to cells expressing e-selectin on its cell surface. It inhibited the binding of the monocytic cell line U937 to human endothelial cells activated with TNFalpha to upregulate the e-selectin expression. Alpha1,3fucosyltransferase VI seems to make possible the biosynthesis of the sLex and the hLysII/IV-FucTVI glycoprotein seems to be an interesting target to reduce inflammation and metastasis. KW - Glykoproteine KW - E-Selectin KW - Glycoproteinfucosyltransferasen KW - sialyl Lewis x KW - alpha1 KW - 3 fucosyltransferase-VI Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23961 ER - TY - THES A1 - Wicovsky, Andreas T1 - Die Rolle von TRAF1 und JNK bei der TNF-vermittelten Apoptose T1 - The role of TRAF1 and JNK in TNF-induced apoptosis N2 - TNF (Tumor Nekrose Faktor) vermittelt seine biologischen Funktionen durch Interaktionen mit TNFR1 (TNFRezeptor 1) und TNFR2 (TNFRezeptor 2). In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der TNFR2 sowohl durch die Induktion von membrangebundenem TNF als auch durch die proteasomale Degradation von TRAF2 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 2) die TNFR1-vermittelte Apoptose verstärken kann. Des Weiteren war bekannt, dass TRAF1 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 1), ein anderes Mitglied der TRAF-Familie, mit TRAF2 Heterotrimere bilden kann und zudem nach TNF-induzierter NFkappaB- (nuclear factor kappaB) Aktivierung verstärkt exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass TRAF1 in beide TNFR-Signalkomplexe rekrutiert wird und darin in einem TRAF2/TRAF1-Heterotrimer TRAF2 funktionell ersetzen kann. Darüber hinaus verhindert TRAF1 die Rekrutierung von TRAF2 in lipid rafts sowie dessen anschließende proteasomale Degradation. Auf diese Weise kann TRAF1 die TNFR2-abhängige Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose verhindern. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-vermittelte Aktivierung der JNK (c-Jun N-terminale Kinase), dessen Regulation durch ROS (reactive oxygen species), Caspasen (Cysteinyl-Aspartat-spezifische Proteasen) sowie NFkappaB-induzierte Faktoren untersucht. TNF induziert in den meisten Zellen zunächst nach zehn bis 30 Minuten eine transiente JNK-Aktivierung, woraufhin bei NFkB-inhibierten Zellen eine zweite andauernde JNK-Aktivierung folgt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Studien gehen dabei von einem ROS-abhängigen, Caspase-unabhängigen Mechanismus der persistierenden JNK-Aktivierung aus. Des Weiteren wurde in den vor allem bei embryonale Mausfibroblasten durchgeführten Untersuchungen davon ausgegangen, dass bestimmte NFkappaB-induzierte Radikalfänger die andauernde Aktivierung der JNK verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den humanen Zelllinien KB, Jurkat und HaCaT die andauernde Aktivierung der JNK, im Gegensatz zur transienten JNK-Aktivierung, Caspase-abhängig verläuft. Es ergab sich überdies, dass die inhibierende Wirkung des NFkB-Signalweges auf die persistierende JNK-Aktivierung in diesen Zelllinien in erster Linie auf die indirekte Verhinderung der Apoptose durch die Induktion von antiapoptotischen Proteinen wie Flip-L (FLICE-inhibitory protein long) und IAPs (inhibitor of apoptosis) zurückzuführen ist, als auf die direkte Expression von Radikalfängern. Zudem wurde in den untersuchten Zelllinien die Caspase-vermittelte Spaltung von MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) und p21WAF/Cip 1 nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass die Spaltprodukte eine JNK-stimulierende Wirkung haben. Dennoch müssen künftige Studien zeigen, ob die Spaltung von p21WAF/Cip 1 und MEKK-1 in Fragmente mit JNK–stimulierender Aktivität oder andere Caspasesubstrate für die Caspase-vermittelte andauernde Aktivierung der JNK verantwortlich sind. N2 - TNF (tumor necrosis factor) induces its biological functions by interactions with TNFR1 (TNF receptor 1) and TNFR2 (TNF receptor 2). In recent studies it has been shown that stimulation of TNFR2 results in an enhancement of the TNFR1-induced apoptosis. The reason of this finding is the transcriptional induction of membrane-bound TNF as well as the proteasomal degradation of TRAF2 (TNF receptor associated factor 2). Furthermore it was known that TRAF1 (TNF receptor associated factor 1), those expression is induced by TNF mediated NFkB (nuclear factor kappaB) activation, can interact with TRAF2. In the first part of this thesis it could be demonstrated that TRAF1 co-recruits with TRAF2 to TNFR1 and TNFR2 without affecting the downstream signalling pathways. Moreover, TRAF1 expression inhibits TNFR2 induced recruitment of TRAF2 into lipid rafts and its subsequent depletion. In this manner, TRAF1 abrogates the TNFR2-mediated enhancement of TNFR1-induced apoptosis. In the second part of this thesis the TNF-induced activation of JNK (c-Jun N-terminal kinase) as well as its regulation by ROS (reactive oxygen species), caspases (cysteinyl-aspartat-specific proteases) and NFkB-induced proteins were examined. In most cell types TNF induces a transient activation of the JNK pathway, whereas in NFkB-inhibited cells a second sustained activation of JNK is observed. Based on previous studies, it has been suggested that TNF-induced prolonged JNK activation is predominantly mediated by ROS. Moreover, in some studies based on mouse embryonal fibroblasts it has been suggested that expression of NFkB-induced antioxidants prevents prolonged JNK activation upon TNF stimulation. In this thesis it could be shown in various human cellular systems, including KB, Jurkat and HaCaT, that TNF-induced prolonged activation of JNK is in contrast to the transient activation mediated by caspases. Furthermore, it was demonstrated that NFkB induction inhibits the TNF-induced prolonged JNK activation indirectly by inhibiting apoptosis rather than directly by expression of antioxidants. In addition, caspase-dependent cleavage of MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) and p21WAF/Cip 1 was found in these cellular systems. As it is known from previous studies, cleavage of these proteins results in fragments with high JNK-stimulating activity, these caspase substrates could therefore play an important role in TNF-induced prolonged JNK-activation. However, further studies have to evaluate if the cleavage of MEKK-1 and p21WAF/Cip 1 or other caspase substrates mediates the TNF-induced caspase-dependent prolonged JNK-activation. KW - JNK KW - TRAF1 KW - TNF KW - Apoptose KW - JNK KW - TRAF1 KW - TNF KW - apoptosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23689 ER - TY - THES A1 - Lindner, Andreas T1 - Aktivierung und Zytotoxizität von gamma delta T-Lymphozyten gegenüber Tumorzellen hämatologischen Ursprungs - Untersuchungen in vitro T1 - Activation and cytotoxicity of gamma delta T lymphocytes against tumor cells of hematological origin N2 - Auf der Suche nach neuen Therapiemöglichkeiten für Tumorpatienten stellt die Immuntherapie mit gd T-Lymphozyten einen innovativen Ansatz dar. In vitro Zytotoxizität von Vg9Vd2 T-Lymphozyten wurde gegen eine Vielzahl von Tumorzellen belegt. Mit den Aminobisphosphonaten steht eine Reihe zugelassener und langjährig erprobter Medikamente zur Verfügung, die im Bereich therapeutisch verwendeter Dosierungen Vg9Vd2 T-Lymphozyten auch in vivo aktivieren können. Zudem ist Bromohydrin (BrHPP) als hochaffines synthetisches Phosphoantigen ein weiterer attraktiver Kandidat zur Aktivierung von gd T-Zellen und befindet sich am Menschen bereits in klinischen Studien. Strategien einer auf gd T-Zellen beruhenden Immuntherapie umfassen zum einen die in vitro Expansion von gd T-Lymphozyten mittels BrHPP oder Aminobisphosponaten mit anschließendem Transfer, dem so genannten adoptiven Zelltransfer auf den Patienten. Zum anderen kann die Anti-Tumoraktivität von Vg9Vd2 T-Lymphozyten auch direkt in vivo mittels Bisphosphonaten induziert werden, wie in einer Pilotstudie mit einem Anti-Lymphom- bzw. Anti-Myelom-Effekt bis hin zu einer klinischen partiellen Remission durch die Therapie mit einem Bisphosphonat (Pamidronat) und IL-2 eindrucksvoll gezeigt werden konnte. In der hier vorliegenden Arbeit wurde eine effektive Methode zur in vitro Proliferation von Vg9Vd2 T-Zellen mit Ausbildung ihrer Anti-Tumoraktivität durch BrHPP und durch das Bisphosphonat Zoledronat in Anwesenheit von IL-2 gezeigt. Weitergehend konnte mit Zytotoxizitätstestungen – basierend auf der Messung der Laktatdehydrogenase-Aktivität – die zytolytische Aktivität dieser expandierten gd T-Zellen gegenüber den primären Tumorzellen von insgesamt 8 Leukämie-Patienten, sowie je einem Patienten mit einem Lymphom und einem Plasmozytom nachgewiesen werden. Dadurch wurde einerseits das besondere Potential der gd T-Lymphozyten gegenüber hämatologischen Neoplasien unterstrichen, andererseits konnte ein Testverfahren gezeigt werden, mit dem das Spektrum empfindlicher Tumorzellen und Einflussgrößen untersucht werden können. In einem Experiment wurde dargestellt, wie die myelomonozytäre Zelllinie THP1 im Gegensatz zu ihrer sonst vorliegenden Anergie nach Vorbehandlung mit Zoledronat durch gd T-Zellen lysiert werden konnte. In einem autologen Versuchsansatz konnte die Anti-Tumoraktivität der gd T-Zellen eines Patienten mit der Diagnose eines follikuläres B-NHL durch Vorbehandlung der Lymphomzellen mit Zoledronat noch gesteigert werden. gd T-Zellen unterliegen als Teil des komplexen Immunsystems verschiedenen Regulationsmechanismen, die auch manipuliert werden können. In vitro Testverfahren – wie in dieser Arbeit – sind die Voraussetzung für eine Grundlagenforschung, mit deren Hilfe man in Zukunft zu einer hoffnungsvollen, auf gd T-Zellen basierenden Immuntherapie maligner Erkrankungen gelangen könnte. N2 - During the last few years, knowledge about the innate effector lymphocytes – such as natural killer (NK) cells, NK T cells and gd T cells – has advanced enormously, while immunotherapeutic strategies based on gd T cells have received increasingly more attention. The main subset of gd T cells in the human peripheral blood – the Vg9Vd2 T cells – possess a cytotoxic effector activity against a variety of tumor cells in vitro. Aminobisphosphonates – licensed and widely used antiresorptive drugs in malignant and nonmalignant bone disease – have been identified as potent synthetic stimulators of Vg9Vd2 T cells in vitro and in vivo. Furthermore, bromohydrin pyrophosphate (BrHPP) is another highly potent synthetic phosphoantigen for gd T cells. Two strategies for the potential use of gd T cells in tumor immunotherapy are presently being envisaged. On one hand, in vitro expansion of gd T cells by aminobisphosphonates (ABP) or BrHPP in the presence of IL-2 with a resultant cell transfer – the so-called adoptive transfer – to the patient, has shown promising results in animal models. On the other hand, there is the possibility of in vivo therapeutic administration of gd-stimulating synthetical phosphoantigens (ABP or BrHPP) in combination with low dose IL-2 in cancer therapy. In a pioneer pilot study, treatment with a second-generation ABP, Pamidronate, in combination with IL- 2 induced an objective antitumor activity in patients with low-grade non-Hodgkin lymphoma or multiple myeloma. The correlation of expansion of gd T cells in vivo with the clinical response (tumor stabilization or partial remission) demonstrated in this study the feasability of gd T-cell immunotherapy. Phase 1 clinical trials designed to evaluate BrHPP combined with low-dose IL-2 in patients with renal cell carcinoma and relapsed lymphoma are ongoing. In the presented medical thesis, peripheral Vg9Vd2 T cells were activated and expanded to large in vitro clones by stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with BrHPP in the presence of low-dose IL-2. After 12 to 16 days, cultures derived from patient’s PBMCs contained a percentage of gd T cells ranging between 75 % and 92 % (from an initial 4 % – 6 %) with an accompanying 2 to 4-fold increase in the absolute cell counts. Through this protocol, numerous gd T cells can be made available for in vitro experiments or for potential adoptive cell transfers. Furthermore, the capacity of expanded gd T cells from healthy donors to lyse primary tumor cells from patients were analysed with a cytotoxicity assay, based on the release of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). Our examinations displayed a strong cytotoxic effector activity of gd T cells against tumor cells from eight patients with acute myeloid and acute lymphocytic leukemia. The CD69 expression – as an early activation marker – of native gd T-cells induced through the tumor cells was not correlated to the antitumor effect of BrHPP-activated gd T cells against these tumor cells. This may be a consequence of distinct pathways – a TCR-dependent pathway and a natural killer-like pathway - for antitumor immunity. In an autologous experiment, gd T cells of a patient with a non-Hodgkin’s lymphoma showed cytotoxicity against the malignant cells. Additionally, the gd T-cells from this patient exhibited a markedly enhanced cytotoxicity against lymphoma cells pretreated with Zoledronate – currently the most potent third-generation ABP – as compared with untreated lymphoma cells. Further, we showed that the THP-1 tumorline (myelomonocytic leukemia) became susceptible to gd T cell-mediated cytotoxicity following pretreatment with Zoledronate, while normal THP-1 cells remained resistant. These observations outline the critical role of gd T cell population in immune surveillance, particularly against hematopoietic malignancies and the possibility to benefit from synthetical phosphoantigens for this immunotherapeutic approach. In vitro analysis – as demonstrated here – are the presupposition for evaluating future immunotherapeutic strategies with gd T lymphocytes. KW - gamma delta T-Zellen KW - Zytotoxizität KW - Tumor Immuntherapie KW - bromohydrin pyrophosphat KW - zoledronat KW - gamma delta T cells KW - lactate dehydrogenase cytotoxicity assay KW - cancer immunotherapy KW - bromohydrin pyrophosphate KW - zoledronate Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23447 ER - TY - THES A1 - Mezger, Markus T1 - Interaktion zwischen dem humanen Cytomegalievirus, Aspergillus fumigatus, dendritischen Zellen und neutrophilen Granulozyten T1 - Interaction of the human cytomegalovirus, Aspergillus fumigatus, dendritic cells and polymorphonuclear neutrophils N2 - Immunsupprimierte Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für opportunistische Infektionen, die hauptsächlich durch das humane Cytomegalievirus (HCMV) und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus verursacht werden. Aufgrund ihrer Lokalisation in den Geweben unterhalb von Lungenepithelien und des Gastrointestinaltraktes werden dendritische Zellen (DCs) als diejenigen Zellen betrachtet, die während der frühen Phase einer Infektion in Kontakt mit HCMV und A. fumigatus kommen und eine Aktivierung von angeborenen und adaptiven Abwehrmechanismen vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Bedeutung von humanen DCs bei der Bekämpfung von HCMV und A. fumigatus näher untersucht. Um mit dem klinisch relevanten HCMV Stamm TB40E arbeiten zu können, musste zuerst ein geeignetes Zellkultursystem zur Anzucht von HCMV etabliert werden. Die aus Fibroblasten aufgereinigten Viren eigneten sich zur erfolgreichen Infektion von DCs, was durch verschiedene Färbemethoden nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund war es möglich, in Abhängigkeit der Zeit ein Expressionsprofil von Klasse I Interferonen (IFN-alpha, IFN-beta), ausgesuchten Cytokinen (CXCL10, CXCL11, Rantes) und den wichtigen Immunrezeptoren Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) und dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) zu erstellen. Nachdem ein RNA Interferenz (RNAi) System zur erfolgreichen Transfektion von DCs mit small interfering RNA (siRNA) etabliert werden konnte, gelang es die Expression von TLR3 signifikant herunterzuregulieren. Stimulationsexperimente mit dem synthetisch hergestellten Polymer poly I:C identifizierten TLR3 als den Rezeptor, der die Expression von IFN-beta vermittelt. Ferner konnte nachgewiesen werden, dass TLR9 bei ex vivo generierten DCs keine Funktion besitzt. Eine direkte Aktivierung von TLR3 durch HCMV konnte mittels siRNA nicht nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von genomweiten Microarray-Analysen konnten eine Vielzahl an Genen gefunden werden, die nach Co-Kultivierung von DCs und lebenden A. fumigatus Keimschläuchen (KS) differentiell exprimiert waren. Dabei wurde ein breites Spektrum an Cytokinen (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), Chemokinen (IL-8, CCL20, CXCL10), Co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80, CD83, CD86), Prostaglandin Synthese Genen (PTGS2) und Immunrezeptoren (PTX-3, TLR2, TLR4) gefunden, deren zeitabhängiges Expressionsprofil mittels qRT-PCR eindeutig bestätigt wurde. Als Wachen des Immunsystems müssen DCs Krankheitserreger zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion erkennen. Die Erkennung von Pilzen wird durch die unterschiedlichen Rezeptoren vermittelt, die TLRs, C-Typ Lektine und Pentraxine umfassen, wobei ihre Bedeutung für humane DCs bisher nur unzureichend geklärt ist. Durch den Einsatz von siRNA konnte die Expression von TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), DC-SIGN, Pentraxin-3 (PTX-3) und caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) signifikant verringert werden. Für TLR2, TLR4, PTX-3 und DC-SIGN konnte durch den Einsatz der RNAi aufgezeigt werden, dass diese Rezeptoren nicht an der Induktion einer pro-inflammatorischen Immunantwort von DCs nach Infektion mit A. fumigatus beteiligt sind. Sowohl die Stimulierung mit den TLR Liganden Zymosan und LPS, als auch mit A. fumigatus, führte zu einer erhöhten Expression von TNF-alpha und IL-12 (Light Cycler), die sich in einer vermehrten Cytokinfreisetzung (ELISA) bemerkbar machte. Im Gegensatz zur TLR4 siRNA Transfektion und LPS-Stimulation war keine Reduktion der Expression von TNF-alpha und IL-12 nach TLR2 und TLR4 siRNA Transfektion und anschließender Pilzinfektion zu beobachten. Auch der Einsatz von gegen TLRs gerichteten Antikörpern konnte eine mögliche Signaltransduktion bei DCs nicht unterbinden. Anstelle von TLR2 und TLR4 wurde Dectin-1 als DC-Immunrezeptor für A. fumigatus KS identifiziert. Mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen Dectin-1 war es möglich, die Freisetzung von TNF-alpha und IL-12 nach Pilzinfektion zu blockieren. In einem unabhängigen Experiment mit siRNA wurde Dectin-1 als Rezeptor für A. fumigatus bestätigt. Wie fortführende Experimente mit Candida albicans KS und Zymosan gezeigt haben, handelt es sich bei Dectin-1 auf humanen DCs um einen generellen Rezeptor für Pilze. Die durchgeführten SNP-Analysen (single nucleotide polymorphism) zur Ermittlung eines Zusammenhanges mit einem erhöhten Virus- und Pilzinfektionsrisiko für Patienten nach Stammzelltransplantation erbrachten die Erkenntnis darüber, dass zwei Marker (rs735240, rs2287886) in DC-SIGN mit einer erhöhten Empfänglichkeit für HCMV, und drei Marker (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 mit einem vergrößerten Riskio für eine invasive Aspergillose assoziiert waren. Ein Screening von Patienten auf das Vorhandensein dieser definierten SNPs könnte helfen, die individuelle Gefahr für HCMV und A. fumigatus nach nach allogener Stammzelltransplantation abzuschätzen. N2 - Patients after allogenic stem cell transplantation (alloSCT) have an increased risk to suffer from viral and fungal infections, which are mainly caused by the human cytomegalovirus (HCMV) and the mold Aspergillus fumigatus. Due to their localization in tissues under lung epithelia and the gastrointestinal tract, dendritic cells (DCs) are considered to be the first cells coming into close contact with HCMV and A. fumigatus for the activation of innate and adaptive immune mechanisms. Within the scope of this dissertation, the role of human monocyte-derived DCs in the abatement of HCMV and A. fumgatus was analyzed. In order to work with HCMV, a cell culture system for effective culturing of the clinical relevant HCMV strain TB40E had to be established first. The viral particles up-cleaned from lung fibroblasts were used for infection of DCs and successful infection was approved by different staining methods. For this reason, it was possible to determine a time-dependent expression profile of class I interferons (IFN-alpha, IFN-beta), selected cytokines (CXCL10, CXCL11, Rantes) and immunoreceptors (TLR3, DC-SIGN). A RNA interference (RNAi) system for human DCs was established to significantly knock-down expression of TLR3 without the induction of an unwanted pro-inflammatory cytokine response. Stimulation experiments with the synthetic polymer poly I:C (which resembles dsRNA of infectious viruses) identified TLR3 as a receptor for triggering expression of IFN-beta. However, whether there is a direct activation of TLR3 through dsRNA intermediates, possibly emerging during replication of HCMV, can not be answered to date definitively, because TLR3 small interfering RNA (siRNA) transfection prior to HCMV infection did not result in minor expression of IFN-beta. Gene expression pattern of DCs after co-cultivation with living A. fumigatus germ tubes was studied by whole genome microarray analysis and real-time PCR, demonstrating an upregulation of a broad spectrum of cytokines (TNF-alpha, IL-6, IL-10, IL-12), chemokines (IL-8, CCL20, CXCL10), co-stimulatory molecules (CD40, CD80, CD83, CD86), prostaglandin synthesis genes (PTGS2), as well as genes involved in fungal recognition (PTX-3, TLR2, TLR4) and cytoskeleton organization / phagocytosis. As the sentries of the immune system, DCs must recognize fungi at an early step of infection. Pathogen detection is mediated by different receptors comprising TLRs, C-type lectins and Pentraxines (PTX), but only little is known about their relevance for DCs. Using specific siRNAs, expression of TLR2, TLR4, myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88), dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN), Pentraxin-3 (PTX-3) and caspase recruitment domain family member 9 (Card-9) was significantly diminished, respectively. In contrast to control experiments with TLR4 siRNA and LPS stimulation, A. fumigatus induced expression of pro-inflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-12) was not reduced when TLR2 and TLR4 expression was knocked-down by specific siRNAs prior to infection. However, using siRNAs directed against Dectin-1 allowed demonstration of an interaction between Dectin-1 and A. fumigatus germlings, Candida albicans germ tubes and Zymosan. In an independent approach, cytokine secretion could be blocked by anti-Dectin-1 antibody treatement prior to fungal exposure. In conclusion, Dectin-1 was identified as an important fungal receptor on DCs whereas TLR2 and TLR4 seemed to play a negligible role. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in various cellular receptor genes are associated with the susceptibility to and severity of infectious diseases. In this study, genetic polymorphisms in genes encoding for virus entry receptors have been analyzed for their association to HCMV reactivation and disease in patients after allogeneic stem cell transplantation. A comparison of different genotyping methods highlighted the advantages of the Light Cycler system, the cycle-suequencing and the matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI-MS) when using small quantities of patients’ DNA. Two markers (rs735240, rs2287886) in the promoter region of DC-SIGN were found to be significantly associated with an increased susceptibility to HCMV. In addition, three SNPs (rs1554013, rs3921, rs4257674) in CXCL10 elevated the risk for the development of invasive aspergillosis. Screening of patients after alloSCT for the presence of these defined genetic polymorphisms may help to predict the individual risk to suffer from HCMV and A. fumigatus after alloSCT. KW - Aspergillus fumigatus KW - Cytomegalie-Virus KW - Dendritische Zelle KW - Granulozyt KW - SNP KW - Microarray KW - Toll-like-Rezeptoren KW - RNS-Interferenz KW - Aspergillus fumigatus KW - human cytomegalovirus KW - dendritic cell KW - polymorphonuclear neutrophil KW - SNP KW - Microarray KW - Toll-like Receptor KW - RNA interference Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27254 ER - TY - THES A1 - Rosler, Eduard T1 - Allelische Verlustanalyse der chromosomalen Regionen 8p22 und 18q21.1 bei kolorektalen Karzinomen T1 - Analysis of allelic loss of the chromosomal regions 8p22 and 18q21.1 in colorectal carcinomas N2 - In dieser Arbeit wurden 169 kolorektale Karzinome auf das Vorhandensein eines allelischen Verlustes (LOH - "loss of heterozygosity")der Region 8p22 um den Marker D8S254 sowie der Region 18q21.1 um den Marker D18S474 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein allelischer Verlust des Mikrosatellitenmarkers D18S474 signifikant mit einer schlechteren Patientenprognose bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen im Stadium I-IV korreliert ist. Neben der prognostischen Bedeutung könnte ein LOH 18q21.1 auch einen Einfluß auf die Therapie der Patienten haben. Patienten im Stadium II mit LOH D18S474 könnten beispielsweise von einer adjuvanten Chemotherapie eher profitieren als Patienten ohne LOH D18S474. Im Gegensatz zu anderen Arbeitsgruppen konnte keine Korrelation eines allelischen Verlustes des Mikrosatellitenmarkers D8S254 oder einer Kombination von LOH D8S254 und D18S474 bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen im Stadium I-IV mit der Patientenprognose gezeigt werden. Es fanden sich im Rahmen dieser Studie geschlechtsspezifische Unterschiede für die Tumoreigenschaften und die Prognose sowohl für Tumoren mit einem allelischen Verlust im Mikrosatellitenmarker D8S254 und D18S474. Ein LOH des Markers D8S254 bei Frauen scheint signifikant häufiger mit einem Stadium IV-Tumor, bei Männern jedoch signifikant häufiger mit einem Tumor des Stadium II korreliert zu sein. Frauen mit einem LOH des Markers D18S474 weisen signifikant weniger Stadium I-Tumore auf, jedoch signifikant häufiger Stadium IV-Tumore. Bei Männern hingegen zeigt sich kein Zusammenhang. Diese Unterschiede in der Verteilung spiegeln sich auch in der durchschnittlichen Überlebenszeit wieder. Demnach haben Frauen mit einem LOH sowohl der Region 8p22 als auch der Region 18q21.1 und noch deutlicher in Kombination eine signifikant schlechtere Prognose als Patientinnen mit einem kolorektalen Karzinom ohne chromosomalen Verlust einer dieser beiden Regionen. N2 - In this study 169 colorectal Carcinomas were testes for an allelic loss (LOH - "loss of heterozygosity")of the region 8p22 and the marker D8S254 and the region 18q21.1 and the marker D18S474. A LOH of the region 18g21.1 could be correlated with a poor prognosis in every stage. In addition a LOH in this region could have influence on the therapy descision. Patients with stage II Carcinomas and LOH 18q21.1 could benefit from a chemotherapy in opposite to those without this allelic loss. A LOH of the region 8p22 and a combined loss of both chromosomal regions stood in no correlation with a poor survival outcome. But for female patients a loss of heterozygosity of both regions could be found more often in stage IV colorectal ccarcinomas. According to this it could be correlated with a poor outcome especially in a combination of both allelic losses. KW - Kolon KW - Dickdarmkrebs KW - Chromosom 8 KW - Chromosomenanalyse KW - LOH KW - chromosomale Verlustanalyse KW - Allelische Verlustanalyse KW - 8p22 KW - 18q21.1 KW - Loss of heterozygosity KW - colorectal carcinoma Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29361 ER -