TY - THES A1 - Fuchs, Sibylle Maria T1 - Untersuchungen zur Regulation von Shiga-Toxin 2 und zur Attenuierung von enterohämorrhagischen Escherichia coli T1 - Investigation of Shiga toxin 2 regulation and attenuation of enterohaemorrhagic Escherichia coli N2 - Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden. N2 - Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are important emerging pathogens responsible for the development of diarrheal diseases, ranging from unbloody diarrhea to hemorrhagic colitis, and of life-threatening extraintestinal complications like the hemolytic-uremic syndrome. The most important virulence factors of this pathogen are the mostly phage-encoded Shiga toxins (Stx) and the factors involved in the development of so-called "attaching and effacing lesions" on gut epithelial cells. Children and the elderly are mainly affected by these infections, which often occur as outbreaks. The infections are predominantly transmitted by fecally contaminated food. The treatment of EHEC infections with some antibiotics may promote the development of extraintestinal complications. Therefore, the best way to combat this infectious agent would be the vaccination of the endangered people. Another way would be the eradication of the organism in its asymptomatic carrier animals involved in the transmission of EHEC into the human food chain. The objective of this thesis was to lay the basis for the development of a life vaccine strain for people or cattle against EHEC infections. Therefore, different strategies aiming at the attenuation of a Stx2-producing EHEC wildtype strain were followed. One strategy for the attenuation of EHEC is the direct knockout of virulence factor structural genes, like the toxin genes. Therefore, a stx2-negative mutant of the EHEC strain O157:H7 86-24 was constructed by deleting the central part of the stx2 gene cluster, leading to the fusion of the 154 N-terminal aminoacids of StxA2 with the 62 C-terminal aminoacids of StxB2. The characterisation of the mutant revealed that the toxin-converting bacteriophage was still intact, but that the fusion protein had completely lost its cytotoxic activity and that it could be detected using Stx2-specific pig antiserum. It has been concluded that the respective mutant protein had kept part of its antigenic structure and that it could potentially be used for vaccination against Stx2-specific damage. Another strategy aiming at the attenuation of EHEC-strains was the deletion of genes involved in the regulation of virulence factors in order to prevent the expression of the respective factors. Firstly, the identification and characterisation of a formerly postulated bacteriophage-encoded toxin-specific regulator which had the capability to induce the expression of a stx2-specific reporter gene after induction of the phage was attempted. A transposon-mutagenesis of the Stx2-converting phage 933W yielded a variety of phage mutants with altered expression of the reporter gene upon phage induction. Toxin production as well as the capability to produce phage particles did not correlate well with the reporter gene phenotypes. The transposon of the mutant with the lowest induction of the reporter gene was inserted into ORF L0065 located immediately upstream of the phage's int/xis genes. The cloned wildtype ORF was not able to trans-complement the transposon mutant. It was concluded that the mutant's phenotype was due to a reduced excision of the phage genome caused by a polar effect of the transposon on int/xis and therefore reduced phage induction leading to reduced reporter gene induction. Neely et al. (1998) identified the phage antiterminator Q as a possible candidate for the postulated phage-encoded stx2 regulator. The specific deletion of this general phage regulator might help to attenuate EHEC by disturbing regular phage functions. Secondly, recA-negative mutants of the EHEC-strains O157:H7 86-24 and EDL933 were examined in different mouse models as part of a project of Dr. I. Muehldorfer. It was demonstrated that the deletion of recA brought about a massive virulence loss due to a drastic reduction of toxin production, which was indirectly caused by the lack of recA. Thus, the deletion of recA attenuates pathogenic EHEC strains in the mouse model. In contrast, the deletion of recA in UPEC strain O6:K15:H31 536 did not alter the virulence of this strain. The analysis of the revealed virulence data was performed as part of this thesis. In addition, the deletion of recA is an important safety measurement for preventing the integration of foreign DNA into attenuated strains and thus, it helps preventing reversion of the vaccine to pathogenicity. Thirdly, the consequences of a deletion of the gene leuX coding for the minor Leucin specific tRNA5Leu on the expression of virulence factors in EHEC were examined by the construction and characterisation of an EHEC O157:H7 86-24 leuX-deletion mutant. In UPEC strain 536, the deletion of this tRNA lead to an attenuation of this strain due to reduced expression of diverse virulence factors. It was demonstrated that in EHEC, like in UPEC, the production of flagella and enterobactin was reduced. In addition, Hemin utilisation was impaired. The deletion of leuX also diminished the expression of various proteins of the outer and inner membrane as well as of an antigen cross-reacting with serum specific for type 1-fimbriae. In contrast, it did not influence the production of Stx2 as well as the in vivo pathogenicity of the strain in mice. Enterohaemolysis and the expression of Intimin were enhanced. Thus, it was demonstrated that the typical EHEC virulence factors were not reduced in the leuX mutant. In addition, it became obvious that the impact of leuX on the expression of the respective genes is not only based on a translational reduction due to a lack of tRNA availability but seems to involve further mechanisms. We concluded that apparently, an attenuation of EHEC is not possible by the deletion of leuX. KW - EHEC KW - STEC KW - Attenuierung KW - Virulenzfaktor KW - Genexpression KW - Enterhämorrhagische Escherichia coli KW - EHEC KW - STEC KW - Shiga-Toxin 2 KW - Stx2 KW - Stx2-Mutante KW - Regulation KW - Phage KW - lysogen KW - Phageninduktion KW - Enterohaemorrhagic Escherichia coli KW - EHEC KW - STEC KW - shiga toxin 2 KW - Stx2 KW - Stx2-mutant KW - regulation KW - phage KW - lysogen KW - phage induction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1303 ER - TY - THES A1 - Kelm, Bernd T1 - A New Synthesis of enantiopure C-3-substituted Glutamates by Utilization of Ortho Ester protected (S)-Pyroglutamic acid T1 - Eine neue Synthese enantiomerenreiner C-3-substituierter Glutamate unter der Verwendung Orthoester-geschützter (S)-Pyroglutaminsäure N2 - Priority tasks of the present thesis were to generate various enantiopure C-3-substituted pyroglutamates as well as C-3-substituted glutamates, and furthermore to ameliorate the serious drawback of the bad atom-economy in the reaction sequence of previously published silylether-mediated procedures. To meet these requirements, the ortho ester functionality (OBO ester) developed by Corey was introduced. According to the plan of synthesis, the starting material, non-racemic (S)-pyroglutamic acid, was converted to the corresponding oxetane ester via a DCC-mediated esterification. The latter was N-protected to provide N-acceptor substituted pyroglutamic acid oxetane esters (Acceptor=Boc,Cbz,CO2Me). After rearrangement with boron trifluoride, the ortho ester derivatives (Acceptor=Cbz,CO2Me) were at hand and exclusively the N-Cbz derivative was converted to the corresponding alpha,beta-unsaturated lactam via a syn-elimination reaction. The formation of the C-3-substituted ortho ester compounds (R=methyl,ethyl,butyl,allyl,phenyl,4-chlorophenyl,biphenyl,naphthyl) was performed via a copper-mediated conjugate addition to the alpha,beta-enone system of the N-Cbz-alpha,beta-unsaturated lactam. The OBO functionality hence was envisaged to support perfect trans selectivity in this cuprate addition to the Michael system of the N-Cbz-alpha,beta-unsaturated lactam. Spectroscopic NMR-data, on the basis of 1H-, 13C- and DEPT spectra, proved the assumption that the C-3-substituted ortho ester derivatives exclusively are trans-configurated, i.e. the alkyl derivatives (R=methyl,ethyl,butyl,allyl) are (2S,3S)-configurated and the aryl derivatives (R=phenyl,4-chlorophenyl,biphenyl,naphthyl) are (2S,3R)-configurated). The C-3-substituted ortho ester derivatives were completely deprotected to yield the C-3-substituted pyroglutamates (R=ethyl,phenyl,4-chlorophenyl,naphthyl). Finally, ring opening reaction via route A-2 lead to the desired enantiopure C-3-substituted glutamates. Alternatively, latter preferably were reacted via route A-1 to yield the C-3-substituted glutamates (R=methyl,ethyl,butyl,phenyl,4-chlorophenyl,naphthyl). Their (2S,3R)-configuration (R=aryl) and (2S,3S)-configuration (R=alky), respectively, unambiguously was proved on the basis of available spectroscopic NMR-data. To ensure this assumption, diastereomeric (2S,3R)-3-methyl glutamic acid (i.e. cis-configurated) examplarily was synthesized via route A-3 and spectroscopic NMR-data was compared to that of (2S,3S)-3-methyl glutamic acid (i.e. trans-configurated). Conclusively, there can be recorded the fact that the serious drawback of the bad atom-economy in the reaction sequence previously used can be circumvented by the introduction of the OBO functionality, so the concept of an improved atom-economy is achieved. Additionally, in comparison to the silyl-ether-mediated synthesis, the OBO functionality provided crystalline ortho ester derivatives, which facilitated their purification as well as characterization. N2 - Schwerpunkte dieser Arbeit lagen in der Synthese verschiedener enantiomerenreiner C-3-substituierter Pyroglutamate als auch Glutamate und desweiteren darin, die unzulängliche Wirtschaftlichkeit der bereits bekannten Silylether-vermittelten Methode zu verbessern. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, wurde die von Corey entwickelte Orthoester-Funktionalität (OBO Ester) eingeführt. Dem Syntheseplan entsprechend wurde die Ausgangskomponente, nicht-razemische (S)-Pyroglutaminsäure, über eine DCC-vermittelteVeresterung zum entsprechenden Oxetanester umgesetzt. Dieser wurde daraufhin N-geschützt, wobei die N-Akzeptor-substituierten Pyroglutaminsäureoxetanester(Akzeptor=Boc,Cbz,CO2Me) erhalten wurden. Nach der Umlagerung dieser Ester mit Bortrifluorid wurden die Orthoester-Derivate (Akzeptor=Cbz,CO2Me) erhalten, wobei sich ausschliesslich das N-Cbz Derivat über eine syn-Eliminierungsreaktion zum entsprechenden alpha,beta-ungesättigten Lactam umsetzen liess. Die C-3-substituierten Orthoester-Derivate (R = Methyl,Ethyl,Butyl,Allyl,Phenyl,4-Chlorphenyl,Biphenyl,Naphthyl) wurden über eine kupferkatalysierte 1,4-Addition an das alpha,beta-Enon-System des alpha,beta-ungesättigten Orthoester-Derivats erhalten. Hiebei war zu erwarten, dass die OBO-Funktionalität ausschliesslich trans-Selektivität bei der Cuprat-Addition an das Michael System dieses Derivats gewährleistet. 1H-, 13C- und DEPT-Spektren und die daraus erhaltenen Daten lieferten den Beweis, dass die C-3-substituierten Orthoester-Derivate ausschliesslich trans-Konfiguration aufwiesen, d.h. die Alkylderivate (R=Methyl,Ethyl,Butyl,Allyl) sind (2S,3S)-konfiguriert bzw. die Arylderivate (R=Phenyl,4-Chlorphenyl,Biphenyl,Naphthyl) (2S,3R)-konfiguriert. Die C-3-substituierten Orthoester-Derivate wurden vollständig entschützt, um die C-3-substituierten Pyroglutamate (R=Ethyl,Phenyl,4-Chlorphenyl,Naphthyl) zu erhalten. Schliesslich führte eine Ringöffnungsreaktion über Route A-2 zu den gewünschten enantiomerenreinen C-3-substituierten Glutamaten. Alternativ wurden diese Glutamate (R=Methyl,Ethyl,Butyl, Phenyl,4-Chlorphenyl,Naphthyl) auf eine einfachere Art und Weise über Route A-1 aus den entsprechenden C-3-substituierten Orthoester-Derivaten gewonnen. Deren (2S,3R)-Konfiguration (R=aryl) bzw. (2S,3S)-Konfiguration (R=alkyl) wurde anhand verfügbarer spectroskopischer NMR-Daten überprüft. Um diese Vermutung zu untermauern, wurde beispielhaft (2S,3R)-3-Methylglutaminsäure (i.e. cis-konfiguriert) über Route A-3 synthetisiert und deren spectroskopische NMR-Daten mit denen von (2S,3S)-3-Methylglutaminsäure (i.e. trans-konfiguriert) verglichen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Nachteil der unzulänglichen Wirtschaftlichkeit früherer Synthesen durch die Einführung der OBO-Funktionalität umgangen werden kann, so dass letztendlich das Konzept einer verbesserten „atom-economy“ erreicht wurde. Zusätzlich lieferte die OBO-Funktionalität im Vergleich mit Silylether-Synthesen den Vorteil kristalliner Orthoester-Produkte, was sowohl die Aufarbeitung als auch deren Charakterisierung erleichterte. KW - Glutamate KW - Stereoselektive Synthese KW - Pyroglutaminsäure KW - Glutamate KW - C-3-substituiert KW - enantiomerenrein KW - Pyroglutaminsäure KW - Synthese KW - glutamates KW - C-3-substituted KW - enantiopure KW - pyroglutamic acid KW - synthesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1296 ER - TY - THES A1 - Boras, Mihael T1 - Primär-Phosphankomplexe und sekundäre Metallo-phosphane des Molybdäns und Wolframs T1 - Primary phospine complexes of molybdenum and tungsten N2 - Cyclopentadienyl-Triscarbonyl-Primärphosphankomplexe des Molybdäns und Wolframs lassen sich leicht aus den komplexen Metallhydriden mittels Hydridabstraktion und Zugabe des entsprechenden primären Phosphans synthetisieren. Die so erzeugten primären Phosphankomplexe lassen sich mit Triethylamin in die entsprechenden sekundären Metallo-phosphane überführen. Aufgrund ihrer ausgeprägten Nukleophilie können die Metallo-phosphane einer Vielzahl an Oxidationsreaktionen unterworfen werden und reagieren mit sanften Oxygenierungsmitteln wie 1,1-Dimethyldioxiran zu den entsprechenden Metallo-phosphanoxiden oder mit elementarem Schwefel bzw. Selen zu Chalkogen-phosphoranen und verwandten Verbindungen. Die oben beschriebenen Primärphosphankomplexe stellen Ausgangsverbindungen für die Reaktion mit elektronenarmen organischen Mehrfachbindungssystemen dar. Dabei wird durch die Zugabe katalytischer Mengen einer Base wie z.B. Triethylamin intermediär das korrespondierende Metallo-phosphan generiert das als Nukleophil an der Mehrfachbindung angreift. Abschließende Reprotonierung führt zur Ausbildung eines sekundären Phosphankomplexes, wobei formal eine Insertion des ungesättigten Systems (z.B. Maleinsäuredimethylester) in eine P-H-Bindung erfolgt. Auch Metallo-phosphane können für Insertionsreaktionen genutzt werden, wobei mit elektronenarmen Alkinen der Aufbau von Phosphabenzolderivaten gelingt. N2 - Cyclopentadienyl-triscarbonyl-primary-phosphine complexes of molybdenum and tungsten can be easily prepared by hydride abstraction and addition of the corresponding phosphine starting with the metal hydrides. The thus formed primary phosphine complexes can be converted into the corresponding secondary metallo-phosphines using triethylamine. Due to their nucleophilic behaviour the metallo-phosphines can be used for oxygenation reactions. They react with 1,1-dimethyldioxirane to the corresponding metallo-phosphine-oxides or with elemental sulfur or selen to chalkogene-phosphoranes and related compounds. The primary phosphine complexes are starting materials for the reaction of electron deficient organic multiple bond systems. Addition of catalytic amounts of a base e.g. triethylamine leads to the generation of metallo-phosphines, a nucleophilic compounds that attacks the multiple bond. Reprotonation generates a secondary phosphine complexe as a result of an insertion of the unsaturated system (e.g. maleinic acid dimethylester) into a P-H bond. Metallo-phosphines can also be used for insertion reactions. Thus the use of electron deficient alkynes leads to the formation of phosphabenzene derivatives. KW - Übergangsmetallkomplexe KW - Sechste Nebengruppe KW - Phosphine KW - Molybdän KW - Phosphane KW - Wolfram KW - Metallkomplexe KW - Primärphosphankomplexe KW - Metallo-phosphan KW - Hydrophosphinierung KW - Wolfram KW - Molybdän KW - primary phosphine complexes KW - metallo-phosphines KW - hydrophosphination KW - tungsten KW - molybdenum Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1281 ER - TY - THES A1 - Reichel, Sonja T1 - Klonierung der cDNA des Protein A Kinase-Adaptor-Proteins-2 und Untersuchungen zur Regulation seiner mRNA in humanen fötalen Osteoblasten T1 - Clonig of the cDNA of Protein A Kinase-Adapter Protein-2 and Examination of the Regulation of its mRNA N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die vollständige cDNA-Sequenz des Proteinkinase A-Ankerproteins-2 (AKAP-2, 7,5kB) ermittelt. Zu diesem neuen humanen Gen sind bis dato außer einem unvollständigem Datenbankeintrag noch keine experimentellen Daten zur cDNA, mRNA oder zum Protein veröffentlicht. Mittels Northernblot wurde die Regulation der Expression der mRNA von AKAP-2 in humanem osteoblastären hFOB-Zellen sowie ihre Expression in unterschiedlichen Geweben untersucht: In hFOB-Zellen wird die mRNA bereits basal in geringem Maße exprimiert und kann schnell und transient induziert werden.Das Maximum der Induktion sowohl durch TNFa als auch durch TPA erfolgt nach fünf Stunde, v.a. durch veränderte Transskription. Dies entspricht der Kinetik eines sogenannten schnell induzierbaren Gens. Beide Stoffe wirken u.a. über den Transkriptionsfaktor NFkB. Andere Faktoren wie die Phosphatidylinositol-3-Kinase und cAMP dagegen scheinen keine Relevanz für die Expressionsinduktion der mRNA zu haben. TNFa spielt im Knochenstoffwechsel eine wichtige Rolle bei Osteoklastenaktivierung, Knochenresorption und bei der Entstehung von Osteoporose. AKAP-2 wird in Osteoblasten, aber auch in undifferenzierten monozytären Zellen, Vorläufern von Osteoklasten, exprimiert. AKAP-2 könnte also bei der interzellulären Kommunikation zwischen Osteoblasten und Osteoklasten von Bedeutung sein. Bisher wurden Vertreter der Familie der Proteinkinase A-Ankerproteine noch nicht in Knochengewebe nachgewiesen. Ihre Bedeutung für die Organfunktion ist vielfältig. Auf zellulärem Niveau kommt es durch Bindung der PKA in der Nähe der Adenylatzyklase und des hier entstehenden cAMP zu einer lokal erhöhten Wirkung von cAMP-vermittelten Signalen. Da die Expression der mRNA von AKAP-2 selbst unabhängig von cAMP ist, scheint es sich hier um eine Kreuzungsstelle verschiedener Signaltransduktionswege zu handeln, bei der von TNFa aktivierte zweite Botenstoffe bzw. Transkriptionsfaktoren (z.B. NFkB), die PKC und möglicherweise weitere, hier jedoch nicht weiter identifizierte Zytokine und Wachstumsfaktoren zur vermehrten Bereitstellung eines Ankerproteins der PKA führen. N2 - Here we describe for the first time identification of the complete sequence of the cDNA of the protein A kinase adaptor protein 2 (AKAP-2, 7,5kB). Exept an uncomplete database entry no experimental data exist to date for the cDNA, mRNA or for coded protein of this new human gene. By northern blot analyses we examined the regulation of the mRNA expression of AKAP-2 in the human foetal osteoblast cell-line hFOB and the expression in different tissues: In hFOB-cells the basal expression level of the mRNA which can be rapidliy and transiently induced is small. Maximal induction by TNFa and TPA is found after 5 hours, most by enhanced transcription. Both TNFa and TPA use NFkB dependent and independent signalling mechanisms. Phosphatidylinositol-3-kinase and cAMP are likely not to have any effect on the mRNA level. TNFa plays an important role in osteoclast activation, bone resorption and osteoporose development. The mRNA of AKAP2 is expressed in osteoblasts but also in undifferentiated monocytes, precursors of osteoclasts. AKAP-2 could be important for cell-cell-communication between osteoblasts and osteoclasts. This is the first identification of a member of the AKAP-familiy in bone. AKAPs have many roles in organ function. By collocation of PKA and adenylatcyclase the effect the produced cAMP can locally be augmented. As the expression of the mRNA of AKAP-2 seems to be independently of cAMP, it may be a cross-link between different signalling pathways: TNFa activated second messengers or transcription factors (i.e. NFkB), the PKC and other not yet identified cytokines lead to an augmented expression of a protein A kinase adaptor protein. KW - Proteinkinase A-Ankerprotein 2 KW - TNFa KW - TPA KW - Osteoblast KW - Regulation von mRNA KW - Signaltransduktion KW - protein A kinase adaptor protein 2 KW - TNFa KW - TPA KW - osteoblast KW - regulation of mRNA KW - signal transduction Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1274 ER - TY - THES A1 - Salentin, Miriam Thea T1 - Die Präzisionsbestimmung rechnergesteuert hergestellter Organmodelle am Schweineschädelmodell T1 - The determination of precision of computer-aided-manufactured anatomical models on a pigs skull model N2 - An der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der Julius-Maximilians-Universität Würzburg erfolgt seit 1987 die Entwicklung und der Einsatz von Verfahren des rechnergesteuerten Organmodellbaus in der Planung und Durchführung operativer Eingriffe. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung erfolgte die Bestimmung der statistisch belegbaren und reproduzierbaren anatomisch-metrischen Präzision von medizinischen Organmodellen am Schweineschädelmodell in Abhängigkeit von den CT-Parametern und dem Modellbauverfahren. An einem intakten Schweinekopf erfolgte die Spiral-Computertomographische Datenerfassung zur Herstellung eines Stereolithographiemodells und die Mehrschicht- Computertomographische Datenerfassung zur Herstellung eines Lasersintermodells. Der Schweinekopf wurde mazeriert und Vergleichsmessungen von 75 ausgewählten anatomischen Meßpunkten über 200 Meßstrecken an dem Schädel und den beiden Modellen durchgeführt. Dabei konnte bestätigt werden, daß die Dimensionsabweichung unabhängig von der Datenerfassungsart und des Modellbauverfahrens durchschnittlich unterhalb von ± 0,88 mm, bzw. 2,7 Prozent liegt (max. Gesamtabweichung: - 3,0 mm bis + 3,2 mm). Bei gleicher Präzision der Modelle ist die Mehrschicht-Spiral-CT der konventionellen Spiral-CT in der Datenakquisition für den Organmodellbau bei verkürzter Akquisitionszeit und verringerter Strahlenbelastung vorzuziehen. N2 - In the department of Cranio-Maxillo-Facial Surgery of the Julius-Maximilians-University of Würzburg computer manufactured skull models have been developed and been in clinical use since 1987. The purpose of this study is to determine the statistically proved and reproducible anatomical-metrical precision of anatomical three-dimensional models in dependence on computed-tomography-parameters and production methods. The object of examination is the skull of a pig. Based on a helical-volume-CT-scan of an intact entire head of a pig a stereolithography model of the skull was manufactured. Based on a multi-slice-CT-scan of the same head a selective laser sintered model of the skull was produced. 75 anatomical landmarks, comparable to anthropometrical landmarks, were determined and 200 different distances between these measuring points were measured on the macerated pigs skull and both 3D-models. The deviations of both models from the macerated skull amount to an average of +/- 0,88 mm, respectively 2,7 per cent. The maximal deviation is from -3,0 mm to +3,2 mm. These data are neither dependent on the kind of data acquisition nor on the above mentioned production methods. Since there is no difference concerning accuracy the multi-slice-CT-scans are to be prefered to data acquisition for 3D model manufacturing because of shorter CT-data acquisition time and lower x-ray exposition. KW - Stereolithographie KW - Selektive Laser-Sinterung KW - Präzision von Organmodellen KW - Operations-Planungsmodelle KW - Spiral-Computertomographie KW - stereolithographie KW - selecitve laser-sintering KW - precision of anatomical models KW - operation planning models KW - helical-volume-computed-tomography Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1262 ER - TY - THES A1 - Fröhlich, Birgit Susanne T1 - Wachse der Honigbiene Apis mellifera carnica Pollm. T1 - Waxes of the honeybee Apis mellifera carnica Pollm. N2 - Um einen Beitrag zum besseren Verständnis der Rolle der Bienenwachse in der Kommunikation der Honigbienen leisten zu können, wurden Wabenwachse unterschiedlichen Alters und Kutikulawachse unterschiedlicher Kasten,Geschlechter und Berufsgruppen mit Hilfe von Gaschromatographie, Massenspektroskopie und FTIR-Spektroskopie untersucht. Die chemischen Analysen zeigten mittels Diskriminantenfunktionsanalysen hochsignifikante Unterschiede in den aliphatischen Kohlenwasserstoffen zwischen Wabenwachsen unterschiedlichen Alters und Kutikulawachsen unterschiedlicher Kasten und Geschlechter. Erstmals konnte für ein komplexes Substanzgemisch (Bienenwachs) eine lineare Abhängigkeit zwischen dem Schmelzverhalten und der chemischen Zusammensetzung der Wachse nachgewiesen werden.Mit Hilfe von Verhaltensversuchen wurde der Frage nachgegangen, ob die chemischen Unterschiede für die Bienen überhaupt relevant sind. Mit Hilfe der differentielle Konditionierung des Rüsselreflexes wurde getestet, inwieweit Bienen die verschiedenen Wachse unterscheiden können. Eine Diskriminierung der Wachse aufgrund der aliphatischen Kohlenwasserstoffe war den Honigbienen nicht möglich. Dies ergab einen neuen und interessanten Einblick in die Kommunikation der Honigbienen N2 - Quantitative chemical analyses of comb waxes with different age and cuticular waxes of different castes and sexes with gas chromatography, mass spectrometry and FTIR-spectrometry showed significant chemical differences in the aliphatic hydrocarbons and differences in the physical properties of the waxes. We used the proboscis extension reflex to test the ability of the bees to discriminate between these waxes. Differentially conditioned bees significantly discriminated between all waxes. They do not use the aliphatic hydrocarbons, but the esters and more polar components of the waxes. KW - Biene KW - Bienenwachs KW - Zusammensetzung KW - Honigbiene KW - Wachs KW - Gaschromatographie-Massenspektrometrie KW - FTIR-Spektroskopie KW - Rüsselreflex KW - honeybee KW - wax KW - gaschromatography-mass spectrometry KW - FTIR-spectroscopy KW - proboscis extension reflex Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1253 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Uwe T1 - Elektroporation von Säugerzellen T1 - Electroporation of mammalian cells N2 - Ziel der Arbeit war es, die wissenschaftlichen und technischen Voraussetzungen zu schaffen, um eine effiziente Elektroporation von großen aber auch kleinen Zellzahlen zu erreichen. Ein großer Teil der Arbeit diente der Entwicklung eines neuen Elektroporationsgerätes, des Multiporators. Die synergetischen Effekte dieser Technik tragen dazu bei, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Elektrotransfektion von Zellen erzielt werden. Damit konnte zum ersten Mal der Gentransfer durch künstliche Säugerzell-Chromosomen (MACs) nachgewiesen werden. Eine weitere Anwendung der Elektroporation liegt in der Transfektion von primären Zellen. Dabei ist der entscheidende Punkt für eine hohe Transfektionseffizienz der Zellzyklus. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das als Basis für ein neues Elektroporationssystem benutzt werden kann. N2 - The aim of this work was the establishment of the scientific and technical supposition for an efficient electroporation of a large and small number of cells. A part of this work was used for the development of a new electroporation instrument, the Multiporator. The synergy of the instrument and the components enable the electrotransfection of eukaryotic cells with high efficiency. With this technique the gene transfer by mammalian artificial chromosomes (MACs) was demonstrated for the first time. Another application is the transfection of primary cells. The main point for the high yields is the cell cycle. Further, a concept for a new electroporation system was evolved. KW - Säugetiere KW - Zelle KW - Elektroporation KW - Elektroporation KW - Säugerzellen KW - primäre Zellen KW - künstliche Chromosomen KW - Dielektrophorese KW - Electroporation KW - mammalian cells KW - primary cells KW - artificial chromosomes KW - dielectrophoresis Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1241 ER - TY - THES A1 - Forstmeier, Wolfgang T1 - Individual reproductive strategies in the dusky warbler (Phylloscopus fuscatus) T1 - Individuelle reproduktive Strategien beim Dunkellaubsänger (Phylloscopus fuscatus) N2 - This study investigates mechanisms and consequences of sexual selection in a polygynous population of dusky warblers Phylloscopus fuscatus, breeding near Magadan in the Russian Far East. In particular, the study focuses on individual variation in the reproductive behaviours of both females and males. The mating system of this population is characterised by facultative polygyny (17 per cent of the males mated with more than one female), and by an outstandingly high rate of extra-pair paternity (45 per cent of the offspring was not sired by the social partner of the female). The occurrence of polygyny is best explained by the ‘polygyny-threshold model’ (PTM). A novel finding of this study is that female mating decisions follow a conditional strategy. First-year females that have no prior breeding experience prefer monogamy over territory quality, while older females more often mate polygynously. I argue that the costs of receiving no male help may be higher for inexperienced females, while the benefits of having a free choice between territories may be higher for individuals that know which territories had the highest breeding success in previous years. Furthermore, I find support for the existence of two female mating strategies. The ‘emancipated’ female which is not dependent on male help, is free to choose the best territory and the best copulation partners. The ‘help-dependent’ female, in contrast, is bound to find a partner who is willing to assist her with brood care, thus she will have to accept territories and genetic fathers of lesser quality. The most unexpected finding on female mating behaviours is that this dichotomy between emancipated and help-dependent females is accompanied by morphological specialisation, which indicates that there is genetic variation underlying these female mating strategies. Male mating behaviours are characterised by competition for ownership of the best territories and by advertisement of male quality to females, as these are the factors which largely determine male reproductive success. Male success in obtaining copulations depended on the quality of their song, a fact that explains why males spend most of the daytime singing during the period when females are fertile. Individuals that were able to maintain a relatively high sound amplitude during rapid frequency modulations were consistently preferred by females as copulation partners. Studies of physiological limitations on sound production suggest that such subtle differences in male singing performance can provide an honest reflection of male quality. The present study is the first to indicate that females may judge the quality of a male’s song by his performance in sound production. Quality of song was also related to winter survival, which suggests that females can enhance the viability of their offspring by seeking extra-pair fertilisations from good singers (good-genes hypothesis). In general, the present study demonstrates that a complete understanding of avian mating systems is not possible without a detailed analysis of alternative behavioural strategies and of how individuals adjust their reproductive tactics according to their individual needs and abilities. N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen und Auswirkungen sexueller Selektion, untersucht an einer polygynen Population des Dunkellaubsängers Phylloscopus fuscatus, in der Nähe von Magadan im russischen Fernen Osten. Das Hauptanliegen ist die Untersuchung individueller Unterschiede in reproduktiven Strategien, sowohl bei Weibchen als auch bei Männchen. Das Paarungssystem der untersuchten Population ist durch das Vorkommen sozialer Polygynie gekennzeichnet (17 Prozent aller Männchen waren mit mehr als einem Weibchen verpaart), sowie durch eine ungewöhnlich hohe Rate außerpaarlicher Vaterschaften (45 Prozent des Nachwuchses stammte nicht vom sozialen Partner des Weibchens ab). Das Auftreten sozialer Polygynie lässt sich am besten durch das „Polygynie-Schwellen-Modell“ (PSM) erklären. Ein neuartiger Befund dieser Untersuchung ist, dass die Partnerwahl einer konditionellen Strategie unterliegt: Unerfahrene, einjährige Weibchen scheinen die Monogamie der Wahlfreiheit eines Reviers vorzuziehen, während ältere Weibchen öfter in polygynen Beziehungen zu finden sind. Man könnte vermuten, dass die Kosten fehlender Hilfe für unerfahrene Weibchen besonders groß sind, während die Vorteile einer freien Auswahl an Territorien nur von solchen Weibchen optimal genützt werden können, die den zu erwartenden Bruterfolg für die einzelnen Territorien aus den Erfahrungen der letzten Jahre abschätzen können. Desweiteren finde ich Hinweise auf die Existenz von zwei alternativen weiblichen Paarungstaktiken: „Emanzipierte“ Weibchen haben eine freie Auswahl an Brutterritorien und Kopulationspartnern. „Abhängige“ Weibchen müssen einen Paarungspartner finden, der bereit ist, bei der Jungenaufzucht zu helfen, weshalb sie sich oft mit weniger guten Revieren und Geschlechtspartnern zufrieden geben müssen. Der überraschendste Befund hierzu ist, dass die Aufspaltung in „emanzipierte“ und „abhängige“ Weibchen mit einer morphologischen Spezialisierung des Schnabels einhergeht. Dies zeigt an, dass wohl auch erbliche Komponenten zu diesem Verhaltensunterschied beitragen. Männliches Paarungsverhalten ist gekennzeichnet von Konkurrenz um den Besitz der besten Brutreviere und vom Anpreisen eigener Qualitäten gegenüber den Weibchen, da diese Faktoren den Reproduktionserfolg der Männchen bestimmen. Welchen Erfolg Männchen beim Erlangen von Kopulationen hatten, hing in erster Linie von der Qualität ihres Gesangs ab. Ein Befund, der erklärt, warum Männchen, in der Zeit, wenn Weibchen fruchtbar sind, den Großteil des Tages mit Singen verbringen. Weibchen bevorzugten solche Männchen als Kopulationspartner, die in der Lage waren, Töne mit steilen Frequenzmodulationen mit konstant hoher Lautstärke zu singen. Untersuchungen zu physiologischen Limitierungen der Tonerzeugung legen nahe, dass feine Unterschiede in der Qualität der Darbietung durchaus ein ehrliches Signal für die Qualität des Männchens sein können. Die vorliegende Studie ist die erste, die nahe legt, dass Weibchen die Qualität männlichen Gesangs an feinen Unterschieden in der Tonproduktion festmachen könnten. Diese Beobachtung erinnert daran, dass auch wir die Fähigkeiten eines menschlichen Sängers an (im weiteren Sinne) ähnlichen Kriterien messen. Interessanterweise hatten, beim Dunkellaubsänger, gute Sänger bessere Chancen, den Winter zu überleben. Dies weist darauf hin, dass Weibchen die Lebensfähigkeit ihres Nachwuchses dadurch erhöhen, dass sie außerpaarliche Kopulationen mit guten Sängern suchen („Gute-Gene-Hypothese“). Im allgemeinen zeigt die vorliegende Arbeit, dass für ein umfassendes Verständnis eines Paarungssystems eine detaillierte Analyse alternativer Verhaltensstrategien und individueller reproduktiver Taktiken notwendig ist. KW - Laubsänger KW - Polygynie KW - Magadan KW - Dunkler Laubsänger KW - Polygynie KW - außerpaarliche Vaterschaft KW - Paarungssystem KW - Vögel KW - polygyny KW - extra-pair paternity KW - mating system KW - birds Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1232 ER - TY - THES A1 - Foley, Paul Bernard T1 - Beans, roots and leaves T1 - Bohnen, Wurzeln und Blätter N2 - The author presents the first detailed review of the pharmacological therapy of parkinsonism from ancient times until the near present (1980). It is not clear whether parkinsonism as it is now defined – a progressive neurodegenerative disorder of the basal ganglia characterized by sharply reduced striatal dopamine levels, particularly in the striatum – has always affected a significant minority of aged persons, but suggestive evidence to this effect in the older literature is reviewed. The major discussion commences, however, with the administration of various plant alkaloids to parkinsonian patients in the second half of the 19th century. Antiparkinsonian therapy since this time may be divided into a number of phases: 1. The employment of alkaloids derived from solanaceous plants: initially hyoscyamine, then hyoscine/scopolamine and atropine. The discovery and characterization of these alkaloids, and the gradual recognition that other pharmacologically useful solanaceous alkaloids (such as duboisine) were identical with one or other of these three compounds, is discussed. 2. With the outbreak of encephalitis lethargica following the First World War, parkinsonian patient numbers increased dramatically, leading to a multiplicity of new directions, including the use of another solanaceous plant, stramonium, of extremely high atropine doses, and of harmala alkaloids. 3. The so-called “Bulgarian treatment” was popularized in western Europe in the mid-1930s. It was also a belladonna alkaloid-based therapy, but associated with greater efficacy and fewer side effects. This approach, whether as actual plant extracts or as defined combinations of belladonna alkaloids, remained internationally dominant until the end of the 1940s. 4. Synthetic antiparkinsonian agents were examined following the Second World War, with the aim of overcoming the deficiencies of belladonna alkaloid therapy. These agents fell into two major classes: synthetic anticholinergic (= antimuscarinic) agents, such as benzhexol, and antihistaminergic drugs, including diphenhydramine. These agents were regarded as more effective than plant-based remedies, but certainly not as cures for the disease. 5. A complete change in direction was heralded by the discovery in 1960 of the striatal dopamine deficit in parkinsonism. This led to the introduction of L-DOPA therapy for parkinsonism, the first approach directed against an identified physiological abnormality in the disorder. 6. Subsequent developments have thus far concentrated on refinement or supplementation of the L-DOPA effect. Recent attempts to develop neuroprotective or -restorative approaches are also briefly discussed. The thesis also discusses the mechanisms by which the various types of antiparkinsonian agent achieved their effects, and also the problems confronting workers at various periods in the design and assessment of novel agents. The impact of attitudes regarding the etiology and nature of parkinsonism, particularly with regard to symptomatology, is also considered. Finally, the history of antiparkinsonian therapy is discussed in context of the general development of both clinical neurology and fundamental anatomical, physiological and biochemical research. In particular, the deepening understanding of the neurochemical basis of central nervous system function is emphasized, for which reason the history of dopamine research is discussed in some detail. This history of antiparkinsonian therapy also illustrates the fact that the nature of experimental clinical pharmacology has markedly changed throughout this period: No longer the preserve of individual physicians, it is now based firmly on fundamental laboratory research, the clinical relevance of which is not always immediately apparent, and which is only later examined in (large scale) clinical trials. It is concluded that antiparkinsonian therapy was never irrational or without basis, but has always been necessarily rooted in current knowledge regarding neural and muscular function. The achievements of L-DOPA therapy, the first successful pharmacological treatment for a neurodegenerative disorder, derived from the fruitful union of the skills and contributions of different types by laboratory scientists, pharmacologists and clinicians. N2 - Der Autor stellt die erste detaillierte Zusammenfassung der Entwicklung der pharmakologischen Therapie des Parkinsonismus vom Altertum bis in die jüngere Vergangenheit (1980) dar. Es ist nicht klar, ob der Parkinsonismus, wie er jetzt definiert wird – eine progressive neurodegenerative Störung der Basalganglien, die durch die zum scharf verringerten Dopamininhalt des Corpus striatum führende Degeneration der nigrostriatalen Bahn gekennzeichnet wird – zu allen Zeiten eine bedeutende Minderheit älterer Personen heimgesucht hat, verlockende Hinweise darauf findet man aber in der älteren Literatur. Die Hauptdiskussion beginnt jedoch mit der Anwendung verschiedener Pflanzenalkaloide bei Parkinson-Patienten in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts. Die Geschichte der Parkinson-Therapie seit dieser Zeit läßt sich in eine Serie von Phasen gliedern: 1. Die Anwendung von aus den Solanazeen isolierten Alkaloiden: zuerst Hyoscyamin, später Hyoscin/Skopolamin und Atropin. Die Entdeckung und die Charakterisierung dieser Alkaloide und die allmähliche Feststellung, daß andere pharmakologisch nützliche Solanazeen-Alkaloide (z.B. Duboisin) mit einem oder anderem dieser schon bekannten Mittel identisch waren, werden diskutiert. 2. Mit dem Ausbruch der Encephalitis lethargica nach dem Ersten Weltkrieg stieg die Anzahl von Parkinson-Patienten dramatisch an, was zu einer Vielfältigkeit neuer therapeutischer Richtungen führte: Der Einsatz des auch zu den Solanazeen gehörenden Stramonium, die Verabreichung von extrem hohen Atropindosen, und die Benutzung von Harmala-Alkaloiden waren insbesondere hochgeschätzt. 3. Die sogenannte “Bulgarische Kur” verbreitete sich schnell in Westeuropa in der Mitte der dreißiger Jahre. Es handelte sich dabei ebenfalls um eine auf Tollkirsche-Alkaloiden basierte Therapie, der jedoch höhere Wirksamkeit und wenige Nebenwirkungen zugemutet wurde. Diese Methode, vermittels der Verabreichung tatsächlicher Tollkirschenextrakte bzw. definierter Kombinationen von Belladonna-Alkaloiden, beherrschte die Parkinson-Therapie bis zum Ende der vierziger Jahre. 4. Nach dem Zweiten Weltkrieg wurden synthetische Parkinson-Mittel überprüft, in der Hoffnung, die Mängel der bisherigen anticholinergen Therapien überwinden zu können. Diese Mittel teilten sich in zwei Hauptkategorien ein: synthetische anticholinerge (= antimuskarine; z.B. Benzhexol) und antihistaminerge Mittel (z.B., Diphenhydramin). Diese Arzneimittel wurden als wirkungsvoller als pflanzliche Therapien angesehen, jedoch sicherlich nicht als Heilmittel für die Krankheit. 4. Eine gründliche Richtungsänderung der Parkinson-Therapie kündigte sich mit der Entdeckung (1960) des striatalen Dopamindefizits im Parkinsonismus an. Diese führte zur Einführung der L-DOPA-Therapie, der ersten Parkinson-Therapie, die gegen eine genau definierte physiologische Abnormität gerichtet war. 5. Die darauf folgenden Entwicklungen haben sich bis heute auf Verfeinerung bzw. Ergänzung des L-DOPA-Effektes konzentriert. Neuere Ansätze, neuroprotektive bzw. -restorative Therapien zu entwickeln, werden kurz behandelt. Die Arbeit diskutiert auch die Mechanismen, die der Wirksamkeit der verschiedenen Parkinson-Mittelarten zugrunde liegen, und auch die Probleme, die Forscher bei der Entwicklung und Bewertung neuartiger Mittel konfrontiert haben. Diese Diskussion zieht auch in Betracht die Auswirkung der Haltung des jeweiligen Forschers betreffend der Ätiologie und Natur des Parkinsonismus auf die Beurteilung neuer therapeutischer Möglichkeiten. Schließlich wird die Geschichte der Parkinson-Therapie im Kontext der allgemeinen Entwicklung der klinischen Neurologie als auch der grundlegenden anatomischen, physiologischen und biochemischen Forschung während dieser Periode behandelt. Insbesondere wird das wachsende Verständnis der neurochemischen Grundlagen der Funktion des Zentralnervensystems hervorgehoben, indem die Geschichte der Dopaminforschung ausführlich behandelt wird. Die Geschichte der Parkinson-Therapie weist auch darauf hin, daß sich die Natur der experimentellen Pharmakologie während dieser Periode grundsätzlich geändert hat. Sie liegt nämlich nicht mehr im Zuständigkeitsbereich des einzelnen Arztes, sondern wird im Gegenteil auf grundlegender Laborforschung aufgebaut, deren klinische Bedeutung nicht immer sofort deutlich ist. Erst später werden die Ergebnisse dieser Grundlagenforschung in großangelegten klinischen Versuchen bei Patienten überprüft. Es wird gefolgert, daß die Parkinson-Therapie zu keiner Zeit als ohne vernünftige Grundlage bzw. irrational betrachtet werden darf. Sie ist jedoch immer dem aktuellen Wissensstand betreffend neuraler und muskulöser Funktion entsprechend geregelt worden. Der Erfolg der L-DOPA-Therapie, der ersten langfristig wirksamen pharmakologischen Behandlung einer neurodegenerativen Krankheit, ist das Ergebnis der ertragreichen Vereinigung der Fähigkeiten und verschiedenartigen Beiträge von Grundlagenforschern, Pharmakologen und Klinikern. KW - Parkinson-Krankheit KW - Pharmakotherapie KW - Geschichte KW - Medizingeschichte KW - Neurologie KW - Parkinsonismus KW - Solanazeen KW - Pharmazie KW - Neurochemie KW - History of medicine KW - neurology KW - parkinsonism KW - pharmacy KW - neurochemistry Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181975 ER - TY - THES A1 - Föger, Niko T1 - Costimulatory function of CD44 T1 - Die kostimulatorische Funktion von CD44 N2 - T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains. N2 - Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen zwei Signale erfordert, die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TZR) an den Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex und die Bindung sogenannter kostimulatorischer Moleküle an ihren Liganden. Über diese Rezeptor-Liganden-Interaktionen wird eine Kettenreaktion von Signalen ausgelöst, die die Aktivierung einer ganzen Reihe von Genen bewirken. Die Signale die über die Liganden Bindung des TZR in Gang gesetzt werden, sind weitgehend bekannt. Hingegen ist unser Wissen über das Funktionsprinzip kostimulatorischer Moleküle äußerst lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt, dass und auf welche Weise CD44, eines dieser kostimulatorischen Moleküle, maßgeblich zur Verstärkung der über den TZR transduzierten Signale beiträgt. Ausgangspunkt der vorgelegten Studie war der Befund, dass eine Blockade von CD44, z.B. mittels eines kompetitiven löslichen CD44 Moleküls, die Antigen-induzierte Aktivierung einer T-Zelllinie blockieren kann. Zur Klärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde CD44 mittels immobilisierter Antikörper quervernetzt. Bei gleichzeitiger, suboptimaler Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzierte die Quervernetzung von CD44 zum einen die Proliferation reifer T-Zellen, zum anderen den apoptotischen Zelltod von Thymozyten beziehungsweise einer T-Helferzelllinie. Erwartungsgemäß war die CD44-induzierte Proliferation mit der Expression sogenannter Aktivierungsmarker wie CD25 und CD69 und einer erhöhten Zytokinproduktion verbunden. Dementsprechend wurde bei CD44-induzierter Apoptose eine deutlich gesteigerte Expression des CD95 Moleküls und seines Liganden beobachtet. Die kostimulatorische Aktivität von CD44 war mit einer gesteigerten Tyrosinphosphorylierung und einer Hochregulation der ras/ERK und JNK Signalkaskaden verbunden. Da von allen beobachteten Veränderungen bekannt ist, dass sie auch über die Besetzung des TZR mit einem geeigneten Stimulus ausgelöst werden können, war es naheliegend anzunehmen, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine Verstärkung der TZR-vermittelten Signale zurückführen läßt. Der Befund einer gesteigerten Phosphorylierung der TZR-z-Kette und der ZAP-70 Kinase, über die die Aktivierung von T-Zellen eingeleitet wird, unterstützt nachhaltig diese Hypothese. Hinzu kommen zwei weitere Befunde: 1. Die Quervernetzung von CD44 führt nur unter der Voraussetzung einer räumlichen Annäherung von CD44 und dem TZR zu einer Unterstützung der T-Zellaktivierung. Diese findet in sogenannten "Rafts" statt; 2. Die Quervernetzung von CD44 führt zu Adhäsion und Zellspreitzung, bedingt durch ein Rearrangement des Zytoskeletts an dem die GTPase rac1 und die src-Kinasen fyn und lck beteiligt sind. Diese beiden Kinasen sind konstitutiv mit CD44 assoziiert. Bei Quervernetzung des Moleküls und Reorganisation des Zytoskeletts wird eine deutliche Anreicherung von fyn und lck in den Rafts, also in direkter Nachbarschaft zum TZR, beobachtet. Diese Daten unterstützen nachhaltig meine Arbeitshypothese, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine kooperative Aktivität mit dem TZR zurückführen läßt. Es ist wahrscheinlich, dass durch Rekrutierung der Kinasen lck und fyn der Schwellenwert für die Initiierung von Signalen über den TZR signifikant erniedrigt wird. Die Rekrutierung dieser Kinasen wird durch eine Reorganisation des Zytoskeletts, die mit der Einbringung dieser Kinasen in den Bereich der Rafts einhergeht, ermöglicht. Inwieweit die erhobenen Befunde zur kostimulatorischen Aktivität des Adhäsionsmoleküls CD44 im Sinne eines Verstärkungs-mechanismus eingeleitet durch räumliche Annäherung generelle Gültigkeit haben, kann noch nicht abschließend beantwortet werden. Die Mehrheit der in jüngster Zeit erhobenen Befunde zur Klärung des Funktionsprinzips kostimulatorischer Moleküle bestätigt jedoch das Prinzip nachbarschaftlicher Kooperation. KW - Antigen CD44 KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - T-Lymphozyt KW - Aktivierung KW - T-Lymphozyten KW - Signal Transduktion KW - Kostimulatorisches Molekül KW - T-Zell-Rezeptor KW - Lipid Mikrodomänen KW - Aktin-Zytoskelett KW - T lymphocytes KW - signal transduction KW - costimulatory molecule KW - T cell receptor KW - lipid microdomains KW - actin cytoskeleton Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1186 ER - TY - THES A1 - Flügel, Manfred T1 - Molekularbiologische Studien zur Pathogenität und Ökologie von Legionella pneumophila T1 - Molecularbiological studies on the pathogenicity and ecology of Legionella pneumophila N2 - Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein Umweltkeim mit Verbreitung in aquatischen Habitaten. Die Keime sind in der Lage, sich intrazellulär in eukaryontischen Zellen, wie Makrophagen, Monozyten und Protozoen zu vermehren. Die erfolgreiche Besiedlung ökologischer Nischen, aber auch das Virulenzpotential des Keimes können dabei von Umweltfaktoren abhängen. Die Erforschung ökologischer Zusammenhänge kann daher für das Verständnis der bakteriellen Virulenz von großer Bedeutung sein. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die in der späten stationären Phase des Bakterienwachstums von L. pneumophila zu beobachtende intensive Pigmentierung des Kulturmediums. Für diesen Phänotyp ist das Legiolysin (Lly) verantwortlich. Es ist eines der wenigen bekannten Genprodukte von L. pneumophila, die einen Einfluß auf das Überleben des Keimes in der Umwelt haben. Legiolysin kann daher als Fitnessfaktor bezeichnet werden. Um die ökologischen Zusammenhänge der Pigmentgenerierung näher zu untersuchen, wurde das lly-positive Plasmid pEWL 1 subkloniert und sequenziert. Neben lly konnten in diesem Genabschnitt durch Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen sechs weitere Leseraster detektiert werden. Die drei unmittelbar benachbarten Gene von lly kodieren dabei für Proteine mit Funktionalität in Bezug zur lly-Determinante, während die drei upstream von lly liegenden Leseraster Homologien zu Proteinen aufweisen, die an Transportprozessen beteiligt sind. Die Länge des RNA-Transkripts von lly konnte im Northern-Blot mit ungefähr 1,8 kb bestimmt werden und läßt damit auf die gemeinsame Transkription des lly-Gens mit dem unmittelbar upstream liegenden Leseraster schließen. Durch Sequenzanalysen konnte aufgezeigt werden, daß das für diesen Phänotyp verantwortliche Legiolysin-Gen für eine p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) kodiert. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von p-Hydroxyphenylpyruvat zu Homogentisat (HGA). In Zusammenarbeit mit Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) konnte im Vergleich zu lly-negativen L. pneumophila- und rekombinanten E. coli-Stämmen in den Kulturüberständen von lly-positiven Stämmen auf Basis einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) HGA nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, daß das Legiolysin-Gen für ein Protein mit HPPD- Aktivität kodiert, und in die Degradation der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin involviert ist. Des weiteren wurden chromosomale Integrationsmutationen der aus L. pneumophila stammenden Gene lly und mip ("macrophage infectivity potentiator") in E. coli K-12 Stämmen erstellt. Diese wurden nachfolgend in ökologisch ausgerichteten Langzeitstudien eingesetzt. Die chromosomale Integration von lly erfolgte als ortsspezifische Rekombination in die l att - site von E. coli WM 2269. Die Integration von mip erfolgte in die fim-Region des E. coli K-12-Stammes AAEC 160. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befaßt sich mit ökologischen Studien zur Persistenz von L. pneumophila in der Umwelt. Durch die Bestrahlung mit Licht über einen Verlauf von sieben Tagen konnte gezeigt werden, daß die Exprimierung von lly zu einer Persistenz unter Lichtstreß führt. Dieser Lichtschutz könnte in der Umwelt, aber auch bei der Sanierung von Wasserleitungssystemen mittels UV-Licht Relevanz aufweisen. Die Assoziation von L. pneumophila JR32 und JR32-1 (lly-negativ) mit dem Cyanobakterium Fischerella wurde in Mikrokosmen über einen Verlauf von sieben Tagen beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, daß Legionella in Assoziation mit Fischerella bzw. in dessen Überstand zu persistieren vermag, während dies den Bakterien in frischem Fischerella-Medium nicht möglich war. Wie die Coinkubation der Fischerellen mit L. pneumophila JR32-1 zeigte, spielt die Expression von lly dabei keine Rolle. Ein Wachstum der Bakterienkulturen konnte weder im Fischerella-Überstand, noch in Fischerella-Medium beobachtet werden. Durch Rasterelektronenmikroskopie konnte der adhäsive Charakter der Assoziation von L. pneumophila zu Fischerella dokumentiert werden. Durch Persistenzstudien von L. pneumophila und E. coli in Boden wurde die Überlebensfähigkeit der Mikroorganismen in suboptimaler Umgebung getestet. Für Legionella ist eine rapide Abnahme der Zellzahl schon nach kurzer Zeit zu detektieren. Nach sechs Tagen konnten keine Zellen mehr kultiviert werden. Die Defizienz der Pathogenitäts- und Umweltfaktoren Mip, Fla (Flagellin) und Lly hatte dabei keinen Einfluß auf die Persistenz der Bakterien im Boden. Zudem sind die zuvor generierten rekombinanten E. coli-Klone AAEC 160-1 und WM 2269-1 mit genomischer mip- bzw. lly-Integration eingesetzt worden. Innerhalb von vier Wochen konnte für diese Stämme eine kontinuierliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet werden. Somit erwies sich keiner der Organismen als erfolgreicher Besiedler der Bodenprobe. Die Studien zum Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila und E. coli erfolgten in autoklaviertem Leitungswasser bzw. PBS und zwei unterschiedlich behandelten Varianten von Mainwasser. Neben sterilfiltriertem Mainwasser fand die Inokulierung der Organismen auch in einem Ansatz mit autoklaviertem Mainwasser statt. Es konnte gezeigt werden, daß L. pneumophila in Leitungswasser und Mainwasser außerordentlich gut zu persistieren vermochte. Zudem konnte dokumentiert werden, daß auch E. coli DH5a in ein lebensfähiges, aber nicht mehr kultivierbares Ruhestadium (viable but nonculturable, VBNC) eintreten kann. Parallel zur Ermittlung der CFU-Werte wurden während des Verlaufs der Experimente die Lebendzellzahlen durch Fluoreszenzfärbungen bestimmt. Der Übergang von L. pneumophila in das VBNC-Ruhestadium wurde zudem durch in situ - Hybridisierungen mit fluoreszenzmarkierten 16 S rRNA-Oligonukleotidsonden dokumentiert. Im Naturhaushalt spielt dieser Übergang zu VBNC-Stadien bei Umweltbakterien zur Überwindung ungünstiger Phasen eine große Rolle. Schließlich erfolgten Experimente zur Reaktivierung der VBNC-Ruhestadien. Diese Reaktivierung ist abhängig von speziesspezifischen Triggern und kann bei L. pneumophila durch Coinkubation mit Acanthamoeba castellanii erfolgen. N2 - Legionella pneumophila, the causative agent of the Legionnaires' disease, is an environmental strain with a widespread distribution in aquatic habitats. Legionella are able to replicate intracellularly in eucaryotic cells, such as macrophages, monocytes and protozoa. The sucsessful colonization of ecological niches, but also the virulence potential of Legionella depends on environmental factors. Therefore the investigation of ecological context is expected to provide an understanding of bacterial virulence. The starting-point of this dissertation is the intensive pigmentation of the culture medium of L. pneumophila, witch could be observed in the late stationary phase of bacterial growth. The Legiolysin proteine (Lly) is responsible for this phenotype. This gene product of L. pneumophila is known to show an influence on the survival in the environment, which is why Legiolysin has been termed a fitness factor. In order to investigate the ecological connections of the pigmentation, the lly-positive plasmid pEWL 1 was subcloned and sequenced. In this genetic section six further open reading frames (ORF) could be detected besides lly by sequence comparison of the derived amino acid sequences. The three directly neighbouring genes of lly code for proteins which have functionality with regard to the lly-determinant. The three reading frames upstream of lly show homologies to proteins, which are involved in transport processes. The RNA transcript of lly could be determined by Northern blot with a lenght of about 1,8 kb. Therefore transcription of the lly gene together with the upstream ORF is suggested. It could be shown by sequence analysis, that the Legiolysine gene responsible for this phenotype, is coding for a p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD). This enzyme catalyzes the reaction of p-hydroxyphenylpyruvate to homogentisate (HGA). In collaboration with Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) the existence of HGA was demonstrated in culture supernatants of lly-positive strains on the basis of high performance liquid chromatography (HPLC). It could be shown, that the legiolysin gene is coding for a protein with a HPPD activity, and, therefore, is involved in the degradation of the aromatic amino acids Phenylalanine and Tyrosine. Additionally chromosomal integration mutants of the L. pneumophila genes lly and mip ("macrophage infectivity potentiator") were created in E. coli K-12 strains. These mutants were subsequently used in ecological long-time studies. The chromosomal integration of lly took place as a locus-specific recombination in the l att - site of E. coli WM 2269. The integration of mip happened in the fim-region of the E. coli strain AAEC 160. The second part of the present dissertation is concerned with ecological studies to the persistence of L. pneumophila in the environment. Accordingly, it could be shown, that the expression of lly leds to persistence to light-stress. This light protection could be relevant in the environment, but also during the sanitation of water pipes by UV-light. The association of L. pneumophila JR32 and JR32-1 (lly-negative) with the cyanobacterium Fischerella was observed in microcosms during a course of seven days. Legionella are able to persist in association with Fischerella, and in the Fischerella culture supernatant, respectively. Survival of the bacteria was not possible in fresh Fischerella medium. However, the expression of lly shows no difference, as could be shown by the coincubation of L. pneumophila with Fischerella. The growth of bacterial cultures cold neither be detected in supernatants of Fischerella, nor in fresh Fischerella medium. The adhesive character of the association of L. pneumophila with Fischerella could be documented by SEM (scanning electron microscopy). The survival of Legionella in suboptimal environment was tested by studying the persistence of L. pneumophila and E. coli in soil. A rapid decline of CFU (colony forming unit) for Legionella could be detected within a short time, as cells could not be cultivated any more after six days. The deficiency of the pathogenetic and enviromental factors Mip, Fla (Flagellin) and Lly had no influence on the persistence of the bacteria in the soil. Additionally the recombinant E. coli clones AAEC 160-1 and WM 2269-1 with the genomic mip and lly integrations, were used in this exreriments. During a course of four weeks, a continuous reduction of CFU could be observed for these strains. Therefore none of these organisms proved successful in colonization of soil samples. The studies regarding the loss of culturability of L. pneumophila and E. coli were made in autoclaved potable water and PBS (phosphate buffered saline), respectively, and in two variants of Main river water, one of which was autoclavedwhile the other one was sterilized by filtration. It could be shown, that L. pneumophila are able to persist well in potable water and in the river water. Additionally, not only L. pneumophila, but also E. coli DH5a entered a viable but nonculturable state (VBNC). During the course of these experiments, the numbers of live cells were determined by fluorescence dyes Moreover, the transition of L. pneumophila into the VBNC state was documented by in situ hybridization technique with fluorescence marked 16 S rRNA oligonucleotide probes (FISH). This transition into the VBNC state plays an important role to overcome unfavourable phases in natural environments. Finally experiments were made to reactivate the VBNC states. This resuscitation is dependent on species specific triggers and could be achieved by coincubation of L. pneumophila with the amoeba Acanthamoeba castellanii. KW - Legionella pneumophila KW - Pathogenität KW - Ökologie KW - Molekularbiologie KW - Legionella pneumophila KW - Legiolysin KW - p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase KW - Pigmentierung KW - Lichtschutz KW - Fischerella sp. KW - Legionella pneumophila KW - Legiolysin KW - p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase KW - pigmentation KW - light protection KW - Fischerella sp. Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1178 ER - TY - THES A1 - Fendert, Thomas T1 - Charakterisierung der enzymatischen Abwehrreaktion in Schwämmen der Gattung Aplysina und Isolierung von Bromotyrosinalkaloiden aus Aplysina insularis T1 - Characterization of the enzymatic defense mecahnism in sponges of the genus Aplysina and isolation of bromotyrosine alkaloids from Aplysina insularis N2 - Marine Schwämme der Gattung Aplysina besitzen Bromotyrosinealkaloide als typische Sekundärmetabolite. Diese Alkaloide werden in einer enzymatischen Abwehrreaktion zu biologisch aktiven Produkten abgebaut. In der vorliegenden Arbeit ist die Isolierung von 14 Schwamminhaltstsoffen aus dem Schwamm Aplysina insularis beschrieben. 14-oxo-Aerophobin-2 konnte als neues Bromoisoxazolinalkaloid beschrieben werden. Anhand des Schwammes Aplysina cauliformis wurde die Charakterisierung der enzymatischen Abwehrreaktion in Schwämmen der Gattung Aplysina vorgenommnen, die von zwei aufeinanderfolgenden Enzymen durchgeführt wird. Hierbei konnte erstmals eine Nitrilhydratase aus dem marinen Habitat beschrieben werden, die in der beschriebenen Abwehrreaktion als zweites Enzym beteiligt ist. N2 - Marine sponges of the genus Aplysina posses bromotyrosine alkaloids as characteristic secondary metabolites. These alkaloids serve as substrates of a chemical defense mechanism in Aplysina sponges. In this dissertation the isolation of 14 constituents of the sponge Aplysina insularis is described. The bromoisoxazoline alkaloid 14-oxo-aerophobin-2 could be described as a new compound. The sponge Aplysina cauliformis was choosen for the characterization of the enzymatic defense mechanism in sponges of the genus Aplysina. In this two step mechanism a nitrilhydratase could be described for the first time. It is also the first time a nitrilhydratase could be described from a marine organism. KW - Aplysina KW - Bromorganische Verbindungen KW - Sekundärmetabolit KW - Aplysina KW - Aplysina caulifromis KW - Aplysina insularis KW - Bromoisoxazolinalkaloide KW - Bromotyrosinalkaloide KW - enzymatische Abwehrreaktion KW - Aplysina KW - Aplysina caulifromis KW - Aplysina insularis KW - bromoisoxazoline alkaloids KW - bromotyrosine alkaloids KW - enzymatic defense mechanism Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1166 ER - TY - THES A1 - Ernst, Roman T1 - Visuelle Mustererkennung und Parameterextraktion bei Drosophila melanogaster T1 - Visual pattern recognition and parameter extraction in Drosophila melanogaster N2 - In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht. N2 - The results of operant conditioning experiments at the flight simulator suggest that Drosophila melanogaster can extract four parameters from visual patterns: pattern area, vertical position of the center of gravity, separatedness and horizontal/vertical pattern orientation. It can not be excluded that the fly can extract additional parameters. Spontaneous pattern preferences and conditioned preferences show different relationships with pattern parameters. The fly treats separated pattern elements as a compound figure. Retinal transfer is not observed even when patterns are presented at two different vertical training positions. Patterns are generalized if the positions of the centers of gravity of corresponding patterns are retained between training and test although training and test patterns do not overlap retinally. In this case there is no retinotopy of pattern memory on the pixel level but possibly on the level of the pattern parameter 'center of gravity'. Flies can not be trained to discriminate certain patterns that differ only by the vertical position of their centers of gravity. However, when tested with different patterns with corresponding centers of gravity they prefer the previously unpunished position of the center of gravity. The extraction of center of gravity and pattern area are modelled with a simple artificial neuronal filter. The architecture of this filter is based on an algorithm for the computation of the common center of gravity of multiple elements. KW - Taufliege KW - Mustererkennung KW - Visuelle Wahrnehmung KW - visuelle Mustererkennung KW - Musterlernen KW - Parameterextraktion KW - Generalisierung KW - neuronales Filter KW - Drosophila melanogaster KW - visiual pattern recognition KW - pattern conditioning KW - parameter extraction KW - generalization KW - neuronal filter KW - Drosophila melanogaster Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1156 ER - TY - THES A1 - Engelhardt, Stefan T1 - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren T1 - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann. KW - Beta-Rezeptor KW - Maus KW - Transgene Tiere KW - Herzinsuffizienz KW - Transgene Mäuse KW - beta-adrenerge Rezeptoren KW - Hypertrophie KW - Fibrose KW - Na/H-Austauscher KW - Herzinsuffizienz KW - transgenic mice KW - cardiac hypertrophy KW - fibrosis KW - Na/H-exchanger KW - heart failure Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950 ER - TY - THES A1 - Eltz, Thomas T1 - Ecology of stingless bees (Apidae, Meliponini) in lowland dipterocarp forests in Sabah, Malaysia, and an evaluation of logging impact on populations and communities T1 - Ökologie Stachelloser Bienen (Apidae, Meliponini) in Dipterocarpaceen-Wäldern im Tiefland von Sabah, Malaysia, mit einer Evaluierung des Einflusses der kommerziellen Holznutzung auf Populationen und Gemeinschaften N2 - The present thesis reports on four years of field research on stingless bee ecology in Sabah, Malaysia. Hereby, it was the main focus to evaluate the effect of selective logging for timber extraction on communities of bees, and to elucidate causative relationships involved in regulating bee populations. Included were background studies on resource use (3.1, 3.2, 3.3) and nesting biology (3.4) as well as comparative studies on stingless bee diversity and abundance in logged and unlogged lowland rainforest sites (4.1, 4.2). Stingless bees proved to be generalist foragers that used a large range of plant species as pollen sources. Nevertheless, different species of bees had rather distinct pollen diets, a findind that was independent of fluctuations in flowering activity in the habitat. At one particular point in time colonies of one species (Trigona collina)collected mold spores (Rhizopus sp.) as a pollen surrogate. In order to obtain low-effort estimates of meliponine pollen sources a new method was developed: Trapping of bee garbage (with funnel traps) and the quantitative analysis of pollen in garbage samples. Pollen in bee garbage reflected pollen import with a certain time lag and could therefore be used for an assessment of long-term pollen foraging (see below). The majority of stingless bee nests (275 nests of 12 species) were found in cavities in trunks or under the bases of large, living canopy trees. Nest trees mostly belonged to commercial species and were of the correct size and (partly) timber quality to warrant harvesting. It was estimated that roughly one third of stingless bee nests in an given forest area would be killed during a selective logging operation. Besides causing direct mortality, logging may also indirectly affect bee populations by reducing the availability of potential nest sites (trees). However, in a comparison of primary and differentially logged forest sites (10 to 30 years after logging) no effect of the degree of disturbance on meliponine nest density was found. Instead, the variation in nest density (0 to 16.2 nest/ha) was best explained by differences in the available floral resources (assessed by analysis of pollen in bee garbage). Bee populations in forest edge situations were favored: there was a positive correlation between nest density and the proportion of external non-forest pollen (e.g. from crop plants, road edge vegetation, mangroves) in the bees’ diet. The highest nest density was found in a site bordering the mangroves in Sandakan Bay. Here, the mangrove tree Rhizophora apiculata represented a extraordinary large fraction of the pollen volume. Presumably, external pollen sources effectively supplement bee diets at times when little flowering occurs inside the forest, thus increasing overall bee carrying-capacity. The idea of differential pollen limitation was strengthened by direct measurements of pollen import and foraging activity over a period of five months. Both were elevated in colonies in a site with high bee density. It is concluded that the abundance of stingless bees in forests in Sabah is chiefly dependent on the local availability of food resources. Hereby, bee populations strongly benefit from edge effects and increased habitat diversity. Although direct negative effects of selective logging are strongly indicated by a close association of bee nests with commercial trees, no clear effects were detected in regenerating forests ten to 30 years after logging. N2 - Die vorliegende Dissertation umfaßt die Ergebnisse einer vierjährigen Studie zur Ökologie von Stachellosen Bienen in den Regenwäldern von Sabah, Malaysia. Hauptziel war es dabei, mögliche Auswirkungen der selektiven Holznutzung auf Bienengemeinschaften zu erforschen und, falls sich ein Effekt nachweisen läßt, die dafür verantwortlichen Wirkfaktoren zu identifizieren. Die Arbeiten schlossen sowohl Hintergrundstudien zur Nahrungsökologie (3.1, 3.2, 3.3) und Nistbiologie (3.4) ein, als auch vergleichende Erfassungen der Bienenabundanz und -diversität in primären und durch Holznutzung gestörten Tieflandregenwäldern (4.1, 4.2). Stachellose Bienen erwiesen sich als generalistische Blütenbesucher, die über die Zeit eine Vielzahl verschiedener Blütenpflanzen als Pollenquellen nutzen. Die Überlappung der Pollenspektren zwischen verschiedenen Bienenarten war jedoch sowohl bei geringer als bei höherer Blühaktivität relative niedrig. In einer Ausnahmesituation wurden von mehreren Kolonien einer Art (Trigona collina) auch Schimmelpilzsporen (Rhizopus sp.) als Pollenersatz eingetragen. Um die Pollennahrung von Meliponinen mit geringerem Aufwand und noch detaillierter erfassen zu können wurde eine neue Methode entwickelt: das automatisierte Absammeln von ‚Bienenmüll‘ (mittels Trichtefallen) und die quantitative Analyse der enthaltenen Pollenexinen. Die Polleninhalte des Mülls erwiesen sich dabei als verzögertes Abbild des eingetragenen Pollens und konnte daher für eine grobe Bestimmung langfristiger Nahrungsgewohnheiten herangezogen werden (siehe unten). Die große Mehrzahl der gefundenen Meliponinen-Nester (275 von 12 Arten) befanden sich entweder in Hohlräumen des Stämme oder unter der Stammbasis großer, lebender und oft kommerziell nutzbarer Kronenbäume. Grobe Berechnungen ergaben, daß mehr als ein Drittel aller Bienennester einer durchschnittlichen selektiven Fällaktion zum Opfer fallen würden. Neben diesem direkten Schaden könnte die kommerzielle Holznutzung auch indirekt (über eine Verringerung der zur Verfügung stehenden, potentiellen Nistbäume) die Bienenpopulationen negativ beeinflussen. Im Vergleich unterschiedlich stark eingeschlagener Flächen (10 bis 30 Jahre nach der letzen Nutzung) konnte allerdings kein Zusammenhang der Bienennestdichte mit dem Störungsgrad des Waldes gefunden werden. Statt dessen wurde die hohe Variation der Nestdichte (0 bis 16.2 Nester/ha) am besten durch die Unterschiede in den verfügbaren Nahrungsressourcen erklärt (bestimmt durch Müllpollenanalyse). Hier waren vor allem Waldflächen in Randlage begünstigt. Es bestand eine positive Korrelation der Nestdichte und dem Anteil externer, nicht aus dem Wald stammender Pollentypen (z. B. Kulturpflanzen, Straßenrandvegetation, Mangrovenpflanzen) an der Bienennahrung. Die bei weitem höchste Nestdichte wurden in einem an die Mangroven der Sandakan Bay angrenzenden Wald gefunden, wo ein herausragender Teil der Pollennahrung aus Pollen des Mangrovenbaums Rhizophora apiculata bestand. Vermutlich stellen externe Pollenquellen eine wichtige Ergänzung der Bienennahrung zu Zeiten geringer Blühaktivität im Wald dar, die die ‘carrying capacity’ des Waldes für Meliponinen erhöht. Die Theorie der unterschiedlichen Limitierung durch Pollenquellen wurde durch direkte Messungen von Polleneintrag und Fouragieraktivität überprüft: Beides war über fünf Monate hinweg bei Nestern in einer bienenreichen Fläche erhöht. Zusammenfassend läßt sich schließen, daß die Abundanz von Stachellosen Bienen in Sabahanischen Wäldern hauptsächlich von der lokalen Nahrungsverfügbarkeit abhängt und Bienenpopulationen hierbei stark von Randeffekten und erhöhter Habitatdiversität profitieren. Ein Einfluß von anthropogener Störung durch selektive Holznutzung ist aufgrund der Nistbiologie von Meliponinen kurz und mittelfristig zu erwarten, konnte aber in regenerierenden Wäldern zehn bis 30 Jahren nach dem Einschlag nicht eindeutig nachgewiesen werden. KW - Sabah KW - Stachellose Biene KW - Anthropogener Einfluss KW - Demökologie KW - Meliponini KW - stingless bees KW - Pollennahrung KW - Ressourcenteilung KW - begrenzte Ressource KW - Blühphänologie KW - Pollenanalyse KW - Nistgelegenheit KW - Holznutzung KW - Meliponini KW - stingless bees KW - pollen foraging KW - resource partitioning KW - resource limitation KW - flowering phenology KW - pollen analysis KW - nesting resources Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1130 ER - TY - THES A1 - El-Barkani, Abdelmalic T1 - Molekulargenetische Charakterisierung des pH-regulierten Dimorphismus und der pH-abhängigen Genexpression von Candida albicans und Entwicklung eines Reportersystem für Candida glabrata T1 - Molecular genetic Characterisation of the pH Regulated Dimorphism and the pH Dependent Gene Expression of Candida albicans and Development of a Reporter System for Candida glabrata N2 - Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können. N2 - Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata. KW - Candida albicans KW - Wasserstoffionenkonzentration KW - Genexpression KW - Torulopsis glabrata KW - Markierungsgen KW - Candida albicans KW - pH KW - Dimorphismus KW - Genexpression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - Reportergen KW - Candida albicans KW - pH KW - dimorphism KW - gene expression KW - RIM101 KW - Candida glabrata KW - reporter gene Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1125 ER - TY - THES A1 - Eckert, Martin T1 - Zur Regulation und Expression von Aquaporinen unter Berücksichtigung des pflanzlichen Wasserhaushaltes T1 - On the regulation and expression of aquaporins with regard to plant water relation N2 - Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet. N2 - Gas exchange measurement of plants was optimized for the model organism Arabidopsis thaliana. Consequently, studies on the participation of aquaporin PIP1b in water transport processes became possible. The transpiration rates obtained for PIP1b anti-sense plants revealed no differences in the time course of stomatal opening. Thus, water permeabilities of guard cell plasma membranes seem not to be influenced by the extend of PIP1b expression. - Gas exchange measurement of the Nicotiana tabacum NtAQP1 anti-sense plants showed a reduced transpiration in response to light and a reduced basal transpiration in the dark. This indicates the participation of NtAQP1 in water movement. - Selected Arabidopsis thaliana mutants were analyzed with regard to their stomatal response to red, red/blue light irradiation. For that, a dual beam protocol was developed. A comparison of the mutant lines to the wild-type revealed significant differences for the phytochrome A (phyA-103), the abscisic acid (aba3-2) and the auxin resistent (axr1-3) mutants. Furthermore, the mutant line npq1-2 did not show the abnormal stomatal response to blue light reported previously. - The expression patterns of a PIP1b-GFP-reporter gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants were analyzed. High promotor activities were obtained in areas of meristematic tissue in roots and shoot, in vascular elements, in young cotyledons and in stamina. A close correlation between PIP1b-promoter activity and cell elongation was obvious. - Sequence analysis of the NtAQP1 promoter discovered DNA-motifs that correspond to specific binding sites of MYB-related transcriptional activators. By using promotor-reporter constructs, the involvement of one of this motifs in a GA- and ABA-induced increase of NtAQP1-promoter activity could be shown. In order to elucidate the effects of phytohormones on deleted promoter elements a dual vector system has been created, which was employed in the transient transfection of BY2-protoplasts. - The expression of a GFP::NtAQP1 translational fusion in BY2-cells revealed a subcellular location in the cytoplasmic membrane. Furthermore, the protein-fusion was recorded in small vesicle-like structures. KW - Pflanzen KW - Wasserhaushalt KW - Aquaporine KW - Genexpression KW - Genregulation KW - aquaporin KW - wasserhaushalt KW - stomata KW - GFP KW - protoplasten KW - transformation KW - aquaporins KW - water relation KW - stomata KW - GFP KW - protoplast transformation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1114 ER - TY - THES A1 - Ebert-Dümig, Regina T1 - Expression und Regulation 1,25(OH) 2 -Vitamin D 3-responsiver Gene in monozytären Zellen T1 - Expression and regulation of 1,25 dihydroxyvitamin D3 responsive genes in monocytic cells N2 - Das Secosterid Vitamin D3 wird durch die Nahrung aufgenommen oder im Organismus synthetisiert, wobei eine Reaktion in der Haut durch einen photochemischen Prozess katalysiert wird.Durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere wird Vitamin D3 über 25(OH) Vitamin D3 zum aktiven 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon. 1,25(OH)2 Vitamin D3 hat eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel, es reguliert die Ca2+-Resorption im Dünndarm. Die 1,25(OH)2 Vitamin D3-Synthese in der Niere wird durch Parathormon (PTH) kontrolliert. Ist die Serum Ca2+-Konzentration niedrig, wird PTH ausgeschüttet und die 1a-Hydroxylase, das 25(OH) Vitamin D3-aktivierende Enzym, stimuliert. Das Prinzip der (Seco)steroid-Aktivierung und -Inaktivierung in glandulären Organen, wie Leber und Niere mit anschließender Freisetzung der aktiven Hormone und Transport zu den jeweiligen Zielgeweben gilt heute nicht mehr uneingeschränkt. Auch Einzelzellen sind in der Lage Steroid-modifizierende Enzyme, die Hydroxylasen und Dehydrogenasen, zu exprimieren. Monozytäre Zellen exprimieren das 1,25(OH)2 Vitamin D3-aktivierende und das -inaktivierende Enzym, die 1a-Hydroxylase und die 24-Hydroxylase. Sie sind somit in der Lage, 1,25(OH)2 Vitamin D3 zu sezernieren, welches parakrin auf Nachbarzellen wirken kann. In diesem Zusammenhang wurde die Expression und Regulation der 1a-Hydroxylase in peripheren Blutmonozyten (PBM) und monozytären THP1-Zellen untersucht. Durch Supplementation der Zellen mit dem Substrat 25(OH) Vitamin D3 konnte die Produktion an aktivem 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon in PBM signifikant gesteigert werden. In PBM konnte im Gegensatz zum systemischen Ca2+-Stoffwechsel nur ein geringer Einfluss auf die 1a-Hydroxylase-Aktivität beobachtet werden. Durch RT-PCR-Amplifikation konnte eine Expression des PTH Rezeptors Typ 1 (PTHR1) in PBM und Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Ein weiterer Ligand des PTHR1 ist PTH related Protein (PTHrP), ein Faktor der die Tumorhyperkalzämie propagiert. Durch Markierungsexperimente mit fluoreszenz-markiertem PTHrP konnte gezeigt werden, dass PTHrP an die Zellmembran von PBM und Dendritischen Zellen bindet und in den Zellkern von Dendritischen Zellen transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsive Gene in Monozyten/Makrophagen untersucht. Die Expression der 24-Hydroxylase wird innerhalb der Differenzierung von myeloischen THP1-Zellen zu Makrophagen- bzw. Osteoklasten-ähnlichen Zellen transient induziert. Als weiteres 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsives Gen wurde die Expression von Osteopontin (OPN) untersucht. OPN ist ein vor allem in Knochen vorkommendes Matrixprotein, das wesentlich an der Zelladhäsion beteiligt ist. OPN wird in THP1-Zellen im Zuge der Differenzierung zunehmend exprimiert. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte OPN in Granulomen von Morbus Crohn- und Leberschnitten detektiert werden. Es spielt hier eine wesentliche Rolle bei der Granulomentstehung. Die Thioredoxin Reduktase 1 (TR1) ist ein Selenoenzym, welches maßgeblich an der Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen beteiligt ist. Es moduliert Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen wie die Bindung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB an DNA-responsive Elemente. Die Expression der TR1 wird in THP1-Zellen im Rahmen der Differenzierung induziert und ist in differenzierten Zellen maximal. Aktivitätsmessungen deckten sich mit dieser Beobachtung. In peripheren Blutmonozyten steigt die TR-Aktivität alleine durch Adhäsion der Zellen an das Kulturgefäß und nach Behandlung mit 1,25(OH)2 Vitamin D3. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine Abhängigkeit der TR-Aktivität vom Differenzierungsgrad der Zellen und der Supplementation des Mediums mit dem Spurenelement Selen. Die Expression weiterer Selenoproteine in monozytären Zellen wurde nachgewiesen. So konnten durch 75Selenit-Markierungsexperimente neun Selenoproteine in THP1-Zellen detektiert werden, von denen fünf sezerniert werden. Ein weiteres, in monozytären Zellen charakterisiertes Selenoprotein ist die zelluläre Glutathionperoxidase. Ihre Aktivität konnte in Selenit-supplementierten Zellen um das 70fache gesteigert werden. Die Kultivierung monozytärer Zellen unter Selenit-Supplementation beeinflusst die Funktion dieser Zellen wesentlich. So konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an phagozytierenden, zu Makrophagen differenzierten THP1-Zellen nach Selenit-Supplementation abnahm, während die Phagozytoserate der einzelnen Zellen anstieg. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass monozytäre Zellen mit Komponenten des 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon produzieren, sezernieren und inaktivieren können. Die lokale Kontrolle der 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsiver Gene, wie die Expression des Selenoproteins TR1, das einen direkten Einfluss auf den Redoxstatus und den Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen in diesen und Nachbarzellen ausübt. N2 - The secosteroid 1,25(OH)2 vitamin D3 is either taken up by our daily diet or it is formed by a photochemical prosess in the skin. In liver and kidney vitamin D3 is hydroxylated in two steps to 25(OH) vitamin D3 and the active hormone 1,25(OH)2 vitamin D3. 1,25(OH)2 vitamin D3 plays an important role in bone metabolism. It is a key regulatorof the resorption of Ca2+ in the intestine. In the kidney 1,25(OH)2 vitamin D3 synthesis is controlled by parathyroid hormone (PTH). When the concentration of serum Ca2+ is low, PTH is secreted and 1a-hydroxylase, the 25(OH) vitamin D3 activating enzyme is induced in kidney. The picture of (seco)steroid activation and inactivation in glandular organs, like the liver and kidney, and the release and transport of the activated hormone to the target tissues has been modified recently. Single cells are also able to express steroid-modifying enzymes like hydroxylases and dehydrogenases. Monocytes express the 1,25(OH)2 vitamin D3-activating and the inactivating enzyme, i.e. the 1a-hydroxylase and the 24-hydroxylase. Thus they are able to build and secrete 1,25(OH)2 vitamin D3 which can act on neighbouring cells in a paracrine way. In this context the expression and regulation of the 1a-hydroxylase in peripheral blood monocytes (PBM) and THP1 cells was investigated. By supplementation of cells with the substrate 25(OH) vitamin D3 the production of active 1,25(OH)2 vitamin D3 hormone could be enhanced significantly in PBM. In PBM only a slight influence of PTH on 1a-hydroxylase activity could be observed, in contrast to the regulation in systemic Ca2+-metabolism. An expression of PTH receptor type 1 (PTHR1) could be verified by RT-PCR from whole RNA isolated from PBM and dendritic cells. A further ligand of PTHR1 is PTH related protein (PTHrP), a factor which propagates the humoral hypercalcemia of malignancy. Labeling experiments with a fluorescently marked PTHrP showed clustered membrane staining of PBM and dendritic cells and a transport to the nucleus of dendritic cells. The expression of 1,25(OH)2 vitamin D3-responsive genes in monocytes/macrophages was investigated. 24-hydroxylase is induced transiently during the differentiation of myeloid THP1 cells to macrophages and osteoclast-like cells, respectively. Next, the expression of osteopontin (OPN), a further 1,25(OH)2 vitamin D3 responsive gene was studied. OPN is a matrix protein that is mainly found in bone, it carries a RGD-motive in its aminoacid sequence which can bind to integrins and is involved in cell adhesion. The expression of OPN is increased during differentiation of THP1 cells. By immunohistochemistry OPN could be detected in Crohn's disease and liver granulomas where it also plays an important role in granuloma formation. The thioredoxin reductase 1 (TR1) is a selenoenzyme that is mainly involved in the reduction of disulfide bonds of proteins. It modulates protein/protein and protein/DNA interactions like the binding of the transkription factors AP1 and NFkB to DNA-responsive elements. The expression of TR1 mRNA is induced during differentiation and is maximal in differentiated cells. Activity measurments parallel these observations. In PBM TR-activity is increased by the event of adhesion of cells to the culture dish and after treatment with 1,25(OH)2 vitamin D3. A dependence of TR-activity on the degree of differentiation of cells and the supplementation of the medium with the trace element selenium was observed. The expression of further selenoproteins in monocytic cells was investigated. In THP1 cells nine selenoproteins could be detected By labeling experiments with 75selenite. Five were found as secreted proteins in the culture supernatant. In monocytes cellular glutathione peroxidase (cGPx) is a well characterized selenoprotein. Activity could be increased 70fold by selenit supplementation. Under selenite supplementation the number of differentiated THP1 cells capable of phagocytosis was diminished while the rate of phagocytosis of single cells was enhanced. Taken together, the experiments clearly indicate that monocytic cells are equipped with the components of 1,25(OH)2 vitamin D3 metabolism and thus are capable of 1,25(OH)2 vitamin D3 hormone synthesis, secretion and turnover. Moreover, local control of 1,25(OH)2 vitamin D3 synthesis and inactivation directly regulates the expression of 1,25(OH)2 vitamin D3-responsive genes like the selenoprotein TR and thus even impacts on the cellular redox-status and defense against reactive oxygen species in these and neighbouring cells. KW - Vitamin D3 KW - Stoffwechsel KW - Zelldifferenzierung KW - Molekulargenetik KW - 1 KW - 25 Dihydroxyvitamin D3 KW - Monozyten KW - Selenit KW - Selenoprotein KW - 1 KW - 25 dihydroxyvitamin D3 KW - monocyte KW - selenite KW - selenoprotein Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1101 ER - TY - THES A1 - Dinev, Dragomir T1 - Analysis of the role of extracellular signal regulated kinase (ERK5) in the differentiation of muscle cells T1 - Analyse der Rolle der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK5) in der Differenzierung von Muskelzellen N2 - The MEK5/ ERK5 kinase module is a relatively new discovered mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway with a poorly defined physiological function. Since ERK5 and its upstream activator MEK5 are abundant in skeletal muscle a function of the cascade during muscle differentiation was examined. ERK5 becomes activated upon induction of differentiation in mouse myoblasts. The selective activation of the pathway results in promoter activation of differentiation-specific genes, such as the cdk-inhibitor p21 gene, the myosin light chain (MLC1A) gene, or an E-box containing promoter element, where myogenic basic-helix-loop-helix proteins such as MyoD or myogenin bind. Moreover, myogenic differentiation is completely blocked, when ERK5 expression is inhibited by antisense RNA. The effect can be detected also on the expression level of myogenic determination and differentiation markers such as p21, MyoD and myogenin. Another new finding is that stable expression of ERK5 in C2C12 leads to differentiation like phenotype and to increased p21 expression levels under growth conditions. These results provide first evidence that the MEK5/ERK5 MAP kinase cascade is critical for early steps of muscle cell differentiation. N2 - MEK5/ ERK5 ist ein erst kürzlich entdeckter MAPK- Signalweg, dessen physiologische Funktion noch wenig verstanden ist. Da ERK5 und der in der Kaskade oberhalb liegende Aktivator MEK5 in Skelettmuskeln hoch expremiert werden, wurde eine Funktion der Kaskade während des Muskel-Differenzierung untersucht. ERK5 wird nach einer Induktion der Differenzierung in Maus-Myoblasten aktiviert. Die gezielte Aktivierung dieses Signalwegs führt zur Induzierung von Promotoren differenzierungs-spezifischer Gene, wie z.B. des cdk-Inhibitors p21, der MLC1A, oder eines Promotors, der E-Boxen enthält, woran myogene Basische-Helix- loop- Helix Proteine, wie MyoD oder Myogenin binden können. Darüber hinaus ist die Muskeldifferenzierung völlig blockiert, wenn die Expression von ERK5 mittels antisense-RNA inhibiert wird. Diesen Effekt kann man auch an hand der Menge von exprimierten muskelspezifischen Differenzierungsproteinen, wie p21, MyoD und Myogenin nachweisen. Eine weitere neue Entdeckung ist, daß stabile Expression von ERK5 in C2C12 Zellen zu einem differenzierungsähnlichen Phänotyp und gesteigerter p21 Expression unter Wachstum-bedingungen führt. Diese Ergebnisse geben erste Anhaltspunkte, daß der MEK5/ ERK5 MAP Kinase Signalweg entscheidend für frühe Stadien der Muskeldifferenzierung ist. KW - Muskelzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Signaltransduktion KW - Proteinkinasen KW - ERK5 KW - MEK5 KW - MEF2C KW - MyoD KW - Muskeldifferenzierung KW - Kinase KW - ERK5 KW - MEK5 KW - MEF2C KW - MyoD KW - muscle differentiation KW - kinase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180481 ER - TY - THES A1 - Dietrich, Claudia T1 - Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle für die Virulenz von Legionella pneumophila T1 - Molecular studies of flagellar function in Legionella pneumophila virulence N2 - Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden. N2 - Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires´ disease, lives as a facultative intracellular bacterium in the environment and has the capability to survive and replicate both in protozoa and human phagocytic and non-phagocytic cells. The role of flagella and motility in the infection of host cells still has to be determined. To better characterize the flaA-region of Legionella and to learn about the organisation of flagellar genes, two clones of a cosmid library harbouring this region from the genome of L. pneumophila Philadelphia I have been sequenced. Upstream of flaA, leading in the opposite direction, the metabolic genes accD and folC could be identified. Downstream of flaA the flagellar genes flaG, fliD, coding for the flagella-capping-protein, and fliS are located. Further downstream, two ORFs with homologies to the recently described Legionella genes enhA and milA have been identified. To investigate the influence of the flagella on the infection process, the flaA negative mutant strain KH3, where the flaA gene was inactivated by insertion of a kanamycin cassette, was complemented. This could be achieved, using the suicide vector pMSS704, by integration of the intact flaA gene back into the chromosome, leading to the complemented strain CD10. It could be shown by Western blotting that strain CD10 regained the ability to express the flagellin protein. Electronmicrographs also confirmed the presence of intact assembled flagella. Using the three strains, L. pneumophila Corby wild-type, the flaA mutant KH3, and the complemented flaA mutant CD10, the behaviour of the flagellated and non flagellated strains was investigated concerning encountering, adherence, invasion, intracellular multiplication and lysis of host cells. Both protozoa (A. castellanii) and human phagocytes (HL-60 cells and freshly isolated blood monocytes) have been utilized as potential host cells. It could be shown that flagellation enables the bacteria to reach the cells. In contrast, when the motility defect was artificially overcome by centrifugation, no difference in attachment of the three strains could be detected in our experiments. However, there was a significant reduction in the invasion efficiency for the flaA negative strain which was extremely relevant to the invasion of human phagocytes. Concerning the intracellular replication rate no difference could be observed, although most likely the defect in infectivity of the flaA mutant leads to a slower growth curve in the HL-60 model when using low MOIs. For the flaA mutant strain KH1, an unexpected decrease in cytotoxicity could also be observed. However, as the flaA mutant KH3 showed wildtype behaviour in this respect, the defect is most probably independent of flagellation. The sequencing of the cosmid library clone 12/44, harbouring the genes fliA and motA, showed the clustering of further flagellar genes of Legionella. Upstream of fliA two genes could be identified, showing high similarities to the putative flagellar regulator genes motR and flhF, respectively. Downstream of motA, overlapping by 26 bp, motB is located. It also plays a major role in the function of the flagellar motor and is followed by an ORF of unknown function. Still further downstream an ORF with homologies to prfB of E. coli could be sequenced. Southern blot analysis of different Legionella-strains with a motA specific probe gave positive signals for all L. pneumophila strains, as well as for some non-pneumophila strains (e. g. L. gormanii, L. jordanis, and L. bozemanii). By insertion of a kanamycin cassette into the motA gene of L. pneumophila Corby, a motA negative mutant could also be constructed. Western blot analysis and electronmicrographs confirmed that flagellin was still expressed and assembled into flagella, while light microscopy demonstrated the inability of the mutant to swim due to the impaired flagellar motor. Experiments with A. castellanii and HL-60 cells revealed the importance of motility for the finding and the invasion of host cells as already demonstrated for the flaA mutant, while intracellular replication was not affected. Recently, a gene (flaR) has been described for L. pneumophila Corby, belonging to the LysR-familiy of transcriptional regulators. It could be shown that this regulator is able to bind both to its own promotor as well as to a lower extent to the flaA promotor. Southern hybridization of different Legionella species with a flaR specific probe revealed that FlaR must be a L. pneumophila specific factor, only being present in L. pneumophila strains, together with an upstream gene (ORF234), which is leading in the opposite direction. Fusions of the promotor regions of the two genes with the reporter gene gfp (green fluorescent protein gene) demonstrated that both promotors are actually functional in Legionella, being more active at 37°C than at 30°C. Furthermore, their activity during intracellular replication in amoebae could be demonstrated. In conclusion, the flagellum and the motility, both subject to strict regulation, are of great importance to Legionella´s ability to reach and infect potential host cells KW - Legionella pneumophila KW - Virulenz KW - Geißel KW - Molekularbiologie KW - Legionellen KW - Flagelle KW - Virulenz KW - Invasion KW - intrazelluläre Vermehrung KW - Legionella KW - flagella KW - virulence KW - invasion KW - intracellular multiplication Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081 ER -